RU2821929C1

RU2821929C1 - Escherichia coli compositions and methods based thereon

Info

Publication number: RU2821929C1
Application number: RU2022122527A
Authority: RU
Inventors: Роберт Г.К. ДОНАЛД; Розалинд ПАН
Original assignee: Пфайзер Инк.
Priority date: 2020-02-23
Filing date: 2021-02-20
Publication date: 2024-06-27

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: present invention relates to immunology. Invention discloses a composition of O-polysaccharides modified on a carrier protein, obtained from Escherichia coli (E. coli) and Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) bacteria.

EFFECT: invention can be used in medical practice for inducing an immune response to Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in a subject.

16 cl, 34 tbl, 35 dwg, 35 ex

Description

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙLINK TO LIST OF SEQUENCES

Данная заявка подается в электронном виде через EFS-Web и включает представленный в электронном виде список последовательностей в формате.txt. Файл.txt содержит список последовательностей под названием «PC72591_PROV2 _ST25.txt», созданный 28 января 2021 и имеющий размер 152 КБ. Перечень последовательностей, содержащийся в этом файле.txt, является частью описания и полностью включен в настоящее описание посредством ссылки.This application is submitted electronically via EFS-Web and includes an electronically submitted sequence listing in .txt format. The .txt file contains a list of sequences called "PC72591_PROV2 _ST25.txt" created on January 28, 2021 and is 152 KB in size. The sequence listing contained in this .txt file is part of the specification and is incorporated herein by reference in its entirety.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИTECHNICAL FIELD

Настоящее изобретение относится к композициям Escherichia coli и способам их получения.The present invention relates to Escherichia coli compositions and methods for their preparation.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE ART

Угроза для здоровья населения, создаваемая растущей устойчивостью к противомикробным лекарственным средствам, описана в недавних отчетах, опубликованных ВОЗ и CDC (Thelwall SN, et al. Annual Epidemiological Commentary Mandatory MRSA, MSSA и E. coli bacteraemia and C. difficile infection data 2015/16. 2016; Russo TA, et al. Microbes and infection 2003; 5:449-56). Приоритетные патогены, описанные обоими агентствами, включают Enterobacteriaceae, резистентные к цефалоспоринам третьего поколения за счет продуцирования бета-лактамаз расширенного спектра (ESBL), и к карбапенемам за счет продуцирования ферментов карбапенемаз. По данным CDC, Enterobacteriaceae, экспрессирующие ESBL, представляют собой серьезную угрозу, в то время как резистентность Enterobacteriaceae к карбапенемным антибиотикам последней линии считается неотложной угрозой. Штаммы E. coli ESBL становятся все более распространенными, и неизлечимые инфекции, вызванные Klebsiella pneumoniae, продуцирующей как ESBL, так и карбапенемазы, становятся все более распространенными, особенно в развивающихся странах.The threat to public health posed by increasing antimicrobial drug resistance is described in recent reports published by WHO and CDC (Thelwall SN, et al. Annual Epidemiological Commentary Mandatory MRSA, MSSA and E. coli bacteraemia and C. difficile infection data 2015/16 2016; Russo TA, et al. Microbes and infection 2003; Priority pathogens described by both agencies include Enterobacteriaceae that are resistant to third-generation cephalosporins through the production of extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs) and to carbapenems through the production of carbapenemase enzymes. According to the CDC, Enterobacteriaceae expressing ESBL are a major threat, while Enterobacteriaceae resistance to last-line carbapenem antibiotics is considered an urgent threat. E. coli ESBL strains are becoming more common, and incurable infections caused by Klebsiella pneumoniae, which produces both ESBL and carbapenemases, are becoming more common, especially in developing countries.

Escherichia coli является одним из наиболее распространенных бактериальных патогенов человека с клиническими проявлениями, которые включают инфекции кровотока (70/100000 в США) (Marder EP, et al. Foodborne pathogens and disease 2014; 11:593-5), инфекции мочевыводящих путей (связанные с катетером (25000-525000 случаев в год в США) (Al-Hasan MN, et al. The Journal of antimicrobial chemotherapy 2009; 64:169-7); не связанные с катетером (6-8 миллионов случаев в год в США) (там же)); инфекции в области хирургического вмешательства (127500 случаев в год в США), пневмония (14100-23400 случаев в год в США) (там же) и диарея, связанная с серьезными пищевыми отравлениями (63000 случаев в год в США) (Zowawi HM, et al. Nature review Urology 2015; 12:570-84). Они классифицируются серологически по различиям в структуре связанного с липополисахаридом О-антигена (>180 известных серотипов), капсульного полисахаридного К-антигена (>80 серотипов) и жгутикового Н-антигена (>50 серотипов). Escherichia coliis one of the most common bacterial pathogens of humans with clinical manifestations that include bloodstream infections (70/100,000 in the US) (Marder EP, et al. Foodborne pathogens and disease 2014;11:593-5), urinary tract infections (catheter-associated (25,000-525,000 cases per year in the US) (Al-Hasan MN, et al. The Journal of antimicrobial chemotherapy 2009; 64:169-7); non-catheter related (6-8 million cases per year in the US) (there)); surgical site infections (127,500 cases per year in the USA), pneumonia (14,100-23,400 cases per year in the USA) (there) and diarrhea associated with serious food poisoning (63,000 cases per year in the US) (Zowawi HM, et al. Nature review Urology 2015; 12:570–84). They are classified serologically by differences in the structure of lipopolysaccharide-associated O antigen (>180 known serotypes), capsular polysaccharide K antigen (>80 serotypes), and flagellar H antigen (>50 serotypes).

Инфекции мочевыводящих путей (UTI) чаще всего проявляются в виде цистита, который у некоторых людей может повторяться неоднократно после выздоровления. При отсутствии лечения они могут прогрессировать до пиелонефрита и инфекций кровотока. Инфекции E. coli связаны с высоким уровнем резистентности к антибиотикам (Rogers BA, et al. The Journal of antimicrobial chemotherapy 2011; 66:1-14), при этом многие штаммы резистентны ко многим антибиотикам, включая антибиотики последнего поколения, такие как карбапенемы и полимиксины (Nicolas-Chanoine M-H, et al. Clinical Microbiology Reviews 2014; 27:543-74). В частности, мультилокусный тип последовательности серотипа O25b (MLST) 131 стал всемирным пандемическим клоном, вызывающим преимущественно внебольничные инфекции с высокой степенью резистентности к цефалоспоринам расширенного спектра (ESBL) и фторхинолонам (Poolman JT, et al. The Journal of infectious diseases 2016; 213:6-13; Podschun R, et al. Clin Microbiol Rev 1998; 11:589-603). Штаммы, инфицирующие E. coli BSI и UTI, также известны как инвазивные внекишечные патогенные E. coli (ExPEC) или уропатогенные E. coli (UPEC). Сообщается, что из >180 идентифицированных серотипов О-антигена E. coli среди штаммов ExPEC, на подгруппу из 10-12 О-серотипов приходится >60% случаев бактериемии (Yinnon AM, et al. QJM : monthly journal of the Association of Physicians 1996; 89:933-41).Urinary tract infections (UTI) most often present as cystitis, which in some people may recur more than once after recovery. If left untreated, they can progress to pyelonephritis and bloodstream infections. E. coli infections are associated with high levels of antibiotic resistance (Rogers BA, et al. The Journal of antimicrobial chemotherapy 2011; 66:1-14), with many strains resistant to many antibiotics, including newer antibiotics such as carbapenems and polymyxins (Nicolas-Chanoine MH, et al. Clinical Microbiology Reviews 2014;27:543-74). In particular, multilocus sequence type O25b (MLST) 131 has become a worldwide pandemic clone causing predominantly community-acquired infections with high rates of resistance to extended-spectrum cephalosporins (ESBLs) and fluoroquinolones (Poolman JT, et al. The Journal of infectious diseases 2016; 213: 6-13; Podschun R, et al. Clin Microbiol Rev 1998; Strains that infect E. coli BSI and UTI are also known as invasive extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC) or uropathogenic E. coli (UPEC). Of >180 identified E. coli O-antigen serotypes among ExPEC strains, a subset of 10-12 O-serotypes have been reported to account for >60% of bacteremia cases (Yinnon AM, et al. QJM: monthly journal of the Association of Physicians 1996 ; 89:933-41).

После E.coli, Klebsiella spp. (включая K. pneumoniae и K. oxytoca) являются следующими наиболее распространенными грамотрицательными патогенами, связанными с инвазивными инфекциями, включая UTI, пневмонию, внутрибрюшную инфекцию и инфекцию кровотока (BSI) (Podschun R, et al. Clin Microbiol Rev 1998; 11:589-603; Anderson DJ, et al. PLoS One 2014; 9:e91713; Chen L, et al. Trends Microbiol 2014; 22:686-96; Iredell J, et al. Bmj 2016; 352:h6420). Klebsiella сохраняют глубокую способность приобретать резистентность к антибиотикам за счет горизонтально передающихся ESBL и генов, придающих резистентность к карбапенемам (Follador R, et al. Microbial Genomics 2016; 2:e000073; Schrag SJ, Farley MM, Petit S, et al. Epidemiology of Invasive Early-Onset Neonatal Sepsis, 2005 to 2014. 2016; 138:e20162013). Соответственно, за последнее десятилетие во всем мире резко возросла распространенность резистентных к ESBL клебсиелл, продуцирующих бета-лактамазы расширенного спектра (ESBL). Klebsiella spp. могут экспрессировать до 8 различных O-типов и >80 K-типов. В то время как существует множество К-антигенов, связанных с вирулентными штаммами клебсиелл, только четыре серотипа О-антигена составляют >80% клинических изолятов Klebsiella, независимо от места взятия образца (кровь, моча, мокрота), инфекционного статуса (инвазивная или неинвазивная) или характера приобретения (внебольничная или внутрибольничная) (Stoll BJ, et al. Pediatrics 2011; 127:817-26).After E.coli, Klebsiella spp. (including K. pneumoniae and K. oxytoca) are the next most common gram-negative pathogens associated with invasive infections, including UTI, pneumonia, intra-abdominal infection, and bloodstream infection (BSI) (Podschun R, et al. Clin Microbiol Rev 1998; 11:589 -603; Anderson J, et al. 2014; Chen L, et al. Trends Microbiol 22:686-96; Klebsiella retain a profound ability to acquire antibiotic resistance through horizontally transmitted ESBLs and genes conferring carbapenem resistance (Follador R, et al. Microbial Genomics 2016;2:e000073; Schrag SJ, Farley MM, Petit S, et al. Epidemiology of Invasive Early-Onset Neonatal Sepsis, 2005 to 2014. 2016; 138:e20162013). Accordingly, the prevalence of ESBL-resistant extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)-producing Klebsiella has increased dramatically worldwide over the past decade. Klebsiella spp. can express up to 8 different O-types and >80 K-types. While there are many K antigens associated with virulent Klebsiella strains, only four O antigen serotypes account for >80% of clinical Klebsiella isolates, regardless of sample site (blood, urine, sputum), infection status (invasive or noninvasive) or nature of acquisition (community-acquired or hospital-acquired) (Stoll BJ, et al. Pediatrics 2011; 127:817-26).

Повышенный уровень инвазивных инфекций E. coli и Klebsiella с множественной лекарственной резистентностью (МЛУ) среди уязвимых новорожденных и пожилых людей подчеркивает необходимость применения подходов, основанных на вакцинах, в качестве альтернативы стандартным антибиотикам, которые становятся менее эффективными.Increased rates of invasive multidrug-resistant (MDR) E. coli and Klebsiella infections among vulnerable infants and older adults highlight the need for vaccine-based approaches as an alternative to standard antibiotics, which are becoming less effective.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

Для удовлетворения этих и других потребностей настоящее изобретение относится к композициям и способам их применения для индукции иммунных ответов против серотипов E.coli и K.pneumoniae. To meet these and other needs, the present invention relates to compositions and methods of using them to induce immune responses against serotypes E.coliAnd K. pneumoniae.

В одном варианте осуществления изобретение предлагает композицию, содержащую полипептид, полученный из FimH, или его фрагмента; и сахарид, имеющий структуру, выбранную из Формулы O1, Формулы O1A, Формулы O1B, Формулы O1C, Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4, Формулы O4:K52, Формулы O4:K6, Формулы O5, Формулы O5ab, Формулы O5ac, Формулы O6, Формулы O6:K2; K13; K15, Формулы O6:K54, Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B, Формулы O18B1, Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23, Формулы O23A, Формулы O24, Формулы O25, Формулы O25a, Формулы O25b, Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45, Формулы O45, Формулы O45rel, Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы 62D₁, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73, Формулы O73, Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186, Формулы O187.In one embodiment, the invention provides a composition comprising a polypeptide derived from FimH, or a fragment thereof; and a saccharide having a structure selected from Formula O1, Formula O1A, Formula O1B, Formula O1C, Formula O2, Formula O3, Formula O4, Formula O4:K52, Formula O4:K6, Formula O5, Formula O5ab, Formula O5ac, Formula O6 , Formulas O6:K2; K13; K15, Formulas O6:K54, Formulas O7, Formulas O8, Formulas O9, Formulas O10, Formulas O11, Formulas O12, Formulas O13, Formulas O14, Formulas O15, Formulas O16, Formulas O17, Formulas O18, Formulas O18A, Formulas O18ac, Formulas O18A1, Formulas O18B, Formulas O18B1, Formulas O19, Formulas O20, Formulas O21, Formulas O22, Formulas O23, Formulas O23A, Formulas O24, Formulas O25, Formulas O25a, Formulas O25b, Formulas O26, Formulas O27, Formulas O28, Formulas O29 , Formulas O30, Formulas O32, Formulas O33, Formulas O34, Formulas O35, Formulas O36, Formulas O37, Formulas O38, Formulas O39, Formulas O40, Formulas O41, Formulas O42, Formulas O43, Formulas O44, Formulas O45, Formulas O45, Formulas O45rel , Formulas O46, Formulas O48, Formulas O49, Formulas O50, Formulas O51, Formulas O52, Formulas O53, Formulas O54, Formulas O55, Formulas O56, Formulas O57, Formulas O58, Formulas O59, Formulas O60, Formulas O61, Formulas O62, Formulas 62D ₁ , Formulas O63, Formulas O64, Formulas O65, Formulas O66, Formulas O68, Formulas O69, Formulas O70, Formulas O71, Formulas O73, Formulas O73, Formulas O74, Formulas O75, Formulas O76, Formulas O77, Formulas O78, Formulas O79 , Formulas O80, Formulas O81, Formulas O82, Formulas O83, Formulas O84, Formulas O85, Formulas O86, Formulas O87, Formulas O88, Formulas O89, Formulas O90, Formulas O91, Formulas O92, Formulas O93, Formulas O95, Formulas O96, Formulas O97, Formulas O98, Formulas O99, Formulas O100, Formulas O101, Formulas O102, Formulas O103, Formulas O104, Formulas O105, Formulas O106, Formulas O107, Formulas O108, Formulas O109, Formulas O110, Formulas 0111, Formulas O112, Formulas O113, Formulas O114, Formulas O115, Formulas O116, Formulas O117, Formulas O118, Formulas O119, Formulas O120, Formulas O121, Formulas O123, Formulas O124, Formulas O126, Formulas O127, Formulas O128, Formulas O129, O130, Formulas O131 , Formulas O132, Formulas O133, Formulas O134, Formulas O135, Formulas O136, Formulas O137, Formulas O138, Formulas O139, Formulas O140, Formulas O141, Formulas O142, Formulas O143, Formulas O144, Formulas O145, Formulas O146, Formulas O147, Formulas O148, Formulas O149, Formulas O150, Formulas O151, Formulas O152, Formulas O153, Formulas O154, Formulas O155, Formulas O156, Formulas O157, Formulas O158, Formulas O159, Formulas O160, Formulas O161, Formulas O162, Formulas O16 3, Formulas O164, Formulas O165, Formulas O166, Formulas O167, Formulas O168, Formulas O169, Formulas O170, Formulas O171, Formulas O172, Formulas O173, Formulas O174, Formulas O175, Formulas O176, Formulas O177, Formulas O178, Formulas O179, O180, Formulas O181 , Formulas O182, Formulas O183, Formulas O184, Formulas O185, Formulas O186, Formulas O187.

В одном аспекте, композиция дополнительно содержит, по меньшей мере, один сахарид, полученный из любой одной K. pneumoniae, выбранный из группы, состоящей из O1, O2, O3 и O5.In one aspect, the composition further contains at least one saccharide derived from any one K. pneumoniae selected from the group consisting of O1, O2, O3 and O5.

В другом аспекте, композиция дополнительно содержит сахарид, полученный из K. pneumoniae, который конъюгирован с белком-носителем; и сахарид, полученный из E. coli, конъюгированный с белком-носителем.In another aspect, the composition further comprises a saccharide derived from K. pneumoniae that is conjugated to a carrier protein; and a saccharide derived from E. coli conjugated to a carrier protein.

В другом варианте осуществления, изобретение предлагает композицию, содержащую полипептид, полученный из FimH, или его фрагмент; и, по меньшей мере, один сахарид, полученный из любой одной K. pneumoniae, выбранный из группы, состоящей из O1, O2, O3 и O5. В одном аспекте, композиция дополнительно содержит, по меньшей мере, один сахарид, имеющий структуру, выбранную из Формулы O1, Формулы O1A, Формулы O1B, Формулы O1C, Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4, Формулы O4:K52, Формулы O4:K6, Формулы O5, Формулы O5ab, Формулы O5ac, Формулы O6, Формулы O6:K2; K13; K15, Формулы O6:K54, Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B, Формулы O18B1, Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23, Формулы O23A, Формулы O24, Формулы O25, Формулы O25a, Формулы O25b, Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45, Формулы O45, Формулы O45rel, Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы 62D₁, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73, Формулы O73, Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186, Формулы O187.In another embodiment, the invention provides a composition comprising a polypeptide derived from FimH, or a fragment thereof; and at least one saccharide derived from any one K. pneumoniae selected from the group consisting of O1, O2, O3 and O5. In one aspect, the composition further contains at least one saccharide having a structure selected from Formula O1, Formula O1A, Formula O1B, Formula O1C, Formula O2, Formula O3, Formula O4, Formula O4:K52, Formula O4:K6 , Formulas O5, Formulas O5ab, Formulas O5ac, Formulas O6, Formulas O6:K2; K13; K15, Formulas O6:K54, Formulas O7, Formulas O8, Formulas O9, Formulas O10, Formulas O11, Formulas O12, Formulas O13, Formulas O14, Formulas O15, Formulas O16, Formulas O17, Formulas O18, Formulas O18A, Formulas O18ac, Formulas O18A1, Formulas O18B, Formulas O18B1, Formulas O19, Formulas O20, Formulas O21, Formulas O22, Formulas O23, Formulas O23A, Formulas O24, Formulas O25, Formulas O25a, Formulas O25b, Formulas O26, Formulas O27, Formulas O28, Formulas O29 , Formulas O30, Formulas O32, Formulas O33, Formulas O34, Formulas O35, Formulas O36, Formulas O37, Formulas O38, Formulas O39, Formulas O40, Formulas O41, Formulas O42, Formulas O43, Formulas O44, Formulas O45, Formulas O45, Formulas O45rel , Formulas O46, Formulas O48, Formulas O49, Formulas O50, Formulas O51, Formulas O52, Formulas O53, Formulas O54, Formulas O55, Formulas O56, Formulas O57, Formulas O58, Formulas O59, Formulas O60, Formulas O61, Formulas O62, Formulas 62D ₁ , Formulas O63, Formulas O64, Formulas O65, Formulas O66, Formulas O68, Formulas O69, Formulas O70, Formulas O71, Formulas O73, Formulas O73, Formulas O74, Formulas O75, Formulas O76, Formulas O77, Formulas O78, Formulas O79 , Formulas O80, Formulas O81, Formulas O82, Formulas O83, Formulas O84, Formulas O85, Formulas O86, Formulas O87, Formulas O88, Formulas O89, Formulas O90, Formulas O91, Formulas O92, Formulas O93, Formulas O95, Formulas O96, Formulas O97, Formulas O98, Formulas O99, Formulas O100, Formulas O101, Formulas O102, Formulas O103, Formulas O104, Formulas O105, Formulas O106, Formulas O107, Formulas O108, Formulas O109, Formulas O110, Formulas 0111, Formulas O112, Formulas O113, Formulas O114, Formulas O115, Formulas O116, Formulas O117, Formulas O118, Formulas O119, Formulas O120, Formulas O121, Formulas O123, Formulas O124, Formulas O126, Formulas O127, Formulas O128, Formulas O129, O130, Formulas O131 , Formulas O132, Formulas O133, Formulas O134, Formulas O135, Formulas O136, Formulas O137, Formulas O138, Formulas O139, Formulas O140, Formulas O141, Formulas O142, Formulas O143, Formulas O144, Formulas O145, Formulas O146, Formulas O147, Formulas O148, Formulas O149, Formulas O150, Formulas O151, Formulas O152, Formulas O153, Formulas O154, Formulas O155, Formulas O156, Formulas O157, Formulas O158, Formulas O159, Formulas O160, Formulas O161, Formulas O162, Formulas O16 3, Formulas O164, Formulas O165, Formulas O166, Formulas O167, Formulas O168, Formulas O169, Formulas O170, Formulas O171, Formulas O172, Formulas O173, Formulas O174, Formulas O175, Formulas O176, Formulas O177, Formulas O178, Formulas O179, O180, Formulas O181 , Formulas O182, Formulas O183, Formulas O184, Formulas O185, Formulas O186, Formulas O187.

В другом аспекте, где сахарид, полученный из K. pneumoniae, конъюгирован с белком-носителем; и сахарид, полученный из E. coli, конъюгирован с белком-носителем.In another aspect, wherein the saccharide derived from K. pneumoniae is conjugated to a carrier protein; and a saccharide derived from E. coli is conjugated to a carrier protein.

В другом варианте осуществления изобретение предлагает композицию, содержащую, по меньшей мере, один сахарид, полученный из любого одного K. pneumoniae, выбранный из группы, состоящей из О1, О2, О3 и О5; и, по меньшей мере, один сахарид, имеющий структуру, выбранную из Формулы O1, Формулы O1A, Формулы O1B, Формулы O1C, Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4, Формулы O4:K52, Формулы O4:K6, Формулы O5, Формулы O5ab, Формулы O5ac, Формулы O6, Формулы O6:K2; K13; K15, Формулы O6:K54, Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B, Формулы O18B1, Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23, Формулы O23A, Формулы O24, Формулы O25, Формулы O25a, Формулы O25b, Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45, Формулы O45, Формулы O45rel, Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы 62D₁, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73, Формулы O73, Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186, Формулы O187.In another embodiment, the invention provides a composition comprising at least one saccharide derived from any one K. pneumoniae selected from the group consisting of O1, O2, O3 and O5; and at least one saccharide having a structure selected from Formula O1, Formula O1A, Formula O1B, Formula O1C, Formula O2, Formula O3, Formula O4, Formula O4:K52, Formula O4:K6, Formula O5, Formula O5ab , Formulas O5ac, Formulas O6, Formulas O6:K2; K13; K15, Formulas O6:K54, Formulas O7, Formulas O8, Formulas O9, Formulas O10, Formulas O11, Formulas O12, Formulas O13, Formulas O14, Formulas O15, Formulas O16, Formulas O17, Formulas O18, Formulas O18A, Formulas O18ac, Formulas O18A1, Formulas O18B, Formulas O18B1, Formulas O19, Formulas O20, Formulas O21, Formulas O22, Formulas O23, Formulas O23A, Formulas O24, Formulas O25, Formulas O25a, Formulas O25b, Formulas O26, Formulas O27, Formulas O28, Formulas O29 , Formulas O30, Formulas O32, Formulas O33, Formulas O34, Formulas O35, Formulas O36, Formulas O37, Formulas O38, Formulas O39, Formulas O40, Formulas O41, Formulas O42, Formulas O43, Formulas O44, Formulas O45, Formulas O45, Formulas O45rel , Formulas O46, Formulas O48, Formulas O49, Formulas O50, Formulas O51, Formulas O52, Formulas O53, Formulas O54, Formulas O55, Formulas O56, Formulas O57, Formulas O58, Formulas O59, Formulas O60, Formulas O61, Formulas O62, Formulas 62D ₁ , Formulas O63, Formulas O64, Formulas O65, Formulas O66, Formulas O68, Formulas O69, Formulas O70, Formulas O71, Formulas O73, Formulas O73, Formulas O74, Formulas O75, Formulas O76, Formulas O77, Formulas O78, Formulas O79 , Formulas O80, Formulas O81, Formulas O82, Formulas O83, Formulas O84, Formulas O85, Formulas O86, Formulas O87, Formulas O88, Formulas O89, Formulas O90, Formulas O91, Formulas O92, Formulas O93, Formulas O95, Formulas O96, Formulas O97, Formulas O98, Formulas O99, Formulas O100, Formulas O101, Formulas O102, Formulas O103, Formulas O104, Formulas O105, Formulas O106, Formulas O107, Formulas O108, Formulas O109, Formulas O110, Formulas 0111, Formulas O112, Formulas O113, Formulas O114, Formulas O115, Formulas O116, Formulas O117, Formulas O118, Formulas O119, Formulas O120, Formulas O121, Formulas O123, Formulas O124, Formulas O126, Formulas O127, Formulas O128, Formulas O129, O130, Formulas O131 , Formulas O132, Formulas O133, Formulas O134, Formulas O135, Formulas O136, Formulas O137, Formulas O138, Formulas O139, Formulas O140, Formulas O141, Formulas O142, Formulas O143, Formulas O144, Formulas O145, Formulas O146, Formulas O147, Formulas O148, Formulas O149, Formulas O150, Formulas O151, Formulas O152, Formulas O153, Formulas O154, Formulas O155, Formulas O156, Formulas O157, Formulas O158, Formulas O159, Formulas O160, Formulas O161, Formulas O162, Formulas O16 3, Formulas O164, Formulas O165, Formulas O166, Formulas O167, Formulas O168, Formulas O169, Formulas O170, Formulas O171, Formulas O172, Formulas O173, Formulas O174, Formulas O175, Formulas O176, Formulas O177, Formulas O178, Formulas O179, O180, Formulas O181 , Formulas O182, Formulas O183, Formulas O184, Formulas O185, Formulas O186, Formulas O187.

В одном аспекте, композиция дополнительно содержит полипептид, полученный из FimH, или его фрагмент. В другом аспекте, сахарид E. coli содержит Формулу O8. В другом аспекте, сахарид E. coli содержит Формулу O9.In one aspect, the composition further comprises a FimH-derived polypeptide or fragment thereof. In another aspect, the E. coli saccharide contains Formula O8. In another aspect, the E. coli saccharide contains Formula O9.

В другом варианте осуществления, изобретение относится к способу индукции иммунного ответа против Escherichia coli у млекопитающего, включающему введение млекопитающему эффективного количества композиции по любому из приведенных выше вариантов осуществления и их аспектов.In another embodiment, the invention relates to a method of inducing an immune response against Escherichia coli in a mammal, comprising administering to the mammal an effective amount of a composition according to any of the above embodiments and aspects thereof.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу индукции иммунного ответа против Klebsiella pneumoniae у млекопитающего, включающему введение млекопитающему эффективного количества композиции по любому из приведенных выше вариантов осуществления и их аспектов.In another embodiment, the invention relates to a method of inducing an immune response against Klebsiella pneumoniae in a mammal, comprising administering to the mammal an effective amount of a composition according to any of the above embodiments and aspects thereof.

В одном аспекте, изобретение относится к рекомбинантной клетке млекопитающего, включающей полинуклеотид, кодирующий полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид кодирует полипептид, полученный из фимбриального полипептида H (fimH) E. coli или его фрагмента. В некоторых вариантах осуществления, полипептид, полученный из FimH E. coli, или его фрагмент включает остаток фенилаланина на N-конце полипептида.In one aspect, the invention relates to a recombinant mammalian cell comprising a polynucleotide encoding a polypeptide derived from E. coli , or a fragment thereof. In some embodiments, the polynucleotide encodes a polypeptide derived from E. coli fimbrial polypeptide H (fimH) or a fragment thereof. In some embodiments, the E. coli FimH-derived polypeptide, or fragment thereof, includes a phenylalanine residue at the N-terminus of the polypeptide.

В одном аспекте, изобретение относится к способу получения полипептида, полученного из E.coli, или его фрагмента в рекомбинантной клетке млекопитающего. Способ включает культивирование рекомбинантной клетки млекопитающего в подходящих условиях, тем самым экспрессируя полипептид или его фрагмент; и сбор полипептида или его фрагмента. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает очистку полипептида или его фрагмента. В некоторых вариантах осуществления, выход полипептида составляет, по меньшей мере, 0,05 г/л. В некоторых вариантах осуществления, выход полипептида составляет, по меньшей мере, 0,10 г/л.In one aspect, the invention relates to a method for producing a polypeptide derived from E. coli , or a fragment thereof, in a recombinant mammalian cell. The method includes culturing a recombinant mammalian cell under suitable conditions, thereby expressing the polypeptide or fragment thereof; and collecting the polypeptide or fragment thereof. In some embodiments, the method further includes purifying the polypeptide or fragment thereof. In some embodiments, the polypeptide yield is at least 0.05 g/L. In some embodiments, the polypeptide yield is at least 0.10 g/L.

В одном аспекте, изобретение относится к композиции, включающей полипептид, имеющий, по меньшей мере, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% идентичность с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 29 или любой их комбинацией.In one aspect, the invention provides a composition comprising a polypeptide having at least 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% , 98%, 99% or 99.9% identity with SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29 or any combination thereof.

В другом аспекте, изобретение относится к композиции, которая включает полипептид, содержащий, по меньшей мере, n последовательных аминокислот из любой из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 29, где n равно 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 и более). В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно включает сахарид, выбранный из любой Формулы в Таблице 1, предпочтительно, Формулы O1A, Формулы O1B, Формулы O2, Формулы O6 и Формулы O25B, где n представляет собой целое число от 1 до 100, предпочтительно, от 31 до 100.In another aspect, the invention provides a composition that includes a polypeptide comprising at least n consecutive amino acids from any of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29, where n is 7 or more (for example, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 and more). In some embodiments, the composition further includes a saccharide selected from any Formula in Table 1, preferably Formula O1A, Formula O1B, Formula O2, Formula O6 and Formula O25B, where n is an integer from 1 to 100, preferably from 31 to 100.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

На ФИГ. 1А-1Н изображены аминокислотные последовательности, включая аминокислотные последовательности для типовых полипептидов, полученных из E. coli или их фрагментов; и аминокислотные последовательности для типовых последовательностей wzzB.In FIG. 1A-1H depict amino acid sequences, including amino acid sequences for exemplary polypeptides derived from E. coli or fragments thereof; and amino acid sequences for generic wzzB sequences.

На ФИГ. 2A-2T изображены карты типовых векторов экспрессии.In FIG. 2A-2T depict maps of typical expression vectors.

На ФИГ. 3 показаны результаты экспрессии и очистки.In FIG. Figure 3 shows the expression and purification results.

На ФИГ. 4 показаны результаты экспрессии и очистки.In FIG. Figure 4 shows the expression and purification results.

На ФИГ. 5 показаны результаты экспрессии.In FIG. Figure 5 shows the expression results.

На ФИГ. 6A-6C показаны пулы SEC pSB02083 и pSB02158 и аффинности; включая выходы.In FIG. 6A-6C show pSB02083 and pSB02158 SEC pools and affinities; including exits.

На ФИГ. 7 показаны результаты экспрессии мутантной конструкции pSB2198 FimH dscG Lock.In FIG. Figure 7 shows the results of expression of the pSB2198 FimH dscG Lock mutant construct.

На ФИГ. 8 показаны результаты экспрессии pSB2307 FimH dscG дикого типа.In FIG. Figure 8 shows the expression results of wild-type pSB2307 FimH dscG.

На ФИГ. 9А-9С показаны структуры О-антигенов, синтезированных полимеразно-зависимым путем с четырьмя или менее остатками в остове.In FIG. 9A-9C show the structures of O-antigens synthesized in a polymerase-dependent manner with four or fewer backbone residues.

На ФИГ. 10А-10В: на ФИГ. 10А показаны структуры О-антигенов, синтезируемых полимеразно-зависимым путем с пятью или шестью остатками в остове; на ФИГ. 10В показаны О-антигены, которые, как предполагается, синтезируются с помощью ABC-транспортер-зависимого пути.In FIG. 10A-10B: in FIG. 10A shows the structures of O-antigens synthesized in a polymerase-dependent pathway with five or six residues in the backbone; in FIG. 10B shows O-antigens that are believed to be synthesized by the ABC transporter-dependent pathway.

На ФИГ. 11 показано компьютерное сканирование мутагенеза Phe1 с другими аминокислотами, имеющими алифатические гидрофобные боковые цепи, например, Ile, Leu и Val, которые могут стабилизировать белок FimH и обеспечить связывание маннозы.In FIG. Figure 11 shows computer scan mutagenesis of Phe1 with other amino acids having aliphatic hydrophobic side chains, such as Ile, Leu and Val, which can stabilize the FimH protein and mediate mannose binding.

На ФИГ. 12A-12B показаны плазмиды: плазмида репликона pUC, 500-700x копий на клетку, регулятор длины цепи (ФИГ. 12A); и плазмида репликона Р15а, 10-12х копий на клетку, О-антигенный оперон (ФИГ. 12В).In FIG. 12A - 12B show plasmids: pUC replicon plasmid, 500-700x copies per cell, chain length regulator ( FIG. 12A) ; and replicon plasmid P15a, 10-12x copies per cell, O-antigen operon ( FIG. 12B) .

На ФИГ. 13A-13B показана модуляция длины цепи О-антигена в штаммах серотипов O25a и O25b посредством экспрессии на основе плазмид гетерологичных регуляторов длины цепи wzzB и fepE. Показана генетическая комплементация экспрессии LPS в плазмидных трансформантах нокаутных штаммов wzzB O25K5H1 (O25a) и GAR2401 (O25b). На левой стороне ФИГ. 13A показаны профили LPS плазмидных трансформантов O25a O25K5HΔwzzB; и справа аналогичные профили трансформантов O25b GAR 2401ΔwzzB. Иммуноблот репликата геля, зондированного O25-специфической сывороткой (Statens Serum Institut), показан на ФИГ. 13В. O25a Δ wxxB (нокаут) фон, связанный с дорожками 1-7; O25b 2401 ΔwzzB (нокаут) фон, связанный с дорожками 8-15.In FIG. 13A-13B show modulation of O-antigen chain length in serotype O25a and O25b strains through plasmid-based expression of the heterologous chain length regulators wzzB and fepE. Genetic complementation of LPS expression in plasmid transformants of the wzzB knockout strains O25K5H1 (O25a) and GAR2401 (O25b) was demonstrated. On the left side of FIG. 13A shows the LPS profiles of plasmid transformants O25a O25K5HΔwzzB; and on the right are similar profiles of O25b GAR 2401ΔwzzB transformants. An immunoblot of a replicate gel probed with O25-specific serum (Statens Serum Institut) is shown in FIG. 13V. O25a Δ wxxB (knockout) background associated with lanes 1–7; O25b 2401 Δ wzzB (knockout) background associated with tracks 8-15.

На ФИГ. 14 показана экспрессия длинноцепочечного О-антигена, обеспечиваемая плазмидами E. coli и Salmonella fepE в организме хозяина O25K5H1ΔwzzB.In FIG. 14 shows long chain O antigen expression mediated by E. coli and Salmonella fepE plasmids in the O25K5H1ΔwzzB host.

На ФИГ. 15 показано, что экспрессия Salmonella fepE генерирует LPD длинного О-антигена в различных клинических изолятах.In FIG. 15 shows that expression of Salmonella fepE generates long O antigen LPD in various clinical isolates.

На ФИГ. 16A-16B изображена опосредованная плазмидой индуцируемая арабинозой экспрессия O25b длинного O-антигена LPS в штамме-хозяине с нокаутом O25b O-антигена. Результаты SPS PAGE показаны на ФИГ. 16A, и результаты иммуноблота O25 показаны на ФИГ. 16B, где дорожка 1 соответствует клону 1, без арабинозы; дорожка 2 соответствует клону 1, 0,2% арабинозы; дорожка 3 соответствует клону 9, без арабинозы; дорожка 4 соответствует клону 9, 0,2% арабинозы; дорожка 5 соответствует стандарту O55 E. coli LPS; и дорожка 6 соответствует стандарту O111 E. coli LPS, как на ФИГ. 16А и на ФИГ. 16В. In FIG. 16A-16B depict plasmid-mediated arabinose-inducible expression of the O25b long O antigen of LPS in an O25b O antigen knockout host strain. The SPS PAGE results are shown in FIG. 16A , and the O25 immunoblot results are shown in FIG. 16B , where lane 1 corresponds to clone 1, without arabinose; lane 2 corresponds to clone 1, 0.2% arabinose; lane 3 corresponds to clone 9, without arabinose; Lane 4 corresponds to clone 9, 0.2% arabinose; Lane 5 is O55 E. coli LPS; and lane 6 corresponds to the O111 E. coli LPS standard as in FIG. 16A and FIG. 16V.

На ФИГ. 17 показана опосредованная плазмидой индуцируемая арабинозой экспрессия LPS длинного О-антигена в обычном штамме-хозяине.In FIG. 17 shows plasmid-mediated arabinose-inducible expression of long O antigen LPS in a common host strain.

На ФИГ. 18 показана экспрессия LPS О25 О-антигена в штаммах Exploratory Bioprocess.In FIG. 18 shows the expression of LPS O25 O-antigen in Exploratory Bioprocess strains.

На ФИГ. 19A-19B показаны профили SEC и свойства короткого (ФИГ. 19A, штамм 1 O25b wt 2831) и длинного O25b O-антигенов (ФИГ. 19B, штамм 2 O25b 2401Δ wzzB /LT2 FepE), очищенных от штаммов GAR2831 и '2401ΔwzzB/ fepE.In FIG. 19A-19B show SEC profiles and properties of short ( FIG. 19A , strain 1 O25b wt 2831) and long O25b O-antigens ( FIG. 19B , strain 2 O25b 2401Δ wzzB /LT2 FepE) purified from strains GAR2831 and '2401ΔwzzB/fepE .

На ФИГ. 20A-20B показаны схемы вакцинации кроликов: (ФИГ. 20A) информация относительно схемы вакцинации для исследования кроликов 1 VAC-2017-PRL-EC-0723; (ФИГ. 20B) схема вакцинации для исследования на кроликах 2 VAC-2018-PRL-EC-077.In FIG. 20A-20B show vaccination schedules for rabbits: ( FIG. 20A ) information regarding the vaccination schedule for rabbit study 1 VAC-2017-PRL-EC-0723; ( FIG. 20B ) Vaccination schedule for rabbit study 2 VAC-2018-PRL-EC-077.

На ФИГ. 21A-21C показаны ответы IgG гликоконъюгата O25b, где -●- означает результаты перед сбором крови; -■- сбор крови 1 (6 недель); -▲- сбор крови 2 (8 недель); -♦- сбор крови 3 (12 недель). На ФИГ. 21А показаны результаты для кролика 1-3 (средняя активация); На ФИГ. 21B показаны результаты для кролика 2-3 (низкая активация); На ФИГ. 21C показаны результаты для кролика 3-1 (высокая активация).In FIG. 21A-21C show the O25b glycoconjugate IgG responses, where -●- indicates the results before blood collection; -■- blood collection 1 (6 weeks); -▲- blood collection 2 (8 weeks); -♦- blood collection 3 (12 weeks). In FIG. 21A shows the results for rabbits 1-3 (medium activation); In FIG. 21B shows results for rabbit 2-3 (low activation); In FIG. 21C shows the results for rabbit 3-1 (high activation).

На ФИГ. 22A-22F показаны IgG-ответы на гликоконъюгат O25b длинного O-антигена, т. е. конъюгат O25b-CRM₁₉₇ с низкой активацией (ФИГ. 22D - 22F, где -●- означает результаты предварительного отбора крови от кролика 2-1, -■- 12-я неделя антисыворотки от кролика 2-1) по сравнению с неконъюгированным полисахаридом, т.е. свободным полисахаридом O25b (ФИГ. 22A-22C, где -●- означает результаты предварительного отбора крови от кролика A-1, -■- антисыворотка на 6 неделе от кролика A-1, -▲- антисыворотка на 8 неделе от кролика A-1). Обратите внимание, что MFI нанесены на график в логарифмической шкале, чтобы выделить различия между предиммунными и иммунными антителами в диапазоне <1000 MFI. На ФИГ. 22А показаны результаты для кролика А-1 (неконъюгированный поли); на ФИГ. 22В показаны результаты для кролика А-3 (неконъюгированный поли); на ФИГ. 22С показаны результаты для кролика А-4 (неконъюгированный поли); на ФИГ. 22D показаны результаты для кролика 2-1 (низкая активация); на ФИГ. 22E показаны результаты для кролика 2-2 (низкая активация); и на ФИГ. 22F показаны результаты для кролика 2-3 (низкая активация).In FIG. 22A-22F show IgG responses to the O25b glycoconjugate of the long O antigen, i.e., the low activation O25b-CRM ₁₉₇ conjugate ( FIGS. 22D - 22F , where -●- indicates the results of pre-blood sampling from rabbit 2-1, - ■- 12th week of antiserum from rabbit 2-1) compared to unconjugated polysaccharide, i.e. free polysaccharide O25b ( FIGS. 22A-22C , where -●- means the results of preliminary blood collection from rabbit A-1, -■- week 6 antiserum from rabbit A-1, -▲- week 8 antiserum from rabbit A-1 ). Note that MFIs are plotted on a logarithmic scale to highlight differences between preimmune and immune antibodies in the <1000 MFI range. In FIG. 22A shows results for rabbit A-1 (unconjugated poly); in FIG. 22B shows the results for rabbit A-3 (unconjugated poly); in FIG. 22C shows results for rabbit A-4 (unconjugated poly); in FIG. 22D shows results for rabbit 2-1 (low activation); in FIG. 22E shows results for rabbit 2-2 (low activation); and in FIG. 22F shows the results for rabbit 2-3 (low activation).

На ФИГ. 23A-23C показана поверхностная экспрессия нативного O-антигена по сравнению с длинным O25b O-антигеном, обнаруженным с помощью антисыворотки O25b. На ФИГ. 23A показаны результаты, где -●- означает результаты сравнения O25b 2831 с PD3 антисывороткой; -■- представляет результаты O25b 2831 wt по сравнению с перед сбором крови; -▲- представляет результаты исследования O25b 2831/fepE по сравнению с PD3 антисывороткой; -▼- представляет результаты O25b 2831/fepE по сравнению с перед сбором крови. На ФИГ. 23B показаны результаты, где -●- представляет результаты O25b 2401 по сравнению с PD3 антисывороткой; -■- представляет результаты O25b 2401 по сравнению с перед сбором крови; -▲- представляет результаты O25b 2401/fepE по сравнению с PD3 антисывороткой; -▼- представляет результаты O25b 2401/fepE по сравнению с перед сбором крови. На ФИГ. 23C показаны результаты, где -●- представляет результаты E. coli K12 по сравнению с PD3 антисывороткой; и -■- представляет результаты E. coli K12 по сравнению с перед сбором крови.In FIG. 23A-23C show surface expression of the native O antigen compared to the long O25b O antigen detected with the O25b antiserum. In FIG. 23A shows the results, where -●- means the results of comparing O25b 2831 with PD3 antiserum; -■- presents the results of O25b 2831 wt compared to before blood collection; -▲- represents the results of the O25b 2831/fepE study compared with PD3 antiserum; -▼- represents O25b 2831/fepE results compared to before blood collection. In FIG. 23B shows the results, where -●- represents the results of O25b 2401 compared to PD3 antiserum; -■- presents the results of O25b 2401 compared to before blood collection; -▲- represents the results of O25b 2401/fepE compared with PD3 antiserum; -▼- represents O25b 2401/fepE results compared to before blood collection. In FIG. 23C shows the results, where -●- represents the results of E. coli K12 compared to PD3 antiserum; and -■- represents E. coli K12 results compared to before blood collection.

На ФИГ. 24 представлены обобщенные структуры углеводного остова олигосахаридов внешнего ядра пяти известных хемотипов. Все глюкозы находятся в α-аномерной конфигурации, если не указано иное. Гены, продукты которых катализируют образование каждой связи, указаны пунктирными стрелками. Звездочкой обозначен остаток корового олигосахарида, к которому происходит присоединение О-антигена.In FIG. Figure 24 shows the generalized structures of the carbohydrate backbone of the outer core oligosaccharides of five known chemotypes. All glucoses are in the α-anomeric configuration unless otherwise noted. The genes whose products catalyze the formation of each bond are indicated by dotted arrows. The asterisk indicates the residue of the core oligosaccharide to which the O-antigen attaches.

На ФИГ. 25 показано, что неконъюгированный свободный полисахарид O25b не является иммуногенным (dLIA), где -●- представляет результаты недели 18 (1 нед=PD4) с антисывороткой из 4-1; -■- представляет результаты недели 18 (1 нед=PD4) с антисывороткой из 4-2; -▲- представляет результаты недели 18 (1 нед=PD4) с антисывороткой из 5-1; -▼- представляет результаты недели 18 (1 нед=PD4) с антисывороткой из 5-2; -*- представляет результаты недели 18 (1 нед=PD4) с антисывороткой из 6-1; -- представляет результаты недели 18 (1 нед=PD4) с антисывороткой из 6-2.In FIG. 25 shows that the unconjugated free polysaccharide O25b is not immunogenic (dLIA), where -●- represents the results of week 18 (1 week=PD4) with antiserum from 4-1; -■- represents the results of week 18 (1 week=PD4) with antiserum from 4-2; -▲- represents the results of week 18 (1 week=PD4) with antiserum from 5-1; -▼- represents results from week 18 (1 week=PD4) with antiserum from 5-2; -*- represents results from week 18 (1 week=PD4) with antiserum from 6-1; - - represents the results of week 18 (1 week=PD4) with antiserum from 6-2.

На ФИГ. 26A-26C представлены графики, иллюстрирующие специфичность титров OPA конъюгированных иммунных сывороток BRC Rabbit O25b RAC. На ФИГ. 26A показаны титры OPA в сыворотке кролика 2-3 до иммунизации (-●-) и в сыворотке после иммунизации через 13 недель (-■-). На ФИГ. 26B показаны титры OPA в сыворотке кролика 1-2 до иммунизации (-●-) и сыворотке после иммунизации через 19 недель (-■-). На ФИГ. 26C показана специфичность титра OPA кролика 1-2 через 19 недель, при котором активность OPA иммунной сыворотки кролика 1-2 блокируется предварительной инкубацией со 100 мкг/мл очищенного неконъюгированного O25b длинного полисахарида O-антигена, где -■- представляет результаты для иммунной сыворотки кролика 1-2, неделя 19; и -▼- представляет результаты для кролика 1-2, неделя 19 w/R1 Long-OAg.In FIG. 26A-26C are graphs illustrating the specificity of OPA titers of BRC Rabbit O25b RAC conjugated immune sera. In FIG. 26A shows OPA titers in rabbit serum 2-3 before immunization (-●-) and in serum after immunization 13 weeks later (-■-). In FIG. 26B shows OPA titers in rabbit 1-2 serum before immunization (-●-) and serum after immunization at 19 weeks (-■-). In FIG. 26C shows the specificity of the OPA titer of rabbit 1-2 at 19 weeks, in which the OPA activity of rabbit immune serum 1-2 is blocked by preincubation with 100 μg/ml purified unconjugated O25b long O-antigen polysaccharide, where -■- represents the results for rabbit immune serum 1-2, week 19; and -▼- represents the results for rabbit 1-2, week 19 w/R1 Long-OAg.

На ФИГ. 27А-27С на ФИГ. 27A представлена иллюстрация типовой схемы введения. На ФИГ. 27В и ФИГ. 27C представлены графики, изображающие уровни O-антигена O25b IgG, индуцированные неконъюгированным полисахаридом O25b длинного O-антигена (ФИГ. 27B, O25b Free Poly (2 мкг)) и полученного гликоконъюгата O25b RAC/DMSO длинного O-антигена (ФИГ. 27C, O25b-CRM₁₉₇ RAC Long (2 мкг)), где -… - (пунктирная линия) представляет уровень наивного CD1 O25b IgG.In FIG. 27A-27C in FIG. 27A is an illustration of a typical administration pattern. In FIG. 27B and FIG. 27C are graphs depicting O25b IgG O-antigen levels induced by unconjugated O25b long O-antigen polysaccharide ( FIG. 27B , O25b Free Poly (2 μg)) and the resulting O25b RAC/DMSO long O-antigen glycoconjugate ( FIG. 27C , O25b -CRM ₁₉₇ RAC Long (2 μg)), where -… - (dashed line) represents the level of naïve CD1 O25b IgG.

На ФИГ. 28A-28B представлены графики, показывающие OPA иммуногенность RAC, длинных гликоконъюгатов eTEC O25b и гликоконъюгатов с одним концом после введения дозы 2 (ФИГ. 28A) и после введения дозы 3 (ФИГ. 28B), где -○- представляет результаты для короткого гликоконъюгата с одним концом 2 мкг; -●- одноконцевой длинный 2 мкг; -▲- RAC/ДМСО длинный 2 мкг; -▼- eTEC длинный 2 мкг; * Фоновый контроль (n=20). Показатели пациентов, ответивших на лечение, представляют собой % мышей с титрами >2х от исходного уровня до вакцинации.In FIG. 28A-28B are graphs showing the OPA immunogenicity of RAC, long eTEC O25b glycoconjugates, and single-end glycoconjugates after dose 2 ( FIG. 28A) and after dose 3 ( FIG. 28B) , where -○- represents the results for the short glycoconjugate with one end 2 mcg; -●- single-terminal long 2 μg; -▲- RAC/DMSO long 2 µg; -▼- eTEC long 2 µg; * Background control (n=20). Responder rates represent the % of mice with titers >2x baseline before vaccination.

На ФИГ. 29 представлен график, показывающий иммуногенность ОРА химического состава eTEC и измененные уровни активации полисахарида. Показатели пациентов, ответивших на лечение, представляют собой % мышей с титрами >2х от исходного уровня до вакцинации.In FIG. 29 is a graph showing the OPA immunogenicity of eTEC chemistry and the altered polysaccharide activation levels. Responder rates represent the % of mice with titers >2x baseline before vaccination.

На ФИГ. 30A-30B показана типовая схема введения (ФИГ. 30A); и график, изображающий защиту мышей, иммунизированных дозами конъюгатов eTEC E. coli, от летального заражения изолятом O25b (ФИГ. 30B), где -◊- представляет активацию eTEC с длинной цепью 17%; -Δ- eTEC представляет 10% активацию длинной цепи; -∇- представляет активацию eTEC с длинной цепью 4%; -□- представляет собой полисахарид O25b; -○- представляет собой невакцинированные контроли.In FIG. 30A-30B show a typical administration regimen ( FIG. 30A) ; and a graph depicting the protection of mice immunized with doses of E. coli eTEC conjugates against lethal challenge with isolate O25b ( FIG. 30B) , where -◊- represents 17% long-chain eTEC activation; -Δ- eTEC represents 10% long chain activation; -∇- represents 4% long-chain eTEC activation; -□- is a polysaccharide O25b; -○- represents unvaccinated controls.

На ФИГ. 31 представлена схема, иллюстрирующая пример получения конъюгатов с одним концом, где процесс конъюгации включает селективную активацию 2-кето-3-дезоксиоктановой кислоты (KDO) дисульфид-аминовым линкером при демаскировании тиоловой функциональной группы. Затем KDO конъюгируют с активированным бромом белком CRM ₁₉₇, как показано на ФИГ. 31 (Получение односторонних конъюгатов).In FIG. 31 is a diagram illustrating an example of the preparation of single-end conjugates where the conjugation process involves selective activation of 2-keto-3-deoxyoctanoic acid (KDO) with a disulfide-amine linker while unmasking the thiol functionality. KDO is then conjugated to bromine activated protein CRM ₁₉₇ as shown in FIG. 31 (Preparation of one-way conjugates).

На ФИГ. 32A-32B представлена типовая блок-схема процессов активации (ФИГ. 32A) и конъюгации (ФИГ. 32B), используемых при получении гликоконъюгата E. coli с CRM₁₉₇.In FIG. 32A-32B show a typical flow diagram of the activation ( FIG. 32A ) and conjugation ( FIG. 32B) processes used to prepare an E. coli glycoconjugate with CRM ₁₉₇ .

На ФИГ. 33 изображены структуры повторяющейся единицы (RU) полиманнановых О-антигенов E.coli и K.pneumoniae. Условные обозначения: тримерные E. coli O8 и K. pneumoniae O5 идентичны, как и терамерные E. coli O9A/ K. pneumoniae O3a и пентамерные E. coli O9/ K. pneumoniae O3. Дифференциация подтипов O3 K. pneumoniae на уровне биосинтетических ферментных последовательностей описана в Guachalla LM et al. (Scientific Reports 2017; 7:6635). In FIG. 33 depicts the structures of the repeat unit (RU) of the polymannan O-antigens of E. coli and K. pneumoniae. Legend: trimeric E. coli O8 and K. pneumoniae O5 are identical, as are terameric E. coli O9A/ K. pneumoniae O3a and pentameric E. coli O9/ K. pneumoniae O3. Differentiation of K. pneumoniae O3 subtypes at the level of biosynthetic enzyme sequences is described in Guachalla LM et al. ( Scientific Reports 2017;7:6635).

На ФИГ. 34A-34B показана иммунная сыворотка E. coli серотипа O8, обладающая бактерицидным действием против инвазивных штаммов K. pneumoniae серотипа O5. Условные обозначения: иммунную сыворотку кролика, индуцированную конъюгатом E.coli серотипа O8-антиген CRM₁₉₇, оценивают в бактерицидных анализах со штаммом E.coli O8 (ФИГ. 34A) и штаммом K. pneumoniae O5 (ФИГ. 34B). Сильная опсонофагоцитарная активность (OPA) против штамма E. coli O8 наблюдалась после двух доз вакцины (неделя 15), которая отсутствовала после предварительной адсорбции с неконъюгированным полисахаридом O8 (O8-OAg) или с подобранной предиммунизированной сывороткой (неделя 0). Та же иммунная сыворотка кролика показала антигенспецифическую бактерицидную активность сыворотки (SBA) против штамма K. pneumoniae O5. BRC - комплемент крольчат, hC - обедненная IgG/IgM сыворотка человека в качестве источника комплемента.In FIG. 34A-34B show E. coli serotype O8 immune serum that is bactericidal against invasive strains of K. pneumoniae serotype O5. Legend: Rabbit immune serum induced by E. coli serotype O8-CRM ₁₉₇ antigen conjugate was evaluated in bactericidal assays with E. coli strain O8 ( FIG. 34A ) and K. pneumoniae strain O5 ( FIG. 34B ). Strong opsonophagocytic activity (OPA) against E. coli O8 strain was observed after two doses of vaccine (week 15), which was absent after preadsorption with unconjugated O8 polysaccharide (O8-OAg) or with matched preimmunization serum (week 0). The same rabbit immune serum showed serum antigen-specific bactericidal activity (SBA) against K. pneumoniae strain O5. BRC - rabbit complement, hC - depleted IgG/IgM human serum as a source of complement.

На ФИГ. 35A-35 изображена иммунная сыворотка E. coli серотипа O9 О-антигена, обладающая бактерицидным действием против инвазивного изолята K. pneumoniae O3. Условные обозначения: Иммунную сыворотку кролика, полученную с помощью конъюгата E. coli серотипа O9a O-антигена CRM₁₉₇, оценивают в анализе опсонофагоцитов (OPA) со штаммом E. coli O9a (ФИГ. 35A) и штаммом K. pneumoniae O3b (ФИГ. 35B). Активность OPA против штамма E. coli O9 наблюдалась после введения двух доз вакцины (15 неделя), которая отсутствовала после предварительной адсорбции с неконъюгированным полисахаридом O9 (O9-OAg) или с подобранной предиммунизированной сывороткой (0 неделя). Та же иммунная сыворотка кролика также показала мощную антигенспецифическую бактерицидную активность сыворотки (SBA) против штамма K. pneumoniae O3b. BRC, комплемент для крольчат; hC, обедненная IgG/IgM сыворотка человека, используемая в качестве источника комплемента.On FIG. 35A-35 immune serum is shown E. coliserotype O9 O-antigen, which has a bactericidal effect against the invasive isolate K. pneumoniae O3. Legend: Immune rabbit serum obtained using a conjugate E. coliserotype O9a O-antigen CRM₁₉₇, assessed in the opsonophagocyte assay (OPA) with strain E. coliO9a (FIG. 35A) and strain K. pneumoniaeO3b (FIG. 35B). OPA activity against strain E. coliO9 was observed after two doses of vaccine (week 15), which was absent after pre-adsorption with unconjugated O9 polysaccharide (O9-OAg) or with matched preimmune serum (week 0). The same rabbit immune serum also showed potent antigen-specific serum bactericidal activity (SBA) against strain K. pneumoniae O3b. BRC, rabbit complement; hC, IgG/IgM-depleted human serum used as a source of complement.

ИДЕНТИФИКАТОРЫ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИSEQUENCE IDENTIFIERS

SEQ ID NO: 1 представляет аминокислотную последовательность D-манноза-специфичного адгезина фимбрии 1 дикого типа [Escherichia coli FimH J96].SEQ ID NO: 1 represents the amino acid sequence of wild-type D-mannose-specific fimbria adhesin 1 [Escherichia coli FimH J96].

SEQ ID NO: 2 представляет собой аминокислотную последовательность фрагмента FimH, соответствующую остаткам 22-300 а.к. SEQ ID NO: 1 (зрелый белок FimH).SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of the FimH fragment corresponding to residues 22-300 aa. SEQ ID NO: 1 (FimH mature protein).

SEQ ID NO: 3 представляет аминокислотную последовательность лектинового домена FimH.SEQ ID NO: 3 represents the amino acid sequence of the FimH lectin domain.

SEQ ID NO: 4 представляет аминокислотную последовательность пилинового домена FimH.SEQ ID NO: 4 represents the amino acid sequence of the pilin domain of FimH.

SEQ ID NO: 5 представляет аминокислотную последовательность полипептида, полученного из E. coli FimH (pSB02198 - FimH mIgK сигнальный пептид/F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S N249Q/7 АК линкер/FimG A1..K14/ GGHis8 в pcDNA3.1(+))SEQ ID NO: 5 represents the amino acid sequence of the polypeptide derived from E. coli FimH (pSB02198 - FimH mIgK signal peptide/F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S N249Q/7 AK linker/FimG A1..K14/GGHis8 in pcDNA3. 1(+))

SEQ ID NO: 6 представляет аминокислотную последовательность полипептида, полученного из E. coli FimH (pSB02307 - FimH mIgK signal pept/F22..Q300 J96 FimH N28S N91S N249Q/His8 в pcDNA3.1(+))SEQ ID NO: 6 represents the amino acid sequence of the polypeptide derived from E. coli FimH (pSB02307 - FimH mIgK signal pept/F22..Q300 J96 FimH N28S N91S N249Q/His8 in pcDNA3.1(+))

SEQ ID NO: 7 представляет аминокислотную последовательность фрагмента полипептида, полученного из FimH E. coli (конструкция pSB02083 FimH лектиновый домен дикого типа)SEQ ID NO: 7 represents the amino acid sequence of a polypeptide fragment derived from E. coli FimH (construct pSB02083 FimH wild type lectin domain)

SEQ ID NO: 8 представляет аминокислотную последовательность фрагмента полипептида, полученного из E. coli FimH (pSB02158 FimH замкнутого мутанта лектинового домена).SEQ ID NO: 8 represents the amino acid sequence of a polypeptide fragment derived from E. coli FimH (pSB02158 FimH lectin domain closed mutant).

SEQ ID NO: 9 представляет аминокислотную последовательность фрагмента полипептида, полученного из E. coli FimG (FimG A1..K14).SEQ ID NO: 9 represents the amino acid sequence of a polypeptide fragment derived from E. coli FimG (FimG A1..K14).

SEQ ID NO: 10 представляет аминокислотную последовательность фрагмента полипептида, полученного из E. coli FimC.SEQ ID NO: 10 represents the amino acid sequence of a polypeptide fragment derived from E. coli FimC.

SEQ ID NO: 11 представляет аминокислотную последовательность линкера из 4 а.к.SEQ ID NO: 11 represents the amino acid sequence of the 4 aa linker.

SEQ ID NO: 12 представляет аминокислотную последовательность линкера из 5 а.к.SEQ ID NO: 12 represents the amino acid sequence of the 5 aa linker.

SEQ ID NO: 13 представляет аминокислотную последовательность линкера из 6 а.к.SEQ ID NO: 13 represents the amino acid sequence of the 6 aa linker.

SEQ ID NO: 14 представляет аминокислотную последовательность линкера из 7 а.к.SEQ ID NO: 14 represents the amino acid sequence of the 7 aa linker.

SEQ ID NO: 15 представляет аминокислотную последовательность линкера из 8 а.к.SEQ ID NO: 15 represents the amino acid sequence of the 8 aa linker.

SEQ ID NO: 16 представляет аминокислотную последовательность линкера из 9 а.к.SEQ ID NO: 16 represents the amino acid sequence of the 9 aa linker.

SEQ ID NO: 17 представляет аминокислотную последовательность линкера из 10 а.к.SEQ ID NO: 17 represents the amino acid sequence of the 10 aa linker.

SEQ ID NO: 18 представляет аминокислотную последовательность для сигнальной последовательности FimH J96.SEQ ID NO: 18 represents the amino acid sequence for the FimH J96 signal sequence.

SEQ ID NO: 19 представляет собой аминокислотную последовательность сигнального пептида SEQ ID NO: 5 (pSB02198 - сигнальный пептид FimH mIgK/F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S N249Q/линкер 7 А.К./FimG A1..K14/GGHis8 в pcDNA3.1(+)).SEQ ID NO: 19 is the amino acid sequence of the signal peptide SEQ ID NO: 5 (pSB02198 - signal peptide FimH mIgK/F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S N249Q/linker 7 A.K./FimG A1..K14/GGHis8 in pcDNA3.1(+)).

SEQ ID NO: 20 представляет аминокислотную последовательность полипептида, полученного из E. coli FimH, в соответствии с SEQ ID NO: 5 (зрелый белок pSB02198 - сигнальный белок FimH mIgK/F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S N249Q/линкер 7 А.К./FimG A1..K14/GGHis8 в pcDNA3.1(+)).SEQ ID NO: 20 represents the amino acid sequence of the polypeptide derived from E. coli FimH according to SEQ ID NO: 5 (mature protein pSB02198 - FimH signal protein mIgK/F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S N249Q/7 A linker .K./FimG A1..K14/GGHis8 in pcDNA3.1(+)).

SEQ ID NO: 21 представляет аминокислотную последовательность полипептида, полученного из E. coli FimG.SEQ ID NO: 21 represents the amino acid sequence of a polypeptide derived from E. coli FimG.

SEQ ID NO: 22 представляет аминокислотную последовательность сигнального пептида SEQ ID NO: 6 (pSB02307 - сигнальный пептид FimH mIgK/F22..Q300 J96 FimH N28S N91S N249Q/His8 в pcDNA3.1(+)).SEQ ID NO: 22 represents the amino acid sequence of the signal peptide SEQ ID NO: 6 (pSB02307 - signal peptide FimH mIgK/F22..Q300 J96 FimH N28S N91S N249Q/His8 in pcDNA3.1(+)).

SEQ ID NO: 23 представляет аминокислотную последовательность полипептида, полученного из E. coli FimH, в соответствии с SEQ ID NO: 6 (зрелый белок сигнального белка FimH mIgK/F22..Q300 J96 FimH N28S N91S N249Q/His8 в pcDNA3. 1(+)).SEQ ID NO: 23 represents the amino acid sequence of the polypeptide derived from E. coli FimH, in accordance with SEQ ID NO: 6 (mature signal protein FimH mIgK/F22..Q300 J96 FimH N28S N91S N249Q/His8 in pcDNA3. 1(+ )).

SEQ ID NO: 24 представляет аминокислотную последовательность полипептида, полученного из E. coli FimH, в соответствии с SEQ ID NO: 7 (зрелый белок конструкция pSB02083 лектинового домена FimH дикого типа).SEQ ID NO: 24 represents the amino acid sequence of the E. coli FimH-derived polypeptide according to SEQ ID NO: 7 (wild-type FimH lectin domain mature protein construct pSB02083).

SEQ ID NO: 25 представляет последовательность аминокислот для His-метки.SEQ ID NO: 25 represents the amino acid sequence for the His tag.

SEQ ID NO: 26 представляет аминокислотную последовательность полипептида, полученного из E. coli FimH, в соответствии с SEQ ID NO: 8 (зрелый белок pSB02158 замкнутый мутант лектинового домена FimH).SEQ ID NO: 26 represents the amino acid sequence of the E. coli FimH-derived polypeptide according to SEQ ID NO: 8 (mature protein pSB02158 closed mutant of the FimH lectin domain).

SEQ ID NO: 27 представляет аминокислотную последовательность полипептида, полученного из E. coli FimH (pSB01878).SEQ ID NO: 27 represents the amino acid sequence of a polypeptide derived from E. coli FimH (pSB01878).

SEQ ID NO: 28 представляет аминокислотную последовательность полипептида, полученного из E. coli FimH (K12).SEQ ID NO: 28 represents the amino acid sequence of a polypeptide derived from E. coli FimH (K12).

SEQ ID NO: 29 представляет аминокислотную последовательность полипептида, полученного из E. coli FimH (UTI89).SEQ ID NO: 29 represents the amino acid sequence of a polypeptide derived from E. coli FimH (UTI89).

SEQ ID NO: 30 представляет аминокислотную последовательность O25b 2401 WzzB.SEQ ID NO: 30 represents the amino acid sequence of O25b 2401 WzzB.

SEQ ID NO: 31 представляет аминокислотную последовательность O25a:K5:H1 WzzB.SEQ ID NO: 31 represents the amino acid sequence of O25a:K5:H1 WzzB.

SEQ ID NO: 32 представляет аминокислотную последовательность O25a ETEC ATCC WzzB.SEQ ID NO: 32 represents the amino acid sequence of O25a ETEC ATCC WzzB.

SEQ ID NO: 33 представляет аминокислотную последовательность K12 W3110 WzzB.SEQ ID NO: 33 represents the amino acid sequence of K12 W3110 WzzB.

SEQ ID NO: 34 представляет аминокислотную последовательность WzzB Salmonella LT2.SEQ ID NO: 34 represents the amino acid sequence of Salmonella LT2 WzzB.

SEQ ID NO: 35 представляет аминокислотную последовательность O25b 2401 FepE.SEQ ID NO: 35 represents the amino acid sequence of O25b 2401 FepE.

SEQ ID NO: 36 представляет аминокислотную последовательность O25a:K5:H1 FepE.SEQ ID NO: 36 represents the amino acid sequence of O25a:K5:H1 FepE.

SEQ ID NO: 37 представляет аминокислотную последовательность O25a ETEC ATCC FepE.SEQ ID NO: 37 represents the amino acid sequence of O25a ETEC ATCC FepE.

SEQ ID NO: 38 представляет аминокислотную последовательность O157 FepE.SEQ ID NO: 38 represents the amino acid sequence of O157 FepE.

SEQ ID NO: 39 представляет аминокислотную последовательность FepE Salmonella LT2.SEQ ID NO: 39 represents the amino acid sequence of Salmonella LT2 FepE.

SEQ ID NO: 40 представляет последовательность праймеров для LT2wzzB_S.SEQ ID NO: 40 represents the primer sequence for LT2wzzB_S.

SEQ ID NO: 41 представляет последовательность праймеров для LT2wzzB_AS.SEQ ID NO: 41 represents the primer sequence for LT2wzzB_AS.

SEQ ID NO: 42 представляет последовательность праймеров для O25bFepE_S.SEQ ID NO: 42 represents the primer sequence for O25bFepE_S.

SEQ ID NO: 43 представляет последовательность праймеров для O25bFepE_A.SEQ ID NO: 43 represents the primer sequence for O25bFepE_A.

SEQ ID NO: 44 представляет последовательность праймеров для wzzB P1_S.SEQ ID NO: 44 represents the primer sequence for wzzB P1_S.

SEQ ID NO: 45 представляет последовательность праймеров для wzzB P2_AS.SEQ ID NO: 45 represents the primer sequence for wzzB P2_AS.

SEQ ID NO: 46 представляет последовательность праймеров для wzzB P3_S.SEQ ID NO: 46 represents the primer sequence for wzzB P3_S.

SEQ ID NO: 47 представляет последовательность праймеров для wzzB P4_AS.SEQ ID NO: 47 represents the primer sequence for wzzB P4_AS.

SEQ ID NO: 48 представляет последовательность праймеров для O157 FepE_S.SEQ ID NO: 48 represents the primer sequence for O157 FepE_S.

SEQ ID NO: 49 представляет последовательность праймеров для O157 FepE_AS.SEQ ID NO: 49 represents the primer sequence for O157 FepE_AS.

SEQ ID NO: 50 представляет последовательность праймеров для pBAD33_adaptor_S.SEQ ID NO: 50 represents the primer sequence for pBAD33_adaptor_S.

SEQ ID NO: 51 представляет последовательность праймеров для pBAD33_adaptor_AS.SEQ ID NO: 51 represents the primer sequence for pBAD33_adaptor_AS.

SEQ ID NO: 52 представляет последовательность праймеров для JUMPSTART_r.SEQ ID NO: 52 represents the primer sequence for JUMPSTART_r.

SEQ ID NO: 53 представляет последовательность праймеров для gnd_f.SEQ ID NO: 53 represents the primer sequence for gnd_f.

SEQ ID NO: 54 представляет аминокислотную последовательность для сигнальной последовательности мышиного IgK.SEQ ID NO: 54 represents the amino acid sequence for the murine IgK signal sequence.

SEQ ID NO: 55 представляет аминокислотную последовательность сигнального пептида большой субъединицы p51 FcRn рецептора IgG человека.SEQ ID NO: 55 represents the amino acid sequence of the human IgG receptor large subunit p51 FcRn signal peptide.

SEQ ID NO: 56 представляет аминокислотную последовательность сигнального пептида белка IL-10 человека.SEQ ID NO: 56 represents the amino acid sequence of the signal peptide of the human IL-10 protein.

SEQ ID NO: 57 представляет аминокислотную последовательность сигнального пептида слияния гликопротеина F0 респираторно-синцитиального вируса А человека (штамм А2).SEQ ID NO: 57 represents the amino acid sequence of the signal peptide fusion glycoprotein F0 of human respiratory syncytial virus A (strain A2).

SEQ ID NO: 58 представляет аминокислотную последовательность сигнального пептида гемагглютинина вируса гриппа А.SEQ ID NO: 58 represents the amino acid sequence of the influenza A virus hemagglutinin signal peptide.

SEQ ID NO: 59-101 представляют последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот для родственного наноструктуре полипептида, или его фрагмента.SEQ ID NO: 59-101 represent the amino acid and nucleic acid sequences for a nanostructure-related polypeptide, or fragment thereof.

SEQ ID NO: 102-109 представляют последовательности SignalP 4.1 (DTU Bioinformatics) из различных видов, используемые для прогнозирования сигнальных пептидов.SEQ ID NOs: 102-109 represent SignalP 4.1 (DTU Bioinformatics) sequences from various species used for signal peptide prediction.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

В одном варианте осуществления, изобретение предлагает композицию, содержащую полипептид, полученный из FimH, или его фрагмент; и сахарид, имеющий структуру, выбранную из Формулы O1, Формулы O1A, Формулы O1B, Формулы O1C, Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4, Формулы O4:K52, Формулы O4:K6, Формулы O5, Формулы O5ab, Формулы O5ac, Формулы O6, Формулы O6:K2; K13; K15, Формулы O6:K54, Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B, Формулы O18B1, Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23, Формулы O23A, Формулы O24, Формулы O25, Формулы O25a, Формулы O25b, Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45, Формулы O45, Формулы O45rel, Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы 62D₁, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73, Формулы O73, Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186, Формулы O187.In one embodiment, the invention provides a composition comprising a FimH-derived polypeptide or fragment thereof; and a saccharide having a structure selected from Formula O1, Formula O1A, Formula O1B, Formula O1C, Formula O2, Formula O3, Formula O4, Formula O4:K52, Formula O4:K6, Formula O5, Formula O5ab, Formula O5ac, Formula O6 , Formulas O6:K2; K13; K15, Formulas O6:K54, Formulas O7, Formulas O8, Formulas O9, Formulas O10, Formulas O11, Formulas O12, Formulas O13, Formulas O14, Formulas O15, Formulas O16, Formulas O17, Formulas O18, Formulas O18A, Formulas O18ac, Formulas O18A1, Formulas O18B, Formulas O18B1, Formulas O19, Formulas O20, Formulas O21, Formulas O22, Formulas O23, Formulas O23A, Formulas O24, Formulas O25, Formulas O25a, Formulas O25b, Formulas O26, Formulas O27, Formulas O28, Formulas O29 , Formulas O30, Formulas O32, Formulas O33, Formulas O34, Formulas O35, Formulas O36, Formulas O37, Formulas O38, Formulas O39, Formulas O40, Formulas O41, Formulas O42, Formulas O43, Formulas O44, Formulas O45, Formulas O45, Formulas O45rel , Formulas O46, Formulas O48, Formulas O49, Formulas O50, Formulas O51, Formulas O52, Formulas O53, Formulas O54, Formulas O55, Formulas O56, Formulas O57, Formulas O58, Formulas O59, Formulas O60, Formulas O61, Formulas O62, Formulas 62D ₁ , Formulas O63, Formulas O64, Formulas O65, Formulas O66, Formulas O68, Formulas O69, Formulas O70, Formulas O71, Formulas O73, Formulas O73, Formulas O74, Formulas O75, Formulas O76, Formulas O77, Formulas O78, Formulas O79 , Formulas O80, Formulas O81, Formulas O82, Formulas O83, Formulas O84, Formulas O85, Formulas O86, Formulas O87, Formulas O88, Formulas O89, Formulas O90, Formulas O91, Formulas O92, Formulas O93, Formulas O95, Formulas O96, Formulas O97, Formulas O98, Formulas O99, Formulas O100, Formulas O101, Formulas O102, Formulas O103, Formulas O104, Formulas O105, Formulas O106, Formulas O107, Formulas O108, Formulas O109, Formulas O110, Formulas 0111, Formulas O112, Formulas O113, Formulas O114, Formulas O115, Formulas O116, Formulas O117, Formulas O118, Formulas O119, Formulas O120, Formulas O121, Formulas O123, Formulas O124, Formulas O126, Formulas O127, Formulas O128, Formulas O129, O130, Formulas O131 , Formulas O132, Formulas O133, Formulas O134, Formulas O135, Formulas O136, Formulas O137, Formulas O138, Formulas O139, Formulas O140, Formulas O141, Formulas O142, Formulas O143, Formulas O144, Formulas O145, Formulas O146, Formulas O147, Formulas O148, Formulas O149, Formulas O150, Formulas O151, Formulas O152, Formulas O153, Formulas O154, Formulas O155, Formulas O156, Formulas O157, Formulas O158, Formulas O159, Formulas O160, Formulas O161, Formulas O162, Formulas O16 3, Formulas O164, Formulas O165, Formulas O166, Formulas O167, Formulas O168, Formulas O169, Formulas O170, Formulas O171, Formulas O172, Formulas O173, Formulas O174, Formulas O175, Formulas O176, Formulas O177, Formulas O178, Formulas O179, O180, Formulas O181 , Formulas O182, Formulas O183, Formulas O184, Formulas O185, Formulas O186, Formulas O187.

В одном аспекте, композиция дополнительно содержит, по меньшей мере, один сахарид, полученный из любой одной K. pneumoniae, выбранный из группы, состоящей из O1, O2, O3 и O5. В другом аспекте, композиция дополнительно содержит сахарид, полученный из Klebsiella pneumoniae типа O1. В другом аспекте, композиция дополнительно содержит сахарид, полученный из K. pneumoniae типа О2. В другом аспекте, композиция дополнительно содержит сахарид, полученный из K. pneumoniae типа О3. В другом аспекте, композиция дополнительно содержит сахарид, полученный из K. pneumoniae типа О5. В другом аспекте, композиция дополнительно содержит сахарид, полученный из K. pneumoniae типа O1 и сахарид, полученный из K. pneumoniae типа О2.In one aspect, the composition further comprises at least one saccharide derived from any one K. pneumoniae selected from the group consisting of O1, O2, O3 and O5. In another aspect, the composition further comprises a saccharide derived from Klebsiella pneumoniae type O1. In another aspect, the composition further comprises a saccharide derived from K. pneumoniae type O2. In another aspect, the composition further comprises a saccharide derived from K. pneumoniae type O3. In another aspect, the composition further comprises a saccharide derived from K. pneumoniae type O5. In another aspect, the composition further comprises a saccharide derived from K. pneumoniae type O1 and a saccharide derived from K. pneumoniae type O2.

В другом аспекте, композиция дополнительно содержит сахарид, полученный из K. pneumoniae, который конъюгирован с белком-носителем; и сахарид, полученный из E. coli, конъюгированный с белком-носителем.In another aspect, the composition further comprises a saccharide derived from K. pneumoniae that is conjugated to a carrier protein; and a saccharide derived from E. coli , conjugated to a carrier protein.

В другом аспекте, композиция дополнительно содержит полипептид, полученный из K. pneumoniae. In another aspect, the composition further comprises a polypeptide derived from K. pneumoniae.

В другом варианте осуществления изобретение предлагает композицию, содержащую полипептид, полученный из FimH, или его фрагмент; и, по меньшей мере, один сахарид, полученный из любой одной K. pneumoniae, выбранный из группы, состоящей из O1, O2, O3 и O5. В одном аспекте, композиция дополнительно содержит, по меньшей мере, один сахарид, имеющий структуру, выбранную из Формулы O1, Формулы O1A, Формулы O1B, Формулы O1C, Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4, Формулы O4:K52, Формулы O4:K6, Формулы O5, Формулы O5ab, Формулы O5ac, Формулы O6, Формулы O6:K2; K13; K15, Формулы O6:K54, Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B, Формулы O18B1, Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23, Формулы O23A, Формулы O24, Формулы O25, Формулы O25a, Формулы O25b, Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45, Формулы O45, Формулы O45rel, Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы 62D₁, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73, Формулы O73, Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186, Формулы O187.In another embodiment, the invention provides a composition comprising a FimH-derived polypeptide or fragment thereof; and at least one saccharide derived from any one K. pneumoniae selected from the group consisting of O1, O2, O3 and O5. In one aspect, the composition further contains at least one saccharide having a structure selected from Formula O1, Formula O1A, Formula O1B, Formula O1C, Formula O2, Formula O3, Formula O4, Formula O4:K52, Formula O4:K6 , Formulas O5, Formulas O5ab, Formulas O5ac, Formulas O6, Formulas O6:K2; K13; K15, Formulas O6:K54, Formulas O7, Formulas O8, Formulas O9, Formulas O10, Formulas O11, Formulas O12, Formulas O13, Formulas O14, Formulas O15, Formulas O16, Formulas O17, Formulas O18, Formulas O18A, Formulas O18ac, Formulas O18A1, Formulas O18B, Formulas O18B1, Formulas O19, Formulas O20, Formulas O21, Formulas O22, Formulas O23, Formulas O23A, Formulas O24, Formulas O25, Formulas O25a, Formulas O25b, Formulas O26, Formulas O27, Formulas O28, Formulas O29 , Formulas O30, Formulas O32, Formulas O33, Formulas O34, Formulas O35, Formulas O36, Formulas O37, Formulas O38, Formulas O39, Formulas O40, Formulas O41, Formulas O42, Formulas O43, Formulas O44, Formulas O45, Formulas O45, Formulas O45rel , Formulas O46, Formulas O48, Formulas O49, Formulas O50, Formulas O51, Formulas O52, Formulas O53, Formulas O54, Formulas O55, Formulas O56, Formulas O57, Formulas O58, Formulas O59, Formulas O60, Formulas O61, Formulas O62, Formulas 62D ₁ , Formulas O63, Formulas O64, Formulas O65, Formulas O66, Formulas O68, Formulas O69, Formulas O70, Formulas O71, Formulas O73, Formulas O73, Formulas O74, Formulas O75, Formulas O76, Formulas O77, Formulas O78, Formulas O79 , Formulas O80, Formulas O81, Formulas O82, Formulas O83, Formulas O84, Formulas O85, Formulas O86, Formulas O87, Formulas O88, Formulas O89, Formulas O90, Formulas O91, Formulas O92, Formulas O93, Formulas O95, Formulas O96, Formulas O97, Formulas O98, Formulas O99, Formulas O100, Formulas O101, Formulas O102, Formulas O103, Formulas O104, Formulas O105, Formulas O106, Formulas O107, Formulas O108, Formulas O109, Formulas O110, Formulas 0111, Formulas O112, Formulas O113, Formulas O114, Formulas O115, Formulas O116, Formulas O117, Formulas O118, Formulas O119, Formulas O120, Formulas O121, Formulas O123, Formulas O124, Formulas O126, Formulas O127, Formulas O128, Formulas O129, O130, Formulas O131 , Formulas O132, Formulas O133, Formulas O134, Formulas O135, Formulas O136, Formulas O137, Formulas O138, Formulas O139, Formulas O140, Formulas O141, Formulas O142, Formulas O143, Formulas O144, Formulas O145, Formulas O146, Formulas O147, Formulas O148, Formulas O149, Formulas O150, Formulas O151, Formulas O152, Formulas O153, Formulas O154, Formulas O155, Formulas O156, Formulas O157, Formulas O158, Formulas O159, Formulas O160, Formulas O161, Formulas O162, Formulas O16 3, Formulas O164, Formulas O165, Formulas O166, Formulas O167, Formulas O168, Formulas O169, Formulas O170, Formulas O171, Formulas O172, Formulas O173, Formulas O174, Formulas O175, Formulas O176, Formulas O177, Formulas O178, Formulas O179, O180, Formulas O181 , Formulas O182, Formulas O183, Formulas O184, Formulas O185, Formulas O186, Formulas O187.

В еще одном аспекте, композиция дополнительно содержит полипептид, полученный из K. pneumoniae.In yet another aspect, the composition further comprises a polypeptide derived from K. pneumoniae .

В другом варианте осуществления, изобретение предлагает композицию, содержащую, по меньшей мере, один сахарид, полученный из любого одного K. pneumoniae, выбранный из группы, состоящей из О1, О2, О3 и О5; и, по меньшей мере, один сахарид, имеющий структуру, выбранную из Формулы O1, Формулы O1A, Формулы O1B, Формулы O1C, Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4, Формулы O4:K52, Формулы O4:K6, Формулы O5, Формулы O5ab, Формулы O5ac, Формулы O6, Формулы O6:K2; K13; K15, Формулы O6:K54, Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B, Формулы O18B1, Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23, Формулы O23A, Формулы O24, Формулы O25, Формулы O25a, Формулы O25b, Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45, Формулы O45, Формулы O45rel, Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы 62D₁, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73, Формулы O73, Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186, Формулы O187.In another embodiment, the invention provides a composition comprising at least one saccharide derived from any one K. pneumoniae selected from the group consisting of O1, O2, O3 and O5; and at least one saccharide having a structure selected from Formula O1, Formula O1A, Formula O1B, Formula O1C, Formula O2, Formula O3, Formula O4, Formula O4:K52, Formula O4:K6, Formula O5, Formula O5ab , Formulas O5ac, Formulas O6, Formulas O6:K2; K13; K15, Formulas O6:K54, Formulas O7, Formulas O8, Formulas O9, Formulas O10, Formulas O11, Formulas O12, Formulas O13, Formulas O14, Formulas O15, Formulas O16, Formulas O17, Formulas O18, Formulas O18A, Formulas O18ac, Formulas O18A1, Formulas O18B, Formulas O18B1, Formulas O19, Formulas O20, Formulas O21, Formulas O22, Formulas O23, Formulas O23A, Formulas O24, Formulas O25, Formulas O25a, Formulas O25b, Formulas O26, Formulas O27, Formulas O28, Formulas O29 , Formulas O30, Formulas O32, Formulas O33, Formulas O34, Formulas O35, Formulas O36, Formulas O37, Formulas O38, Formulas O39, Formulas O40, Formulas O41, Formulas O42, Formulas O43, Formulas O44, Formulas O45, Formulas O45, Formulas O45rel , Formulas O46, Formulas O48, Formulas O49, Formulas O50, Formulas O51, Formulas O52, Formulas O53, Formulas O54, Formulas O55, Formulas O56, Formulas O57, Formulas O58, Formulas O59, Formulas O60, Formulas O61, Formulas O62, Formulas 62D ₁ , Formulas O63, Formulas O64, Formulas O65, Formulas O66, Formulas O68, Formulas O69, Formulas O70, Formulas O71, Formulas O73, Formulas O73, Formulas O74, Formulas O75, Formulas O76, Formulas O77, Formulas O78, Formulas O79 , Formulas O80, Formulas O81, Formulas O82, Formulas O83, Formulas O84, Formulas O85, Formulas O86, Formulas O87, Formulas O88, Formulas O89, Formulas O90, Formulas O91, Formulas O92, Formulas O93, Formulas O95, Formulas O96, Formulas O97, Formulas O98, Formulas O99, Formulas O100, Formulas O101, Formulas O102, Formulas O103, Formulas O104, Formulas O105, Formulas O106, Formulas O107, Formulas O108, Formulas O109, Formulas O110, Formulas 0111, Formulas O112, Formulas O113, Formulas O114, Formulas O115, Formulas O116, Formulas O117, Formulas O118, Formulas O119, Formulas O120, Formulas O121, Formulas O123, Formulas O124, Formulas O126, Formulas O127, Formulas O128, Formulas O129, O130, Formulas O131 , Formulas O132, Formulas O133, Formulas O134, Formulas O135, Formulas O136, Formulas O137, Formulas O138, Formulas O139, Formulas O140, Formulas O141, Formulas O142, Formulas O143, Formulas O144, Formulas O145, Formulas O146, Formulas O147, Formulas O148, Formulas O149, Formulas O150, Formulas O151, Formulas O152, Formulas O153, Formulas O154, Formulas O155, Formulas O156, Formulas O157, Formulas O158, Formulas O159, Formulas O160, Formulas O161, Formulas O162, Formulas O16 3, Formulas O164, Formulas O165, Formulas O166, Formulas O167, Formulas O168, Formulas O169, Formulas O170, Formulas O171, Formulas O172, Formulas O173, Formulas O174, Formulas O175, Formulas O176, Formulas O177, Formulas O178, Formulas O179, O180, Formulas O181 , Formulas O182, Formulas O183, Formulas O184, Formulas O185, Formulas O186, Formulas O187.

В одном аспекте вышеупомянутых вариантов осуществления, сахарид ковалентно связан с белком-носителем. В одном аспекте, сахарид дополнительно содержит группу 3-дезокси-d-манно-окт-2-улозоновой кислоты (KDO). В другом аспекте, где белок-носитель выбран из любого из CRM197, группы B дифтерийного токсина (DTFB), DTFB C8, дифтерийного анатоксина (DT), столбнячного анатоксина (TT), фрагмента C TT, коклюшного анатоксина, холерного анатоксина или экзотоксина А из Pseudomonas aeruginosa; детоксицированного экзотоксина A P. aeruginosa (EPA), белка, связывающего мальтозу (MBP), детоксицированного гемолизина A S. aureus, фактора слипания A, фактора слипания B, субъединицы холерного токсина B (CTB), Streptococcus pneumoniae пневмолизина и его детоксицированных вариантов, AcrA C. jejuni, природных гликопротеинов C. jejuni и стрептококковой пептидазы C5a (SCP).In one aspect of the above embodiments, the saccharide is covalently linked to a carrier protein. In one aspect, the saccharide further contains a 3-deoxy-d-manno-oct-2-ulosonic acid (KDO) group. In another aspect, wherein the carrier protein is selected from any of CRM197, diphtheria toxoid group B (DTFB), DTFB C8, diphtheria toxoid (DT), tetanus toxoid (TT), TT fragment C, pertussis toxoid, cholera toxoid, or exotoxin A of Pseudomonas aeruginosa; detoxified P. aeruginosa exotoxin A (EPA), maltose binding protein (MBP), detoxified S. aureus hemolysin A, clumping factor A, clumping factor B, cholera toxin subunit B (CTB), Streptococcus pneumoniae pneumolysin and its detoxified variants, AcrA C. jejuni, natural C. jejuni glycoproteins, and streptococcal C5a peptidase (SCP).

В другом варианте осуществления, изобретение относится к способу индукции иммунного ответа против Escherichia coli у млекопитающего, включающему введение млекопитающему эффективного количества композиции в соответствии с любым из приведенных выше вариантов осуществления и их аспектов. В одном аспекте, иммунный ответ включает опсонофагоцитарные антитела против E. coli. В другом аспекте, иммунный ответ защищает млекопитающее от инфекции E.coli.In another embodiment, the invention relates to a method of inducing an immune response against Escherichia coli in a mammal, comprising administering to the mammal an effective amount of a composition in accordance with any of the above embodiments and aspects thereof. In one aspect, the immune response includes opsonophagocytic antibodies against E. coli. In another aspect, the immune response protects the mammal from E. coli infection.

В другом варианте осуществления, изобретение относится к способу индукции иммунного ответа против Klebsiella pneumoniae у млекопитающего, включающему введение млекопитающему эффективного количества композиции в соответствии с любым из приведенных выше вариантов осуществления и их аспектов. В одном аспекте, иммунный ответ включает опсонофагоцитарные антитела против Klebsiella pneumoniae. В другом аспекте, иммунный ответ защищает млекопитающее от инфекции Klebsiella pneumoniae.In another embodiment, the invention relates to a method of inducing an immune response against Klebsiella pneumoniae in a mammal, comprising administering to the mammal an effective amount of a composition in accordance with any of the above embodiments and aspects thereof. In one aspect, the immune response includes opsonophagocytic antibodies against Klebsiella pneumoniae. In another aspect, the immune response protects the mammal from Klebsiella pneumoniae infection.

Изобретатели преодолели трудности продуцирования полипептидов, полученных из белков адгезинов E. coli, путем использования клеток млекопитающих для экспрессии. Как показано в настоящем описании, на протяжении всего описания и в разделе «Примеры», было обнаружено, что экспрессия рекомбинантных полипептидов в клетках млекопитающих неизменно обеспечивает высокие выходы по сравнению с экспрессией полипептидов в E. coli. Кроме того, изобретатели неожиданно идентифицировали мутации и конструкции экспрессии для стабилизации рекомбинантных полипептидов и их фрагментов в желаемой конформации.Inventors Overcame Difficulties in Producing Polypeptides Derived from Adhesin Proteins E. coli, by using mammalian cells for expression. As shown herein and in the Examples section, expression of recombinant polypeptides in mammalian cells has been found to consistently provide high yields compared to expression of polypeptides in E. coli. In addition, the inventors have unexpectedly identified mutations and expression constructs to stabilize recombinant polypeptides and fragments thereof in the desired conformation.

Блокирование первичных стадий инфекции, а именно прикрепления бактерий к рецепторам клеток-хозяев и колонизации поверхности слизистой оболочки, важно для профилактики, лечения и/или снижения вероятности бактериальных инфекций. Бактериальное прикрепление может включать взаимодействие между поверхностным бактериальным белком, называемым адгезином, и рецептором клетки-хозяина. Предыдущие доклинические исследования адгезина FimH (полученного из уропатогенной E. coli) подтвердили, что против адгезина вырабатываются антитела. Успехи в идентификации, характеризации и выделении адгезинов необходимы для профилактики инфекций, от среднего отита и кариеса до пневмонии и сепсиса.Blocking the primary stages of infection, namely bacterial attachment to host cell receptors and colonization of the mucosal surface, is important for preventing, treating and/or reducing the likelihood of bacterial infections. Bacterial attachment may involve an interaction between a bacterial surface protein called an adhesin and a host cell receptor. Previous preclinical studies of the FimH adhesin (derived from uropathogenic E. coli ) confirmed that antibodies are produced against the adhesin. Advances in the identification, characterization, and isolation of adhesins are essential for the prevention of infections, from otitis media and caries to pneumonia and sepsis.

Для продуцирования адгезивных белков, таких как FimH и их фрагменты, в промышленных масштабах необходимо идентифицировать подходящие конструкции и подходящие хозяева, чтобы полипептид и его фрагменты могли экспрессироваться в достаточных количествах в течение продолжительного периода времени и в предпочтительной конформации. Например, в некоторых вариантах осуществления, предпочтительная конформация рекомбинантного полипептида проявляет низкую аффинность (например, K _d ~ 300 мкМ) к мономаннозе. В некоторых вариантах осуществления, предпочтительная конформация проявляет высокую аффинность (например, K _d <1,2 мкМ) к мономаннозе.To produce adhesion proteins such as FimH and fragments thereof on an industrial scale, it is necessary to identify suitable constructs and suitable hosts so that the polypeptide and its fragments can be expressed in sufficient quantities over an extended period of time and in a preferred conformation. For example, in some embodiments, the preferred conformation of the recombinant polypeptide exhibits low affinity (eg, K _d ~ 300 μM) for monomannose. In some embodiments, the preferred conformation exhibits high affinity (eg, K _d <1.2 μM) for monomannose.

Адгезиновые белки, полученные из E.coli, были рекомбинантно экспрессированы в клетках E.coli. Однако выходы были менее 10 мг/л. Очистка больших количеств адгезина, связанного с ворсинками, может быть сложной задачей, если он продуцируется в E. coli. Не ограничиваясь какой-либо теорией или механизмом, было высказано предположение, что продукт, экспрессируемый в E. coli, может иметь конформацию, которая не оптимальна для индукции эффективного иммунного ответа у млекопитающих. E. coli- derived adhesin proteins have been recombinantly expressed in E. coli cells. However, the yields were less than 10 mg/L. Purifying large quantities of villus-associated adhesin can be challenging when produced in E. coli. Without being limited to any theory or mechanism, it has been proposed that the product expressed in E. coli may have a conformation that is not optimal for inducing an effective immune response in mammals.

В одном аспекте, изобретение включает рекомбинантную клетку млекопитающего, которая включает полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, полученный из бактериального адгезинового белка или его фрагмента.In one aspect, the invention includes a recombinant mammalian cell that includes a polynucleotide sequence encoding a polypeptide derived from a bacterial adhesin protein or a fragment thereof.

В другом аспекте, изобретение включает способ получения полипептида или его фрагмента в клетке млекопитающего, включающий: (i) культивирование клетки млекопитающего в подходящих условиях, тем самым экспрессируя указанный полипептид или его фрагмент; и (ii) сбор указанного полипептида или его фрагмента из культуры. Способ может дополнительно включать очистку полипептида или его фрагмента. Также в настоящем документе описан полипептид или его фрагмент, полученный этим способом.In another aspect, the invention includes a method of producing a polypeptide or fragment thereof in a mammalian cell, comprising: (i) culturing the mammalian cell under suitable conditions, thereby expressing said polypeptide or fragment thereof; and (ii) collecting said polypeptide or fragment thereof from the culture. The method may further include purifying the polypeptide or fragment thereof. Also described herein is a polypeptide or fragment thereof obtained by this method.

В другом аспекте, изобретение включает композицию, включающую описанный в настоящем документе полипептид или его фрагмент. Композиция может включать полипептид или его фрагмент, который подходит для введения in vivo. Например, полипептид или его фрагмент в такой композиции может иметь чистоту, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 86%, по меньшей мере, 87%, по меньшей мере, 88%, по меньшей мере, 89%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 91%, по меньшей мере, 92%, по меньшей мере, 93%, по меньшей мере, 94%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98% или по меньшей мере, 99% массовых. Композиция может дополнительно содержать адъювант.In another aspect, the invention includes a composition comprising a polypeptide or fragment thereof described herein. The composition may include a polypeptide or fragment thereof that is suitable for administration in vivo. For example, the polypeptide or fragment thereof in such a composition may have a purity of at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least , 97%, at least 98% or at least 99% by weight. The composition may further contain an adjuvant.

В еще одном аспекте, изобретение включает композицию для индукции иммунного ответа против E. coli. Также описано применение композиции, описанной в настоящем документе, для индуцирования иммунного ответа против E.coli, и применение композиции, описанной в настоящем документе, в производстве лекарственного средства для индуцирования иммунного ответа против E.coli.In yet another aspect, the invention includes a composition for inducing an immune response against E. coli . Also described is the use of a composition described herein for inducing an immune response against E. coli, and the use of a composition described herein in the manufacture of a medicament for inducing an immune response against E. coli .

I. Полипептиды, полученные из I. Polypeptides derived from E. coli,E. coli, и их фрагменты and their fragments

В одном аспекте, в настоящем документе описана клетка млекопитающего, которая включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент. Используемый в настоящем документе термин «полученный из» относится к полипептиду, который содержит аминокислотную последовательность полипептида FimH или полипептидного комплекса FimCH или его фрагмента, как описано в настоящем документе, который был изменен путем введения замены, делеции или добавления аминокислотного остатка. Предпочтительно, полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент включает последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% идентичность последовательности соответствующего полипептида или фрагмента FimH E. coli дикого типа. В некоторых вариантах осуществления, полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент имеет такую же общую длину аминокислот, что и соответствующий полипептид FimH дикого типа или полипептидный комплекс FimCH или их фрагмент.In one aspect, described herein is a mammalian cell that includes a polynucleotide encoding a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof. As used herein, the term “derived from” refers to a polypeptide that contains the amino acid sequence of a FimH polypeptide or a FimCH polypeptide complex or fragment thereof, as described herein, that has been altered by introducing a substitution, deletion, or addition of an amino acid residue. Preferably, a polypeptide derived from E.coli, or a fragment thereof includes a sequence having at least 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82 %, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 99.9% sequence identity to the corresponding FimH polypeptide or fragment E. coli wild type. In some embodiments, a polypeptide derived from E. coli, or its fragment has the same total amino acid length as the corresponding wild-type FimH polypeptide or FimCH polypeptide complex or fragment thereof.

Фрагменты должны включать, по меньшей мере, n последовательных аминокислот из последовательностей и, в зависимости от конкретной последовательности, n равно 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или более). Предпочтительно, фрагменты включают эпитоп из последовательности. В некоторых вариантах осуществления фрагмент включает аминокислотную последовательность из, по меньшей мере, 50 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере, 100 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере, 125 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере, 150 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере, 175 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере, 200 последовательных аминокислотных остатков или, по меньшей мере, 250 последовательных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности полипептида, полученного из E.coli.The fragments must include at least n consecutive amino acids from the sequences and, depending on the specific sequence, n is 7 or more (eg, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 or more). Preferably, the fragments include an epitope from the sequence. In some embodiments, the fragment includes an amino acid sequence of at least 50 contiguous amino acid residues, at least 100 contiguous amino acid residues, at least 125 contiguous amino acid residues, at least 150 contiguous amino acid residues, at least 175 contiguous amino acid residues, at least 200 contiguous amino acid residues, or at least 250 contiguous amino acid residues of the amino acid sequence of an E. coli -derived polypeptide.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент включает одну или несколько неклассических аминокислот по сравнению с соответствующим полипептидом или фрагментом FimH E. coli дикого типа.In some embodiments, a polypeptide derived from E. coli, or its fragment includes one or more non-classical amino acids compared to the corresponding FimH polypeptide or fragment E. coli wild type.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент обладают аналогичной или идентичной функцией соответствующего полипептида FimH дикого типа или его фрагмента.In some embodiments, a polypeptide derived from E. coli, or its fragment have similar or identical function to the corresponding wild-type FimH polypeptide or fragment thereof.

В предпочтительном варианте осуществления, полипептиды или полипептидные комплексы или их фрагменты по изобретению выделяют или очищают.In a preferred embodiment, the polypeptides or polypeptide complexes or fragments thereof of the invention are isolated or purified.

В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид, кодирующий полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент интегрируется в геномную ДНК клетки млекопитающего, и, при культивировании в подходящих условиях, указанный полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент экспрессируется клеткой млекопитающего.In some embodiments, a polynucleotide encoding a polypeptide derived from E. coli, or its fragment integrated into the genomic DNA of a mammalian cell, and, when cultured under suitable conditions, said polypeptide derived from E. coli, or its fragment expressed by a mammalian cell.

В предпочтительном варианте осуществления, полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент растворим.In a preferred embodiment, a polypeptide derived from E. coli, or its fragment soluble.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент секретируется из клетки-хозяина млекопитающего.In some embodiments, a polypeptide derived from E. coli, or its fragment secreted from the mammalian host cell.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент могут включать дополнительные аминокислотные остатки, такие как N-концевые или C-концевые удлинения. Такие удлинения могут включать одну или несколько меток, которые могут облегчить обнаружение (например, эпитопную метку для обнаружения моноклональными антителами) и/или очистку (например, полигистидиновую метку, позволяющую проводить очистку на никельхелатирующей смоле) полипептида или его фрагмента.. В некоторых вариантах осуществления, метка включает аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 25. Такие метки для аффинной очистки известны в данной области техники. Примеры меток аффинной очистки включают, например, метку His (гексагистидин, который может, например, связываться с ионом металла), белок, связывающий мальтозу (MBP), который может, например, связываться с амилозой, глутатион-S-трансферазу (GST), которая может, например, связываться с глутатионом, метку FLAG, которая может, например, связываться с анти-flag антителом), метку Strep, которая может, например, связываться со стрептавидином или его производным). В предпочтительных вариантах осуществления, полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент не включает дополнительные аминокислотные остатки, такие как N-концевые или С-концевые удлинения. В некоторых вариантах осуществления, полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент, описанный в настоящем документе, не включает последовательность экзогенной метки.In some embodiments, a polypeptide derived from E. coli, or its fragment may include additional amino acid residues such as N-terminal or C-terminal extensions. Such extensions may include one or more tags that can facilitate detection (e.g., an epitope tag for detection by monoclonal antibodies) and/or purification (e.g., a polyhistidine tag allowing purification on a nickel chelating resin) of the polypeptide or fragment thereof. In some embodiments, , the tag includes an amino acid sequence selected from any of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 25. Such affinity purification tags are known in the art. Examples of affinity purification tags include, for example, a His tag (hexahistidine, which can, for example, bind to a metal ion), maltose binding protein (MBP), which can, for example, bind to amylose, glutathione-S-transferase (GST), which can, for example, bind to glutathione, a FLAG tag, which can, for example, bind to an anti-flag antibody), a Strep tag, which can, for example, bind to streptavidin or a derivative thereof). In preferred embodiments, a polypeptide derived from E.coli, or its fragment does not include additional amino acid residues, such as N-terminal or C-terminal extensions. In some embodiments, a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof, described herein does not include an exogenous tag sequence.

Хотя в настоящем документе могут быть указаны конкретные штаммы E.coli, следует понимать, что полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент не ограничиваются конкретными штаммами, если не указано иное.Although specific strains of E. coli may be referenced herein, it should be understood that the E. coli -derived polypeptide or fragment thereof is not limited to specific strains unless otherwise indicated.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид, полученный из E. coli FimH, или его фрагмент включает остаток фенилаланина на N-конце полипептида. В некоторых вариантах осуществления, полипептид, полученный из FimH или его фрагмента, включает остаток фенилаланина в пределах первых 20 положений остатков на N-конце. Предпочтительно, остаток фенилаланина расположен в положении 1 полипептида. Например, в некоторых вариантах осуществления полипептид, полученный из E.coli FimH, или его фрагмент не включает дополнительный остаток глицина на N-конце полипептида, полученного из E.coli FimH, или его фрагмента.In some embodiments, the E. coli FimH-derived polypeptide, or a fragment thereof, includes a phenylalanine residue at the N-terminus of the polypeptide. In some embodiments, the polypeptide derived from FimH or a fragment thereof includes a phenylalanine residue within the first 20 residue positions at the N-terminus. Preferably, the phenylalanine residue is located at position 1 of the polypeptide. For example, in some embodiments, the E. coli FimH-derived polypeptide or fragment thereof does not include an additional glycine residue at the N-terminus of the E. coli FimH-derived polypeptide or fragment thereof.

В некоторых вариантах осуществления, фенилаланиновый остаток в положении 1 зрелого FimH E. coli дикого типа заменен алифатической гидрофобной аминокислотой, такой как, например, любой из остатков Ile, Leu и Val.In some embodiments, the phenylalanine residue at position 1 of mature wild-type E. coli FimH is replaced with an aliphatic hydrophobic amino acid, such as, for example, any of the Ile, Leu, and Val residues.

В некоторых вариантах осуществления, сигнальный пептид может применяться для экспрессирования полипептида, полученного из E. coli или его фрагмента. Сигнальные последовательности и кассеты экспрессии для продуцирования белков известны в данной области техники. Как правило, лидерные пептиды имеют длину от 5 до 30 аминокислот и обычно присутствуют на N-конце вновь синтезированного полипептида. Сигнальный пептид обычно содержит длинный участок гидрофобных аминокислот, который имеет тенденцию к образованию одиночной альфа-спирали. Кроме того, многие сигнальные пептиды начинаются с короткого положительно заряженного участка аминокислот, что может помочь обеспечить правильную топологию полипептида во время транслокации. На конце сигнального пептида обычно находится участок аминокислот, который распознается и расщепляется сигнальной пептидазой. Сигнальная пептидаза может расщепляться во время или после завершения транслокации с образованием свободного сигнального пептида и зрелого белка. В некоторых вариантах осуществления, сигнальный пептид включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9% или 100% идентичность любой из SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 22.In some embodiments, the signal peptide may be used to express a polypeptide derived from E. coli or a fragment thereof. Signal sequences and expression cassettes for producing proteins are known in the art. Typically, leader peptides range from 5 to 30 amino acids in length and are usually present at the N-terminus of the newly synthesized polypeptide. The signal peptide typically contains a long stretch of hydrophobic amino acids that tends to form a single alpha helix. In addition, many signal peptides begin with a short, positively charged stretch of amino acids, which can help ensure correct polypeptide topology during translocation. At the end of the signal peptide there is usually a stretch of amino acids that is recognized and cleaved by the signal peptidase. The signal peptidase can be cleaved during or after completion of the translocation to produce the free signal peptide and mature protein. In some embodiments, the signal peptide includes an amino acid sequence having at least 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% , 98%, 99%, 99.9%, or 100% identical to any of SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, and SEQ ID NO: 22.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент описанный в настоящем документе, может включать расщепляемый линкер. Такие линкеры позволяют отделить метку от очищенного комплекса, например, путем добавления агента, способного расщеплять линкер. Расщепляемые линкеры известны в данной области техники. Такие линкеры могут быть расщеплены, например, путем облучения фотолабильной связи или гидролиза, катализируемого кислотой. Другой пример расщепляемого линкера включает полипептидный линкер, который включает сайт распознавания протеазы и может быть расщеплен путем добавления подходящего фермента протеазы.In some embodiments, a polypeptide derived from E. coli, or its fragment described herein may include a cleavable linker. Such linkers allow the label to be separated from the purified complex, for example by adding an agent capable of cleaving the linker. Cleavable linkers are known in the art. Such linkers can be cleaved, for example, by irradiation of the photolabile linkage or acid-catalyzed hydrolysis. Another example of a cleavable linker includes a polypeptide linker that includes a protease recognition site and can be cleaved by adding a suitable protease enzyme.

В некоторых вариантах осуществления полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент включает модификацию по сравнению с соответствующим полипептидом или фрагментом FimH E. coli дикого типа. Модификация может включать ковалентное присоединение молекулы к полипептиду. Например, такие модификации могут включать гликозилирование, ацетилирование, пэгилирование, фосфорилирование, амидирование, дериватизацию известными защитными/блокирующими группами, протеолитическое расщепление, связывание с клеточным лигандом или другим белком и т.д. В некоторых вариантах осуществления полипептид, полученный из E. coli или его фрагмент может включать модификацию, такую как химическая модификация с использованием способов, известных специалистам в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, специфическое химическое расщепление, ацетилирование, формилирование, метаболический синтез туникамицина и т.д. по сравнению с соответствующим полипептидом FimH E. coli дикого типа или его фрагментом. В другом варианте осуществления, модификация может включать ковалентное присоединение молекулы липида к полипептиду. В некоторых вариантах осуществления, полипептид не включает ковалентное присоединение молекулы к полипептиду по сравнению с соответствующим полипептидом FimH E. coli дикого типа, или его фрагментом.In some embodiments, a polypeptide derived from E. coli, or its fragment includes modification compared to the corresponding polypeptide or FimH fragment E. coli wild type. The modification may involve covalently attaching a molecule to a polypeptide. For example, such modifications may include glycosylation, acetylation, pegylation, phosphorylation, amidation, derivatization with known protecting/blocking groups, proteolytic cleavage, binding to a cellular ligand or other protein, etc. In some embodiments, a polypeptide derived from E. colior a fragment thereof may include modification, such as chemical modification using methods known to those skilled in the art, including, but not limited to, specific chemical cleavage, acetylation, formylation, metabolic synthesis of tunicamycin, etc. compared to the corresponding FimH polypeptide E. coli wild type or a fragment thereof. In another embodiment, the modification may involve covalently attaching a lipid molecule to a polypeptide. In some embodiments, the polypeptide does not involve covalently attaching a molecule to the polypeptide compared to the corresponding FimH polypeptide E. coli wild type, or a fragment thereof.

Например, белки и полипептиды, продуцируемые в клеточной культуре, могут быть гликопротеинами, которые содержат ковалентно связанные углеводные структуры, включая олигосахаридные цепи. Эти олигосахаридные цепи связаны с белком либо N-связями, либо O-связями. Олигосахаридные цепи могут составлять значительную часть массы гликопротеина. Как правило, N-связанный олигосахарид добавляют к аминогруппе на боковой цепи остатка аспарагина в целевой консенсусной последовательности Asn-X-Ser/Thr, где X может быть любой аминокислотой, кроме пролина. В некоторых вариантах осуществления, сайт гликозилирования включает аминокислотную последовательность, выбранную из любой из следующих: аспарагин-глицин-треонин (NGT), аспарагин-изолейцин-треонин (NIT), аспарагин-глицин-серин (NGS), аспарагин-серин-треонин (NST) и аспарагин-треонин-серин (NTS). Полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент, продуцируемый в клетках млекопитающих, может быть гликозилирован. Гликозилирование может происходить по N-связанному сигналу гликозилирования Asn-Xaa-Ser/Thr в последовательности полипептида, полученного из E.coli, или его фрагмента. «N-связанное гликозилирование» относится к присоединению углеводного фрагмента через GIcNAc к аспарагиновому остатку в полипептидной цепи. N-связанный углевод содержит обычную структуру ядра Man 1-6(Man1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-R, где R представляет собой аспарагиновый остаток продуцируемого полипептида, полученного из E. coli, или его фрагмента.For example, proteins and polypeptides produced in cell culture may be glycoproteins that contain covalently linked carbohydrate structures, including oligosaccharide chains. These oligosaccharide chains are linked to the protein by either N-bonds or O-bonds. Oligosaccharide chains can constitute a significant portion of the mass of the glycoprotein. Typically, an N-linked oligosaccharide is added to the amino group on the side chain of an asparagine residue in the target consensus sequence Asn-X-Ser/Thr, where X can be any amino acid except proline. In some embodiments, the glycosylation site includes an amino acid sequence selected from any of the following: asparagine-glycine-threonine (NGT), asparagine-isoleucine-threonine (NIT), asparagine-glycine-serine (NGS), asparagine-serine-threonine ( NST) and asparagine-threonine-serine (NTS). The E. coli -derived polypeptide, or a fragment thereof, produced in mammalian cells may be glycosylated. Glycosylation may occur through the N-linked glycosylation signal Asn-Xaa-Ser/Thr in the E. coli- derived polypeptide sequence or a fragment thereof. "N-linked glycosylation" refers to the addition of a carbohydrate moiety via GIcNAc to an aspartic residue in a polypeptide chain. The N-linked carbohydrate contains the usual core structure Man 1-6(Man1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-R, where R is the aspartic residue of the produced E. coli -derived polypeptide, or a fragment thereof.

В некоторых вариантах осуществления, сайт гликозилирования в полипептиде, полученном из E.coli, или его фрагменте удален посредством мутации в последовательности полипептида, полученного из E.coli, или его фрагмента. Например, в некоторых вариантах осуществления остаток Asn мотива гликозилирования (Asn-Xaa-Ser/Thr) может быть мутирован, предпочтительно путем замены. В некоторых вариантах осуществления замена остатка выбрана из любого из Ser, Asp, Thr и Gln.In some embodiments, a glycosylation site in an E. coli -derived polypeptide or fragment thereof is removed by mutation in the sequence of the E. coli -derived polypeptide or fragment thereof. For example, in some embodiments, the Asn residue of the glycosylation motif (Asn-Xaa-Ser/Thr) may be mutated, preferably by substitution. In some embodiments, the residue substitution is selected from any of Ser, Asp, Thr, and Gln.

В некоторых вариантах осуществления, остаток Ser мотива гликозилирования может быть мутирован, предпочтительно путем замены. В некоторых вариантах осуществления, замена остатка выбрана из любого из Asp, Thr и Gln.In some embodiments, the Ser residue of the glycosylation motif may be mutated, preferably by substitution. In some embodiments, the residue replacement is selected from any of Asp, Thr, and Gln.

В некоторых вариантах осуществления, остаток Thr мотива гликозилирования может быть мутирован, предпочтительно путем замены. В некоторых вариантах осуществления замена остатка выбрана из любого из Ser, Asp и Gln.In some embodiments, the Thr residue of the glycosylation motif may be mutated, preferably by substitution. In some embodiments, the residue substitution is selected from any of Ser, Asp, and Gln.

В некоторых вариантах осуществления, сайт гликозилирования (такой как Asn-Xaa-Ser/Thr) в полипептиде, полученном из E. coli, или его фрагменте не удаляют и не модифицируют. В некоторых вариантах осуществления, в среду для культивирования клеток можно добавить соединение для снижения или ингибирования гликозилирования. В таких вариантах осуществления, полипептид или белок содержит, по меньшей мере, еще один негликозилированный (т.е. агликозилированный) сайт, то есть полностью незанятый гликановый сайт, к которому не присоединена углеводная группа, или содержит, по меньшей мере, на один углеводный фрагмент меньше в том же потенциальном сайте гликозилирования, чем идентичный полипептид или белок, который продуцируется клеткой в идентичных условиях, но в отсутствие соединения, ингибирующего гликозилирование. Такие соединения известны в данной области техники и могут включать, помимо прочего, туникамицин, гомологи туникаймицина, стрептовирудин, микоспоцидин, амфомицин, цусимицин, антибиотик 24010, антибиотик ММ 19290, бацитрацин, коринетоксин, шоудомицин, дуимицин, 1-дезоксиманноноджиримицин, дезоксиноджиримицин, N-метил-1-дексойманноджиримицин, брефельдин А, аналоги глюкозы и маннозы, 2-дезокси-D-глюкозу, 2-дезоксиглюкозу, D-(+)-маннозу, D-(+) галактозу, 2-дезокси-2-фтор-D-глюкозу, 1,4-дидезокси-1,4-имино-D-маннит (DIM), фторглюкозу, фторманнозу, UDP-2-дезоксиглюкозу, GDP-2-дезоксиглюкозу, ингибиторы гидроксиметилглутарил-СоА-редуктазы, 25-гидроксихолестерин, гидроксихолестерин, свайнсонин, циклогексимид, пуромицин, актиномицин D, монензин, м-хлоркарбонилцианид фенилгидразон (CCCP), компактин, долихил-фосфорил-дезоксиглюкозу, N-ацетил-D-глюкозамин, гигоксантин, тимидин, холестерин, глюкозамин, маннозамин, кастаноспермин, глутамин, бромокондурит, кондуритол эпоксид и производные кондуритола, гликозилметил-п-нитрофенилтриазены, β-гидроксинорвалин, трео-β-фтораспарагин, δ-лактон D-(+)-глюконовой кислоты, ди(2-этилгексил)фосфат, трибутилфосфат, додецилфосфат, 2-диметиламиноэтиловый эфир (дифенилметил)-фосфорной кислоты, йодид [2-(дифенилфосфинилокси)этил]триметиламмония, йодоацетат и/или фторацетат. Специалист в данной области техники легко распознает или сможет определить ингибирующие гликозилирование вещества, которые могут использоваться в соответствии со способами и композициями по настоящему изобретению без ненужных экспериментов. В таких вариантах осуществления, гликозилирование полипептида или его фрагмента можно контролировать без введения аминокислотной мутации в полипептид или его фрагмент.In some embodiments, the glycosylation site (such as Asn-Xaa-Ser/Thr) in the E. coli -derived polypeptide or fragment thereof is not removed or modified. In some embodiments, a compound may be added to the cell culture medium to reduce or inhibit glycosylation. In such embodiments, the polypeptide or protein contains at least one additional non-glycosylated (i.e., aglycosylated) site, that is, a completely unoccupied glycan site to which no carbohydrate group is attached, or contains at least one more carbohydrate fragment is smaller at the same potential glycosylation site than an identical polypeptide or protein that is produced by a cell under identical conditions but in the absence of a compound that inhibits glycosylation. Such compounds are known in the art and may include, but are not limited to, tunicamycin, tunicamycin homologues, streptovirudin, mycospocidin, amphomycin, tsushimycin, antibiotic 24010, antibiotic MM 19290, bacitracin, corinetoxin, showdomycin, duimicin, 1-deoxymannonojirimycin, deoxynojirimycin, N- methyl-1-dexoymannnojirimycin, brefeldin A, glucose and mannose analogues, 2-deoxy-D-glucose, 2-deoxyglucose, D-(+)-mannose, D-(+) galactose, 2-deoxy-2-fluoro-D -glucose, 1,4-dideoxy-1,4-imino-D-mannitol (DIM), fluoroglucose, fluoromannose, UDP-2-deoxyglucose, GDP-2-deoxyglucose, hydroxymethylglutaryl-CoA reductase inhibitors, 25-hydroxycholesterol, hydroxycholesterol , swainsonine, cycloheximide, puromycin, actinomycin D, monensin, m-chlorocarbonyl cyanide phenylhydrazone (CCCP), compactin, dolichyl phosphoryl deoxyglucose, N-acetyl-D-glucosamine, higoxanthin, thymidine, cholesterol, glucosamine, mannosamine, castanospermine, glutamine, bromocondurite, conduritol epoxide and conduritol derivatives, glycosylmethyl-p-nitrophenyl triazenes, β-hydroxynorvaline, threo-β-fluoroasparagine, D-(+)-gluconic acid δ-lactone, di(2-ethylhexyl)phosphate, tributyl phosphate, dodecyl phosphate, 2- (diphenylmethyl)phosphoric acid dimethylaminoethyl ester, [2-(diphenylphosphinyloxy)ethyl]trimethylammonium iodide, iodoacetate and/or fluoroacetate. One skilled in the art will readily recognize or be able to identify glycosylation inhibitory substances that can be used in accordance with the methods and compositions of the present invention without unnecessary experimentation. In such embodiments, glycosylation of the polypeptide or fragment thereof can be controlled without introducing an amino acid mutation into the polypeptide or fragment thereof.

В некоторых вариантах осуществления, уровень гликозилирования (например, количество гликановых сайтов, которые заняты на полипептиде или его фрагменте, размер и/или сложность гликоформы в этом сайте и подобные) полипептида или его фрагмента, продуцируемого клетки млекопитающих, ниже, чем уровни гликозилирования полипептида или его фрагмента, продуцируемые в идентичных во всем остальном условиях в идентичной во всем остальном среде, в которой отсутствует такое соединение, ингибирующее гликолиз, и/или мутация.In some embodiments, the level of glycosylation (e.g., the number of glycan sites that are occupied on a polypeptide or fragment thereof, the size and/or complexity of the glycoform at that site, and the like) of the polypeptide or fragment thereof produced by the mammalian cell is lower than the glycosylation levels of the polypeptide or fragment thereof, produced under otherwise identical conditions in an otherwise identical environment in which such glycolysis-inhibiting compound and/or mutation is absent.

В некоторых вариантах осуществления, последовательность полипептида, полученного из E.coli, или его фрагмента не включает сайт гликозилирования N-связанного белка. В некоторых вариантах осуществления, последовательность полипептида, полученного из E.coli, или его фрагмента не включает, по меньшей мере, один сайт гликозилирования N-связанного белка. В некоторых вариантах осуществления, последовательность полипептида, полученного из E.coli, или его фрагмента не включает какие-либо сайты гликозилирования N-связанного белка. В некоторых вариантах осуществления, последовательность полипептида, полученного из E. coli, или его фрагмента включает сайт гликозилирования N-связанного белка. В некоторых вариантах осуществления, последовательность полипептида, полученного из E. coli, или его фрагмента включает не более 1 сайта гликозилирования N-связанного белка. В некоторых вариантах осуществления, последовательность полипептида, полученного из E. coli, или его фрагмента включает не более 2 сайтов гликозилирования N-связанного белка.In some embodiments, the sequence of the E. coli derived polypeptide or fragment thereof does not include a glycosylation site for an N-linked protein. In some embodiments, the sequence of the E. coli derived polypeptide or fragment thereof does not include at least one N-linked protein glycosylation site. In some embodiments, the sequence of the E. coli derived polypeptide or fragment thereof does not include any N-linked protein glycosylation sites. In some embodiments, the sequence of the E. coli -derived polypeptide or fragment thereof includes a glycosylation site for an N-linked protein. In some embodiments, the sequence of the E. coli -derived polypeptide or fragment thereof includes no more than 1 N-linked protein glycosylation site. In some embodiments, the sequence of the E. coli -derived polypeptide or fragment thereof includes no more than 2 N-linked protein glycosylation sites.

Полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент, экспрессируемый различными клеточными линиями или у трансгенных животных, может иметь различные по сравнению друг с другом занятости гликановых сайтов, гликоформы и/или паттерны гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления, изобретение охватывает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент, независимо от гликозилирования, присутствия гликана или структуры гликоформ полипептида, полученного из E.coli, или его фрагмента, продуцируемого в клетке млекопитающего.A polypeptide derived from E. coli , or a fragment thereof, expressed in different cell lines or in transgenic animals may have different glycan site occupancies, glycoforms and/or glycosylation patterns compared to each other. In some embodiments, the invention covers an E. coli -derived polypeptide or fragment thereof, regardless of the glycosylation, glycan presence or glycoform structure of the E. coli -derived polypeptide or fragment thereof produced in a mammalian cell.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент может быть получен из полипептида E. coli FimH, где аминокислотный остаток в положении 1 полипептида представляет собой фенилаланин, а не метионин, например, полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Предпочтительно, полипептид, полученный из E.coli FimH, содержит фенилаланин в положении 1 аминокислотной последовательности полипептида, полученного из E.coli. В другом предпочтительном варианте осуществления, полипептид, полученный из E.coli FimH, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, где, предпочтительно, остаток в положении 1 аминокислотной последовательности полипептида, полученного из E.coli, представляет собой фенилаланин. В некоторых вариантах осуществления, полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, которая может быть получена из полипептида FimH E.coli. In some embodiments, the E. coli -derived polypeptide, or a fragment thereof, may be derived from an E. coli FimH polypeptide, wherein the amino acid residue at position 1 of the polypeptide is phenylalanine rather than methionine, for example, a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Preferably, the E. coli -derived polypeptide FimH contains phenylalanine at position 1 of the amino acid sequence of the E. coli- derived polypeptide. In another preferred embodiment, the E. coli -derived polypeptide FimH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, where preferably the residue at position 1 of the amino acid sequence of the E. coli -derived polypeptide is phenylalanine. In some embodiments, the E. coli -derived polypeptide, or fragment thereof, may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, which may be derived from the E. coli FimH polypeptide.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9% или 100% идентичность любой из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 29. В некоторых вариантах осуществления, полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент может быть получен из FimG полипептида E. coli, например, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления, полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент может быть получен из FimC полипептида E. coli, например, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.In some embodiments, the E. coli -derived polypeptide, or fragment thereof, comprises an amino acid sequence having at least 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% , 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, or 100% identical to any of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, and SEQ ID NO: 29. In some embodiments, the E. coli -derived polypeptide, or a fragment thereof, may be derived from a FimG polypeptide E. coli , for example, having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9. In some embodiments, the E. coli -derived polypeptide, or a fragment thereof, may be derived from an E. coli FimC polypeptide, for example, having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.

А. Полипептиды, полученные из FimHA. Polypeptides derived from FimH E. coli E. coli , и их фрагменты, and their fragments

Бактериальные фимбриальные адгезины FimH и FmlH позволяют Escherichia coli использовать различные микросреды мочевыводящих путей посредством распознавания специфических гликопротеинов клеток-хозяев. FimH связывается с манозилированными рецепторами уроплакина в уроэпителии, тогда как FmlH связывается с галактозой или N-ацетилгалактозамин-О-гликанами на эпителиальных поверхностных белках в почках и воспаленном мочевом пузыре. Фимбрии FimH также играют роль в колонизации энтеротоксигенной E.coli (ETEC) и инвазивной E.coli с множественной лекарственной резистентностью в кишечнике посредством связывания с высокоманнозилированными белками на кишечном эпителии.The bacterial fimbrial adhesins FimH and FmlH allow Escherichia coli to exploit different urinary tract microenvironments through recognition of specific host cell glycoproteins. FimH binds to manosylated uroplakin receptors in the uroepithelium, whereas FmlH binds to galactose or N-acetylgalactosamine-O-glycans on epithelial surface proteins in the kidney and inflamed bladder. FimH fimbriae also play a role in the colonization of enterotoxigenic E. coli (ETEC) and invasive multidrug-resistant E. coli in the intestine by binding to highly mannosylated proteins on the intestinal epithelium.

Полноразмерный FimH состоит из двух доменов: N-концевого лектинового домена и С-концевого пилинового домена, которые соединены коротким линкером. Лектиновый домен FimH содержит домен распознавания углеводов, который отвечает за связывание с маннозилированным уроплакином 1a на поверхности уротелиальных клеток. Пилиновый домен прикрепляется к ядру пилуса через донорную цепь последующей субъединицы FimG, что представляет собой процесс, называемый комплементацией донорной цепи.Full-length FimH consists of two domains: an N-terminal lectin domain and a C-terminal pilin domain, which are connected by a short linker. The lectin domain of FimH contains a carbohydrate recognition domain that is responsible for binding to mannosylated uroplakin 1a on the surface of urothelial cells. The pilin domain is attached to the pilus core through the donor strand of the subsequent FimG subunit, in a process called donor strand complementation.

Конформация и лиганд-связывающие свойства лектинового домена FimH находятся под аллостерическим контролем пилинового домена FimH. В статических условиях, взаимодействие двух доменов полноразмерного FimH стабилизирует лектиновый домен в области низкой аффинности к мономаннозе (например, K _d ~ 300 мкМ), которое характеризуется неглубоким карманом связывания. Связывание с маннозидным лигандом вызывает конформационные изменения, ведущие к состоянию средней аффинности, при котором лектиновый и пилиновый домены остаются в тесном контакте. Однако при напряжении сдвига лектиновый и пилиновый домены разделяются, тем самым вызывая состояние высокой аффинности (например, K _d <1,2 мкМ).The conformation and ligand-binding properties of the lectin domain of FimH are under allosteric control of the pilin domain of FimH. Under static conditions, the interaction of the two domains of full-length FimH stabilizes the lectin domain in a region of low affinity for monomannose (e.g., K _d ~ 300 μM), which is characterized by a shallow binding pocket. Binding to a mannoside ligand causes a conformational change leading to a medium-affinity state in which the lectin and pilin domains remain in close contact. However, under shear stress, the lectin and pilin domains separate, thereby inducing a high affinity state (eg, K _d <1.2 μM).

Из-за отсутствия отрицательной аллостерической регуляции, осуществляемой пилиновым доменом, выделенный лектиновый домен FimH заблокирован в высокоаффинном состоянии. Выделенный рекомбинантный лектиновый домен, который заблокирован в высокоаффинном состоянии, проявляет высокую стабильность. Однако блокировка адгезина в конформации с низким уровнем связывания индуцирует выработку ингибирующих адгезию антител. Соответственно, существует интерес к стабилизации лектинового домена в низкоаффинном состоянии.Due to the lack of negative allosteric regulation exerted by the pilin domain, the isolated lectin domain of FimH is locked in a high-affinity state. The isolated recombinant lectin domain, which is locked in a high affinity state, exhibits high stability. However, blocking the adhesin in a low-binding conformation induces the production of adhesion-inhibiting antibodies. Accordingly, there is interest in stabilizing the lectin domain in a low-affinity state.

Существует дополнительный интерес к способам экспрессии FimH с высокими выходами, достаточными для разработки продукта. Препятствием для разработки композиций, содержащих FimH, является низкий выход, достигаемый при экспрессии FimH в нативном состоянии в периплазме E. coli. Типовые выходы, указанные в лабораторных условиях, составляют 3-5 мг/л для очищенного комплекса FimCH и 4-10 мг/л для FimH(LD), что ниже уровней, которые считаются масштабируемыми для производства материала для клинических испытаний. Конформация FimH in vivo отличается от конформации очищенной рекомбинантной формы белка. В общем, FimH имеет нативную конформацию, которая, по меньшей мере, частично определяется взаимодействием in vivo FimH с его периплазматическим белком теплового шока, называемым FimC.There is additional interest in ways to express FimH in high yields sufficient for product development. An obstacle to the development of compositions containing FimH is the low yield achieved when FimH is expressed in its native state in the periplasm of E. coli . Typical yields reported in vitro are 3-5 mg/L for purified FimCH complex and 4-10 mg/L for FimH(LD), which are below levels considered scalable for production of clinical trial material. The conformation of FimH in vivo differs from that of the purified recombinant form of the protein. In general, FimH has a native conformation that is at least partially determined by the in vivo interaction of FimH with its periplasmic heat shock protein called FimC.

Рекомбинантное продуцирование FimH остается сложной задачей. Экспрессия и очистка белков не является рутинным процессом.Recombinant production of FimH remains challenging. Expression and purification of proteins is not a routine process.

В предпочтительном варианте осуществления, полипептид или его фрагмент происходят из FimH E. coli. В некоторых вариантах осуществления, полипептид или его фрагмент включает полноразмерный FimH E. coli. Полноразмерный FimH включает два домена: N-концевой лектиновый домен и С-концевой пилиновый домен, которые соединены коротким линкером. В некоторых вариантах осуществления, полная длина FimH E.coli включает 279 аминокислот, что включает полную длину зрелого белка FimH E.coli. В некоторых вариантах осуществления, полная длина FimH E.coli включает 300 аминокислот, что включает полную длину зрелого белка FimH E.coli и последовательность сигнального пептида, имеющую длину 21 аминокислоту. Первичная структура FimH дикого типа длиной 300 аминокислот высоко консервативна во всех штаммах E. coli.In a preferred embodiment, the polypeptide or fragment thereof is derived from E. coli FimH. In some embodiments, the polypeptide or fragment thereof comprises full-length E. coli FimH. Full-length FimH includes two domains: an N-terminal lectin domain and a C-terminal pilin domain, which are connected by a short linker. In some embodiments, the full length of E. coli FimH comprises 279 amino acids, which includes the full length of the mature E. coli FimH protein. In some embodiments, the full length of E. coli FimH comprises 300 amino acids, which includes the full length of the mature E. coli FimH protein and a signal peptide sequence having a length of 21 amino acids. The primary structure of wild-type FimH, 300 amino acids long, is highly conserved across E. coli strains.

Типовой последовательностью для полноразмерного FimH E. coli является SEQ ID NO: 1. Полноразмерная последовательность FimH включает последовательность лектинового домена и последовательность пилинового домена. Лектиновый домен FimH содержит домен распознавания углеводов, который отвечает за связывание с маннозилированным уроплакином 1a на поверхности уротелиальных клеток. Пилиновый домен прикрепляется к ядру пилуса через донорную цепь последующей субъединицы FimG, что представляет собой процесс, называемый комплементацией донорной цепи.The representative sequence for full-length E. coli FimH is SEQ ID NO: 1. The full-length FimH sequence includes a lectin domain sequence and a pilin domain sequence. The lectin domain of FimH contains a carbohydrate recognition domain that is responsible for binding to mannosylated uroplakin 1a on the surface of urothelial cells. The pilin domain is attached to the pilus core through the donor strand of the subsequent FimG subunit, in a process called donor strand complementation.

Начиная с N-конца, названия и в скобках иллюстративные аминокислотные последовательности каждого домена полноразмерного FimH следующие: лектин FimH (SEQ ID NO: 2) и пилин FimH (SEQ ID NO: 3).Starting from the N-terminus, the name and in parentheses, exemplary amino acid sequences of each domain of full-length FimH are as follows: FimH lectin (SEQ ID NO: 2) and FimH pilin (SEQ ID NO: 3).

Другие подходящие полипептиды и их фрагменты, полученные из E. coli FimH, включают варианты, которые имеют различную степень идентичности с любой из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 29, такую, как, по меньшей мере, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% идентичность любой из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 29. В некоторых вариантах осуществления, варианты белков FimH: (i) образуют часть FimH-FimC; (ii) содержат, по меньшей мере, один эпитоп из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 29; и/или (iii) могут индуцировать антитела in vivo, которые иммунологически перекрестно реагируют с FimH E. coli.Other suitable polypeptides and fragments thereof derived from E. coli FimH include variants that have varying degrees of identity to any of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29, such as at least 70%, 71%, 72 %, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 99.9% identical to any of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29. In some embodiments, the FimH protein variants: (i) form a FimH-FimC portion; (ii) contain at least one epitope from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29; and/or (iii) can induce antibodies in vivo that immunologically cross-react with E. coli FimH.

В некоторых вариантах осуществления композиция включает полипептид, содержащий, по меньшей мере, n последовательных аминокислот из любой из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 29, где n равно 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 и более). Предпочтительно, фрагменты включают эпитоп из последовательности. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает полипептид, содержащий, по меньшей мере, 50 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере, 100 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере, 125 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере, 150 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере, 175 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере, по меньшей мере, 200 последовательных аминокислотных остатков или по меньшей мере, 250 последовательных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 29.In some embodiments, the composition includes a polypeptide comprising at least n consecutive amino acids from any of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29, where n is 7 or more (for example, 8, 10, 12, 14, 16, 18 , 20 or more). Preferably, the fragments include an epitope from the sequence. In some embodiments, the composition includes a polypeptide comprising at least 50 contiguous amino acid residues, at least 100 contiguous amino acid residues, at least 125 contiguous amino acid residues, at least 150 contiguous amino acid residues, at least , 175 contiguous amino acid residues, at least at least 200 contiguous amino acid residues, or at least 250 contiguous amino acid residues of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29.

В некоторых вариантах осуществления, композиция включает полипептид, имеющий, по меньшей мере, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% идентичность с SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает полипептид, имеющий, по меньшей мере, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% идентичность с SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает полипептид, имеющий по меньшей мере, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% идентичность с SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает полипептид, имеющий, по меньшей мере, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% идентичность с SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает полипептид, имеющий, по меньшей мере, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% идентичность с SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает полипептид, имеющий, по меньшей мере, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% идентичность с SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает полипептид, имеющий, по меньшей мере, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% идентичность SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает полипептид, содержащий, по меньшей мере, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% идентичность с SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает полипептид, имеющий, по меньшей мере, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% идентичность с SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает полипептид, имеющий, по меньшей мере, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% идентичность с SEQ ID NO: 30.In some embodiments, the composition includes a polypeptide having at least 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81% , 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99%, or 99.9% identity to SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the composition includes a polypeptide having at least 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92% 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 99.9% identity with SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the composition includes a polypeptide having at least 70% , 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87 %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 99.9% identity with SEQ ID NO: 3. In some embodiments, the composition includes a polypeptide having at least 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81% , 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99%, or 99.9% identity to SEQ ID NO: 4. In some embodiments, the composition includes a polypeptide having at least 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 99.9% identity to SEQ ID NO: 20. In some embodiments, the composition includes a polypeptide having at least 70 %, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 99.9% identity with SEQ ID NO: 23 In some embodiments, the composition includes a polypeptide having at least 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81. %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 99.9% identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, the composition includes a polypeptide containing at least 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 99.9% identity with SEQ ID NO: 26. In some embodiments, the composition includes a polypeptide having at least 70 %, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 99.9% identity with SEQ ID NO: 28 In some embodiments, the composition includes a polypeptide having at least 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81. %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 99.9% identity with SEQ ID NO: 30.

Другой пример подходящего полипептида и его фрагментов, полученных из E. coli FimH, описанных в настоящем документе, показан как SEQ ID NO: 2, в котором отсутствует N-концевая сигнальная последовательность дикого типа, и он соответствует аминокислотным остаткам 22-300 SEQ ID NO: 1. Другой пример фрагмента FimH включает всю N-концевую сигнальную последовательность и зрелый белок, как указано в SEQ ID NO: 1.Another example of a suitable polypeptide and fragments thereof derived from E. coli FimH described herein is shown as SEQ ID NO: 2, which lacks the wild-type N-terminal signal sequence and corresponds to amino acid residues 22-300 of SEQ ID NO: : 1. Another example of a FimH fragment includes the entire N-terminal signal sequence and the mature protein as set forth in SEQ ID NO: 1.

В некоторых вариантах осуществления, сайт гликозилирования в полипептиде, полученном из E.coli, или его фрагменте, удален посредством мутации в последовательности полипептида, полученного из E.coli, или его фрагмента. Например, в некоторых вариантах осуществления, остаток Asn в положении 7 зрелого полипептида FimH E. coli (например, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2) может быть мутирован, предпочтительно путем замены. В некоторых вариантах осуществления, остаток Asn в положении 7 лектинового домена полипептида FimH E. coli (например, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 3) может быть мутирован, предпочтительно путем замены. В некоторых вариантах осуществления замена остатка выбрана из любого из Ser, Asp, Thr и Gln.In some embodiments, a glycosylation site in an E. coli -derived polypeptide or fragment thereof is removed by mutation in the sequence of the E. coli -derived polypeptide or fragment thereof. For example, in some embodiments, the Asn residue at position 7 of a mature E. coli FimH polypeptide (eg, as assigned to SEQ ID NO: 2) may be mutated, preferably by substitution. In some embodiments, the Asn residue at position 7 of the lectin domain of an E. coli FimH polypeptide (eg, as assigned to SEQ ID NO: 3) may be mutated, preferably by substitution. In some embodiments, the residue substitution is selected from any of Ser, Asp, Thr, and Gln.

В некоторых вариантах осуществления, остаток Thr в положении 10 зрелого полипептида FimH E. coli (например, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2) может быть мутирован, предпочтительно путем замены. В некоторых вариантах осуществления, остаток Thr в положении 7 лектинового домена полипептида FimH E. coli (например, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 3) может быть мутирован, предпочтительно путем замены. В некоторых вариантах осуществления, замена остатка выбрана из любого из Ser, Asp и Gln.In some embodiments, the Thr residue at position 10 of a mature E. coli FimH polypeptide (eg, as assigned to SEQ ID NO: 2) may be mutated, preferably by substitution. In some embodiments, the Thr residue at position 7 of the lectin domain of an E. coli FimH polypeptide (eg, as assigned to SEQ ID NO: 3) may be mutated, preferably by substitution. In some embodiments, the residue substitution is selected from any of Ser, Asp, and Gln.

В некоторых вариантах осуществления, остаток Asn в положении N235 зрелого полипептида FimH E. coli (например, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2) может быть мутирован, предпочтительно путем замены. В некоторых вариантах осуществления, остаток Asn в положении N228 зрелого полипептида FimH E. coli (например, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2) может быть мутирован, предпочтительно путем замены. В некоторых вариантах осуществления, замена остатка выбрана из любого из Ser, Asp, Thr и Gln.In some embodiments, the Asn residue at position N235 of a mature E. coli FimH polypeptide (eg, as assigned to SEQ ID NO: 2) may be mutated, preferably by substitution. In some embodiments, the Asn residue at position N228 of a mature E. coli FimH polypeptide (eg, as assigned to SEQ ID NO: 2) may be mutated, preferably by substitution. In some embodiments, the residue substitution is selected from any of Ser, Asp, Thr, and Gln.

В некоторых вариантах осуществления, остаток Asn в положении 70 зрелого полипептида FimH E. coli (например, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2) может быть мутирован, предпочтительно путем замены. В некоторых вариантах осуществления, остаток Asn в положении 70 лектинового домена полипептида FimH E. coli (например, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 3) может быть мутирован, предпочтительно путем замены. В некоторых вариантах осуществления, замена остатка выбрана из любого из Ser, Asp, Thr и Gln.In some embodiments, the Asn residue at position 70 of a mature E. coli FimH polypeptide (eg, as assigned to SEQ ID NO: 2) may be mutated, preferably by substitution. In some embodiments, the Asn residue at position 70 of the lectin domain of an E. coli FimH polypeptide (eg, as assigned to SEQ ID NO: 3) may be mutated, preferably by substitution. In some embodiments, the residue substitution is selected from any of Ser, Asp, Thr, and Gln.

В некоторых вариантах осуществления, остаток Ser в положении 72 зрелого полипептида FimH E. coli (например, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2) может быть мутирован, предпочтительно путем замены. В некоторых вариантах осуществления, остаток Ser в положении 72 лектинового домена полипептида FimH E. coli (например, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 3) может быть мутирован, предпочтительно путем замены. В некоторых вариантах осуществления, замена остатка выбрана из любого из Asp, Thr и Gln.In some embodiments, the Ser residue at position 72 of a mature E. coli FimH polypeptide (eg, as assigned to SEQ ID NO: 2) may be mutated, preferably by substitution. In some embodiments, the Ser residue at position 72 of the lectin domain of an E. coli FimH polypeptide (eg, as assigned to SEQ ID NO: 3) may be mutated, preferably by substitution. In some embodiments, the residue replacement is selected from any of Asp, Thr, and Gln.

Используемый в настоящем документе термин «фрагмент» относится к полипептиду и определяется как любая дискретная часть данного полипептида, которая уникальна или характерна для этого полипептида. Используемый в настоящем документе термин также относится к любой отдельной части данного полипептида, которая сохраняет, по меньшей мере, часть активности полноразмерного полипептида. В некоторых вариантах осуществления, доля сохраняемой активности составляет, по меньшей мере, 10% активности полноразмерного полипептида. В некоторых вариантах осуществления, доля сохраняемой активности составляет, по меньшей мере, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% активности полноразмерного полипептида. В некоторых вариантах осуществления, доля сохраняемой активности составляет, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% активности полноразмерного полипептида. В некоторых вариантах осуществления, доля сохраняемой активности составляет 100% или более от активности полноразмерного полипептида. В некоторых вариантах осуществления, фрагмент включает, по меньшей мере, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более последовательных аминокислот полноразмерного полипептида.As used herein, the term “fragment” refers to a polypeptide and is defined as any discrete part of a given polypeptide that is unique or characteristic of that polypeptide. As used herein, the term also refers to any individual portion of a given polypeptide that retains at least a portion of the activity of the full-length polypeptide. In some embodiments, the proportion of activity retained is at least 10% of the activity of the full-length polypeptide. In some embodiments, the percentage of activity retained is at least 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90% of the activity of the full-length polypeptide. In some embodiments, the percentage of activity retained is at least 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% of the activity of the full-length polypeptide. In some embodiments, the percentage of activity retained is 100% or more of the activity of the full-length polypeptide. In some embodiments, the fragment includes at least 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 or more consecutive amino acids of a full-length polypeptide.

В. Комплекс FimH, FimC и их фрагментовB. Complex of FimH, FimC and their fragments

В некоторых вариантах осуществления, полипептид, полученный из E.coli FimH, или его фрагмент присутствует в комплексе с полипептидом, полученным из E.coli. FimC или его фрагментом. В предпочтительном варианте осуществления, полипептид, полученный из E. coli FimH или его фрагмент, и полипептид, полученный из E. coli FimC или его фрагмент присутствуют в комплексе, предпочтительно, в соотношении 1:1 в комплексе. Не ограничиваясь какой-либо теорией или механизмом, полноразмерный FimH может быть стабилизирован в активной конформации с помощью периплазматического белка теплового шока FimC, что делает возможным очистку полноразмерного белка FimH. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления, полипептид или его фрагмент включает полноразмерный FimH и полноразмерный FimC.In some embodiments, the E. coli FimH-derived polypeptide, or a fragment thereof, is present in complex with the E. coli -derived polypeptide. FimC or a fragment thereof. In a preferred embodiment, the E. coli FimH-derived polypeptide or fragment thereof and the E. coli FimC-derived polypeptide or fragment thereof are present in the complex, preferably in a 1:1 ratio in the complex. Without being limited to any theory or mechanism, full-length FimH can be stabilized in the active conformation by the periplasmic heat shock protein FimC, allowing purification of the full-length FimH protein. Accordingly, in some embodiments, the polypeptide or fragment thereof includes full-length FimH and full-length FimC.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид или его фрагмент включает фрагмент FimH и фрагмент FimC. В некоторых вариантах осуществления, полипептид или его фрагмент включает полноразмерный FimH и фрагмент FimC. Типовая последовательность FimC E.coli представлена в SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах осуществления, полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент включает комплексообразующие фрагменты FimH.In some embodiments, the polypeptide or fragment thereof includes a FimH fragment and a FimC fragment. In some embodiments, the polypeptide or fragment thereof includes a full-length FimH and a FimC fragment. Type sequence of FimC E. coli presented in SEQ ID NO: 10. In some embodiments, a polypeptide derived from E.coli, or its fragment includes complex-forming fragments of FimH.

Комплексообразующий фрагмент FimH может представлять собой любую часть или часть белка FimH, которые сохраняют способность образовывать комплекс с FimC или его фрагментом. Подходящий комплексообразующий фрагмент FimH также может быть получен или определен с помощью стандартных анализов, известных в данной области техники, таких как ко-иммунопреципитация, перекрестное связывание или совместная локализация с помощью флуоресцентного окрашивания и т.д. SDS-PAGE или вестерн-блотинг также могут быть использованы. (например, показывая, что фрагмент FimH и FimC или его фрагмент находятся в комплексе, что подтверждается гель-электрофорезом). В некоторых вариантах осуществления, комплексообразующий фрагмент FimH (i) образует часть комплекса FimH-FimC; (ii) содержит, по меньшей мере, один эпитоп из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 29; и/или (iii) может индуцировать антитела in vivo, которые иммунологически перекрестно реагируют с FimH E. coli.A complexing fragment of FimH can be any portion or portion of the FimH protein that retains the ability to form a complex with FimC or a fragment thereof. A suitable complexing fragment of FimH can also be obtained or determined using standard assays known in the art, such as co-immunoprecipitation, cross-linking or fluorescent staining co-localization, etc. SDS-PAGE or Western blotting can also be used. (eg, showing that the FimH fragment and FimC or a fragment thereof are in a complex, as confirmed by gel electrophoresis). In some embodiments, the FimH complexing moiety (i) forms part of a FimH-FimC complex; (ii) contains at least one epitope from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29; and/or (iii) can induce antibodies in vivo that immunologically cross-react with E. coli FimH.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент включает полноразмерный FimH, где FimH не находится в комплексе с FimC. В дополнительных вариантах осуществления, полипептид или его фрагмент включает фрагмент FimH, где фрагмент не образует комплекс с FimC. В некоторых вариантах осуществления, полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент FimC включает SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах осуществления, комплекс может быть экспрессирован из одной и той же плазмиды, предпочтительно, под контролем отдельных промоторов для каждого полипептида или его фрагмента.In some embodiments, the E. coli -derived polypeptide or fragment thereof comprises full-length FimH, where FimH is not complexed with FimC. In additional embodiments, the polypeptide or fragment thereof includes a FimH fragment, where the fragment does not form a complex with FimC. In some embodiments, the E. coli -derived polypeptide, or FimC fragment thereof, includes SEQ ID NO: 10. In some embodiments, the complex may be expressed from the same plasmid, preferably under the control of separate promoters for each polypeptide or its fragment.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид, полученный из FimH E. coli, или его фрагмента, связывается с полипептидом, полученным из FimC E. coli, или его фрагментом, который может быть встроен в структуру полипептида, полученного из E. coli. FimH или его фрагмента. Часть молекулы FimC, которая связывается с FimH в комплексе, называется «донорной цепью», и механизм образования нативной структуры FimH с использованием цепи из FimC, которая связывается с FimH в комплексе FimCH, известен как «комплементация донорной цепи».In some embodiments, the E. coli FimH-derived polypeptide, or a fragment thereof, is linked to an E. coli FimC-derived polypeptide, or a fragment thereof, which may be incorporated into the E. coli- derived polypeptide. FimH or its fragment. The part of the FimC molecule that binds to FimH in a complex is called the "donor strand", and the mechanism of formation of the native FimH structure using a strand from FimC that binds to FimH in the FimCH complex is known as "donor strand complementation".

В некоторых вариантах осуществления, полипептид, полученный из FimH E. coli, или его фрагмент может быть экспрессирован соответствующей версией FimH, комплементированной донорной цепью, где аминокислотная последовательность FimC, которая взаимодействует с FimH в комплексе FimCH, сама сконструирована в C-конце FimH для обеспечения нативной конформации без необходимости присутствия остатка молекулы FimC. В некоторых вариантах осуществления, полипептид, полученный из FimH E. coli, или его фрагмент может быть экспрессирован в форме комплекса, который включает его изолированные домены, такие как лектинсвязывающий домен и пилиновый домен, и такие домены могут быть связаны друг с другом ковалентно или нековалентно. Например, в некоторых вариантах осуществления, связывающий сегмент может включать аминокислотные последовательности или другие олигомерные структуры, в том числе, простые полимерные структуры.In some embodiments, a polypeptide derived from E. coli FimH, or a fragment thereof, can be expressed by a corresponding version of FimH complemented by a donor strand, wherein the amino acid sequence FimC that interacts with FimH in the FimCH complex is itself engineered at the C terminus of FimH to provide native conformation without the need for the presence of a residue of the FimC molecule. In some embodiments, the E. coli FimH-derived polypeptide or fragment thereof may be expressed in the form of a complex that includes isolated domains thereof, such as a lectin binding domain and a pilin domain, and such domains may be linked to each other covalently or non-covalently . For example, in some embodiments, the binding segment may include amino acid sequences or other oligomeric structures, including simple polymeric structures.

Способы и композиции по изобретению могут включать описанные в настоящем документе комплексы, в которых указанные полипептиды или их фрагменты, полученные из E. coli, коэкспрессируются или образуются в комбинированном состоянии.The methods and compositions of the invention may include complexes described herein in which the E. coli -derived polypeptides or fragments thereof are coexpressed or formed in a combined state.

С. Лектиновый домен, пилиновый домен и их вариантыC. Lectin domain, pilin domain and their variants

Конформация и лиганд-связывающие свойства лектинового домена FimH могут находиться под аллостерическим контролем пилинового домена FimH. В статических условиях, взаимодействие двух доменов полноразмерного FimH стабилизирует лектиновый домен в состоянии с низким сродством к мономаннозе (например, K _d ~ 300 мкМ), для которого характерен неглубокий карман связывания. Связывание с маннозидным лигандом может вызывать конформационные изменения, ведущие к состоянию средней аффинности, при котором лектиновый и пилиновый домены остаются в тесном контакте. Однако при напряжении сдвига лектиновый и пилиновый домены могут разделяться и индуцировать состояние высокого сродства (например, K _d <1,2 мкМ).The conformation and ligand-binding properties of the lectin domain of FimH may be under allosteric control of the pilin domain of FimH. Under static conditions, the interaction of the two domains of full-length FimH stabilizes the lectin domain in a low-affinity state for monomannose (e.g., K _d ~300 μM), which is characterized by a shallow binding pocket. Binding to a mannoside ligand can cause a conformational change leading to a mid-affinity state in which the lectin and pilin domains remain in close contact. However, under shear stress, the lectin and pilin domains can separate and induce a high-affinity state (eg, K _d <1.2 μM).

Из-за отсутствия отрицательной аллостерической регуляции, осуществляемой пилиновым доменом, изолированный лектиновый домен FimH заблокирован в высокоаффинном состоянии (например, K _d <1,2 мкМ). Изолированный рекомбинантный лектиновый домен, который заблокирован в высокоаффинном состоянии. Блокировка адгезина в низкоаффинной конформации (например, K _d ~ 300 мкМ), однако, индуцирует выработку ингибирующих адгезию антител. Соответственно, существует интерес к стабилизации лектинового домена в низкоаффинном состоянии.Due to the lack of negative allosteric regulation exerted by the pilin domain, the isolated lectin domain of FimH is locked in a high-affinity state (e.g., K _d <1.2 μM). An isolated recombinant lectin domain that is locked in a high affinity state. Blocking the adhesin in a low-affinity conformation (eg, K _d ~ 300 μM), however, induces the production of adhesion-inhibiting antibodies. Accordingly, there is interest in stabilizing the lectin domain in a low-affinity state.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент включает лектиновый домен FimH E.coli. Примеры последовательностей лектинового домена включают любую из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления, лектиновый домен E. coli FimH включает цистеиновые замены. В предпочтительном варианте осуществления, лектиновый домен FimH E. coli включает цистеиновые замены в первых 50 аминокислотных остатках лектинового домена. В некоторых вариантах осуществления, лектиновый домен может включать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 цистеиновых замен. Предпочтительно, лектиновый домен включает 2 цистеиновых замены. См., например, pSB02158 и pSB02198.In some embodiments, a polypeptide derived from E.coli, or a fragment thereof includes the FimH lectin domain E.coli. Examples of lectin domain sequences include any of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 24, and SEQ ID NO: 26. In some embodiments, the lectin domain E. coli FimH includes cysteine substitutions. In a preferred embodiment, the FimH lectin domain E. coli includes cysteine substitutions in the first 50 amino acid residues of the lectin domain. In some embodiments, the lectin domain may include 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 cysteine substitutions. Preferably, the lectin domain includes 2 cysteine substitutions. See, for example, pSB02158 and pSB02198.

Другие подходящие полипептиды и их фрагменты, полученные из FimH E. coli, включают варианты лектинового домена FimH, которые имеют различную степень идентичности с SEQ ID NO: 3, такую как, по меньшей мере, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% идентичность последовательности, указанной в SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает полипептид, имеющий, по меньшей мере, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% идентичность SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления, полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент включает пилиновый домен FimH E.coli. Другие подходящие полипептиды и их фрагменты, полученные из FimH E. coli, включают варианты пилинового домена FimH, которые имеют различную степень идентичности с SEQ ID NO: 7, такую как, по меньшей мере, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% идентичность последовательности, указанной в SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает полипептид, имеющий, по меньшей мере, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% идентичность SEQ ID NO: 4. Другие подходящие полипептиды и их фрагменты, полученные из FimH E. coli, включают варианты лектинового домена FimH, которые имеют различную степень идентичности с SEQ ID NO: 8, такую как, по меньшей мере, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% идентичность к последовательности, указанной в SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает полипептид, имеющий, по меньшей мере, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% идентичность с SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления, полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент включает пилиновый домен FimH E. coli. Другие подходящие полипептиды и их фрагменты, полученные из FimH E. coli, включают варианты пилинового домена FimH, которые имеют различную степень идентичности с SEQ ID NO: 24, такую как, по меньшей мере, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% идентичность последовательности, указанной в SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает полипептид, имеющий, по меньшей мере, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% идентичность SEQ ID NO: 24. Другие подходящие полипептиды и их фрагменты, полученные из FimH E. coli, включают варианты лектинового домена FimH, которые имеют различную степень идентичности с SEQ ID NO: 26, такую как, по меньшей мере, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% идентичность последовательности SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает полипептид, имеющий, по меньшей мере, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% идентичность SEQ ID NO: 26.Other suitable polypeptides and fragments thereof derived from E. coli FimH include FimH lectin domain variants that have varying degrees of identity to SEQ ID NO: 3, such as at least 70%, 71%, 72%, 73% , 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 99.9% sequence identity to SEQ ID NO: 3. In some embodiments, the composition includes a polypeptide having at least 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83% , 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 99 .9% identity to SEQ ID NO: 3. In some embodiments, the E. coli derived polypeptide or fragment thereof comprises the E. coli FimH pilin domain. Other suitable polypeptides and fragments thereof derived from E. coli FimH include variants of the FimH pilin domain that have varying degrees of identity to SEQ ID NO: 7, such as at least 70%, 71%, 72%, 73% , 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 99.9% sequence identity to SEQ ID NO: 7. In some embodiments, the composition includes a polypeptide having at least 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83% , 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 99 .9% identity to SEQ ID NO: 4. Other suitable polypeptides and fragments thereof derived from E. coli FimH include FimH lectin domain variants that have varying degrees of identity to SEQ ID NO: 8, such as at least 70 %, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 99.9% identity to the sequence specified in SEQ ID NO: 8. In some embodiments, the composition includes a polypeptide having at least 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% 97%, 98%, 99%, or 99.9% identity to SEQ ID NO: 8. In some embodiments, the E. coli -derived polypeptide or fragment thereof comprises the E. coli FimH pilin domain. Other suitable polypeptides and fragments thereof derived from E. coli FimH include variants of the FimH pilin domain that have varying degrees of identity to SEQ ID NO: 24, such as at least 70%, 71%, 72%, 73% , 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 99.9% sequence identity to SEQ ID NO: 24. In some embodiments, the composition includes a polypeptide having at least 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83% , 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 99 .9% identity to SEQ ID NO: 24. Other suitable polypeptides and fragments thereof derived from E. coli FimH include FimH lectin domain variants that have varying degrees of identity to SEQ ID NO: 26, such as at least 70 %, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 99.9% sequence identity SEQ ID NO: 26 In some embodiments, the composition includes a polypeptide having at least 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81. %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 99.9% identity SEQ ID NO: 26.

В некоторых вариантах осуществления, композиция включает полипептид, содержащий, по меньшей мере, n последовательных аминокислот из любой из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 26., где n равно 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или более). Предпочтительно, фрагменты включают эпитоп из последовательности. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает полипептид, содержащий, по меньшей мере, 50 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере, 100 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере, 125 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере, 150 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере, 175 последовательных аминокислотных остатков, по меньшей мере, 200 последовательных аминокислотных остатков или, по меньшей мере, 250 последовательных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 26.In some embodiments, the composition includes a polypeptide comprising at least n consecutive amino acids from any of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 24, and SEQ ID NO: 26 ., where n is 7 or more (for example, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 or more). Preferably, the fragments include an epitope from the sequence. In some embodiments, the composition includes a polypeptide comprising at least 50 contiguous amino acid residues, at least 100 contiguous amino acid residues, at least 125 contiguous amino acid residues, at least 150 contiguous amino acid residues, at least , 175 contiguous amino acid residues, at least 200 contiguous amino acid residues, or at least 250 contiguous amino acid residues of the amino acid sequence of any of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 26.

Расположение и длину лектинового домена E. coli FimH или его гомолога или варианта можно предсказать на основе попарного выравнивания его последовательности с любой из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 26, например, путем сопоставления аминокислотной последовательности FimH с SEQ ID NO: 1 и идентификации последовательности, которая соответствует остаткам 22-179 SEQ ID NO: 1.The location and length of the lectin domain of E. coli FimH or a homologue or variant thereof can be predicted based on a pairwise sequence alignment thereof to any of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 24, and SEQ ID NO: 26, for example, by aligning the amino acid sequence of FimH with SEQ ID NO: 1 and identifying a sequence that corresponds to residues 22-179 of SEQ ID NO: 1.

D. N-концевая сигнальная последовательность дикого типаD. Wild-type N-terminal signal sequence

В некоторых вариантах осуществления, N-концевая сигнальная последовательность дикого типа полноразмерного FimH расщепляется в клетке-хозяине с образованием зрелого полипептида FimH. Таким образом, FimH, экспрессируемый клеткой-хозяином, может не иметь N-концевой сигнальной последовательности. В предпочтительных вариантах осуществления полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент могут кодироваться нуклеотидной последовательностью, в которой отсутствует кодирующая последовательность для N-концевой сигнальной последовательности дикого типа.In some embodiments, the wild-type N-terminal signal sequence of full-length FimH is cleaved in the host cell to produce a mature FimH polypeptide. Thus, FimH expressed by the host cell may lack an N-terminal signal sequence. In preferred embodiments, the E. coli -derived polypeptide or fragment thereof may be encoded by a nucleotide sequence that lacks the coding sequence for the wild-type N-terminal signal sequence.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент включает фрагменты FimH, образующие комплекс FimH-FimC, N-концевую сигнальную последовательность (например, остатки 1-21 SEQ ID NO: 1) или их сочетание. Комплексообразующий фрагмент FimH может представлять собой любую часть или участок белка FimH, который сохраняет способность образовывать комплекс с FimC.In some embodiments, the E. coli -derived polypeptide or fragment thereof comprises FimH fragments forming the FimH-FimC complex, an N-terminal signal sequence (eg, residues 1-21 of SEQ ID NO: 1), or a combination thereof. A FimH complexing fragment can be any part or region of the FimH protein that retains the ability to form a complex with FimC.

В некоторых вариантах осуществления, в полипептиде, полученном из E. coli, или его фрагменте может отсутствовать от 1 до 21 аминокислотного остатка (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 аминокислотный остаток или отсутствовать 1-21 остаток, 1-20 остатков, 1-15 остатков, 1-10 остатков, 2-20 остатков, 2-15 остатков, 2-10 остатков, 5-20 остатков, 5-15 остатков или 5-10 остатков) на N-конце и/или С-конце полноразмерного полипептида FimH, который может включать сигнальную последовательность, лектиновый домен и пилиновый домен.In some embodiments, the E. coli -derived polypeptide or fragment thereof may lack 1 to 21 amino acid residues (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 or 21 amino acid residues or missing 1-21 residues, 1-20 residues, 1-15 residues, 1-10 residues, 2-20 residues, 2- 15 residues, 2-10 residues, 5-20 residues, 5-15 residues, or 5-10 residues) at the N-terminus and/or C-terminus of the full-length FimH polypeptide, which may include a signal sequence, a lectin domain, and a pilin domain.

II. Нуклеиновые кислотыII. Nucleic acids

В одном аспекте, описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент. Одну или несколько конструкций нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент, можно использовать для геномной интеграции и последующей экспрессии полипептида, полученного из E.coli, или его фрагмента. Например, в клетку-хозяин можно ввести единственную конструкцию нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент. Альтернативно, кодирующие последовательности для полипептида, полученного из E. coli, или его фрагмента могут быть перенесены двумя или несколькими конструкциями нуклеиновой кислоты, которые затем вводятся в клетку-хозяин одновременно или последовательно.In one aspect, nucleic acids encoding a polypeptide derived from E.coli, or a fragment thereof. One or more nucleic acid constructs encoding a polypeptide derived from E.coli, or a fragment thereof, can be used for genomic integration and subsequent expression of a polypeptide derived from E.coli, or a fragment thereof. For example, a single nucleic acid construct encoding a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof. Alternatively, coding sequences for a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof can be transferred by two or more nucleic acid constructs, which are then introduced into the host cell simultaneously or sequentially.

Например, в одном иллюстративном варианте осуществления, одна конструкция нуклеиновой кислоты кодирует лектиновый домен и пилиновый домен FimH E. coli. В другом типовом варианте осуществления, одна конструкция нуклеиновой кислоты кодирует лектиновый домен, и вторая конструкция нуклеиновой кислоты кодирует пилиновый домен FimH E. coli. В некоторых вариантах осуществления, достигается геномная интеграция.For example, in one illustrative embodiment, one nucleic acid construct encodes a lectin domain and a pilin domain of E. coli FimH. In another exemplary embodiment, one nucleic acid construct encodes a lectin domain and a second nucleic acid construct encodes an E. coli FimH pilin domain. In some embodiments, genomic integration is achieved.

Конструкция нуклеиновой кислоты может содержать геномную ДНК, содержащую один или несколько интронов, или кДНК. Некоторые гены экспрессируются более эффективно, когда присутствуют интроны. В некоторых вариантах осуществления, последовательность нуклеиновой кислоты пригодна для экспрессии экзогенных полипептидов в указанной клетке млекопитающего.The nucleic acid construct may comprise genomic DNA containing one or more introns, or cDNA. Some genes are expressed more efficiently when introns are present. In some embodiments, the nucleic acid sequence is suitable for expressing exogenous polypeptides in said mammalian cell.

В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид или его фрагмент, является кодон-оптимизированной для повышения уровня экспрессии в любой конкретной клетке.In some embodiments, the nucleic acid encoding the polypeptide or fragment thereof is codon-optimized to enhance the level of expression in any particular cell.

В некоторых вариантах осуществления, конструкция нуклеиновой кислоты включает сигнальную последовательность, которая кодирует пептид, управляющий секрецией полипептида, полученного из E. coli, или его фрагмента. В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновая кислота включает нативную сигнальную последовательность полипептида, полученного из E. coli FimH. В некоторых вариантах осуществления, где полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент включает эндогенную сигнальную последовательность, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая сигнальную последовательность, может быть кодон-оптимизированной для повышения уровня экспрессии белка в клетке-хозяине.In some embodiments, the nucleic acid construct includes a signal sequence that encodes a peptide that directs the secretion of a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof. In some embodiments, the nucleic acid includes the native signal sequence of a polypeptide derived from E. coli FimH. In some embodiments, wherein the polypeptide derived from E. colior a fragment thereof includes an endogenous signal sequence, the nucleic acid sequence encoding the signal sequence may be codon-optimized to enhance the expression level of the protein in a host cell.

В некоторых вариантах осуществления сигнальная последовательность имеет любую из следующих длин: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 и 30 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, длина сигнальной последовательности составляет 20 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, длина сигнальной последовательности составляет 21 аминокислоту.In some embodiments, the signal sequence has any of the following lengths: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, and 30 amino acids. In some embodiments, the signal sequence is 20 amino acids in length. In some embodiments, the signal sequence is 21 amino acids in length.

В некоторых вариантах осуществления, где полипептид или его фрагмент включает сигнальную последовательность, эндогенная сигнальная последовательность, ассоциированная с полипептидом в природе, может быть заменена сигнальной последовательностью, не связанной с полипептидом дикого типа, для повышения уровня экспрессии полипептида или его фрагмента в культивируемых клетках. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления, нуклеиновая кислота не включает нативную сигнальную последовательность полипептида, полученного из E. coli, или его фрагмента. В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновая кислота не включает нативную сигнальную последовательность полипептида, полученного из FimH E. coli. В некоторых вариантах осуществления, полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент может быть экспрессирован гетерологичным пептидом, который предпочтительно представляет собой сигнальную последовательность, или другим пептидом, имеющим специфический сайт расщепления на N-конце зрелого белка или полипептида, полученного из E. coli, или ее фрагмент. Например, полипептид, полученный из FimH E. coli или его фрагмент может быть экспрессирован гетерологичным пептидом (например, сигнальной последовательностью IgK), который предпочтительно представляет собой сигнальную последовательность или другой пептид, имеющий специфический сайт расщепления на N-конце зрелого белка FimH E. coli. В предпочтительных вариантах осуществления, специфический сайт расщепления на N-конце зрелого белка FimH E.coli находится непосредственно перед исходным остатком фенилаланина зрелого белка E.coli FimH. Выбранная гетерологичная последовательность, предпочтительно, является той, которая распознается и процессируется (т.е. расщепляется сигнальной пептидазой) клеткой-хозяином.In some embodiments, where the polypeptide or fragment thereof includes a signal sequence, the endogenous signal sequence associated with the polypeptide in nature can be replaced with a signal sequence not associated with the wild-type polypeptide to increase the level of expression of the polypeptide or fragment thereof in cultured cells. Accordingly, in some embodiments, the nucleic acid does not include the native signal sequence of a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof. In some embodiments, the nucleic acid does not include the native signal sequence of a FimH-derived polypeptideE. coli. In some embodiments, a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof may be expressed by a heterologous peptide, which is preferably a signal sequence, or another peptide having a specific cleavage site at the N-terminus of the mature protein or polypeptide derived from E. coli, or its fragment. For example, a polypeptide derived from FimHE. coli or a fragment thereof may be expressed by a heterologous peptide (eg, an IgK signal sequence), which is preferably a signal sequence or other peptide having a specific cleavage site at the N-terminus of the mature FimH protein E. coli. In preferred embodiments, the specific cleavage site is at the N-terminus of the mature FimH protein E.coli is located immediately before the original phenylalanine residue of the mature protein E.coli FimH. The heterologous sequence selected is preferably one that is recognized and processed (ie, cleaved by signal peptidase) by the host cell.

В предпочтительных вариантах осуществления, сигнальная последовательность представляет собой сигнальную последовательность IgK. В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновая кислота кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновая кислота кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновая кислота кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO: NO: 22. В предпочтительных вариантах осуществления, сигнальная последовательность представляет собой сигнальную последовательность мышиного IgK.In preferred embodiments, the signal sequence is an IgK signal sequence. In some embodiments, the nucleic acid encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18. In some embodiments, the nucleic acid encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. In some embodiments, the nucleic acid encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: NO: 22. In preferred embodiments, the signal sequence is a murine IgK signal sequence.

Подходящие векторы экспрессии млекопитающих для продуцирования полипептида, полученного из E. coli или его фрагментов, известны в данной области техники и могут быть коммерчески доступными, например вектор экспрессии pSecTag2 от Invitrogen™. Типовая последовательность сигнального пептида Ig каппа мыши включает последовательность ETDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 54). В некоторых вариантах осуществления, вектор включает вектор экспрессии млекопитающих pBudCE4.1 от Thermo Fisher. Дополнительные типовые и подходящие векторы включают вектор экспрессии млекопитающих pcDNA™ 3.1 (Thermo Fisher).Suitable mammalian expression vectors for the production of polypeptide derived from E. coli or fragments thereof are known in the art and may be commercially available, such as the pSecTag2 expression vector from Invitrogen™. A typical mouse kappa Ig signal peptide sequence includes the sequence ETDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 54). In some embodiments, the vector includes the mammalian expression vector pBudCE4.1 from Thermo Fisher. Additional exemplary and suitable vectors include pcDNA™ 3.1 mammalian expression vector (Thermo Fisher).

В некоторых вариантах осуществления, сигнальная последовательность не включает сигнальную последовательность гемагглютинина.In some embodiments, the signal sequence does not include a hemagglutinin signal sequence.

В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновая кислота включает нативную сигнальную последовательность полипептида, полученного из E. coli, или ее фрагмент. В некоторых вариантах осуществления сигнальная последовательность не является сигнальной последовательностью IgK. В некоторых вариантах осуществления сигнальная последовательность включает сигнальную последовательность гемагглютинина.In some embodiments, the nucleic acid includes a native E. coli -derived polypeptide signal sequence or a fragment thereof. In some embodiments, the signal sequence is not an IgK signal sequence. In some embodiments, the signal sequence includes a hemagglutinin signal sequence.

В одном аспекте в настоящем документе раскрыты векторы, которые включают кодирующие последовательности для полипептида, полученного из E. coli, или его фрагмента. Примеры векторов включают плазмиды, которые способны реплицироваться автономно или реплицироваться в клетке млекопитающего. Типовые векторы экспрессии содержат подходящие промоторы, энхансеры и терминаторы, которые можно использовать для регуляции экспрессии кодирующей последовательности(ей) в конструкции экспрессии. Векторы могут также включать маркеры селекции для обеспечения фенотипического признака для селекции трансформированных клеток-хозяев (например, придания резистентности к антибиотикам, таким как ампициллин или неомицин).In one aspect, disclosed herein are vectors that include coding sequences for an E. coli -derived polypeptide or fragment thereof. Examples of vectors include plasmids that are capable of replicating autonomously or replicating within a mammalian cell. Typical expression vectors contain suitable promoters, enhancers and terminators that can be used to regulate the expression of the coding sequence(s) in the expression construct. Vectors may also include selection markers to provide a phenotypic trait for selection of transformed host cells (eg, conferring resistance to antibiotics such as ampicillin or neomycin).

Подходящие промоторы известны в данной области техники. Примеры промоторов включают, например, промотор CMV, аденовируса, EF1a, промотор металлотионина GAPDH, ранний промотор SV-40, более поздний промотор SV-40, промотор вируса опухоли молочной железы мышей, промотор вируса саркомы Рауса, промотор полиэдрина и т.д. Промоторы могут быть конститутивными или индуцибельными. Можно использовать один или несколько векторов (например, один вектор, кодирующий все субъединицы, или домены, или их фрагменты, или несколько векторов, вместе кодирующих субъединицы, или домены, или их фрагменты).Suitable promoters are known in the art. Examples of promoters include, for example, CMV, adenovirus, EF1a promoter, metallothionein GAPDH promoter, SV-40 early promoter, SV-40 late promoter, mouse mammary tumor virus promoter, Rous sarcoma virus promoter, polyhedrin promoter, etc. Promoters can be constitutive or inducible. One or more vectors may be used (eg, one vector encoding all subunits or domains, or fragments thereof, or multiple vectors together encoding subunits or domains, or fragments thereof).

Также можно использовать внутренний сайт посадки рибосомы (IRES) и пептидные последовательности 2А. IRES и пептид 2A обеспечивают альтернативные подходы к совместной экспрессии нескольких последовательностей. IRES представляет собой нуклеотидную последовательность, которая позволяет инициировать трансляцию в середине последовательности матричной РНК (мРНК) как часть более крупного процесса синтеза белка. Обычно у эукариот трансляция может инициироваться только на 5'-конце молекулы мРНК. Элементы IRES позволяют экспрессировать несколько генов в одном транскрипте. Полицистронные векторы на основе IRES, которые экспрессируют несколько белков из одного транскрипта, могут уменьшать ускользание неэкспрессирующих клонов от селекции. Пептид 2А позволяет транслировать несколько белков в одной открытой рамке считывания в полипротеин, который впоследствии расщепляется на отдельные белки с помощью механизма проскока рибосом. Пептид 2A может обеспечивать более сбалансированную экспрессию множества белковых продуктов. Примеры последовательностей IRES включают, например, IRES EV71, IRES EMCV, IRES HCV. Для геномной интеграции, интеграция может быть сайт-специфической или случайной. Сайт-специфическая рекомбинация может быть достигнута путем введения гомологичной последовательности (последовательностей) в конструкции нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе. Такая гомологичная последовательность по существу соответствует эндогенной последовательности в конкретном сайте-мишени в геноме хозяина. В качестве альтернативы можно использовать случайное интегрирование. Иногда уровень экспрессии белка может варьироваться в зависимости от сайта интеграции. Следовательно, может быть желательно выбрать ряд клонов в соответствии с уровнем экспрессии рекомбинантного белка, чтобы идентифицировать клон, который достигает желаемого уровня экспрессии.Internal ribosome entry site (IRES) and 2A peptide sequences can also be used. IRES and peptide 2A provide alternative approaches to coexpression of multiple sequences. An IRES is a nucleotide sequence that allows translation to be initiated in the middle of a messenger RNA (mRNA) sequence as part of the larger process of protein synthesis. Typically, in eukaryotes, translation can only initiate at the 5' end of the mRNA molecule. IRES elements allow the expression of multiple genes in a single transcript. Polycistronic IRES-based vectors that express multiple proteins from a single transcript can reduce the escape of non-expressing clones from selection. Peptide 2A allows multiple proteins to be translated in a single open reading frame into a polyprotein, which is subsequently cleaved into individual proteins by the ribosome slipping mechanism. Peptide 2A may provide more balanced expression of multiple protein products. Examples of IRES sequences include, for example, EV71 IRES, EMCV IRES, HCV IRES. For genomic integration, integration can be site-specific or random. Site-specific recombination can be achieved by introducing homologous sequence(s) into the nucleic acid constructs described herein. Such a homologous sequence essentially corresponds to an endogenous sequence at a particular target site in the host genome. As an alternative, random integration can be used. Sometimes the level of protein expression can vary depending on the site of integration. Therefore, it may be desirable to select a number of clones according to the level of expression of the recombinant protein in order to identify a clone that achieves the desired level of expression.

Примеры конструкций нуклеиновых кислот дополнительно описаны на фигурах, таких как любая из фиг. 2А- 2Т.Examples of nucleic acid constructs are further described in the figures, such as any of FIG. 2A-2T.

В одном аспекте, последовательность нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9% или 100% идентичность любой из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 29.In one aspect, the nucleic acid sequence encodes an amino acid sequence having at least 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% , 98%, 99%, 99.9% or 100% identical to any of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26 , SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29.

III. Клетки-хозяеваIII. Host cells

В одном аспекте, изобретение относится к клеткам, в которых последовательности, кодирующие полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент, экспрессируются в клетке-хозяине млекопитающего. В одном варианте осуществления, полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент временно экспрессируется в клетке-хозяине. В другом варианте осуществления, полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент стабильно интегрируется в геном клеток-хозяев и при культивировании в подходящих условиях экспрессирует полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент. В предпочтительном варианте осуществления, полинуклеотидная последовательность экспрессируется с высокой эффективностью и геномной стабильностью.In one aspect, the invention relates to cells in which sequences encoding a polypeptide derived from E.coli, or a fragment thereof, are expressed in a mammalian host cell. In one embodiment, a polypeptide derived from E. coli, or its fragment transiently expressed in the host cell. In another embodiment, a polypeptide derived from E.coli, or a fragment thereof, is stably integrated into the genome of host cells and, when cultured under suitable conditions, expresses a polypeptide derived from E.coli, or a fragment thereof. In a preferred embodiment, the polynucleotide sequence is expressed with high efficiency and genomic stability.

Подходящие клетки-хозяева млекопитающих известны в данной области техники. Предпочтительно клетка-хозяин пригодна для продуцирования белка в промышленных масштабах. Примеры клеток-хозяев млекопитающих включают любые из следующих клеток и их производные: клетки яичника китайского хомяка (CHO), клетки COS (линия клеток, полученная из почки обезьяны (африканская зеленая мартышка), клетки Vero, клетки Hela, клетки почки детеныша хомячка (BHK), клетки эмбриональной почки человека (HEK), клетки NSO (линия клеток миеломы мыши) и клетки C127 (линия клеток неопухолевой мыши). Дополнительные типовые клетки-хозяева млекопитающих включают Сертоли мыши (TM4), печень серой крысы (BRL 3A), опухоль молочной железы мыши (MMT), гепатому крысы (HTC), миелому мыши (NSO), гибридому мыши (Sp2/0), тимому мыши (EL4), яичник китайского хомячка (CHO) и производные клеток CHO, эмбрион мыши (NIH/3T3, 3T3 Li), миокард крысы (H9c2), миобласт мыши (C2C12) и почку мыши (miMCD-3). Другие примеры клеточных линий млекопитающих включают NS0/1, Sp2/0, Hep G2, PER.C6, COS-7, TM4, CV1, VERO-76, MDCK, BRL 3A, W138, MMT 060562, TR1, MRC5 и FS4.Suitable mammalian host cells are known in the art. Preferably, the host cell is suitable for producing the protein on an industrial scale. Examples of mammalian host cells include any of the following cells and their derivatives: Chinese hamster ovary (CHO) cells, COS cells (a cell line derived from monkey kidney (African green monkey), Vero cells, Hela cells, baby hamster kidney (BHK) cells ), human embryonic kidney (HEK) cells, NSO cells (a mouse myeloma cell line), and C127 cells (a non-tumor mouse cell line) Additional typical mammalian host cells include mouse Sertoli (TM4), gray rat liver (BRL 3A), tumor. mouse mammary tumor (MMT), rat hepatoma (HTC), mouse myeloma (NSO), mouse hybridoma (Sp2/0), mouse thymoma (EL4), Chinese hamster ovary (CHO) and CHO cell derivatives, mouse embryo (NIH/3T3 , 3T3 Li), rat myocardium (H9c2), mouse myoblast (C2C12) and mouse kidney (miMCD-3), Other examples of mammalian cell lines include NS0/1, Sp2/0, Hep G2, PER.C6, COS-7, TM4, CV1, VERO-76, MDCK, BRL 3A, W138, MMT 060562, TR1, MRC5 and FS4.

Любая клетка, восприимчивая к клеточной культуре, может быть использована в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах осуществления, клетка представляет собой клетку млекопитающего. Неограничивающие примеры клеток млекопитающих, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, включают линию миеломы мыши BALB/c (NSO/1, ЕСАСС №: 85110503); ретинобласты человека (PER.C6, Leiden, The Netherlands); линию почки обезьяны CV1, трансформированные SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); линию почек эмбриона человека (клетки 293 или 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59, 1977); клетки почек детенышей хомячков (BHK, ATCC CCL 10); клетки яичника китайского хомячка +/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); клетки Сертоли мыши (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980); клетки почки обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76, ATCC CRL-1 587); клетки карциномы шейки матки человека (HeLa, ATCC CCL 2); клетки почек собак (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени серой крысы (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клетки легкого человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, HB 8065); опухоль молочной железы мыши (MMT 060562, ATCC CCL51); клетки TRI (Mather et al., Annals NY Acad. Sci., 383:44-68, 1982); клетки МРС 5; клетки FS4; и линию гепатомы человека (Hep G2). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, клетки представляют собой клетки СНО. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, клетки представляют собой GS-клетки.Any cell susceptible to cell culture can be used in accordance with the present invention. In some embodiments, the cell is a mammalian cell. Non-limiting examples of mammalian cells that can be used in accordance with the present invention include the mouse myeloma line BALB/c (NSO/1, ECACC No: 85110503); human retinoblasts (PER.C6, Leiden, The Netherlands); monkey kidney line CV1 transformed with SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); human embryonic kidney line (293 or 293 cells subcloned for growth in suspension culture, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59, 1977); baby hamster kidney cells (BHK, ATCC CCL 10); Chinese Hamster Ovary +/-DHFR cells (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); mouse Sertoli cells (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980); monkey kidney cells (CV1 ATCC CCL 70); African green monkey kidney cells (VERO-76, ATCC CRL-1 587); human cervical carcinoma cells (HeLa, ATCC CCL 2); canine kidney cells (MDCK, ATCC CCL 34); gray rat liver cells (BRL 3A, ATCC CRL 1442); human lung cells (W138, ATCC CCL 75); human liver cells (Hep G2, HB 8065); mouse mammary tumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI cells (Mather et al., Annals NY Acad. Sci., 383:44-68, 1982); MPC 5 cells; FS4 cells; and the human hepatoma line (Hep G2). In some preferred embodiments, the cells are CHO cells. In some preferred embodiments, the cells are GS cells.

Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением, можно использовать любое количество коммерчески доступных и некоммерческих клеточных линий гибридомы. Термин «гибридома», используемый в настоящем документе, относится к клетке или потомству клетки, полученному в результате слияния иммортализованной клетки и клетки, продуцирующей антитело. Такая полученная гибридома представляет собой иммортализованную клетку, продуцирующую антитела. Отдельные клетки, используемые для создания гибридомы, могут быть получены из любого млекопитающего, включая, но не ограничиваясь ими, крысу, свинью, кролика, овцу, свинью, козу и человека. В некоторых вариантах осуществления, гибридома представляет собой клеточную линию триомы, которая возникает, когда потомство слияний гетерогибридной миеломы, которые являются продуктом слияния между клетками человека и клеточной линией миеломы мыши, впоследствии сливают с плазматической клеткой. В некоторых вариантах осуществления гибридома представляет собой любую иммортализованную гибридную клеточную линию, которая продуцирует антитела, такую как, например, квадромы (см., например, Milstein et al., Nature, 537:3053, 1983). Специалисту в данной области техники будет понятно, что клеточные линии гибридомы могут иметь различные требования к питанию и/или могут требовать различных условий культивирования для оптимального роста, и он сможет модифицировать условия по мере необходимости.Additionally, any number of commercially available and non-commercial hybridoma cell lines can be used in accordance with the present invention. The term "hybridoma" as used herein refers to a cell or progeny of a cell resulting from the fusion of an immortalized cell and an antibody-producing cell. This resulting hybridoma is an immortalized cell that produces antibodies. The individual cells used to create a hybridoma can be obtained from any mammal, including, but not limited to, rat, pig, rabbit, sheep, pig, goat and human. In some embodiments, the hybridoma is a trioma cell line that arises when progeny heterohybrid myeloma fusions that are the product of a fusion between human cells and a mouse myeloma cell line are subsequently fused to a plasma cell. In some embodiments, a hybridoma is any immortalized hybrid cell line that produces antibodies, such as, for example, Quadromas (see, for example, Milstein et al., Nature, 537:3053, 1983). One skilled in the art will appreciate that hybridoma cell lines may have different nutritional requirements and/or may require different culture conditions for optimal growth and will be able to modify conditions as necessary.

В некоторых вариантах осуществления, клетка содержит первый представляющий интерес ген, где первый представляющий интерес ген является хромосомно интегрированным. В некоторых вариантах осуществления, первый представляющий интерес ген содержит репортерный ген, селекционный ген, представляющий интерес ген (например, кодирующий полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент), вспомогательный ген или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления, ген, представляющий терапевтический интерес, содержит ген, кодирующий трудно экспрессируемый белок (DtE).In some embodiments, the cell contains a first gene of interest, where the first gene of interest is chromosomally integrated. In some embodiments, the first gene of interest comprises a reporter gene, a selection gene, a gene of interest (eg, encoding an E. coli -derived polypeptide or fragment thereof), an accessory gene, or a combination thereof. In some embodiments, the gene of therapeutic interest comprises a gene encoding a difficult to express (DtE) protein.

В некоторых вариантах осуществления, первый представляющий интерес ген расположен между двумя отдельными сайтами-мишенями рекомбинации (RTS) в клетке млекопитающего с сайт-специфической интеграцией (SSI), где два RTS являются хромосомно интегрированными в локус NL1 или локус NL2. См., например, публикацию патентной заявки США № 20200002727 для описания локуса NL1, локуса NL2, локуса NL3, локуса NL4, локуса NL5 и локуса NL6. В некоторых вариантах осуществления, первый представляющий интерес ген расположен в локусе NL1. В некоторых вариантах осуществления, клетка содержит второй представляющий интерес ген, где второй представляющий интерес ген является хромосомно интегрированным. В некоторых вариантах осуществления, второй представляющий интерес ген содержит репортерный ген, селекционный ген, представляющий терапевтический интерес ген (такой как полипептид, полученный из E. coli или его фрагмент), вспомогательный ген или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления, ген, представляющий терапевтический интерес, содержит ген, кодирующий белок DtE. В некоторых вариантах осуществления, второй представляющий интерес ген расположен между двумя RTS. В некоторых вариантах осуществления второй представляющий интерес ген расположен в локусе NL1 или локусе NL2. В некоторых вариантах осуществления, первый представляющий интерес ген расположен в локусе NL1, и второй представляющий интерес ген расположен в пределах локуса NL2. В некоторых вариантах осуществления клетка содержит третий представляющий интерес ген, где третий представляющий интерес ген является хромосомно интегрированным. В некоторых вариантах осуществления третий представляющий интерес ген содержит репортерный ген, селекционный ген, представляющий терапевтический интерес ген (такой как полипептид, полученный из E. coli или его фрагмент), вспомогательный ген или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления ген, представляющий терапевтический интерес, содержит ген, кодирующий белок DtE. В некоторых вариантах осуществления третий представляющий интерес ген расположен между двумя RTS. В некоторых вариантах осуществления, третий представляющий интерес ген расположен в пределах локуса NL1 или локуса NL2. В некоторых вариантах осуществления, третий представляющий интерес ген расположен в локусе, отличном от локуса NL1 и локуса NL2. В некоторых вариантах осуществления первый представляющий интерес ген, второй представляющий интерес ген и третий представляющий интерес ген находятся в пределах трех отдельных локусов. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, один из первого представляющего интерес гена, второго представляющего интерес гена и третьего представляющего интерес гена находится в локусе NL1, и, по меньшей мере, один из первого представляющего интерес гена, второго представляющего интерес гена и третьего представляющего интерес гена находится в локусе NL2. В некоторых вариантах осуществления, клетка содержит сайт-специфический ген рекомбиназы. В некоторых вариантах осуществления, сайт-специфический ген рекомбиназы встроен в хромосому.In some embodiments, the first gene of interest is located between two separate recombination target sites (RTS) in a mammalian cell with site-specific integration (SSI), where the two RTS are chromosomally integrated at the NL1 locus or the NL2 locus. See, for example, US Patent Application Publication No. 20200002727 for the description of the NL1 locus, NL2 locus, NL3 locus, NL4 locus, NL5 locus and NL6 locus. In some embodiments, the first gene of interest is located at the NL1 locus. In some embodiments, the cell contains a second gene of interest, where the second gene of interest is chromosomally integrated. In some embodiments, the second gene of interest comprises a reporter gene, a selection gene, a gene of therapeutic interest (such as an E. coli -derived polypeptide or fragment thereof), an accessory gene, or a combination thereof. In some embodiments, the gene of therapeutic interest comprises a gene encoding a DtE protein. In some embodiments, the second gene of interest is located between two RTSs. In some embodiments, the second gene of interest is located at the NL1 locus or the NL2 locus. In some embodiments, the first gene of interest is located within the NL1 locus, and the second gene of interest is located within the NL2 locus. In some embodiments, the cell contains a third gene of interest, wherein the third gene of interest is chromosomally integrated. In some embodiments, the third gene of interest comprises a reporter gene, a selection gene, a gene of therapeutic interest (such as an E. coli -derived polypeptide or fragment thereof), an accessory gene, or a combination thereof. In some embodiments, the gene of therapeutic interest comprises a gene encoding a DtE protein. In some embodiments, the third gene of interest is located between two RTSs. In some embodiments, the third gene of interest is located within the NL1 locus or the NL2 locus. In some embodiments, the third gene of interest is located at a locus other than the NL1 locus and the NL2 locus. In some embodiments, the first gene of interest, the second gene of interest, and the third gene of interest are within three separate loci. In some embodiments, at least one of the first gene of interest, the second gene of interest, and the third gene of interest is located at the NL1 locus, and at least one of the first gene of interest, the second gene of interest, and the third gene of interest The gene of interest is at the NL2 locus. In some embodiments, the cell contains a site-specific recombinase gene. In some embodiments, the site-specific recombinase gene is inserted into a chromosome.

В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к клетке млекопитающего, содержащей, по меньшей мере, четыре различных RTS, где клетка содержит (a) по меньшей мере, два различных RTS, хромосомно интегрированных в локус NL1 или локус NL2; (b) первый представляющий интерес ген встроен между, по меньшей мере, двумя RTS из (а), где первый представляющий интерес ген содержит репортерный ген, ген, кодирующий белок DtE, вспомогательный ген или их комбинацию; (c) и второй представляющий интерес ген интегрирован во второй хромосомный локус, отличный от локуса (a), где второй представляющий интерес ген содержит репортерный ген, ген, кодирующий белок DtE (такой как полипептид, полученный из E. coli или его фрагмент), вспомогательный ген или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к клетке млекопитающего, содержащей, по меньшей мере, четыре различных RTS, где клетка содержит (a) по меньшей мере, два различных RTS, интегрированных в хромосому в пределах локуса Fer1L4; (b) по меньшей мере, два различных RTS хромосомно интегрированных в локус NL1 или локус NL2; (c) первый представляющий интерес ген является хромосомно интегрированным в локус Fer1L4, при этом первый представляющий интерес ген содержит репортерный ген, ген, кодирующий белок DtE, вспомогательный ген или их комбинацию; и (d) второй представляющий интерес ген встроен в хромосому внутри локуса NL1 или локуса NL2 из (b), где второй представляющий интерес ген содержит репортерный ген, ген, кодирующий белок DtE (например, полученный из полипептида из E. coli или его фрагмента), вспомогательный ген или их комбинацию.In some embodiments, the present invention relates to a mammalian cell containing at least four different RTS, wherein the cell contains (a) at least two different RTS chromosomally integrated into the NL1 locus or the NL2 locus; (b) the first gene of interest is inserted between at least two RTSs of (a), wherein the first gene of interest comprises a reporter gene, a gene encoding a DtE protein, an accessory gene, or a combination thereof; (c) and the second gene of interest is integrated into a second chromosomal locus different from locus (a), wherein the second gene of interest comprises a reporter gene, a gene encoding a DtE protein (such as an E. coli -derived polypeptide or a fragment thereof), accessory gene or a combination thereof. In some embodiments, the present invention relates to a mammalian cell containing at least four different RTS, wherein the cell contains (a) at least two different RTS integrated into a chromosome within the Fer1L4 locus; (b) at least two different RTSs chromosomally integrated into the NL1 locus or the NL2 locus; (c) the first gene of interest is chromosomally integrated into the Fer1L4 locus, wherein the first gene of interest comprises a reporter gene, a gene encoding a DtE protein, an accessory gene, or a combination thereof; and (d) the second gene of interest is inserted into a chromosome within the NL1 locus or the NL2 locus of (b), wherein the second gene of interest comprises a reporter gene, a gene encoding a DtE protein (e.g., derived from a polypeptide from E. coli or a fragment thereof) , an accessory gene, or a combination thereof.

В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к клетке млекопитающего, содержащей, по меньшей мере, шесть различных RTS, где клетка содержит (а) по меньшей мере, два различных RTS и первый представляющий интерес ген, интегрированные в хромосому в пределах локуса Fer1L4; (b) по меньшей мере, два различных RTS и второй интересующий ген, хромосомно интегрированные в локус NL1; и (c) по меньшей мере, два различных RTS и третий представляющий интерес ген, хромосомно интегрированные в локус NL2.In some embodiments, the present invention relates to a mammalian cell containing at least six different RTSs, wherein the cell contains (a) at least two different RTSs and a first gene of interest integrated into a chromosome within the Fer1L4 locus; (b) at least two different RTS and a second gene of interest chromosomally integrated into the NL1 locus; and (c) at least two different RTS and a third gene of interest chromosomally integrated into the NL2 locus.

Как упоминается в настоящем документе, термины «в функциональной комбинации», «в функциональном порядке» и «функционально связанный» относятся к связыванию последовательностей нуклеиновых кислот таким образом, что молекула нуклеиновой кислоты способна направлять транскрипцию данного гена и/или синтез желаемой продуцируемой белковой молекулы. Этот термин также относится к соединению аминокислотных последовательностей таким образом, что образуется функциональный белок. В некоторых вариантах осуществления, представляющий интерес ген функционально связан с промотором, где представляющий интерес ген встроен в хромосому клетки-хозяина. В некоторых вариантах осуществления, представляющий интерес ген функционально связан с гетерологичным промотором; где представляющий интерес ген хромосомно интегрирован в клетку-хозяина. В некоторых вариантах осуществления, вспомогательный ген функционально связан с промотором, где вспомогательный ген хромосомно интегрирован в геном клетки-хозяина. В некоторых вариантах осуществления, вспомогательный ген функционально связан с гетерологичным промотором; где вспомогательный ген хромосомно интегрирован в геном клетки-хозяина. В некоторых вариантах осуществления ген, кодирующий белок DtE, функционально связан с промотором, где ген, кодирующий белок DtE, хромосомно интегрирован в геном клетки-хозяина. В некоторых вариантах осуществления, ген, кодирующий белок DtE, функционально связан с гетерологичным промотором, где ген, кодирующий белок DtE, хромосомно интегрирован в геном клетки-хозяина. В некоторых вариантах осуществления ген рекомбиназы функционально связан с промотором, где ген рекомбиназы встроен в хромосому клетки-хозяина. В некоторых вариантах осуществления ген рекомбиназы функционально связан с промотором, где ген рекомбиназы не интегрирован в геном клетки-хозяина. В некоторых вариантах осуществления ген рекомбиназы функционально связан с гетерологичным промотором, где ген рекомбиназы не встроен в хромосому в геном клетки-хозяина. В некоторых вариантах осуществления, ген рекомбиназы функционально связан с гетерологичным промотором, где ген рекомбиназы не встроен в хромосому в геном клетки-хозяина.As referred to herein, the terms “in functional combination,” “in a functional order,” and “operably linked” refer to the linking of nucleic acid sequences such that the nucleic acid molecule is capable of directing the transcription of a given gene and/or the synthesis of the desired protein molecule produced. The term also refers to the joining of amino acid sequences in such a way that a functional protein is formed. In some embodiments, the gene of interest is operably linked to a promoter, where the gene of interest is inserted into a host cell chromosome. In some embodiments, the gene of interest is operably linked to a heterologous promoter; where the gene of interest is chromosomally integrated into the host cell. In some embodiments, the accessory gene is operably linked to a promoter, where the accessory gene is chromosomally integrated into the genome of the host cell. In some embodiments, the accessory gene is operably linked to a heterologous promoter; where the accessory gene is chromosomally integrated into the genome of the host cell. In some embodiments, the gene encoding the DtE protein is operably linked to a promoter where the gene encoding the DtE protein is chromosomally integrated into the genome of the host cell. In some embodiments, the gene encoding the DtE protein is operably linked to a heterologous promoter, wherein the gene encoding the DtE protein is chromosomally integrated into the genome of the host cell. In some embodiments, the recombinase gene is operably linked to a promoter where the recombinase gene is inserted into a host cell chromosome. In some embodiments, the recombinase gene is operably linked to a promoter where the recombinase gene is not integrated into the genome of the host cell. In some embodiments, the recombinase gene is operably linked to a heterologous promoter, where the recombinase gene is not chromosomally integrated into the genome of the host cell. In some embodiments, the recombinase gene is operably linked to a heterologous promoter where the recombinase gene is not chromosomally integrated into the genome of the host cell.

Используемый в настоящем документе термин «хромосомно-интегрированный» или «хромосомная интеграция» относится к стабильному включению последовательности нуклеиновой кислоты в хромосому клетки-хозяина, например клетки млекопитающего. т.е. последовательности нуклеиновой кислоты, которая хромосомно интегрирована в геномную ДНК (гДНК) клетки-хозяина, например клетки млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления, последовательность нуклеиновой кислоты, интегрированная в хромосому, является стабильной. В некоторых вариантах осуществления, последовательность нуклеиновой кислоты, интегрированная в хромосому, не расположена на плазмиде или векторе. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, интегрированная в хромосому, не вырезается. В некоторых вариантах осуществления хромосомная интеграция опосредована сгруппированными короткими палиндромными повторами с регулярными промежутками (CRISPR) и системой редактирования генов CRISPR-ассоциированного белка (Cas) (CRISPR/CAS).As used herein, the term “chromosomal integrated” or “chromosomal integration” refers to the stable inclusion of a nucleic acid sequence into the chromosome of a host cell, such as a mammalian cell. those. a nucleic acid sequence that is chromosomally integrated into the genomic DNA (gDNA) of a host cell, such as a mammalian cell. In some embodiments, the nucleic acid sequence integrated into the chromosome is stable. In some embodiments, the nucleic acid sequence integrated into the chromosome is not located on a plasmid or vector. In some embodiments, the nucleic acid sequence integrated into the chromosome is not excised. In some embodiments, chromosomal integration is mediated by clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and the CRISPR-associated protein (Cas) gene editing system (CRISPR/CAS).

В некоторых вариантах осуществления, клетки-хозяева подходят для выращивания в суспензионных культурах. Суспензионно-компетентные клетки-хозяева обычно являются монодисперсными или растут рыхлыми агрегатами без существенной агрегации. Суспензионно-компетентные клетки-хозяева включают клетки, подходящие для суспензионного культивирования без адаптации или манипуляций (например, гемопоэтические клетки, лимфоидные клетки), и клетки, которые сделали суспензионно-компетентными путем модификации или адаптации зависимых от прикрепления клеток (например, эпителиальные клетки, фибробласты).In some embodiments, the host cells are suitable for growth in suspension cultures. Suspension-competent host cells are typically monodisperse or grow in loose aggregates without significant aggregation. Suspension-competent host cells include cells suitable for suspension culture without adaptation or manipulation (eg, hematopoietic cells, lymphoid cells) and cells that are made suspension-competent by modification or adaptation of anchorage-dependent cells (eg, epithelial cells, fibroblasts). ).

В некоторых вариантах осуществления, уровень экспрессии или активность полипептида, полученного из E. coli, или его фрагмента увеличивается, по меньшей мере, в 2 раза, по меньшей мере, в 3 раза, по меньшей мере, в 5 раз, по меньшей мере, в 10 раз, по меньшей мере, в 20 раз, при по меньшей мере, в 30 раз, по меньшей мере, в 40 раз, по меньшей мере, в 50 раз, по меньшей мере, в 60 раз, по меньшей мере, в 70 раз, по меньшей мере, в 75 раз, по меньшей мере, в 80 раз, по меньшей мере, в 90 раз, по меньшей мере, в 100 раз по сравнению с экспрессией полипептида, полученного из E.coli, или его фрагмента в бактериальной клетке, такой как, например, клетка-хозяин E.coli.In some embodiments, the expression level or activity of the E. coli -derived polypeptide or fragment thereof is increased by at least 2-fold, at least 3-fold, at least 5-fold, at least 10 times, at least 20 times, at least 30 times, at least 40 times, at least 50 times, at least 60 times, at least 70-fold, at least 75-fold, at least 80-fold, at least 90-fold, at least 100-fold compared to the expression of an E. coli -derived polypeptide or fragment thereof in a bacterial cell, such as, for example, an E. coli host cell.

Описанные в настоящем документе клетки-хозяева подходят для крупномасштабного культивирования. Например, клеточные культуры могут иметь объем 10 л, 30 л, 50 л, 100 л, 150 л, 200 л, 300 л, 500 л, 1000 л, 2000 л, 3000 л, 4000 л, 5000 л, 10000 л или больше. В некоторых вариантах осуществления, размер клеточной культуры может составлять от 10 л до 5000 л, от 10 л до 10000 л, от 10 л до 20000 л, от 10 л до 50000 л, от 40 л до 50000 л, от 100 л. до 50000 л, от 500 л до 50000 л, от 1000 л до 50000 л, от 2000 л до 50000 л, от 3000 л, до 50000 л, от 4000 л до 50000 л, от 4500 л до 50000 л, от 1000 л до 10000 л, от 1000 л до 20000 л, от 1000 л до 25000 л, от 1000 л до 30000 л, от 15 л до 2000 л, от 40 л до 1000 л, от 100 л до 500 л, от 200 л до 400 л или любое целое число между ними. Компоненты среды для клеточной культуры известны в данной области техники и могут включать, например, буфер, содержание аминокислот, содержание витаминов, содержание солей, содержание минералов, содержание сыворотки, содержание источника углерода, содержание липидов, содержание нуклеиновой кислоты, содержание гормонов, содержание микроэлементов, содержание аммиака, содержание кофакторов, содержание индикаторов, содержание малых молекул, содержание гидролизатов и содержание модуляторов ферментов.The host cells described herein are suitable for large-scale cultivation. For example, cell cultures may have a volume of 10 L, 30 L, 50 L, 100 L, 150 L, 200 L, 300 L, 500 L, 1000 L, 2000 L, 3000 L, 4000 L, 5000 L, 10000 L or more . In some embodiments, the cell culture size may be from 10 L to 5000 L, from 10 L to 10000 L, from 10 L to 20000 L, from 10 L to 50000 L, from 40 L to 50000 L, from 100 L. up to 50000 l, from 500 l to 50000 l, from 1000 l to 50000 l, from 2000 l to 50000 l, from 3000 l, to 50000 l, from 4000 l to 50000 l, from 4500 l to 50000 l, from 1000 l up to 10000 l, from 1000 l to 20000 l, from 1000 l to 25000 l, from 1000 l to 30000 l, from 15 l to 2000 l, from 40 l to 1000 l, from 100 l to 500 l, from 200 l to 400 l or any whole number in between. Cell culture medium components are known in the art and may include, for example, buffer, amino acid content, vitamin content, salt content, mineral content, serum content, carbon source content, lipid content, nucleic acid content, hormone content, trace element content, ammonia content, cofactor content, indicator content, small molecule content, hydrolysate content and enzyme modulator content.

Используемые в настоящем документе термины «среда», «среда для культивирования клеток» и «среда для культивирования» относятся к раствору, содержащему питательные вещества, которые питают растущие клетки млекопитающих. Как правило, такие растворы содержат незаменимые и заменимые аминокислоты, витамины, источники энергии, липиды и микроэлементы, необходимые клетке для минимального роста и/или выживания. Такой раствор может также содержать дополнительные компоненты, которые усиливают рост и/или выживаемость выше минимальной скорости, включая, помимо прочего, гормоны и/или другие факторы роста, определенные ионы (такие как натрий, хлорид, кальций, магний и фосфат), буферы, витамины, нуклеозиды или нуклеотиды, микроэлементы (неорганические соединения, обычно присутствующие в очень низких конечных концентрациях), неорганические соединения, присутствующие в высоких конечных концентрациях (например, железо), аминокислоты, липиды и/или глюкоза или другой источник энергии. В некоторых вариантах осуществления среда преимущественно составлена с рН и концентрацией соли, оптимальными для выживания и пролиферации клеток. В некоторых вариантах осуществления среда представляет собой питательную среду, которую добавляют после начала культивирования клеток.As used herein, the terms “medium,” “cell culture medium,” and “culture medium” refer to a solution containing nutrients that nourish growing mammalian cells. Typically, such solutions contain essential and non-essential amino acids, vitamins, energy sources, lipids and microelements necessary for the cell to undergo minimal growth and/or survival. Such solution may also contain additional components that enhance growth and/or survival above the minimum rate, including, but not limited to, hormones and/or other growth factors, certain ions (such as sodium, chloride, calcium, magnesium and phosphate), buffers, vitamins, nucleosides or nucleotides, trace elements (inorganic compounds usually present in very low final concentrations), inorganic compounds present in high final concentrations (eg iron), amino acids, lipids and/or glucose or other energy source. In some embodiments, the medium is advantageously formulated at a pH and salt concentration optimal for cell survival and proliferation. In some embodiments, the medium is a growth medium that is added after cell culture has begun.

В некоторых вариантах осуществления, клетки можно выращивать в одной из множества сред с определенным химическим составом, где компоненты сред известны и контролируются. В некоторых вариантах осуществления клетки можно выращивать в сложной среде, в которой не все компоненты среды известны и/или контролируются. Среды для выращивания культур клеток млекопитающих с определенным химическим составом широко разрабатывались и публиковались в течение последних нескольких десятилетий. Все компоненты определенных сред хорошо охарактеризованы, поэтому определенные среды не содержат сложных добавок, таких как сыворотка или гидролизаты. Ранние составы сред были разработаны для обеспечения роста клеток и поддержания их жизнеспособности практически без учета продуцирования белка. Совсем недавно составы сред были разработаны специально для поддержки высокопродуктивных клеточных культур, продуцирующих рекомбинантный белок. Такие среды предпочтительны для использования в способе изобретения. Такие среды обычно содержат большое количество питательных веществ и, в частности, аминокислот для поддержки роста и/или поддержания высокой плотности клеток. При необходимости эти среды могут быть модифицированы специалистом в данной области техники для использования в способе по изобретению. Например, специалист в данной области техники может уменьшить количество фенилаланина, тирозина, триптофана и/или метионина в этих средах для их использования в качестве основных сред или питательных сред в способе, описанном в настоящем документе.In some embodiments, cells can be grown in one of a variety of chemically defined media where the components of the media are known and controlled. In some embodiments, cells can be grown in a complex environment in which not all components of the environment are known and/or controlled. Mammalian cell culture media with defined chemical compositions have been widely developed and published over the past several decades. All components of certain media are well characterized, so certain media do not contain complex additives such as whey or hydrolysates. Early media formulations were designed to promote cell growth and maintain cell viability with little regard for protein production. More recently, media formulations have been developed specifically to support high-yield cell cultures producing recombinant protein. Such media are preferred for use in the method of the invention. Such media typically contain large amounts of nutrients and, in particular, amino acids to support growth and/or maintain high cell densities. If necessary, these media can be modified by one skilled in the art for use in the method of the invention. For example, one skilled in the art can reduce the amount of phenylalanine, tyrosine, tryptophan and/or methionine in these media for use as base media or culture media in the method described herein.

Не все компоненты сложных сред хорошо охарактеризованы, поэтому сложные среды могут содержать добавки, такие как простые и/или сложные источники углерода, простые и/или сложные источники азота и сыворотку, среди прочего. В некоторых вариантах комплексная среда, подходящая для настоящего изобретения, содержит добавки, такие как гидролизаты, в дополнение к другим компонентам определенной среды, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления определенная среда обычно включает примерно пятьдесят химических соединений в известных концентрациях в воде. Большинство из них также содержат один или несколько хорошо охарактеризованных белков, таких как инсулин, IGF-1, трансферрин или BSA, но другие не требуют белковых компонентов и поэтому называются средами с определенными свойствами, не содержащими белков. Типовые химические компоненты среды делятся на пять широких категорий: аминокислоты, витамины, неорганические соли, микроэлементы и другие категории, не поддающиеся четкой категоризации.Not all components of complex media are well characterized, so complex media may contain additives such as simple and/or complex carbon sources, simple and/or complex nitrogen sources, and serum, among others. In some embodiments, a complex medium suitable for the present invention contains additives, such as hydrolysates, in addition to other components of the defined medium, as described herein. In some embodiments, the defined medium typically includes about fifty chemical compounds at known concentrations in water. Most also contain one or more well-characterized proteins such as insulin, IGF-1, transferrin or BSA, but others do not require protein components and are therefore called protein-free defined media. Typical chemical components of the environment are divided into five broad categories: amino acids, vitamins, inorganic salts, trace elements and other categories that cannot be clearly categorized.

Среда для культивирования клеток может быть необязательно дополнена дополнительными компонентами. Используемый в настоящем документе термин «дополнительные компоненты» относится к компонентам, которые усиливают рост и/или выживаемость выше минимальной скорости, включая, помимо прочего, гормоны и/или другие факторы роста, определенные ионы (такие как натрий, хлорид, кальций, магний и фосфат), буферы, витамины, нуклеозиды или нуклеотиды, микроэлементы (неорганические соединения, обычно присутствуют в очень низких конечных концентрациях), аминокислоты, липиды и/или глюкозу или другой источник энергии. В некоторых вариантах осуществления, к исходной культуре клеток могут быть добавлены дополнительные компоненты. В некоторых вариантах осуществления дополнительные компоненты могут быть добавлены после начала культивирования клеток. Как правило, микроэлементы относятся к различным неорганическим солям, содержащимся в микромолярных или более низких количествах. Например, часто включаемыми микроэлементами являются цинк, селен, медь и другие. В некоторых вариантах осуществления железо (двухвалентное железо или соли трехвалентного железа) может быть включено в качестве микроэлемента в исходную среду для культивирования клеток в микромолярных концентрациях. Марганец также часто включается в число микроэлементов в виде двухвалентного катиона (MnCl₂ или MnSO₄) в диапазоне концентраций от наномолярных до микромолярных. Многочисленные менее распространенные микроэлементы обычно добавляют в наномолярных концентрациях.The cell culture medium may optionally be supplemented with additional components. As used herein, the term “additional components” refers to components that enhance growth and/or survival above a minimum rate, including, but not limited to, hormones and/or other growth factors, certain ions (such as sodium, chloride, calcium, magnesium and phosphate), buffers, vitamins, nucleosides or nucleotides, trace elements (inorganic compounds, usually present in very low final concentrations), amino acids, lipids and/or glucose or other energy source. In some embodiments, additional components may be added to the original cell culture. In some embodiments, additional components may be added after cell culture has begun. Generally, micronutrients refer to various inorganic salts found in micromolar or lower amounts. For example, commonly included micronutrients are zinc, selenium, copper, and others. In some embodiments, iron (ferrous iron or ferric iron salts) may be included as a trace element in the initial cell culture medium at micromolar concentrations. Manganese is also often included among trace elements as a divalent cation (MnCl ₂ or MnSO ₄ ) in concentrations ranging from nanomolar to micromolar. Numerous less common micronutrients are usually added in nanomolar concentrations.

В некоторых вариантах осуществления, среда, используемая в способе по изобретению, представляет собой среду, пригодную для поддержания высокой плотности клеток, например, 1х10⁶ клеток/мл, 5х10⁶ клеток/мл, 1х10⁷ клеток/мл, 5х10⁷ клеток/мл, 1х10⁸ клеток/мл или 5х10⁸ клеток/мл в культуре клеток. В некоторых вариантах осуществления, клеточная культура представляет собой периодическую культуру клеток млекопитающих, предпочтительно периодическую культуру клеток СНО.In some embodiments, the medium used in the method of the invention is a medium suitable for maintaining high cell densities, for example, 1 x 10 ⁶ cells/ml, 5 x 10 ⁶ cells/ml, 1 x 10 ⁷ cells/ml, 5 x 10 ⁷ cells/ml, 1x10 ⁸ cells/ml or 5x10 ⁸ cells/ml in cell culture. In some embodiments, the cell culture is a batch culture of mammalian cells, preferably a batch culture of CHO cells.

В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит фенилаланин в концентрации ниже 2 мМ, ниже 1 мМ, от 0,1 до 2 мМ, от 0,1 до 1 мМ, от 0,5 до 1,5 мМ или от 0,5 до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит тирозин в концентрации ниже 2 мМ, ниже 1 мМ, от 0,1 до 2 мМ, от 0,1 до 1 мМ, от 0,5 до 1,5 мМ или от 0,5 до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит триптофан в концентрации ниже 2 мМ, ниже 1 мМ, от 0,1 до 2 мМ, от 0,1 до 1 мМ, от 0,5 до 1,5 мМ или от 0,5 до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления среда для культивирования клеток содержит метионин в концентрации ниже 2 мМ, ниже 1 мМ, от 0,1 до 2 мМ, от 0,1 до 1 мМ, от 0,5 до 1,5 мМ или от 0,5 до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит лейцин в концентрации ниже 2 мМ, ниже 1 мМ, от 0,1 до 2 мМ, от 0,1 до 1 мМ, от 0,5 до 1,5 мМ или от 0,5 до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит серин в концентрации ниже 2 мМ, ниже 1 мМ, от 0,1 до 2 мМ, от 0,1 до 1 мМ, от 0,5 до 1,5 мМ или от 0,5 до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит треонин в концентрации ниже 2 мМ, ниже 1 мМ, от 0,1 до 2 мМ, от 0,1 до 1 мМ, от 0,5 до 1,5 мМ или от 0,5 до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит глицин в концентрации ниже 2 мМ, ниже 1 мМ, от 0,1 до 2 мМ, от 0,1 до 1 мМ, от 0,5 до 1,5 мМ или от 0,5 до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит два компонента: фенилаланин, тирозин, триптофан, метионин, лейцин, серин, треонин и глицин в концентрации ниже 2 мМ, ниже 1 мМ, от 0,1 до 2 мМ, от 0,1 до 1 мМ, от 0,5 до 1,5 мМ. или от 0,5 до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит фенилаланин и тирозин в концентрации ниже 2 мМ, ниже 1 мМ, от 0,1 до 2 мМ, от 0,1 до 1 мМ, от 0,5 до 1,5 мМ или от 0,5 до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит фенилаланин и триптофан в концентрации ниже 2 мМ, ниже 1 мМ, от 0,1 до 2 мМ, от 0,1 до 1 мМ, от 0,5 до 1,5 мМ или от 0,5 до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит фенилаланин и метионин в концентрации ниже 2 мМ, ниже 1 мМ, от 0,1 до 2 мМ, от 0,1 до 1 мМ, от 0,5 до 1,5 мМ или от 0,5 до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит тирозин и триптофан в концентрации ниже 2 мМ, ниже 1 мМ, от 0,1 до 2 мМ, от 0,1 до 1 мМ, от 0,5 до 1,5 мМ или от 0,5 до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит тирозин и метионин в концентрации ниже 2 мМ, ниже 1 мМ, от 0,1 до 2 мМ, от 0,1 до 1 мМ, от 0,5 до 1,5 мМ или от 0,5 до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит триптофан и метионин в концентрации ниже 2 мМ, ниже 1 мМ, от 0,1 до 2 мМ, от 0,1 до 1 мМ, от 0,5 до 1,5 мМ или от 0,5 до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит три из фенилаланина, тирозина, триптофана, метионина, лейцина, серина, треонина и глицина в концентрации ниже 2 мМ, ниже 1 мМ, от 0,1 до 2 мМ, от 0,1 до 1 мМ, от 0,5 до 1,5 мМ. или от 0,5 до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит фенилаланин, тирозин и триптофан в концентрации ниже 2 мМ, ниже 1 мМ, от 0,1 до 2 мМ, от 0,1 до 1 мМ, от 0,5 до 1,5 мМ или от 0,5 до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит фенилаланин, тирозин и метионин в концентрации ниже 2 мМ, ниже 1 мМ, от 0,1 до 2 мМ, от 0,1 до 1 мМ, от 0,5 до 1,5 мМ или от 0,5 до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит фенилаланин, триптофан и метионин в концентрации ниже 2 мМ, ниже 1 мМ, от 0,1 до 2 мМ, от 0,1 до 1 мМ, от 0,5 до 1,5 мМ или от 0,5 до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит тирозин, триптофан и метионин в концентрации ниже 2 мМ, ниже 1 мМ, от 0,1 до 2 мМ, от 0,1 до 1 мМ, от 0,5 до 1,5 мМ или от 0,5 до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит четыре из фенилаланина, тирозина, триптофана, метионина, лейцина, серина, треонина и глицина в концентрации ниже 2 мМ, ниже 1 мМ, от 0,1 до 2 мМ, от 0,1 до 1 мМ, от 0,5 до 1,5 мМ. или от 0,5 до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит фенилаланин, тирозин, триптофан и метионин в концентрации ниже 2 мМ, ниже 1 мМ, от 0,1 до 2 мМ, от 0,1 до 1 мМ, от 0,5 до 1,5 мМ или от 0,5 до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит пять из фенилаланина, тирозина, триптофана, метионина, лейцина, серина, треонина и глицина в концентрации ниже 2 мМ, ниже 1 мМ, от 0,1 до 2 мМ, от 0,1 до 1 мМ, от 0,5 до 1,5 мМ. или от 0,5 до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит шесть из фенилаланина, тирозина, триптофана, метионина, лейцина, серина, треонина и глицина в концентрации ниже 2 мМ, ниже 1 мМ, от 0,1 до 2 мМ, от 0,1 до 1 мМ, от 0,5 до 1,5 мМ. или от 0,5 до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит семь из фенилаланина, тирозина, триптофана, метионина, лейцина, серина, треонина и глицина в концентрации ниже 2 мМ, ниже 1 мМ, от 0,1 до 2 мМ, от 0,1 до 1 мМ, от 0,5 до 1,5 мМ. или от 0,5 до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит фенилаланин, тирозин, триптофан, метионин, лейцин, серин, треонин и глицин в концентрации ниже 2 мМ, ниже 1 мМ, от 0,1 до 2 мМ, от 0,1 до 1 мМ, от 0,5 до 1,5 мМ или от 0,5 до 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток дополнительно содержит, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 глицина, валина, лейцина, изолейцина, пролина, серина, треонина, лизина, аргинина, гистидина, аспартата, глутамата и аспарагина в концентрации выше 2 мМ, 3 мМ, 4 мМ, 5 мМ, 10 мМ, 15 мМ, предпочтительно, 2 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток дополнительно содержит, по меньшей мере, 5 из глицина, валина, лейцина, изолейцина, пролина, серина, треонина, лизина, аргинина, гистидина, аспартата, глутамата и аспарагина в концентрации выше 2 мМ, 3 мМ, 4 мМ, 5 мМ, 10 мМ, 15 мМ, предпочтительно, 2 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток дополнительно содержит глицин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, серин, треонин, лизин, аргинин, гистидин, аспартат, глутамат и аспарагин в концентрации выше 2 мМ, 3 мМ, 4 мМ, 5 мМ, 10 мМ, 15 мМ, предпочтительно, 2 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток дополнительно содержит по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 валина, изолейцина, пролина, лизина, аргинина, гистидина, аспартата, глутамата и аспарагина в концентрации концентрация выше 2 мМ, 3 мМ, 4 мМ, 5 мМ, 10 мМ, 15 мМ, предпочтительно, 2 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток дополнительно содержит, по меньшей мере, 5 из валина, изолейцина, пролина, лизина, аргинина, гистидина, аспартата, глутамата и аспарагина в концентрации выше 2 мМ, 3 мМ, 4 мМ, 5 мМ, 10 мМ, 15 мМ, предпочтительно, 2 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток дополнительно содержит валин, изолейцин, пролин, лизин, аргинин, гистидин, аспартат, глутамат и аспарагин в концентрации выше 2 мМ, 3 мМ, 4 мМ, 5 мМ, 10 мМ, 15 мМ, предпочтительно, 2 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит серин в концентрации выше 3 мМ, 5 мМ, 7 мМ, 10 мМ, 15 мМ или 20 мМ, предпочтительно, 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит валин в концентрации выше 3 мМ, 5 мМ, 7 мМ, 10 мМ, 15 мМ или 20 мМ, предпочтительно 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит цистеин в концентрации выше 3 мМ, 5 мМ, 7 мМ, 10 мМ, 15 мМ или 20 мМ, предпочтительно, 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит изолейцин в концентрации выше 3 мМ, 5 мМ, 7 мМ, 10 мМ, 15 мМ или 20 мМ, предпочтительно, 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления, среда для культивирования клеток содержит лейцин в концентрации выше 3 мМ, 5 мМ, 7 мМ, 10 мМ, 15 мМ или 20 мМ, предпочтительно, 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления, указанная выше среда для культивирования клеток предназначена для использования в способе, описанном в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления, вышеуказанная среда для культивирования клеток используется в описанном в настоящем документе способе в качестве базовой среды. В некоторых вариантах осуществления, описанную выше среду для культивирования клеток используют в качестве питательной среды описанным в настоящем документе способом.In some embodiments, the cell culture medium contains phenylalanine at a concentration of less than 2 mM, less than 1 mM, 0.1 to 2 mM, 0.1 to 1 mM, 0.5 to 1.5 mM, or 0. 5 to 1 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains tyrosine at a concentration of less than 2 mM, less than 1 mM, 0.1 to 2 mM, 0.1 to 1 mM, 0.5 to 1.5 mM, or 0. 5 to 1 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains tryptophan at a concentration of less than 2 mM, less than 1 mM, 0.1 to 2 mM, 0.1 to 1 mM, 0.5 to 1.5 mM, or 0. 5 to 1 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains methionine at a concentration of less than 2 mM, less than 1 mM, 0.1 to 2 mM, 0.1 to 1 mM, 0.5 to 1.5 mM, or 0.5 up to 1 mm. In some embodiments, the cell culture medium contains leucine at a concentration of less than 2 mM, less than 1 mM, 0.1 to 2 mM, 0.1 to 1 mM, 0.5 to 1.5 mM, or 0. 5 to 1 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains serine at a concentration of less than 2 mM, less than 1 mM, 0.1 to 2 mM, 0.1 to 1 mM, 0.5 to 1.5 mM, or 0. 5 to 1 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains threonine at a concentration of less than 2 mM, less than 1 mM, 0.1 to 2 mM, 0.1 to 1 mM, 0.5 to 1.5 mM, or 0. 5 to 1 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains glycine at a concentration of less than 2 mM, less than 1 mM, 0.1 to 2 mM, 0.1 to 1 mM, 0.5 to 1.5 mM, or 0. 5 to 1 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains two components: phenylalanine, tyrosine, tryptophan, methionine, leucine, serine, threonine, and glycine at a concentration below 2 mM, below 1 mM, from 0.1 to 2 mM, from 0.1 up to 1 mm, from 0.5 to 1.5 mm. or from 0.5 to 1 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains phenylalanine and tyrosine at a concentration of less than 2 mM, less than 1 mM, 0.1 to 2 mM, 0.1 to 1 mM, 0.5 to 1.5 mM, or 0.5 to 1 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains phenylalanine and tryptophan at a concentration of less than 2 mM, less than 1 mM, 0.1 to 2 mM, 0.1 to 1 mM, 0.5 to 1.5 mM, or 0.5 to 1 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains phenylalanine and methionine at a concentration of less than 2 mM, less than 1 mM, 0.1 to 2 mM, 0.1 to 1 mM, 0.5 to 1.5 mM, or 0.5 to 1 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains tyrosine and tryptophan at a concentration of less than 2 mM, less than 1 mM, 0.1 to 2 mM, 0.1 to 1 mM, 0.5 to 1.5 mM, or 0.5 to 1 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains tyrosine and methionine at a concentration of less than 2 mM, less than 1 mM, 0.1 to 2 mM, 0.1 to 1 mM, 0.5 to 1.5 mM, or 0.5 to 1 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains tryptophan and methionine at a concentration of less than 2 mM, less than 1 mM, 0.1 to 2 mM, 0.1 to 1 mM, 0.5 to 1.5 mM, or 0.5 to 1 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains three of phenylalanine, tyrosine, tryptophan, methionine, leucine, serine, threonine, and glycine at a concentration of less than 2 mM, less than 1 mM, 0.1 to 2 mM, 0.1 to 1 mm, from 0.5 to 1.5 mm. or from 0.5 to 1 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains phenylalanine, tyrosine, and tryptophan at a concentration of less than 2 mM, less than 1 mM, 0.1 to 2 mM, 0.1 to 1 mM, 0.5 to 1.5 mM or from 0.5 to 1 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains phenylalanine, tyrosine, and methionine at a concentration of less than 2 mM, less than 1 mM, 0.1 to 2 mM, 0.1 to 1 mM, 0.5 to 1.5 mM or from 0.5 to 1 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains phenylalanine, tryptophan, and methionine at a concentration of less than 2 mM, less than 1 mM, 0.1 to 2 mM, 0.1 to 1 mM, 0.5 to 1.5 mM or from 0.5 to 1 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains tyrosine, tryptophan, and methionine at a concentration of less than 2 mM, less than 1 mM, 0.1 to 2 mM, 0.1 to 1 mM, 0.5 to 1.5 mM or from 0.5 to 1 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains four of phenylalanine, tyrosine, tryptophan, methionine, leucine, serine, threonine, and glycine at a concentration of less than 2 mM, less than 1 mM, 0.1 to 2 mM, 0.1 to 1 mm, from 0.5 to 1.5 mm. or from 0.5 to 1 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains phenylalanine, tyrosine, tryptophan, and methionine at a concentration of less than 2 mM, less than 1 mM, 0.1 to 2 mM, 0.1 to 1 mM, 0.5 to 1, 5 mM or 0.5 to 1 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains five of phenylalanine, tyrosine, tryptophan, methionine, leucine, serine, threonine, and glycine at a concentration of less than 2 mM, less than 1 mM, 0.1 to 2 mM, 0.1 to 1 mm, from 0.5 to 1.5 mm. or from 0.5 to 1 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains six of phenylalanine, tyrosine, tryptophan, methionine, leucine, serine, threonine, and glycine at a concentration of less than 2 mM, less than 1 mM, 0.1 to 2 mM, 0.1 to 1 mm, from 0.5 to 1.5 mm. or from 0.5 to 1 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains seven of phenylalanine, tyrosine, tryptophan, methionine, leucine, serine, threonine, and glycine at a concentration of less than 2 mM, less than 1 mM, 0.1 to 2 mM, 0.1 to 1 mm, from 0.5 to 1.5 mm. or from 0.5 to 1 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains phenylalanine, tyrosine, tryptophan, methionine, leucine, serine, threonine, and glycine at a concentration of less than 2 mM, less than 1 mM, 0.1 to 2 mM, 0.1 to 1 mM , from 0.5 to 1.5 mM or from 0.5 to 1 mM. In some embodiments, the cell culture medium further contains at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, or 13 glycine, valine, leucine, isoleucine, proline , serine, threonine, lysine, arginine, histidine, aspartate, glutamate and asparagine in concentrations above 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, preferably 2 mM. In some embodiments, the cell culture medium further contains at least 5 of glycine, valine, leucine, isoleucine, proline, serine, threonine, lysine, arginine, histidine, aspartate, glutamate and asparagine at a concentration greater than 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, preferably 2 mM. In some embodiments, the cell culture medium further contains glycine, valine, leucine, isoleucine, proline, serine, threonine, lysine, arginine, histidine, aspartate, glutamate, and asparagine at concentrations greater than 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM , 10 mM, 15 mM, preferably 2 mM. In some embodiments, the cell culture medium further contains at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9 valine, isoleucine, proline, lysine, arginine, histidine, aspartate, glutamate, and asparagine in concentration concentration above 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, preferably 2 mM. In some embodiments, the cell culture medium further contains at least 5 of valine, isoleucine, proline, lysine, arginine, histidine, aspartate, glutamate, and asparagine at a concentration greater than 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, preferably 2 mM. In some embodiments, the cell culture medium further contains valine, isoleucine, proline, lysine, arginine, histidine, aspartate, glutamate and asparagine at a concentration greater than 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, preferably , 2 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains serine at a concentration greater than 3 mM, 5 mM, 7 mM, 10 mM, 15 mM, or 20 mM, preferably 10 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains valine at a concentration greater than 3 mM, 5 mM, 7 mM, 10 mM, 15 mM, or 20 mM, preferably 10 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains cysteine at a concentration greater than 3 mM, 5 mM, 7 mM, 10 mM, 15 mM, or 20 mM, preferably 10 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains isoleucine at a concentration greater than 3 mM, 5 mM, 7 mM, 10 mM, 15 mM, or 20 mM, preferably 10 mM. In some embodiments, the cell culture medium contains leucine at a concentration greater than 3 mM, 5 mM, 7 mM, 10 mM, 15 mM, or 20 mM, preferably 10 mM. In some embodiments, the above cell culture medium is for use in the method described herein. In some embodiments, the above cell culture medium is used in the method described herein as a base medium. In some embodiments, the cell culture medium described above is used as a culture medium in the manner described herein.

IV. Способ производстваIV. Mode of production

В одном аспекте, изобретение включает способ получения полипептида, полученного из E.coli, или его фрагмента. Способ включает культивирование клетки млекопитающего в подходящих условиях, тем самым экспрессируя полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент. Способ может дополнительно включать сбор полипептида, полученного из E. coli, или его фрагмента из культуры. Способ может дополнительно включать очистку полипептида, полученного из E. coli, или его фрагмента.In one aspect, the invention includes a method for producing a polypeptide derived from E. coli , or a fragment thereof. The method involves culturing a mammalian cell under suitable conditions, thereby expressing an E. coli -derived polypeptide or fragment thereof. The method may further include collecting the E. coli -derived polypeptide, or a fragment thereof, from the culture. The method may further include purifying the E. coli -derived polypeptide or a fragment thereof.

В некоторых вариантах осуществления, способ дает полипептид или его фрагмент с выходом от 0,1 г/л до 0,5 г/л.In some embodiments, the method produces a polypeptide or fragment thereof in a yield of 0.1 g/L to 0.5 g/L.

В некоторых вариантах осуществления, клетки можно выращивать в периодических культурах или культурах с подпиткой, где культивирование останавливают после достаточной экспрессии полипептида, после чего экспрессированный полипептид собирают и, необязательно, очищают. В некоторых вариантах осуществления, клетки можно выращивать в перфузионных культурах, где культивирование не останавливается, и к культуре периодически или непрерывно добавляются новые питательные вещества и другие компоненты, во время которых периодически или непрерывно собирают экспрессированный полипептид.In some embodiments, cells can be grown in batch or fed-batch cultures, where the culture is stopped after sufficient expression of the polypeptide, after which the expressed polypeptide is collected and, optionally, purified. In some embodiments, cells can be grown in perfusion cultures where the culture is not stopped and new nutrients and other components are periodically or continuously added to the culture, during which the expressed polypeptide is periodically or continuously collected.

В некоторых вариантах осуществления, клетки можно выращивать в небольших реакционных сосудах объемом от нескольких миллилитров до нескольких литров. В некоторых вариантах осуществления, клетки можно выращивать в крупномасштабных коммерческих биореакторах объемом от приблизительно, по меньшей мере, 1 литра до 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10000, 12000 литров или более или любого другого объема между указанными.In some embodiments, cells can be grown in small reaction vessels ranging in volume from a few milliliters to several liters. In some embodiments, cells can be grown in large-scale commercial bioreactors with a volume of from about at least 1 liter to 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10000, 12000 liters or more, or any other volume between indicated.

Температуру клеточной культуры выбирают, прежде всего, исходя из диапазона температур, при которых клеточная культура остается жизнеспособной, при которой вырабатывается высокий уровень полипептида, температуру, при которой образование или накопление продуктов метаболизма сводится к минимуму, и/ или любую комбинацию этих или других факторов, которые практикующий специалист считает важными. В качестве одного неограничивающего примера, клетки CHO хорошо растут и продуцируют высокие уровни белка или полипептида при температуре приблизительно 37°C. В целом, большинство клеток млекопитающих хорошо растут и/или могут продуцировать высокие уровни белка или полипептида в диапазоне приблизительно от 25°C до 42°C, хотя способы, изложенные в настоящем описании, не ограничиваются этими температурами. Некоторые клетки млекопитающих хорошо растут и/или могут продуцировать высокие уровни белка или полипептида в диапазоне примерно от 35°C до 40°C. В некоторых вариантах осуществления, клеточную культуру выращивают при температуре 20°C, 21°C, 22°C, 23°С, 24°C, 25°C, 26°C, 27℃, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C или 45°C, один или несколько раз в процессе культивирования клеток.The cell culture temperature is selected primarily based on the range of temperatures at which the cell culture remains viable, at which high levels of polypeptide are produced, the temperature at which the formation or accumulation of metabolic products is minimized, and/or any combination of these or other factors, which the practitioner considers important. As one non-limiting example, CHO cells grow well and produce high levels of protein or polypeptide at approximately 37°C. In general, most mammalian cells grow well and/or can produce high levels of protein or polypeptide in the range of approximately 25°C to 42°C, although the methods described herein are not limited to these temperatures. Some mammalian cells grow well and/or can produce high levels of protein or polypeptide in the range of about 35°C to 40°C. In some embodiments, the cell culture is grown at a temperature of 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30 °C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42°C , 43°C, 44°C, or 45°C, one or more times during cell culture.

Термины «культура» и «культура клеток», используемые в настоящем документе, относятся к клеточной популяции, которая суспендирована в среде в условиях, подходящих для выживания и/или роста клеточной популяции. Как будет понятно специалистам в данной области техники, в некоторых вариантах осуществления, эти термины, используемые в настоящем документе, относятся к комбинации, включающей клеточную популяцию и среду, в которой популяция суспендирована. В некоторых вариантах осуществления, клетки клеточной культуры включают клетки млекопитающих.The terms “culture” and “cell culture” as used herein refer to a cell population that is suspended in a medium under conditions suitable for the survival and/or growth of the cell population. As will be understood by those skilled in the art, in some embodiments, these terms as used herein refer to a combination including a cell population and a medium in which the population is suspended. In some embodiments, the cell culture cells include mammalian cells.

Настоящее изобретение можно использовать с любым способом культивирования клеток, который подходит для желаемого процесса (например, продуцирования рекомбинантного белка (например, антитела)). В качестве неограничивающего примера, клетки можно выращивать в периодических культурах или культурах с подпиткой, где культивирование останавливают после достаточной экспрессии рекомбинантного белка (например, антитела), после чего собирают экспрессированный белок (например, антитело). Альтернативно, в качестве еще одного неограничивающего примера, клетки можно выращивать с периодической подпиткой, при которой культивирование не прекращают, и новые питательные вещества и другие компоненты периодически или постоянно добавляют в культуру, во время чего экспрессированный рекомбинантный белок (например, антитело) собирают периодически или постоянно. Другие подходящие способы (например, культивирование в центрифужных пробирках) известны в данной области техники и могут быть использованы для практического применения настоящего изобретения.The present invention can be used with any cell culture method that is suitable for the desired process (eg, production of a recombinant protein (eg, antibody)). As a non-limiting example, cells can be grown in batch or fed-batch cultures where the culture is stopped after sufficient expression of the recombinant protein (eg, antibody) and the expressed protein (eg, antibody) is harvested. Alternatively, as another non-limiting example, cells can be grown in a fed-batch manner, in which the culture is not interrupted and new nutrients and other components are periodically or continuously added to the culture, during which time the expressed recombinant protein (eg, antibody) is collected periodically or constantly. Other suitable methods (eg, culture in centrifuge tubes) are known in the art and can be used to practice the present invention.

В некоторых вариантах осуществления, клеточная культура, подходящая для настоящего изобретения, представляет собой культуру с подпиткой. Используемый в настоящем документе термин «культура с подпиткой» относится к способу культивирования клеток, при котором дополнительные компоненты добавляют в культуру в момент или в моменты после начала процесса культивирования. Такие предоставленные компоненты обычно содержат питательные компоненты для клеток, которые были истощены в процессе культивирования. Культуру с подпиткой обычно останавливают в какой-то момент, и клетки и/или компоненты среды собирают и, необязательно, очищают. В некоторых вариантах осуществления, культура с подпиткой содержит базовую среду с добавлением питательной среды.In some embodiments, a cell culture suitable for the present invention is a fed-batch culture. As used herein, the term “fed culture” refers to a method of culturing cells in which additional components are added to the culture at the time or points after the start of the culture process. Such provided components typically contain nutritional components for cells that have been depleted during the culture process. The fed-batch culture is usually stopped at some point and the cells and/or media components are collected and optionally purified. In some embodiments, the fed-batch culture comprises a basal medium supplemented with growth medium.

Клетки можно выращивать в любом удобном объеме, выбранном практикующим врачом. Например, клетки можно выращивать в небольших реакционных сосудах объемом от нескольких миллилитров до нескольких литров. Альтернативно, клетки можно выращивать в крупномасштабных коммерческих биореакторах объемом приблизительно от 1 литра до 10, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10000, 12000, 15000, 20000 или 25000 литров или больше или любого объема между указанными.Cells can be grown in any convenient volume chosen by the practitioner. For example, cells can be grown in small reaction vessels ranging in volume from a few milliliters to several liters. Alternatively, cells can be grown in large-scale commercial bioreactors ranging in volume from approximately 1 liter to 10, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10000, 12000, 15000, 20000 or 25000 liters or more, or any volume in between. .

Температуру клеточной культуры выбирают, прежде всего, исходя из диапазона температур, при котором клеточная культура остается жизнеспособной, и диапазона, при котором продуцируется высокий уровень желаемого продукта (например, рекомбинантного белка). В общем, большинство клеток млекопитающих хорошо растут и могут продуцировать желаемые продукты (например, рекомбинантные белки) в диапазоне температур примерно от 25°С до 42°С, хотя способы, описанные в настоящем изобретении, не ограничиваются этими температурами. Некоторые клетки млекопитающих хорошо растут и могут продуцировать желаемые продукты (например, рекомбинантные белки или антитела) в диапазоне температур примерно от 35°С до 40°С. В некоторых вариантах осуществления, культуру клеток выращивают при температуре 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°С, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C или 45°C, один или несколько раз в течение процесса культивирования клеток. Специалисты в данной области техники смогут выбрать подходящую температуру или температуры для выращивания клеток в зависимости от конкретных потребностей клеток и конкретных требований к продуцированию от практикующего специалиста. Клетки можно выращивать в течение любого периода времени, в зависимости от потребностей практикующего специалиста и требований самих клеток. В некоторых вариантах осуществления, клетки выращивают при 37°C. В некоторых вариантах осуществления, клетки выращивают при 36,5°C.The cell culture temperature is selected primarily based on the temperature range at which the cell culture remains viable and the range at which high levels of the desired product (eg, recombinant protein) are produced. In general, most mammalian cells grow well and can produce desired products (eg, recombinant proteins) in a temperature range of about 25°C to 42°C, although the methods described in the present invention are not limited to these temperatures. Some mammalian cells grow well and can produce desired products (eg, recombinant proteins or antibodies) in a temperature range of about 35°C to 40°C. In some embodiments, the cell culture is grown at a temperature of 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42° C, 43°C, 44°C, or 45°C, one or more times during the cell culture process. Those skilled in the art will be able to select the appropriate temperature or temperatures for growing cells depending on the specific needs of the cells and the specific production requirements of the practitioner. Cells can be grown for any period of time, depending on the needs of the practitioner and the requirements of the cells themselves. In some embodiments, cells are grown at 37°C. In some embodiments, cells are grown at 36.5°C.

В некоторых вариантах осуществления, клетки можно выращивать во время начальной фазы роста (или фазы роста) в течение большего или меньшего времени, в зависимости от потребностей практикующего специалиста и требований самих клеток. В некоторых вариантах осуществления, клетки выращивают в течение периода времени, достаточного для достижения заданной плотности клеток. В некоторых вариантах осуществления, клетки выращивают в течение периода времени, достаточного для достижения плотности клеток, которая представляет собой заданную долю от максимальной плотности клеток, которой, в конечном итоге, достигли бы клетки, если бы им давали возможность расти без помех. Например, клетки можно выращивать в течение периода времени, достаточного для достижения желаемой плотности жизнеспособных клеток 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99 процентов от максимальной плотности клеток. В некоторых вариантах осуществления, клетки выращивают до тех пор, пока плотность клеток не увеличится более чем на 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% в день культивирования. В некоторых вариантах осуществления, клетки выращивают до тех пор, пока плотность клеток не увеличится более чем на 5% в день культивирования.In some embodiments, cells can be grown during the initial growth phase (or growth phase) for more or less time, depending on the needs of the practitioner and the requirements of the cells themselves. In some embodiments, the cells are grown for a period of time sufficient to achieve the desired cell density. In some embodiments, cells are grown for a period of time sufficient to achieve a cell density that is a predetermined fraction of the maximum cell density that the cells would eventually achieve if they were allowed to grow undisturbed. For example, cells can be grown for a period of time sufficient to achieve a desired viable cell density of 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 , 85, 90, 95, or 99 percent of maximum cell density. In some embodiments, the cells are grown until the cell density increases by more than 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5 %, 4%, 3%, 2% or 1% on the day of cultivation. In some embodiments, cells are grown until cell density increases by more than 5% per day of culture.

В некоторых вариантах осуществления, клетки могут расти в течение определенного периода времени. Например, в зависимости от исходной концентрации клеточной культуры, температуры, при которой выращивают клетки, и собственной скорости роста клеток, клетки можно выращивать в течение 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более дней, предпочтительно, от 4 до 10 дней. В некоторых случаях, клеткам может быть позволено расти в течение месяца или более. Практикующий специалист по настоящему изобретению сможет выбрать продолжительность начальной фазы роста в зависимости от требований к продуцированию белка и потребностей самих клеток.In some embodiments, the cells may grow over a period of time. For example, depending on the initial cell culture concentration, the temperature at which the cells are grown, and the cells' intrinsic growth rate, cells can be grown for 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 or more days, preferably 4 to 10 days. In some cases, the cells may be allowed to grow for a month or more. A practitioner of the present invention will be able to select the duration of the initial growth phase depending on the protein production requirements and the needs of the cells themselves.

Культуру клеток можно перемешивать или встряхивать во время начальной фазы культивирования, чтобы увеличить оксигенацию и диспергирование питательных веществ в клетках. В соответствии с настоящим изобретением, специалисту в данной области техники будет понятно, что может быть полезно контролировать или регулировать определенные внутренние условия биореактора во время начальной фазы роста, включая, помимо прочего, рН, температуру, оксигенацию и т.д.The cell culture can be stirred or shaken during the initial culture phase to increase oxygenation and nutrient dispersion within the cells. In accordance with the present invention, one skilled in the art will appreciate that it may be useful to control or regulate certain internal conditions of the bioreactor during the initial growth phase, including, but not limited to, pH, temperature, oxygenation, etc.

В конце начальной фазы роста, по меньшей мере, одно из условий культивирования может быть изменено таким образом, что применяется второй набор условий культивирования, и в культуре происходит метаболический сдвиг. Метаболический сдвиг может быть достигнут, например, путем изменения температуры, pH, осмоляльности или уровня химической индукции клеточной культуры. В одном неограничивающем варианте осуществления, условия культивирования изменяют путем изменения температуры культивирования. Однако, как известно в данной области техники, изменение температуры не является единственным механизмом, с помощью которого может быть достигнут соответствующий метаболический сдвиг. Например, такой метаболический сдвиг также может быть достигнут путем изменения других условий культивирования, включая, но не ограничиваясь ими, рН, осмоляльность и уровни бутирата натрия. Время культурального сдвига будет определять специалист, практикующий настоящее изобретение, исходя из требований к продуцированию белка или потребностей самих клеток.At the end of the initial growth phase, at least one of the culture conditions can be changed such that a second set of culture conditions is applied and a metabolic shift occurs in the culture. A metabolic shift can be achieved, for example, by changing temperature, pH, osmolality or the level of chemical induction of the cell culture. In one non-limiting embodiment, the culture conditions are changed by changing the culture temperature. However, as is known in the art, temperature change is not the only mechanism by which a corresponding metabolic shift can be achieved. For example, such a metabolic shift can also be achieved by changing other culture conditions, including, but not limited to, pH, osmolality and sodium butyrate levels. The timing of the culture shift will be determined by one skilled in the art based on the protein production requirements or the needs of the cells themselves.

При смещении температуры культивирования, сдвиг температуры может быть относительно постепенным. Например, для полного изменения температуры может потребоваться несколько часов или дней. Альтернативно, температурный сдвиг может быть относительно резким. Например, изменение температуры может быть завершено менее чем за несколько часов. При наличии соответствующего производственного и контрольного оборудования, которое является стандартным для промышленного крупномасштабного производства полипептидов или белков, изменение температуры может быть завершено менее чем за час.When shifting the culture temperature, the temperature shift may be relatively gradual. For example, it may take several hours or days for the temperature to completely change. Alternatively, the temperature shift may be relatively abrupt. For example, a temperature change can be completed in less than a few hours. With appropriate production and control equipment, which is standard for industrial large-scale production of polypeptides or proteins, the temperature change can be completed in less than an hour.

В некоторых вариантах осуществления, после изменения условий клеточной культуры, как обсуждалось выше, клеточную культуру поддерживают для последующей фазы продуцирования при втором наборе условий культивирования, способствующих выживанию и жизнеспособности клеточной культуры и подходящих для экспрессии желаемого полипептида или белка в коммерчески приемлемых количествах.In some embodiments, after changing the cell culture conditions as discussed above, the cell culture is maintained for a subsequent production phase under a second set of culture conditions that promote the survival and viability of the cell culture and are suitable for expressing the desired polypeptide or protein in commercially acceptable amounts.

Как обсуждалось выше, культура может быть изменена путем изменения одного или нескольких условий культивирования, включая, но не ограничиваясь ими, температуру, рН, осмоляльность и уровни бутирата натрия. В некоторых вариантах осуществления, сдвигается температура культуры. В соответствии с этим вариантом осуществления, во время последующей фазы продуцирования культуру поддерживают при температуре или диапазоне температур, которые ниже, чем температура или диапазон температур начальной фазы роста. Как обсуждалось выше, для увеличения плотности или жизнеспособности клеток или для увеличения экспрессии рекомбинантного белка можно использовать множественные дискретные температурные сдвиги.As discussed above, the culture can be modified by changing one or more culture conditions, including, but not limited to, temperature, pH, osmolality and sodium butyrate levels. In some embodiments, the temperature of the crop is shifted. According to this embodiment, during the subsequent production phase, the culture is maintained at a temperature or temperature range that is lower than the temperature or temperature range of the initial growth phase. As discussed above, multiple discrete temperature shifts can be used to increase cell density or viability or to increase recombinant protein expression.

В некоторых вариантах осуществления, клетки можно поддерживать на последующей фазе продуцирования до тех пор, пока не будет достигнута желаемая плотность клеток или титр продуцирования. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, клеткам позволяют расти в течение определенного периода времени во время последующей фазы продуцирования. Например, в зависимости от концентрации клеточной культуры в начале последующей фазы роста, температура, при которой выращивают клетки, и собственная скорость роста клеток клетки могут расти в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и более дней. В некоторых случаях, клеткам может быть позволено расти в течение месяца или более. Специалист, практикующий настоящее изобретение, сможет выбрать продолжительность последующей фазы продуцирования в зависимости от требований к продуцированию полипептидов или белков и потребностей самих клеток.In some embodiments, the cells can be maintained in a subsequent production phase until the desired cell density or production titer is achieved. In another embodiment of the present invention, the cells are allowed to grow for a certain period of time during a subsequent production phase. For example, depending on the concentration of the cell culture at the beginning of the subsequent growth phase, the temperature at which the cells are grown and the cell's own cell growth rate can grow for 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 or more days. In some cases, the cells may be allowed to grow for a month or more. The practitioner of the present invention will be able to select the duration of the subsequent production phase depending on the requirements for the production of polypeptides or proteins and the needs of the cells themselves.

Культуру клеток можно перемешивать или встряхивать во время последующей фазы продуцирования, чтобы увеличить оксигенацию и распределение питательных веществ в клетках. В соответствии с настоящим изобретением, специалист в данной области техники поймет, что может быть полезно контролировать или регулировать определенные внутренние условия биореактора во время последующей фазы роста, включая, помимо прочего, рН, температуру, оксигенацию и т. д.The cell culture can be stirred or shaken during the subsequent production phase to increase oxygenation and nutrient distribution within the cells. In accordance with the present invention, one skilled in the art will appreciate that it may be useful to control or regulate certain internal conditions of the bioreactor during the subsequent growth phase, including, but not limited to, pH, temperature, oxygenation, etc.

В некоторых вариантах осуществления, клетки экспрессируют рекомбинантный белок, и способ культивирования клеток по изобретению включает фазу роста и фазу продуцирования.In some embodiments, the cells express the recombinant protein, and the cell culture method of the invention includes a growth phase and a production phase.

В некоторых вариантах осуществления, стадия (ii) любого из способов, описанных в настоящем документе, применяется в течение всего способа культивирования клеток. В некоторых вариантах осуществления, стадия (ii) любого из способов, описанных в настоящем документе, применяется во время части способа культивирования клеток. В некоторых вариантах осуществления, стадию (ii) применяют до тех пор, пока не будет достигнута заданная плотность жизнеспособных клеток.In some embodiments, step (ii) of any of the methods described herein is applied throughout the cell culture method. In some embodiments, step (ii) of any of the methods described herein is applied during the cell culture portion of the method. In some embodiments, step (ii) is applied until the desired viable cell density is achieved.

В некоторых вариантах осуществления, способ культивирования клеток по изобретению включает фазу роста и фазу продуцирования, и стадию (ii) применяют во время фазы роста. В некоторых вариантах осуществления, способ культивирования клеток по изобретению включает фазу роста и фазу продуцирования, и стадию (ii) применяют в течение части фазы роста. В некоторых вариантах осуществления, способ культивирования клеток по изобретению включает фазу роста и фазу продуцирования, и стадию (ii) применяют во время фазы роста и фазы продуцирования.In some embodiments, the cell culture method of the invention includes a growth phase and a production phase, and step (ii) is applied during the growth phase. In some embodiments, the cell culture method of the invention includes a growth phase and a production phase, and step (ii) is applied during a portion of the growth phase. In some embodiments, the cell culture method of the invention includes a growth phase and a production phase, and step (ii) is applied during the growth phase and the production phase.

На стадии (ii) любого из описанных в настоящем документе способов, термин «поддерживание» может относиться к поддерживанию концентрации аминокислоты или метаболита ниже C1 или C2 в течение всего процесса культивирования (до сбора) или в течение части процесса культивирования, такой как, например, фаза роста, часть фазы роста или до тех пор, пока не будет получена заданная плотность клеток.In step (ii) of any of the methods described herein, the term "maintenance" may refer to maintaining the amino acid or metabolite concentration below C1 or C2 throughout the entire culture process (prior to harvest) or during a portion of the culture process, such as, for example, growth phase, part of the growth phase, or until the desired cell density is achieved.

В некоторых вариантах осуществления любого из вышеупомянутых способов, рост и/или продуктивность клеток увеличиваются по сравнению с контрольной культурой, где указанная контрольная культура идентична, за исключением того, что она не включает стадию (ii).In some embodiments of any of the above methods, cell growth and/or productivity is increased compared to a control culture, wherein said control culture is identical except that it does not include step (ii).

В некоторых вариантах осуществления любого из вышеупомянутых способов, способ по изобретению представляет собой способ улучшения роста клеток. В некоторых вариантах осуществления, способ по изобретению представляет собой способ улучшения роста клеток в культуре клеток высокой плотности при высокой плотности клеток.In some embodiments of any of the above methods, the method of the invention is a method for improving cell growth. In some embodiments, the method of the invention is a method of improving cell growth in a high-density cell culture at a high cell density.

Высокая плотность клеток, используемая в настоящем документе, относится к плотности клеток выше 1х10⁶ клеток/мл, 5х10⁶ клеток/мл, 1х10⁷ клеток/мл, 5х10⁷ клеток/мл, 1х10⁸ клеток/мл или 5х10⁸ клеток/мл, предпочтительно, выше 1х10⁷ клеток/мл, более предпочтительно, выше 5х10⁷ клеток/мл.High cell density, as used herein, refers to cell densities greater than 1 x ^{10 6} cells/ml, 5 x 10 ⁶ cells/ml, 1 x 10 ⁷ cells/ml, 5 x 10 ⁷ cells/ml, 1 x 10 ⁸ cells/ml, or 5 x 10 ⁸ cells/ml. preferably greater than 1 x 10 ⁷ cells/ml, more preferably greater than 5 x 10 ⁷ cells/ml.

В некоторых вариантах осуществления, способ по изобретению представляет собой способ улучшения роста клеток в клеточной культуре, где плотность клеток превышает 1х10⁶ клеток/мл, 5х10⁶ клеток/мл, 1х10⁷ клеток/мл, 5x10⁷ клеток/мл, 1х10⁸ клеток/мл или 5х10⁸ клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления, способ по изобретению представляет собой способ улучшения роста клеток в клеточной культуре, где максимальная плотность клеток превышает 1х10⁶ клеток/мл, 5х10⁶ клеток/мл, 1х10⁷ клеток/мл, 5х10⁷ клеток/мл, 1х10⁸ клеток/мл или 5х10⁸ клеток/мл.In some embodiments, the method of the invention is a method of improving cell growth in a cell culture where the cell density exceeds 1x10 ⁶ cells/ml, 5x10 ⁶ cells/ml, 1x10 ⁷ cells/ml, 5x10 ⁷ cells/ml, 1x10 ⁸ cells/ ml or 5x10 ⁸ cells/ml. In some embodiments, the method of the invention is a method of improving cell growth in a cell culture where the maximum cell density exceeds 1x10 ⁶ cells/ml, 5x10 ⁶ cells/ml, 1x10 ⁷ cells/ml, 5x10 ⁷ cells/ml, 1x10 ⁸ cells /ml or 5x10 ⁸ cells/ml.

В некоторых вариантах осуществления, рост клеток определяется плотностью жизнеспособных клеток (VCD), максимальной плотностью жизнеспособных клеток или интегрированным подсчетом жизнеспособных клеток (IVCC). В некоторых вариантах осуществления, рост клеток определяется максимальной плотностью жизнеспособных клеток.In some embodiments, cell growth is determined by viable cell density (VCD), maximum viable cell density, or integrated viable cell count (IVCC). In some embodiments, cell growth is determined by the maximum viable cell density.

Используемый в настоящем документе термин «плотность жизнеспособных клеток» относится к числу клеток, присутствующих в данном объеме среды. Плотность жизнеспособных клеток может быть измерена любым способом, известным специалисту в данной области техники. Предпочтительно, плотность жизнеспособных клеток измеряют с использованием автоматического счетчика клеток, такого как Bioprofile Flex®. Используемый в настоящем документе термин «максимальная плотность клеток» относится к максимальной плотности клеток, достигаемой во время культивирования клеток. Используемый в настоящем документе термин «жизнеспособность клеток» относится к способности клеток в культуре выживать при заданном наборе условий культивирования или экспериментальных вариациях. Специалистам в данной области техники будет понятно, что в настоящее изобретение включен один из многих способов определения жизнеспособности клеток. Например, для определения жизнеспособности клетки можно использовать краситель (например, трипановый синий), который не проходит через мембрану живой клетки, но может проходить через разрушенную мембрану мертвой или умирающей клетки.As used herein, the term “viable cell density” refers to the number of cells present in a given volume of medium. Viable cell density can be measured by any method known to one skilled in the art. Preferably, viable cell density is measured using an automatic cell counter such as Bioprofile Flex®. As used herein, the term “maximum cell density” refers to the maximum cell density achieved during cell culture. As used herein, the term “cell viability” refers to the ability of cells in culture to survive a given set of culture conditions or experimental variations. Those skilled in the art will appreciate that the present invention includes one of many methods for determining cell viability. For example, to determine cell viability, you can use a dye (such as trypan blue) that does not pass through the membrane of a living cell, but can pass through the destroyed membrane of a dead or dying cell.

Термин «интегрированный подсчет жизнеспособных клеток (IVCC)», используемый в настоящем документе, относится к площади под кривой плотности жизнеспособных клеток (VCD). IVCC можно рассчитать по следующей формуле: IVCC_t+1=IVCC_t+(VCD_t+VCD_t+1)*(Δt)/2, где Δt означает разницу во времени между моментами времени t и t+1. IVCC_t=0 можно не принимать в расчет. VCD_t и VCD_t+1 означают плотности жизнеспособных клеток в моменты времени t и t+1.The term "integrated viable cell count (IVCC)" as used herein refers to the area under the viable cell density (VCD) curve. IVCC can be calculated using the following formula: IVCC _t+1 =IVCC _t +(VCD _t +VCD _t+1 )*(Δt)/2, where Δt means the time difference between time t and t+1. IVCC _t=0 can be ignored. VCD _t and VCD _t+1 indicate the viable cell densities at time t and t+1.

Используемый в настоящем документе термин «титр» относится, например, к общему количеству рекомбинантно экспрессированного белка, продуцируемого клеточной культурой в заданном количестве объема среды. Титр обычно выражается в граммах белка на литр среды.As used herein, the term “titer” refers, for example, to the total amount of recombinantly expressed protein produced by a cell culture in a given amount of volume of medium. The titer is usually expressed in grams of protein per liter of medium.

В некоторых вариантах осуществления, рост клеток увеличивается, по меньшей мере, на 5%, 10%, 15%, 20% или 25% по сравнению с контрольной культурой. В некоторых вариантах осуществления, рост клеток увеличивается, по меньшей мере, на 10% по сравнению с контрольной культурой. В некоторых вариантах осуществления, рост клеток увеличивается, по меньшей мере, на 20% по сравнению с контрольной культурой.In some embodiments, cell growth is increased by at least 5%, 10%, 15%, 20%, or 25% compared to a control culture. In some embodiments, cell growth is increased by at least 10% compared to a control culture. In some embodiments, cell growth is increased by at least 20% compared to a control culture.

В некоторых вариантах осуществления, продуктивность определяют по титру и/или объемной продуктивности.In some embodiments, productivity is determined by titer and/or volumetric productivity.

В некоторых вариантах продуктивность определяют по титру. В некоторых вариантах осуществления, продуктивность повышается, по меньшей мере, на 5%, 10%, 15%, 20% или 25% по сравнению с контрольной культурой. В некоторых вариантах осуществления, продуктивность увеличивается, по меньшей мере, на 10% по сравнению с контрольной культурой. В некоторых вариантах осуществления, продуктивность увеличивается, по меньшей мере, на 20% по сравнению с контрольной культурой.In some embodiments, productivity is determined by titer. In some embodiments, productivity is increased by at least 5%, 10%, 15%, 20%, or 25% compared to the control crop. In some embodiments, productivity is increased by at least 10% compared to the control crop. In some embodiments, productivity is increased by at least 20% compared to the control crop.

В некоторых вариантах осуществления, максимальная плотность клеток клеточной культуры превышает 1х10⁶ клеток/мл, 5х10⁶ клеток/мл, 1х10⁷ клеток/мл, 5х10⁷ клеток/мл, 1х10⁸ клеток/мл или 5х10⁸ клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления, максимальная плотность клеток клеточной культуры превышает 5х10⁶ клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления, максимальная плотность клеток в клеточной культуре превышает 1х10⁸ клеток/мл.In some embodiments, the maximum cell density of the cell culture is greater than 1 x ^{10 6} cells/ml, 5 x 10 ⁶ cells/ml, 1 x 10 ⁷ cells/ml, 5 x 10 ⁷ cells/ml, 1 x 10 ⁸ cells/ml, or 5 x 10 ⁸ cells/ml. In some embodiments, the maximum cell density of the cell culture is greater than 5 x 10 ⁶ cells/ml. In some embodiments, the maximum cell density in the cell culture is greater than 1 x 10 ⁸ cells/ml.

V. ОчисткаV. Cleaning

В некоторых вариантах осуществления, способ получения полипептида, полученного из E.coli, или его фрагмента включает выделение и/или очистку полипептида, полученного из E.coli, или его фрагмента. В некоторых вариантах осуществления, экспрессированный полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент секретируется в среду, и, таким образом, клетки и другие твердые вещества могут быть удалены путем центрифугирования и/или фильтрации.In some embodiments, a method of producing an E. coli -derived polypeptide or fragment thereof comprises isolating and/or purifying the E. coli -derived polypeptide or fragment thereof. In some embodiments, the expressed E. coli -derived polypeptide, or a fragment thereof, is secreted into the medium, and thus the cells and other solids can be removed by centrifugation and/or filtration.

Полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент, полученный в соответствии с описанными в настоящем документе способами, может быть получен из клеток-хозяев и очищен любым подходящим способом. Подходящие способы очистки полипептида или его фрагмента включают преципитацию и различные типы хроматографии, такие как гидрофобное взаимодействие, ионный обмен, аффинность, хелатирование и эксклюзионную хроматографию, все из которых известны в данной области техники. Подходящие схемы очистки могут включать два или несколько из этих или других подходящих способов. В некоторых вариантах осуществления, один или несколько полипептидов или их фрагментов, происходящих из E. coli может включать «метку», облегчающую очистку, такую как эпитопная метка или HIS метка, Strep метка. Такие меченые полипептиды могут быть легко очищены, например, из кондиционированных сред с помощью хелатирующей хроматографии или аффинной хроматографии. Необязательно, последовательность метки может быть расщеплена после очистки.The E. coli -derived polypeptide, or fragment thereof, obtained in accordance with the methods described herein, can be obtained from host cells and purified by any suitable method. Suitable methods for purifying a polypeptide or fragment thereof include precipitation and various types of chromatography, such as hydrophobic interaction, ion exchange, affinity, chelation and size exclusion chromatography, all of which are known in the art. Suitable purification schemes may include two or more of these or other suitable methods. In some embodiments, one or more E. coli -derived polypeptides or fragments thereof may include a “tag” to facilitate purification, such as an epitope tag or HIS tag, Strep tag. Such labeled polypeptides can be easily purified, for example, from conditioned media using chelating chromatography or affinity chromatography. Optionally, the tag sequence may be cleaved after purification.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент может включать метку для аффинной очистки. Метки аффинной очистки известны в данной области техники. Примеры включают, например, His метку (связывается с ионом металла), антитело, мальтозо-связывающий белок (MBP) (связывается с амилозой), глутатион-S-трансферазу (GST) (связывается с глутатионом), FLAG метку, Strep метку (связывается со стрептавидином или его производным).In some embodiments, the E. coli -derived polypeptide or fragment thereof may include an affinity purification tag. Affinity purification labels are known in the art. Examples include, for example, His tag (binds to a metal ion), antibody, maltose binding protein (MBP) (binds to amylose), glutathione S-transferase (GST) (binds to glutathione), FLAG tag, Strep tag (binds to with streptavidin or its derivative).

В предпочтительном варианте осуществления, полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент не включает метку очистки.In a preferred embodiment, the E. coli -derived polypeptide or fragment thereof does not include a purification tag.

В некоторых вариантах осуществления, выход полипептида, полученного из E. coli, или его фрагмента составляет, по меньшей мере, примерно 1 мг/л, по меньшей мере, примерно 2 мг/л, по меньшей мере, примерно 3 мг/л, по меньшей мере, примерно 4 мг/л, по меньшей мере, примерно 5 мг/л, по меньшей мере, примерно 6 мг/л, по меньшей мере, примерно 7 мг/л, по меньшей мере, примерно 8 мг/л, по меньшей мере, примерно 9 мг/л, по меньшей мере, примерно 10 мг/л, при по меньшей мере, примерно 11 мг/л, по меньшей мере, примерно 12 мг/л, по меньшей мере, примерно 13 мг/л, по меньшей мере, примерно 14 мг/л, по меньшей мере, примерно 15 мг/л, по меньшей мере, примерно 16 мг/л, по меньшей мере, примерно 17 мг/л, по меньшей мере, примерно 18 мг/л, по меньшей мере, примерно 19 мг/л, по меньшей мере, примерно 20 мг/л, по меньшей мере, примерно 25 мг/л, по меньшей мере, примерно 30 мг/л, по меньшей мере, примерно 35 мг /л, по меньшей мере, примерно 40 мг/л, по меньшей мере, примерно 45 мг/л, по меньшей мере, примерно 50 мг/л, по меньшей мере, примерно 55 мг/л, по меньшей мере, примерно 60 мг/л, по меньшей мере, примерно 65 мг/л, по меньшей мере, примерно 70 мг/л, по меньшей мере, примерно 75 мг/л, по меньшей мере, примерно 80 мг/л, по меньшей мере, примерно 85 мг/л, по меньшей мере, примерно 90 мг/л, по меньшей мере, примерно 95 мг/л, или по меньшей мере, около 100 мг/л.In some embodiments, the yield of the E. coli -derived polypeptide or fragment thereof is at least about 1 mg/L, at least about 2 mg/L, at least about 3 mg/L, at least about 4 mg/L, at least about 5 mg/L, at least about 6 mg/L, at least about 7 mg/L, at least about 8 mg/L, according to at least about 9 mg/L, at least about 10 mg/L, at least about 11 mg/L, at least about 12 mg/L, at least about 13 mg/L, at least about 14 mg/L, at least about 15 mg/L, at least about 16 mg/L, at least about 17 mg/L, at least about 18 mg/L, at least about 19 mg/L, at least about 20 mg/L, at least about 25 mg/L, at least about 30 mg/L, at least about 35 mg/L, at least about 40 mg/L, at least about 45 mg/L, at least about 50 mg/L, at least about 55 mg/L, at least about 60 mg/L, at least about 65 mg/L, at least about 70 mg/L, at least about 75 mg/L, at least about 80 mg/L, at least about 85 mg/L, at least about 90 mg/L, at least about 95 mg/L, or at least about 100 mg/L.

В некоторых вариантах осуществления, культура имеет размер, по меньшей мере, примерно 10 л, например, объем, по меньшей мере, примерно 10 л, по меньшей мере, примерно 20 л, по меньшей мере, примерно 30 л, по меньшей мере, примерно 40 л, по меньшей мере, примерно 50 л, по меньшей мере, примерно 60 л, по меньшей мере, примерно 70 л, по меньшей мере, примерно 80 л, по меньшей мере, примерно 90 л, по меньшей мере, примерно 100 л, по меньшей мере, примерно 150 л, по меньшей мере, примерно 200 л, по меньшей мере, примерно 250 л, по меньшей мере, примерно 300 л, по меньшей мере, примерно 400 л, по меньшей мере, примерно 500 л, по меньшей мере, примерно 600 л, по меньшей мере, примерно 700 л, по меньшей мере, примерно 800 л, по меньшей мере, примерно 900 л, по меньшей мере, примерно 1000 л, по меньшей мере, примерно 2000 л, по меньшей мере, примерно 3000 л, по меньшей мере, примерно 4000 л, по меньшей мере, примерно 5000 л, по меньшей мере, примерно 6000 л, по меньшей мере, примерно 10000 л, по меньшей мере, примерно 15000 л, по меньшей мере, примерно 20000 л, по меньшей мере, примерно 25000 л, по меньшей мере, примерно 30000 л, по меньшей мере, примерно 35000 л, по меньшей мере, примерно 40000 л, при по меньшей мере, примерно 45000 л, по меньшей мере, примерно 50000 л, по меньшей мере, примерно 55000 л, по меньшей мере, примерно 60000 л, по меньшей мере, примерно 65000 л, по меньшей мере, примерно 70000 л, по меньшей мере, примерно 75000 л, по меньшей мере, примерно 80000 л, по меньшей мере, примерно 85000 л, по меньшей мере, примерно 90000 л, по меньшей мере, примерно 95000 л, по меньшей мере, примерно 100000 л и т.д.In some embodiments, the crop has a size of at least about 10 L, e.g., a volume of at least about 10 L, at least about 20 L, at least about 30 L, at least about 40 L, at least about 50 L, at least about 60 L, at least about 70 L, at least about 80 L, at least about 90 L, at least about 100 L at least about 150 L, at least about 200 L, at least about 250 L, at least about 300 L, at least about 400 L, at least about 500 L, according to at least about 600 L, at least about 700 L, at least about 800 L, at least about 900 L, at least about 1000 L, at least about 2000 L, at least , about 3000 l, at least about 4000 l, at least about 5000 l, at least about 6000 l, at least about 10000 l, at least about 15000 l, at least about 20,000 L, at least about 25,000 L, at least about 30,000 L, at least about 35,000 L, at least about 40,000 L, at least about 45,000 L, at least about 50,000 l, at least about 55,000 l, at least about 60,000 l, at least about 65,000 l, at least about 70,000 l, at least about 75,000 l, at least about 80,000 l, at least about 85,000 L, at least about 90,000 L, at least about 95,000 L, at least about 100,000 L, etc.

VI. Композиции и составыVI. Compositions and formulations

В одном аспекте, изобретение включает композицию, которая включает полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления, композиция вызывает иммунный ответ, включая антитела, которые могут придавать иммунитет к патогенным видам E. coli.In one aspect, the invention includes a composition that includes an E. coli -derived polypeptide, or a fragment thereof. In some embodiments, the composition induces an immune response, including antibodies, which can confer immunity to pathogenic E. coli species.

В некоторых вариантах осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент в качестве единственного антигена. В некоторых вариантах осуществления, композиция не включает конъюгат.In some embodiments, the composition includes an E. coli -derived polypeptide or fragment thereof as the sole antigen. In some embodiments, the composition does not include a conjugate.

В некоторых вариантах осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент и дополнительный антиген. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент и дополнительный антиген E.coli. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент, и гликоконъюгат из E.coli.In some embodiments, the composition includes an E. coli -derived polypeptide or fragment thereof and an additional antigen. In some embodiments, the composition includes an E. coli -derived polypeptide or fragment thereof and an additional E. coli antigen. In some embodiments, the composition includes an E. coli-derived polypeptide, or fragment thereof, and an E. coli -derived glycoconjugate.

В некоторых вариантах осуществления, полипептид или его фрагмент происходят из FimH E. coli.In some embodiments, the polypeptide or fragment thereof is derived from E. coli FimH.

В некоторых вариантах осуществления, композиция включает полипептид, полученный из FimC E. coli, или его фрагмент.In some embodiments, the composition includes a polypeptide derived from E. coli FimC, or a fragment thereof.

В некоторых вариантах осуществления, композиция включает полипептид, полученный из FimH E. coli, или его фрагмент; и полипептид, полученный из FimC E. coli, или его фрагмент.In some embodiments, the composition includes a polypeptide derived from E. coli FimH, or a fragment thereof; and a polypeptide derived from E. coli FimC, or a fragment thereof.

В одном аспекте, изобретение включает композицию, включающую полипептид, полученный из FimH E. coli, или его фрагмент; и сахарид, имеющий структуру, выбранную из Формулы O1 (например, Формулы O1A, Формулы O1B и Формулы O1C), Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4 (например, Формулы O4:K52 и Формулы O4:K6), Формулы O5 (например, Формулы O5ab и Формулы O5ac (штамм 180/C3)), Формулы O6 (например, Формулы O6:K2; K13; K15 и Формулы O6:K54), Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18 (например, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B и Формулы O18B1), Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23 (например, Формулы O23A), Формулы O24, Формулы O25 (например, Формулы O25a и Формулы O25b), Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45 (например, Формулы O45 и Формулы O45rel), Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы 62D₁, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73 (например, Формулы O73 (штамм 73-1)), Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186 и Формулы O187, где n представляет собой целое число от 1 до 100.In one aspect, the invention includes a composition comprising a polypeptide derived from E. coli FimH, or a fragment thereof; and a saccharide having a structure selected from Formula O1 (for example, Formula O1A, Formula O1B and Formula O1C), Formula O2, Formula O3, Formula O4 (for example, Formula O4:K52 and Formula O4:K6), Formula O5 (for example, Formulas O5ab and Formulas O5ac (strain 180/C3)), Formulas O6 (e.g. Formulas O6:K2; K13; K15 and Formulas O6:K54), Formulas O7, Formulas O8, Formulas O9, Formulas O10, Formulas O11, Formulas O12 , Formulas O13, Formulas O14, Formulas O15, Formulas O16, Formulas O17, Formulas O18 (for example, Formulas O18A, Formulas O18ac, Formulas O18A1, Formulas O18B and Formulas O18B1), Formulas O19, Formulas O20, Formulas O21, Formulas O22, Formulas O23 (for example, Formula O23A), Formula O24, Formula O25 (for example, Formula O25a and Formula O25b), Formula O26, Formula O27, Formula O28, Formula O29, Formula O30, Formula O32, Formula O33, Formula O34, Formula O35, Formula O36, Formula O37, Formula O38, Formula O39, Formula O40, Formula O41, Formula O42, Formula O43, Formula O44, Formula O45 (e.g. Formula O45 and Formula O45rel), Formula O46, Formula O48, Formula O49, Formula O50 , Formulas O51, Formulas O52, Formulas O53, Formulas O54, Formulas O55, Formulas O56, Formulas O57, Formulas O58, Formulas O59, Formulas O60, Formulas O61, Formulas O62, Formulas 62D ₁ , Formulas O63, Formulas O64, Formulas O65, Formulas O66, Formulas O68, Formulas O69, Formulas O70, Formulas O71, Formulas O73 (e.g. Formulas O73 (strain 73-1)), Formulas O74, Formulas O75, Formulas O76, Formulas O77, Formulas O78, Formulas O79, Formulas O80 , Formulas O81, Formulas O82, Formulas O83, Formulas O84, Formulas O85, Formulas O86, Formulas O87, Formulas O88, Formulas O89, Formulas O90, Formulas O91, Formulas O92, Formulas O93, Formulas O95, Formulas O96, Formulas O97, Formulas O98, Formulas O99, Formulas O100, Formulas O101, Formulas O102, Formulas O103, Formulas O104, Formulas O105, Formulas O106, Formulas O107, Formulas O108, Formulas O109, Formulas O110, Formulas 0111, Formulas O112, Formulas O113 , Formulas O114, Formulas O115, Formulas O116, Formulas O117, Formulas O118, Formulas O119, Formulas O120, Formulas O121, Formulas O123, Formulas O124, Formulas O125, Formulas O126, Formulas O127, Formulas O128, Formulas O129, Formulas O130, O131, Formulas O132 , Formulas O133, Formulas O134, Formulas O135, Formulas O136, Formulas O137, Formulas O138, Formulas O139, Formulas O140, Formulas O141, Formulas O142, Formulas O143, Formulas O144, Formulas O145, Formulas O146, Formulas O147, Formulas O148, Formulas O149, Formulas O150, Formulas O151, Formulas O152, Formulas O153, Formulas O154, Formulas O155, Formulas O156, Formulas O157, Formulas O158, Formulas O159, Formulas O160, Formulas O161, Formulas O162, Formulas O163, Formulas O16 4, Formula O165, Formulas O166, Formulas O167, Formulas O168, Formulas O169, Formulas O170, Formulas O171, Formulas O172, Formulas O173, Formulas O174, Formulas O175, Formulas O176, Formulas O177, Formulas O178, Formulas O179, Formulas O180, O181, Formulas O182 , Formulas O183, Formulas O184, Formulas O185, Formulas O186, and Formulas O187, where n is an integer between 1 and 100.

В некоторых вариантах осуществления, композиция включает один или несколько сахаридов, которые являются или получены из одного или нескольких серотипов K. pneumoniae, выбранных из O1 (и вариантов d-Gal-III), O2 (и вариантов d-Gal-III), O2ac, О3, О4, О5, О7, О8 и О12. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает сахарид из одного или нескольких серотипов O1, O2, O3 и O5 или их комбинацию или полученный из них. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает сахарид из каждого из серотипов K. pneumoniae O1, O2, O3 и O5 или полученный из них.In some embodiments, the composition includes one or more saccharides that are or are derived from one or more serotypes of K. pneumoniae selected from O1 (and d-Gal-III variants), O2 (and d-Gal-III variants), O2ac , O3, O4, O5, O7, O8 and O12. In some embodiments, the composition includes a saccharide from or derived from one or more serotypes O1, O2, O3 and O5, or a combination thereof. In some embodiments, the composition includes a saccharide from or derived from each of K. pneumoniae serotypes O1, O2, O3, and O5.

В некоторых вариантах осуществления, композиция дополнительно включает, по меньшей мере, один сахарид, полученный из любого типа K. pneumoniae, выбранного из группы, состоящей из O1, O2, O3 и O5. В некоторых вариантах осуществления, композиция дополнительно включает, по меньшей мере, один сахарид, полученный из K. pneumoniae типа O1. В некоторых вариантах осуществления, композиция дополнительно включает, по меньшей мере, один сахарид, полученный из K. pneumoniae типа O2. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает комбинацию сахаридов, где сахарид получен из любого одного из типов K. pneumoniae, выбранных из группы, состоящей из O1, O2, O3 и O5. Например, в некоторых вариантах осуществления, композиция включает, по меньшей мере, один сахарид, полученный из K. pneumoniae типа O1, и по меньшей мере, один сахарид, полученный из K. pneumoniae типа O2. В предпочтительном варианте осуществления, сахарид, полученный из K. pneumoniae, конъюгирован с белком-носителем; и сахарид, полученный из E. coli, конъюгирован с белком-носителем.In some embodiments, the composition further includes at least one saccharide derived from any type of K. pneumoniae selected from the group consisting of O1, O2, O3 and O5. In some embodiments, the composition further includes at least one saccharide derived from K. pneumoniae type O1. In some embodiments, the composition further includes at least one saccharide derived from K. pneumoniae type O2. In some embodiments, the composition includes a combination of saccharides, where the saccharide is derived from any one of the types of K. pneumoniae selected from the group consisting of O1, O2, O3 and O5. For example, in some embodiments, the composition includes at least one saccharide derived from K. pneumoniae type O1 and at least one saccharide derived from K. pneumoniae type O2. In a preferred embodiment, the saccharide obtained from K. pneumoniae is conjugated to a carrier protein; and a saccharide derived from E. coli is conjugated to a carrier protein.

В некоторых вариантах осуществления, композиция включает любой из описанных в настоящем документе сахаридов. В предпочтительных вариантах осуществления, композиция включает любой из описанных в настоящем документе конъюгатов.In some embodiments, the composition includes any of the saccharides described herein. In preferred embodiments, the composition includes any of the conjugates described herein.

В некоторых вариантах осуществления, композиция включает, по меньшей мере, один гликоконъюгат из серотипа O25 E. coli, предпочтительно, серотипа O25b. В одном варианте осуществления, композиция включает, по меньшей мере, один гликоконъюгат из серотипа О1 Е. coli, предпочтительно, серотипа О1а. В одном варианте осуществления, композиция включает, по меньшей мере, один гликоконъюгат из серотипа О2 Е. coli. В одном варианте осуществления, композиция включает, по меньшей мере, один гликоконъюгат из серотипа О6 Е. coli.In some embodiments, the composition includes at least one glycoconjugate from E. coli serotype O25, preferably serotype O25b. In one embodiment, the composition includes at least one glycoconjugate from E. coli serotype O1, preferably serotype O1a. In one embodiment, the composition includes at least one glycoconjugate from E. coli serotype O2. In one embodiment, the composition includes at least one glycoconjugate from E. coli serotype O6.

В одном варианте осуществления, композиция включает, по меньшей мере, один гликоконъюгат, выбранный из любого из следующих серотипов O25, O1, O2 и O6 E. coli, предпочтительно, O25b, O1a, O2 и O6. В одном варианте осуществления, композиция включает, по меньшей мере, два гликоконъюгата, выбранных из любого из следующих серотипов O25, O1, O2 и O6 E. coli, предпочтительно, O25b, O1a, O2 и O6. В одном варианте осуществления, композиция включает, по меньшей мере, три гликоконъюгата, выбранных из любого из следующих серотипов O25, O1, O2 и O6 E. coli, предпочтительно, O25b, O1a, O2 и O6. В одном варианте осуществления, композиция включает гликоконъюгат каждого из следующих серотипов O25, O1, O2 и O6 E. coli, предпочтительно, O25b, O1a, O2 и O6.In one embodiment, the composition includes at least one glycoconjugate selected from any of the following E. coli serotypes O25, O1, O2 and O6, preferably O25b, O1a, O2 and O6. In one embodiment, the composition includes at least two glycoconjugates selected from any of the following E. coli serotypes O25, O1, O2 and O6, preferably O25b, O1a, O2 and O6. In one embodiment, the composition includes at least three glycoconjugates selected from any of the following E. coli serotypes O25, O1, O2 and O6, preferably O25b, O1a, O2 and O6. In one embodiment, the composition includes a glycoconjugate of each of the following E. coli serotypes O25, O1, O2 and O6, preferably O25b, O1a, O2 and O6.

В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат любой из вышеуказанных композиций индивидуально конъюгирован с CRM₁₉₇.In a preferred embodiment, a glycoconjugate of any of the above compositions is individually conjugated to CRM ₁₉₇ .

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент; и О-антиген, по меньшей мере, из одного серотипа E.coli. В предпочтительном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из более чем 1 серотипа E. coli. Например, композиция может включать О-антиген от двух разных серотипов E.coli (или «v», валентность) до 12 различных серотипов (12v). В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 3 разных серотипов. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 4 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления, композиция включает О-антиген из 5 различных серотипов E.coli. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 6 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 7 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 8 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 9 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 10 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 11 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 12 различных серотипов. В одном варианте осуществления композиция, включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 13 различных серотипов. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 14 различных серотипов. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 15 различных серотипов. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 16 различных серотипов. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 17 различных серотипов. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 18 различных серотипов. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 19 различных серотипов. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 20 различных серотипов.Accordingly, in some embodiments, the composition includes an E. coli -derived polypeptide or fragment thereof; and an O antigen from at least one serotype of E. coli . In a preferred embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli , or a fragment thereof; and O antigen from more than 1 serotype of E. coli . For example, the composition may include O-antigen from two different serotypes of E. coli (or "v", valency) to 12 different serotypes (12v). In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli , or a fragment thereof; and O-antigen from 3 different serotypes. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli , or a fragment thereof; and O-antigen from 4 different serotypes of E. coli . In one embodiment, the composition includes O-antigen from 5 different serotypes of E. coli. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli , or a fragment thereof; and O-antigen from 6 different serotypes of E. coli . In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli , or a fragment thereof; and O-antigen from 7 different serotypes of E. coli . In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli , or a fragment thereof; and O-antigen from 8 different serotypes of E. coli . In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli , or a fragment thereof; and O-antigen from 9 different serotypes of E. coli . In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and O antigen from 10 different serotypes of E. coli . In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli , or a fragment thereof; and O antigen from 11 different serotypes of E. coli . In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and O-antigen from 12 different serotypes. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli , or a fragment thereof; and O-antigen from 13 different serotypes. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli , or a fragment thereof; and O-antigen from 14 different serotypes. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli , or a fragment thereof; and O-antigen from 15 different serotypes. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli , or a fragment thereof; and O-antigen from 16 different serotypes. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli , or a fragment thereof; and O-antigen from 17 different serotypes. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli , or a fragment thereof; and O-antigen from 18 different serotypes. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli , or a fragment thereof; and O-antigen from 19 different serotypes. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli , or a fragment thereof; and O-antigen from 20 different serotypes.

Предпочтительно, количество сахаридов E. coli может варьироваться от 1 серотипа (или «v», валентности) до 26 различных серотипов (26v). В одном варианте осуществления, имеется один серотип. В одном варианте осуществления, имеется 2 различных серотипа. В одном варианте осуществления, имеется 3 различных серотипа. В одном варианте осуществления, имеется 4 различных серотипа. В одном варианте осуществления, имеется 5 различных серотипов. В одном варианте осуществления, имеется 6 различных серотипов. В одном варианте осуществления, имеется 7 различных серотипов. В одном варианте осуществления, имеется 8 различных серотипов. В одном варианте осуществления, имеется 9 различных серотипов. В одном варианте осуществления, имеется 10 различных серотипов. В одном варианте осуществления, имеется 11 различных серотипов. В одном варианте осуществления, имеется 12 различных серотипов. В одном варианте осуществления, имеется 13 различных серотипов. В одном варианте осуществления, имеется 14 различных серотипов. В одном варианте осуществления, имеется 15 различных серотипов. В одном варианте осуществления, имеется 16 различных серотипов. В одном варианте осуществления, имеется 17 различных серотипов. В одном варианте осуществления, имеется 18 различных серотипов. В одном варианте осуществления, имеется 19 различных серотипов. В одном варианте осуществления, имеется 20 различных серотипов. В одном варианте осуществления, имеется 21 различный серотип. В одном варианте осуществления, имеется 22 различных серотипа. В одном варианте осуществления, имеется 23 различных серотипа. В одном варианте осуществления, имеется 24 различных серотипа. В варианте осуществления, существует 25 различных серотипов. В одном варианте осуществления, имеется 26 различных серотипов. Сахариды конъюгируют с белком-носителем с образованием гликоконъюгатов, как описано в настоящем документе.Preferably, the number of E. coli saccharides can vary from 1 serotype (or "v", valency) to 26 different serotypes (26v). In one embodiment, there is one serotype. In one embodiment, there are 2 different serotypes. In one embodiment, there are 3 different serotypes. In one embodiment, there are 4 different serotypes. In one embodiment, there are 5 different serotypes. In one embodiment, there are 6 different serotypes. In one embodiment, there are 7 different serotypes. In one embodiment, there are 8 different serotypes. In one embodiment, there are 9 different serotypes. In one embodiment, there are 10 different serotypes. In one embodiment, there are 11 different serotypes. In one embodiment, there are 12 different serotypes. In one embodiment, there are 13 different serotypes. In one embodiment, there are 14 different serotypes. In one embodiment, there are 15 different serotypes. In one embodiment, there are 16 different serotypes. In one embodiment, there are 17 different serotypes. In one embodiment, there are 18 different serotypes. In one embodiment, there are 19 different serotypes. In one embodiment, there are 20 different serotypes. In one embodiment, there are 21 different serotypes. In one embodiment, there are 22 different serotypes. In one embodiment, there are 23 different serotypes. In one embodiment, there are 24 different serotypes. In an embodiment, there are 25 different serotypes. In one embodiment, there are 26 different serotypes. Saccharides are conjugated to a carrier protein to form glycoconjugates as described herein.

В одном аспекте, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и гликоконъюгат, который включает О-антиген, по меньшей мере, из одной серогруппы E. coli, где О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из более чем 1 серотипа E. coli, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 2 различных серотипов E. coli, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 3 различных серотипов E. coli, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 4 различных серотипов E.coli, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 5 различных серотипов E. coli, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 6 различных серотипов E. coli, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 7 различных серотипов E. coli, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 8 различных серотипов E. coli, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 9 различных серотипов E. coli, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает О-антиген из полипептида, полученного из E. coli, или его фрагмент; и 10 различных серотипов E. coli, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает О-антиген из полипептида, полученного из E. coli, или его фрагмент; и 11 различных серотипов E. coli, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 12 различных серотипов, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 13 различных серотипов, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 14 различных серотипов, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 15 различных серотипов, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 16 различных серотипов, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 17 различных серотипов, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 18 различных серотипов, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 19 различных серотипов, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-антиген из 20 различных серотипов, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем.In one aspect, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and a glycoconjugate that includes an O-antigen from at least one serogroup of E. coli, wherein the O-antigen is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and an O-antigen from more than 1 serotype of E. coli, where each O-antigen is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and an O-antigen from 2 different serotypes of E. coli, where each O-antigen is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and O-antigen from 3 different serotypes of E. coli, where each O-antigen is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and O-antigen from 4 different serotypes of E. coli, where each O-antigen is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and O-antigen from 5 different serotypes of E. coli, where each O-antigen is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and O-antigen from 6 different serotypes of E. coli, where each O-antigen is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and O-antigen from 7 different serotypes of E. coli, where each O-antigen is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and O-antigen from 8 different serotypes of E. coli, where each O-antigen is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and O-antigen from 9 different serotypes of E. coli, where each O-antigen is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes an O-antigen from an E. coli-derived polypeptide, or a fragment thereof; and 10 different serotypes of E. coli, where each O-antigen is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes an O-antigen from an E. coli-derived polypeptide, or a fragment thereof; and 11 different serotypes of E. coli, where each O-antigen is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and O-antigen from 12 different serotypes, where each O-antigen is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and O-antigen from 13 different serotypes, where each O-antigen is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and O-antigen from 14 different serotypes, where each O-antigen is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and O-antigen from 15 different serotypes, where each O-antigen is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and O-antigen from 16 different serotypes, where each O-antigen is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and O-antigen from 17 different serotypes, where each O-antigen is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and O-antigen from 18 different serotypes, where each O-antigen is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and O-antigen from 19 different serotypes, where each O-antigen is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and O-antigen from 20 different serotypes, where each O-antigen is conjugated to a carrier protein.

В другом аспекте, композиция включает О-полисахарид, по меньшей мере, одного серотипа E.coli. В предпочтительном варианте композиция включает О-полисахарид из более чем 1 серотипа E. coli. Например, композиция может включать О-полисахарид из от двух различных серотипов E.coli до 12 различных серотипов E.coli. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 3 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 4 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 5 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 6 различных серотипов E.coli. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 7 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 8 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 9 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 10 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 11 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 12 различных серотипов. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 13 различных серотипов. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 14 различных серотипов. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 15 различных серотипов. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 16 различных серотипов. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 17 различных серотипов. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 18 различных серотипов. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 19 различных серотипов. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 20 различных серотипов.In another aspect, the composition includes an O-polysaccharide from at least one serotype of E. coli . In a preferred embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from more than 1 serotype of E. coli . For example, the composition may include an O-polysaccharide from two different serotypes of E. coli to 12 different serotypes of E. coli. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 3 different serotypes of E. coli . In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 4 different serotypes of E. coli . In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 5 different serotypes of E. coli . In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 6 different serotypes of E. coli . In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 7 different serotypes of E. coli. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 8 different serotypes of E. coli. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 9 different serotypes of E. coli. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 10 different serotypes of E. coli. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 11 different serotypes of E. coli. In one embodiment, the composition includes O-polysaccharide from 12 different serotypes. In one embodiment, the composition includes O-polysaccharide from 13 different serotypes. In one embodiment, the composition includes O-polysaccharide from 14 different serotypes. In one embodiment, the composition includes O-polysaccharide from 15 different serotypes. In one embodiment, the composition includes O-polysaccharide from 16 different serotypes. In one embodiment, the composition includes O-polysaccharide from 17 different serotypes. In one embodiment, the composition includes O-polysaccharide from 18 different serotypes. In one embodiment, the composition includes O-polysaccharide from 19 different serotypes. In one embodiment, the composition includes O-polysaccharide from 20 different serotypes.

В предпочтительном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид, по меньшей мере, из одного серотипа E. coli, где О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В предпочтительном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из более чем 1 серотипа E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. Например, композиция может включать О-полисахарид от двух различных серотипов E.coli до 12 различных серотипов E.coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 3 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 4 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 5 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 6 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 7 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 8 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 9 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 10 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 11 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 12 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 13 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 14 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 15 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 16 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 17 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 18 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 19 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 20 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем.In a preferred embodiment, the composition comprises an O-polysaccharide from at least one serotype of E. coli, wherein the O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein. In a preferred embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from more than 1 serotype of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein. For example, the composition may include an O-polysaccharide from two different serotypes of E. coli to 12 different serotypes of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 3 different serotypes of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 4 different serotypes of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 5 different serotypes of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 6 different serotypes of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 7 different serotypes of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 8 different serotypes of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 9 different serotypes of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 10 different serotypes of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 11 different serotypes of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 12 different serotypes, where each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 13 different serotypes, where each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 14 different serotypes, where each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 15 different serotypes, where each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 16 different serotypes, where each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 17 different serotypes, where each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 18 different serotypes, where each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 19 different serotypes, where each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 20 different serotypes, where each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления, композиция включает O-полисахарид, по меньшей мере, из одного серотипа E. coli, где О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В предпочтительном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из более чем 1 серотипа E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. Например, композиция может включать О-полисахарид от двух разных серотипов E. coli до 12 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и основной сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 3 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 4 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 5 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 6 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 7 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 8 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 9 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 10 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 11 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 12 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и при этом О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 13 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и при этом О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 14 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 15 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 16 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и при этом О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 17 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и при этом О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 18 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 19 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает О-полисахарид из 20 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и при этом О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В предпочтительном варианте осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.In a most preferred embodiment, the composition comprises an O-polysaccharide from at least one serotype of E. coli, wherein the O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein, and wherein the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In a preferred embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from more than 1 serotype of E. coli, wherein each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein, and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. For example, the composition may include an O-polysaccharide from two different serotypes of E. coli to 12 different serotypes of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein, and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a base saccharide. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 3 different serotypes of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein, and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 4 different serotypes of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein, and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 5 different serotypes of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein, and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 6 different serotypes of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein, and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 7 different serotypes of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein, and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 8 different serotypes of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein, and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 9 different serotypes of E. coli, wherein each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein, and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 10 different serotypes of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein, and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 11 different serotypes of E. coli, wherein each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein, and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 12 different serotypes, wherein each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein, and wherein the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 13 different serotypes, wherein each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein, and wherein the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 14 different serotypes, wherein each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein, and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 15 different serotypes, wherein each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein, and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 16 different serotypes, wherein each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein, and wherein the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 17 different serotypes, wherein each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein, and wherein the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 18 different serotypes, wherein each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein, and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 19 different serotypes, wherein each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein, and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes an O-polysaccharide from 20 different serotypes, wherein each O-polysaccharide is conjugated to a carrier protein, and wherein the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In a preferred embodiment, the carrier protein is CRM ₁₉₇ .

В другом предпочтительном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где О-полисахарид включает формулу O25a, где n равно, по меньшей мере, 40, и коровый сахарид. В предпочтительном варианте осуществления, композиция дополнительно включает О-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где О-полисахарид включает формулу O25b, где n равно, по меньшей мере, 40, и коровый сахарид. В другом варианте осуществления, композиция дополнительно включает О-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где О-полисахарид включает формулу O1a, где n равно, по меньшей мере, 40, и коровый сахарид. В другом варианте осуществления, композиция дополнительно включает О-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где О-полисахарид включает Формулу О2, где n равно, по меньшей мере, 40, и коровый сахарид. В другом варианте осуществления, композиция дополнительно включает О-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где О-полисахарид включает Формулу О6, где n равно, по меньшей мере, 40, и коровый сахарид.In another preferred embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and an O-polysaccharide conjugated to CRM ₁₉₇ , wherein the O-polysaccharide includes the formula O25a, where n is at least 40, and a core saccharide. In a preferred embodiment, the composition further comprises an O-polysaccharide conjugated to CRM ₁₉₇ , wherein the O-polysaccharide includes formula O25b, where n is at least 40, and a core saccharide. In another embodiment, the composition further includes an O-polysaccharide conjugated to CRM ₁₉₇ , wherein the O-polysaccharide includes formula O1a, where n is at least 40, and a core saccharide. In another embodiment, the composition further includes an O-polysaccharide conjugated to CRM ₁₉₇ , wherein the O-polysaccharide includes Formula O2, where n is at least 40, and a core saccharide. In another embodiment, the composition further includes an O-polysaccharide conjugated to CRM ₁₉₇ , wherein the O-polysaccharide includes Formula O6, where n is at least 40, and a core saccharide.

В другом варианте осуществления, композиция дополнительно включает О-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где О-полисахарид включает Формулу О17, где n равно, по меньшей мере, 40, и коровый сахарид. В другом варианте осуществления, композиция дополнительно включает O-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где O-полисахарид включает формулу O15, где n равно, по меньшей мере, 40, и коровый сахарид. В другом варианте осуществления, композиция дополнительно включает О-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где О-полисахарид включает формулу O18A, где n равно, по меньшей мере, 40, и коровый сахарид. В другом варианте осуществления, композиция дополнительно включает О-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где О-полисахарид включает Формулу О75, где n равно, по меньшей мере, 40, и коровый сахарид. В другом варианте осуществления, композиция дополнительно включает О-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где О-полисахарид включает Формулу О4, где n равно, по меньшей мере, 40, и коровый сахарид. В другом варианте осуществления, композиция дополнительно включает О-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где О-полисахарид включает формулу O16, где n равно, по меньшей мере, 40, и коровый сахарид. В другом варианте осуществления, композиция дополнительно включает О-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где О-полисахарид включает формулу O13, где n равно, по меньшей мере, 40, и коровый сахарид. В другом варианте осуществления, композиция дополнительно включает О-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где О-полисахарид включает Формулу О7, где n равно, по меньшей мере, 40, и основной сахарид.In another embodiment, the composition further includes an O-polysaccharide conjugated to CRM ₁₉₇ , wherein the O-polysaccharide includes Formula O17, where n is at least 40, and a core saccharide. In another embodiment, the composition further includes an O-polysaccharide conjugated to CRM ₁₉₇ , wherein the O-polysaccharide includes formula O15, where n is at least 40, and a core saccharide. In another embodiment, the composition further includes an O-polysaccharide conjugated to CRM ₁₉₇ , wherein the O-polysaccharide includes the formula O18A, where n is at least 40, and a core saccharide. In another embodiment, the composition further includes an O-polysaccharide conjugated to CRM ₁₉₇ , wherein the O-polysaccharide includes Formula O75, where n is at least 40, and a core saccharide. In another embodiment, the composition further includes an O-polysaccharide conjugated to CRM ₁₉₇ , wherein the O-polysaccharide includes Formula O4, where n is at least 40, and a core saccharide. In another embodiment, the composition further includes an O-polysaccharide conjugated to CRM ₁₉₇ , wherein the O-polysaccharide includes formula O16, where n is at least 40, and a core saccharide. In another embodiment, the composition further includes an O-polysaccharide conjugated to CRM ₁₉₇ , wherein the O-polysaccharide includes formula O13, where n is at least 40, and a core saccharide. In another embodiment, the composition further includes an O-polysaccharide conjugated to CRM ₁₉₇ , wherein the O-polysaccharide includes Formula O7, where n is at least 40, and a base saccharide.

В другом варианте осуществления, композиция дополнительно включает О-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где О-полисахарид включает Формулу О8, где n равно, по меньшей мере, 40, и коровый сахарид. В другом варианте осуществления, О-полисахарид включает формулу О8, где n равно 1-20, предпочтительно, 2-5, более предпочтительно, 3. Формула О8 показана, например, на ФИГ. 10В. В другом варианте осуществления, композиция дополнительно включает О-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где О-полисахарид включает Формулу О9, где n равно, по меньшей мере, 40, и коровый сахарид. В другом варианте осуществления, О-полисахарид включает формулу О9, где n равно 1-20, предпочтительно, 4-8, более предпочтительно, 5. Формула О9 показана, например, на ФИГ. 10В. В другом варианте осуществления, О-полисахарид включает формулу O9a, где n равно 1-20, предпочтительно, 4-8, более предпочтительно, 5. Формула O9a показана, например, на ФИГ. 10В.In another embodiment, the composition further includes an O-polysaccharide conjugated to CRM ₁₉₇ , wherein the O-polysaccharide includes Formula O8, where n is at least 40, and a core saccharide. In another embodiment, the O-polysaccharide includes formula O8, where n is 1-20, preferably 2-5, more preferably 3. Formula O8 is shown, for example, in FIG. 10V. In another embodiment, the composition further includes an O-polysaccharide conjugated to CRM ₁₉₇ , wherein the O-polysaccharide includes Formula O9, where n is at least 40, and a core saccharide. In another embodiment, the O-polysaccharide includes formula O9, where n is 1-20, preferably 4-8, more preferably 5. Formula O9 is shown, for example, in FIG. 10V. In another embodiment, the O-polysaccharide includes formula O9a, where n is 1-20, preferably 4-8, more preferably 5. Formula O9a is shown, for example, in FIG. 10V.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, О-полисахарид выбран из Формулы O20ab, Формулы O20ac, Формулы O52, Формулы O97 и Формулы O101, где n равно 1-20, предпочтительно, 4-8, более предпочтительно, 5. См., например, ФИГ. 10В.In some embodiments, the O-polysaccharide is selected from Formula O20ab, Formula O20ac, Formula O52, Formula O97, and Formula O101, where n is 1-20, preferably 4-8, more preferably 5. See, for example, FIG. . 10V.

Как описано выше, композиция может включать полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и любую комбинацию конъюгированных О-полисахаридов (антигенов). В одном примерном варианте осуществления, композиция включает полисахарид, который включает Формулу O25b, полисахарид, который включает Формулу O1A, полисахарид, который включает Формулу O2, и полисахарид, который включает Формулу O6. Более конкретно, такая композиция, которая включает: (i) О-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где О-полисахарид включает формулу O25b, где n равно, по меньшей мере, 40, и основной сахарид; (ii) О-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где О-полисахарид включает формулу O1a, где n равно, по меньшей мере, 40, и коровый сахарид; (iii) О-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где О-полисахарид включает Формулу О2, где n равно, по меньшей мере, 40, и коровый сахарид; и (iv) О-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где О-полисахарид включает формулу О6, где n равно, по меньшей мере, 40, и основной сахарид.As described above, the composition may include an E. coli -derived polypeptide or fragment thereof; and any combination of conjugated O-polysaccharides (antigens). In one exemplary embodiment, the composition includes a polysaccharide that includes Formula O25b, a polysaccharide that includes Formula O1A, a polysaccharide that includes Formula O2, and a polysaccharide that includes Formula O6. More specifically, such a composition which includes: (i) an O-polysaccharide conjugated to CRM ₁₉₇ , wherein the O-polysaccharide includes the formula O25b, where n is at least 40, and a basic saccharide; (ii) an O-polysaccharide conjugated to CRM ₁₉₇ , wherein the O-polysaccharide includes formula O1a, where n is at least 40, and a core saccharide; (iii) an O-polysaccharide conjugated to CRM ₁₉₇ , wherein the O-polysaccharide includes Formula O2, where n is at least 40, and a core saccharide; and (iv) an O-polysaccharide conjugated to CRM ₁₉₇ , wherein the O-polysaccharide includes the formula O6, where n is at least 40, and a basic saccharide.

В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и, по меньшей мере, один O-полисахарид, полученный из любого серотипа E. coli, где серотип не является O25a. Например, в одном варианте осуществления, композиция не включает сахарид, который включает Формулу O25a. Такая композиция может включать, например, О-полисахарид, который включает Формулу O25b, О-полисахарид, который включает Формулу O1A, О-полисахарид, который включает Формулу O2, и О-полисахарид, который включает Формулу O6.In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and at least one O-polysaccharide derived from any serotype of E. coli where the serotype is not O25a. For example, in one embodiment, the composition does not include a saccharide that includes Formula O25a. Such a composition may include, for example, an O-polysaccharide that includes Formula O25b, an O-polysaccharide that includes Formula O1A, an O-polysaccharide that includes Formula O2, and an O-polysaccharide that includes Formula O6.

В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-полисахарид из 2 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с CRM₁₉₇, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-полисахарид из 3 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с CRM₁₉₇, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-полисахарид из 4 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с CRM₁₉₇, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-полисахарид из 5 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с CRM₁₉₇, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-полисахарид из 6 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с CRM₁₉₇, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-полисахарид из 7 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с CRM₁₉₇, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-полисахарид из 8 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с CRM₁₉₇, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-полисахарид из 9 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с CRM₁₉₇, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-полисахарид из 10 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с CRM₁₉₇, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-полисахарид из 11 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с CRM₁₉₇, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-полисахарид из 12 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с CRM₁₉₇, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-полисахарид из 13 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с CRM₁₉₇, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-полисахарид из 14 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с CRM₁₉₇, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-полисахарид из 15 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с CRM₁₉₇, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-полисахарид из 16 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с CRM₁₉₇, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-полисахарид из 17 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с CRM₁₉₇, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-полисахарид из 18 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с CRM₁₉₇, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-полисахарид из 19 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с CRM₁₉₇, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид. В одном варианте осуществления, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и О-полисахарид из 20 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с CRM₁₉₇, и где О-полисахарид включает О-антиген и коровый сахарид.In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and an O-polysaccharide from 2 different serotypes of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to CRM ₁₉₇ , and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and an O-polysaccharide from 3 different serotypes of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to CRM ₁₉₇ , and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and an O-polysaccharide from 4 different serotypes of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to CRM ₁₉₇ , and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and an O-polysaccharide from 5 different serotypes of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to CRM ₁₉₇ , and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and an O-polysaccharide from 6 different serotypes of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to CRM ₁₉₇ , and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and an O-polysaccharide from 7 different serotypes of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to CRM ₁₉₇ , and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and an O-polysaccharide from 8 different serotypes of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to CRM ₁₉₇ , and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and an O-polysaccharide from 9 different serotypes of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to CRM ₁₉₇ , and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and an O-polysaccharide from 10 different serotypes of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to CRM ₁₉₇ , and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and an O-polysaccharide from 11 different serotypes of E. coli, where each O-polysaccharide is conjugated to CRM ₁₉₇ , and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and an O-polysaccharide from 12 different serotypes, where each O-polysaccharide is conjugated to CRM ₁₉₇ , and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and an O-polysaccharide from 13 different serotypes, where each O-polysaccharide is conjugated to CRM ₁₉₇ , and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and an O-polysaccharide from 14 different serotypes, where each O-polysaccharide is conjugated to CRM ₁₉₇ , and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and an O-polysaccharide from 15 different serotypes, where each O-polysaccharide is conjugated to CRM ₁₉₇ , and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and an O-polysaccharide from 16 different serotypes, where each O-polysaccharide is conjugated to CRM ₁₉₇ , and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and an O-polysaccharide from 17 different serotypes, where each O-polysaccharide is conjugated to CRM ₁₉₇ , and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and an O-polysaccharide from 18 different serotypes, where each O-polysaccharide is conjugated to CRM ₁₉₇ , and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and an O-polysaccharide from 19 different serotypes, where each O-polysaccharide is conjugated to CRM ₁₉₇ , and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide. In one embodiment, the composition includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and an O-polysaccharide from 20 different serotypes, where each O-polysaccharide is conjugated to CRM ₁₉₇ , and where the O-polysaccharide includes an O-antigen and a core saccharide.

В одном аспекте, изобретение относится к композиции, которая включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и конъюгат, включающий сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем, где сахарид включает Формулу O25b, где n равно 15 ± 2. В одном аспекте, изобретение относится к композиции, которая включает полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент; и конъюгат, включающий сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем, где сахарид включает Формулу O25b, где n равно 17 ± 2. В одном аспекте, изобретение относится к композиции, которая включает полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент; и конъюгат, включающий сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем, где сахарид включает Формулу O25b, где n равно 55 ± 2. В другом аспекте, изобретение относится к композиции, которая включает полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент; и конъюгат, включающий сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем, где сахарид включает Формулу O25b, где n равно 51 ± 2. В одном варианте осуществления, сахарид дополнительно включает коровую сахаридную группу E. coli R1. В другом варианте осуществления, сахарид дополнительно включает коровую сахаридную часть E. coli K12. В другом варианте осуществления, сахарид дополнительно включает фрагмент KDO. Предпочтительно, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления, конъюгат получают путем односторонне-связанной конъюгации. В одном варианте осуществления, конъюгат получают химическим методом восстановительного аминирования, предпочтительно в ДМСО буфере. В одном варианте осуществления, сахарид конъюгирован с белком-носителем через спейсер (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбамат (eTEC). Предпочтительно, композиция дополнительно включает фармацевтически приемлемый разбавитель.In one aspect, the invention relates to a composition that includes a polypeptide derived from E. coli or a fragment thereof; and a conjugate comprising a saccharide covalently linked to a carrier protein, wherein the saccharide comprises Formula O25b, wherein nequal to 15 ± 2. In one aspect, the invention relates to a composition that includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and a conjugate comprising a saccharide covalently linked to a carrier protein, wherein the saccharide comprises Formula O25b, wherein nequal to 17 ± 2. In one aspect, the invention provides a composition that includes a polypeptide derived from E. coli or a fragment thereof; and a conjugate comprising a saccharide covalently linked to a carrier protein, wherein the saccharide comprises Formula O25b, wherein nequal to 55 ± 2. In another aspect, the invention relates to a composition that includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and a conjugate comprising a saccharide covalently linked to a carrier protein, wherein the saccharide comprises Formula O25b, wherein nequal to 51 ± 2. In one embodiment, the saccharide further includes a core saccharide group E. coliR1. In another embodiment, the saccharide further includes a core saccharide moiety E. coliK12. In another embodiment, the saccharide further includes a KDO moiety. Preferably, the carrier protein is a CRM₁₉₇. In one embodiment, the conjugate is obtained by one-way-linked conjugation. In one embodiment, the conjugate is prepared by chemical reductive amination, preferably in DMSO buffer. In one embodiment, the saccharide is conjugated to a carrier protein via a (2-((2-oxoethyl)thio)ethyl)carbamate (eTEC) spacer. Preferably, the composition further includes a pharmaceutically acceptable diluent.

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция индуцирует антитела IgG у людей, где указанные антитела способны связывать полисахарид E. coli серотипа O25B в концентрации, по меньшей мере, 0,2 пг/мл, 0,3 пг/мл, 0,35 пг/мл, 0,4 пг/мл или 0,5 пг/мл по данным анализа ELISA. Таким образом, можно провести сравнение активности OPA в сыворотке до и после иммунизации с иммуногенной композицией по изобретению и сравнить их реакцию на серотип O25B, чтобы оценить потенциальное увеличение числа пациентов, ответивших на лечение. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция индуцирует антитела IgG у людей, где указанные антитела способны убивать E. coli серотипа O25B по данным опсонофагоцитарного анализа in vitro. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция вырабатывает функциональные антитела у людей, где указанные антитела способны убивать серотип O25B E. coli по данным опсонофагоцитарного анализа in vitro. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция по изобретению увеличивает долю пациентов, ответивших на лечение против серотипа O25B E. coli (т.е. индивидуумов с сывороткой, имеющей титр, по меньшей мере, 1:8 по данным OPA in vitro) по сравнению с предварительно иммунизированной популяцией. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция вызывает титр, по меньшей мере, 1:8 против серотипа O25B E. coli, по меньшей мере, у 50% субъектов по данным анализа опсонофагоцитарного уничтожения in vitro. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция по изобретению вызывает титр, по меньшей мере, 1:8 против серотипа O25B E. coli, по меньшей мере, у 60%, 70%, 80% или, по меньшей мере, 90% субъектов, по данным анализа опсонофагоцитарного уничтожения in vitro. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция по изобретению значительно увеличивает долю пациентов, ответивших на лечение против серотипа O25B E. coli (т.е. индивидуумов с сывороткой, имеющей титр, по меньшей мере, 1:8 по данным OPA in vitro) по сравнению с предварительно иммунизированной популяцией. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция по изобретению значительно увеличивает титры ОРА у людей против серотипа O25B E. coli по сравнению с предварительно иммунизированной популяцией.In one embodiment, the immunogenic composition induces IgG antibodies in humans, wherein said antibodies are capable of binding the polysaccharide E. coliserotype O25B at a concentration of at least 0.2 pg/ml, 0.3 pg/ml, 0.35 pg/ml, 0.4 pg/ml or 0.5 pg/ml by ELISA. Thus, it is possible to compare serum OPA activity before and after immunization with the immunogenic composition of the invention and compare their response to serotype O25B to evaluate the potential increase in the number of patients responding to treatment. In one embodiment, the immunogenic composition induces IgG antibodies in humans, wherein said antibodies are capable of killing E. coliserotype O25B according to opsonophagocytic analysis in vitro. In one embodiment, the immunogenic composition produces functional antibodies in humans, wherein said antibodies are capable of killing serotype O25B E. coliaccording to opsonophagocytic analysis in vitro. In one embodiment, the immunogenic composition of the invention increases the proportion of patients responding to treatment against serotype O25B E. coli(i.e. individuals with serum titer of at least 1:8 according to OPA in vitro) compared to a pre-immunized population. In one embodiment, the immunogenic composition produces a titer of at least 1:8 against serotype O25BE. coliin at least 50% of subjects by opsonophagocytic killing assay in vitro. In one embodiment, the immunogenic composition of the invention produces a titer of at least 1:8 against serotype O25BE. coliin at least 60%, 70%, 80%, or at least 90% of subjects, as determined by opsonophagocytic killing assay in vitro. In one embodiment, the immunogenic composition of the invention significantly increases the proportion of patients responding to treatment against serotype O25B E. coli(i.e. individuals with serum titer of at least 1:8 according to OPA in vitro) compared to a pre-immunized population. In one embodiment, the immunogenic composition of the invention significantly increases OPA titers in humans against serotype O25B E. colicompared to a pre-immunized population.

В одном аспекте, изобретение относится к композиции, которая включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и конъюгат, включающий сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем, где сахарид включает формулу O1a, где n равно 39 ± 2. В другом аспекте, изобретение относится к композиции, которая включает полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент; и конъюгат, включающий сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем, где сахарид включает формулу O1a, где n равно 13 ± 2. В одном варианте осуществления, сахарид дополнительно включает коровую сахаридную группу E. coli R1. В одном варианте осуществления, сахарид дополнительно включает фрагмент KDO. Предпочтительно, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления, конъюгат получают путем односторонне-связанной конъюгации. В одном варианте осуществления, конъюгат получают химическим способом восстановительного аминирования, предпочтительно в ДМСО буфере. В одном варианте осуществления, сахарид конъюгирован с белком-носителем через спейсер (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбамат (eTEC). Предпочтительно, композиция дополнительно включает фармацевтически приемлемый разбавитель.In one aspect, the invention relates to a composition that includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and a conjugate comprising a saccharide covalently linked to a carrier protein, wherein the saccharide comprises formula O1a where n is 39 ± 2. In another aspect, the invention provides a composition that includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and a conjugate comprising a saccharide covalently linked to a carrier protein, wherein the saccharide comprises formula O1a where n is 13 ± 2. In one embodiment, the saccharide further comprises an E. coli R1 core saccharide group. In one embodiment, the saccharide further includes a KDO moiety. Preferably, the carrier protein is CRM ₁₉₇ . In one embodiment, the conjugate is obtained by one-way-linked conjugation. In one embodiment, the conjugate is prepared by chemical reductive amination, preferably in a DMSO buffer. In one embodiment, the saccharide is conjugated to a carrier protein via a (2-((2-oxoethyl)thio)ethyl)carbamate (eTEC) spacer. Preferably, the composition further includes a pharmaceutically acceptable diluent.

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция индуцирует антитела IgG у людей, где указанные антитела способны связывать полисахарид серотип O1A E. coli в концентрации, по меньшей мере, 0,2 пг/мл, 0,3 пг/мл, 0,35 пг/мл, 0,4 пг/мл или 0,5 пг/мл по данным анализа ELISA. Таким образом, можно провести сравнение ОРА активности сыворотки до и после иммунизации иммуногенной композицией по изобретению и сравнить их ответ на серотип О1А, чтобы оценить потенциальное увеличение числа пациентов, ответивших на лечение. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция индуцирует антитела IgG у людей, где указанные антитела способны убивать серотип O1A E. coli по данным опсонофагоцитарного анализа in vitro. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция индуцирует функциональные антитела у людей, где указанные антитела способны убивать серотип О1А Е. coli по данным опсонофагоцитарного анализа in vitro. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция по изобретению увеличивает долю пациентов, ответивших на лечение против серотипа O1A E. coli (т.е. индивидуумов с сывороткой, имеющей титр, по меньшей мере, 1:8 по данным OPA in vitro) по сравнению с предварительно иммунизированной популяцией. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция вызывает титр, по меньшей мере, 1:8 против серотипа O1A E. coli, по меньшей мере, у 50% субъектов по данным анализа опсонофагоцитарного уничтожения in vitro. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция по изобретению вызывает титр, по меньшей мере, 1:8 против серотипа O1A E. coli, по меньшей мере, у 60%, 70%, 80% или, по меньшей мере, 90% субъектов по данным анализа опсонофагоцитарного уничтожения in vitro. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция по изобретению значительно увеличивает долю пациентов, ответивших на лечение против серотипов O1A E. coli (т.е. индивидуумов с сывороткой, имеющей титр, по меньшей мере, 1:8 по данным OPA in vitro) по сравнению с предварительно иммунизированной популяцией. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция по изобретению значительно увеличивает титры ОРА у людей против серотипа О1А Е. coli по сравнению с предварительно иммунизированной популяцией.In one embodiment, the immunogenic composition induces IgG antibodies in humans, wherein said antibodies are capable of binding polysaccharide serotype O1A E. coliat a concentration of at least 0.2 pg/ml, 0.3 pg/ml, 0.35 pg/ml, 0.4 pg/ml or 0.5 pg/ml as determined by ELISA. Thus, a comparison of serum OPA activity before and after immunization with the immunogenic composition of the invention can be made and their response to serotype O1A can be compared to assess the potential increase in the number of patients responding to treatment. In one embodiment, the immunogenic composition induces IgG antibodies in humans, wherein said antibodies are capable of killing serotype O1AE. coli according to opsonophagocytic analysis in vitro. In one embodiment, the immunogenic composition induces functional antibodies in humans, wherein said antibodies are capable of killing serotype O1AE. coli according to opsonophagocytic analysis in vitro. In one embodiment, the immunogenic composition of the invention increases the proportion of patients responding to treatment against serotype O1A E. coli(i.e. individuals with serum titer of at least 1:8 according to OPA in vitro) compared to a pre-immunized population. In one embodiment, the immunogenic composition produces a titer of at least 1:8 against serotype O1A E. coli,in at least 50% of subjects by opsonophagocytic killing assay in vitro. In one embodiment, the immunogenic composition of the invention produces a titer of at least 1:8 against serotype O1A E. coli,in at least 60%, 70%, 80%, or at least 90% of subjects by opsonophagocytic killing assay in vitro. In one embodiment, the immunogenic composition of the invention significantly increases the proportion of patients responding to treatment against O1A serotypes E. coli(i.e. individuals with serum titer of at least 1:8 according to OPA in vitro) compared to a pre-immunized population. In one embodiment, the immunogenic composition of the invention significantly increases OPA titers in humans against serotype O1A E. colicompared to a pre-immunized population.

В одном аспекте, изобретение относится к композиции, которая включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и конъюгат, включающий сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем, где сахарид включает формулу O2, где n равно 43 ± 2. В другом аспекте, изобретение относится к композиции, которая включает полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент; и конъюгат, включающий сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем, где сахарид включает формулу O2, где n равно 47 ± 2. В другом аспекте, изобретение относится к композиции, которая включает конъюгат, включающий сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем, где сахарид включает формулу O2, где n равно 17 ± 2. В другом аспекте, изобретение относится к композиции, которая включает конъюгат, включающий сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем, где сахарид включает формулу O2, где n равно 18 ± 2. В одном варианте осуществления, сахарид дополнительно включает коровую сахаридную группу E. coli R1. В другом варианте осуществления, сахарид дополнительно включает коровую сахаридную группу E. coli R4. В другом варианте осуществления, сахарид дополнительно включает фрагмент KDO. Предпочтительно, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления, конъюгат получают путем односторонне-связанной конъюгации. В одном варианте осуществления, конъюгат получают химическим способом восстановительного аминирования, предпочтительно в ДМСО буфере. В одном варианте осуществления, сахарид конъюгирован с белком-носителем через спейсер (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбамат (eTEC). Предпочтительно, композиция дополнительно включает фармацевтически приемлемый разбавитель.In one aspect, the invention relates to a composition that includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and a conjugate comprising a saccharide covalently linked to a carrier protein, wherein the saccharide comprises the formula O2 where n is 43 ± 2. In another aspect, the invention provides a composition that includes a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof; and a conjugate comprising a saccharide covalently linked to a carrier protein, wherein the saccharide comprises the formula O2 where n is 47 ± 2. In another aspect, the invention provides a composition that includes a conjugate comprising a saccharide covalently linked to a carrier protein, wherein the saccharide includes the formula O2, where n is 17 ± 2. In another aspect, the invention provides a composition that includes a conjugate comprising a saccharide covalently linked to a carrier protein, wherein the saccharide includes the formula O2, where n is 18 ± 2. In one In an embodiment, the saccharide further includes an E. coli R1 core saccharide group. In another embodiment, the saccharide further includes an E. coli R4 core saccharide group. In another embodiment, the saccharide further includes a KDO moiety. Preferably, the carrier protein is CRM ₁₉₇ . In one embodiment, the conjugate is obtained by one-way-linked conjugation. In one embodiment, the conjugate is prepared by chemical reductive amination, preferably in a DMSO buffer. In one embodiment, the saccharide is conjugated to a carrier protein via a (2-((2-oxoethyl)thio)ethyl)carbamate (eTEC) spacer. Preferably, the composition further includes a pharmaceutically acceptable diluent.

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция индуцирует антитела IgG у людей, где указанные антитела способны связывать полисахарид серотип O2 E. coli в концентрации, по меньшей мере, 0,2 пг/мл, 0,3 пг/мл, 0,35 пг/мл, 0,4 пг/мл или 0,5 пг/мл по данным анализа ELISA. Таким образом, можно провести сравнение ОРА активности сыворотки до и после иммунизации с иммуногенной композицией по изобретению и сравнить их ответ на серотип О2, чтобы оценить потенциальное увеличение пациентов, ответивших на лечение. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция индуцирует антитела IgG у людей, где указанные антитела способны убивать серотип О2 Е. coli по данным опсонофагоцитарного анализа in vitro. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция вырабатывает у людей функциональные антитела, где указанные антитела способны убивать серотип О2 Е. coli по данным опсонофагоцитарного анализа in vitro. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция по изобретению увеличивает долю пациентов, ответивших на лечение против серотипа О2 E. coli (т.е. индивидуумов с сывороткой, имеющей титр, по меньшей мере, 1:8 по данным OPA in vitro) по сравнению с предварительно иммунизированной популяцией. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция вызывает титр, по меньшей мере, 1:8 против серотипа О2 Е. coli, по меньшей мере, у 50% субъектов по данным анализа опсонофагоцитарного уничтожения in vitro. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция по изобретению вызывает титр, по меньшей мере, 1:8 против серотипа О2 E. coli, по меньшей мере, у 60%, 70%, 80% или, по меньшей мере, 90% субъектов по данным анализа опсонофагоцитарного уничтожения in vitro. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция по изобретению значительно увеличивает долю пациентов, ответивших на лечение против серотипа O2 E. coli (т.е. индивидуумов с сывороткой, имеющей титр, по меньшей мере, 1:8 по данным OPA in vitro) по сравнению с предварительно иммунизированной популяцией. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция по изобретению значительно увеличивает титры ОРА у людей против серотипа О2 Е. coli по сравнению с предварительно иммунизированной популяцией.In one embodiment, the immunogenic composition induces IgG antibodies in humans, wherein said antibodies are capable of binding a serotype O2 polysaccharide E. coliat a concentration of at least 0.2 pg/ml, 0.3 pg/ml, 0.35 pg/ml, 0.4 pg/ml or 0.5 pg/ml as determined by ELISA. Thus, it is possible to compare the OPA activity of serum before and after immunization with the immunogenic composition of the invention and compare their response to serotype O2 to assess the potential increase in patient responders. In one embodiment, the immunogenic composition induces IgG antibodies in humans, wherein said antibodies are capable of killing serotype O2 E. coliaccording to opsonophagocytic analysis in vitro.In one embodiment, the immunogenic composition produces functional antibodies in humans, wherein said antibodies are capable of killing serotype O2 E. coliaccording to opsonophagocytic analysis in vitro.In one embodiment, the immunogenic composition of the invention increases the proportion of patients responding to treatment against serotype O2 E. coli(i.e. individuals with serum titer of at least 1:8 according to OPA in vitro) compared to a pre-immunized population. In one embodiment, the immunogenic composition produces a titer of at least 1:8 against serotype O2 E. coli,in at least 50% of subjects by opsonophagocytic killing assay in vitro. In one embodiment, the immunogenic composition of the invention produces a titer of at least 1:8 against serotype O2 E. coliin at least 60%, 70%, 80%, or at least 90% of subjects by opsonophagocytic killing assayin vitro. In one embodiment, the immunogenic composition of the invention significantly increases the proportion of patients responding to treatment against serotype O2 E. coli(i.e. individuals with serum titer of at least 1:8 according to OPA in vitro) compared to a pre-immunized population. In one embodiment, the immunogenic composition of the invention significantly increases OPA titers in humans against serotype O2 E. colicompared to a pre-immunized population.

В одном аспекте, изобретение относится к композиции, которая включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и конъюгат, включающий сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем, где сахарид включает Формулу O6, где n равно 42 ± 2. В другом аспекте, изобретение относится к композиции, которая включает полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент; и конъюгат, включающий сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем, где сахарид включает формулу O6, где n равно 50 ± 2. В другом аспекте, изобретение относится к композиции, которая включает конъюгат, включающий сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем, где сахарид включает формулу O6, где n равно 17 ± 2. В другом аспекте, изобретение относится к композиции, которая включает конъюгат, включающий сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем, где сахарид включает формулу O6, где n равно 18 ± 2. В одном варианте осуществления, сахарид дополнительно включает коровую сахаридную группу E. coli R1. В одном варианте осуществления, сахарид дополнительно включает фрагмент KDO. Предпочтительно белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления, конъюгат получают путем односторонне-связанной конъюгации. В одном варианте осуществления, конъюгат получают химическим способом восстановительного аминирования, предпочтительно в ДМСО буфере. В одном варианте осуществления, сахарид конъюгирован с белком-носителем через спейсер (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбамат (eTEC). Предпочтительно, композиция дополнительно включает фармацевтически приемлемый разбавитель.In one aspect, the invention relates to a composition that includes a polypeptide derived from E. coli or a fragment thereof; and a conjugate comprising a saccharide covalently linked to a carrier protein, wherein the saccharide comprises Formula O6, wherein nequal to 42 ± 2. In another aspect, the invention relates to a composition that includes a polypeptide derived from E. coli or a fragment thereof; and a conjugate comprising a saccharide covalently linked to a carrier protein, wherein the saccharide comprises the formula O6, wherein nequal to 50 ± 2. In another aspect, the invention relates to a composition that includes a conjugate comprising a saccharide covalently linked to a carrier protein, wherein the saccharide comprises the formula O6, where nequal to 17 ± 2. In another aspect, the invention relates to a composition that includes a conjugate comprising a saccharide covalently linked to a carrier protein, wherein the saccharide comprises the formula O6, where nequal to 18 ± 2. In one embodiment, the saccharide further includes a core saccharide group E. coliR1. In one embodiment, the saccharide further includes a KDO moiety. Preferably the carrier protein is a CRM₁₉₇. In one embodiment, the conjugate is obtained by one-way-linked conjugation. In one embodiment, the conjugate is prepared by chemical reductive amination, preferably in a DMSO buffer. In one embodiment, the saccharide is conjugated to a carrier protein via a (2-((2-oxoethyl)thio)ethyl)carbamate (eTEC) spacer. Preferably, the composition further includes a pharmaceutically acceptable diluent.

В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция индуцирует антитела IgG у людей, где указанные антитела способны связывать полисахарид серотипа O6 E. coli в концентрации, по меньшей мере, 0,2 пг/мл, 0,3 пг/мл, 0,35 пг/мл, 0,4 пг/мл или 0,5 пг/мл по данным анализа ELISA. Таким образом, можно провести сравнение ОРА активности сыворотки до и после иммунизации с иммуногенной композицией по изобретению и сравнить их ответ на серотип О6, чтобы оценить потенциальное увеличение числа пациентов, ответивших на лечение. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция индуцирует антитела IgG у людей, где указанные антитела способны убивать серотип О6 Е. coli по данным опсонофагоцитарного анализа in vitro. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция вырабатывает у людей функциональные антитела, где указанные антитела способны убивать серотип О6 Е. coli по данным опсонофагоцитарного анализа in vitro. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция по изобретению увеличивает долю пациентов, ответивших на лечение против серотипа О6 E. coli (т. е. индивидуумов с сывороткой, имеющей титр, по меньшей мере, 1:8 по данным OPA in vitro) по сравнению с предварительно иммунизированной популяцией. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция вызывает титр, по меньшей мере, 1:8 против серотипа О6 Е. coli, по меньшей мере, у 50% субъектов по данным анализа опсонофагоцитарного уничтожения in vitro. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция по изобретению вызывает титр, по меньшей мере, 1:8 против серотипа О6 E. coli, по меньшей мере, у 60%, 70%, 80% или, по меньшей мере, 90% субъектов по данным анализа опсонофагоцитарного уничтожения in vitro. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция по изобретению значительно увеличивает долю пациентов, ответивших на лечение против серотипов O6 E. coli (т.е. индивидуумов с сывороткой, имеющей титр, по меньшей мере, 1:8 по данным OPA in vitro) по сравнению с предварительно иммунизированной популяцией. В одном варианте осуществления, иммуногенная композиция по изобретению значительно увеличивает титры ОРА у людей против серотипа О6 Е. coli по сравнению с предварительно иммунизированной популяцией.In one embodiment, the immunogenic composition induces IgG antibodies in humans, wherein said antibodies are capable of binding a serotype O6 polysaccharide E. coliat a concentration of at least 0.2 pg/ml, 0.3 pg/ml, 0.35 pg/ml, 0.4 pg/ml or 0.5 pg/ml as determined by ELISA. Thus, it is possible to compare the OPA activity of serum before and after immunization with the immunogenic composition of the invention and compare their response to serotype O6 to evaluate the potential increase in the number of patients responding to treatment. In one embodiment, the immunogenic composition induces IgG antibodies in humans, wherein said antibodies are capable of killing serotype O6 E. coliaccording to opsonophagocytic analysis in vitro.In one embodiment, the immunogenic composition produces functional antibodies in humans, wherein said antibodies are capable of killing serotype O6 E. coliaccording to opsonophagocytic analysis in vitro.In one embodiment, the immunogenic composition of the invention increases the proportion of patients responding to treatment against serotype O6 E. coli(i.e. individuals with serum titer of at least 1:8 as determined by OPA in vitro) compared to a pre-immunized population. In one embodiment, the immunogenic composition produces a titer of at least 1:8 against serotype O6 E. coli,in at least 50% of subjects by opsonophagocytic killing assay in vitro. In one embodiment, the immunogenic composition of the invention produces a titer of at least 1:8 against serotype O6 E. coli,in at least 60%, 70%, 80%, or at least 90% of subjects by opsonophagocytic killing assay in vitro. In one embodiment, the immunogenic composition of the invention significantly increases the proportion of patients responding to treatment against O6 serotypes E. coli(i.e. individuals with serum titer of at least 1:8 according to OPA in vitro) compared to a pre-immunized population. In one embodiment, the immunogenic composition of the invention significantly increases OPA titers in humans against serotype O6 E. colicompared to a pre-immunized population.

В одном аспекте, композиция включает полипептид, полученный из E.coli, или его фрагмент; и конъюгат, включающий сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем, где сахарид имеет структуру, выбранную из Формулы O1 (например, Формулы O1A, Формулы O1B и Формулы O1C), Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4 (например, Формулы O4:K52 и Формулы O4:K6), Формулы O5 (например, Формулы O5ab и Формулы O5ac (штамм 180/C3)), Формулы O6 (например, Формулы O6:K2; K13; K15 и Формулы O6:K54), Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18 (например, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B и Формулы O18B1), Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23 (например, Формулы O23A), Формулы O24, Формулы O25 (например, Формулы O25a и Формулы O25b), Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45 (например, Формулы O45 и Формулы O45rel), Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы 62D₁, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73 (например, Формулы O73 (штамм 73-1)), Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186 и Формулы O187, где n представляет собой целое число от 1 до 100. В одном варианте осуществления, сахарид дополнительно включает коровую сахаридную группу E. coli R1. В одном варианте осуществления, сахарид дополнительно включает коровую сахаридную группу E. coli R2. В одном варианте осуществления, сахарид дополнительно включает коровую сахаридную группу E. coli R3. В другом варианте осуществления, сахарид дополнительно включает коровую сахаридную группу E. coli R4. В одном варианте осуществления, сахарид дополнительно включает сахаридную часть ядра E. coli K12. В другом варианте осуществления, сахарид дополнительно включает фрагмент KDO. Предпочтительно белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления, конъюгат получают путем односторонне-связанной конъюгации. В одном варианте осуществления, конъюгат получают химическим способом восстановительного аминирования, предпочтительно в ДМСО буфере. В одном варианте осуществления, сахарид конъюгирован с белком-носителем через спейсер (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбамат (eTEC). Предпочтительно, композиция дополнительно включает фармацевтически приемлемый разбавитель. В одном варианте осуществления, композиция дополнительно включает, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 дополнительных конъюгатов до не более чем 30 дополнительных конъюгатов, где каждый конъюгат включает сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем, где сахарид включает структуру, выбранную из любой из указанных Формул.In one aspect, the composition includes a polypeptide derived from E. coli or a fragment thereof; and a conjugate comprising a saccharide covalently linked to a carrier protein, wherein the saccharide has a structure selected from Formula O1 (for example, Formula O1A, Formula O1B and Formula O1C), Formula O2, Formula O3, Formula O4 (for example, Formula O4:K52 and Formulas O4:K6), Formulas O5 (for example, Formulas O5ab and Formulas O5ac (strain 180/C3)), Formulas O6 (for example, Formulas O6:K2; K13; K15 and Formulas O6:K54), Formulas O7, Formulas O8 , Formulas O9, Formulas O10, Formulas O11, Formulas O12, Formulas O13, Formulas O14, Formulas O15, Formulas O16, Formulas O17, Formulas O18 (for example, Formulas O18A, Formulas O18ac, Formulas O18A1, Formulas O18B and Formulas O18B1), Formulas O19, Formula O20, Formula O21, Formula O22, Formula O23 (for example, Formula O23A), Formula O24, Formula O25 (for example, Formula O25a and Formula O25b), Formula O26, Formula O27, Formula O28, Formula O29, Formula O30, Formula O32, Formula O33, Formula O34, Formula O35, Formula O36, Formula O37, Formula O38, Formula O39, Formula O40, Formula O41, Formula O42, Formula O43, Formula O44, Formula O45 (for example, Formula O45 and Formula O45rel) , Formulas O46, Formulas O48, Formulas O49, Formulas O50, Formulas O51, Formulas O52, Formulas O53, Formulas O54, Formulas O55, Formulas O56, Formulas O57, Formulas O58, Formulas O59, Formulas O60, Formulas O61, Formulas O62, Formulas 62D₁, Formulas O63, Formulas O64, Formulas O65, Formulas O66, Formulas O68, Formulas O69, Formulas O70, Formulas O71, Formulas O73 (for example, Formulas O73 (strain 73-1)), Formulas O74, Formulas O75, Formulas O76, Formulas O77, Formulas O78, Formulas O79, Formulas O80, Formulas O81, Formulas O82, Formulas O83, Formulas O84, Formulas O85, Formulas O86, Formulas O87, Formulas O88, Formulas O89, Formulas O90, Formulas O91, Formulas O92, Formulas O93, Formulas O95, Formulas O96, Formulas O97, Formulas O99, Formulas O100, Formulas O101, Formulas O102, Formulas O103, Formulas O104, Formulas O105, Formulas O106, Formulas O107, Formulas O108, Formulas O109, Formulas O110, Formulas 0111 , Formulas O112, Formulas O113, Formulas O114, Formulas O115, Formulas O116, Formulas O117, Formulas O118, Formulas O119, Formulas O120, Formulas O121, Formulas O123, Formulas O124, Formulas O125, Formulas O126, Formulas O127, Formulas O128, Formulas O129, Formulas O130, Formulas O131, Formulas O132, Formulas O133, Formulas O134, Formulas O135, Formulas O136, Formulas O137, Formulas O138, Formulas O139, Formulas O140, Formulas O141, Formulas O142, Formulas O143, Formulas O14 4, Formula O145, Formulas O146, Formulas O147, Formulas O148, Formulas O149, Formulas O150, Formulas O151, Formulas O152, Formulas O153, Formulas O154, Formulas O155, Formulas O156, Formulas O157, Formulas O158, Formulas O159, Formulas O160, O161, Formulas O162 , Formulas O163, Formulas O164, Formulas O165, Formulas O166, Formulas O167, Formulas O168, Formulas O169, Formulas O170, Formulas O171, Formulas O172, Formulas O173, Formulas O174, Formulas O175, Formulas O176, Formulas O177, Formulas O178, Formulas O179, Formula O180, Formula O181, Formula O182, Formula O183, Formula O184, Formula O185, Formula O186 and Formula O187, where nis an integer from 1 to 100. In one embodiment, the saccharide further includes a core saccharide group E. coliR1. In one embodiment, the saccharide further includes a core saccharide group E. coliR2. In one embodiment, the saccharide further includes a core saccharide group E. coli R3. In another embodiment, the saccharide further includes a core saccharide group E. coli R4. In one embodiment, the saccharide further includes a saccharide core portion E. coli K12. In another embodiment, the saccharide further includes a KDO moiety. Preferably the carrier protein is a CRM₁₉₇. In one embodiment, the conjugate is obtained by one-way-linked conjugation. In one embodiment, the conjugate is prepared by chemical reductive amination, preferably in a DMSO buffer. In one embodiment, the saccharide is conjugated to a carrier protein via a (2-((2-oxoethyl)thio)ethyl)carbamate (eTEC) spacer. Preferably, the composition further includes a pharmaceutically acceptable diluent. In one embodiment, the composition further includes at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 additional conjugates to no more than 30 additional conjugates, where each conjugate includes a saccharide covalently linked to a carrier protein, where the saccharide includes a structure selected from any of the above Formulas.

А. СахаридA. Saccharide

В одном варианте осуществления, сахарид получают путем экспрессии (не обязательно сверхэкспрессии) различных белков Wzz (например, WzzB) для контроля размера сахарида.In one embodiment, the saccharide is produced by expressing (not necessarily overexpressing) various Wzz proteins (eg, WzzB) to control the size of the saccharide.

Используемый в настоящем документе термин «сахарид» относится к одной сахарной группе или моносахаридной единице, а также к комбинациям двух или нескольких отдельных сахарных групп или моносахаридных единиц, ковалентно связанных с образованием дисахаридов, олигосахаридов и полисахаридов. Сахарид может быть линейным или разветвленным.As used herein, the term “saccharide” refers to a single sugar group or monosaccharide unit, as well as combinations of two or more individual sugar groups or monosaccharide units covalently linked to form disaccharides, oligosaccharides and polysaccharides. The saccharide can be linear or branched.

В одном варианте осуществления, сахарид продуцируется рекомбинантной грамотрицательной бактерией. В одном варианте осуществления, сахарид продуцируется в рекомбинантной клетке E.coli. В одном варианте осуществления, сахарид продуцируется в рекомбинантной клетке Salmonella. Примеры бактерий включают E. coli O25K5H1, E. coli BD559, E. coli GAR2831, E. coli GAR865, E. coli GAR868, E. coli GAR869, E. coli GAR872, E. coli GAR878, E. coli GAR896, E. coli GAR1902, E. coli O25a ETC NR-5, E. coli O157:H7:K-, Salmonella enterica серотип Typhimurium, штамм LT2, E. coli GAR2401, Salmonella enterica серотип Enteritidis CVD 1943, Salmonella enterica серотип Typhimurium CVD 1925, Salmonella enterica серотип Paratyphi A CVD 1902 и Shigella flexneri CVD 1208S. В одном варианте осуществления, бактерия не является E.coli GAR2401. Этот генетический подход к продуцированию сахаридов позволяет эффективно производить О-полисахариды и молекулы О-антигена в качестве компонентов вакцины.In one embodiment, the saccharide is produced by a recombinant gram-negative bacterium. In one embodiment, the saccharide is produced in a recombinant E. coli cell. In one embodiment, the saccharide is produced in a recombinant Salmonella cell. Examples of bacteria include E. coli O25K5H1 , E. coli BD559, E. coli GAR2831, E. coli GAR865, E. coli GAR868, E. coli GAR869, E. coli GAR872, E. coli GAR878, E. coli GAR896, E. coli GAR1902, E. coli O25a ETC NR-5, E. coli O157:H7:K-, Salmonella enterica serotype Typhimurium, strain LT2, E. coli GAR2401, Salmonella enterica serotype Enteritidis CVD 1943, Salmonella enterica serotype Typhimurium CVD 1925, Salmonella enterica serotype Paratyphi A CVD 1902 and Shigella flexneri CVD 1208S. In one embodiment, the bacterium is not E. coli GAR2401. This genetic approach to saccharide production allows for the efficient production of O-polysaccharides and O-antigen molecules as vaccine components.

Термин «белок wzz», используемый в настоящем документе, относится к полипептиду, определяющему длину цепи, такому как, например, wzzB, wzz, wzz_SF, wzz_ST, fepE, wzz_fepE, wzzl и wzz2. Номера доступа GenBank для типовых последовательностей генов wzz: AF011910 для E4991/76, AF011911 для F186, AF011912 для M70/1-1, AF011913 для 79/311, AF011914 для Bi7509- 41, AF011915 для C664-1992, AF011916 для C258-94, AF011917 для C722-89 и AF011919 для EDL933. Номера доступа GenBank для последовательностей генов G7 и Bi316-41 wzz: U39305 и U39306, соответственно. Дополнительные номера доступа в GenBank для типовых последовательностей генов wzz: NP_459581 для Salmonella enterica подвид enterica, серовар Typhimurium str. LT2 FepE; AIG66859 для штамма E. coli O157:H7 EDL933 FepE; NP_461024 для Salmonella enterica подвид enterica, серовар Typhimurium str. LT2 WzzB. NP_416531 для E. coli K-12 подштамм MG1655 WzzB, NP_415119 для E. coli K-12 подштамм MG1655 FepE. В предпочтительных вариантах осуществления, белок семейства wzz представляет собой любой из белков wzzB, wzz, wzz_SF, wzz_ST, fepE, wzz_fepE, wzz1 и wzz2, наиболее предпочтительно, wzzB, более предпочтительно, fepE.The term “wzz protein” as used herein refers to a chain length determining polypeptide such as, for example, wzzB, wzz, wzz _SF , wzz _ST , fepE, wzz _fepE , wzzl and wzz2. GenBank accession numbers for type wzz gene sequences: AF011910 for E4991/76, AF011911 for F186, AF011912 for M70/1-1, AF011913 for 79/311, AF011914 for Bi7509-41, AF011915 for C664-1992, AF0 11916 for C258-94 , AF011917 for C722-89 and AF011919 for EDL933. The GenBank accession numbers for the G7 and Bi316-41 wzz gene sequences are U39305 and U39306, respectively. Additional GenBank accession numbers for type wzz gene sequences: NP_459581 for Salmonella enterica subspecies enterica, serovar Typhimurium str. LT2 FepE; AIG66859 for E. coli strain O157:H7 EDL933 FepE; NP_461024 for Salmonella enterica subspecies enterica, serovar Typhimurium str. LT2 WzzB. NP_416531 for E. coli K-12 substrain MG1655 WzzB, NP_415119 for E. coli K-12 substrain MG1655 FepE. In preferred embodiments, the wzz family protein is any of wzzB, wzz, wzz _SF , wzz _ST , fepE, wzz _fepE , wzz1 and wzz2, most preferably wzzB, more preferably fepE.

Примеры последовательностей wzzB включают последовательности, представленные в SEQ ID No: 30-34. Примеры последовательностей FepE включают последовательности, представленные в SEQ ID No: 35-39.Examples of wzzB sequences include those shown in SEQ ID Nos: 30-34. Examples of FepE sequences include those shown in SEQ ID Nos: 35-39.

В некоторых вариантах осуществления, модифицированный сахарид (модифицированный по сравнению с соответствующим сахаридом дикого типа) может быть получен путем экспрессии (не обязательно сверхэкспрессии) белка семейства wzz (например, fepE) из грамотрицательной бактерии в грамотрицательной бактерии и/или путем выключения (т.е. репрессии, делеции, удаления) второго гена wzz (например, wzzB) для получения высокомолекулярных сахаридов, таких как липополисахариды, содержащие промежуточные или длинные цепи О-антигена. Например, модифицированные сахариды могут быть получены путем экспрессии (не обязательно сверхэкспрессии) wzz2 и выключения wzzl. Или, альтернативно, модифицированные сахариды могут быть получены путем экспрессии (не обязательно сверхэкспрессии) wzzfepE и выключения wzzB. В другом варианте осуществления, модифицированные сахариды могут быть получены путем экспрессии (не обязательно сверхэкспрессии) wzzB, но отключения wzzfepE. В другом варианте осуществления, модифицированные сахариды могут быть получены путем экспрессии fepE. Предпочтительно, белок семейства wzz получают из штамма, гетерологичного клетке-хозяину.In some embodiments, a modified saccharide (modified from the corresponding wild-type saccharide) can be produced by expressing (not necessarily overexpressing) a wzz family protein (e.g., fepE) from a gram-negative bacterium in the gram-negative bacterium and/or by knocking out (i.e. . repression, deletion, removal) of the second wzz gene (for example, wzzB) to produce high molecular weight saccharides, such as lipopolysaccharides containing intermediate or long chains of the O-antigen. For example, modified saccharides can be produced by expressing (not necessarily overexpressing) wzz2 and switching off wzzl. Or, alternatively, modified saccharides can be produced by expressing (not necessarily overexpressing) wzzfepE and switching off wzzB. In another embodiment, modified saccharides can be produced by expressing (not necessarily overexpressing) wzzB but knocking out wzzfepE. In another embodiment, modified saccharides can be produced by expressing fepE. Preferably, the wzz family protein is obtained from a strain heterologous to the host cell.

В некоторых вариантах осуществления сахарид получают путем экспрессии белка семейства wzz, имеющего аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 30%, 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 99% или 100% идентичность последовательности любой из SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39. В одном варианте осуществления, белок семейства wzz включает последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39. Предпочтительно, белок семейства wzz имеет, по меньшей мере, 30%, 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления, сахарид получают путем экспрессии белка, аминокислотная последовательность которого имеет, по меньшей мере, 30%, 50% 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности белка fepE.In some embodiments, the saccharide is produced by expressing a wzz family protein having an amino acid sequence that is at least 30%, 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 99 % or 100% sequence identity to any of SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, and SEQ ID NO: 39. In one embodiment, the wzz family protein includes a sequence selected from any of SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 39. Preferably, the wzz family protein has, at least 30%, 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, or 100% sequence identity to SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34. In some embodiments, the saccharide is produced by expressing a protein whose amino acid sequence is at least 30%, 50% 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, or 100% fepE protein sequence identity.

В одном аспекте, изобретение относится к сахаридам, полученным путем экспрессии белка семейства wzz, предпочтительно fepE, в грамотрицательной бактерии с образованием высокомолекулярных сахаридов, содержащих промежуточные или длинные цепи О-антигена, которые имеют увеличение, по меньшей мере, на 1, 2, 3, 4 или 5 повторяющихся единиц по сравнению с соответствующим О-полисахаридом дикого типа. В одном аспекте, изобретение относится к сахаридам, продуцируемым грамотрицательной бактерией в культуре, которая экспрессирует (не обязательно сверхэкспрессирует) белок семейства wzz (например, wzzB) из грамотрицательной бактерии для получения высокомолекулярных сахаридов, содержащих короткие или промежуточные или длинные цепи О-антигена, которые имеют увеличение, по меньшей мере, на 1, 2, 3, 4 или 5 повторяющихся единиц по сравнению с соответствующим О-антигеном дикого типа. См. описание О-полисахаридов и О-антигенов ниже для дополнительных иллюстративных сахаридов, имеющих увеличенное количество повторяющихся единиц по сравнению с соответствующими сахаридами дикого типа. Желаемой длиной цепи является длина цепи, обеспечивающая улучшенную или максимальную иммуногенность в контексте данной конструкции вакцины.In one aspect, the invention relates to saccharides produced by expressing a wzz family protein, preferably fepE, in a Gram-negative bacterium to produce high molecular weight saccharides containing O-antigen intermediate or long chains that have an increase of at least 1, 2, 3 , 4 or 5 repeat units compared to the corresponding wild-type O-polysaccharide. In one aspect, the invention relates to saccharides produced by a gram-negative bacterium in culture that expresses (not necessarily overexpresses) a wzz family protein (e.g., wzzB) from the gram-negative bacterium to produce high molecular weight saccharides containing short or intermediate or long O-antigen chains that have an increase of at least 1, 2, 3, 4 or 5 repeat units compared to the corresponding wild-type O-antigen. See the description of O-polysaccharides and O-antigens below for additional illustrative saccharides having an increased number of repeat units compared to the corresponding wild-type saccharides. The desired chain length is the chain length that provides improved or maximum immunogenicity in the context of a given vaccine design.

В другом варианте осуществления, сахарид включает любую Формулу, выбранную из Таблицы 1, где количество повторяющихся звеньев n в сахариде больше, чем количество повторяющихся звеньев в соответствующем O-полисахариде дикого типа на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 или более повторяющихся единиц. Предпочтительно, сахарид включает увеличение, по меньшей мере, на 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 повторяющихся единиц по сравнению с соответствующим О-полисахаридом дикого типа. См., например, Таблицу 24. Способы определения длины сахаридов известны в данной области техники. Такие способы включают ядерный магнитный резонанс, масс-спектроскопию и эксклюзионную хроматографию, как описано в примере 13.In another embodiment, the saccharide includes any Formula selected from Table 1, wherein the number of repeat units n in the saccharide is greater than the number of repeat units in the corresponding wild-type O-polysaccharide by 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 or more repeat units. Preferably, the saccharide includes an increase of at least 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 , 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, or 50 repeat units compared to the corresponding wild-type O-polysaccharide. See, for example, Table 24. Methods for determining the length of saccharides are known in the art. Such methods include nuclear magnetic resonance, mass spectroscopy and size exclusion chromatography, as described in Example 13.

В предпочтительном варианте осуществления, изобретение относится к сахариду, продуцируемому в рекомбинантной клетке-хозяине E. coli, где ген эндогенного регулятора длины О-антигена wzz (например, wzzB) удален и заменен (вторым) геном wzz из грамотрицательной бактерии, гетерологичной рекомбинантной клетке-хозяину E. coli (например, Salmonella fepE), с образованием высокомолекулярных сахаридов, таких как липополисахариды, содержащие промежуточные или длинные цепи О-антигена. В некоторых вариантах осуществления, рекомбинантная клетка-хозяин E.coli включает ген wzz из Salmonella, предпочтительно из Salmonella enterica. В других вариантах осуществления, изобретение применимо ко всем штаммам E.coli, экспрессирующим О-антигены, регулируемые wzzB. В одном аспекте, штаммы E. coli серотипа O8 и O9, которые продуцируют О-антигены, состоящие из гомополимерных маннанов, не продуцируются в соответствии с этим вариантом осуществления, поскольку они используют разные механизмы для регуляции длины цепи и транспорта LPS к наружной мембране (J Biol Chem 2009; 284:30662-72; J Biol Chem 2012; 287:35078-91; Proceedings of the National Academy of Sciences 2014; 111:6407-12). В дополнительном варианте осуществления, гомополимерные галактаны полисахариды Klebsiella серотипов О1 и О2 получают в соответствии со способом, изложенным в этом варианте осуществления.In a preferred embodiment, the invention relates to a saccharide produced in a recombinant E. coli host cell wherein the endogenous O-antigen length regulator gene wzz (e.g., wzzB) is deleted and replaced by a (second) wzz gene from a Gram-negative bacterium heterologous to the recombinant cell. host E. coli (for example, Salmonella fepE), with the formation of high molecular weight saccharides, such as lipopolysaccharides containing intermediate or long chains of O-antigen. In some embodiments, the recombinant E. coli host cell includes a wzz gene from Salmonella, preferably from Salmonella enterica. In other embodiments, the invention is applicable to all E. coli strains expressing O-antigens regulated by wzzB. In one aspect, E. coli strains serotype O8 and O9, which produce O-antigens composed of homopolymeric mannans, are not produced according to this embodiment because they use different mechanisms to regulate chain length and transport of LPS to the outer membrane (J Biol Chem 2009; 284:30662-72; J Biol Chem 2012; 287:35078-91; Proceedings of the National Academy of Sciences 2014; In a further embodiment, homopolymeric galactan polysaccharides of Klebsiella serotypes O1 and O2 are prepared in accordance with the method set forth in this embodiment.

В одном варианте осуществления, клетка-хозяин включает гетерологичный ген белка семейства wzz в виде стабильно поддерживаемого плазмидного вектора. В другом варианте осуществления, клетка-хозяин включает гетерологичный ген белка семейства wzz в качестве встроенного гена в хромосомную ДНК клетки-хозяина. Способы стабильной экспрессии плазмидного вектора в клетке-хозяине E.coli и способы интеграции гетерологичного гена в хромосому клетки-хозяина E.coli известны в данной области техники. В одном варианте осуществления, клетка-хозяин включает гетерологичные гены О-антигена в виде стабильно поддерживаемого плазмидного вектора. В другом варианте осуществления, клетка-хозяин включает гетерологичные гены О-антигена в виде встроенного гена в хромосомную ДНК клетки-хозяина. Способы стабильной экспрессии плазмидного вектора в клетке-хозяине E.coli и клетке-хозяине Salmonella известны в данной области техники. Способы интеграции гетерологичного гена в хромосому клетки-хозяина E.coli и клетки-хозяина Salmonella известны в данной области техники.In one embodiment, the host cell includes a heterologous wzz family protein gene in the form of a stably maintained plasmid vector. In another embodiment, the host cell includes a heterologous wzz family protein gene as an integrated gene into the chromosomal DNA of the host cell. Methods for stably expressing a plasmid vector in an E. coli host cell and methods for integrating a heterologous gene into the chromosome of an E. coli host cell are known in the art. In one embodiment, the host cell includes heterologous O-antigen genes in the form of a stably maintained plasmid vector. In another embodiment, the host cell includes heterologous O-antigen genes as an integrated gene into the chromosomal DNA of the host cell. Methods for stably expressing a plasmid vector in an E. coli host cell and a Salmonella host cell are known in the art. Methods for integrating a heterologous gene into the chromosome of an E. coli host cell and a Salmonella host cell are known in the art.

В одном аспекте, рекомбинантную клетку-хозяин культивируют в среде, содержащей источник углерода. Источники углерода для культивирования E.coli известны в данной области техники. Примеры источников углерода включают сахарные спирты, полиолы, альдольные сахара или кетосахара, включая арабинозу, целлобиозу, фруктозу, глюкозу, глицерин, инозит, лактозу, мальтозу, маннит, маннозу, рамнозу, раффинозу, сорбит, сорбозу, сахарозу, трегалозу, пируват, сукцинат и метиламин. В предпочтительном варианте осуществления, среда включает глюкозу. В некоторых вариантах осуществления, среда включает полиол или альдольный сахар, например, маннит, инозит, сорбозу, глицерин, сорбит, лактозу и арабинозу в качестве источника углерода. Все источники углерода могут быть добавлены в среду до начала культивирования, либо их можно добавлять поэтапно или непрерывно во время культивирования.In one aspect, the recombinant host cell is cultured in a medium containing a carbon source. Carbon sources for culturing E. coli are known in the art. Examples of carbon sources include sugar alcohols, polyols, aldol sugars or ketosaccharides, including arabinose, cellobiose, fructose, glucose, glycerol, inositol, lactose, maltose, mannitol, mannose, rhamnose, raffinose, sorbitol, sorbose, sucrose, trehalose, pyruvate, succinate and methylamine. In a preferred embodiment, the medium includes glucose. In some embodiments, the medium includes a polyol or aldol sugar, for example, mannitol, inositol, sorbose, glycerol, sorbitol, lactose and arabinose as a carbon source. All carbon sources can be added to the medium before culture begins, or they can be added in stages or continuously during culture.

Типовая культуральная среда для рекомбинантной клетки-хозяина включает элемент, выбранный из любого из KH₂PO₄, K₂HPO₄, (NH₄)₂SO₄, цитрата натрия, Na₂SO₄, аспарагиновой кислоты, глюкозы, MgSO₄, FeSO₄-7H₂O, Na₂MoO₄-2H₂O, H₃BO₃, CoCl₂-6H₂O, CuCl₂-2H₂O, MnCl₂-4H₂O, ZnCl₂ и CaCl₂-2H₂O. Предпочтительно, среда включает KH₂PO₄, K₂HPO₄, (NH₄)₂SO₄, цитрат натрия, Na₂SO₄, аспарагиновую кислоту, глюкозу, MgSO₄, FeSO₄-7H₂O, Na₂MoO₄-2H₂O, H₃BO₃, CoCl₂-6H₂O, CuCl₂-2H₂O, MnCl₂-4H₂O, ZnCl₂ и CaCl₂-2H₂O.A typical culture medium for a recombinant host cell includes an element selected from any of KH ₂ PO ₄ , K ₂ HPO ₄ , (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , sodium citrate, Na ₂ SO ₄ , aspartic acid, glucose, MgSO ₄ , FeSO ₄ -7H ₂ O, Na ₂ MoO ₄ -2H ₂ O, H ₃ BO ₃ , CoCl ₂ -6H ₂ O, CuCl ₂ -2H ₂ O, MnCl ₂ -4H ₂ O, ZnCl ₂ and CaCl ₂ -2H ₂ O Preferably, the medium includes KH ₂ PO ₄ , K ₂ HPO ₄ , (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , sodium citrate, Na ₂ SO ₄ , aspartic acid, glucose, MgSO ₄ , FeSO ₄ -7H ₂ O, Na ₂ MoO ₄ -2H ₂ O, H ₃ BO ₃ , CoCl ₂ -6H ₂ O, CuCl ₂ -2H ₂ O, MnCl ₂ -4H ₂ O, ZnCl ₂ and CaCl ₂ -2H ₂ O.

Используемая в настоящем документе среда может быть твердой или жидкой, синтетической (т.е. искусственной) или природной, и может включать достаточное количество питательных веществ для культивирования рекомбинантной клетки-хозяина. Предпочтительно, среда представляет собой жидкую среду.The medium used herein may be solid or liquid, synthetic (ie, artificial) or natural, and may contain sufficient nutrients to culture the recombinant host cell. Preferably, the medium is a liquid medium.

В некоторых вариантах осуществления, среда может дополнительно включать подходящие неорганические соли. В некоторых вариантах осуществления, среда может дополнительно включать микроэлементы питательных веществ. В некоторых вариантах осуществления, среда может дополнительно включать факторы роста. В некоторых вариантах осуществления, среда может дополнительно включать дополнительный источник углерода. В некоторых вариантах осуществления, среда может дополнительно включать подходящие неорганические соли, микроэлементы, факторы роста и дополнительный источник углерода. Неорганические соли, следовые питательные вещества, факторы роста и дополнительные источники углерода, подходящие для культивирования E. coli, известны в данной области техники.In some embodiments, the medium may further include suitable inorganic salts. In some embodiments, the medium may further include micronutrients. In some embodiments, the medium may further include growth factors. In some embodiments, the medium may further include an additional carbon source. In some embodiments, the medium may further include suitable inorganic salts, micronutrients, growth factors, and an additional carbon source. Inorganic salts, trace nutrients, growth factors and additional carbon sources suitable for culturing E. coli are known in the art.

В некоторых вариантах осуществления, среда может включать дополнительные компоненты, по мере необходимости, такие как пептон, N-Z амин, ферментативный гидрозилат сои, дополнительный дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, дополнительные источники углерода и различные витамины. В некоторых вариантах осуществления, среда не включает такие дополнительные компоненты, как пептон, N-Z амин, ферментативный гидрозилат сои, дополнительный дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, дополнительные источники углерода и различные витамины.In some embodiments, the medium may include additional components, as needed, such as peptone, N-Z amine, soy enzymatic hydrosylate, additional yeast extract, malt extract, additional carbon sources, and various vitamins. In some embodiments, the medium does not include additional components such as peptone, N-Z amine, soy enzymatic hydrosylate, additional yeast extract, malt extract, additional carbon sources, and various vitamins.

Иллюстративные примеры подходящих дополнительных источников углерода включают, но не ограничены ими, другие углеводы, такие как глюкоза, фруктоза, маннит, крахмал или гидролизат крахмала, гидролизат целлюлозы и меласса; органические кислоты, такие как уксусная кислота, пропионовая кислота, молочная кислота, муравьиная кислота, яблочная кислота, лимонная кислота и фумаровая кислота; и спирты, такие как глицерин, инозит, маннит и сорбит.Illustrative examples of suitable additional carbon sources include, but are not limited to, other carbohydrates such as glucose, fructose, mannitol, starch or starch hydrolysate, cellulose hydrolysate and molasses; organic acids such as acetic acid, propionic acid, lactic acid, formic acid, malic acid, citric acid and fumaric acid; and alcohols such as glycerin, inositol, mannitol and sorbitol.

В некоторых вариантах осуществления, среда дополнительно включает источник азота. Источники азота, подходящие для культивирования E.coli, известны в данной области техники. Иллюстративные примеры подходящих источников азота включают, но не ограничены ими, аммиак, включая газообразный аммиак и водный раствор аммиака; аммониевые соли неорганических или органических кислот, такие как хлорид аммония, нитрат аммония, фосфат аммония, сульфат аммония и ацетат аммония; мочевину; нитратные или нитритные соли и другие азотсодержащие материалы, включая аминокислоты в чистом или неочищенном виде, мясной экстракт, пептон, рыбную муку, рыбный гидролизат, кукурузный экстракт, гидролизат казеина, гидролизат соевого жмыха, дрожжевой экстракт, сухие дрожжи, этанол-дрожжевой дистиллят, соевую муку, хлопковую муку и подобные.In some embodiments, the medium further includes a nitrogen source. Nitrogen sources suitable for culturing E. coli are known in the art. Illustrative examples of suitable nitrogen sources include, but are not limited to, ammonia, including ammonia gas and aqueous ammonia; ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonium chloride, ammonium nitrate, ammonium phosphate, ammonium sulfate and ammonium acetate; urea; nitrate or nitrite salts and other nitrogen-containing materials including pure or crude amino acids, meat extract, peptone, fish meal, fish hydrolysate, corn extract, casein hydrolysate, soybean meal hydrolysate, yeast extract, dry yeast, ethanol-yeast distillate, soybean flour, cottonseed meal and the like.

В некоторых вариантах осуществления, среда включает неорганическую соль. Иллюстративные примеры подходящих неорганических солей включают, но не ограничены ими, соли калия, кальция, натрия, магния, марганца, железа, кобальта, цинка, меди, молибдена, вольфрама и других микроэлементов, и фосфорную кислоту.In some embodiments, the medium includes an inorganic salt. Illustrative examples of suitable inorganic salts include, but are not limited to, salts of potassium, calcium, sodium, magnesium, manganese, iron, cobalt, zinc, copper, molybdenum, tungsten and other trace elements, and phosphoric acid.

В некоторых вариантах осуществления, среда включает соответствующие факторы роста. Иллюстративные примеры подходящих микроэлементов, факторов роста и подобных включают, но не ограничены ими, коэнзим А, пантотеновую кислоту, пиридоксин-HCl, биотин, тиамин, рибофлавин, флавин мононуклеотид, флавин адениндинуклеотид, DL-6,8-тиоктовую кислоту, фолиевую кислоту, витамин B₁₂, другие витамины, аминокислоты, такие как цистеин и гидроксипролин, основания, такие как аденин, урацил, гуанин, тимин и цитозин, тиосульфат натрия, п- или р-аминобензойную кислоту, ниацинамид, нитрилоацетат и другие например, в виде чистых или частично очищенных химических соединений или в виде природных материалов. Количества могут быть определены эмпирически специалистом в данной области техники в соответствии со способами и методиками, известными в данной области техники.In some embodiments, the medium includes appropriate growth factors. Illustrative examples of suitable micronutrients, growth factors and the like include, but are not limited to, coenzyme A, pantothenic acid, pyridoxine-HCl, biotin, thiamine, riboflavin, flavin mononucleotide, flavin adenine dinucleotide, DL-6,8-thioctic acid, folic acid, vitamin B ₁₂ , other vitamins, amino acids such as cysteine and hydroxyproline, bases such as adenine, uracil, guanine, thymine and cytosine, sodium thiosulfate, p- or p-aminobenzoic acid, niacinamide, nitriloacetate and others, for example, in the form of pure or partially purified chemical compounds or in the form of natural materials. Amounts can be determined empirically by one skilled in the art in accordance with methods and techniques known in the art.

В другом варианте осуществления, описанный в настоящем документе модифицированный сахарид (по сравнению с соответствующим сахаридом дикого типа) получают синтетическим путем, например, in vitro. Синтетическое продуцирование или синтез сахаридов может способствовать отказу от дорогостоящих и длительных процессов продуцирования. В одном варианте осуществления, сахарид синтезируется синтетическим путем, например, с использованием стратегии последовательного гликозилирования или комбинации последовательного гликозилирования и стратегии [3+2] блока синтеза из подходящим образом защищенных моносахаридных промежуточных соединений. Например, тиогликозиды и производные гликозилтрихлорацетимидата могут быть использованы в качестве доноров гликозила при гликозилировании. В одном варианте осуществления, сахарид, который синтетически синтезирован in vitro, имеет структуру, идентичную сахариду, полученному рекомбинантными способами, такими как манипулирование белком семейства wzz, описанным выше.In another embodiment, the modified saccharide described herein (as compared to the corresponding wild-type saccharide) is produced synthetically, for example, in vitro. Synthetic production or synthesis of saccharides can help eliminate expensive and time-consuming production processes. In one embodiment, the saccharide is synthesized synthetically, for example, using a sequential glycosylation strategy or a combination of sequential glycosylation and a [3+2] block synthesis strategy from suitably protected monosaccharide intermediates. For example, thioglycosides and glycosyltrichloroacetimidate derivatives can be used as glycosyl donors in glycosylation. In one embodiment, the saccharide that is synthetically synthesized in vitro has an identical structure to the saccharide produced by recombinant methods, such as wzz family protein manipulation described above.

Сахарид, полученный (с помощью рекомбинантных или синтетических средств), имеет структуру, полученную из любого серотипа E. coli, включая, например, любой из следующих серотипов E. coli: O1 (например, O1A, O1B и O1C), O2, O3, O4 (например, O4:K52 и O4:K6), O5 (например, O5ab и O5ac (штамм 180/C3)), O6 (например, O6:K2; K13; K15 и O6:K54), O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18 (например, O18A, O18ac, O18A1, O18B и O18B1), O19, O20, O21, O22, O23 (например, O23A), O24, O25 (например, O25a и O25b), O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41, O42, O43, O44, O45 (например, O45 и O45rel), O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, 62D₁, O63, O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73 (например, O73 (штамм 73-1)), O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86, O87, O88, O89, O90, O91, O92, O93, O95, O96, O97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106, O107, O108, O109, O110, 0111, O112, O113, O114, O115, O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, O142, O143, O144, O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158, O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, O167, O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, O185, O186 и O187.The saccharide produced (by recombinant or synthetic means) has a structure derived from any serotype of E. coli, including, for example, any of the following serotypes of E. coli : O1 (for example, O1A, O1B and O1C), O2, O3, O4 (e.g. O4:K52 and O4:K6), O5 (e.g. O5ab and O5ac (strain 180/C3)), O6 (e.g. O6:K2; K13; K15 and O6:K54), O7, O8, O9 , O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18 (eg O18A, O18ac, O18A1, O18B and O18B1), O19, O20, O21, O22, O23 (eg O23A), O24, O25 (eg O25a and O25b), O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41, O42, O43, O44, O45 (eg O45 and O45rel), O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, 62D ₁ , O63, O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73 (e.g. O73 (strain 73-1)), O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86, O87, O88, O89, O90 , O91, O92, O93, O95, O96, O97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106, O107, O108, O109, O110, 0111, O112, O113, O114, O115, O116 , O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, 142 , O143, O144, O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158, O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, 167 , O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, O185, O186 and O187.

Индивидуальные полисахариды обычно очищают (обогащают по отношению к количеству конъюгата полисахарид-белок) способами, известными в данной области техники, такими как, например, диализ, операции концентрирования, операции диафильтрации, фильтрация в тангенциальном потоке, осаждение, элюирование, центрифугирование, преципитация, ультрафильтрация, глубинная фильтрация и/или колоночная хроматография (ионообменная хроматография, мультимодальная ионообменная хроматография, ДЭАЭ и хроматография гидрофобного взаимодействия). Полисахариды предпочтительно очищают способом, который включает фильтрацию с тангенциальным потоком.Individual polysaccharides are typically purified (enriched relative to the amount of polysaccharide-protein conjugate) by methods known in the art, such as, for example, dialysis, concentration steps, diafiltration steps, tangential flow filtration, sedimentation, elution, centrifugation, precipitation, ultrafiltration , depth filtration and/or column chromatography (ion exchange chromatography, multimodal ion exchange chromatography, DEAE and hydrophobic interaction chromatography). The polysaccharides are preferably purified by a method that includes tangential flow filtration.

Очищенные полисахариды могут быть активированы (например, химически активированы), чтобы сделать их способными реагировать (например, либо непосредственно с белком-носителем, либо через линкер, такой как спейсер eTEC), и затем включаться в гликоконъюгаты по изобретению, как дополнительно описано в настоящем документе.Purified polysaccharides can be activated (e.g., chemically activated) to render them capable of reacting (e.g., either directly with a carrier protein or through a linker such as an eTEC spacer) and then incorporated into the glycoconjugates of the invention, as further described herein document.

В одном предпочтительном варианте осуществления, сахарид по изобретению получают из серотипа E. coli, где серотип представляет собой O25a. В другом предпочтительном варианте осуществления, серотип представляет собой O25b. В другом предпочтительном варианте осуществления, серотип представляет собой O1A. В другом предпочтительном варианте осуществления, серотип представляет собой О2. В другом предпочтительном варианте осуществления, серотип представляет собой О6. В другом предпочтительном варианте осуществления, серотип представляет собой O17. В другом предпочтительном варианте осуществления, серотип представляет собой O15. В другом предпочтительном варианте осуществления, серотип представляет собой O18A. В другом предпочтительном варианте осуществления, серотип представляет собой O75. В другом предпочтительном варианте осуществления, серотип представляет собой О4. В другом предпочтительном варианте осуществления, серотип представляет собой O16. В другом предпочтительном варианте осуществления, серотип представляет собой O13. В другом предпочтительном варианте осуществления, серотип представляет собой О7. В другом предпочтительном варианте осуществления, серотип представляет собой О8. В другом предпочтительном варианте осуществления, серотип представляет собой О9.In one preferred embodiment, the saccharide of the invention is obtained from a serotype of E. coli, where the serotype is O25a. In another preferred embodiment, the serotype is O25b. In another preferred embodiment, the serotype is O1A. In another preferred embodiment, the serotype is O2. In another preferred embodiment, the serotype is O6. In another preferred embodiment, the serotype is O17. In another preferred embodiment, the serotype is O15. In another preferred embodiment, the serotype is O18A. In another preferred embodiment, the serotype is O75. In another preferred embodiment, the serotype is O4. In another preferred embodiment, the serotype is O16. In another preferred embodiment, the serotype is O13. In another preferred embodiment, the serotype is O7. In another preferred embodiment, the serotype is O8. In another preferred embodiment, the serotype is O9.

Используемая в настоящем документе ссылка на любой из перечисленных выше серотипов относится к серотипу, который включает в себя структуру повторяющихся единиц (О-единица, как описано ниже), известную в данной области техники, и является уникальной для соответствующего серотипа. Например, термин серотип «O25a» (также известный в данной области техники как серотип «O25») относится к серотипу, который охватывает Формулу O25, показанную в таблице 1. В качестве другого примера, термин серотип «O25b» относится к серотипу, который охватывает Формулу O25b, показанную в таблице 1.As used herein, reference to any of the above serotypes refers to a serotype that includes a repeat unit structure (O-unit as described below) known in the art and is unique to the corresponding serotype. For example, the term serotype "O25a" (also known in the art as serotype "O25") refers to the serotype that covers Formula O25 shown in Table 1. As another example, the term serotype "O25b" refers to the serotype that covers Formula O25b shown in Table 1.

Используемые в настоящем документе серотипы упоминаются в настоящем документе в общем, если не указано иное, так что, например, термин «формула «O18» в общем относится к Формуле O18A, Формуле O18ac, Формуле 18A1, Формуле O18B и Формуле O18B1.As used herein, serotypes are referred to herein generally unless otherwise noted, so that, for example, the term “Formula O18” generally refers to Formula O18A, Formula O18ac, Formula 18A1, Formula O18B, and Formula O18B1.

Используемый в настоящем документе термин «O1» в общем относится к видам формулы, которые включают общий термин «O1» в названии формулы в соответствии с таблицей 1, такой как любая из Формулы O1A, Формулы O1A1, Формулы O1B и Формулы O1C, каждая из которых показана в таблице 1. Соответственно, «серотип O1» в общем относится к серотипу, который охватывает любую из Формулы O1A, Формулы O1A1, Формулы O1B и Формулы O1C.As used herein, the term "O1" generally refers to types of claims that include the general term "O1" in the title of the claim in accordance with Table 1, such as any of Formula O1A, Formula O1A1, Formula O1B and Formula O1C, each of which is shown in Table 1. Accordingly, “serotype O1” generally refers to a serotype that includes any of Formula O1A, Formula O1A1, Formula O1B and Formula O1C.

Используемый в настоящем документе термин «О6» в общем относится к разновидностям Формулы, которые включают общий термин «О6» в названии Формулы в соответствии с таблице 1, такой как любая из Формулы О6:К2; К13; К15; и O6:K54, каждая из которых показана в таблице 1. Соответственно, «серотип O6» в общем относится к серотипу, который охватывает любую из формул O6:K2; К13; К15; и О6:К54.As used herein, the term "O6" generally refers to variations of a Formula that include the general term "O6" in the title of the Formula in accordance with Table 1, such as any of Formula O6:K2; K13; K15; and O6:K54, each of which is shown in Table 1. Accordingly, “serotype O6” generally refers to a serotype that covers any of the formulas O6:K2; K13; K15; and O6:K54.

Другие примеры терминов, которые в общем относятся к разновидностям Формулы, которые включают общий термин в название Формулы в соответствии с таблицей 1, включают: «O4», «O5», «O18» и «O45».Other examples of terms that generally refer to variations of a Formula that include the generic term in the Formula title as defined in Table 1 include: "O4", "O5", "O18" and "O45".

Используемый в настоящем документе термин «О2» относится к формуле О2, показанной в таблице 1. Термин «О-антиген О2» относится к сахариду, который охватывает формулу О2, показанную в таблице 1.As used herein, the term “O2” refers to the formula O2 shown in Table 1. The term “O-antigen O2” refers to a saccharide that covers the formula O2 shown in Table 1.

Используемая в настоящем документе ссылка на О-антиген серотипа, перечисленного выше, относится к сахариду, который охватывает формулу, помеченную соответствующим названием серотипа. Например, термин «О-антиген O25B» относится к сахариду, который охватывает Формулу O25B, показанную в таблице 1.As used herein, reference to the O-antigen of a serotype listed above refers to the saccharide that covers the formula labeled with the appropriate serotype name. For example, the term "O-antigen O25B" refers to a saccharide that covers Formula O25B shown in Table 1.

В качестве другого примера, термин «О1-О-антиген» в общем относится к сахариду, который охватывает Формулу, включающую термин «О1», такую как Формула О1А, Формула О1А1, Формула О1В и Формула О1С, каждая из которых показана в таблице 1.As another example, the term "O1-O antigen" generally refers to a saccharide that covers a Formula including the term "O1", such as Formula O1A, Formula O1A1, Formula O1B and Formula O1C, each of which is shown in Table 1 .

В качестве другого примера, термин «О6-О-антиген» в общем относится к сахариду, который охватывает Формулу, включающую термин «О6», такую как Формула О6:К2; Формула O6:K13; Формула O6:K15 и Формула O6:K54, каждая из которых показана в таблице 1.As another example, the term "O6-O-antigen" generally refers to a saccharide that covers a Formula including the term "O6", such as Formula O6:K2; Formula O6:K13; Formula O6:K15 and Formula O6:K54, each shown in Table 1.

В. O-полисахаридB. O-polysaccharide

Используемый в настоящем документе термин «О-полисахарид» относится к любой структуре, которая включает О-антиген, при условии, что структура не включает целую клетку или липид А. Например, в одном варианте осуществления, О-полисахарид включает липополисахарид где липид А не связан. Стадия удаления липида А известна в данной области техники и включает, например, термическую обработку с добавлением кислоты. Пример процесса включает обработку 1% уксусной кислотой при 100°С в течение 90 минут. Этот процесс сочетается с процессом выделения липида А как удаленного. Типовой способ выделения липида А включает ультрацентрифугирование.As used herein, the term "O-polysaccharide" refers to any structure that includes an O-antigen, provided that the structure does not include a whole cell or lipid A. For example, in one embodiment, the O-polysaccharide includes a lipopolysaccharide where lipid A is not connected. The lipid A removal step is known in the art and includes, for example, heat treatment with the addition of an acid. An example process involves treatment with 1% acetic acid at 100°C for 90 minutes. This process is combined with the process of separating lipid A as removed. A typical method for isolating lipid A involves ultracentrifugation.

В одном варианте осуществления, О-полисахарид относится к структуре, состоящей из О-антигена, и в этом случае О-полисахарид является синонимом термина О-антиген. В одном предпочтительном варианте осуществления, О-полисахарид относится к структуре, которая включает повторяющиеся звенья О-антигена без корового сахарида. Соответственно, в одном варианте осуществления, О-полисахарид не включает коровую группу E. coli R1. В другом варианте осуществления, О-полисахарид не включает коровую группу E. coli R2. В другом варианте осуществления, О-полисахарид не включает коровую группу E. coli R3. В другом варианте осуществления, О-полисахарид не включает коровую группу E. coli R4. В другом варианте осуществления, O-полисахарид не включает коровую группу E. coli K12. В другом предпочтительном варианте осуществления, О-полисахарид относится к структуре, которая включает О-антиген и коровый сахарид. В другом варианте осуществления, О-полисахарид относится к структуре, которая включает О-антиген, коровый сахарид и фрагмент KDO.In one embodiment, O-polysaccharide refers to a structure consisting of O-antigen, in which case O-polysaccharide is synonymous with the term O-antigen. In one preferred embodiment, O-polysaccharide refers to a structure that includes O-antigen repeat units without the core saccharide. Accordingly, in one embodiment, the O-polysaccharide does not include the E. coli R1 core group . In another embodiment, the O-polysaccharide does not include the E. coli R2 core group . In another embodiment, the O-polysaccharide does not include the E. coli R3 core group . In another embodiment, the O-polysaccharide does not include the E. coli R4 core group . In another embodiment, the O-polysaccharide does not include the E. coli K12 core group. In another preferred embodiment, O-polysaccharide refers to a structure that includes O-antigen and a core saccharide. In another embodiment, O-polysaccharide refers to a structure that includes an O-antigen, a core saccharide, and a KDO moiety.

Способы очистки О-полисахарида, который включает коровый олигосахарид, от LPS известны в данной области техники. Например, после очистки LPS, очищенный LPS можно гидролизовать путем нагревания в 1% (об./об.) уксусной кислоте в течение 90 минут при 100 градусах Цельсия с последующим ультрацентрифугированием при 142000 х g в течение 5 часов при 4 градусах Цельсия. Супернатант, содержащий О-полисахарид, сушат вымораживанием и хранят при 4 градусах Цельсия. В некоторых вариантах осуществления, описана делеция генов синтеза капсулы для обеспечения простой очистки О-полисахарида.Methods for purifying O-polysaccharide, which includes the core oligosaccharide, from LPS are known in the art. For example, after purification of LPS, purified LPS can be hydrolyzed by heating in 1% (v/v) acetic acid for 90 minutes at 100 degrees Celsius followed by ultracentrifugation at 142,000 x g for 5 hours at 4 degrees Celsius. The supernatant containing O-polysaccharide is freeze-dried and stored at 4 degrees Celsius. In some embodiments, deletion of capsule synthesis genes is described to allow simple purification of the O-polysaccharide.

О-полисахарид может быть выделен способами, включая, но не ограничиваясь ими, мягкий кислотный гидролиз для удаления липида А из LPS. Другие варианты осуществления могут включать использование гидразина в качестве агента для получения О-полисахарида. Получение LPS можно осуществить известными в данной области техники способами.The O-polysaccharide can be isolated by methods including, but not limited to, mild acid hydrolysis to remove lipid A from LPS. Other embodiments may include the use of hydrazine as an O-polysaccharide producing agent. The preparation of LPS can be accomplished by methods known in the art.

В некоторых вариантах осуществления О-полисахариды, очищенные от штаммов грамотрицательных бактерий дикого типа, модифицированных или аттенуированных, которые экспрессируют (не обязательно сверхэкспрессируют) белок Wzz (например, wzzB), предназначены для использования в конъюгированных вакцинах. В предпочтительных вариантах осуществления, О-полисахаридная цепь очищается из штамма грамотрицательных бактерий, экспрессирующих (не обязательно сверхэкспрессирующих) белок wzz, для использования в качестве вакцинного антигена либо в виде конъюгата, либо в виде комплексной вакцины.In some embodiments, O-polysaccharides purified from wild-type, modified or attenuated strains of gram-negative bacteria that express (not necessarily overexpress) the Wzz protein (eg, wzzB) are intended for use in conjugate vaccines. In preferred embodiments, the O-polysaccharide chain is purified from a strain of gram-negative bacteria expressing (not necessarily overexpressing) the wzz protein for use as a vaccine antigen, either as a conjugate or as a complex vaccine.

В одном варианте осуществления, О-полисахарид имеет молекулярную массу, которая увеличивается примерно в 1-кратно, 2-кратно, 3-кратно, 4-кратно, 5-кратно, 6-кратно, 7-кратно, 8-кратно, 9-кратно, 10-кратно, 11-кратно, 12-кратно, 13-кратно, 14-кратно, 15-кратно, 16-кратно, 17-кратно, 18-кратно, 19-кратно, 20-кратно, 21-кратно, 22-кратно, 23-кратно, 24-кратно, 25-кратно, 26-кратно, 27-кратно, 28-кратно, 29-кратно, 30-кратно, 31-кратно, 32-кратно, 33-кратно, 34-кратно, 35-кратно, 36-кратно, 37-кратно, 38-кратно, 39-кратно, 40-кратно, 41-кратно, 42-кратно, 43-кратно, 44-кратно, 45-кратно, 46-кратно, 47-кратно, 48-кратно, 49-кратно, 50-кратно, 51-кратно, 52-кратно, 53-кратно, 54-кратно, 55-кратно, 56-кратно, 57-кратно, 58-кратно, 59-кратно, 60-кратно, 61-кратно, 62-кратно, 63-кратно, 64-кратно, 65-кратно, 66-кратно, 67-кратно, 68-кратно, 69-кратно, 70-кратно, 71-кратно, 72-кратно, 73-кратно, 74-кратно, 75-кратно, 76-кратно, 77-кратно, 78-кратно, 79-кратно, 80-кратно, 81-кратно, 82-кратно, 83-кратно, 84-кратно, 85-кратно, 86-кратно, 87-кратно, 88-кратно, 89-кратно, 90-кратно, 91-кратно, 92-кратно, 93-кратно, 94-кратно, 95-кратно, 96-кратно, 97-кратно, 98-кратно, 99-кратно, 100-кратно или более по сравнению с соответствующим O-полисахаридом дикого типа. В предпочтительном варианте осуществления, О-полисахарид имеет молекулярную массу, увеличенную по меньшей мере, 1-кратно и не более чем 5-кратно по сравнению с соответствующим О-полисахаридом дикого типа. В другом варианте осуществления, О-полисахарид имеет молекулярную массу, увеличенную по меньшей мере, 2-кратно и не более чем 4-кратно по сравнению с соответствующим О-полисахаридом дикого типа. Увеличение молекулярной массы О-полисахарида по сравнению с соответствующим О-полисахаридом дикого типа предпочтительно связано с увеличением количества повторяющихся единиц О-антигена. В одном варианте осуществления, увеличение молекулярной массы О-полисахарида обусловлено белком семейства wzz.In one embodiment, the O-polysaccharide has a molecular weight that is increased by about 1-fold, 2-fold, 3-fold, 4-fold, 5-fold, 6-fold, 7-fold, 8-fold, 9-fold multiple, 10 times, 11 times, 12 times, 13 times, 14 times, 15 times, 16 times, 17 times, 18 times, 19 times, 20 times, 21 times, 22-fold, 23-fold, 24-fold, 25-fold, 26-fold, 27-fold, 28-fold, 29-fold, 30-fold, 31-fold, 32-fold, 33-fold, 34-fold multiple, 35 times, 36 times, 37 times, 38 times, 39 times, 40 times, 41 times, 42 times, 43 times, 44 times, 45 times, 46 times, 47 times, 48 times, 49 times, 50 times, 51 times, 52 times, 53 times, 54 times, 55 times, 56 times, 57 times, 58 times, 59- multiple, 60 times, 61 times, 62 times, 63 times, 64 times, 65 times, 66 times, 67 times, 68 times, 69 times, 70 times, 71 times, 72-fold, 73-fold, 74-fold, 75-fold, 76-fold, 77-fold, 78-fold, 79-fold, 80-fold, 81-fold, 82-fold, 83-fold, 84-fold multiple, 85 times, 86 times, 87 times, 88 times, 89 times, 90 times, 91 times, 92 times, 93 times, 94 times, 95 times, 96 times, 97-fold, 98-fold, 99-fold, 100-fold or more compared to the corresponding wild-type O-polysaccharide. In a preferred embodiment, the O-polysaccharide has a molecular weight increased by at least 1-fold and no more than 5-fold compared to the corresponding wild-type O-polysaccharide. In another embodiment, the O-polysaccharide has a molecular weight increased by at least 2-fold and no more than 4-fold compared to the corresponding wild-type O-polysaccharide. The increase in molecular weight of the O-polysaccharide relative to the corresponding wild-type O-polysaccharide is preferentially due to an increase in the number of O-antigen repeat units. In one embodiment, the increase in molecular weight of the O-polysaccharide is due to a wzz family protein.

В одном варианте осуществления, O-полисахарид имеет молекулярную массу, которая увеличена примерно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 кДа или более по сравнению с соответствующим О-полисахаридом дикого типа. В одном варианте осуществления, О-полисахарид по изобретению имеет молекулярную массу, увеличенную, по меньшей мере, на 1 и не более чем на 200 кДа по сравнению с соответствующим О-полисахаридом дикого типа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 5 и не более чем на 200 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 10 и не более чем на 200 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 12 и не более чем на 200 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 15 и не более чем на 200 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 18 и не более чем на 200 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 20 и не более чем на 200 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 21 и не более чем на 200 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 22 и не более чем на 200 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 30 и не более чем на 200 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 1 и не более чем на 100 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 5 и не более чем на 100 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 10 и не более чем на 100 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 12 и не более чем на 100 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 15 и не более чем на 100 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 20 и не более чем на 100 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 1 и не более чем на 75 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 5 и не более чем на 75 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 10 и не более чем на 75 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 12 и не более чем на 75 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 15 и не более чем на 75 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 18 и не более чем на 75 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 20 и не более чем на 75 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 30 и не более чем на 75 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 10 и не более чем на 90 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 12 и не более чем на 85 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 10 и не более чем на 75 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 10 и не более чем на 70 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 10 и не более чем на 60 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 10 и не более чем на 50 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 10 и не более чем на 49 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 10 и не более чем на 48 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 10 и не более чем на 47 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 10 и не более чем на 46 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 20 и не более чем на 45 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 20 и не более чем на 44 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 20 и не более чем на 43 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 20 и не более чем на 42 кДа. В одном варианте осуществления, молекулярная масса увеличивается, по меньшей мере, на 20 и не более чем на 41 кДа. Такое увеличение молекулярной массы О-полисахарида по сравнению с соответствующим О-полисахаридом дикого типа предпочтительно связано с увеличением количества повторяющихся единиц О-антигена. В одном варианте осуществления, увеличение молекулярной массы О-полисахарида обусловлено белком семейства wzz. См., например, Таблицу 21.In one embodiment, the O-polysaccharide has a molecular weight that is increased by about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 kDa or more compared to the corresponding wild-type O-polysaccharide. In one embodiment, the O-polysaccharide of the invention has a molecular weight increased by at least 1 and no more than 200 kDa compared to the corresponding wild-type O-polysaccharide. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 5 and no more than 200 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 10 and no more than 200 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 12 and no more than 200 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 15 and no more than 200 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 18 and no more than 200 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 20 and no more than 200 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 21 and no more than 200 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 22 and no more than 200 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 30 and no more than 200 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 1 and no more than 100 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 5 and no more than 100 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 10 and no more than 100 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 12 and no more than 100 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 15 and no more than 100 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 20 and no more than 100 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 1 and no more than 75 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 5 and no more than 75 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 10 and no more than 75 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 12 and no more than 75 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 15 and no more than 75 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 18 and no more than 75 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 20 and no more than 75 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 30 and no more than 75 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 10 and no more than 90 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 12 and no more than 85 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 10 and no more than 75 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 10 and no more than 70 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 10 and no more than 60 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 10 and no more than 50 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 10 and no more than 49 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 10 and no more than 48 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 10 and no more than 47 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 10 and no more than 46 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 20 and no more than 45 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 20 and no more than 44 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 20 and no more than 43 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 20 and no more than 42 kDa. In one embodiment, the molecular weight is increased by at least 20 and no more than 41 kDa. This increase in molecular weight of the O-polysaccharide relative to the corresponding wild-type O-polysaccharide is preferentially due to an increase in the number of O-antigen repeat units. In one embodiment, the increase in molecular weight of the O-polysaccharide is due to a wzz family protein. See, for example, Table 21.

В другом варианте осуществления, О-полисахарид включает любую Формулу, выбранную из Таблицы 1, где количество повторяющихся звеньев n в О-полисахариде больше, чем количество повторяющихся звеньев в соответствующем О-полисахариде дикого типа на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 или более повторяющихся единиц. Предпочтительно, сахарид включает увеличение, по меньшей мере, на 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 повторяющихся единиц по сравнению с соответствующим О-полисахаридом дикого типа. См., например, Таблицу 21.In another embodiment, the O-polysaccharide includes any Formula selected from Table 1 wherein the number of repeat units n in the O-polysaccharide is greater than the number of repeat units in the corresponding wild-type O-polysaccharide by 1, 2, 3, 4, 5. 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 or more repeat units. Preferably, the saccharide includes an increase of at least 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 , 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, or 50 repeat units compared to the corresponding wild-type O-polysaccharide. See, for example, Table 21.

С. О-антигенC. O-antigen

О-антиген входит в состав липополисахарида (LPS) внешней мембраны грамотрицательных бактерий. О-антиген находится на поверхности клетки и является вариабельным компонентом клетки. Вариабельность О-антигена служит основой для серотипирования грамотрицательных бактерий. Текущая схема серотипирования E. coli включает О-полисахариды с 1 по 181.O-antigen is part of the lipopolysaccharide (LPS) of the outer membrane of Gram-negative bacteria. O-antigen is located on the cell surface and is a variable component of the cell. O-antigen variability serves as the basis for serotyping Gram-negative bacteria. The current E. coli serotyping scheme includes O-polysaccharides 1 to 181.

О-антиген включает олигосахаридные повторяющиеся единицы (О-единицы), структура дикого типа которых обычно содержит от двух до восьми остатков из широкого спектра сахаров. О-единицы типовых О-антигенов E. coli показаны в таблице 1, см. также ФИГ. 9А-9С и ФИГ. 10А-10В.O-antigen comprises oligosaccharide repeat units (O-units), the wild-type structure of which typically contains two to eight residues from a wide range of sugars. O-units of typical E. coli O-antigens are shown in Table 1, see also FIG. 9A-9C and FIG. 10A-10B.

В одном варианте осуществления, сахарид по изобретению может представлять собой одну олигосахаридную единицу. В одном варианте осуществления, сахарид по изобретению представляет собой одну повторяющуюся олигосахаридную единицу соответствующего серотипа. В таких вариантах осуществления, сахарид может включать структуру, выбранную из Формулы O8, Формулы O9a, Формулы O9, Формулы O20ab, Формулы O20ac, Формулы O52, Формулы O97 и Формулы O101.In one embodiment, the saccharide of the invention may be a single oligosaccharide unit. In one embodiment, the saccharide of the invention is a single repeating oligosaccharide unit of the appropriate serotype. In such embodiments, the saccharide may include a structure selected from Formula O8, Formula O9a, Formula O9, Formula O20ab, Formula O20ac, Formula O52, Formula O97, and Formula O101.

В одном варианте осуществления, сахарид по изобретению может представлять собой олигосахариды. Олигосахариды имеют небольшое количество повторяющихся единиц (обычно, 5-15 повторяющихся единиц) и обычно получают синтетическим путем или путем гидролиза полисахаридов. В таких вариантах осуществления сахарид может включать структуру, выбранную из Формулы O8, Формулы O9a, Формулы O9, Формулы O20ab, Формулы O20ac, Формулы O52, Формулы O97 и Формулы O101.In one embodiment, the saccharide of the invention may be an oligosaccharide. Oligosaccharides have a small number of repeating units (usually 5-15 repeating units) and are usually produced synthetically or by hydrolysis of polysaccharides. In such embodiments, the saccharide may include a structure selected from Formula O8, Formula O9a, Formula O9, Formula O20ab, Formula O20ac, Formula O52, Formula O97, and Formula O101.

Предпочтительно, чтобы все сахариды по настоящему изобретению и в иммуногенных композициях по настоящему изобретению были полисахаридами. Высокомолекулярные полисахариды могут индуцировать определенные иммунные ответы антител из-за эпитопов, присутствующих на антигенной поверхности. Выделение и очистка высокомолекулярных полисахаридов предпочтительно рассматриваются для использования в конъюгатах, композициях и способах по настоящему изобретению.It is preferred that all saccharides of the present invention and in the immunogenic compositions of the present invention are polysaccharides. High molecular weight polysaccharides can induce certain antibody immune responses due to epitopes present on the antigenic surface. Isolation and purification of high molecular weight polysaccharides are preferably contemplated for use in the conjugates, compositions and methods of the present invention.

В некоторых вариантах осуществления, количество повторяющихся единиц O в каждом отдельном полимере O-антигена (и, следовательно, длина и молекулярная масса полимерной цепи) зависит от регулятора длины цепи wzz, белка внутренней мембраны. Разные белки wzz придают разные диапазоны модальной длины (от 4 до >100 повторяющихся единиц). Термин «модальная длина» относится к количеству повторяющихся O-единиц. Грамотрицательные бактерии часто имеют два разных белка Wzz, которые обеспечивают две различные длины модальных цепей OAg: одну длиннее, и другую короче. Экспрессия (не обязательно сверхэкспрессия) белков семейства wzz (например, wzzB) в грамотрицательных бактериях может позволить манипулировать длиной О-антигена, сдвигать или смещать бактериальное продуцирование О-антигенов определенных диапазонов длины и для увеличения продуцирования высокопродуктивных липополисахаридов с большой молекулярной массой. В одном варианте осуществления, «короткая» модальная длина, используемая в настоящем документе, относится к небольшому количеству повторяющихся O-единиц, например, 1-20. В одном варианте осуществления, «длинная» модальная длина, используемая в настоящем документе, относится к количеству повторяющихся O-единиц, превышающему 20 и максимальному количеству 40. В одном варианте осуществления, «очень длинная» модальная длина, используемая в настоящем документе, относится к более чем 40 повторяющихся О-единиц.In some embodiments, the number of O repeat units in each individual O-antigen polymer (and therefore the length and molecular weight of the polymer chain) depends on the chain length regulator wzz, an inner membrane protein. Different wzz proteins confer different ranges of modal length (from 4 to >100 repeat units). The term "modal length" refers to the number of repeating O-units. Gram-negative bacteria often have two different Wzz proteins that provide two different lengths of OAg modal chains: one longer and one shorter. Expression (not necessarily overexpression) of wzz family proteins (eg, wzzB) in Gram-negative bacteria may allow manipulation of O-antigen length, shifting or shifting bacterial production of O-antigens to certain length ranges and to increase the production of high-yield, high-molecular-weight lipopolysaccharides. In one embodiment, a "short" modal length as used herein refers to a small number of repeating O-units, for example, 1-20. In one embodiment, "long" modal length, as used herein, refers to a number of repeating O-units greater than 20 and a maximum of 40. In one embodiment, "very long" modal length, as used herein, refers to more than 40 repeating O-units.

В одном варианте осуществления, полученный сахарид имеет увеличение, по меньшей мере, на 10 повторяющихся единиц, 15 повторяющихся единиц, 20 повторяющихся единиц, 25 повторяющихся единиц, 30 повторяющихся единиц, 35 повторяющихся единиц, 40 повторяющихся единиц, 45 повторяющихся единиц, 50 повторяющихся единиц, 55 повторяющиеся единицы, 60 повторяющихся единиц, 65 повторяющихся единиц, 70 повторяющихся единиц, 75 повторяющихся единиц, 80 повторяющихся единиц, 85 повторяющихся единиц, 90 повторяющихся единиц, 95 повторяющихся единиц или 100 повторяющихся единиц по сравнению с соответствующим O-полисахаридом дикого типа.In one embodiment, the resulting saccharide has an increase of at least 10 repeat units, 15 repeat units, 20 repeat units, 25 repeat units, 30 repeat units, 35 repeat units, 40 repeat units, 45 repeat units, 50 repeat units , 55 repeat units, 60 repeat units, 65 repeat units, 70 repeat units, 75 repeat units, 80 repeat units, 85 repeat units, 90 repeat units, 95 repeat units, or 100 repeat units compared to the corresponding wild-type O-polysaccharide.

В другом варианте осуществления, сахарид по изобретению имеет увеличение на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 или более повторяющихся единиц по сравнению с соответствующим О-полисахаридом дикого типа. Предпочтительно, сахарид включает увеличение, по меньшей мере, на 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 повторяющихся единиц по сравнению с соответствующим О-полисахаридом дикого типа. См., например, Таблицу 21. Способы определения длины сахаридов известны в данной области техники. Такие способы включают ядерный магнитный резонанс, масс-спектроскопию и эксклюзионную хроматографию, как описано в примере 13.In another embodiment, the saccharide of the invention has an increase of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 , 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 , 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 , 96, 97, 98, 99, 100 or more repeat units compared to the corresponding wild-type O-polysaccharide. Preferably, the saccharide includes an increase of at least 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 , 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, or 50 repeat units compared to the corresponding wild-type O-polysaccharide. See, for example, Table 21. Methods for determining the length of saccharides are known in the art. Such methods include nuclear magnetic resonance, mass spectroscopy and size exclusion chromatography, as described in Example 13.

Способы определения количества повторяющихся единиц в сахариде также известны в данной области техники. Например, количество повторяющихся единиц (или «n» в Формуле) можно рассчитать путем деления молекулярной массы полисахарида (без молекулярной массы основного сахарида или остатка KDO) на молекулярную массу повторяющейся единицы (т.е. молекулярную масса структуры в соответствующей Формуле, показанной, например, в таблице 1, которая теоретически может быть рассчитана как сумма молекулярной массы каждого моносахарида в Формуле). Молекулярная масса каждого моносахарида в формуле известна в данной области техники. Молекулярная масса повторяющейся единицы Формулы O25b, например, составляет около 862 Да. Молекулярная масса повторяющейся единицы Формулы O1a, например, составляет около 845 Да. Молекулярная масса повторяющейся единицы Формулы O2, например, составляет около 829 Да. Молекулярная масса повторяющейся единицы Формулы O6, например, составляет около 893 Да. При определении количества повторяющихся единиц в конъюгате, в расчете учитываются молекулярная масса белка-носителя и соотношение белок:полисахарид. Как определено в настоящем документе, «n» относится к количеству повторяющихся единиц (представленных в скобках в таблице 1) в молекуле полисахарида. Как известно в данной области техники, в биологических макромолекулах повторяющиеся структуры могут перемежаться областями несовершенных повторов, такими как, например, отсутствующие ответвления. Кроме того, в данной области техники известно, что полисахариды, выделенные и очищенные из природных источников, таких как бактерии, могут быть гетерогенными по размеру и разветвлению. В таком случае n может представлять собой среднее или медианное значение n для молекул в популяции.Methods for determining the number of repeating units in a saccharide are also known in the art. For example, the number of repeat units (or " n " in a Formula) can be calculated by dividing the molecular weight of the polysaccharide (excluding the molecular weight of the main saccharide or KDO residue) by the molecular weight of the repeat unit (i.e., the molecular weight of the structure in the corresponding Formula shown, e.g. , in Table 1, which can theoretically be calculated as the sum of the molecular weight of each monosaccharide in the Formula). The molecular weight of each monosaccharide in the formula is known in the art. The molecular weight of the repeating unit of Formula O25b, for example, is about 862 Da. The molecular weight of the Formula O1a repeating unit, for example, is about 845 Da. The molecular weight of the repeating unit of Formula O2, for example, is about 829 Da. The molecular weight of the repeating unit of Formula O6, for example, is about 893 Da. When determining the number of repeating units in a conjugate, the molecular weight of the carrier protein and the protein:polysaccharide ratio are taken into account in the calculation. As defined herein, " n " refers to the number of repeating units (represented in parentheses in Table 1) in a polysaccharide molecule. As is known in the art, in biological macromolecules, repeat structures may be interspersed with regions of imperfect repeats, such as missing branches. In addition, it is known in the art that polysaccharides isolated and purified from natural sources such as bacteria can be heterogeneous in size and branching. In such a case, n may represent the mean or median value of n for the molecules in the population.

В одном варианте осуществления, О-полисахарид имеет увеличение, по меньшей мере, на одну повторяющуюся единицу О-антигена по сравнению с соответствующим О-полисахаридом дикого типа. Повторяющиеся единицы О-антигенов показаны в таблице 1. В одном варианте осуществления, О-полисахарид включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 или более повторяющихся единиц. Предпочтительно, сахарид имеет в общей сложности от, по меньшей мере, 3 до не более 80 повторяющихся единиц. В другом варианте осуществления, О-полисахарид имеет увеличение на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 или более повторяющихся единиц по сравнению с соответствующим О-полисахаридом дикого типа.In one embodiment, the O-polysaccharide has an increase of at least one O-antigen repeat unit compared to the corresponding wild-type O-polysaccharide. The O-antigen repeat units are shown in Table 1. In one embodiment, the O-polysaccharide includes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 , 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 , 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 or more repeat units. Preferably, the saccharide has a total of from at least 3 to at most 80 repeat units. In another embodiment, the O-polysaccharide has an increase of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 , 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 , 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 , 96, 97, 98, 99, 100 or more repeat units compared to the corresponding wild-type O-polysaccharide.

В одном варианте осуществления, сахарид включает О-антиген, где n в любой из формул О-антигена (такой как, например, формулы, показанные в таблице 1 (см. также ФИГ. 9A-9C и ФИГ. 10A-10B)) представляет собой целое число, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, и не более 200, 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51 или 50. Любое минимальное значение и любое максимальное значение могут быть объединены для определения диапазона. Типовые диапазоны включают, например, от, по меньшей мере, 1 до не более 1000; от, по меньшей мере, 10 до не более 500; и от, по меньшей мере, 20 до не более 80, предпочтительно, не более 90. В одном предпочтительном варианте осуществления, n составляет от, по меньшей мере, 31 до не более 90. В предпочтительном варианте осуществления, n составляет от 40 до 90, более предпочтительно, от 60 до 85.In one embodiment, the saccharide includes an O-antigen, where n in any of the O-antigen formulas (such as, for example, the formulas shown in Table 1 (see also FIGS. 9A-9C and FIGS. 10A-10B)) represents is an integer of at least 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, and no more than 200, 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 81, 80 , 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51 or 50. Any minimum value and any maximum value can be combined to define a range. Typical ranges include, for example, from at least 1 to at most 1000; from at least 10 to not more than 500; and from at least 20 to at most 80, preferably at most 90. In one preferred embodiment, n is from at least 31 to at most 90. In a preferred embodiment, n is from 40 to 90 , more preferably from 60 to 85.

В одном варианте осуществления, сахарид включает О-антиген, где n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 1 и не более 200. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 5 и не более 200. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 10 и не более 200. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 25 и не более 200. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 50 и не более 200. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 75 и не более 200. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 100 и не более 200. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 125 и не более 200. В одном варианте осуществления, n в любой в формулах О-антигена составляет, по меньшей мере, 150 и не более 200. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 175 и не более 200. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 175 и не более 200. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 1 и не более 100. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 5 и не более 100. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 10 и не более 100. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 25 и не более 100. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 50 и не более 100. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 75 и не более 100. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 1 и не более 75. В одном из вариантов осуществления n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 5 и не более 75. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 10 и не более 75. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 20 и не более 75. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 25 и не более 75. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 30 и не более 75. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 40 и не более 75. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 50 и не более 75. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 30 и не более 90. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 35 и не более 85. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 35 и не более 75. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 35 и не более 70. В одном варианте осуществления, n в любой из формул одна из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 35 и не более 60. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 35 и не более 50. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 35 и не более 49. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 35 и не более 48. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 35 и не более 47. В о В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 35 и не более 46. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 36 и не более 45. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 37 и не более 44. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 38 и не более 43. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 39 и не более 42. В одном варианте осуществления, n в любой из формул О-антигена составляет, по меньшей мере, 39 и не более 41.In one embodiment, the saccharide includes an O-antigen, wherein nin any of the formulas, the O-antigen is at least 1 and no more than 200. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 5 and no more than 200. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 10 and no more than 200. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 25 and no more than 200. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 50 and no more than 200. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 75 and no more than 200. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 100 and no more than 200. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 125 and no more than 200. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 150 and no more than 200. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 175 and no more than 200. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 175 and no more than 200. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 1 and no more than 100. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 5 and no more than 100. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 10 and no more than 100. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 25 and no more than 100. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 50 and no more than 100. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 75 and no more than 100. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 1 and no more than 75. In one embodiment nin any of the formulas, the O-antigen is at least 5 and no more than 75. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 10 and no more than 75. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 20 and no more than 75. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 25 and no more than 75. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 30 and no more than 75. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 40 and no more than 75. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 50 and no more than 75. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 30 and no more than 90. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 35 and no more than 85. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 35 and no more than 75. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 35 and no more than 70. In one embodiment, nin any of the formulas, one of the O-antigen formulas is at least 35 and no more than 60. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 35 and no more than 50. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 35 and no more than 49. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 35 and no more than 48. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 35 and no more than 47. In one embodiment, nto any of the O-antigen formulas are at least 35 and no more than 46. In one embodiment, nin any one of the formulas, the O-antigen is at least 36 and no more than 45. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 37 and no more than 44. In one embodiment, nin any one of the formulas, the O-antigen is at least 38 and no more than 43. In one embodiment, nin any of the formulas, the O-antigen is at least 39 and no more than 42. In one embodiment, nin any of the O-antigen formulas is at least 39 and not more than 41.

Например, в одном варианте осуществления, n в сахариде составляет 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 или 90, наиболее предпочтительно, 40. В другом варианте осуществления, n составляет от, по меньшей мере, 35 до не более 60. Например, в одном варианте осуществления, n составляет любое из 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 и 60, предпочтительно, 50. В другом предпочтительном варианте осуществления, n составляет от, по меньшей мере, 55 до не более 75. Например, в одном варианте осуществления, n составляет 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 или 69, наиболее предпочтительно, 60.For example, in one embodiment, the n in the saccharide is 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 , 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75 , 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 or 90, most preferably 40. In another embodiment, n is from at least 35 to no more than 60. For example, in one embodiment, n is any of 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 and 60, preferably 50. In another preferred embodiment, n is from at least 55 to at most 75. For example, in one embodiment, n is 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 or 69, most preferably 60.

Структура сахарида может быть определена способами и инструментами, известными из уровня техники, такими как, например, ЯМР, включая 1D, 1H и/или 13C, 2D TOCSY, DQF-COSY, NOESY и/или HMQC.The structure of the saccharide can be determined by methods and tools known in the art, such as, for example, NMR, including 1D, 1H and/or 13C, 2D TOCSY, DQF-COSY, NOESY and/or HMQC.

В некоторых вариантах осуществления, очищенный полисахарид перед конъюгацией имеет молекулярную массу от 5 кДа до 400 кДа. В других таких вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 10 кДа до 400 кДа; от 5 кДа до 400 кДа; от 5 кДа до 300 кДа; от 5 кДа до 200 кДа; от 5 кДа до 150 кДа; от 10 кДа до 100 кДа; от 10 кДа до 75 кДа; от 10 кДа до 60 кДа; от 10 кДа до 40 кДа; от 10 кДа до 100 кДа; 10 кДа до 200 кДа; от 15 кДа до 150 кДа; от 12 кДа до 120 кДа; от 12 кДа до 75 кДа; от 12 кДа до 50 кДа; от 12 и 60 кДа; от 35 кДа до 75 кДа; от 40 кДа до 60 кДа; от 35 кДа до 60 кДа; от 20 кДа до 60 кДа; от 12 кДа до 20 кДа; или от 20 кДа до 50 кДа. В дополнительных вариантах осуществления, полисахарид имеет молекулярную массу от 7 кДа до 15 кДа; 8 кДа до 16 кДа; 9 кДа до 25 кДа; 10 кДа до 100; 10 кДа до 60 кДа; 10 кДа до 70 кДа; 10 кДа до 160 кДа; 15 кДа до 600 кДа; 20 кДа до 1000 кДа; 20 кДа до 600 кДа; 20 кДа до 400 кДа; 30 кДа до 1000 КДа; 30 кДа до 60 кДа; 30 кДа до 50 кДа или 5 кДа до 60 кДа. Любое целое число в любом из вышеуказанных диапазонов рассматривается как вариант осуществления изобретения.In some embodiments, the purified polysaccharide has a molecular weight ranging from 5 kDa to 400 kDa before conjugation. In other such embodiments, the saccharide has a molecular weight of 10 kDa to 400 kDa; from 5 kDa to 400 kDa; from 5 kDa to 300 kDa; from 5 kDa to 200 kDa; from 5 kDa to 150 kDa; from 10 kDa to 100 kDa; from 10 kDa to 75 kDa; from 10 kDa to 60 kDa; from 10 kDa to 40 kDa; from 10 kDa to 100 kDa; 10 kDa to 200 kDa; from 15 kDa to 150 kDa; from 12 kDa to 120 kDa; from 12 kDa to 75 kDa; from 12 kDa to 50 kDa; from 12 and 60 kDa; from 35 kDa to 75 kDa; from 40 kDa to 60 kDa; from 35 kDa to 60 kDa; from 20 kDa to 60 kDa; from 12 kDa to 20 kDa; or from 20 kDa to 50 kDa. In additional embodiments, the polysaccharide has a molecular weight of 7 kDa to 15 kDa; 8 kDa to 16 kDa; 9 kDa to 25 kDa; 10 kDa to 100; 10 kDa to 60 kDa; 10 kDa to 70 kDa; 10 kDa to 160 kDa; 15 kDa to 600 kDa; 20 kDa to 1000 kDa; 20 kDa to 600 kDa; 20 kDa to 400 kDa; 30 kDa to 1000 KDa; 30 kDa to 60 kDa; 30 kDa to 50 kDa or 5 kDa to 60 kDa. Any integer in any of the above ranges is considered an embodiment of the invention.

Используемый в настоящем документе термин «молекулярная масса» полисахарида или конъюгата белок-носитель-полисахарид относится к молекулярной массе, рассчитанной с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC) в сочетании с детектором многоуглового лазерного светорассеяния (MALLS).As used herein, the term “molecular weight” of a polysaccharide or protein-carrier-polysaccharide conjugate refers to the molecular weight calculated using size exclusion chromatography (SEC) coupled with a multi-angle laser light scattering (MALLS) detector.

Полисахарид может немного уменьшиться в размерах во время обычных процедур очистки. Кроме того, как описано в настоящем документе, полисахарид можно подвергнуть классификации по размерам перед конъюгацией. Может быть использована механическая или химическая классификация по размерам. Химический гидролиз можно проводить с использованием уксусной кислоты. Механическая калибровка может быть проведена с использованием сдвигов гомогенизации под высоким давлением. Упомянутые выше диапазоны молекулярных масс относятся к очищенным полисахаридам перед конъюгацией (например, перед активацией).The polysaccharide may shrink slightly during normal cleaning procedures. Additionally, as described herein, the polysaccharide can be size classified prior to conjugation. Mechanical or chemical size classification may be used. Chemical hydrolysis can be carried out using acetic acid. Mechanical calibration can be done using high pressure homogenization shifts. The molecular weight ranges mentioned above refer to purified polysaccharides before conjugation (eg, before activation).

D. Коровый олигосахаридD. Core oligosaccharide

Основной олигосахарид расположен между липидом А и внешней областью О-антигена в LPS E. coli дикого типа. Более конкретно, коровый олигосахарид представляет собой часть полисахарида, которая включает связь между О-антигеном и липидом А в E. coli дикого типа. Эта связь включает кетозидную связь между полукетальной функцией самого внутреннего остатка 3-дезокси-d-манно-окт-2-улозоновой кислоты (KDO)) и гидроксильной группой остатка GlcNAc липида А. Основной олигосахарид регион демонстрирует высокую степень сходства среди штаммов E. coli дикого типа. Обычно он включает ограниченное количество сахаров. Коровый олигосахарид включает внутреннюю коровую область и внешнюю коровую область.The core oligosaccharide is located between lipid A and the outer O-antigen region in wild-type E. coli LPS. More specifically, the core oligosaccharide is the portion of the polysaccharide that comprises the linkage between O antigen and lipid A in wild-type E. coli . This relationship involves a ketosidic bond between the hemiketal function of the innermost 3-deoxy-d-manno-oct-2-ulosonic acid (KDO) residue and the hydroxyl group of the GlcNAc residue of lipid A. The core oligosaccharide region shows a high degree of similarity among wild E. coli strains type. It usually includes a limited amount of sugars. The core oligosaccharide includes an inner core region and an outer core region.

Более конкретно, внутреннее ядро состоит в основном из L-глицеро-D-манно-гептозы (гептозы) и остатков KDO. Внутреннее ядро очень консервативно. Остаток KDO включает следующую формулу KDO:More specifically, the inner core consists mainly of L-glycero-D-manno-heptose (heptose) and KDO residues. The inner core is very conservative. The KDO remainder includes the following KDO formula:

Внешняя область корового олигосахарида демонстрирует больше вариаций, чем внутренняя коровая область, и различия в этой области отличают пять хемотипов E. coli: R1, R2, R3, R4 и K-12. См. ФИГ. 24, которая иллюстрирует обобщенные структуры углеводного остова внешних коровых олигосахаридов пяти известных хемотипов. HepII является последним остатком внутреннего корового олигосахарида. В то время как все внешние коровые олигосахариды имеют общую структурную тему, с (гексозным)₃ углеводным остовом и двумя остатками боковой цепи, порядок гексоз в основной цепи, а также природа, положение и связь остатков боковой цепи могут варьироваться. Структуры внешних коровых олигосахаридов R1 и R4 очень похожи, различаясь только одним β-связанным остатком.The outer region of the core oligosaccharide shows more variation than the inner core region, and differences in this region distinguish the five chemotypes E. coli: R1, R2, R3, R4 and K-12. See FIG. 24, which illustrates the generalized structures of the carbohydrate backbone of the outer core oligosaccharides of the five known chemotypes. HepII is the last residue of the internal core oligosaccharide. While all outer core oligosaccharides share a common structural theme, with (hexose)₃ carbohydrate backbone and two side chain residues, the order of the hexoses in the main chain, and the nature, position and connectivity of the side chain residues can vary. The structures of the outer core oligosaccharides R1 and R4 are very similar, differing only in one β-linked residue.

Коровые олигосахариды E. coli дикого типа классифицируются в данной области техники на основе структур дистального олигосахарида на пять различных хемотипов: E. coli R1, E. coli R2, E. coli R3, E. coli R4 и E. coli К12.Core oligosaccharides of wild-type E. coli are classified in the art based on distal oligosaccharide structures into five different chemotypes: E. coli R1, E. coli R2, E. coli R3, E. coli R4, and E. coli K12.

В предпочтительном варианте осуществления, композиции, описанные в настоящем документе, включают гликоконъюгаты, в которых О-полисахарид включает коровый олигосахарид, связанный с О-антигеном. В одном варианте осуществления, композиция индуцирует иммунный ответ, по меньшей мере, против любого из коровых хемотипов E.coli: E.coli R1, E.coli R2, E.coli R3, E.coli R4 и E.coli K12. В другом варианте осуществления, композиция индуцирует иммунный ответ, по меньшей мере, против двух коровых хемотипов E. coli. В другом варианте осуществления, композиция индуцирует иммунный ответ, по меньшей мере, против трех коровых хемотипов E. coli. В другом варианте осуществления, композиция индуцирует иммунный ответ, по меньшей мере, против четырех коровых хемотипов E. coli. В другом варианте осуществления, композиция индуцирует иммунный ответ против всех пяти коровых хемотипов E. coli. In a preferred embodiment, the compositions described herein include glycoconjugates in which the O-polysaccharide includes a core oligosaccharide linked to an O-antigen. In one embodiment, the composition induces an immune response against at least any of the core chemotypes of E. coli: E. coli R1, E. coli R2, E. coli R3, E. coli R4 and E. coli K12. In another embodiment, the composition induces an immune response against at least two core chemotypes of E. coli. In another embodiment, the composition induces an immune response against at least three core chemotypes of E. coli. In another embodiment, the composition induces an immune response against at least four core chemotypes of E. coli. In another embodiment, the composition induces an immune response against all five core chemotypes of E. coli.

В другом предпочтительном варианте осуществления, композиции, описанные в настоящем документе, включают гликоконъюгаты, в которых О-полисахарид не включает коровый олигосахарид, связанный с О-антигеном. В одном варианте осуществления, такая композиция индуцирует иммунный ответ, по меньшей мере, против любого из коровых хемотипов E.coli: E.coli R1, E.coli R2, E.coli R3, E.coli R4 и E.coli K12, несмотря на гликоконъюгат, содержащий О-полисахарид, который не включает коровый олигосахарид.In another preferred embodiment, the compositions described herein include glycoconjugates wherein the O-polysaccharide does not include a core oligosaccharide associated with an O-antigen. In one embodiment, such a composition induces an immune response against at least any of the core chemotypes of E. coli: E. coli R1, E. coli R2, E. coli R3, E. coli R4 and E. coli K12, despite to a glycoconjugate containing an O-polysaccharide that does not include a core oligosaccharide.

Серотипы E. coli можно охарактеризовать в соответствии с одним из пяти хемотипов. В таблице 2 перечислены типовые серотипы, охарактеризованные в соответствии с хемотипом. Серотипы, выделенные жирным шрифтом, представляют собой серотипы, которые чаще всего связаны с указанным коровым хемотипом. Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления, композиция индуцирует иммунный ответ, по меньшей мере, против любого из коровых хемотипов E.coli: E.coli R1, E.coli R2, E.coli R3, E.coli R4 и E.coli K12, который включает иммунный ответ против любого из соответствующих серотипов E. coli. E. coli serotypes can be characterized according to one of five chemotypes. Table 2 lists the type serotypes characterized according to chemotype. Serotypes in bold represent the serotypes most commonly associated with the indicated core chemotype. Accordingly, in a preferred embodiment, the composition induces an immune response against at least any of the core chemotypes of E. coli: E. coli R1, E. coli R2, E. coli R3, E. coli R4 and E. coli K12, which involves an immune response against any of the relevant E. coli serotypes.

Таблица 2: Основной хемотип и связанный с ним серотип E. Table 2: Major chemotype and associated serotype E. colicoli Коровый хемотипCore chemotype СеротипSerotype R1R1 О25а, О6, О2, О1, О75, О4, О16, О8, О18, О9, О13, О20, О21, О91 и О163.O25a, O6, O2, O1, O75, O4, O16, O8, O18, O9, O13, O20, O21, O91 and O163. R2R2 О21, О4 4, О11, О89, О162, О9O21, O4 4, O11, O89, O162, O9 R3R3 О25б, О15, О153, О21, О17, О11, О159, О22 О86, О93O25b, O15, O153, O21, O17, O11, O159, O22 O86, O93 R4R4 О2, О1, О86, О7, О102, О160, О166O2, O1, O86, O7, O102, O160, O166 К-12K-12 О25б, О16 O25b, O16

В некоторых вариантах осуществления, композиция включает сахарид, имеющий структуру, полученную из серотипа, имеющего хемотип R1, например, выбранный из сахарида, имеющего Формулу O25a, Формулу O6, Формулу O2, Формулу O1, Формулу O75, Формулу O4, Формулу O16, Формулу O8, Формулу O18, Формулу O9, Формулу O13, Формулу O20, Формулу O21, Формулу O91 и Формулу O163, где n составляет от 1 до 100. В некоторых вариантах осуществления, сахарид в указанной композиции дополнительно включает коровую группу E. coli R1., например, показанную на ФИГ. 24.In some embodiments, the composition includes a saccharide having a structure derived from a serotype having chemotype R1, for example, selected from a saccharide having Formula O25a, Formula O6, Formula O2, Formula O1, Formula O75, Formula O4, Formula O16, Formula O8 , Formula O18, Formula O9, Formula O13, Formula O20, Formula O21, Formula O91, and Formula O163, wherein n is from 1 to 100. In some embodiments, the saccharide in said composition further includes an E. coli R1 core group, for example , shown in FIG. 24.

В некоторых вариантах осуществления композиция, включает сахарид, имеющий структуру, полученную из серотипа, имеющего хемотип R1, например, выбранный из сахарида, имеющего Формулу O25a, Формулу O6, Формулу O2, Формулу O1, Формулу O75, Формулу O4, Формулу O16, Формулу O18, Формулу O13, Формулу O20, Формулу O21, Формулу O91 и Формулу O163, где n составляет от 1 до 100, предпочтительно, от 31 до 100, более предпочтительно, от 35 до 90, наиболее предпочтительно, от 35 до 65. В некоторых вариантах осуществления сахарид в указанной композиции дополнительно включает коровую группу E. coli R1 в сахариде.In some embodiments, the composition includes a saccharide having a structure derived from a serotype having chemotype R1, for example, selected from a saccharide having Formula O25a, Formula O6, Formula O2, Formula O1, Formula O75, Formula O4, Formula O16, Formula O18 , Formula O13, Formula O20, Formula O21, Formula O91 and Formula O163, where n is from 1 to 100, preferably from 31 to 100, more preferably from 35 to 90, most preferably from 35 to 65. In some embodiments implementation, the saccharide in said composition further includes an E. coli R1 core group in the saccharide.

В некоторых вариантах осуществления, композиция включает сахарид, имеющий структуру, полученную из серотипа, имеющего хемотип R2, например, выбранный из сахарида, имеющего Формулу O21, Формулу O44, Формулу O11, Формулу O89, Формулу O162 и Формулу O9, где n составляет от 1 до 100, предпочтительно, от 31 до 100, более предпочтительно, от 35 до 90, наиболее предпочтительно, от 35 до 65. В некоторых вариантах осуществления сахарид в указанной композиции дополнительно включает коровую группу E. coli R2, например, показанную на ФИГ. 24.In some embodiments, the composition includes a saccharide having a structure derived from a serotype having chemotype R2, for example, selected from a saccharide having Formula O21, Formula O44, Formula O11, Formula O89, Formula O162 and Formula O9, where n is from 1 to 100, preferably 31 to 100, more preferably 35 to 90, most preferably 35 to 65. In some embodiments, the saccharide in the composition further includes an E. coli R2 core group, such as that shown in FIG. 24.

В некоторых вариантах осуществления, композиция включает сахарид, имеющий структуру, полученную из серотипа, имеющего хемотип R3, например, выбранный из сахарида, имеющего Формулу O25b, Формулу O15, Формулу O153, Формулу O21, Формулу O17, Формулу O11, Формулу O159, Формулу O22, Формулу O86 и Формулу O93, где n составляет от 1 до 100, предпочтительно, от 31 до 100, более предпочтительно, от 35 до 90, наиболее предпочтительно, от 35 до 65. В некоторых вариантах осуществления сахарид в указанной композиции дополнительно включает коровую группу E. coli R3, например, показанную на ФИГ. 24.In some embodiments, the composition includes a saccharide having a structure derived from a serotype having chemotype R3, for example, selected from a saccharide having Formula O25b, Formula O15, Formula O153, Formula O21, Formula O17, Formula O11, Formula O159, Formula O22 , Formula O86 and Formula O93, wherein n is from 1 to 100, preferably from 31 to 100, more preferably from 35 to 90, most preferably from 35 to 65. In some embodiments, the saccharide in the composition further includes a core group E. coli R3, for example, shown in FIG. 24.

В некоторых вариантах осуществления, композиция включает сахарид, имеющий структуру, полученную из серотипа, имеющего хемотип R4, например, выбранный из сахарида, имеющего Формулу O2, Формулу O1, Формулу O86, Формулу O7, Формулу O102, Формулу O160 и Формулу O166, где n составляет от 1 до 100, предпочтительно, от 31 до 100, более предпочтительно, от 35 до 90, наиболее предпочтительно, от 35 до 65. В некоторых вариантах осуществления сахарид в указанной композиции дополнительно включает коровую группу E. coli R4, например, показанную на ФИГ. 24.In some embodiments, the composition includes a saccharide having a structure derived from a serotype having chemotype R4, for example, selected from a saccharide having Formula O2, Formula O1, Formula O86, Formula O7, Formula O102, Formula O160 and Formula O166, where n is from 1 to 100, preferably from 31 to 100, more preferably from 35 to 90, most preferably from 35 to 65. In some embodiments, the saccharide in the composition further includes an E. coli R4 core group, such as shown in FIG. 24.

В некоторых вариантах осуществления, композиция включает сахарид, имеющий структуру, полученную из серотипа, имеющего хемотип К-12 (например, выбранного из сахарида, имеющего формулу O25b, и сахарида, имеющего формулу O16), где n составляет от 1 до 1000, предпочтительно, от 31 до 100, более предпочтительно, от 35 до 90, наиболее предпочтительно, от 35 до 65. В некоторых вариантах осуществления, сахарид в указанной композиции дополнительно включает коровую группу E. coli K-12, например, показанную на ФИГ. 24.In some embodiments, the composition includes a saccharide having a structure derived from a serotype having the K-12 chemotype (for example, selected from a saccharide having the formula O25b and a saccharide having the formula O16), where n is from 1 to 1000, preferably from 31 to 100, more preferably from 35 to 90, most preferably from 35 to 65. In some embodiments, the saccharide in the composition further includes an E. coli K-12 core group, such as that shown in FIG. 24.

В некоторых вариантах осуществления, сахарид включает коровый сахарид. Соответственно, в одном варианте осуществления, О-полисахарид дополнительно включает коровую группу E. coli R1. В другом варианте осуществления, О-полисахарид дополнительно включает коровую группу E. coli R2. В другом варианте осуществления, О-полисахарид дополнительно включает коровую группу E. coli R3. В другом варианте осуществления, О-полисахарид дополнительно включает коровую группу R4 E. coli. В другом варианте осуществления, О-полисахарид дополнительно включает коровую группу E. coli K12.In some embodiments, the saccharide includes a bark saccharide. Accordingly, in one embodiment, the O-polysaccharide further comprises the E. coli R1 core group . In another embodiment, the O-polysaccharide further comprises an E. coli R2 core group . In another embodiment, the O-polysaccharide further comprises an E. coli R3 core group. In another embodiment, the O-polysaccharide further comprises an E. coli R4 core group. In another embodiment, the O-polysaccharide further comprises an E. coli K12 core group.

В некоторых вариантах осуществления, сахарид не включает коровый сахарид. Соответственно, в одном варианте осуществления, О-полисахарид не включает коровую группу E. coli R1. В другом варианте осуществления, О-полисахарид не включает коровую группу E. coli R2. В другом варианте осуществления, О-полисахарид не включает коровую группу E. coli R3. В другом варианте осуществления, О-полисахарид не включает коровую группу E. coli R4. В другом варианте осуществления, O-полисахарид не включает коровую группу E. coli K12.In some embodiments, the saccharide does not include a bark saccharide. Accordingly, in one embodiment, the O-polysaccharide does not include the E. coli R1 core group . In another embodiment, the O-polysaccharide does not include the E. coli R2 core group . In another embodiment, the O-polysaccharide does not include the E. coli R3 core group . In another embodiment, the O-polysaccharide does not include the E. coli R4 core group . In another embodiment, the O-polysaccharide does not include the E. coli K12 core group.

Е. Конъюгированные О-антигеныE. Conjugated O-antigens

Химическая связь О-антигенов или, предпочтительно, О-полисахаридов с белковыми носителями может улучшить иммуногенность О-антигенов или О-полисахаридов. Однако изменчивость размера полимера представляет собой практическую проблему для производства. При коммерческом использовании, размер сахарида может влиять на совместимость с различными стратегиями синтеза конъюгации, однородность продукта и иммуногенность конъюгата. Контроль экспрессии регулятора длины цепи белка семейства Wzz посредством манипулирования путями синтеза О-антигена позволяет производить цепи О-антигена желаемой длины в различных штаммах грамотрицательных бактерий, включая E. coli. Chemical association of O-antigens or, preferably, O-polysaccharides with protein carriers can improve the immunogenicity of O-antigens or O-polysaccharides. However, polymer size variability poses a practical challenge for manufacturing. In commercial use, saccharide size may affect compatibility with different conjugation synthesis strategies, product uniformity, and conjugate immunogenicity. Controlling the expression of the Wzz family protein chain length regulator by manipulating O-antigen synthesis pathways allows the production of O-antigen chains of desired lengths in various strains of Gram-negative bacteria, including E. coli.

В одном варианте осуществления, очищенные сахариды химически активируют для получения активированных сахаридов, способных реагировать с белком-носителем. После активации, каждый сахарид отдельно конъюгируется с белком-носителем с образованием конъюгата, а именно, гликоконъюгата. Используемый в настоящем документе термин «гликоконъюгат» относится к сахариду, ковалентно связанному с белком-носителем. В одном варианте осуществления, сахарид связан непосредственно с белком-носителем. В другом варианте осуществления, сахарид связан с белком через спейсер/линкер. Конъюгаты могут быть получены по схемам, которые связывают носитель с О-антигеном в одном или нескольких сайтах вдоль О-антигена, или по схемам, которые активируют, по меньшей мере, один остаток корового олигосахарида.In one embodiment, purified saccharides are chemically activated to produce activated saccharides capable of reacting with a carrier protein. After activation, each saccharide is individually conjugated to a carrier protein to form a conjugate, namely a glycoconjugate. As used herein, the term “glycoconjugate” refers to a saccharide covalently linked to a carrier protein. In one embodiment, the saccharide is linked directly to a carrier protein. In another embodiment, the saccharide is linked to the protein via a spacer/linker. Conjugates can be prepared by patterns that bind the carrier to the O-antigen at one or more sites along the O-antigen, or by patterns that activate at least one core oligosaccharide residue.

В одном варианте осуществления, каждый сахарид конъюгирован с одним и тем же белком-носителем. Если белок-носитель является одинаковым для 2 или нескольких сахаридов в композиции, сахариды могут быть конъюгированы с одной и той же молекулой белка-носителя (например, молекулы-носители имеют конъюгированные с ней 2 или несколько различных сахаридов).In one embodiment, each saccharide is conjugated to the same carrier protein. If the carrier protein is the same for 2 or more saccharides in the composition, the saccharides may be conjugated to the same carrier protein molecule (eg, the carrier molecules have 2 or more different saccharides conjugated thereto).

В предпочтительном варианте осуществления, каждый из сахаридов индивидуально конъюгирован с разными молекулами белкового носителя (каждая молекула белкового носителя имеет конъюгированный с ней только один тип сахарида). В указанном варианте осуществления, сахариды, как говорят, индивидуально конъюгированы с белком-носителем.In a preferred embodiment, each of the saccharides is individually conjugated to a different protein carrier molecule (each protein carrier molecule has only one type of saccharide conjugated to it). In this embodiment, the saccharides are said to be individually conjugated to a carrier protein.

Химическая активация сахаридов и последующая конъюгация с белком-носителем могут быть достигнуты описанными в настоящем документе способами активации и конъюгации. После конъюгации полисахарида с белком-носителем, гликоконъюгаты очищают (обогащают по отношению к количеству конъюгата полисахарид-белок) различными методами. Эти методы включают операции концентрации/диафильтрации, осаждения/элюирования, колоночной хроматографии и глубинной фильтрации. После очистки отдельных гликоконъюгатов их смешивают с получением иммуногенной композиции по настоящему изобретению.Chemical activation of saccharides and subsequent conjugation to a carrier protein can be achieved by the activation and conjugation methods described herein. After conjugation of the polysaccharide to the carrier protein, the glycoconjugates are purified (enriched relative to the amount of polysaccharide-protein conjugate) by various methods. These methods include concentration/diafiltration, precipitation/elution, column chromatography and depth filtration operations. After purification of the individual glycoconjugates, they are mixed to obtain the immunogenic composition of the present invention.

Активация. Настоящее изобретение дополнительно относится к активированным полисахаридам, полученным в соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, где полисахарид активируют химическим реагентом с образованием реакционноспособных групп для конъюгации с линкером или белком-носителем. В некоторых вариантах осуществления, сахарид по изобретению активируют перед конъюгацией с белком-носителем. В некоторых вариантах осуществления, степень активации не приводит к значительному снижению молекулярной массы полисахарида. Например, в некоторых вариантах осуществления, степень активации не расщепляет полисахаридный остов. В некоторых вариантах осуществления степень активации не оказывает существенного влияния на степень конъюгации, измеряемую количеством остатков лизина, модифицированных в белке-носителе, таком как CRM₁₉₇ (по данным аминокислотного анализа). Например, в некоторых вариантах осуществления, степень активации не приводит к значительному увеличению количества модифицированных остатков лизина (по данным аминокислотного анализа) в белке-носителе в 3 раза по сравнению с количеством лизиновых остатков, модифицированных в белке-носителе конъюгата с эталонным полисахаридом при той же степени активации. В некоторых вариантах осуществления, степень активации не увеличивает уровень неконъюгированного свободного сахарида. В некоторых вариантах осуществления, степень активации не снижает оптимальное соотношение сахарид/белок. Activation. The present invention further relates to activated polysaccharides prepared in accordance with any of the embodiments described herein, wherein the polysaccharide is activated with a chemical reagent to form reactive groups for conjugation with a linker or carrier protein. In some embodiments, the saccharide of the invention is activated prior to conjugation to a carrier protein. In some embodiments, the degree of activation does not significantly reduce the molecular weight of the polysaccharide. For example, in some embodiments, the degree of activation does not cleave the polysaccharide backbone. In some embodiments, the degree of activation does not significantly affect the degree of conjugation, as measured by the number of lysine residues modified in a carrier protein such as CRM ₁₉₇ (as determined by amino acid analysis). For example, in some embodiments, the degree of activation does not significantly increase the number of modified lysine residues (as determined by amino acid analysis) in the carrier protein by a factor of 3 compared to the number of lysine residues modified in the carrier protein of a reference polysaccharide conjugate at the same degree of activation. In some embodiments, the degree of activation does not increase the level of unconjugated free saccharide. In some embodiments, the degree of activation does not reduce the optimal saccharide/protein ratio.

В некоторых вариантах осуществления, активированный сахарид имеет долю активации, при котором количество молей тиола на повторяющуюся единицу сахарида активированного сахарида составляет от 1 до 100%, например, от 2 до 80%, от 2 до 50%, 3-30% и 4-25%. Степень активации составляет, по меньшей мере, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, ≥20%, ≥30%, ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, или ≥90%, или около 100%. Предпочтительно, степень активации составляет, самое большее, 50%, более предпочтительно, самое большее, 25%. В одном варианте осуществления, степень активации составляет, самое большее, 20%. Любое минимальное значение и любое максимальное значение могут быть объединены для определения диапазона.In some embodiments, the activated saccharide has an activation fraction such that the number of moles of thiol per saccharide repeating unit of the activated saccharide is from 1 to 100%, such as from 2 to 80%, from 2 to 50%, from 3 to 30%, and from 4- 25%. The degree of activation is at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, ≥20%, ≥30%, ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, or ≥90%, or about 100%. Preferably, the activation degree is at most 50%, more preferably at most 25%. In one embodiment, the degree of activation is at most 20%. Any minimum value and any maximum value can be combined to define a range.

В одном варианте осуществления, полисахарид активируют тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP) с образованием цианатного эфира. Активированный полисахарид затем связывают напрямую или через спейсерную (линкерную) группу с аминогруппой на белке-носителе (предпочтительно CRM₁₉₇ или столбнячном анатоксине).In one embodiment, the polysaccharide is activated with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate (CDAP) to form a cyanate ester. The activated polysaccharide is then linked directly or via a spacer group to an amino group on a carrier protein (preferably CRM ₁₉₇ or tetanus toxoid).

Например, спейсером может быть цистамин или цистеамин для получения тиолированного полисахарида, который может быть сопряжен с носителем через тиоэфирную связь, полученную после реакции с малеимид-активированным белком-носителем (например, с использованием сложного эфира N-[Y-малеимидобутирокси]сукцинимида (GMBS)) или галоацетилированным белком-носителем (например, с использованием йодацетимида, N-сукцинимидилбромацетата (SBA; SIB), N-сукцинимидил(4-йодацетил)аминобензоата (SIAB), сульфосукцинимидил(4-йодацетил)аминобензоата (сульфо-SIAB), N-сукцинимидилиодацетата (SIA) или сукцинимидил-3-[бромацетамидо]пропионата (SBAP)). В одном варианте осуществления, цианатный эфир (необязательно полученный с помощью CDAP химии) сочетают с гександиамином или дигидразидом адипиновой кислоты (ADH), и аминопроизводный сахарид конъюгируют с белком-носителем (например, CRM₁₉₇) с использованием карбодиимида (например, EDAC или EDC) через карбоксильную группу на белковом носителе.For example, the spacer may be cystamine or cysteamine to produce a thiolated polysaccharide, which can be conjugated to a carrier through a thioester linkage obtained after reaction with a maleimide-activated carrier protein (for example, using N-[Y-maleimidobutyroxy]succinimide ester (GMBS) )) or a haloacetylated carrier protein (e.g. using iodoacetimide, N-succinimidyl bromoacetate (SBA; SIB), N-succinimidyl(4-iodoacetyl)aminobenzoate (SIAB), sulfosuccinimidyl(4-iodoacetyl)aminobenzoate (sulfo-SIAB), N -succinimidyliodoacetate (SIA) or succinimidyl-3-[bromoacetamido]propionate (SBAP)). In one embodiment, a cyanate ester (optionally prepared by CDAP chemistry) is combined with a hexanediamine or adipic acid dihydrazide (ADH), and the amino derivative saccharide is conjugated to a carrier protein (e.g., CRM ₁₉₇ ) using a carbodiimide (e.g., EDAC or EDC) through the carboxyl group on the protein carrier.

В других подходящих методиках конъюгации используют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, п-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU. Конъюгация может включать карбонильный линкер, который может быть образован реакцией свободной гидроксильной группы сахарида с CDI с последующей реакцией с белком с образованием карбаматной связи. Это может включать восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, необязательную защиту/снятие защиты первичной гидроксильной группы, реакцию первичной гидроксильной группы с CDI с образованием карбаматного промежуточного соединения CDI и связывание карбаматного промежуточного соединения CDI с аминогруппой на белке (CDI химия).Other suitable conjugation techniques use carbodiimides, hydrazides, active esters, norborane, p-nitrobenzoic acid, N-hydroxysuccinimide, S-NHS, EDC, TSTU. The conjugation may involve a carbonyl linker, which may be formed by reacting the free hydroxyl group of a saccharide with CDI, followed by reaction with the protein to form a carbamate bond. This may include reduction of the anomeric end to a primary hydroxyl group, optional protection/deprotection of the primary hydroxyl group, reaction of the primary hydroxyl group with CDI to form a CDI carbamate intermediate, and coupling of the CDI carbamate intermediate to an amino group on the protein (CDI chemistry).

Молекулярная масса. В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат содержит сахарид с молекулярной массой от 10 кДа до 2000 кДа. В других вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1000 кДа. В других вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 70 кДа до 900 кДа. В других вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 800 кДа. В других вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 200 кДа до 600 кДа. В дополнительных вариантах осуществления, сахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 1000 кДа; до 100 кДа до 900 кДа; до 100 кДа до 800 кДа; до 100 кДа до 700 кДа; до 100 кДа до 600 кДа; до 100 кДа до 500 кДа; до 100 кДа до 400 кДа; до 100 кДа до 300 кДа; до 150 кДа до 1,000 кДа; до 150 кДа до 900 кДа; до 150 кДа до 800 кДа; до 150 кДа до 700 кДа; до 150 кДа до 600 кДа; до 150 кДа до 500 кДа; до 150 кДа до 400 кДа; до 150 кДа до 300 кДа; до 200 кДа до 1,000 кДа; до 200 кДа до 900 кДа; до 200 кДа до 800 кДа; до 200 кДа до 700 кДа; до 200 кДа до 600 кДа; до 200 кДа до 500 кДа; до 200 кДа до 400 кДа; до 200 кДа до 300; 250 кДа до 1,000 кДа; до 250 кДа до 900 кДа; до 250 кДа до 800 кДа; до 250 кДа до 700 кДа; до 250 кДа до 600 кДа; до 250 кДа до 500 кДа; до 250 кДа до 400 кДа; до 250 кДа до 350 кДа; до 300 кДа до 1,000 кДа; до 300 кДа до 900 кДа; до 300 кДа до 800 кДа; до 300 кДа до 700 кДа; до 300 кДа до 600 кДа; до 300 кДа до 500 кДа; до 300 кДа до 400 кДа; до 400 кДа до 1,000 кДа; до 400 кДа до 900 кДа; до 400 кДа до 800 кДа; до 400 кДа до 700 кДа; до 400 кДа до 600 кДа; до 500 кДа до 600 кДа. В одном варианте осуществления, гликоконъюгат, имеющий такую молекулярную массу, получают односторонней конъюгацией. В другом варианте осуществления, гликоконъюгат, имеющий такую молекулярную массу, получают с помощью химии восстановительного аминирования (RAC), приготовленного в водном буфере. Любое целое число в любом из вышеуказанных диапазонов рассматривается как вариант осуществления изобретения. Molecular mass. In some embodiments, the glycoconjugate contains a saccharide with a molecular weight of 10 kDa to 2000 kDa. In other embodiments, the saccharide has a molecular weight from 50 kDa to 1000 kDa. In other embodiments, the saccharide has a molecular weight of 70 kDa to 900 kDa. In other embodiments, the saccharide has a molecular weight from 100 kDa to 800 kDa. In other embodiments, the saccharide has a molecular weight from 200 kDa to 600 kDa. In additional embodiments, the saccharide has a molecular weight of from 100 kDa to 1000 kDa; up to 100 kDa up to 900 kDa; up to 100 kDa up to 800 kDa; up to 100 kDa up to 700 kDa; up to 100 kDa up to 600 kDa; up to 100 kDa up to 500 kDa; up to 100 kDa up to 400 kDa; up to 100 kDa up to 300 kDa; up to 150 kDa up to 1,000 kDa; up to 150 kDa up to 900 kDa; up to 150 kDa up to 800 kDa; up to 150 kDa up to 700 kDa; up to 150 kDa up to 600 kDa; up to 150 kDa up to 500 kDa; up to 150 kDa up to 400 kDa; up to 150 kDa up to 300 kDa; up to 200 kDa up to 1,000 kDa; up to 200 kDa up to 900 kDa; up to 200 kDa up to 800 kDa; up to 200 kDa up to 700 kDa; up to 200 kDa up to 600 kDa; up to 200 kDa up to 500 kDa; up to 200 kDa up to 400 kDa; up to 200 kDa up to 300; 250 kDa to 1,000 kDa; up to 250 kDa up to 900 kDa; up to 250 kDa up to 800 kDa; up to 250 kDa up to 700 kDa; up to 250 kDa up to 600 kDa; up to 250 kDa up to 500 kDa; up to 250 kDa up to 400 kDa; up to 250 kDa up to 350 kDa; up to 300 kDa up to 1,000 kDa; up to 300 kDa up to 900 kDa; up to 300 kDa up to 800 kDa; up to 300 kDa up to 700 kDa; up to 300 kDa up to 600 kDa; up to 300 kDa up to 500 kDa; up to 300 kDa up to 400 kDa; up to 400 kDa up to 1,000 kDa; up to 400 kDa up to 900 kDa; up to 400 kDa up to 800 kDa; up to 400 kDa up to 700 kDa; up to 400 kDa up to 600 kDa; up to 500 kDa up to 600 kDa. In one embodiment, a glycoconjugate having such a molecular weight is prepared by one-way conjugation. In another embodiment, a glycoconjugate having such a molecular weight is prepared using reductive amination chemistry (RAC) prepared in an aqueous buffer. Any integer in any of the above ranges is considered an embodiment of the invention.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат по изобретению имеет молекулярную массу от 400 кДа до 15000 кДа; от 500 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; от 3000 кДа до 8000 кДа; или от 3000 кДа до 5000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат имеет молекулярную массу от 500 кДа до 10000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 8000 кДа. В других вариантах осуществления, гликоконъюгат имеет молекулярную массу от 2000 кДа до 8000 кДа или от 3000 кДа до 7000 кДа. В дополнительных вариантах осуществления, гликоконъюгат по изобретению имеет молекулярную массу от 200 кДа до 20000 кДа; от 200 кДа до 15000 кДа; от 200 кДа до 10000 кДа; от 200 кДа до 7,500 кДа; от 200 кДа до 5000 кДа; от 200 кДа до 3000 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 500 кДа до 20000 кДа; от 500 кДа до 15000 кДа; от 500 кДа до 12,500 кДа; от 500 кДа до 10000 кДа; от 500 кДа до 7,500 кДа; от 500 кДа до 6000 кДа; от 500 кДа до 5000 кДа; от 500 кДа до 4000 кДа; от 500 кДа до 3000 кДа; от 500 кДа до 2000 кДа; от 500 кДа до 1,500 кДа; от 500 кДа до 1000 кДа; от 750 кДа до 20000 кДа; от 750 кДа до 15000 кДа; от 750кДа до 12,500 кДа; от 750кДа до 10000 кДа; от 750кДа до 7,500 кДа; от 750 кДа до 6000 кДа; от 750 кДа до 5000 кДа; от 750 кДа до 4000 кДа; от 750 кДа до 3000 кДа; от 750 кДа до 2000 кДа; от 750 кДа до 1,500 кДа; от 1000 кДа до 15000 кДа; от 1000 кДа до 12,500 кДа; от 1000 кДа до 10000 кДа; от 1000 кДа до 7,500 кДа; от 1000 кДа до 6000 кДа; от 1000 кДа до 5000 кДа; от 1000 кДа до 4000 кДа; от 1000 кДа до 2,500 кДа; от 2000 кДа до 15000 кДа; от 2000 кДа до 12,500 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 7,500 кДа; от 2000 кДа до 6000 кДа; от 2000 кДа до 5000 кДа; от 2000 кДа до 4000 кДа; или от 2000 кДа до 3000 кДа. В одном варианте осуществления, гликоконъюгат, имеющий такую молекулярную массу, получают конъюгацией eTEC, описанной в настоящем документе. В другом варианте осуществления, гликоконъюгат, имеющий такую молекулярную массу, получают с помощью химии восстановительного аминирования (RAC). В другом варианте осуществления, гликоконъюгат, имеющий такую молекулярную массу, получают с помощью химии восстановительного аминирования (RAC) в ДМСО.In some embodiments, the glycoconjugate of the invention has a molecular weight of 400 kDa to 15,000 kDa; from 500 kDa to 10000 kDa; from 2000 kDa to 10000 kDa; from 3000 kDa to 8000 kDa; or from 3000 kDa to 5000 kDa. In other embodiments, the glycoconjugate has a molecular weight from 500 kDa to 10,000 kDa. In other embodiments, the glycoconjugate has a molecular weight of from 1000 kDa to 8000 kDa. In other embodiments, the glycoconjugate has a molecular weight of 2000 kDa to 8000 kDa, or 3000 kDa to 7000 kDa. In additional embodiments, the glycoconjugate of the invention has a molecular weight of from 200 kDa to 20,000 kDa; from 200 kDa to 15000 kDa; from 200 kDa to 10000 kDa; from 200 kDa to 7,500 kDa; from 200 kDa to 5000 kDa; from 200 kDa to 3000 kDa; from 200 kDa to 1000 kDa; from 500 kDa to 20000 kDa; from 500 kDa to 15000 kDa; from 500 kDa to 12,500 kDa; from 500 kDa to 10000 kDa; from 500 kDa to 7,500 kDa; from 500 kDa to 6000 kDa; from 500 kDa to 5000 kDa; from 500 kDa to 4000 kDa; from 500 kDa to 3000 kDa; from 500 kDa to 2000 kDa; from 500 kDa to 1,500 kDa; from 500 kDa to 1000 kDa; from 750 kDa to 20,000 kDa; from 750 kDa to 15000 kDa; from 750 kDa to 12,500 kDa; from 750 kDa to 10000 kDa; from 750 kDa to 7,500 kDa; from 750 kDa to 6000 kDa; from 750 kDa to 5000 kDa; from 750 kDa to 4000 kDa; from 750 kDa to 3000 kDa; from 750 kDa to 2000 kDa; from 750 kDa to 1,500 kDa; from 1000 kDa to 15000 kDa; from 1000 kDa to 12,500 kDa; from 1000 kDa to 10000 kDa; from 1000 kDa to 7,500 kDa; from 1000 kDa to 6000 kDa; from 1000 kDa to 5000 kDa; from 1000 kDa to 4000 kDa; from 1000 kDa to 2,500 kDa; from 2000 kDa to 15000 kDa; from 2000 kDa to 12,500 kDa; from 2000 kDa to 10000 kDa; from 2000 kDa to 7,500 kDa; from 2000 kDa to 6000 kDa; from 2000 kDa to 5000 kDa; from 2000 kDa to 4000 kDa; or from 2000 kDa to 3000 kDa. In one embodiment, a glycoconjugate having such a molecular weight is prepared by eTEC conjugation as described herein. In another embodiment, a glycoconjugate having such a molecular weight is prepared using reductive amination chemistry (RAC). In another embodiment, a glycoconjugate having such a molecular weight is prepared using reductive amination chemistry (RAC) in DMSO.

В дополнительных вариантах осуществления, гликоконъюгат по изобретению имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 20000 кДа; от 1000 кДа до 15000 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 7500 кДа; от 2000 кДа до 5000 кДа; от 3000 кДа до 20000 кДа; от 3000 кДа до 15000 кДа; от 3000 кДа до 12500 кДа; от 4000 кДа до 10000 кДа; от 4000 кДа до 7500 кДа; от 4000 кДа до 6000 кДа; или между 5000 кДа и 7000 кДа. В одном варианте осуществления, гликоконъюгат, имеющий такую молекулярную массу, получают с помощью химии восстановительного аминирования (RAC). В другом варианте осуществления, гликоконъюгат, имеющий такую молекулярную массу, получают с помощью химии восстановительного аминирования (RAC) в ДМСО. В другом варианте осуществления, гликоконъюгат с такой молекулярной массой получают с помощью описанной в настоящем документе конъюгации eTEC.In additional embodiments, the glycoconjugate of the invention has a molecular weight of from 1000 kDa to 20000 kDa; from 1000 kDa to 15000 kDa; from 2000 kDa to 10000 kDa; from 2000 kDa to 7500 kDa; from 2000 kDa to 5000 kDa; from 3000 kDa to 20000 kDa; from 3000 kDa to 15000 kDa; from 3000 kDa to 12500 kDa; from 4000 kDa to 10000 kDa; from 4000 kDa to 7500 kDa; from 4000 kDa to 6000 kDa; or between 5000 kDa and 7000 kDa. In one embodiment, a glycoconjugate having such a molecular weight is prepared using reductive amination chemistry (RAC). In another embodiment, a glycoconjugate having such a molecular weight is prepared using reductive amination chemistry (RAC) in DMSO. In another embodiment, a glycoconjugate with such a molecular weight is obtained using eTEC conjugation described herein.

В дополнительных вариантах осуществления, гликоконъюгат по изобретению имеет молекулярную массу от 5000 кДа до 20000 кДа; от 5000 кДа до 15000 кДа; от 5000 кДа до 10000 кДа; от 5000 кДа до 7500 кДа; от 6000 кДа до 20000 кДа; от 6000 кДа до 15000 кДа; от 6000 кДа до 12500 кДа; от 6000 кДа до 10000 кДа или от 6000 кДа до 7500 кДа.In additional embodiments, the glycoconjugate of the invention has a molecular weight of 5,000 kDa to 20,000 kDa; from 5000 kDa to 15000 kDa; from 5000 kDa to 10000 kDa; from 5000 kDa to 7500 kDa; from 6000 kDa to 20000 kDa; from 6000 kDa to 15000 kDa; from 6000 kDa to 12500 kDa; from 6000 kDa to 10000 kDa or from 6000 kDa to 7500 kDa.

Молекулярную массу гликоконъюгата можно измерить с помощью SEC-MALLS. Любое целое число в любом из вышеуказанных диапазонов рассматривается как вариант осуществления изобретения. Гликоконъюгаты по изобретению также могут характеризоваться отношением (масса/масса) сахарида к белку-носителю. В некоторых вариантах осуществления, отношение полисахарида к белку-носителю в гликоконъюгате (масс./масс.) составляет от 0,5 до 3 (например, примерно 0,5, примерно 0,6, примерно 0,7, примерно 0,8, примерно 0,9, примерно 1,0, примерно 1,1, примерно 1,2, примерно 1,3, примерно 1,4, примерно 1,5, примерно 1,6, примерно 1,7, примерно 1,8, примерно 1,9, примерно 2,0, примерно 2,1, примерно 2,2, примерно 2,3, примерно 2,4, примерно 2,5, примерно 2,6, примерно 2,7, примерно 2,8, примерно 2,9 или примерно 3,0). В других вариантах осуществления, отношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,5 до 2,0, от 0,5 до 1,5, от 0,8 до 1,2, от 0,5 до 1,0, от 1,0 до 1,5 или от 1,0 до 2,0. В дополнительных вариантах осуществления, отношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,8 до 1,2. В предпочтительном варианте осуществления, отношение полисахарида к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,9 до 1,1. В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.The molecular weight of the glycoconjugate can be measured using SEC-MALLS. Any integer in any of the above ranges is considered an embodiment of the invention. The glycoconjugates of the invention can also be characterized by the ratio (w/w) of saccharide to carrier protein. In some embodiments, the ratio of polysaccharide to carrier protein in the glycoconjugate (w/w) is from 0.5 to 3 (e.g., about 0.5, about 0.6, about 0.7, about 0.8, about 0.9, about 1.0, about 1.1, about 1.2, about 1.3, about 1.4, about 1.5, about 1.6, about 1.7, about 1.8, about 1.9, about 2.0, about 2.1, about 2.2, about 2.3, about 2.4, about 2.5, about 2.6, about 2.7, about 2.8, about 2.9 or about 3.0). In other embodiments, the ratio of saccharide to carrier protein (w/w) is 0.5 to 2.0, 0.5 to 1.5, 0.8 to 1.2, 0.5 to 1.0, from 1.0 to 1.5 or from 1.0 to 2.0. In further embodiments, the ratio of saccharide to carrier protein (w/w) is from 0.8 to 1.2. In a preferred embodiment, the ratio of polysaccharide to carrier protein in the conjugate is from 0.9 to 1.1. In some such embodiments, the carrier protein is CRM ₁₉₇ .

Гликоконъюгаты также могут быть охарактеризованы распределением их молекул по размерам (K_d). Среду эксклюзионной хроматографии (CL-4B) можно использовать для определения относительного распределения молекул конъюгата по размерам. Эксклюзионную хроматографию (ЭХ) используют в колонках с гравитационной подачей для профилирования распределения молекул конъюгатов по размерам. Крупные молекулы, исключенные из пор среды, элюируются быстрее, чем мелкие. Сборщики фракций используют для сбора элюата колонки. Фракции тестируют колориметрически с помощью анализа сахаридов. Для определения K_d колонки калибруют, чтобы установить долю, при которой молекулы полностью исключаются (V₀), (K_d=0), и долю, представляющую максимальное удержание (V_i), (K_d=1). Доля, при которой достигается указанный признак образца (V_e), связана с Kd выражением K_d=(V_e - V_o)/ (V_i - V₀).Glycoconjugates can also be characterized by their molecular size distribution ( _Kd ). Size exclusion chromatography medium (CL-4B) can be used to determine the relative size distribution of the conjugate molecules. Size exclusion chromatography (SEC) is used in gravity-fed columns to profile the molecular size distribution of conjugates. Large molecules excluded from the pores of the medium elute faster than small ones. Fraction collectors use columns to collect the eluate. Fractions are tested colorimetrically using saccharide analysis. To determine _Kd, columns are calibrated to determine the fraction at which molecules are completely excluded (V ₀ ), (K _d =0), and the fraction representing maximum retention (V _i ), (K _d =1). The fraction at which the specified characteristic of the sample (V _e ) is achieved is related to Kd by the expression K _d = (V _e - V _o )/ (V _i - V ₀ ).

Свободный сахарид. Гликоконъюгаты и иммуногенные композиции по изобретению могут включать свободный сахарид, который нековалентно конъюгирован с белком-носителем, но, тем не менее, присутствует в композиции гликоконъюгата. Свободный сахарид может быть нековалентно связан с (т.е. нековалентно связан, адсорбирован или захвачен) гликоконъюгатом. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит не более 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% или 15% свободного полисахарида по сравнению с общим количеством полисахарида. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит менее примерно 25% свободного полисахарида по сравнению с общим количеством полисахарида. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит не более примерно 20% свободного полисахарида по сравнению с общим количеством полисахарида. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит не более примерно 15% свободного полисахарида по сравнению с общим количеством полисахарида. В другом предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит не более примерно 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% свободного полисахарида по сравнению с общим количеством полисахарида. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит менее примерно 8% свободного полисахарида по сравнению с общим количеством полисахарида. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит не более примерно 6% свободного полисахарида по сравнению с общим количеством полисахарида. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат содержит не более примерно 5% свободного полисахарида по сравнению с общим количеством полисахарида. См., например, Таблицу 19, Таблицу 20, Таблицу 21, Таблицу 22, Таблицу 23, Таблицу 24 и Таблицу 25. Free saccharide. The glycoconjugates and immunogenic compositions of the invention may include a free saccharide that is non-covalently conjugated to the carrier protein but is nonetheless present in the glycoconjugate composition. The free saccharide may be non-covalently associated with (ie, non-covalently bound, adsorbed or entrapped) the glycoconjugate. In a preferred embodiment, the glycoconjugate contains no more than 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% or 15% free polysaccharide, relative to the total amount of polysaccharide. In a preferred embodiment, the glycoconjugate contains less than about 25% free polysaccharide compared to the total amount of polysaccharide. In a preferred embodiment, the glycoconjugate contains no more than about 20% free polysaccharide relative to the total amount of polysaccharide. In a preferred embodiment, the glycoconjugate contains no more than about 15% free polysaccharide relative to the total amount of polysaccharide. In another preferred embodiment, the glycoconjugate contains no more than about 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% or 1% free polysaccharide compared to the total amount of polysaccharide. In a preferred embodiment, the glycoconjugate contains less than about 8% free polysaccharide compared to the total amount of polysaccharide. In a preferred embodiment, the glycoconjugate contains no more than about 6% free polysaccharide relative to the total amount of polysaccharide. In a preferred embodiment, the glycoconjugate contains no more than about 5% free polysaccharide relative to the total amount of polysaccharide. See, for example, Table 19, Table 20, Table 21, Table 22, Table 23, Table 24 and Table 25.

Ковалентная связь. В других вариантах осуществления, конъюгат содержит, по меньшей мере, одну ковалентную связь между белком-носителем и сахаридом на каждые 5-10 повторяющихся единиц сахарида; каждые 2-7 сахаридных повторяющихся единиц; каждые 3-8 сахаридных повторяющихся единиц; каждые 4-9 сахаридных повторяющихся единиц; каждые 6-11 сахаридных повторяющихся единиц; каждые 7-12 сахаридных повторяющихся единиц; каждые 8-13 сахаридных повторяющихся единиц; каждые 9-14 сахаридных повторяющихся единиц; каждые 10-15 сахаридных повторяющихся единиц; каждые 2-6 сахаридных повторяющихся единиц, каждые 3-7 сахаридных повторяющихся единиц; каждые 4-8 сахаридных повторяющихся единиц; каждые 6-10 сахаридных повторяющихся единиц; каждые 7-11 сахаридных повторяющихся единиц; каждые 8-12 сахаридных повторяющихся единиц; каждые 9-13 сахаридных повторяющихся единиц; каждые 10-14 сахаридных повторяющихся единиц; каждые 10-20 сахаридных повторяющихся единиц; каждые 4-25 сахаридных повторяющихся единиц или каждые 2-25 сахаридных повторяющихся единиц. В частых вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В другом варианте осуществления, по меньшей мере, одна связь между белком-носителем и сахаридом возникает на каждые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 сахаридных повторяющихся единиц полисахарида. В одном варианте осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. Любое целое число в любом из вышеуказанных диапазонов рассматривается как вариант осуществления изобретения. Covalent bond. In other embodiments, the conjugate contains at least one covalent bond between the carrier protein and the saccharide for every 5-10 saccharide repeat units; every 2-7 saccharide repeat units; every 3-8 saccharide repeat units; every 4-9 saccharide repeat units; every 6-11 saccharide repeating units; every 7-12 saccharide repeating units; every 8-13 saccharide repeating units; every 9-14 saccharide repeat units; every 10-15 saccharide repeating units; every 2-6 saccharide repeat units, every 3-7 saccharide repeat units; every 4-8 saccharide repeat units; every 6-10 saccharide repeating units; every 7-11 saccharide repeating units; every 8-12 saccharide repeat units; every 9-13 saccharide repeating units; every 10-14 saccharide repeating units; every 10-20 saccharide repeating units; every 4-25 saccharide repeat units or every 2-25 saccharide repeat units. In frequent embodiments, the carrier protein is CRM ₁₉₇ . In another embodiment, at least one bond between the carrier protein and the saccharide occurs every 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, or 25 saccharide repeating units of a polysaccharide. In one embodiment, the carrier protein is CRM ₁₉₇ . Any integer in any of the above ranges is considered an embodiment of the invention.

Лизиновые остатки. Другой способ охарактеризовать гликоконъюгаты по изобретению заключается в количестве лизиновых остатков в белке-носителе (например, CRM₁₉₇), которые становятся конъюгированными с сахаридом, что может быть охарактеризовано как ряд конъюгированных лизинов (степень конъюгации). Доказательства лизиновой модификации белка-носителя вследствие ковалентных связей с полисахаридами могут быть получены с помощью аминокислотного анализа с использованием обычных методов, известных специалистам в данной области техники. Конъюгация приводит к уменьшению количества восстановленных лизиновых остатков по сравнению с исходным материалом белка-носителя, используемым для получения материалов конъюгата. В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата по изобретению составляет от 2 до 15, от 2 до 13, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 3 до 15, от 3 до 13, от 3 до 10, от 3 до 8, от 3 до 6, от 3 до 5, от 3 до 4, от 5 до 15, от 5 до 10, от 8 до 15, от 8 до 12, от 10 до 15 или от 10 до 12. В одном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата по изобретению составляет примерно 2, примерно 3, примерно 4, примерно 5, примерно 6, примерно 7, примерно 8, примерно 9, примерно 10, примерно 11, примерно 12, примерно 13, примерно 14 или примерно 15. В предпочтительном варианте осуществления, степень конъюгации гликоконъюгата по изобретению составляет от 4 до 7. В некоторых таких вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. Lysine residues. Another way to characterize the glycoconjugates of the invention is by the number of lysine residues in the carrier protein (eg, CRM ₁₉₇ ) that become conjugated to the saccharide, which can be characterized as a number of conjugated lysines (degree of conjugation). Evidence of lysine modification of the carrier protein due to covalent bonds with polysaccharides can be obtained by amino acid analysis using conventional methods known to those skilled in the art. Conjugation results in a decrease in the number of reduced lysine residues compared to the original carrier protein material used to prepare the conjugate materials. In a preferred embodiment, the degree of conjugation of the glycoconjugate of the invention is 2 to 15, 2 to 13, 2 to 10, 2 to 8, 2 to 6, 2 to 5, 2 to 4, 3 to 15 , from 3 to 13, from 3 to 10, from 3 to 8, from 3 to 6, from 3 to 5, from 3 to 4, from 5 to 15, from 5 to 10, from 8 to 15, from 8 to 12 , from 10 to 15 or from 10 to 12. In one embodiment, the degree of conjugation of the glycoconjugate of the invention is about 2, about 3, about 4, about 5, about 6, about 7, about 8, about 9, about 10, about 11, about 12, about 13, about 14, or about 15. In a preferred embodiment, the degree of conjugation of the glycoconjugate of the invention is from 4 to 7. In some such embodiments, the carrier protein is CRM ₁₉₇ .

Частота присоединения сахаридной цепи к лизину на белке-носителе является еще одним параметром для характеристики гликоконъюгатов по изобретению. Например, в некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, одна ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом приходится на каждые 4 сахаридных повторяющихся единицы полисахарида. В другом варианте осуществления, ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом возникает, по меньшей мере, один раз на каждые 10 сахаридных повторяющихся единиц полисахарида. В другом варианте осуществления, ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом возникает по меньшей мере, один раз на каждые 15 сахаридных повторяющихся единиц полисахарида. В другом варианте осуществления, ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом возникает, по меньшей мере, один раз на каждые 25 сахаридных повторяющихся единиц полисахарида.The frequency of attachment of the saccharide chain to lysine on the carrier protein is another parameter for characterizing the glycoconjugates of the invention. For example, in some embodiments, there is at least one covalent bond between the carrier protein and the polysaccharide for every 4 saccharide repeating units of the polysaccharide. In another embodiment, the covalent bond between the carrier protein and the polysaccharide occurs at least once for every 10 saccharide repeating units of the polysaccharide. In another embodiment, the covalent bond between the carrier protein and the polysaccharide occurs at least once for every 15 saccharide repeating units of the polysaccharide. In another embodiment, the covalent bond between the carrier protein and the polysaccharide occurs at least once for every 25 saccharide repeating units of the polysaccharide.

О-ацетилирование. В некоторых вариантах осуществления, сахариды по изобретению являются O-ацетилированными. В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат содержит сахарид, который имеет степень O-ацетилирования между 10-100%, между 20-100%, между 30-100%, между 40-100%, между 50-100%, между 60-100%, между 70-100%, между 75-100%, 80-100%, 90-100%, 50-90%, 60-90%, 70-90% или 80-90%. В других вариантах осуществления, степень ацетилирования составляет ≥10%, ≥20%, ≥30%, ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, или ≥90%, или около 100%. Под % О-ацетилирования подразумевается доля данного сахарида по отношению к 100% (где каждая повторяющаяся единица полностью ацетилирована относительно ее ацетилированной структуры). O-acetylation. In some embodiments, the saccharides of the invention are O-acetylated. In some embodiments, the glycoconjugate contains a saccharide that has a degree of O-acetylation between 10-100%, between 20-100%, between 30-100%, between 40-100%, between 50-100%, between 60-100% , between 70-100%, between 75-100%, 80-100%, 90-100%, 50-90%, 60-90%, 70-90% or 80-90%. In other embodiments, the degree of acetylation is ≥10%, ≥20%, ≥30%, ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, or ≥90%, or about 100%. By % O-acetylation we mean the proportion of a given saccharide relative to 100% (where each repeating unit is completely acetylated relative to its acetylated structure).

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат получают восстановительным аминированием. В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат представляет собой односторонне-связанный конъюгированный сахарид, где сахарид ковалентно связан непосредственно с белком-носителем. В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат ковалентно связан с белком-носителем через спейсер (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбамат (eTEC).In some embodiments, the glycoconjugate is prepared by reductive amination. In some embodiments, a glycoconjugate is a one-way linked conjugated saccharide, where the saccharide is covalently linked directly to a carrier protein. In some embodiments, the glycoconjugate is covalently linked to a carrier protein through a (2-((2-oxoethyl)thio)ethyl)carbamate (eTEC) spacer.

ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЕ АМИНИРОВАНИЕ. В одном варианте осуществления, сахарид конъюгирован с белком-носителем посредством восстановительного аминирования (например, как описано в публикациях патентных заявок США №№ 2006/0228380, 2007/0231340, 2007/0184071 и 2007/0184072, WO 2006/110381, WO 2008/079653 и WO 2008/143709). RESTORATIVE AMINATION. In one embodiment, the saccharide is conjugated to a carrier protein through reductive amination (for example, as described in US Patent Application Publications Nos. 2006/0228380, 2007/0231340, 2007/0184071 and 2007/0184072, WO 2006/110381, WO 2008/ 079653 and WO 2008/143709).

Восстановительное аминирование включает (1) окисление сахарида, (2) восстановление активированного сахарида и белка-носителя с образованием конъюгата. Перед окислением сахарид необязательно гидролизуют. Можно использовать механический или химический гидролиз. Химический гидролиз можно проводить с использованием уксусной кислоты.Reductive amination involves (1) oxidation of the saccharide, (2) reduction of the activated saccharide and the carrier protein to form a conjugate. The saccharide is optionally hydrolyzed before oxidation. Mechanical or chemical hydrolysis can be used. Chemical hydrolysis can be carried out using acetic acid.

Стадия окисления может включать реакцию с периодатом. Используемый в настоящем документе термин «периодат» относится как к периодату, так и к йодной кислоте. Этот термин также включает как метапериодат (IO₄ ^-), так и ортопериодат (IO₆ ^5-), а также различные соли периодата (например, периодат натрия и периодат калия). В одном варианте осуществления, полисахарид окисляют в присутствии метапериодата, предпочтительно, в присутствии периодата натрия (NaIO₄). В другом варианте осуществления, полисахарид окисляют в присутствии ортопериодата, предпочтительно, в присутствии йодной кислоты.The oxidation step may include reaction with a periodate. As used herein, the term “periodate” refers to both periodate and periodic acid. The term also includes both metaperiodate (IO ₄ ^- ) and orthoperiodate (IO ₆ ^{5 -} ), as well as various periodate salts (eg, sodium periodate and potassium periodate). In one embodiment, the polysaccharide is oxidized in the presence of metaperiodate, preferably in the presence of sodium periodate (NaIO ₄ ). In another embodiment, the polysaccharide is oxidized in the presence of orthoperiodate, preferably in the presence of periodic acid.

В одном варианте осуществления, окисляющий агент представляет собой стабильное нитроксильное или нитроксидное радикальное соединение, такое как соединения пиперидин-N-окси или пирролидин-N-окси, в присутствии окислителя для селективного окисления первичных гидроксилов. В указанной реакции, фактическим окислителем является соль N-оксоаммония в каталитическом цикле. В одном аспекте, указанное стабильное нитроксильное или нитроксидное радикальное соединение представляет собой соединения пиперидин-N-окси или пирролидин-N-окси. В одном аспекте, указанное стабильное нитроксильное или нитроксидное радикальное соединение несет группу TEMPO (2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилокси) или PROXYL (2,2,5,5-тетраметил-1-пирролидинилокси). В одном аспекте, указанное стабильное нитроксильное радикальное соединение представляет собой TEMPO или его производное. В одном аспекте, указанный окислитель представляет собой молекулу, несущую фрагмент N-галогена. В одном аспекте, указанный окислитель выбран из любого из N-хлорсукцинимида, N-бромсукцинимида, N-лодосукцинимида, дихлоризоциануровой кислоты, 1,3,5-трихлор-1,3,5-триазинан-2,4,6-триона, дибромизоциануровой кислоты, 1,3,5-трибром-1,3,5-триазинан-2,4,6-триона, дийодизоциануровой кислоты и 1,3,5-трииод-1,3,5-триазинан-2,4,6-триона. Предпочтительно, указанный окислитель представляет собой N-хлорсукцинимид.In one embodiment, the oxidizing agent is a stable nitroxide or nitroxide radical compound, such as piperidine-N-oxy or pyrrolidine-N-oxy compounds, in the presence of an oxidizing agent to selectively oxidize primary hydroxyls. In this reaction, the actual oxidizing agent is the N-oxoammonium salt in the catalytic cycle. In one aspect, said stable nitroxyl or nitroxide radical compound is piperidine-N-oxy or pyrrolidine-N-oxy compounds. In one aspect, said stable nitroxyl or nitroxide radical compound bears a TEMPO (2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy) or PROXYL (2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxy) group. In one aspect, said stable nitroxyl radical compound is TEMPO or a derivative thereof. In one aspect, said oxidizing agent is a molecule bearing an N-halogen moiety. In one aspect, said oxidizing agent is selected from any of N-chlorosuccinimide, N-bromosuccinimide, N-lodosuccinimide, dichloroisocyanuric acid, 1,3,5-trichloro-1,3,5-triazinan-2,4,6-trione, dibromoisocyanuric acid acid, 1,3,5-tribromo-1,3,5-triazinan-2,4,6-trione, diiodisocyanuric acid and 1,3,5-triiodo-1,3,5-triazinan-2,4,6 -trione. Preferably, said oxidizing agent is N-chlorosuccinimide.

После стадии окисления сахарида, говорят, что сахарид активирован, и далее в настоящем описании он упоминается как «активированный». Активированный сахарид и белок-носитель могут быть лиофилизированы (высушены вымораживанием) либо независимо (дискретная лиофилизация), либо вместе (совместно лиофилизированы). В одном варианте осуществления, активированный сахарид и белок-носитель лиофилизируют совместно. В другом варианте осуществления, активированный полисахарид и белок-носитель лиофилизируют независимо.After the saccharide oxidation step, the saccharide is said to be activated and is referred to hereinafter as "activated". The activated saccharide and the carrier protein can be lyophilized (freeze-dried) either independently (discrete lyophilization) or together (co-lyophilized). In one embodiment, the activated saccharide and the carrier protein are lyophilized together. In another embodiment, the activated polysaccharide and the carrier protein are lyophilized independently.

В одном варианте осуществления, лиофилизация происходит в присутствии невосстанавливающего сахара, возможные невосстанавливающие сахара включают сахарозу, трегалозу, раффинозу, стахиозу, мелецитозу, декстран, маннит, лактит и палатинит.In one embodiment, lyophilization occurs in the presence of a non-reducing sugar, possible non-reducing sugars include sucrose, trehalose, raffinose, stachyose, melecytose, dextran, mannitol, lactitol and palatinite.

Следующей стадией процесса конъюгации является восстановление активированного сахарида и белка-носителя с образованием конъюгата (так называемое восстановительное аминирование) с использованием восстанавливающего агента. Подходящие восстанавливающие агенты включают цианоборгидриды, такие как цианоборгидрид натрия, триацетоксиборгидрид натрия или боргидрид натрия или цинка в присутствии кислот Бренстеда или Льюиса), аминобораны, такие как пиридинборан, 2-пиколинборан, 2,6-диборанметанол, диметиламинборан, t-BuMe'PrN-BH3, бензиламин-BH3 или 5-этил-2-метилпиридинборан (PEMB), боран-пиридин или борогидрид-обменная смола. В одном варианте осуществления, восстановителем является цианоборгидрид натрия.The next step in the conjugation process is the reduction of the activated saccharide and the carrier protein to form a conjugate (called reductive amination) using a reducing agent. Suitable reducing agents include cyanoborohydrides such as sodium cyanoborohydride, sodium triacetoxyborohydride or sodium or zinc borohydride in the presence of Bronsted or Lewis acids), aminoboranes such as pyridine borane, 2-picoline borane, 2,6-diboranemethanol, dimethylamine borane, t-BuMe'PrN- BH3, benzylamine-BH3 or 5-ethyl-2-methylpyridineborane (PEMB), borane-pyridine or borohydride exchange resin. In one embodiment, the reducing agent is sodium cyanoborohydride.

В одном варианте осуществления, реакцию восстановления проводят в водном растворителе (например, выбранном из PBS, MES, HEPES, Bis-tris, ADA, PIPES, MOPSO, BES, MOPS, DIPSO, MOBS, HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS, Bicine или HEPB, при pH от 6,0 до 8,5, от 7,0 до 8,0 или от 7,0 до 7,5), в другом варианте осуществления, реакцию проводят в апротонном растворителе. В одном варианте осуществления, реакцию восстановления проводят в растворителе ДМСО (диметилсульфоксиде) или в ДМФ (диметилформамиде). Растворитель ДМСО или ДМФ можно использовать для восстановления активированного полисахарида и белка-носителя, которые были лиофилизированы.In one embodiment, the reduction reaction is carried out in an aqueous solvent (for example, selected from PBS, MES, HEPES, Bis-tris, ADA, PIPES, MOPSO, BES, MOPS, DIPSO, MOBS, HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS, Bicine or HEPB, at a pH of 6.0 to 8.5, 7.0 to 8.0, or 7.0 to 7.5), in another embodiment, the reaction is carried out in an aprotic solvent. In one embodiment, the reduction reaction is carried out in a solvent of DMSO (dimethyl sulfoxide) or DMF (dimethylformamide). The solvent DMSO or DMF can be used to reconstitute the activated polysaccharide and carrier protein that have been lyophilized.

В конце реакции восстановления, в конъюгатах могут остаться непрореагировавшие альдегидные группы, которые можно блокировать с помощью подходящего защитного агента. В одном варианте осуществления, этот защитный агент представляет собой боргидрид натрия (NaBH₄). После конъюгации (реакции восстановления и, необязательно, кэпирования) гликоконъюгаты могут быть очищены (обогащены по отношению к количеству конъюгата полисахарид-белок) различными методами, известными специалисту в данной области техники. Эти методы включают диализ, операции концентрирования/диафильтрации, осаждение/элюирование тангенциальной проточной фильтрацией, колоночную хроматографию (DEAE или хроматографию гидрофобного взаимодействия) и глубинную фильтрацию. Гликоконъюгаты могут быть очищены диафильтрацией и/или ионообменной хроматографией и/или эксклюзионной хроматографией. В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты очищают диафильтрацией или ионообменной хроматографией или эксклюзионной хроматографией. В одном варианте осуществления, гликоконъюгаты подвергают стерильной фильтрации.At the end of the reduction reaction, unreacted aldehyde groups may remain in the conjugates, which can be blocked using a suitable protecting agent. In one embodiment, this protecting agent is sodium borohydride (NaBH ₄ ). After conjugation (reduction reaction and optionally capping), the glycoconjugates can be purified (enriched relative to the amount of polysaccharide-protein conjugate) by various methods known to one skilled in the art. These methods include dialysis, concentration/diafiltration operations, precipitation/elution by tangential flow filtration, column chromatography (DEAE or hydrophobic interaction chromatography) and depth filtration. Glycoconjugates can be purified by diafiltration and/or ion exchange chromatography and/or size exclusion chromatography. In one embodiment, the glycoconjugates are purified by diafiltration or ion exchange chromatography or size exclusion chromatography. In one embodiment, the glycoconjugates are subjected to sterile filtration.

В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгат из серотипа E. coli выбран из любого из O25B, O1, O2 и O6, получен восстановительным аминированием. В предпочтительном варианте осуществления, гликоконъюгаты из E. coli серотипов O25B, O1, O2 и O6 получают восстановительным аминированием.In a preferred embodiment, the glycoconjugate from an E. coli serotype selected from any of O25B, O1, O2 and O6 is prepared by reductive amination. In a preferred embodiment, glycoconjugates from E. coli serotypes O25B, O1, O2 and O6 are prepared by reductive amination.

В одном аспекте, изобретение относится к конъюгату, который включает белок-носитель, например, CRM₁₉₇, связанный с сахаридом формулы O25B, представленной , In one aspect, the invention relates to a conjugate that includes a carrier protein, for example CRM ₁₉₇ , linked to a saccharide of formula O25B represented by ,

где n представляет собой любое целое число, большее или равное 1. В предпочтительном варианте осуществления, n является целым числом, равным, по меньшей мере, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 и не более 200, 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51 или 50. Любое минимальное значение и любое максимальное значение могут быть объединены для определения диапазона. Типовые диапазоны включают, например, по меньшей мере, от 1 до не более 1000; по меньшей мере, от 10 до не более 500; и по меньшей мере, от 20 до не более 80. В одном предпочтительном варианте осуществления, n составляет, по меньшей мере, от 31 до не более 90, более предпочтительно, от 40 до 90, наиболее предпочтительно, от 60 до 85.Where n represents any integer greater than or equal to 1. In a preferred embodiment, nis an integer equal to at least 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 and not more than 200, 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, or 50. Any minimum value and any maximum value can be combined to define a range. Typical ranges include, for example, from at least 1 to at most 1000; at least from 10 to not more than 500; and from at least 20 to at most 80. In one preferred embodiment, nis at least from 31 to no more than 90, more preferably, from 40 to 90, most preferably, from 60 to 85.

В другом аспекте, изобретение относится к конъюгату, который включает белок-носитель, например, CRM₁₉₇, связанный с сахаридом, имеющим любую из следующих структур, показанных в таблице 1 (см. также ФИГ. 9A-9C и ФИГ. 10A-10B), где n представляет собой целое число, большее или равное 1.In another aspect, the invention relates to a conjugate that includes a carrier protein, for example, CRM ₁₉₇ , associated with a saccharide having any of the following structures shown in table 1 (see also FIGS. 9A-9C and FIGS. 10A-10B) , where n is an integer greater than or equal to 1.

Без привязки к какой-либо теории или механизму, в некоторых вариантах осуществления, считается, что стабильный конъюгат требует такого уровня модификации сахаридного антигена, который уравновешивает сохранение структурной целостности критических иммуногенных эпитопов антигена.Without being bound by any theory or mechanism, in some embodiments, a stable conjugate is believed to require a level of modification of the saccharide antigen that balances maintaining the structural integrity of critical immunogenic epitopes of the antigen.

Активация и образование альдегида. В некоторых вариантах осуществления, сахарид по изобретению активируется, что приводит к образованию альдегида. В таких вариантах осуществления, где сахарид активирован, доля (%) активации (или степень окисления (DO)) (см., например, пример 31) относится к молям повторяющейся единицы сахарида на моль альдегида активированного полисахарида. Например, в некоторых вариантах осуществления, сахарид активируется периодатным окислением вицинальных диолов на повторяющейся единицу полисахарида, что приводит к образованию альдегида. Изменение молярных эквивалентов (мэкв) периодата натрия по отношению к сахаридному повторяющемуся звену и температуре во время окисления приводит к различным уровням степени окисления (DO). Activation and formation of aldehyde. In some embodiments, the saccharide of the invention is activated, resulting in the formation of an aldehyde. In such embodiments, where the saccharide is activated, the fraction (%) of activation (or state of oxidation (DO)) (see, for example, Example 31) refers to the moles of saccharide repeating unit per mole of aldehyde of the activated polysaccharide. For example, in some embodiments, the saccharide is activated by periodate oxidation of vicinal diols on a repeating unit of the polysaccharide, resulting in the formation of an aldehyde. Varying molar equivalents (mEq) of sodium periodate relative to the saccharide repeat unit and temperature during oxidation results in different levels of oxidation state (DO).

Концентрации сахаридов и альдегидов обычно определяют с помощью колориметрических анализов. Альтернативным реагентом является комбинация TEMPO (2,2,6,6-тетраметилпиперидин 1-оксильный радикал)-N-хлорсукцинимида (NCS), которая приводит к образованию альдегидов из первичных спиртовых групп.Concentrations of saccharides and aldehydes are usually determined using colorimetric assays. An alternative reagent is the combination TEMPO (2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl radical)-N-chlorosuccinimide (NCS), which produces aldehydes from primary alcohol groups.

В некоторых вариантах осуществления, активированный сахарид имеет степень окисления, при которой количество молей повторяющейся единицы сахарида на моль альдегида активированного сахарида составляет между 1-100, например, между 2-80, между 2-50, между 3-30 и между 4-25. Степень активации, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ≥20, ≥30, ≥40, ≥50, ≥60, ≥70, ≥80 или ≥90 или примерно 100. Предпочтительно, степень окисления (DO) составляет, по меньшей мере, 5 и не более 50, более предпочтительно, по меньшей мере, 10 и не более 25. В одном варианте осуществления, степень активации составляет, по меньшей мере, 10 и не более 25. Любое минимальное значение и любое максимальное значение могут быть объединены для определения диапазона. Степень окисления может быть представлена в долях (%) активации. Например, в одном варианте осуществления, значение DO, равное 10, относится к одной повторяющейся единице активированного сахарида из общего числа 10 повторяющихся единиц сахарида в активированном сахариде, и в этом случае значение DO, равное 10, может быть представлено как 10% активации.In some embodiments, the activated saccharide has an oxidation state such that the number of moles of saccharide repeating unit per mole of aldehyde of the activated saccharide is between 1-100, such as between 2-80, between 2-50, between 3-30, and between 4-25 . Activation degree of at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ≥20, ≥30 , ≥40, ≥50, ≥60, ≥70, ≥80 or ≥90 or about 100. Preferably, the oxidation number (DO) is at least 5 and no more than 50, more preferably at least 10 and no more than 25. In one embodiment, the activation degree is at least 10 and no more than 25. Any minimum value and any maximum value can be combined to define a range. The degree of oxidation can be represented in fractions (%) of activation. For example, in one embodiment, a DO value of 10 refers to one activated saccharide repeat unit out of a total of 10 saccharide repeat units in the activated saccharide, in which case a DO value of 10 may be represented as 10% activation.

В некоторых вариантах осуществления, конъюгат, полученный с помощью восстановительного аминирования, включает белок-носитель и сахарид, где сахарид имеет структуру, выбранную из Формулы O1 (например, Формулы O1A, Формулы O1B и Формулы O1C), Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4 (например, Формулы O4:K52 и Формулы O4:K6), Формулы O5 (например, Формулы O5ab и Формулы O5ac (штамм 180/C3)), Формулы O6 (например, Формулы O6:K2; K13; K15 и Формулы O6:K54), Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18 (например, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B и Формулы O18B1), Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23 (например, Формулы O23A), Формулы O24, Формулы O25 (например, Формулы O25a и Формулы O25b), Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45 (например, Формулы O45 и Формулы O45rel), Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы 62D₁, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73 (например, Формулы O73 (штамм 73-1)), Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186 и Формулы O187. В некоторых вариантах осуществления, сахарид в конъюгате включает Формулу, где n представляет собой целое число от 1 до 1000, от 5 до 1000, предпочтительно, от 31 до 100, более предпочтительно, от 35 до 90, наиболее предпочтительно, от 35 до 65.In some embodiments, the conjugate produced by reductive amination includes a carrier protein and a saccharide, wherein the saccharide has a structure selected from Formula O1 (e.g., Formula O1A, Formula O1B, and Formula O1C), Formula O2, Formula O3, Formula O4 (for example, Formulas O4:K52 and Formulas O4:K6), Formulas O5 (for example, Formulas O5ab and Formulas O5ac (strain 180/C3)), Formulas O6 (for example, Formulas O6:K2; K13; K15 and Formulas O6:K54 ), Formulas O7, Formulas O8, Formulas O9, Formulas O10, Formulas O11, Formulas O12, Formulas O13, Formulas O14, Formulas O15, Formulas O16, Formulas O17, Formulas O18 (for example, Formulas O18A, Formulas O18ac, Formulas O18A1, Formulas O18B and O18B1 Formulas), O19 Formulas, O20 Formulas, O21 Formulas, O22 Formulas, O23 Formulas (e.g. O23A Formulas), O24 Formulas, O25 Formulas (e.g. O25a Formulas and O25b Formulas), O26 Formulas, O27 Formulas, O28 Formulas , Formulas O29, Formulas O30, Formulas O32, Formulas O33, Formulas O34, Formulas O35, Formulas O36, Formulas O37, Formulas O38, Formulas O39, Formulas O40, Formulas O41, Formulas O42, Formulas O43, Formulas O44, Formulas O45 (for example , Formulas O45 and Formulas O45rel), Formulas O46, Formulas O48, Formulas O49, Formulas O50, Formulas O51, Formulas O52, Formulas O53, Formulas O54, Formulas O55, Formulas O56, Formulas O57, Formulas O58, Formulas O59, Formulas O60, Formulas O61, Formulas O62, Formulas 62D ₁ , Formulas O63, Formulas O64, Formulas O65, Formulas O66, Formulas O68, Formulas O69, Formulas O70, Formulas O71, Formulas O73 (for example, Formulas O73 (strain 73-1)), Formulas O74, Formulas O75, Formulas O76, Formulas O77, Formulas O78, Formulas O79, Formulas O80, Formulas O81, Formulas O82, Formulas O83, Formulas O84, Formulas O85, Formulas O86, Formulas O87, Formulas O88, Formulas O89, Formulas O90, Formulas O91, Formulas O92, Formulas O93, Formulas O96, Formulas O97, Formulas O98, Formulas O99, Formulas O100, Formulas O101, Formulas O102, Formulas O103, Formulas O104, Formulas O105, Formulas O106, Formulas O107, O108 , Formulas O109, Formulas O110, Formulas 0111, Formulas O112, Formulas O113, Formulas O114, Formulas O115, Formulas O116, Formulas O117, Formulas O118, Formulas O119, Formulas O120, Formulas O121, Formulas O123, Formulas O124, Formulas O125, Formulas O126, Formulas O127, Formulas O128, Formulas O129, Formulas O130, Formulas O131, Formulas O132, Formulas O133, Formulas O134, Formulas O135, Formulas O136, Formulas O137, Formulas O138, Formulas O139, Formulas O140, Formulas O14 1, Formula O142, Formulas O143, Formulas O144, Formulas O145, Formulas O146, Formulas O147, Formulas O148, Formulas O149, Formulas O150, Formulas O151, Formulas O152, Formulas O153, Formulas O154, Formulas O155, Formulas O156, Formulas O157, O158, Formulas O159 , Formulas O160, Formulas O161, Formulas O162, Formulas O163, Formulas O164, Formulas O165, Formulas O166, Formulas O167, Formulas O168, Formulas O169, Formulas O170, Formulas O171, Formulas O172, Formulas O173, Formulas O174, Formulas O175, Formulas Formula O176, Formula O177, Formula O178, Formula O179, Formula O180, Formula O181, Formula O182, Formula O183, Formula O184, Formula O185, Formula O186 and Formula O187. In some embodiments, the saccharide in the conjugate includes Formula where n is an integer from 1 to 1000, from 5 to 1000, preferably from 31 to 100, more preferably from 35 to 90, most preferably from 35 to 65.

ОДНОСТОРОННЕ-СВЯЗАННЫЕ КОНЬЮГАТЫONE-WAY BOUND CONJUGATES

В некоторых вариантах осуществления, конъюгат представляет собой конъюгированный сахарид с односторонней связью, где сахарид ковалентно связан на одном конце сахарида с белком-носителем. В некоторых вариантах осуществления, односторонне-связанный конъюгированный полисахарид имеет концевой сахарид. Например, конъюгат является односторонне-связанным, если один из концов (концевой сахаридный остаток) полисахарида ковалентно связан с белком-носителем. В некоторых вариантах осуществления, конъюгат является односторонне-связанным, если концевой сахаридный остаток полисахарида ковалентно связан с белком-носителем через линкер. Такие линкеры могут включать, например, цистаминовый линкер (А1), 3,3'-дитиобис(пропановый дигидразидный) линкер (А4) и 2,2'-дитио-N,N'-бис(этан-2,1-диил)бис(2-(аминоокси)ацетамидный) линкер (А6).In some embodiments, the conjugate is a one-way bond conjugated saccharide, where the saccharide is covalently linked at one end of the saccharide to a carrier protein. In some embodiments, the one-way linked conjugated polysaccharide has a terminal saccharide. For example, a conjugate is one-way linked if one of the ends (terminal saccharide residue) of the polysaccharide is covalently linked to the carrier protein. In some embodiments, the conjugate is single-linked if the terminal saccharide residue of the polysaccharide is covalently linked to the carrier protein via a linker. Such linkers may include, for example, the cystamine linker (A1), the 3,3'-dithiobis(propane dihydrazide) linker (A4), and the 2,2'-dithio-N,N'-bis(ethane-2,1-diyl) bis(2-(aminooxy)acetamide) linker (A6).

В некоторых вариантах осуществления, сахарид конъюгирован с белком-носителем через остаток 3-дезокси-d-манно-окт-2-улозоновой кислоты (KDO) с образованием односторонне-связанного конъюгата. См., например, пример 26, пример 27, пример 28 и ФИГ. 17.In some embodiments, the saccharide is conjugated to a carrier protein via a 3-deoxy-d-manno-oct-2-ulosonic acid (KDO) residue to form a one-way conjugate. See, for example, Example 26, Example 27, Example 28 and FIG. 17.

В некоторых вариантах осуществления, конъюгат предпочтительно не является биоконъюгатом. Термин «биоконъюгат» относится к конъюгату между белком (например, белком-носителем) и антигеном, например, О-антигеном (например, О25В), полученным на фоне клетки-хозяина, где механизм клетки-хозяина связывает антиген с белком (например, N-ссылки). Гликоконъюгаты включают биоконъюгаты, а также конъюгаты сахарный антиген (например, олиго- и полисахариды)-белок, полученные способами, не требующими приготовления конъюгата в клетке-хозяине, например конъюгированием путем химической связи белка и сахарида.In some embodiments, the conjugate is preferably not a bioconjugate. The term "bioconjugate" refers to a conjugate between a protein (e.g., carrier protein) and an antigen, e.g., O-antigen (e.g., O25B) produced in a host cell background, wherein the host cell machinery couples the antigen to the protein (e.g., N -links). Glycoconjugates include bioconjugates as well as sugar antigen (eg, oligo- and polysaccharides)-protein conjugates produced by methods that do not require preparation of the conjugate in the host cell, such as conjugation by chemical coupling of protein and saccharide.

Тиолактивированные сахариды. В некоторых вариантах осуществления, сахарид по изобретению активирован тиолом. В таких вариантах осуществления, где сахарид активирован тиолом, доля (%) активации относится к молям тиола на сахаридную повторяющуюся единицу активированного полисахарида. Концентрации сахарида и тиола обычно определяют с помощью анализа Эллмана для количественного определения сульфгидрилов. Например, в некоторых вариантах осуществления, сахарид включает активацию 2-кето-3-дезоксиоктановой кислоты (KDO) дисульфид-аминовым линкером. См., например, пример 10 и ФИГ. 31. В некоторых вариантах осуществления, сахарид ковалентно связан с белком-носителем через двухвалентный гетеробифункциональный линкер (также называемый в настоящем документе «спейсером»). Линкер предпочтительно обеспечивает тиоэфирную связь между сахаридом и белком-носителем, что приводит к образованию гликоконъюгата, называемого в настоящем документе «тиоэфирным гликоконъюгатом». В некоторых вариантах осуществления, линкер дополнительно обеспечивает карбаматные и амидные связи, такие как, например, (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбамат (eTEC). См., например, Пример 21. Thiol-activated saccharides. In some embodiments, the saccharide of the invention is thiol activated. In such embodiments, where the saccharide is activated by a thiol, the fraction (%) of activation refers to the moles of thiol per saccharide repeating unit of the activated polysaccharide. Saccharide and thiol concentrations are typically determined using the Ellman assay to quantify sulfhydryls. For example, in some embodiments, the saccharide includes activation of 2-keto-3-deoxyoctanoic acid (KDO) with a disulfide-amine linker. See, for example, Example 10 and FIG. 31. In some embodiments, the saccharide is covalently linked to a carrier protein through a divalent heterobifunctional linker (also referred to herein as a “spacer”). The linker preferably provides a thioester linkage between the saccharide and the carrier protein, resulting in the formation of a glycoconjugate, referred to herein as a “thioether glycoconjugate.” In some embodiments, the linker further provides carbamate and amide linkages, such as, for example, (2-((2-oxoethyl)thio)ethyl)carbamate (eTEC). See, for example, Example 21.

В некоторых вариантах осуществления односторонне-связанный конъюгат включает белок-носитель и сахарид, где сахарид имеет структуру, выбранную из любой из Формулы O1 (например, Формулы O1A, Формулы O1B и Формулы O1C), Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4 (например, Формулы O4:K52 и Формулы O4:K6), Формулы O5 (например, Формулы O5ab и Формулы O5ac (штамм 180/C3)), Формулы O6 (например, Формулы O6:K2; K13; K15 и Формулы O6:K54), Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18 (например, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B и Формулы O18B1), Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23 (например, Формулы O23A), Формулы O24, Формулы O25 (например, Формулы O25a и Формулы O25b), Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45 (например, Формулы O45 и Формулы O45rel), Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы 62D₁, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73 (например, Формулы O73 (штамм 73-1)), Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186 и Формулы O187. В некоторых вариантах осуществления, сахарид в конъюгате включает Формулу, где n представляет собой целое число от 1 до 1000, от 5 до 1000, предпочтительно, от 31 до 100, более предпочтительно, от 35 до 90, наиболее предпочтительно, от 35 до 65.In some embodiments, the single-linked conjugate includes a carrier protein and a saccharide, where the saccharide has a structure selected from any of Formula O1 (e.g., Formula O1A, Formula O1B, and Formula O1C), Formula O2, Formula O3, Formula O4 (e.g., Formulas O4:K52 and Formulas O4:K6), Formulas O5 (for example, Formulas O5ab and Formulas O5ac (strain 180/C3)), Formulas O6 (for example, Formulas O6:K2; K13; K15 and Formulas O6:K54), Formulas O7, Formula O8, Formula O9, Formula O10, Formula O11, Formula O12, Formula O13, Formula O14, Formula O15, Formula O16, Formula O17, Formula O18 (e.g. Formula O18A, Formula O18ac, Formula O18A1, Formula O18B and Formula O18B1), Formula O19, Formula O20, Formula O21, Formula O22, Formula O23 (e.g. Formula O23A), Formula O24, Formula O25 (e.g. Formula O25a and Formula O25b), Formula O26, Formula O27, Formula O28, Formula O29 , Formulas O30, Formulas O32, Formulas O33, Formulas O34, Formulas O35, Formulas O36, Formulas O37, Formulas O38, Formulas O39, Formulas O40, Formulas O41, Formulas O42, Formulas O43, Formulas O44, Formulas O45 (for example, Formulas O45 and Formulas O45rel), Formulas O46, Formulas O48, Formulas O49, Formulas O50, Formulas O51, Formulas O52, Formulas O53, Formulas O54, Formulas O55, Formulas O56, Formulas O57, Formulas O58, Formulas O59, Formulas O60, Formulas O61, Formulas O62, Formulas 62D ₁ , Formulas O63, Formulas O64, Formulas O65, Formulas O66, Formulas O68, Formulas O69, Formulas O70, Formulas O71, Formulas O73 (for example, Formulas O73 (strain 73-1)), Formulas O74, Formulas O75, Formulas O76, Formulas O77, Formulas O78, Formulas O79, Formulas O80, Formulas O81, Formulas O82, Formulas O83, Formulas O84, Formulas O85, Formulas O86, Formulas O87, Formulas O88, Formulas O89, Formulas O90, Formulas O91, Formulas O92, Formulas O93, Formulas O95, Formulas O96, Formulas O97, Formulas O98, Formulas O99, Formulas O100, Formulas O101, Formulas O102, Formulas O103, Formulas O104, Formulas O105, Formulas O106, Formulas O107, Formulas O108, s O109 , Formulas O110, Formulas 0111, Formulas O112, Formulas O113, Formulas O114, Formulas O115, Formulas O116, Formulas O117, Formulas O118, Formulas O119, Formulas O120, Formulas O121, Formulas O123, Formulas O124, Formulas O125, Formulas O126, Formulas O127, Formulas O128, Formulas O129, Formulas O130, Formulas O131, Formulas O132, Formulas O133, Formulas O134, Formulas O135, Formulas O136, Formulas O137, Formulas O138, Formulas O139, Formulas O140, Formulas O141, Formulas O14 2, Formulas O143, Formulas O144, Formulas O145, Formulas O146, Formulas O147, Formulas O148, Formulas O149, Formulas O150, Formulas O151, Formulas O152, Formulas O153, Formulas O154, Formulas O155, Formulas O156, Formulas O157, Formulas O158, O159, Formulas O160 , Formulas O161, Formulas O162, Formulas O163, Formulas O164, Formulas O165, Formulas O166, Formulas O167, Formulas O168, Formulas O169, Formulas O170, Formulas O171, Formulas O172, Formulas O173, Formulas O174, Formulas O175, Formulas O176, Formulas O177, Formula O178, Formula O179, Formula O180, Formula O181, Formula O182, Formula O183, Formula O184, Formula O185, Formula O186 and Formula O187. In some embodiments, the saccharide in the conjugate includes Formula where n is an integer from 1 to 1000, from 5 to 1000, preferably from 31 to 100, more preferably from 35 to 90, most preferably from 35 to 65.

Например, в одном варианте осуществления, односторонне-связанный конъюгат включает белок-носитель и сахарид, имеющий структуру, выбранную из Формулы O8, Формулы O9a, Формулы O9, Формулы O20ab, Формулы O20ac, Формулы O52, Формулы O97 и Формулы O101, где n представляет собой целое число от 1 до 10.For example, in one embodiment, the single-linked conjugate includes a carrier protein and a saccharide having a structure selected from Formula O8, Formula O9a, Formula O9, Formula O20ab, Formula O20ac, Formula O52, Formula O97, and Formula O101, where n is is an integer from 1 to 10.

F. КОНЪЮГАТЫ eTECF. eTEC CONJUGATES

В одном аспекте, изобретение в целом относится к гликоконъюгатам, содержащим сахарид, полученный из описанной выше E. coli, ковалентно конъюгированный с белком-носителем через спейсер (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбамат (eTEC) (как описано, например, в патенте США 9517274 и публикации международной патентной заявки WO 2014027302, полностью включенных в настоящее описание посредством ссылки), включая иммуногенные композиции, содержащие такие гликоконъюгаты, и способы получения и применения таких гликоконъюгатов и иммуногенных композиций. Указанные гликоконъюгаты содержат сахарид, ковалентно конъюгированный со спейсером eTEC через один или несколько спейсеров eTEC, где сахарид ковалентно конъюгирован со спейсером eTEC посредством карбаматной связи, и где белок-носитель ковалентно конъюгирован со спейсером eTEC посредством амидной связи. Спейсер eTEC включает семь линейных атомов (т.е. -C(O)NH(CH₂)₂SCH₂C(O)-) и обеспечивает стабильные тиоэфирные и амидные связи между сахаридом и белком-носителем.In one aspect, the invention generally relates to glycoconjugates containing a saccharide derived from E. coli described above, covalently conjugated to a carrier protein through a spacer (2-((2-oxoethyl)thio)ethyl)carbamate (eTEC) (as described eg, US Pat. No. 9,517,274 and International Patent Application Publication WO 2014027302, incorporated herein by reference in their entirety), including immunogenic compositions containing such glycoconjugates, and methods for making and using such glycoconjugates and immunogenic compositions. Said glycoconjugates comprise a saccharide covalently conjugated to an eTEC spacer via one or more eTEC spacers, where the saccharide is covalently conjugated to an eTEC spacer via a carbamate bond, and where the carrier protein is covalently conjugated to an eTEC spacer via an amide bond. The eTEC spacer contains seven linear atoms (ie -C(O)NH(CH ₂ ) ₂ SCH ₂ C(O)-) and provides stable thioester and amide bonds between the saccharide and the carrier protein.

Гликоконъюгаты, связанные с eTEC, по изобретению могут быть представлены общей формулой (I):The eTEC-linked glycoconjugates of the invention may be represented by the general formula (I):

где атомы, составляющие спейсер eTEC, содержатся в центральной рамке.where the atoms that make up the eTEC spacer are contained in the central frame.

В указанных гликоконъюгатах по изобретению сахарид может представлять собой полисахарид или олигосахарид.In said glycoconjugates of the invention, the saccharide may be a polysaccharide or an oligosaccharide.

Белки-носители, включенные в гликоконъюгаты по изобретению, выбраны из группы белков-носителей, обычно подходящих для таких целей, как описано в настоящем документе далее или известно специалистам в данной области техники. В конкретных вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.The carrier proteins included in the glycoconjugates of the invention are selected from the group of carrier proteins generally suitable for such purposes, as described hereinafter or known to those skilled in the art. In specific embodiments, the carrier protein is CRM ₁₉₇ .

В другом аспекте, изобретение предлагает способ получения гликоконъюгата, содержащего сахарид, описанный в настоящем документе, конъюгированного с белком-носителем через спейсер eTEC, включающий стадии а) реакции сахарида с производным угольной кислоты в органическом растворителе с получением активированного сахарида; b) взаимодействие активированного сахарида с цистамином или цистеамином или их солью с получением тиолированного сахарида; c) взаимодействие тиолированного сахарида с восстанавливающим агентом с получением активированного тиолированного сахарида, содержащего один или несколько свободных сульфгидрильных остатков; d) взаимодействие активированного тиолированного сахарида с активированным белком-носителем, содержащим одну или несколько α-галогенацетамидных групп, с получением конъюгата тиолированный сахарид-белок-носитель; и e) взаимодействие конъюгата тиолированный сахарид-белок-носитель с (i) первым кэпирующим реагентом, способным кэпировать неконъюгированные α-галогенацетамидные группы активированного белка-носителя; и/или (ii) вторым кэпирующим реагентом, способным кэпировать неконъюгированные свободные сульфгидрильные остатки активированного тиолированного сахарида; в результате чего образуется гликоконъюгат, связанный с eTEC.In another aspect, the invention provides a method for producing a glycoconjugate containing a saccharide described herein conjugated to a carrier protein through an eTEC spacer, comprising the steps of a) reacting the saccharide with a carbonic acid derivative in an organic solvent to produce an activated saccharide; b) reacting the activated saccharide with cystamine or cysteamine or a salt thereof to produce a thiolated saccharide; c) reacting the thiolated saccharide with a reducing agent to produce an activated thiolated saccharide containing one or more free sulfhydryl residues; d) reacting the activated thiolated saccharide with an activated carrier protein containing one or more α-haloacetamide groups to produce a thiolated saccharide-carrier protein conjugate; and e) reacting the thiolated saccharide-carrier protein conjugate with (i) a first capping reagent capable of capping unconjugated α-haloacetamide groups of the activated carrier protein; and/or (ii) a second capping reagent capable of capping unconjugated free sulfhydryl moieties of the activated thiolated saccharide; resulting in the formation of a glycoconjugate associated with eTEC.

В частых вариантах осуществления, производное угольной кислоты представляет собой 1,1'-карбонил-ди-(1,2,4-триазол) (CDT) или 1,1'-карбонилдиимидазол (CDI). Предпочтительно, производное угольной кислоты представляет собой CDT, и органический растворитель представляет собой полярный апротонный растворитель, такой как диметилсульфоксид (ДМСО). В предпочтительных вариантах осуществления, тиолированный сахарид получают реакцией активированного сахарида с бифункциональным симметричным тиоалкиламиновым реагентом, цистамином или его солью. Альтернативно, тиолированный сахарид может быть образован реакцией активированного сахарида с цистеамином или его солью. Гликоконъюгаты, связанные с eTEC, полученные способами по изобретению, могут быть представлены общей формулой (I).In frequent embodiments, the carbonic acid derivative is 1,1'-carbonyl-di-(1,2,4-triazole) (CDT) or 1,1'-carbonyldiimidazole (CDI). Preferably, the carbonic acid derivative is CDT, and the organic solvent is a polar aprotic solvent such as dimethyl sulfoxide (DMSO). In preferred embodiments, the thiolated saccharide is prepared by reacting the activated saccharide with a bifunctional symmetric thioalkylamine reagent, cystamine or a salt thereof. Alternatively, the thiolated saccharide may be formed by reacting the activated saccharide with cysteamine or a salt thereof. Glycoconjugates associated with eTEC obtained by the methods of the invention can be represented by the general formula (I).

В частых вариантах осуществления, первым кэпирующим реагентом является N-ацетил-L-цистеин, который реагирует с неконъюгированными α-галогенацетамидными группами на остатках лизина белка-носителя с образованием остатка S-карбоксиметилцистеина (СМС), ковалентно связанного с активированным остатком лизина через тиоэфирную связь.In frequent embodiments, the first capping reagent is N-acetyl-L-cysteine, which reacts with unconjugated α-haloacetamide groups on lysine residues of the carrier protein to form an S-carboxymethylcysteine (CMC) residue covalently linked to the activated lysine residue via a thioester bond .

В других вариантах осуществления, второй кэпирующий реагент представляет собой йодацетамид (IAA), который взаимодействует с неконъюгированными свободными сульфгидрильными группами активированного тиолированного сахарида с получением кэпированного тиоацетамида. Часто стадия е) включает кэпирование как первым кэпирующим реагентом, так и вторым кэпирующим реагентом. В некоторых вариантах осуществления, стадия e) включает кэпирование с помощью N-ацетил-L-цистеина в качестве первого кэпирующего реагента и IAA в качестве второго кэпирующего реагента.In other embodiments, the second capping reagent is iodoacetamide (IAA), which reacts with the unconjugated free sulfhydryl groups of the activated thiolated saccharide to produce capped thioacetamide. Often step e) involves capping with both a first capping reagent and a second capping reagent. In some embodiments, step e) includes capping with N-acetyl-L-cysteine as the first capping reagent and IAA as the second capping reagent.

В некоторых вариантах осуществления, стадия кэпирования e) дополнительно включает реакцию с восстанавливающим агентом, например, DTT, TCEP или меркаптоэтанолом, после реакции с первым и/или вторым реагентом кэпирования.In some embodiments, capping step e) further includes reacting with a reducing agent, for example, DTT, TCEP or mercaptoethanol, after reacting with the first and/or second capping reagent.

Гликоконъюгаты, связанные с eTEC, и иммуногенные композиции по изобретению могут включать свободные сульфгидрильные остатки. В некоторых случаях, активированные тиолированные сахариды, образованные способами, предложенными в настоящем документе, будут включать несколько свободных сульфгидрильных остатков, некоторые из которых могут не подвергаться ковалентной конъюгации с белком-носителем на стадии конъюгации. Такие остаточные свободные сульфгидрильные остатки кэпируются реакцией с атиол-реактивным блокирующим реагентом, например, йодацетамидом (IAA), для блокирования потенциально реакционноспособной функциональной группы. Другие тиол-реакционноспособные кэпирующие реагенты, например малеимидсодержащие реагенты и подобные, также рассматриваются.The eTEC-linked glycoconjugates and immunogenic compositions of the invention may include free sulfhydryl moieties. In some cases, activated thiolated saccharides formed by the methods proposed herein will include several free sulfhydryl residues, some of which may not be covalently conjugated to the carrier protein during the conjugation step. Such residual free sulfhydryl moieties are capped by reaction with an thiol-reactive blocking reagent, such as iodoacetamide (IAA), to block the potentially reactive functional group. Other thiol-reactive capping reagents, such as maleimide-containing reagents and the like, are also contemplated.

Кроме того, гликоконъюгаты, связанные с eTEC, и иммуногенные композиции по изобретению могут включать остаточный неконъюгированный белок-носитель, который может включать активированный белок-носитель, который претерпел модификацию во время стадий процесса кэпирования.In addition, the eTEC-linked glycoconjugates and immunogenic compositions of the invention may include residual unconjugated carrier protein, which may include an activated carrier protein that has undergone modification during the capping process steps.

В некоторых вариантах осуществления, стадия d) дополнительно включает получение активированного белка-носителя, содержащего одну или несколько α-галогенацетамидных групп, перед реакцией активированного тиолированного сахарида с активированным белком-носителем. В частых вариантах осуществления, активированный белок-носитель содержит одну или несколько α-бромацетамидных групп.In some embodiments, step d) further comprises providing an activated carrier protein containing one or more α-haloacetamide groups before reacting the activated thiolated saccharide with the activated carrier protein. In frequent embodiments, the activated carrier protein contains one or more α-bromoacetamide groups.

В другом аспекте, изобретение относится к гликоконъюгату, связанному с eTEC, содержащему описанный в настоящем документе сахарид, конъюгированный с белком-носителем через спейсер eTEC, полученный в соответствии с любым из описанных в настоящем документе способов.In another aspect, the invention provides an eTEC-linked glycoconjugate comprising a saccharide described herein conjugated to a carrier protein via an eTEC spacer prepared in accordance with any of the methods described herein.

В некоторых вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇, и ковалентная связь через спейсер eTEC между CRM₁₉₇ и полисахаридом происходит, по меньшей мере, один раз в каждых 4, 10, 15 или 25 сахаридных повторяющихся единицах полисахарида.In some embodiments, the carrier protein is CRM ₁₉₇ , and covalent linkage through an eTEC spacer between CRM ₁₉₇ and the polysaccharide occurs at least once in every 4, 10, 15, or 25 saccharide repeat units of the polysaccharide.

Для каждого из аспектов изобретения, в конкретных вариантах осуществления способов и композиций, описанных в настоящем документе, гликоконъюгат, связанный с eTEC, содержит сахарид, описанный в настоящем документе, например, сахарид, полученный из E. coli. For each aspect of the invention, in particular embodiments of the methods and compositions described herein, the eTEC-linked glycoconjugate contains a saccharide described herein, for example, a saccharide derived from E. coli.

В другом аспекте, изобретение предлагает способ профилактики, лечения или облегчения бактериальной инфекции, заболевания или состояния у субъекта, включающий введение субъекту иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции по изобретению, где указанная иммуногенная композиция содержит связанный с eTEC гликоконъюгат, содержащий описанный в настоящем документе сахарид. В некоторых вариантах осуществления, сахарид получают из E. coli. In another aspect, the invention provides a method of preventing, treating, or ameliorating a bacterial infection, disease, or condition in a subject, comprising administering to the subject an immunologically effective amount of an immunogenic composition of the invention, wherein said immunogenic composition comprises an eTEC-linked glycoconjugate containing a saccharide described herein. In some embodiments, the saccharide is derived from E. coli.

В некоторых вариантах осуществления, гликоконъюгат, связанный с eTEC, содержит белок-носитель и сахарид, в котором указанный сахарид имеет структуру, выбранную из Формулы O1 (например, Формулы O1A, Формулы O1B и Формулы O1C), Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4 (например, Формулы O4:K52 and Формулы O4:K6), Формулы O5 (например, Формулы O5ab и Формулы O5ac (штамм 180/C3)), Формулы O6 (например, Формулы O6:K2; K13; K15 и Формулы O6:K54), Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18 (например, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B и Формулы O18B1), Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23 (например, Формулы O23A), Формулы O24, Формулы O25 (например, Формулы O25a и Формулы O25b), Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45 (например, Формулы O45 и Формулы O45rel), Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы 62D₁, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73 (например, Формулы O73 (штамм 73-1)), Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186 и Формулы O187. В некоторых вариантах осуществления, сахарид в конъюгате включает Формулу, где n представляет собой целое число от 1 до 1000, от 5 до 1000, предпочтительно, от 31 до 100, более предпочтительно, от 35 до 90, наиболее предпочтительно, от 35 до 65.In some embodiments, the eTEC-linked glycoconjugate contains a carrier protein and a saccharide, wherein said saccharide has a structure selected from Formula O1 (e.g., Formula O1A, Formula O1B, and Formula O1C), Formula O2, Formula O3, Formula O4 (for example, Formulas O4:K52 and Formulas O4:K6), Formulas O5 (for example, Formulas O5ab and Formulas O5ac (strain 180/C3)), Formulas O6 (for example, Formulas O6:K2; K13; K15 and Formulas O6:K54 ), Formulas O7, Formulas O8, Formulas O9, Formulas O10, Formulas O11, Formulas O12, Formulas O13, Formulas O14, Formulas O15, Formulas O16, Formulas O17, Formulas O18 (for example, Formulas O18A, Formulas O18ac, Formulas O18A1, Formulas O18B and O18B1 Formulas), O19 Formulas, O20 Formulas, O21 Formulas, O22 Formulas, O23 Formulas (e.g. O23A Formulas), O24 Formulas, O25 Formulas (e.g. O25a Formulas and O25b Formulas), O26 Formulas, O27 Formulas, O28 Formulas , Formulas O29, Formulas O30, Formulas O32, Formulas O33, Formulas O34, Formulas O35, Formulas O36, Formulas O37, Formulas O38, Formulas O39, Formulas O40, Formulas O41, Formulas O42, Formulas O43, Formulas O44, Formulas O45 (for example , Formulas O45 and Formulas O45rel), Formulas O46, Formulas O48, Formulas O49, Formulas O50, Formulas O51, Formulas O52, Formulas O53, Formulas O54, Formulas O55, Formulas O56, Formulas O57, Formulas O58, Formulas O59, Formulas O60, Formulas O61, Formulas O62, Formulas 62D ₁ , Formulas O63, Formulas O64, Formulas O65, Formulas O66, Formulas O68, Formulas O69, Formulas O70, Formulas O71, Formulas O73 (for example, Formulas O73 (strain 73-1)), Formulas O74, Formulas O75, Formulas O76, Formulas O77, Formulas O78, Formulas O79, Formulas O80, Formulas O81, Formulas O82, Formulas O83, Formulas O84, Formulas O85, Formulas O86, Formulas O87, Formulas O88, Formulas O89, Formulas O90, Formulas O91, Formulas O92, Formulas O93, Formulas O96, Formulas O97, Formulas O98, Formulas O99, Formulas O100, Formulas O101, Formulas O102, Formulas O103, Formulas O104, Formulas O105, Formulas O106, Formulas O107, O108 , Formulas O109, Formulas O110, Formulas 0111, Formulas O112, Formulas O113, Formulas O114, Formulas O115, Formulas O116, Formulas O117, Formulas O118, Formulas O119, Formulas O120, Formulas O121, Formulas O123, Formulas O124, Formulas O125, Formulas O126, Formulas O127, Formulas O128, Formulas O129, Formulas O130, Formulas O131, Formulas O132, Formulas O133, Formulas O134, Formulas O135, Formulas O136, Formulas O137, Formulas O138, Formulas O139, Formulas O140, Formulas O14 1, Formula O142, Formulas O143, Formulas O144, Formulas O145, Formulas O146, Formulas O147, Formulas O148, Formulas O149, Formulas O150, Formulas O151, Formulas O152, Formulas O153, Formulas O154, Formulas O155, Formulas O156, Formulas O157, O158, Formulas O159 , Formulas O160, Formulas O161, Formulas O162, Formulas O163, Formulas O164, Formulas O165, Formulas O166, Formulas O167, Formulas O168, Formulas O169, Formulas O170, Formulas O171, Formulas O172, Formulas O173, Formulas O174, Formulas O175, Formulas Formula O176, Formula O177, Formula O178, Formula O179, Formula O180, Formula O181, Formula O182, Formula O183, Formula O184, Formula O185, Formula O186 and Formula O187. In some embodiments, the saccharide in the conjugate includes Formula where n is an integer from 1 to 1000, from 5 to 1000, preferably from 31 to 100, more preferably from 35 to 90, most preferably from 35 to 65.

Количество лизиновых остатков в белке-носителе, которые становятся конъюгированными с сахаридом, можно охарактеризовать как диапазон конъюгированных лизинов. Например, в некоторых вариантах осуществления иммуногенных композиций, CRM₁₉₇ может содержать от 4 до 16 лизиновых остатков из 39, ковалентно связанных с сахаридом. Другой способ выражения этого параметра состоит в том, что примерно от 10% до примерно 41% лизинов CRM₁₉₇ ковалентно связаны с сахаридом. В других вариантах осуществления, CRM₁₉₇ может содержать от 2 до 20 лизиновых остатков из 39, ковалентно связанных с сахаридом. Другой способ выражения этого параметра заключается в том, что примерно от 5% до примерно 50% лизинов CRM₁₉₇ ковалентно связаны с сахаридом.The number of lysine residues in a carrier protein that become conjugated to a saccharide can be described as the conjugated lysine range. For example, in some embodiments of immunogenic compositions, CRM ₁₉₇ may contain from 4 to 16 of the 39 lysine residues covalently linked to the saccharide. Another way of expressing this parameter is that from about 10% to about 41% of the lysines of CRM ₁₉₇ are covalently linked to the saccharide. In other embodiments, CRM ₁₉₇ may contain from 2 to 20 of the 39 lysine residues covalently linked to the saccharide. Another way of expressing this parameter is that from about 5% to about 50% of the lysines of CRM ₁₉₇ are covalently linked to the saccharide.

В частых вариантах осуществления, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇, и ковалентная связь через спейсер eTEC между CRM₁₉₇ и полисахаридом происходит, по меньшей мере, один раз в каждых 4, 10, 15 или 25 сахаридных повторяющихся единицах полисахарида.In frequent embodiments, the carrier protein is CRM ₁₉₇ , and covalent linkage through the eTEC spacer between CRM ₁₉₇ and the polysaccharide occurs at least once in every 4, 10, 15, or 25 saccharide repeat units of the polysaccharide.

В других вариантах осуществления, конъюгат содержит, по меньшей мере, одну ковалентную связь между белком-носителем и сахаридом на каждые 5-10 повторяющихся единиц сахарида; каждые 2-7 повторяющихся единиц сахарида; каждые 3-8 повторяющихся единиц сахарида; каждые 4-9 повторяющихся единиц сахарида; каждые 6-11 повторяющихся единиц сахарида; каждые 7-12 повторяющихся единиц сахарида; каждые 8-13 повторяющихся единиц сахарида; каждые 9-14 повторяющихся единиц сахарида; каждые 10-15 повторяющихся единиц сахарида; каждые 2-6 повторяющихся единиц сахарида, каждые 3-7 повторяющихся единиц сахарида; каждые 4-8 повторяющихся единиц сахарида; каждые 6-10 повторяющихся единиц сахарида; каждые 7-11 повторяющихся единиц сахарида; каждые 8-12 повторяющихся единиц сахарида; каждые 9-13 повторяющихся единиц сахарида; каждые 10-14 повторяющихся единиц сахарида; каждые 10-20 повторяющихся единиц сахарида; или каждые 4-25 повторяющихся единиц сахарида.In other embodiments, the conjugate contains at least one covalent bond between the carrier protein and the saccharide for every 5-10 saccharide repeat units; every 2-7 repeating units of saccharide; every 3-8 repeating saccharide units; every 4-9 repeating units of saccharide; every 6-11 repeating units of saccharide; every 7-12 repeating saccharide units; every 8-13 repeating saccharide units; every 9-14 repeating units of saccharide; every 10-15 repeating units of saccharide; every 2-6 repeating saccharide units, every 3-7 repeating saccharide units; every 4-8 repeating units of saccharide; every 6-10 repeating saccharide units; every 7-11 repeating units of saccharide; every 8-12 repeating units of saccharide; every 9-13 repeating units of saccharide; every 10-14 repeating units of saccharide; every 10-20 repeating units of saccharide; or every 4-25 repeating saccharide units.

В другом варианте осуществления, по меньшей мере, одна связь между белком-носителем и сахаридом возникает на каждые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 повторяющихся единиц сахарида полисахарида.In another embodiment, at least one bond occurs between the carrier protein and the saccharide every 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, or 25 repeating polysaccharide saccharide units.

G. БЕЛКИ-НОСИТЕЛИG. CARRIER PROTEINS

Компонент гликоконъюгата по изобретению представляет собой белок-носитель, с которым конъюгирован сахарид. Термины «белок-носитель» или «белок-носитель» или «носитель» могут использоваться в настоящем документе взаимозаменяемо. Белки-носители должны поддаваться стандартным процедурам конъюгации.The glycoconjugate component of the invention is a carrier protein to which a saccharide is conjugated. The terms "carrier protein" or "carrier protein" or "carrier" may be used interchangeably herein. Carrier proteins must be amenable to standard conjugation procedures.

Одним из компонентов конъюгата является белок-носитель, с которым конъюгирован О-полисахарид. В одном варианте осуществления, конъюгат включает белок-носитель, конъюгированный с сердцевинным олигосахаридом О-полисахарида (см. ФИГ. 24). В одном варианте осуществления, конъюгат включает белок-носитель, конъюгированный с О-антигеном О-полисахарида.One of the components of the conjugate is a carrier protein to which the O-polysaccharide is conjugated. In one embodiment, the conjugate includes a carrier protein conjugated to a core O-polysaccharide oligosaccharide (see FIG. 24). In one embodiment, the conjugate includes a carrier protein conjugated to the O-antigen of the O-polysaccharide.

Термины «белок-носитель» или «белок-носитель» или «носитель» могут использоваться в настоящем документе взаимозаменяемо. Белки-носители должны поддаваться стандартным процедурам конъюгации.The terms "carrier protein" or "carrier protein" or "carrier" may be used interchangeably herein. Carrier proteins must be amenable to standard conjugation procedures.

В предпочтительном варианте осуществления, белок-носитель конъюгатов независимо выбран из любого одного из мутантов TT, DT, DT (таких как CRM₁₉₇), белка D H.influenzae, слитых белков PhtX, PhtD, PhtDE (в частности, описанных в WO 01/98334 и WO 03/54007), детоксицированного пневмолизина, PorB, белка N19, PspA, OMPC, токсина A или B C. Difficile и PsaA. В одном варианте осуществления, белок-носитель конъюгатов по изобретению представляет собой DT (дифтерийный анатоксин). В другом варианте осуществления, белок-носитель конъюгатов по изобретению представляет собой ТТ (столбнячный анатоксин). В другом варианте осуществления, белок-носитель конъюгатов по изобретению представляет собой PD (белок D Haemophilus influenzae - см., например, ЕР 0 594 610 В). В некоторых вариантах осуществления, белок-носитель включает поли(L-лизин) (PLL). В другом варианте осуществления, белком-носителем конъюгатов по изобретению является SCP (стрептококковая пептидаза C5a) (Brown, C.K. et al., 2005, PNAS 102(51): 18391-18396).In a preferred embodiment, the conjugate carrier protein is independently selected from any one of TT, DT, DT mutants (such as CRM ₁₉₇ ), H. influenzae D protein, PhtX, PhtD, PhtDE fusion proteins (particularly those described in WO 01/ 98334 and WO 03/54007), detoxified pneumolysin, PorB, N19 protein, PspA, OMPC, C. Difficile toxin A or B and PsaA. In one embodiment, the carrier protein of the conjugates of the invention is DT (diphtheria toxoid). In another embodiment, the carrier protein of the conjugates of the invention is TT (tetanus toxoid). In another embodiment, the carrier protein of the conjugates of the invention is PD (Protein D of Haemophilus influenzae - see, for example, EP 0 594 610 B). In some embodiments, the carrier protein includes poly(L-lysine) (PLL) . In another embodiment, the carrier protein of the conjugates of the invention is SCP (streptococcal C5a peptidase) (Brown, CK et al., 2005, PNAS 102(51): 18391-18396).

В предпочтительном варианте осуществления, сахариды конъюгированы с белком CRM₁₉₇. Белок CRM₁₉₇ представляет собой нетоксичную форму дифтерийного токсина, но иммунологически неотличим от дифтерийного токсина. CRM₁₉₇ продуцируется C. diphtheriae, инфицированным нетоксигенным фагом β197tox, созданным в результате нитрозогуанидинового мутагенеза токсигенного коринефага бета. Белок CRM₁₉₇ имеет ту же молекулярную массу, что и дифтерийный токсин, но отличается от него одной заменой основания (гуанин на аденин) в структурном гене. Это единственное изменение основания вызывает аминокислотную замену глицина на глутаминовую кислоту в зрелом белке и устраняет токсические свойства дифтерийного токсина. Белок CRM₁₉₇ является безопасным и эффективным носителем сахаридов, зависящим от Т-клеток.In a preferred embodiment, the saccharides are conjugated to the CRM ₁₉₇ protein. The CRM ₁₉₇ protein is a nontoxic form of diphtheria toxin but is immunologically indistinguishable from diphtheria toxin. CRM ₁₉₇ is produced by C. diphtheriae infected with the nontoxigenic phage β197tox, generated by nitrosoguanidine mutagenesis of the toxigenic corynephage beta. The CRM ₁₉₇ protein has the same molecular weight as diphtheria toxin, but differs from it by one base substitution (guanine to adenine) in the structural gene. This single base change causes the amino acid substitution of glycine for glutamic acid in the mature protein and eliminates the toxic properties of diphtheria toxin. CRM ₁₉₇ protein is a safe and effective T cell-dependent saccharide carrier.

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления, конъюгаты по изобретению включают CRM₁₉₇ в качестве белка-носителя, где сахарид ковалентно связан с CRM₁₉₇.Accordingly, in some embodiments, the conjugates of the invention include CRM ₁₉₇ as a carrier protein, wherein the saccharide is covalently linked to CRM ₁₉₇ .

В предпочтительном варианте осуществления, белок-носитель гликоконъюгатов выбран из группы, состоящей из DT (дифтерийного токсина), TT (столбнячного анатоксина) или фрагмента C из TT, CRM197 (нетоксичного, но антигенно идентичного варианта дифтерийного токсина), других мутантов DT (таких как CRM176, CRM228, CRM 45 (Uchida et al. J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973), CRM9, CRM45, CRM102, CRM103 или CRM107; и другие мутации, описанные Nicholls and Youle in Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; делеции или мутации Glu-148 в Asp, Gln или Ser и/или Ala 158 в GIy и другие мутации, описанные в US 4709017 или US 4950740; мутации, по меньшей мере, одного или нескольких остатков Lys 516, Lys 526, Phe 530 и/или Lys 534 и другие мутации, описанные в US 5917017 или US 6455673; или фрагмент, описанный в US 5843711), пневмококкового пневмолизина (Kuo et al (1995) Infect lmmun 63; 2706-13) включая детоксицированный каким-либо образом слой, например, dPLY-GMBS (WO 04081515, PCT/EP2005/010258) или dPLY-формол, PhtX, включая PhtA, PhtB, PhtD, PhtE (последовательности PhtA, PhtB, PhtD или PhtE описаны в WO 00/37105 или WO 00/39299) и слияния белков Pht, например слияния PhtDE, слияния PhtBE, Pht AE (WO 01/98334, WO 03/54007, WO 2009/000826), OMPC (менингококкового белка наружной мембраны - обычно экстрагируется из N. meningitidis серогруппы B - EP0372501), PorB (из N. meningitidis), PD (белок Haemophilus influenzae D - см., например, ЕР 0594610 В) или их иммунологически функциональных эквивалентов, синтетических пептидов (ЕР0378881, ЕР0427347), белков теплового шока (WO 93/17712, WO 94/03208), белков коклюша (WO 98/58668, ЕР0471177), цитокинов, лимфокинов, факторов роста или гормонов (WO 91/01146), искусственных белков, содержащих множественные CD4+ Т-клеточные эпитопы человека из различных антигенов, происходящих от патогенов (Falugi et al (2001) Eur J Immunol 31; 3816-3824), например белка N19 (Baraldoi et al. (2004) Infect lmmun 72; 4884-7), поверхностного белка пневмококка PspA (WO 02/091998), белков, поглощающих железо (WO 01/72337), токсина A или B или C. difficile (WO 00/61761), трансферрин-связывающих белков, белка пневмококковой адгезии (PsaA), рекомбининатного экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa (в частности, его нетоксических мутантов (таких как экзотоксин A, несущий замену на глутаминовой кислоте 553 (Uchida Cameron DM, RJ Collier. 1987. J. Bacteriol. 169:4967-4971)). Другие белки, такие как овальбумин, гемоцианин лимфы улитки (KLH), бычий сывороточный альбумин (BSA) или очищенное белковое производное туберкулина (PPD), также могут быть использованы в качестве белков-носителей. Другие подходящие белки-носители включают инактивированные бактериальные токсины, такие как холерный анатоксин (например, как описано в международной патентной заявке № WO 2004/083251), E.coli LT, E.coli ST и экзотоксин A из Pseudomonas aeruginosa. In a preferred embodiment, the glycoconjugate carrier protein is selected from the group consisting of DT (diphtheria toxin), TT (tetanus toxoid) or fragment C of TT, CRM197 (a non-toxic but antigenically identical variant of diphtheria toxin), other DT mutants (such as CRM176, CRM228, CRM 45 (Uchida et al. J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973), CRM9, CRM45, CRM102, CRM103 or CRM107 and other mutations described by Nicholls and Youle in Genetically Engineered Toxins, Ed; : Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; deletions or mutations of Glu-148 in Asp, Gln or Ser and/or Ala 158 in GIy and other mutations described in US 4709017 or US 4950740 mutations of at least one or more residues; Lys 516, Lys 526, Phe 530 and/or Lys 534 and other mutations described in US 5917017 or US 6455673; or fragment described in US 5843711), pneumococcal pneumolysin (Kuo et al (1995) Infect lmmun 63; 2706-13 ) including a layer detoxified in some way, for example, dPLY-GMBS (WO 04081515, PCT/EP2005/010258) or dPLY-formol, PhtX, including PhtA, PhtB, PhtD, PhtE (the sequences of PhtA, PhtB, PhtD or PhtE are described in WO 00/37105 or WO 00/39299) and Pht protein fusions, e.g. PhtDE fusions, PhtBE fusions, Pht AE (WO 01/98334, WO 03/54007, WO 2009/000826), OMPC (meningococcal outer membrane protein - usually extracted from N. meningitidis serogroup B - EP0372501), PorB (from N. meningitidis), PD (Haemophilus influenzae protein D - see, for example, EP 0594610 B) or their immunologically functional equivalents, synthetic peptides (EP0378881, EP0427347), heat proteins shock (WO 93/17712, WO 94/03208), pertussis proteins (WO 98/58668, EP0471177), cytokines, lymphokines, growth factors or hormones (WO 91/01146), artificial proteins containing multiple human CD4+ T-cell epitopes from various pathogen-derived antigens (Falugi et al (2001) Eur J Immunol 31; 3816-3824), for example N19 protein (Baraldoi et al. (2004) Infect lmmun 72; 4884-7), pneumococcal surface protein PspA (WO 02/091998), iron uptake proteins (WO 01/72337), toxin A or B or C. difficile (WO 00/61761), transferrin-binding proteins, pneumococcal adhesion protein (PsaA), recombinant exotoxin A of Pseudomonas aeruginosa (in particular, its non-toxic mutants (such as exotoxin A carrying a substitution on glutamic acid 553 (Uchida Cameron DM, RJ Collier. 1987. J. Bacteriol. 169:4967-4971)). can be used as carrier proteins. Other suitable carrier proteins include inactivated bacterial toxins such as cholera toxoid (eg, as described in international patent application No. WO 2004/083251), E. coli LT, E. coli ST and exotoxin. A from Pseudomonas aeruginosa.

В некоторых вариантах осуществления, белок-носитель выбран из любого из, например, CRM₁₉₇, фрагмента B дифтерийного токсина (DTFB), DTFB C8, дифтерийного анатоксина (DT), столбнячного анатоксина (TT), фрагмента C из TT, коклюшного анатоксина, холерного анатоксина или экзотоксина А из Pseudomonas aeruginosa; детоксицированного экзотоксина A P. aeruginosa (EPA), белка, связывающего мальтозу (MBP), флагеллина, детоксицированного гемолизина A S. aureus, фактора слипания A, фактора слипания B, субъединицы холерного токсина B (CTB), пневмолизина Streptococcus pneumoniae и его детоксицированных вариантов, C. jejuni AcrA и природных гликопротеинов C. jejuni. В одном варианте осуществления, белок-носитель представляет собой детоксицированный экзотоксин Pseudomonas (EPA). В другом варианте осуществления, белок-носитель представляет собой не детоксицированный экзотоксин Pseudomonas (EPA). В одном варианте осуществления, белок-носитель представляет собой флагеллин. В другом варианте осуществления, белок-носитель не является флагеллином.In some embodiments, the carrier protein is selected from any of, for example, CRM ₁₉₇ , diphtheria toxin fragment B (DTFB), DTFB C8, diphtheria toxoid (DT), tetanus toxoid (TT), TT fragment C, pertussis toxoid, cholera toxoid or exotoxin A from Pseudomonas aeruginosa; detoxified P. aeruginosa exotoxin A (EPA), maltose binding protein (MBP), flagellin, detoxified S. aureus hemolysin A, clumping factor A, clumping factor B, cholera toxin subunit B (CTB), Streptococcus pneumoniae pneumolysin and its detoxified variants , C. jejuni AcrA and natural glycoproteins of C. jejuni. In one embodiment, the carrier protein is a detoxified Pseudomonas exotoxin (EPA). In another embodiment, the carrier protein is an undetoxified Pseudomonas exotoxin (EPA). In one embodiment, the carrier protein is flagellin. In another embodiment, the carrier protein is not flagellin.

В предпочтительном варианте осуществления, белок-носитель гликоконъюгатов независимо выбран из группы, состоящей из мутантов ТТ, DT, DT (таких как CRM₁₉₇), белка D H. influenzae, слияний PhtX, PhtD, PhtDE (в частности, описанных в WO 01/98334 и WO 03/54007), детоксицированного пневмолизина, PorB, белка N19, PspA, OMPC, токсина A или B C. Difficile и PsaA. В одном варианте осуществления, белок-носитель гликоконъюгатов по изобретению представляет собой DT (дифтерийный анатоксин). В другом варианте осуществления, белок-носитель гликоконъюгатов по изобретению представляет собой ТТ (столбнячный анатоксин). В другом варианте осуществления, белок-носитель гликоконъюгатов по изобретению представляет собой PD (белок D Haemophilus influenzae - см., например, ЕР 0 594 610 В).In a preferred embodiment, the glycoconjugate carrier protein is independently selected from the group consisting of TT, DT, DT mutants (such as CRM ₁₉₇ ), H. influenzae D protein, PhtX, PhtD, PhtDE fusions (particularly those described in WO 01/ 98334 and WO 03/54007), detoxified pneumolysin, PorB, N19 protein, PspA, OMPC, C. Difficile toxin A or B and PsaA. In one embodiment, the carrier protein of the glycoconjugates of the invention is DT (diphtheria toxoid). In another embodiment, the carrier protein of the glycoconjugates of the invention is TT (tetanus toxoid). In another embodiment, the carrier protein of the glycoconjugates of the invention is PD (Protein D of Haemophilus influenzae - see, for example, EP 0 594 610 B).

В предпочтительном варианте осуществления, капсульные сахариды по изобретению конъюгированы с белком CRM₁₉₇. Белок CRM₁₉₇ представляет собой нетоксичную форму дифтерийного токсина, но иммунологически неотличим от дифтерийного токсина. CRM₁₉₇ продуцируется C. diphtheriae, инфицированным нетоксигенным фагом β197tox, созданным нитрозогуанидиновым мутагенезом токсигенного коринефага бета (Uchida, T. et al. 1971, Nature New Biology 233:8-11). Белок CRM₁₉₇ имеет ту же молекулярную массу, что и дифтерийный токсин, но отличается от него одной заменой основания (гуанин на аденин) в структурном гене. Это единственное изменение основания вызывает аминокислотную замену глицина на глутаминовую кислоту в зрелом белке и устраняет токсические свойства дифтерийного токсина. Белок CRM₁₉₇ является безопасным и эффективным носителем сахаридов, зависящим от Т-клеток. Более подробную информацию о CRM₁₉₇ и его продуцировании можно найти, например, в US 5,614,382.In a preferred embodiment, the capsular saccharides of the invention are conjugated to the CRM ₁₉₇ protein. The CRM ₁₉₇ protein is a nontoxic form of diphtheria toxin but is immunologically indistinguishable from diphtheria toxin. CRM ₁₉₇ is produced by C. diphtheriae infected with the nontoxigenic phage β197tox, created by nitrosoguanidine mutagenesis of the toxigenic corynephage beta (Uchida, T. et al. 1971, Nature New Biology 233:8-11). The CRM ₁₉₇ protein has the same molecular weight as diphtheria toxin, but differs from it by one base substitution (guanine to adenine) in the structural gene. This single base change causes the amino acid substitution of glycine for glutamic acid in the mature protein and eliminates the toxic properties of diphtheria toxin. CRM ₁₉₇ protein is a safe and effective T cell-dependent saccharide carrier. More detailed information about CRM ₁₉₇ and its production can be found, for example, in US 5,614,382.

Соответственно, в частых вариантах осуществления, гликоконъюгаты по изобретению содержат CRM₁₉₇ в качестве белка-носителя, где капсулярный полисахарид ковалентно связан с CRM₁₉₇.Accordingly, in frequent embodiments, the glycoconjugates of the invention contain CRM ₁₉₇ as a carrier protein, wherein the capsular polysaccharide is covalently linked to CRM ₁₉₇ .

Н. ДОЗИРОВКИ КОМПОЗИЦИЙN. DOSAGE OF COMPOSITIONS

Схемы дозирования могут быть скорректированы для обеспечения оптимального желаемого ответа. Например, можно вводить одну дозу полипептида, полученного из E. coli, или его фрагмента, можно вводить несколько разделенных доз в течение времени, или дозу можно пропорционально уменьшать или увеличивать в зависимости от остроты ситуации. Следует отметить, что значения дозировки могут варьироваться в зависимости от типа и тяжести состояния, подлежащего облегчению, и могут включать однократные или многократные дозы. Кроме того, следует понимать, что для любого конкретного субъекта конкретные схемы дозирования должны корректироваться с течением времени в соответствии с индивидуальными потребностями и профессиональным мнением лица, вводящего или контролирующего введение композиций, и что диапазоны дозировок, указанные в настоящем документе, являются только типовыми и не предназначены для ограничения объема или применения заявленной композиции. Определение подходящих дозировок и схем введения терапевтического белка хорошо известно в соответствующей области техники, и будут поняты специалистом в данной области техники после предоставления описанных в настоящем документе идей.Dosing regimens may be adjusted to provide the optimal desired response. For example, a single dose of an E. coli- derived polypeptide or fragment thereof may be administered, multiple divided doses may be administered over time, or the dose may be proportionally decreased or increased depending on the severity of the situation. It should be noted that dosage amounts may vary depending on the type and severity of the condition being alleviated and may include single or multiple doses. In addition, it should be understood that for any particular subject, specific dosage regimens should be adjusted over time in accordance with individual needs and the professional judgment of the person administering or supervising the administration of the compositions, and that the dosage ranges set forth herein are exemplary only and not are intended to limit the scope or application of the claimed composition. Determination of suitable dosages and schedules of administration of a therapeutic protein is well known in the art, and will be understood by one skilled in the art once the teachings described herein are provided.

В некоторых вариантах осуществления, количество полипептида, полученного из E.coli, или его фрагмента в композиции может составлять от примерно 10 мкг до примерно 300 мкг каждого белка-антигена. В некоторых вариантах осуществления, количество полипептида, полученного из E. coli, или его фрагмента в композиции может составлять от примерно 20 мкг до примерно 200 мкг каждого белкового антигена.In some embodiments, the amount of E. coli- derived polypeptide or fragment thereof in the composition may be from about 10 μg to about 300 μg of each antigen protein. In some embodiments, the amount of E. coli- derived polypeptide or fragment thereof in the composition may be from about 20 μg to about 200 μg of each protein antigen.

Количество гликоконъюгата(ов) в каждой дозе выбирают как количество, которое индуцирует иммунозащитный ответ без существенных неблагоприятных побочных эффектов в типовых вакцинах. Такое количество будет варьироваться в зависимости от того, какой конкретный иммуноген используется и как он презентирован.The amount of glycoconjugate(s) in each dose is selected as the amount that induces an immunoprotective response without significant adverse side effects in typical vaccines. This amount will vary depending on the specific immunogen used and how it is presented.

Количество конкретного гликоконъюгата в иммуногенной композиции можно рассчитать на основе общего количества полисахаридов для этого конъюгата (конъюгированного и не конъюгированного). Например, гликоконъюгат с 20% свободного полисахарида будет содержать около 80 г конъюгированного полисахарида и около 20 г не конъюгированного полисахарида в дозе 100 г полисахарида. Количество гликоконъюгата может варьироваться в зависимости от серотипа E. coli. Концентрацию сахарида можно определить с помощью анализа уроновой кислоты.The amount of a particular glycoconjugate in an immunogenic composition can be calculated based on the total amount of polysaccharides for that conjugate (conjugated and non-conjugated). For example, a glycoconjugate with 20% free polysaccharide will contain about 80 g of conjugated polysaccharide and about 20 g of unconjugated polysaccharide in a dose of 100 g of polysaccharide. The amount of glycoconjugate may vary depending on the E. coli serotype. The saccharide concentration can be determined using the uronic acid assay.

«Иммуногенное количество» различных полисахаридных компонентов в иммуногенной композиции может различаться, и каждое из них может составлять примерно 1,0 г, примерно 2,0 г, примерно 3,0 г, примерно 4,0 г, примерно 5,0 г, примерно 6,0 г, примерно 7,0 г, примерно 8,0 г, примерно 9,0 г, примерно 10,0 г, примерно 15,0 г, примерно 20,0 г, примерно 30,0 г, примерно 40,0 пг, примерно 50,0 пг, примерно 60,0 пг, примерно 70,0 пг, примерно 80,0 пг, примерно 90,0 пг или примерно 100,0 г любого конкретного полисахаридного антигена. Как правило, каждая доза будет содержать от 0,1 г до 100 г полисахарида для данного серотипа, в частности, от 0,5 г до 20 г, более конкретно, от 1 г до 10 г, и еще более конкретно, от 2 г до 5 г. Любое целое число в любом из вышеуказанных диапазонов рассматривается как вариант осуществления изобретения. В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать 1 г, 2 г, 3 г, 4 г, 5 г, 6 г, 7 г, 8 г, 9 г, 10 г, 15 г или 20 г полисахарида для данного серотипа.The "immunogenic amount" of the various polysaccharide components in the immunogenic composition may vary, and each may be about 1.0 g, about 2.0 g, about 3.0 g, about 4.0 g, about 5.0 g, about 6.0 g, about 7.0 g, about 8.0 g, about 9.0 g, about 10.0 g, about 15.0 g, about 20.0 g, about 30.0 g, about 40, 0 pg, about 50.0 pg, about 60.0 pg, about 70.0 pg, about 80.0 pg, about 90.0 pg, or about 100.0 g of any particular polysaccharide antigen. Typically, each dose will contain from 0.1 g to 100 g of polysaccharide for a given serotype, in particular from 0.5 g to 20 g, more particularly from 1 g to 10 g, and even more particularly from 2 g up to 5 g. Any integer in any of the above ranges is considered an embodiment of the invention. In one embodiment, each dose will contain 1 g, 2 g, 3 g, 4 g, 5 g, 6 g, 7 g, 8 g, 9 g, 10 g, 15 g, or 20 g of polysaccharide for a given serotype.

Количество белка-носителя. Как правило, каждая доза будет содержать от 5 г до 150 г белка-носителя, в частности, от 10 г до 100 г белка-носителя, более конкретно, от 15 г до 100 г белка-носителя, более конкретно, от 25 до 75 г белка-носителя, более конкретно, от 30 г до 70 г белка-носителя, более конкретно, от 30 до 60 г белка-носителя, более конкретно, от 30 г до 50 г белка-носителя, и еще более конкретно, от 40 до 60 г белка-носителя. В одном варианте осуществления, указанный белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления, каждая доза будет содержать примерно 25 г, примерно 26 г, примерно 27 г, примерно 28 г, примерно 29 г, примерно 30 г, примерно 31 г, примерно 32 г, примерно 33 г, примерно 34 г, примерно 35 г, примерно 36 г, примерно 37 г, примерно 38 г, примерно 39 г, примерно 40 г, примерно 41 г, примерно 42 г, примерно 43 г, примерно 44 г, примерно 45 г, примерно 46 г, примерно 47 г, примерно 48 г, примерно 49 г, примерно 50 г, примерно 51 г, примерно 52 г, примерно 53 г, примерно 54 г, примерно 55 г, примерно 56 г, примерно 57 г, примерно 58 г, примерно 59 г, примерно 60 г, примерно 61 г, примерно 62 г, примерно 63 г, примерно 64 г, примерно 65 г, примерно 66 г, примерно 67 г, 68 г, примерно 69 г, примерно 70 г, примерно 71 г, примерно 72 г, примерно 73 г, примерно 74 г или примерно 75 г белка-носителя. В одном варианте осуществления, указанный белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. Amount of carrier protein. Typically, each dose will contain from 5 g to 150 g of carrier protein, in particular from 10 g to 100 g of carrier protein, more particularly from 15 g to 100 g of carrier protein, more particularly from 25 to 75 g of carrier protein, more particularly, from 30 g to 70 g of carrier protein, more particularly, from 30 to 60 g of carrier protein, more particularly, from 30 g to 50 g of carrier protein, and even more particularly, from 40 up to 60 g of carrier protein. In one embodiment, said carrier protein is CRM ₁₉₇ . In one embodiment, each dose will contain about 25 g, about 26 g, about 27 g, about 28 g, about 29 g, about 30 g, about 31 g, about 32 g, about 33 g, about 34 g, about 35 g, approximately 36 g, approximately 37 g, approximately 38 g, approximately 39 g, approximately 40 g, approximately 41 g, approximately 42 g, approximately 43 g, approximately 44 g, approximately 45 g, approximately 46 g, approximately 47 g , about 48 g, about 49 g, about 50 g, about 51 g, about 52 g, about 53 g, about 54 g, about 55 g, about 56 g, about 57 g, about 58 g, about 59 g, about 60 g, approximately 61 g, approximately 62 g, approximately 63 g, approximately 64 g, approximately 65 g, approximately 66 g, approximately 67 g, 68 g, approximately 69 g, approximately 70 g, approximately 71 g, approximately 72 g, about 73 g, about 74 g, or about 75 g carrier protein. In one embodiment, said carrier protein is CRM ₁₉₇ .

I. АДЪЮВАНТI. ADJUVANT

В некоторых вариантах осуществления, описанные в настоящем документе иммуногенные композиции могут дополнительно содержать, по меньшей мере, один, два или три адъюванта. Термин «адъювант» относится к соединению или смеси, которые усиливают иммунный ответ на антиген. Антигены могут действовать в первую очередь как система доставки, в первую очередь как иммуномодулятор или иметь сильные черты обоих. Подходящие адъюванты включают адъюванты, подходящие для применения у млекопитающих, включая человека.In some embodiments, the immunogenic compositions described herein may further comprise at least one, two, or three adjuvants. The term "adjuvant" refers to a compound or mixture that enhances the immune response to an antigen. Antigens may act primarily as a delivery system, primarily as an immunomodulator, or have strong features of both. Suitable adjuvants include those suitable for use in mammals, including humans.

Примеры известных подходящих адъювантов типа системы доставки, которые можно использовать у людей, включают, но не ограничены ими, квасцы (например, фосфат алюминия, сульфат алюминия или гидроксид алюминия), фосфат кальция, липосомы, эмульсии масло-в-воде, такие как MF59 (4,3% масс./об. сквалена, 0,5% масс./об. полисорбата 80 (Tween 80), 0,5% масс./об. сорбитантриолеата (Span 85)), эмульсии вода-в-масле, такие как Монтанид, и микрочастицы или наночастицы поли(D,L-лактид-со-гликолид) (PLG).Examples of known suitable delivery system type adjuvants that can be used in humans include, but are not limited to, alum (eg aluminum phosphate, aluminum sulfate or aluminum hydroxide), calcium phosphate, liposomes, oil-in-water emulsions such as MF59 (4.3% w/v squalene, 0.5% w/v polysorbate 80 (Tween 80), 0.5% w/v sorbitan trioleate (Span 85)), water-in-oil emulsions , such as Montanide, and poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLG) microparticles or nanoparticles.

В одном варианте осуществления, иммуногенные композиции, описанные в настоящем документе, содержат соли алюминия (квасцы) в качестве адъюванта (например, фосфат алюминия, сульфат алюминия или гидроксид алюминия). В предпочтительном варианте осуществления, иммуногенные композиции, описанные в настоящем документе, содержат фосфат алюминия или гидроксид алюминия в качестве адъюванта. В одном варианте осуществления, иммуногенные композиции, описанные в настоящем документе, содержат от 0,1 мг/мл до 1 мг/мл или от 0,2 мг/мл до 0,3 мг/мл элементарного алюминия в форме фосфата алюминия. В одном варианте осуществления, иммуногенные композиции, описанные в настоящем документе, содержат примерно 0,25 мг/мл элементарного алюминия в форме фосфата алюминия. Примеры известных подходящих адъювантов иммуномодулирующего типа, которые можно использовать у людей, включают, но не ограничены ими, сапониновые экстракты из коры дерева Aquilla (QS21, Quil A), агонисты TLR4, такие как MPL (монофосфорил липид A), 3DMPL (3-O-деацилированный MPL) или GLA-AQ, мутанты LT/CT, цитокины, такие как различные интерлейкины (например, IL-2, IL-12) или GM-CSF, AS01 и подобные.In one embodiment, the immunogenic compositions described herein contain aluminum salts (alum) as an adjuvant (eg, aluminum phosphate, aluminum sulfate or aluminum hydroxide). In a preferred embodiment, the immunogenic compositions described herein contain aluminum phosphate or aluminum hydroxide as an adjuvant. In one embodiment, the immunogenic compositions described herein contain from 0.1 mg/ml to 1 mg/ml or from 0.2 mg/ml to 0.3 mg/ml elemental aluminum in the form of aluminum phosphate. In one embodiment, the immunogenic compositions described herein contain about 0.25 mg/ml elemental aluminum in the form of aluminum phosphate. Examples of known suitable immunomodulatory type adjuvants that can be used in humans include, but are not limited to, saponin extracts from Aquilla bark (QS21, Quil A), TLR4 agonists such as MPL (monophosphoryl lipid A), 3DMPL (3-O -deacylated MPL) or GLA-AQ, LT/CT mutants, cytokines such as various interleukins (eg IL-2, IL-12) or GM-CSF, AS01 and the like.

Примеры известных подходящих адъювантов иммуномодулирующего типа, с признаками как доставки, так и иммуномодуляции, которые могут быть использованы у людей, включают, но не ограничены ими, ISCOMS (см., например, Sjölander et al. (1998) J. Leukocyte Biol. 64:713; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 00/48630, WO 98/36772, WO 00/41720, WO 2006/134423 и WO 2007/026190) или GLA-EM, который представляет собой комбинацию агониста TLR4 и эмульсии масло-в-воде.Examples of known suitable immunomodulatory type adjuvants, with features of both delivery and immunomodulation, which can be used in humans include, but are not limited to, ISCOMS (see, for example, Sjölander et al. (1998) J. Leukocyte Biol. 64 :713; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 00/48630, WO 98/36772, WO 00/41720, WO 2006/134423 and WO 2007/026190) or GLA-EM, which is a combination of a TLR4 agonist and oil-in-water emulsions.

Для ветеринарных применений, включая, помимо прочего, эксперименты на животных, можно использовать полный адъювант Фрейнда (CFA), неполный адъювант Фрейнда (IFA), Эмульсиген, N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетил-нор-мурамил-L-аланил-D-изоглутамин (CGP 11637, обозначаемый как нор-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (CGP 19835A, обозначаемый как MTP-PE) и RIBI, который содержит три компонента, экстрагированные из бактерий, монофосфориловый липид A, димиколат трегалозы и скелет клеточной стенки (MPL+TDM+CWS) в 2% эмульсии сквалена/Tween 80.For veterinary applications, including but not limited to animal experiments, complete Freund's adjuvant (CFA), incomplete Freund's adjuvant (IFA), Emulsigen, N-acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamine (thr-MDP), N-acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamine (thr-MDP), acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (CGP 11637, referred to as nor-MDP), N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2-(1'-2'-dipalmitoyl -sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamine (CGP 19835A, referred to as MTP-PE) and RIBI, which contains three components extracted from bacteria, monophosphoryl lipid A, trehalose dimycolate and cell wall skeleton (MPL+TDM+CWS) in 2% squalene/Tween 80 emulsion.

Дополнительные типовые адъюванты для повышения эффективности иммуногенных композиций, описанных в настоящем документе, включают, но не ограничены ими, (1) составы эмульсий типа «масло в воде» (с или без других специфических иммуностимулирующих агентов, таких как мурамиловые пептиды (см. ниже) или компонентов клеточной стенки бактерий)), такие как, например, (а) SAF, содержащий 10% сквалана, 0,4% Tween 80, 5% блокированного плюроником полимера L121 и thr-MDP, либо микрофлюидизированного в субмикронную эмульсию, либо перемешанного для получения эмульсии большего размера, и (b) адъювантная система RIBI™ (RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, Mont.), содержащая 2% сквалена, 0,2% Tween 80 и один или несколько компонентов бактериальной клеточной стенки, таких как монофосфорилипид A (MPL), трегалозодимиколат (TDM) и скелет клеточной стенки (CWS), предпочтительно MPL+CWS (DETOX™); (2) сапониновые адъюванты, такие как QS21, STIMULON™ (Cambridge Bioscience, Worcester, Mass.), ABISCO® (Isconova, Sweden) или ISCOMATRIX® (Commonwealth Serum Laboratories, Australia), или полученные из них частицы, такие как ISCOM (иммуностимулирующие комплексы), где ISCOMS могут быть лишены дополнительного детергента (например, WO 00/07621); (3) полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда (IFA); (4) цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (например, WO 99/44636)), интерфероны (например, гамма-интерферон), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), фактор некроза опухоли (TNF) и т.д.; (5) монофосфориллипид А (MPL) или 3-O-деацилированный MPL (3dMPL) (см., например, GB2220211, EP0689454) (см., например, WO 00/56358); (6) комбинации 3dMPL, например, с QS21 и/или эмульсиями масло-в-воде (см., например, ЕР0835318, ЕР0735898, ЕР0761231); (7) полиоксиэтиленовый эфир или полиоксиэтиленовый эфир (см., например, WO 99/52549); (8) поверхностно-активное вещество на основе сложного эфира полиоксиэтиленсорбитана в комбинации с октоксинолом (например, WO 01/21207) или поверхностно-активное вещество на основе алкилового или сложного эфира полиоксиэтилена в сочетании, по меньшей мере, с одним дополнительным неионным поверхностно-активным веществом, таким как октоксинол (например, WO 01/21152); (9) сапонин и иммуностимулирующий олигонуклеотид (например, олигонуклеотид CpG) (например, WO 00/62800); (10) иммуностимулятор и частицу соли металла (см., например, WO 00/23105); (11) сапонин и эмульсию масло-в-воде (например, WO 99/11241); (12) сапонин (например, QS21) + 3dMPL+IM2 (необязательно+стерол) (например, WO 98/57659); (13) другие вещества, которые действуют как иммуностимулирующие агенты для повышения эффективности композиции. Мурамиловые пептиды включают N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-25-ацетил-нормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (nor-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутарнинил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин MTP-PE) и т.д.Additional exemplary adjuvants to enhance the effectiveness of the immunogenic compositions described herein include, but are not limited to, (1) oil-in-water emulsion formulations (with or without other specific immunostimulatory agents, such as muramyl peptides (see below) or bacterial cell wall components)), such as, for example, (a) SAF containing 10% squalane, 0.4% Tween 80, 5% Pluronic-capped polymer L121 and thr-MDP, either microfluidized into a submicron emulsion or mixed to producing a larger emulsion, and (b) the RIBI™ Adjuvant System (RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, Mont.) containing 2% squalene, 0.2% Tween 80, and one or more bacterial cell wall components such as monophosphorylipid A (MPL), trehalose dimycolate (TDM) and cell wall skeleton (CWS), preferably MPL+CWS (DETOX™); (2) saponin adjuvants such as QS21, STIMULON™ (Cambridge Bioscience, Worcester, Mass.), ABISCO® (Isconova, Sweden) or ISCOMATRIX® (Commonwealth Serum Laboratories, Australia), or particles derived from them such as ISCOM ( immunostimulating complexes), where ISCOMS may be devoid of additional detergent (eg WO 00/07621); (3) complete Freund's adjuvant (CFA) and incomplete Freund's adjuvant (IFA); (4) cytokines such as interleukins (eg IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (eg WO 99/44636)), interferons ( eg interferon gamma), macrophage colony stimulating factor (M-CSF), tumor necrosis factor (TNF), etc.; (5) monophosphoryl lipid A (MPL) or 3-O-deacylated MPL (3dMPL) (see, for example, GB2220211, EP0689454) (see, for example, WO 00/56358); (6) combinations of 3dMPL, for example, with QS21 and/or oil-in-water emulsions (see, for example, EP0835318, EP0735898, EP0761231); (7) polyoxyethylene ether or polyoxyethylene ether (see, for example, WO 99/52549); (8) a polyoxyethylene sorbitan ester surfactant in combination with an octoxynol (for example, WO 01/21207) or an alkyl or polyoxyethylene ester surfactant in combination with at least one additional non-ionic surfactant a substance such as octoxynol (eg WO 01/21152); (9) saponin and immunostimulatory oligonucleotide (eg CpG oligonucleotide) (eg WO 00/62800); (10) an immunostimulant and a metal salt particle (see, for example, WO 00/23105); (11) saponin and oil-in-water emulsion (eg WO 99/11241); (12) saponin (eg QS21) + 3dMPL+IM2 (optional + sterol) (eg WO 98/57659); (13) other substances that act as immunostimulating agents to enhance the effectiveness of the composition. Muramyl peptides include N-acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamine (thr-MDP), N-25-acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (nor-MDP), N-acetylmuramyl-L-alanyl-D -isoglutarninyl-L-alanine-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamine MTP-PE), etc.

В варианте осуществления настоящего изобретения, иммуногенные композиции, описанные в настоящем документе, содержат олигонуклеотид CpG в качестве адъюванта. Олигонуклеотид CpG, используемый в настоящем документе, относится к иммуностимулирующему олигодезоксинуклеотиду CpG (CpG ODN), и, соответственно, эти термины используются взаимозаменяемо, если не указано иное. Иммуностимулирующие олигодезоксинуклеотиды CpG содержат один или несколько иммуностимулирующих мотивов CpG, которые представляют собой неметилированные цитозин-гуаниновые динуклеотиды, необязательно в определенных предпочтительных контекстах оснований. Статус метилирования иммуностимулирующего мотива CpG обычно относится к остатку цитозина в динуклеотиде. Иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий, по меньшей мере, один неметилированный динуклеотид CpG, представляет собой олигонуклеотид, который содержит 5' неметилированный цитозин, связанный фосфатной связью с 3' гуанином, и который активирует иммунную систему посредством связывания с Toll-подобным рецептором 9 (TLR-9). В другом варианте осуществления, иммуностимулирующий олигонуклеотид может содержать один или несколько метилированных динуклеотидов CpG, которые будут активировать иммунную систему через TLR9, но не так сильно, как если бы мотив(ы) CpG был/были неметилированы. Иммуностимулирующие олигонуклеотиды CpG могут содержать один или несколько палиндромов, которые, в свою очередь, могут охватывать динуклеотид CpG. Олигонуклеотиды CpG описаны в ряде выданных патентов, опубликованных патентных заявках и других публикациях, включая патенты США №№ 6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239,116; и 6,339,068.In an embodiment of the present invention, the immunogenic compositions described herein contain a CpG oligonucleotide as an adjuvant. CpG oligonucleotide as used herein refers to immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotide (CpG ODN), and accordingly these terms are used interchangeably unless otherwise noted. Immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotides contain one or more immunostimulatory CpG motifs, which are unmethylated cytosine-guanine dinucleotides, optionally in certain preferred base contexts. The methylation status of the immunostimulatory CpG motif usually refers to the cytosine residue in the dinucleotide. An immunostimulatory oligonucleotide containing at least one unmethylated CpG dinucleotide is an oligonucleotide that contains a 5' unmethylated cytosine linked by a phosphate bond to a 3' guanine and which activates the immune system through binding to Toll-like receptor 9 (TLR-9 ). In another embodiment, the immunostimulatory oligonucleotide may contain one or more methylated CpG dinucleotides that will activate the immune system through TLR9, but not as strongly as if the CpG motif(s) were/were unmethylated. Immunostimulatory CpG oligonucleotides may contain one or more palindromes, which in turn may span a CpG dinucleotide. CpG oligonucleotides are described in a number of issued patents, published patent applications and other publications, including US Patent Nos. 6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239,116; and 6,339,068.

В варианте осуществления, настоящего изобретения, иммуногенные композиции, описанные в настоящем документе, содержат любой из олигонуклеотидов CpG, описанных на странице 3, строка 22, до страницы 12, строка 36 WO 2010/125480.In an embodiment of the present invention, the immunogenic compositions described herein contain any of the CpG oligonucleotides described on page 3, line 22, through page 12, line 36 of WO 2010/125480.

Были идентифицированы различные классы иммуностимулирующих олигонуклеотидов CpG. Они обозначаются как классы А, В, С и Р и более подробно описаны на стр. 3, строка 22, на стр. 12, строка 36, WO 2010/125480. Способы по изобретению охватывают использование этих различных классов иммуностимулирующих олигонуклеотидов CpG.Various classes of immunostimulatory CpG oligonucleotides have been identified. They are designated as classes A, B, C and P and are described in more detail on page 3, line 22, on page 12, line 36, WO 2010/125480. The methods of the invention encompass the use of these different classes of immunostimulatory CpG oligonucleotides.

VII. НаночастицыVII. Nanoparticles

В другом аспекте, в настоящем документе описан иммуногенный комплекс, включающий 1) наноструктуру; и 2) по меньшей мере, один фимбриальный полипептидный антиген или его фрагмент. Предпочтительно, фимбриальный полипептид или его фрагмент получают из фимбриального H E. coli (fimH). В предпочтительном варианте осуществления, фимбриальный полипептид выбран из любого из фимбриальных полипептидов, описанных выше. Например, фимбриальный полипептид может содержать любую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-10, 18, 20, 21, 23, 24 и 26-29.In another aspect, described herein is an immunogenic complex comprising 1) a nanostructure; and 2) at least one fimbrial polypeptide antigen or fragment thereof. Preferably, the fimbrial polypeptide or fragment thereof is derived from E. coli fimbrial H (fimH). In a preferred embodiment, the fimbrial polypeptide is selected from any of the fimbrial polypeptides described above. For example, the fimbrial polypeptide may comprise any amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1-10, 18, 20, 21, 23, 24 and 26-29.

В некоторых вариантах осуществления, антиген слит или конъюгирован с внешней частью наноструктуры для стимуляции развития адаптивных иммунных ответов на отображаемые эпитопы. В некоторых вариантах осуществления, иммуногенный комплекс дополнительно включает адъювант или другие иммуномодулирующие соединения, прикрепленные к внешней стороне и/или инкапсулированные внутри клетки, чтобы помочь адаптировать тип иммунного ответа, генерируемого для каждого патогена.In some embodiments, the antigen is fused or conjugated to the external portion of the nanostructure to stimulate the development of adaptive immune responses to the displayed epitopes. In some embodiments, the immunogenic complex further includes an adjuvant or other immunomodulatory compounds attached to the outside of and/or encapsulated within the cell to help tailor the type of immune response generated for each pathogen.

В некоторых вариантах осуществления, наноструктура включает единую сборку, включающую множество идентичных первых родственных наноструктуре полипептидов.In some embodiments, the nanostructure includes a single assembly comprising a plurality of polypeptides identical to the first nanostructure-related polypeptides.

В альтернативных вариантах осуществления, наноструктура включает множество сборок, включая множество идентичных первых родственных наноструктуре полипептидов, и множество вторых сборок, где каждая вторая сборка содержит множество идентичных вторых родственных наноструктуре полипептидов.In alternative embodiments, the nanostructure includes a plurality of assemblies, including a plurality of identical first nanostructure-related polypeptides, and a plurality of second assemblies, wherein each second assembly comprises a plurality of identical second nanostructure-related polypeptides.

Для создания описанных в настоящем документе иммуногенных композиций можно использовать различные платформы наноструктур. В некоторых вариантах осуществления, используемые наноструктуры образованы множеством копий одной субъединицы. В некоторых вариантах осуществления, используемые наноструктуры образованы множеством копий множества различных субъединиц.Various nanostructure platforms can be used to create the immunogenic compositions described herein. In some embodiments, the nanostructures used are formed by multiple copies of a single subunit. In some embodiments, the nanostructures used are formed by multiple copies of multiple different subunits.

Наноструктуры обычно имеют шарообразную форму и/или имеют вращательную симметрию (например, с 3-кратной и 5-кратной осью), например, с икосаэдрической структурой, приведенной в настоящем документе в качестве примера.Nanostructures are typically spherical in shape and/or have rotational symmetry (eg, 3-fold and 5-fold axis), for example, with the icosahedral structure exemplified herein.

В некоторых вариантах осуществления, антиген представлен на самособирающихся наночастицах, таких как самособирающиеся наноструктуры, полученные из ферритина (FR), E2p, Qβ и I3-01. E2p представляет собой переконструированный вариант дигидролипоилацилтрансферазы из Bacillus stearothermophilus. I3-01 представляет собой сконструированный белок, который может самособираться в гиперстабильные наночастицы. Последовательности субъединиц этих белков известны в данной области техники. В первом аспекте, в настоящем документе описан родственный наноструктуре полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 75% идентична по своей длине и идентична, по меньшей мере, в одном идентифицированном положении интерфейса аминокислотной последовательности родственного наноструктуре полипептида, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 59-92. Родственные наноструктуре полипептиды можно использовать, например, для получения наноструктур. Родственные наноструктуре полипептиды были сконструированы благодаря их способности к самосборке в пары с образованием наноструктур, таких как икосаэдрические наноструктуры.In some embodiments, the antigen is presented on self-assembled nanoparticles, such as self-assembled nanostructures derived from ferritin (FR), E2p, Qβ, and I3-01. E2p is a redesigned variant of the dihydrolipoyl acyltransferase from Bacillus stearothermophilus. I3-01 is an engineered protein that can self-assemble into hyperstable nanoparticles. The sequences of the subunits of these proteins are known in the art. In a first aspect, disclosed herein is a nanostructure-related polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 75% identical in length and identical at at least one identified interface position to the amino acid sequence of a nanostructure-related polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NO: 59-92. Nanostructure-related polypeptides can be used, for example, to produce nanostructures. Nanostructure-related polypeptides have been engineered for their ability to self-assemble into pairs to form nanostructures such as icosahedral nanostructures.

В некоторых вариантах осуществления, наноструктура включает (а) множество первых сборок, каждая первая сборка содержит множество идентичных первых родственных наноструктуре полипептидов, где первые родственные наноструктуре полипептиды содержат аминокислотную последовательность родственного наноструктуре полипептида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO: 59-92; и (b) множество вторых сборок, каждая вторая сборка содержит множество идентичных вторых родственных наноструктуре полипептидов, где вторые родственные наноструктуре полипептиды содержат аминокислотную последовательность родственного наноструктуре полипептида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 59-92, и где второй родственный наноструктуре полипептид отличается от первого родственного наноструктуре полипептида; где множество первых сборок нековалентно взаимодействует с множеством вторых сборок с образованием наноструктуры;In some embodiments, the nanostructure includes (a) a plurality of first assemblies, each first assembly comprising a plurality of identical first nanostructure-related polypeptides, wherein the first nanostructure-related polypeptides comprise the amino acid sequence of a nanostructure-related polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 59-92 ; and (b) a plurality of second assemblies, each second assembly comprising a plurality of identical second nanostructure-related polypeptides, wherein the second nanostructure-related polypeptides comprise the amino acid sequence of a nanostructure-related polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 59-92, and wherein the second nanostructure-related polypeptide the polypeptide is different from the first nanostructure-related polypeptide; wherein the plurality of first assemblies interact non-covalently with the plurality of second assemblies to form a nanostructure;

Наноструктуры включают симметрично повторяющиеся, неприродные, нековалентные поверхности раздела полипептид-полипептид, которые ориентируют первую сборку и вторую сборку в наноструктуру, такую как структура с икосаэдрической симметрией.Nanostructures include symmetrically repeating, non-natural, non-covalent polypeptide-polypeptide interfaces that orient a first assembly and a second assembly into a nanostructure, such as a structure with icosahedral symmetry.

SEQ ID NO: 59-92 предоставляют аминокислотную последовательность иллюстративных родственных наноструктуре полипептидов. Количество остатков интерфейса для типовых родственных наноструктуре полипептидов, SEQ ID NO: 59-92 находится в диапазоне от 4 до 13 остатков. В различных вариантах осуществления, родственные наноструктуре полипептиды содержат аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность по длине и идентичность, по меньшей мере, в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 идентифицированных положениях интерфейса (в зависимости от количество остатков интерфейса для данного родственного наноструктуре полипептида), к аминокислотной последовательности родственного наноструктуре полипептида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO: 59-92. В других вариантах осуществления, родственные наноструктуре полипептиды содержат аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность по длине и идентичность, по меньшей мере, на 20%, 25%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% или 100% идентифицированных положений интерфейса к аминокислотной последовательности родственного наноструктуре полипептида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO: 59-92. В дополнительных вариантах осуществления, родственные наноструктуре полипептиды включают родственный наноструктуре полипептид, имеющий аминокислотную последовательность родственного наноструктуре полипептида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO: 59-98.SEQ ID NOs: 59-92 provide the amino acid sequence of exemplary nanostructure-related polypeptides. The number of interface residues for typical nanostructure-related polypeptides, SEQ ID NO: 59-92 ranges from 4 to 13 residues. In various embodiments, the nanostructure-related polypeptides comprise an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% , 98% or 99% identity in length and identity in at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 or 13 identified interface positions (depending on the number interface residues for a given nanostructure-related polypeptide) to the amino acid sequence of a nanostructure-related polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NO: 59-92. In other embodiments, the nanostructure-related polypeptides comprise an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% , 98% or 99% identical in length and at least 20%, 25%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% or 100% identical to those identified interface positions to the amino acid sequence of a nanostructure-related polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NO: 59-92. In further embodiments, the nanostructure-related polypeptides include a nanostructure-related polypeptide having the amino acid sequence of a nanostructure-related polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 59-98.

В одном неограничивающем варианте осуществления, полипептиды, относящиеся к наноструктуре, могут быть модифицированы для облегчения ковалентной связи с представляющим интерес «грузом». В одном неограничивающем примере, родственные наноструктуре полипептиды могут быть модифицированы, например, путем введения различных цистеиновых остатков в определенные положения для облегчения связывания с одним или несколькими представляющими интерес антигенами, так что наноструктура родственных наноструктуре полипептидов, будет обеспечивать каркас для предоставления большого количества антигенов для доставки в качестве вакцины для создания улучшенного иммунного ответа.In one non-limiting embodiment, the polypeptides associated with the nanostructure can be modified to facilitate covalent bonding to the cargo of interest. In one non-limiting example, the nanostructure-related polypeptides may be modified, for example, by introducing different cysteine residues at specific positions to facilitate binding to one or more antigens of interest, such that the nanostructure-related polypeptides will provide a framework for providing a large number of antigens for delivery as a vaccine to create an improved immune response.

В некоторых вариантах осуществления, некоторые или все нативные остатки цистеина, которые присутствуют в полипептидах, связанных с наноструктурой, но не предназначены для использования для конъюгации, могут быть заменены другими аминокислотами для облегчения конъюгации в определенных положениях. В другом неограничивающем варианте осуществления, родственные наноструктуре полипептиды могут быть модифицированы путем связывания (ковалентного или нековалентного) с фрагментом для облегчения «эндосомального высвобождения». Для применений, которые включают доставку молекул, представляющих интерес, в клетку-мишень, таких как адресная доставка, критическим шагом может быть высвобождение из эндосомы - мембраносвязанной органеллы, которая является точкой входа средства доставки в клетку. Эндосомы созревают в лизосомы, которые разлагают свое содержимое. Таким образом, если средство доставки каким-то образом не «высвободится» из эндосомы до того, как станет лизосомой, оно будет деградировать и не будет выполнять свою функцию. Существует множество липидов или органических полимеров, которые разрушают эндосомы и позволяют проникнуть в цитозоль. Таким образом, в этом варианте осуществления, родственные наноструктуре полипептиды могут быть модифицированы, например, путем введения цистеиновых остатков, которые сделают возможной химическую конъюгацию такого липида или органического полимера с мономером или полученной поверхностью сборки. В другом неограничивающем примере, полипептиды, связанные с наноструктурой, могут быть модифицированы, например, путем введения цистеиновых остатков, которые сделают возможной химическую конъюгацию флуорофоров или других визуализирующих агентов, позволяющих визуализировать наноструктуры in vitro или in vivo.In some embodiments, some or all of the native cysteine residues that are present in the polypeptides associated with the nanostructure but are not intended to be used for conjugation may be replaced by other amino acids to facilitate conjugation at certain positions. In another non-limiting embodiment, nanostructure-related polypeptides can be modified by binding (covalent or non-covalent) to the moiety to facilitate "endosomal release". For applications that involve the delivery of molecules of interest to a target cell, such as targeted delivery, a critical step may be release from the endosome, a membrane-bound organelle that is the entry point of the delivery vehicle into the cell. Endosomes mature into lysosomes, which decompose their contents. Thus, unless the delivery vehicle is somehow "released" from the endosome before becoming a lysosome, it will be degraded and will not perform its function. There are many lipids or organic polymers that disrupt endosomes and allow entry into the cytosol. Thus, in this embodiment, the nanostructure-related polypeptides can be modified, for example, by introducing cysteine residues that allow chemical conjugation of such lipid or organic polymer to the monomer or resulting assembly surface. In another non-limiting example, the polypeptides associated with the nanostructure can be modified, for example, by introducing cysteine residues that allow chemical conjugation of fluorophores or other imaging agents to allow visualization of the nanostructures in vitro or in vivo.

Поверхностные аминокислотные остатки на полипептидах, связанных с наноструктурой, могут быть мутированы для улучшения стабильности или растворимости белковых субъединиц или собранных наноструктур. Как должно быть известно специалистам в данной области техники, если родственный наноструктуре полипептид имеет значительную гомологию последовательности с существующим семейством белков, можно использовать множественное выравнивание последовательностей других белков из этого семейства для выбора аминокислотных мутаций в неконсервативных положения, которые могут повышать стабильность и/или растворимость белка, процесс, называемый консенсусным дизайном белка (9).Surface amino acid residues on polypeptides associated with a nanostructure can be mutated to improve the stability or solubility of protein subunits or assembled nanostructures. As will be known to those skilled in the art, if a nanostructure-related polypeptide has significant sequence homology to an existing family of proteins, multiple sequence alignments of other proteins from that family can be used to select amino acid mutations at non-conserved positions that may increase the stability and/or solubility of the protein , a process called consensus protein design (9).

Поверхностные аминокислотные остатки на полипептидах, связанных с наноструктурой, могут быть мутированы в положительно заряженные (Arg, Lys) или отрицательно заряженные (Asp, Glu) аминокислоты, чтобы придать поверхности белка общий положительный или общий отрицательный заряд. В одном неограничивающем варианте осуществления, поверхностные аминокислотные остатки на полипептидах, связанных с наноструктурой, могут быть мутированы, чтобы придать внутренней поверхности самособирающейся наноструктуры высокий суммарный заряд. Затем такую наноструктуру можно использовать для упаковки или инкапсуляции молекулы груза с противоположным суммарным зарядом из-за электростатического взаимодействия между внутренней поверхностью наноструктуры и молекулой груза. В одном неограничивающем варианте осуществления, поверхностные аминокислотные остатки на полипептидах, связанных с наноструктурой, могут быть мутированы, в первую очередь аргининовыми или лизиновыми остатками, чтобы придать внутренней поверхности самособирающейся наноструктуры суммарный положительный заряд. Затем растворы, содержащие родственные наноструктуре полипептиды, можно смешивать в присутствии молекулы-носителя нуклеиновой кислоты, такой как дцДНК, оцДНК, дцРНК, оцРНК, кДНК, миРНК, киРНК, кшРНК, пиРНК или другая нуклеиновая кислота, чтобы инкапсулировать нуклеиновую кислоту внутри самособирающейся наноструктуры. Такую наноструктуру можно использовать, например, для защиты, доставки или концентрирования нуклеиновых кислот.Surface amino acid residues on nanostructure-associated polypeptides can be mutated into positively charged (Arg, Lys) or negatively charged (Asp, Glu) amino acids to impart an overall positive or net negative charge to the protein surface. In one non-limiting embodiment, surface amino acid residues on polypeptides associated with the nanostructure can be mutated to impart a high net charge to the interior surface of the self-assembled nanostructure. Such a nanostructure can then be used to package or encapsulate a cargo molecule with an opposite net charge due to the electrostatic interaction between the interior surface of the nanostructure and the cargo molecule. In one non-limiting embodiment, the surface amino acid residues on the polypeptides associated with the nanostructure can be mutated, primarily with arginine or lysine residues, to impart an overall positive charge to the interior surface of the self-assembled nanostructure. Solutions containing nanostructure-related polypeptides can then be mixed in the presence of a nucleic acid carrier molecule, such as dsDNA, ssDNA, dsRNA, ssRNA, cDNA, siRNA, siRNA, shRNA, piRNA, or other nucleic acid, to encapsulate the nucleic acid within a self-assembled nanostructure. Such a nanostructure can be used, for example, for the protection, delivery or concentration of nucleic acids.

В одном варианте осуществления, наноструктура имеет икосаэдрическую симметрию. В этом варианте осуществления, наноструктура может содержать 60 копий первого родственного наноструктуре полипептида и 60 копий второго родственного наноструктуре полипептида. В одном из таких вариантов осуществления, количество идентичных первых родственных наноструктуре полипептидов в каждой первой сборке отличается от количества идентичных вторых родственных наноструктуре полипептидов в каждой второй сборке. Например, в одном варианте осуществления, наноструктура содержит двенадцать первых сборок и двадцать вторых сборок; в этом варианте осуществления, каждая первая сборка может; например, содержат пять копий идентичного первого родственного наноструктуре полипептида, и каждая вторая сборка может, например, содержать три копии идентичного второго родственного наноструктуре полипептида. В другом варианте осуществления, наноструктура содержит двенадцать первых сборок и тридцать вторых сборок; в этом варианте осуществления, каждая первая сборка может, например, содержать пять копий идентичного первого родственного наноструктуре полипептида, и каждая вторая сборка может, например, содержать две копии идентичного второго родственного наноструктуре полипептида. В другом варианте осуществления, наноструктура содержит двадцать первых сборок и тридцать вторых сборок; в этом варианте осуществления, каждая первая сборка может, например, содержать три копии идентичного первого родственного наноструктуре полипептида, и каждая вторая сборка может, например, содержать две копии идентичного второго родственного наноструктуре полипептида. Все эти варианты осуществления способны формировать синтетические наноматериалы с правильной икосаэдрической симметрией.In one embodiment, the nanostructure has icosahedral symmetry. In this embodiment, the nanostructure may comprise 60 copies of a first nanostructure-related polypeptide and 60 copies of a second nanostructure-related polypeptide. In one such embodiment, the number of identical first nanostructure-related polypeptides in each first assembly is different from the number of identical second nanostructure-related polypeptides in every second assembly. For example, in one embodiment, the nanostructure contains twelve first assemblies and twenty second assemblies; in this embodiment, each first assembly may; for example, contain five copies of an identical first nanostructure-related polypeptide, and every second assembly may, for example, contain three copies of an identical second nanostructure-related polypeptide. In another embodiment, the nanostructure contains twelve first assemblies and thirty second assemblies; in this embodiment, each first assembly may, for example, contain five copies of an identical first nanostructure-related polypeptide, and each second assembly may, for example, contain two copies of an identical second nanostructure-related polypeptide. In another embodiment, the nanostructure contains twenty first assemblies and thirty second assemblies; in this embodiment, each first assembly may, for example, contain three copies of an identical first nanostructure-related polypeptide, and each second assembly may, for example, contain two copies of an identical second nanostructure-related polypeptide. All of these embodiments are capable of forming synthetic nanomaterials with regular icosahedral symmetry.

VIII. КОМБИНАЦИЯ С САХАРИДОМ И/ИЛИ ПОЛИПЕПТИДОМ ИЛИ ЕГО ФРАГМЕНТОМ, ПОЛУЧЕННЫМ ИЗ VIII. COMBINATION WITH A SACHARIDE AND/OR POLYPEPTIDE OR FRAGMENT THEREOF OBTAINED FROM KLEBSIELLA PNEUMONIAEKLEBSIELLA PNEUMONIAE

Klebsiella pneumoniae представляет собой грамотрицательный патоген, вызывающий инфекции мочевыводящих путей, бактериемию и сепсис. В одном аспекте, любая из композиций, описанных в настоящем документе, может дополнительно включать, по меньшей мере, один сахарид, который является или получен из, по меньшей мере, одного серотипа K. pneumoniae, выбранного из O1 (и вариантов d-Gal-III), O2 (и вариантов d-Gal-III), O2ac, O3, O4, O5, O7, O8 и O12. В предпочтительном варианте осуществления, любая из описанных в настоящем документе композиций может дополнительно включать полипептид, полученный из K. pneumoniae, выбранный из полипептида, полученного из фимбриального белка типа I K. pneumoniae, или его иммуногенного фрагмента; и полипептид, полученный из фимбриального белка типа III K. pneumoniae или его иммуногенного фрагмента. Klebsiella pneumoniae is a Gram-negative pathogen that causes urinary tract infections, bacteremia, and sepsis. In one aspect, any of the compositions described herein may further include at least one saccharide that is or is derived from at least one serotype of K. pneumoniae selected from O1 (and d-Gal- variants) III), O2 (and d-Gal-III variants), O2ac, O3, O4, O5, O7, O8 and O12. In a preferred embodiment, any of the compositions described herein may further comprise a K. pneumoniae- derived polypeptide selected from a K. pneumoniae type I fimbrial protein-derived polypeptide or an immunogenic fragment thereof; and a polypeptide derived from K. pneumoniae type III fimbrial protein or an immunogenic fragment thereof.

Как известно в данной области техники, антигены O1 и O2 K. pneumoniae содержат гомополимерные галактозные звенья (или галактаны). Каждый из антигенов O1 и O2 K. pneumoniae содержит единицы D-галактана I (иногда называемые повторяющейся единицей O2a), но антигены O1 отличаются тем, что антигены O1 имеют структуру кэпа D-галактана II. D-галактан III (d-Gal-III) представляет собой вариант D-галактана I. В некоторых вариантах осуществления, сахарид, полученный из K. pneumoniae O1, включает повторяющуюся единицу [→3)-β-D-Galf-(1→3)-α-D-Galp-(1→]. В некоторых вариантах осуществления, сахарид, полученный из K. pneumoniae O1, включает повторяющуюся единицу [→3)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→]. В некоторых вариантах осуществления, сахарид, полученный из K. pneumoniae O1, включает повторяющуюся единицу [→3)-β-D-Galf-(1→3)-α-D-Galp-(1→] и повторяющуюся единицу [→3)-α-D- Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→]. В некоторых вариантах осуществления, сахарид, полученный из K. pneumoniae O1, включает повторяющуюся единицу →3)-β-D-Galf -(1→3)-[α-D-Galp-(1→4)]-α-D-Galp-(1→] (упоминающуюся как повторяющаяся единица D-Gal-III).As is known in the art, the O1 and O2 antigens of K. pneumoniae contain homopolymeric galactose units (or galactans). The O1 and O2 antigens of K. pneumoniae each contain D-galactan I units (sometimes called the O2a repeat unit), but the O1 antigens differ in that the O1 antigens have a D-galactan II cap structure. D-galactan III (d-Gal-III) is a variant of D-galactan I. In some embodiments, the saccharide derived from K. pneumoniae O1 includes a repeating unit [→3)-β-D-Gal f -(1 →3)-α-D-Gal p -(1→]. In some embodiments, the saccharide derived from K. pneumoniae O1 includes a repeating unit [→3)-α-D-Gal p -(1→3) -β-D-Gal p -(1→]. In some embodiments, the saccharide derived from K. pneumoniae O1 includes a repeating unit [→3)-β-D-Gal f -(1→3)-α- D-Gal p -(1→] and a repeating unit [→3)-α-D-Gal p -(1→3)-β-D-Gal p -(1→]. In some embodiments, the saccharide obtained from K. pneumoniae O1, includes the repeating unit →3)-β-D-Gal f -(1→3)-[α-D-Gal p -(1→4)]-α-D-Gal p -(1 →] (referred to as the D-Gal-III repeat unit).

В некоторых вариантах осуществления сахарид, полученный из K. pneumoniae O2, включает повторяющуюся единицу [→3)-α-ᴅ-Galp-(1→3)-β-ᴅ-Galf-(1→] (которая может быть элементом антигена O2a серотипа K. pneumoniae). В некоторых вариантах осуществления, сахарид, полученный из K. pneumoniae O2, включает повторяющуюся единицу [→3)-β-ᴅ-GlcpNAc-(1→5)-β-ᴅ-Galf-(1→] (которая может быть элементом антигена O2c серотипа K. pneumoniae). В некоторых вариантах осуществления, сахарид, полученный из O2 K. pneumoniae, включает модификацию повторяющейся единицы O2a путем добавления боковой цепи (1→4)-связанных остатков Galp (которые могут быть элементом антигена O2afg K. pneumoniae). В некоторых вариантах осуществления, сахарид, полученный из O2 K. pneumoniae, включает модификацию повторяющейся единицы O2a путем добавления боковой цепи (1→2)-связанных остатков Galp (которые могут быть элементом антигена O2aeh K. pneumoniae).In some embodiments, the saccharide derived from K. pneumoniae O2 includes a repeating unit [→3)-α-ᴅ-Gal p -(1→3)-β-ᴅ-Gal f -(1→] (which may be an element K. pneumoniae serotype O2a antigen. In some embodiments, the K. pneumoniae O2-derived saccharide includes a [→3)-β-ᴅ-GlcpNAc-(1→5)-β-ᴅ-Gal f -( 1→] (which may be an element of the K. pneumoniae serotype O2c antigen). In some embodiments, the K. pneumoniae O2-derived saccharide includes modification of the O2a repeat unit by the addition of side chain (1→4)-linked Gal p residues ( which may be an element of the K. pneumoniae O2afg antigen. In some embodiments, the K. pneumoniae O2-derived saccharide includes modification of the O2a repeat unit by the addition of side chain (1→2)-linked Gal p residues (which may be an element of the antigen). O2aeh K. pneumoniae ).

Без привязки к механизму или теории, структура полисахарида О-антигена серотипов O3 и O5 K. pneumoniae описана в данной области техники как идентичная таковой у серотипов E. coli O9a (формула O9a) и O8 (формула O8), соответственно.Without being bound by mechanism or theory, the structure of the O-antigen polysaccharide of K. pneumoniae serotypes O3 and O5 is described in the art as identical to that of E. coli serotypes O9a (formula O9a) and O8 (formula O8), respectively.

В некоторых вариантах осуществления сахарид, полученный из K. pneumoniae O4, включает повторяющуюся единицу [→4)-α-D-Galp-(1→2)-β-D-Ribf-(1→)]. В некоторых вариантах осуществления, сахарид, полученный из K. pneumoniae O7, включает повторяющуюся единицу [→2-a-L-Rhap-(1→2)-β-D-Ribf-(1→3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap-(1→]. В некоторых вариантах осуществления, сахарид, полученный из серотипа K. pneumoniae O8, включает ту же структуру повторяющихся единиц, что и K. pneumoniae O2a, но нестехиометрически O-ацетилированную. В некоторых вариантах осуществления, сахарид, полученный из K. pneumoniae серотипа O12, включает повторяющуюся единицу [α-Rhap-(1→3)-β-GlcpNAc] дисахаридной повторяющейся единицы.In some embodiments, the saccharide derived from K. pneumoniae O4 includes a repeating unit [→4)-α-D-Gal p -(1→2)-β-D-Rib f -(1→)]. In some embodiments, the saccharide derived from K. pneumoniae O7 includes a repeating unit [→2-aL-Rha p -(1→2)-β-D-Rib f -(1→3)-α-L-Rha p -(1→3)-α-L-Rha p -(1→]. In some embodiments, the saccharide derived from K. pneumoniae serotype O8 includes the same repeat unit structure as K. pneumoniae O2a, but non-stoichiometrically O-acetylated. In some embodiments, the saccharide derived from K. pneumoniae serotype O12 comprises an [α-Rhap-(1→3)-β-GlcpNAc] disaccharide repeat unit.

В одном аспекте, изобретение включает композицию, включающую полипептид, полученный из E. coli FimH, или его фрагмент; и, по меньшей мере, один сахарид, который является или получен из, по меньшей мере, одного серотипа K. pneumoniae, выбранного из O1 (и вариантов d-Gal-III), O2 (и вариантов d-Gal-III), O2ac, O3, O4, O5, О7, О8 и О12. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает сахариды одного или нескольких серотипов O1, O2, O3 и O5 или их комбинации или полученные из них. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает сахариды каждого из серотипов O1, O2, O3 и O5 или производные от них.In one aspect, the invention includes a composition comprising a polypeptide derived from E. coli FimH, or a fragment thereof; and at least one saccharide that is or is derived from at least one serotype of K. pneumoniae selected from O1 (and d-Gal-III variants), O2 (and d-Gal-III variants), O2ac , O3, O4, O5, O7, O8 and O12. In some embodiments, the composition includes saccharides of one or more serotypes O1, O2, O3 and O5 or combinations thereof or derived from them. In some embodiments, the composition includes saccharides of each of the O1, O2, O3 and O5 serotypes or derivatives thereof.

В другом аспекте, изобретение включает композицию, включающую, по меньшей мере, один сахарид, который является или получен из, по меньшей мере, одного серотипа K. pneumoniae, выбранного из O1 (и вариантов d-Gal-III), O2 (и вариантов d-Gal-III), O2ac, O3, O4, O5, O7, O8 и O12; и сахарид, имеющий структуру, выбранную из Формулы O1 (например, Формулы O1A, Формулы O1B и Формулы O1C), Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4 (например, Формулы O4:K52 и Формулы O4:K6), Формулы O5 (например, Формулы O5ab и Формулы O5ac (штамм 180/C3)), Формулы O6 (например, Формулы O6:K2; K13; K15 и Формулы O6:K54), Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18 (например, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B и Формулы O18B1), Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23 (например, Формулы O23A), Формулы O24, Формулы O25 (например, Формулы O25a и Формулы O25b), Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45 (например, Формулы O45 и Формулы O45rel), Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы 62D₁, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73 (например, Формулы O73 (штамм 73-1)), Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186 и Формулы O187, где n представляет собой целое число от 1 до 100. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает сахарид из или полученный из одного или нескольких серотипов O1, O2, O3 и O5 K. pneumoniae или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает сахарид из или полученный из каждого из серотипов O1, O2, O3 и O5 K. pneumoniae. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает сахарид формулы O9 и не включает сахарид, полученный из серотипа O3 K. pneumoniae. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает сахарид формулы O8 и не включает сахарид, полученный из серотипа O5 K. pneumoniae.In another aspect, the invention includes a composition comprising at least one saccharide that is or is derived from at least one serotype of K. pneumoniae selected from O1 (and d-Gal-III variants), O2 (and variants d-Gal-III), O2ac, O3, O4, O5, O7, O8 and O12; and a saccharide having a structure selected from Formula O1 (for example, Formula O1A, Formula O1B and Formula O1C), Formula O2, Formula O3, Formula O4 (for example, Formula O4:K52 and Formula O4:K6), Formula O5 (for example, Formulas O5ab and Formulas O5ac (strain 180/C3)), Formulas O6 (e.g. Formulas O6:K2; K13; K15 and Formulas O6:K54), Formulas O7, Formulas O8, Formulas O9, Formulas O10, Formulas O11, Formulas O12 , Formulas O13, Formulas O14, Formulas O15, Formulas O16, Formulas O17, Formulas O18 (for example, Formulas O18A, Formulas O18ac, Formulas O18A1, Formulas O18B and Formulas O18B1), Formulas O19, Formulas O20, Formulas O21, Formulas O22, Formulas O23 (for example, Formula O23A), Formula O24, Formula O25 (for example, Formula O25a and Formula O25b), Formula O26, Formula O27, Formula O28, Formula O29, Formula O30, Formula O32, Formula O33, Formula O34, Formula O35, Formula O36, Formula O37, Formula O38, Formula O39, Formula O40, Formula O41, Formula O42, Formula O43, Formula O44, Formula O45 (e.g. Formula O45 and Formula O45rel), Formula O46, Formula O48, Formula O49, Formula O50 , Formulas O51, Formulas O52, Formulas O53, Formulas O54, Formulas O55, Formulas O56, Formulas O57, Formulas O58, Formulas O59, Formulas O60, Formulas O61, Formulas O62, Formulas 62D ₁ , Formulas O63, Formulas O64, Formulas O65, Formulas O66, Formulas O68, Formulas O69, Formulas O70, Formulas O71, Formulas O73 (e.g. Formulas O73 (strain 73-1)), Formulas O74, Formulas O75, Formulas O76, Formulas O77, Formulas O78, Formulas O79, Formulas O80 , Formulas O81, Formulas O82, Formulas O83, Formulas O84, Formulas O85, Formulas O86, Formulas O87, Formulas O88, Formulas O89, Formulas O90, Formulas O91, Formulas O92, Formulas O93, Formulas O95, Formulas O96, Formulas O97, Formulas O98, Formulas O99, Formulas O100, Formulas O101, Formulas O102, Formulas O103, Formulas O104, Formulas O105, Formulas O106, Formulas O107, Formulas O108, Formulas O109, Formulas O110, Formulas 0111, Formulas O112, Formulas O113 , Formulas O114, Formulas O115, Formulas O116, Formulas O117, Formulas O118, Formulas O119, Formulas O120, Formulas O121, Formulas O123, Formulas O124, Formulas O125, Formulas O126, Formulas O127, Formulas O128, Formulas O129, Formulas O130, O131, Formulas O132 , Formulas O133, Formulas O134, Formulas O135, Formulas O136, Formulas O137, Formulas O138, Formulas O139, Formulas O140, Formulas O141, Formulas O142, Formulas O143, Formulas O144, Formulas O145, Formulas O146, Formulas O147, Formulas O148, Formulas O149, Formulas O150, Formulas O151, Formulas O152, Formulas O153, Formulas O154, Formulas O155, Formulas O156, Formulas O157, Formulas O158, Formulas O159, Formulas O160, Formulas O161, Formulas O162, Formulas O163, Formulas O16 4, Formula O165, Formulas O166, Formulas O167, Formulas O168, Formulas O169, Formulas O170, Formulas O171, Formulas O172, Formulas O173, Formulas O174, Formulas O175, Formulas O176, Formulas O177, Formulas O178, Formulas O179, Formulas O180, O181, Formulas O182 , Formula O183, Formula O184, Formula O185, Formula O186, and Formula O187, where n is an integer from 1 to 100. In some embodiments, the composition includes a saccharide from or derived from one or more serotypes O1, O2, O3, and O5 K. pneumoniae or combinations thereof. In some embodiments, the composition includes a saccharide from or derived from each of K. pneumoniae serotypes O1, O2, O3, and O5. In some embodiments, the composition includes a saccharide of formula O9 and does not include a saccharide derived from K. pneumoniae serotype O3. In some embodiments, the composition includes a saccharide of formula O8 and does not include a saccharide derived from K. pneumoniae serotype O5.

В другом аспекте, изобретение относится к композиции, включающей композицию, включающую полипептид, полученный из E. coli FimH, или его фрагмент; по меньшей мере, один сахарид, который является или получен из, по меньшей мере, одного серотипа K. pneumoniae, выбранного из O1 (и вариантов d-Gal-III), O2 (и вариантов d-Gal-III), O2ac, O3, O4, O5, О7, О8 и О12; и сахарид, имеющий структуру, выбранную из Формулы O1 (например, Формулы O1A, Формулы O1B и Формулы O1C), Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4 (например, Формулы O4:K52 и Формулы O4:K6), Формулы O5 (например, Формулы O5ab и Формулы O5ac (штамм 180/C3)), Формулы O6 (например, Формулы O6:K2; K13; K15 и Формулы O6:K54), Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18 (например, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B и Формулы O18B1), Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23 (например, Формулы O23A), Формулы O24, Формулы O25 (например, Формулы O25a и Формулы O25b), Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45 (например, Формулы O45 и Формулы O45rel), Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы 62D₁, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73 (например, Формулы O73 (штамм 73-1)), Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186 и Формулы O187, где n представляет собой целое число от 1 до 100. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает сахарид, имеющий формулу O9, и не включает сахарид, полученный из серотипа O3 K. pneumoniae. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает сахарид формулы O8 и не включает сахарид, полученный из серотипа O5 K. pneumoniae.In another aspect, the invention relates to a composition comprising a composition comprising a polypeptide derived from E. coli FimH, or a fragment thereof; at least one saccharide that is or is derived from at least one serotype of K. pneumoniae selected from O1 (and d-Gal-III variants), O2 (and d-Gal-III variants), O2ac, O3 , O4, O5, O7, O8 and O12; and a saccharide having a structure selected from Formula O1 (for example, Formula O1A, Formula O1B and Formula O1C), Formula O2, Formula O3, Formula O4 (for example, Formula O4:K52 and Formula O4:K6), Formula O5 (for example, Formulas O5ab and Formulas O5ac (strain 180/C3)), Formulas O6 (e.g. Formulas O6:K2; K13; K15 and Formulas O6:K54), Formulas O7, Formulas O8, Formulas O9, Formulas O10, Formulas O11, Formulas O12 , Formulas O13, Formulas O14, Formulas O15, Formulas O16, Formulas O17, Formulas O18 (for example, Formulas O18A, Formulas O18ac, Formulas O18A1, Formulas O18B and Formulas O18B1), Formulas O19, Formulas O20, Formulas O21, Formulas O22, Formulas O23 (for example, Formula O23A), Formula O24, Formula O25 (for example, Formula O25a and Formula O25b), Formula O26, Formula O27, Formula O28, Formula O29, Formula O30, Formula O32, Formula O33, Formula O34, Formula O35, Formula O36, Formula O37, Formula O38, Formula O39, Formula O40, Formula O41, Formula O42, Formula O43, Formula O44, Formula O45 (e.g. Formula O45 and Formula O45rel), Formula O46, Formula O48, Formula O49, Formula O50 , Formulas O51, Formulas O52, Formulas O53, Formulas O54, Formulas O55, Formulas O56, Formulas O57, Formulas O58, Formulas O59, Formulas O60, Formulas O61, Formulas O62, Formulas 62D ₁ , Formulas O63, Formulas O64, Formulas O65, Formulas O66, Formulas O68, Formulas O69, Formulas O70, Formulas O71, Formulas O73 (e.g. Formulas O73 (strain 73-1)), Formulas O74, Formulas O75, Formulas O76, Formulas O77, Formulas O78, Formulas O79, Formulas O80 , Formulas O81, Formulas O82, Formulas O83, Formulas O84, Formulas O85, Formulas O86, Formulas O87, Formulas O88, Formulas O89, Formulas O90, Formulas O91, Formulas O92, Formulas O93, Formulas O95, Formulas O96, Formulas O97, Formulas O98, Formulas O99, Formulas O100, Formulas O101, Formulas O102, Formulas O103, Formulas O104, Formulas O105, Formulas O106, Formulas O107, Formulas O108, Formulas O109, Formulas O110, Formulas 0111, Formulas O112, Formulas O113 , Formulas O114, Formulas O115, Formulas O116, Formulas O117, Formulas O118, Formulas O119, Formulas O120, Formulas O121, Formulas O123, Formulas O124, Formulas O125, Formulas O126, Formulas O127, Formulas O128, Formulas O129, Formulas O130, O131, Formulas O132 , Formulas O133, Formulas O134, Formulas O135, Formulas O136, Formulas O137, Formulas O138, Formulas O139, Formulas O140, Formulas O141, Formulas O142, Formulas O143, Formulas O144, Formulas O145, Formulas O146, Formulas O147, Formulas O148, Formulas O149, Formulas O150, Formulas O151, Formulas O152, Formulas O153, Formulas O154, Formulas O155, Formulas O156, Formulas O157, Formulas O158, Formulas O159, Formulas O160, Formulas O161, Formulas O162, Formulas O163, Formulas O16 4, Formula O165, Formulas O166, Formulas O167, Formulas O168, Formulas O169, Formulas O170, Formulas O171, Formulas O172, Formulas O173, Formulas O174, Formulas O175, Formulas O176, Formulas O177, Formulas O178, Formulas O179, Formulas O180, O181, Formulas O182 , Formula O183, Formula O184, Formula O185, Formula O186, and Formula O187, where n is an integer from 1 to 100. In some embodiments, the composition includes a saccharide having formula O9 and does not include a saccharide derived from serotype O3 K pneumoniae In some embodiments, the composition includes a saccharide of formula O8 and does not include a saccharide derived from K. pneumoniae serotype O5.

В некоторых вариантах осуществления, композиция включает, по меньшей мере, один сахарид, полученный из любого типа K. pneumoniae, выбранного из группы, состоящей из O1, O2, O3 и O5. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает, по меньшей мере, один сахарид, полученный из типа O1 K. pneumoniae. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает, по меньшей мере, один сахарид, полученный из типа O2 K. pneumoniae.In some embodiments, the composition includes at least one saccharide derived from any type of K. pneumoniae selected from the group consisting of O1, O2, O3 and O5. In some embodiments, the composition includes at least one saccharide derived from K. pneumoniae type O1. In some embodiments, the composition includes at least one saccharide derived from the O2 type of K. pneumoniae .

В некоторых вариантах осуществления, композиция включает комбинацию сахаридов, полученных из K. pneumoniae, где первый сахарид получают из любого одного из типов K. pneumoniae, выбранного из группы, состоящей из O1, O2, O3 и O5; и второй сахарид получают из сахарида, полученного из любого одного из типов K. pneumoniae, выбранного из группы, состоящей из O1 (и вариантов d-Gal-III), O2 (и вариантов d-Gal-III), O2ac, O3, О4, О5, О7, О8 и О12. Например, в некоторых вариантах осуществления, композиция включает, по меньшей мере, один сахарид, полученный из типа O1 K. pneumoniae, и, по меньшей мере, один сахарид, полученный из типа O2 K. pneumoniae. В предпочтительном варианте осуществления, сахарид, полученный из K. pneumoniae, конъюгирован с белком-носителем; и сахарид, полученный из E. coli, конъюгирован с белком-носителем.In some embodiments, the composition includes a combination of saccharides derived from K. pneumoniae, wherein the first saccharide is derived from any one of the types of K. pneumoniae selected from the group consisting of O1, O2, O3, and O5; and the second saccharide is derived from a saccharide derived from any one of the types of K. pneumoniae selected from the group consisting of O1 (and d-Gal-III variants), O2 (and d-Gal-III variants), O2ac, O3, O4 , O5, O7, O8 and O12. For example, in some embodiments, the composition includes at least one saccharide derived from K. pneumoniae type O1 and at least one saccharide derived from K. pneumoniae type O2. In a preferred embodiment, the saccharide obtained from K. pneumoniae is conjugated to a carrier protein; and a saccharide derived from E. coli is conjugated to a carrier protein.

В другом аспекте, изобретение включает композицию, включающую полипептид, полученный из E.coli FimH, или его фрагмент; и, по меньшей мере, один сахарид, полученный из любого типа K. pneumoniae, выбранного из группы, состоящей из O1, O2, O3 и O5.In another aspect, the invention includes a composition comprising a polypeptide derived from E. coli FimH, or a fragment thereof; and at least one saccharide derived from any type of K. pneumoniae selected from the group consisting of O1, O2, O3 and O5.

В другом аспекте, изобретение включает по меньшей мере, один сахарид, полученный из любого типа K. pneumoniae, выбранного из группы, состоящей из O1, O2, O3 и O5; и, по меньшей мере, один сахарид, полученный из E. coli, имеющий структуру, выбранную из Формулы O1 (например, Формулы O1A, Формулы O1B и Формулы O1C), Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4 (например, Формулы O4:K52 и Формулы O4:K6), Формулы O5 (например, Формулы O5ab и Формулы O5ac (штамм 180/C3)), Формулы O6 (например, Формулы O6:K2; K13; K15 и Формулы O6:K54), Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18 (например, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B и Формулы O18B1), Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23 (например, Формулы O23A), Формулы O24, Формулы O25 (например, Формулы O25a и Формулы O25b), Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45 (например, Формулы O45 и Формулы O45rel), Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы 62D₁, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73 (например, Формулы O73 (штамм 73-1)), Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186 и Формулы O187. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает сахарид формулы O9 и не включает сахарид, полученный из серотипа O3 K. pneumoniae. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает сахарид формулы O8 и не включает сахарид, полученный из серотипа O5 K. pneumoniae.In another aspect, the invention includes at least one saccharide derived from any type of K. pneumoniae selected from the group consisting of O1, O2, O3 and O5; and at least one saccharide derived from E. coli having a structure selected from Formula O1 (for example, Formula O1A, Formula O1B and Formula O1C), Formula O2, Formula O3, Formula O4 (for example, Formula O4:K52 and Formulas O4:K6), Formulas O5 (for example, Formulas O5ab and Formulas O5ac (strain 180/C3)), Formulas O6 (for example, Formulas O6:K2; K13; K15 and Formulas O6:K54), Formulas O7, Formulas O8 , Formulas O9, Formulas O10, Formulas O11, Formulas O12, Formulas O13, Formulas O14, Formulas O15, Formulas O16, Formulas O17, Formulas O18 (for example, Formulas O18A, Formulas O18ac, Formulas O18A1, Formulas O18B and Formulas O18B1), Formulas O19, Formula O20, Formula O21, Formula O22, Formula O23 (for example, Formula O23A), Formula O24, Formula O25 (for example, Formula O25a and Formula O25b), Formula O26, Formula O27, Formula O28, Formula O29, Formula O30, Formula O32, Formula O33, Formula O34, Formula O35, Formula O36, Formula O37, Formula O38, Formula O39, Formula O40, Formula O41, Formula O42, Formula O43, Formula O44, Formula O45 (for example, Formula O45 and Formula O45rel) , Formulas O46, Formulas O48, Formulas O49, Formulas O50, Formulas O51, Formulas O52, Formulas O53, Formulas O54, Formulas O55, Formulas O56, Formulas O57, Formulas O58, Formulas O59, Formulas O60, Formulas O61, Formulas O62, Formulas 62D ₁ , Formulas O63, Formulas O64, Formulas O65, Formulas O66, Formulas O68, Formulas O69, Formulas O70, Formulas O71, Formulas O73 (for example, Formulas O73 (strain 73-1)), Formulas O74, Formulas O75, Formulas O76 , Formulas O77, Formulas O78, Formulas O79, Formulas O80, Formulas O81, Formulas O82, Formulas O83, Formulas O84, Formulas O85, Formulas O86, Formulas O87, Formulas O88, Formulas O89, Formulas O90, Formulas O91, Formulas O92, Formulas O93, Formulas O95, Formulas O96, Formulas O97, Formulas O99, Formulas O100, Formulas O101, Formulas O102, Formulas O103, Formulas O104, Formulas O105, Formulas O106, Formulas O107, Formulas O108, Formulas O109, Formulas O 110, Formulas 0111, Formulas O112, Formulas O113, Formulas O114, Formulas O115, Formulas O116, Formulas O117, Formulas O118, Formulas O119, Formulas O120, Formulas O121, Formulas O123, Formulas O124, Formulas O125, Formulas O126, s O127, Formulas O128 , Formulas O129, Formulas O130, Formulas O131, Formulas O132, Formulas O133, Formulas O134, Formulas O135, Formulas O136, Formulas O137, Formulas O138, Formulas O139, Formulas O140, Formulas O141, Formulas O142, Formulas O143, Formulas O144, Formulas O145, Formulas O146, Formulas O147, Formulas O148, Formulas O149, Formulas O150, Formulas O151, Formulas O152, Formulas O153, Formulas O154, Formulas O155, Formulas O156, Formulas O157, Formulas O158, Formulas O159, Formulas O16 0, Formulas O161, Formulas O162, Formulas O163, Formulas O164, Formulas O165, Formulas O166, Formulas O167, Formulas O168, Formulas O169, Formulas O170, Formulas O171, Formulas O172, Formulas O173, Formulas O174, Formulas O175, Formulas O176, O177, Formulas O178 , Formulas O179, Formulas O180, Formulas O181, Formulas O182, Formulas O183, Formulas O184, Formulas O185, Formulas O186 and Formulas O187. In some embodiments, the composition includes a saccharide of formula O9 and does not include a saccharide derived from K. pneumoniae serotype O3. In some embodiments, the composition includes a saccharide of formula O8 and does not include a saccharide derived from K. pneumoniae serotype O5.

В некоторых вариантах осуществления, композиция включает, по меньшей мере, один сахарид, полученный из типа O1 K. pneumoniae; и, по меньшей мере, один сахарид, полученный из E.coli, имеющий структуру, выбранную из группы, состоящей из Формулы O8 и Формулы O9. В другом варианте осуществления, композиция включает, по меньшей мере, один сахарид, полученный из типа О2 К. pneumoniae; и, по меньшей мере, один сахарид, полученный из E.coli, имеющий структуру, выбранную из группы, состоящей из Формулы O8 и Формулы O9. В другом варианте осуществления, композиция включает, по меньшей мере, один сахарид, полученный из типа О1 К. pneumoniae; по меньшей мере, один сахарид, полученный из типа О2 К. pneumoniae; и, по меньшей мере, один сахарид, полученный из E.coli, имеющий структуру, выбранную из группы, состоящей из Формулы O8 и Формулы O9.In some embodiments, the composition includes at least one saccharide derived from K. pneumoniae type O1; and at least one saccharide derived from E. coli having a structure selected from the group consisting of Formula O8 and Formula O9. In another embodiment, the composition includes at least one saccharide derived from K. pneumoniae type O2; and at least one saccharide derived from E. coli having a structure selected from the group consisting of Formula O8 and Formula O9. In another embodiment, the composition includes at least one saccharide derived from K. pneumoniae type O1; at least one saccharide derived from K. pneumoniae type O2; and at least one saccharide derived from E. coli having a structure selected from the group consisting of Formula O8 and Formula O9.

В некоторых вариантах осуществления, композиция включает, по меньшей мере, один сахарид, который является или получен из, по меньшей мере, одного серотипа K. pneumoniae, выбранного из O1 (и вариантов d-Gal-III), O2 (и вариантов d-Gal-III), O2ac, О3, О4, О5, О7, О8 и О12; по меньшей мере, один сахарид, полученный из E.coli, имеющий структуру, выбранную из группы, состоящей из Формулы O8 и Формулы O9. В некоторых вариантах осуществления, композиция включает, по меньшей мере, один сахарид, который является или получен из, по меньшей мере, одного серотипа K. pneumoniae, выбранного из O1 (и вариантов d-Gal-III), O2 (и вариантов d-Gal-III), O2ac., О3, О4, О5, О7, О8 и О12; по меньшей мере, один сахарид, полученный из E.coli, имеющий структуру, выбранную из группы, состоящей из формулы O1A, формулы O1B, формулы O2, формулы O6 и формулы O25B.In some embodiments, the composition includes at least one saccharide that is or is derived from at least one serotype of K. pneumoniae selected from O1 (and d-Gal-III variants), O2 (and d-Gal-III variants), Gal-III), O2ac, O3, O4, O5, O7, O8 and O12; at least one saccharide derived from E. coli having a structure selected from the group consisting of Formula O8 and Formula O9. In some embodiments, the composition includes at least one saccharide that is or is derived from at least one serotype of K. pneumoniae selected from O1 (and d-Gal-III variants), O2 (and d-Gal-III variants), Gal-III), O2ac., O3, O4, O5, O7, O8 and O12; at least one saccharide derived from E. coli having a structure selected from the group consisting of formula O1A, formula O1B, formula O2, formula O6 and formula O25B.

В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно включает полипептид, полученный из K. pneumoniae, выбранный из полипептида, полученного из фимбриального белка типа I K. pneumoniae, или его иммуногенного фрагмента; и полипептид, полученный из фимбриального белка типа III K. pneumoniae или его иммуногенного фрагмента. Последовательности таких полипептидов известны в данной области техники.In some embodiments, the composition further comprises a K. pneumoniae- derived polypeptide selected from a K. pneumoniae type I fimbrial protein-derived polypeptide or an immunogenic fragment thereof; and a polypeptide derived from K. pneumoniae type III fimbrial protein or an immunogenic fragment thereof. The sequences of such polypeptides are known in the art.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

Для лучшего понимания настоящего изобретения приведены следующие примеры. Эти примеры предназначены только для целей иллюстрации и не должны рассматриваться как ограничивающие каким-либо образом объем изобретения. Следующие примеры иллюстрируют некоторые варианты осуществления изобретения. For a better understanding of the present invention, the following examples are given. These examples are for illustrative purposes only and should not be construed as limiting in any way the scope of the invention. The following examples illustrate some embodiments of the invention.

ПРИМЕР 1: Сущность конструкцийEXAMPLE 1: Essence of structures

Таблица 3Table 3 КонструкцияDesign Плазми даPlasma yes Сигнальная последова тельностьSignal sequence Описание белкаDescription of the protein ЛинкерLinker Вариант дополнительно го белкаExtra protein option Остовskeleton МассаWeight FimH лектиновый доменFimH lectin domain pSB01877pSB01877 FimH сигнальная последова тельностьFimH signal sequence FimH J96 F22..G181FimH J96 F22..G181 нетNo нетNo pcDNA3.1(+) или
pCAG векторpcDNA3.1(+) or
pCAG vector FimH лектиновый доменFimH lectin domain pSB01878pSB01878 mIgK сигнальная последова тельностьmIgK signal sequence FimH J96 F22..G181FimH J96 F22..G181 нетNo нетNo pcDNA3.1(+) или
pCAG векторpcDNA3.1(+) or
pCAG vector Полностью пониженная масса, с His-меткой: 18117.48
Наблюдаемая не пониженная масса, с His-меткой: 18117.90
Масса без метки:
17022.08Fully reduced weight, with His tag: 18117.48
Observed non-reduced weight, with His tag: 18117.90
Weight without mark:
17022.08 FimH/CFimH/C pSB01879pSB01879 FimH сигнальная последова тельностьFimH signal sequence FimH J96 F22..Q300FimH J96 F22..Q300 нетNo нетNo pBudCE4.1
Вектор с двойным промотором (CMV & EF1α)pBudCE4.1
Dual promoter vector (CMV & EF1α) FimH/CFimH/C pSB01880pSB01880 mIgK сигнальная последова тельностьmIgK signal sequence FimH J96 F22..Q300FimH J96 F22..Q300 нетNo нетNo pBudCE4.1
Вектор с двойным промотором (CMV & EF1α)pBudCE4.1
Dual promoter vector (CMV & EF1α) FimH/CFimH/C pSB01881pSB01881 mIgK сигнальная последова тельностьmIgK signal sequence FimC G37..E241 (согласно SEQ ID NO: 18)FimC G37..E241 (according to SEQ ID NO: 18) нетNo нетNo pBudCE4.1
Вектор с двойным промотором (CMV & EF1α)pBudCE4.1
Dual promoter vector (CMV & EF1α) FimH-dscGFimH-dscG pSB01882pSB01882 FimH сигнальная последова тельностьFimH signal sequence FimH J96 F22..Q300FimH J96 F22..Q300 DNKQDNKQ FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17)FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17) FimH-dscGFimH-dscG pSB01883pSB01883 FimH сигнальная последова тельностьFimH signal sequence FimH J96 F22..Q300FimH J96 F22..Q300 GGSGGGGSGG FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17)FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17) FimH-dscGFimH-dscG pSB01884pSB01884 FimH сигнальная последова тельностьFimH signal sequence FimH J96 F22..Q300FimH J96 F22..Q300 GGSSGGGGSSGG FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17)FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17) FimH-dscGFimH-dscG pSB01885 pSB01885 FimH сигнальная последова тельностьFimH signal sequence FimH J96 F22..Q300FimH J96 F22..Q300 GGSSGGGGGSSGGG FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17)FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17) N-концевой остаток на W20, и поэтому не кажется обработанным в предпочтительном положении; небольшое количество присутствующего белка, демонстрирующего предпочтительную обработку, как показано небольшим количеством определяемого FACK пептидаThe N-terminal residue is at W20, and therefore does not appear to be processed at a preferred position; small amount of protein present showing preferential processing as shown by small amount of detectable FACK peptide FimH-dscGFimH-dscG pSB01886 pSB01886 FimH сигнальная последова тельностьFimH signal sequence FimH J96 F22..Q300FimH J96 F22..Q300 GGGSSGGGGGGSSGGG FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17)FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17) FimH-dscGFimH-dscG pSB01887pSB01887 FimH сигнальная последова тельностьFimH signal sequence FimH J96 F22..Q300FimH J96 F22..Q300 GGGSGSGGGGGGSGSGGG FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17)FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17) FimH-dscGFimH-dscG pSB01888pSB01888 FimH сигнальная последова тельностьFimH signal sequence FimH J96 F22..Q300FimH J96 F22..Q300 GGGSGGSGGGGGGSGGSGGG FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17)FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17) FimH-dscGFimH-dscG pSB01889pSB01889 mIgK сигнальная последова тельностьmIgK signal sequence FimH J96 F22..Q300FimH J96 F22..Q300 DNKQDNKQ FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17)FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17) FimH-dscGFimH-dscG pSB01890pSB01890 mIgK сигнальная последова тельностьmIgK signal sequence FimH J96 F22..Q300FimH J96 F22..Q300 GGSGGGGSGG FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17)FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17) FimH-dscGFimH-dscG pSB01891pSB01891 mIgK сигнальная последова тельностьmIgK signal sequence FimH J96 F22..Q300FimH J96 F22..Q300 GGSSGG GGSSGG FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17)FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17) FimH-dscGFimH-dscG pSB01892pSB01892 mIgK сигнальная последова тельностьmIgK signal sequence FimH J96 F22..Q300FimH J96 F22..Q300 GGSSGGGGGSSGGG FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17)FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17) По видимому, имеет сигнальный пептид, обработанный с F22, являющимся предпочтительным N-концевым остатком; идентификация пептида подтверждается МС/МСAppears to have a signal peptide processed with F22 being the preferred N-terminal residue; peptide identification confirmed by MS/MS FimH-dscGFimH-dscG pSB01893pSB01893 mIgK сигнальная последова тельностьmIgK signal sequence FimH J96 F22..Q300FimH J96 F22..Q300 GGGSSGGGGGGSSGGG FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17)FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17) FimH-dscGFimH-dscG pSB01894pSB01894 mIgK сигнальная последова тельностьmIgK signal sequence FimH J96 F22..Q300FimH J96 F22..Q300 GGGSGSGGGGGGSGSGGG FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17)FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17) FimH-dscGFimH-dscG pSB01895pSB01895 mIgK сигнальная последова тельностьmIgK signal sequence FimH J96 F22..Q300FimH J96 F22..Q300 GGGSGGSGGGGGGSGGSGGG FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17)FimG A1..K14 (SEQ ID NO: 17) FimH лектиновый доменFimH lectin domain pSB02081pSB02081 mIgK сигнальная последова тельностьmIgK signal sequence F22..G181 J96 FimH N28Q N91S/His8 в pcDNA3.1 (+)F22..G181 J96 FimH N28Q N91S/His8 in pcDNA3.1 (+) FimH лектиновый доменFimH lectin domain pSB02082pSB02082 mIgK сигнальная последова тельностьmIgK signal sequence F22..G181 J96 FimH N28Q N91S/His8 в pcDNA3.1 (+)F22..G181 J96 FimH N28Q N91S/His8 in pcDNA3.1 (+) FimH лектиновый доменFimH lectin domain pSB02083pSB02083 mIgK сигнальная последова тельностьmIgK signal sequence F22..G181 J96 FimH N28S N91S/His8 в pcDNA3.1 (+)F22..G181 J96 FimH N28S N91S/His8 in pcDNA3.1 (+) FimH лектиновый доменFimH lectin domain pSB02088pSB02088 mIgK сигнальная последова тельностьmIgK signal sequence F22..G181 J96 FimH V48C L55C/His8 в pcDNA3.1 (+)F22..G181 J96 FimH V48C L55C/His8 in pcDNA3.1 (+) FimH лектиновый доменFimH lectin domain pSB02089pSB02089 mIgK сигнальная последова тельностьmIgK signal sequence F22..G181 J96 FimH N28Q V48C L55C N91S/His8 в pcDNA3.1 (+)F22..G181 J96 FimH N28Q V48C L55C N91S/His8 in pcDNA3.1 (+) FimH лектиновый доменFimH lectin domain pSB02158pSB02158 mIgK сигнальная последова тельностьmIgK signal sequence F22..G181 J96 FimH N28S V48C L55C N91S/His8 в pcDNA3.1 (+)F22..G181 J96 FimH N28S V48C L55C N91S/His8 in pcDNA3.1 (+) FimH-dscGFimH-dscG pSB02159pSB02159 FimH-dscGFimH-dscG pSB02198pSB02198 mIgK сигнальная последова тельностьmIgK signal sequence FimH mIgK сигнальный пептид/ F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S N249Q/7 AA линкер/ FimG A1..K14/ GGHis8 в pcDNA3.1 (+)FimH mIgK signal peptide/ F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S N249Q/7 AA linker/ FimG A1..K14/ GGHis8 in pcDNA3.1 (+) FimH-dscGFimH-dscG pSB02199pSB02199 mIgK сигнальная последова тельностьmIgK signal sequence FimH mIgK сигнальный пептид/ F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S N256Q/ 7 AA линкер/ FimG A1..K14/ GGHis8 в pcDNA3.1 (+)FimH mIgK signal peptide/ F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S N256Q/ 7 AA linker/ FimG A1..K14/ GGHis8 in pcDNA3.1 (+) FimH-dscGFimH-dscG pSB02200pSB02200 mIgK сигнальная последова тельностьmIgK signal sequence FimH mIgK сигнальный пептид/ F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S N249Q N256Q/ 7 AA линкер/ FimG A1..K14/ GGHis8 в pcDNA3.1 (+)FimH mIgK signal peptide/ F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S N249Q N256Q/ 7 AA linker/ FimG A1..K14/ GGHis8 in pcDNA3.1 (+) FimH-dscGFimH-dscG pSB02304pSB02304 mIgK сигнальная последова тельностьmIgK signal sequence FimH mIgK сигнальный пептид/ F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S T251A/ 7 AA линкер/ FimG A1..K14/ GGHis8 в pcDNA3.1 (+)FimH mIgK signal peptide/ F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S T251A/ 7 AA linker/ FimG A1..K14/ GGHis8 in pcDNA3.1 (+) FimH-dscGFimH-dscG pSB02305pSB02305 mIgK сигнальная последова тельностьmIgK signal sequence FimH mIgK сигнальный пептид/ F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S T258A/ 7 AA линкер/ FimG A1..K14/ GGHis8 в pcDNA3.1 (+)FimH mIgK signal peptide/ F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S T258A/ 7 AA linker/ FimG A1..K14/ GGHis8 in pcDNA3.1 (+) FimH-dscGFimH-dscG pSB02306pSB02306 mIgK сигнальная последова тельностьmIgK signal sequence FimH mIgK сигнальный пептид/ F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S T251A T258A/ 7 AA линкер/ FimG A1..K14/ GGHis8 в pcDNA3.1 (+)FimH mIgK signal peptide/ F22..Q300 J96 FimH N28S V48C L55C N91S T251A T258A/ 7 AA linker/ FimG A1..K14/ GGHis8 in pcDNA3.1 (+) FimH-dscGFimH-dscG pSB02307pSB02307 mIgK сигнальная последова тельностьmIgK signal sequence FimH mIgK сигнальный пептид/ F22..Q300 J96 FimH N28S N91S N249Q/ 7 AA линкер/ FimG A1..K14/ GGHis8 в pcDNA3.1 (+)FimH mIgK signal peptide/ F22..Q300 J96 FimH N28S N91S N249Q/ 7 AA linker/ FimG A1..K14/ GGHis8 in pcDNA3.1 (+) FimH-dscGFimH-dscG pSB02308pSB02308 mIgK сигнальная последова тельностьmIgK signal sequence FimH mIgK сигнальный пептид/ F22..Q300 J96 FimH N28S N91S N256Q/ 7 AA линкер/ FimG A1..K14/ GGHis8 в pcDNA3.1 (+)FimH mIgK signal peptide/ F22..Q300 J96 FimH N28S N91S N256Q/ 7 AA linker/ FimG A1..K14/ GGHis8 in pcDNA3.1 (+)

Все исследованные конструкции FimH представляют собой мономерные белки ожидаемой молекулярной массы.All FimH constructs examined are monomeric proteins of the expected molecular weight.

Таблица 4Table 4 БелокProtein Коэффициент седиментации, SSedimentation coefficient, S МM _{м, применяемаяm, applied} МM _{м, ожидаемаяm, expected} ОднородностьUniformity Выражение E. coliE. coli expression Цитозольный FimH-LDCytosolic FimH-LD 1,9 S1.9S 18 кДа18 kDa 18 кДа18 kDa 98%98% Периплазматический FimH-LDPeriplasmic FimH-LD 1,9 S1.9S 18 кДа18 kDa 18 кДа18 kDa 98%98% Закрытый мутант FimH-LDClosed mutant FimH-LD 2,0 S2.0S 19 кДа19 kDa 18 кДа18 kDa 97%97% Экспрессия у млекопитающихExpression in mammals FimH-LDFimH-LD 1,9 S1.9S 18 кДа18 kDa 18 кДа18 kDa >99%>99% Закрытый мутант FimH-LDClosed mutant FimH-LD 1,9 S1.9S 18 кДа18 kDa 18 кДа18 kDa 98%98% FimH дикого типаwild type FimH 2,7 S2.7S 36 кДа36 kDa 34 кДа34 kDa 96%96% Закрытый мутант FimHClosed mutant FimH 2,7 S2.7S 34 кДа34 kDa 34 кДа34 kDa 94%94%

Ожидаемая молекулярная масса комплекса FimC-FimH составляет 53,1 кДа;The expected molecular weight of the FimC-FimH complex is 53.1 kDa;

Ожидаемая молекулярная масса FimC составляет 24 кДа.The expected molecular weight of FimC is 24 kDa.

ПРИМЕР 2: Экспрессия связывающего домена лектина FimH у млекопитающихEXAMPLE 2: Expression of the FimH lectin binding domain in mammals

Настоящий неограничивающий пример относится к получению полипептида, полученного из E.coli, или его фрагмента в клеточной линии НЕК. Выходы являются относительно высокими по сравнению с экспрессией полипептида, полученного из E.coli, или его фрагмента в клетке-хозяине E.coli. This non-limiting example relates to the production of an E. coli- derived polypeptide or fragment thereof in a HEK cell line. Yields are relatively high compared to expression of an E. coli- derived polypeptide or fragment thereof in an E. coli host cell.

Для продуцирования вариантов FimH из клеток млекопитающих используют алгоритм прогнозирования SignalP для анализа различных гетерологичных сигнальных последовательностей для секреции белков и фрагментов. Также анализируют лидерную последовательность FimH дикого типа. Прогнозы показывают, что лидерная последовательность FimH дикого типа может работать для секреции вариантов FimH в клетках млекопитающих, однако было предсказано, что секретируемый вариант расщепляется на остатке W20 полноразмерного FimH дикого типа (см. SEQ ID NO: 1), а не на остатке F22 полноразмерного FimH дикого типа (см. SEQ ID NO: 1). Было предсказано, что сигнальная последовательность гемагглютинина не работает. Было предсказано, что сигнальная последовательность IgK мыши продуцирует N-конец F22 SEQ ID NO: 1 или остаток F1 зрелого белка.To produce FimH variants from mammalian cells, the SignalP prediction algorithm is used to analyze various heterologous signal sequences for secretion of proteins and fragments. The leader sequence of wild-type FimH was also analyzed. Predictions indicate that the wild-type FimH leader sequence may function to secrete FimH variants in mammalian cells, however, the secreted variant was predicted to cleave at residue W20 of full-length wild-type FimH (see SEQ ID NO: 1) rather than at residue F22 of full-length Wild type FimH (see SEQ ID NO: 1). The hemagglutinin signal sequence was predicted to be dysfunctional. The mouse IgK signal sequence was predicted to produce the N-terminus of F22 SEQ ID NO: 1 or the F1 residue of the mature protein.

На основании этих анализов синтезируют ДНК и рекомбинантно получают конструкции для экспрессии лектин-связывающего домена FimH с FimH-лидером дикого типа. Также получают конструкции для экспрессии лектин-связывающего домена FimH с сигнальной последовательностью mIgK. Метки аффинной очистки, такие как His-метка, вводят на С-конце полипептида, полученного из E. coli, или его фрагмента для облегчения очистки.Based on these assays, DNA was synthesized and constructs were recombinantly generated to express the FimH lectin-binding domain with the wild-type FimH leader. Constructs for expression of the FimH lectin binding domain with the mIgK signal sequence are also prepared. Affinity purification tags, such as a His tag, are introduced at the C-terminus of the E. coli- derived polypeptide or fragment thereof to facilitate purification.

Экспрессионную плазмиду трансфицируют в клетки-хозяева НЕК, а именно в клетки млекопитающих EXPI293.The expression plasmid is transfected into HEK host cells, namely mammalian EXPI293 cells.

Полипептиды или их фрагменты, полученные из E.coli, успешно экспрессируют. Например, предпочтительная N-концевая обработка с использованием сигнальной последовательности mIgK, слитой со зрелым началом FimH в F22, продемонстрируют для конструкции pSB01892 FimHdscG с помощью МС. Считается, что обработка корректирует конструкцию домена лектина pSB01878, и данные масс-спектра подтверждают это.Polypeptides or fragments thereof derived from E. coli are successfully expressed. For example, preferential N-terminal processing using the mIgK signal sequence fused to the mature origin of FimH in F22 was demonstrated for the pSB01892 FimHdscG construct by MS. The treatment is thought to correct the design of the lectin domain of pSB01878, and mass spectral data support this.

Предпочтительная N-концевая обработка (т.е. обработка в F22 SEQ ID NO: 1) не показана для нативного лидерного пептида FimH.Preferred N-terminal processing (ie, processing in F22 SEQ ID NO: 1) is not indicated for the native FimH leader peptide.

Конструкции pSB01877 и pSB01878 находятся в векторах экспрессии pcDNA3.1(+) млекопитающих. Клетки разводят и затем используют для трансфекции по 20 мл. Используют 1 мкг/мл ДНК для каждой конструкции и трансфицируют клетки в 125 мл колбах с использованием протокола Expifectamine. Через 72 часа, жизнеспособность клеток все еще остается хорошей, поэтому экспрессию продолжают до 96 часов. Образцы берут через 72 часа и анализируют по 10 мкл каждого на гелях SDS PAGE для проверки экспрессии.Constructs pSB01877 and pSB01878 are in mammalian expression vectors pcDNA3.1(+). Cells are diluted and then used for transfection in 20 ml volumes. Use 1 μg/ml DNA for each construct and transfect cells in 125 ml flasks using the Expifectamine protocol. After 72 hours, cell viability is still good, so expression is continued until 96 hours. Samples were collected after 72 hours and analyzed at 10 μl of each on SDS PAGE gels to check expression.

Через 96 часов, кондиционированную среду собирают и добавляют 0,25 мл смолы Nickel Excel с периодическим связыванием O/N при 4℃ при вращении. Элюируют TrisCl pH 8,0, NaCl, имидазолом. См. ФИГ. 4.After 96 hours, the conditioned medium is collected and 0.25 ml of Nickel Excel resin is added with O/N intermittent coupling at 4℃ with rotation. Elute with TrisCl pH 8.0, NaCl, imidazole. See FIG. 4.

Ожидаемая масса pSB01878 соответствует N-концевому F22. Гликозилирование присутствует на 1 или 2 сайтах (+1 масса от каждого дезамидирования N-D).The expected mass of pSB01878 corresponds to the N-terminal F22. Glycosylation is present at 1 or 2 sites (+1 mass from each N-D deamidation).

Конструируют мутанты гликозилирования. См., например, pSB02081, pSB02082, pSB02083, pSB02088 и pSB02089. Мутанты гликозилирования экспрессируют представляющие интерес полипептиды. Результаты см. на ФИГ. 5.Glycosylation mutants are constructed. See, for example, pSB02081, pSB02082, pSB02083, pSB02088, and pSB02089. Glycosylation mutants express polypeptides of interest. For results see FIG. 5.

Также конструируют замкнутый мутант лектинового домена FimH. См., например, pSB02158. Результаты экспрессии конструкции pSB02158 показаны на ФИГ. 6В.A closed mutant of the FimH lectin domain was also constructed. See, for example, pSB02158. Expression results of construct pSB02158 are shown in FIG. 6B.

Анализ поляризации флуоресценции с использованием 0,5 пмолей аминофенил-маннопиранозида, конъюгированного с флуоресцеином (APMP). Анализ проводят при комнатной температуре, 300 об/мин в течение 64 ч. Результаты, показаны на ФИГ. 6С.Fluorescence polarization assay using 0.5 pmol of fluorescein-conjugated aminophenyl-mannopyranoside (APMP). The analysis is carried out at room temperature, 300 rpm for 64 hours. The results are shown in FIG. 6C.

ПРИМЕР 3: Экспрессия комплекса FimH/C у млекопитающих, pSB01879 и pSB01880EXAMPLE 3: Expression of the FimH/C complex in mammals, pSB01879 and pSB01880

Для получения комплекса FimH/C получают конструкции с двойной экспрессией FimC под промотором EF1alpha и FimH с сигнальным пептидом либо дикого типа, либо mIgK. Их клонируют в вектор экспрессии млекопитающих pBudCE4.1 (ThermoFisher) и к FimC добавляли His-метку C-конца. Вариант FimC разрабатывают для секреции с использованием сигнального пептида mIgK, поскольку это приводит к положительному прогнозу образования FimC G37 в качестве первого остатка зрелого белка на основе анализа SignalP.To obtain the FimH/C complex, constructs with dual expression of FimC under the EF1alpha promoter and FimH with either wild type or mIgK signal peptide are prepared. They were cloned into the mammalian expression vector pBudCE4.1 (ThermoFisher) and a C-terminal His tag was added to FimC. The FimC variant is designed for secretion using the mIgK signal peptide because it results in the positive prediction of FimC G37 as the first residue of the mature protein based on SignalP analysis.

Более конкретно, эти конструкции конструируют таким образом, чтобы фрагмент FimC находился под промотором EF1alpha в векторе pBudCE4.1, и фрагмент FimH был вставлен под промотором CMV в том же векторе. Вектор pBudCE4.1 представляет собой вектор экспрессии от Thermo Fisher, который имеет 2 промотора для экспрессии в клетках млекопитающих. Вставку фрагмента FimC (вставку pSB01881) субклонируют путем расщепления NotI и XhoI и субклонирования в вектор pBudCE4.1 в тех же сайтах. Их высевают на чашки с 2xYT зеоцином в количестве 50 мкг/мл. Колонии инокулируют в 2xYT с 50 мкг/мл зеоцина, выращивают в течение ночи при 37℃ и готовят плазмиду. Их расщепляют NotI и XhoI для проверки наличия вставки, и все колонии имеют размер вставки ~722 п.н.More specifically, these constructs are designed such that the FimC fragment is placed under the EF1alpha promoter in the pBudCE4.1 vector, and the FimH fragment is inserted under the CMV promoter in the same vector. Vector pBudCE4.1 is an expression vector from Thermo Fisher that has 2 promoters for expression in mammalian cells. The FimC fragment insert (insert pSB01881) was subcloned by digestion with NotI and XhoI and subcloning into the pBudCE4.1 vector at the same sites. They are plated on plates containing 2xYT zeocin at 50 μg/ml. Colonies were inoculated in 2xYT with 50 μg/ml Zeocin, grown overnight at 37℃ and plasmid prepared. They are digested with NotI and XhoI to test for the presence of the insert, and all colonies have an insert size of ~722 bp.

pSB01881 расщепляют HindIII и BamHI, и ДНК вставки pSB01879 и вставки pSB01880 расщепляют HindIII и BamHI. Эти фрагменты выделяют из геля и субклонируют в вектор pSB01881 и высевают на планшеты 2xYT zeo 50 мкг/мл. Колонии от каждого инокулируют в 2xYT zeo 50 мкг/мл, выращивают в течение ночи при 37℃, готовят плазмиду и расщепляют с помощью NotI и XhoI для тестирования вставки FimC и HindIII и BamHI для тестирования вставки FimH. Все клоны имеют вставки ожидаемого размера в обоих сайтах клонирования. Клоны pSB01879-1 и pSB01880-1 впоследствии используют для экспрессии.pSB01881 is digested with HindIII and BamHI, and the DNA of the pSB01879 insert and the pSB01880 insert is digested with HindIII and BamHI. These fragments were isolated from the gel and subcloned into the pSB01881 vector and plated on 2xYT zeo 50 μg/ml plates. Colonies from each are inoculated in 2xYT zeo 50 μg/ml, grown overnight at 37℃, plasmid prepared and digested with NotI and XhoI to test the FimC insertion and HindIII and BamHI to test the FimH insertion. All clones have inserts of the expected size at both cloning sites. Clones pSB01879-1 and pSB01880-1 were subsequently used for expression.

Было показано, что комплекс FimH/FimC также экспрессируется в клетках EXPI293. Экспрессию можно оптимизировать, переключая промоторы, такие как EF1α, CAG, Ub, Tub или другие промоторы.The FimH/FimC complex has also been shown to be expressed in EXPI293 cells. Expression can be optimized by switching promoters such as EF1α, CAG, Ub, Tub or other promoters.

Предпочтительная N-концевая обработка (т.е. обработка на F22 SEQ ID NO: 1) не показана для нативного лидерного пептида FimH.Preferred N-terminal processing (ie processing at F22 SEQ ID NO: 1) is not indicated for the native FimH leader peptide.

Типовые результаты SignalP 4.1 (DTU Bioinformatics), используемые для прогнозирования сигнальных пептидов, показаны ниже. Предполагается, что дополнительные сигнальные пептиды будут продуцировать предпочтительный N-конец Phe в положении 1 зрелого полипептида FimH или его фрагмента. Ниже приведен только типовой набор из 4 общих сигнальных последовательностей.Typical SignalP 4.1 (DTU Bioinformatics) results used for signal peptide prediction are shown below. Additional signal peptides are expected to produce a preferred N-terminus of Phe at position 1 of the mature FimH polypeptide or fragment thereof. Below is just a typical set of 4 common signal sequences.

Прогнозируют, что следующие последовательности сигнальных пептидов дают предпочтительный N-конец Phe в положении 1 зрелого полипептида FimH или его фрагмента:The following signal peptide sequences are predicted to give a preferred N-terminus of Phe at position 1 of the mature FimH polypeptide or fragment thereof:

Таблица 5Table 5 Последовательность сигнального пептидаSignal peptide sequence SEQ ID NO:SEQ ID NO: >sp|P55899|FCGRN_HUMAN IgG рецептор FcRn большая субъединица p51 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=FCGRT PE=1 SV=1>sp|P55899|FCGRN_HUMAN IgG receptor FcRn large subunit p51 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=FCGRT PE=1 SV=1 MGVPRPQPWALGLLLFLLPGSLGMGVPRPQPWALGLLLFLLPGSLG SEQ ID NO: 55SEQ ID NO: 55 >tr|Q6FGW4|Q6FGW4_HUMAN IL10 белок OS=Homo sapiens OX=9606 GN=IL10 PE=2 SV=1>tr|Q6FGW4|Q6FGW4_HUMAN IL10 protein OS=Homo sapiens OX=9606 GN=IL10 PE=2 SV=1 MHSSALLCCLVLLTGVRAMHSSALLCCLVLLTGVRA SEQ ID NO: 56SEQ ID NO: 56

Не было спрогнозировано, что следующие последовательности сигнальных пептидов будут давать предпочтительный N-конец Phe в положении 1 зрелого полипептида FimH или его фрагмента:The following signal peptide sequences were not predicted to produce a preferred N-terminus of Phe at position 1 of the mature FimH polypeptide or fragment thereof:

Таблица 6Table 6 Последовательность сигнального пептидаSignal peptide sequence SEQ ID NO:SEQ ID NO: >sp|P03420|FUS_HRSVA слитый гликопротеин F0 OS=респираторный синцитиальный вирус человека A (штамм A2) OX=11259 GN=F PE=1 SV=1>sp|P03420|FUS_HRSVA fusion glycoprotein F0 OS=human respiratory syncytial virus A (strain A2) OX=11259 GN=F PE=1 SV=1 SEQ ID NO: 57SEQ ID NO: 57 >sp|P03451|HEMA_I57A0 гемагглютинин OS=вирус гриппа A (штамм A/Japan/305/1957 H2N2) OX=387161 GN=HA PE=1 SV=1>sp|P03451|HEMA_I57A0 hemagglutinin OS=influenza A virus (strain A/Japan/305/1957 H2N2) OX=387161 GN=HA PE=1 SV=1 MAIIYLILLFTAVRGMAIIYLILLFTAVRG SEQ ID NO: 58SEQ ID NO: 58

Таблица 7Table 7 SignalP 4.1, используемый для прогнозовSignalP 4.1 used for forecasts Последовательность слиянияMerge sequence >sp|P55899|FCGRN_HUMAN IgG рецептор FcRn большая субъединица p51 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=FCGRT PE=1 SV=1
MGVPRPQPWALGLLLFLLPGSLGAESHLSLLYHLTAVSSPAPGTPAFWVSGWLGPQQYLSYNSLRGEAEPCGAWVWENQVSWYWEKETTDLRIKEKLFLEAFKALGGKGPYTLQGLLGCELGPDNTSVPTAKFALNGEEFMNFDLKQGTWGGDWPEALAISQRWQQQDKAANKELTFLLFSCPHRLREHLERGRGNLEWKEPPSMRLKARPSSPGFSVLTCSAFSFYPPELQLRFLRNGLAAGTGQGDFGPNSDGSFHASSSLTVKSGDEHHYCCIVQHAGLAQPLRVELESPAKSSVLVVGIVIGVLLLTAAAVGGALLWRRMRSGLPAPWISLRGDDTGVLLPTPGEAQDADLKDVNV IPATA (SEQ ID NO: 102)>sp|P55899|FCGRN_HUMAN IgG receptor FcRn large subunit p51 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=FCGRT PE=1 SV=1
MGVPRPQPWALGLLLFLLPGSLGAESHLSLLYHLTAVSSPAPGTPAFWVSGWLGPQQYLSYNSLRGEAEPCGAWVWENQVSWYWEKETTDLRIKEKLFLEAFKALGGKGPYTLQGLLGCELGPDNTSVPTAKFALNGEEFMNFDLKQGTWGGDWPEALAISQRWQQQDKAANKELTFLLFSCPHRLREHLERGRGNLEWK EPPSMRLKARPSSPGFSVLTCSAFSFYPPELQLRFLRNGLAAGTGQGDFGPNSDGSFHASSSLTVKSGDEHHYCCIVQHAGLAQPLRVELESPAKSSVLVVGIVIGVLLLTAAAVGGALLWRRMRSGLPAPWISLRGDDTGVLLPTPGEAQDADLKDVNV IPATA (SEQ ID NO: 102) Сигнальный пептид из белка, указанного в соответствующем левом столбце, показан ниже ЗАГЛАВНЫМИ БУКВАМИ. N-конец FimH изображен строчными буквами.
MGVPRPQPWALGLLLFLLPGSLGfacktangtaipigggsanvyvnlapvvnvgqnlvvdls (SEQ ID NO: 103)The signal peptide from the protein listed in the corresponding left column is shown below in CAPITAL LETTERS. The N-terminus of FimH is shown in lowercase letters.
MGVPRPQPWALGLLLFLLPGSLGfacktangtaipigggsanvyvnlapvvnvgqnlvvdls (SEQ ID NO: 103) # Измерение Положение Значение Отсечка сигнальный пептид?# Measurement Position Value Signal peptide cutoff? max. С 24 0,664max. C 24 0.664 max. Y 24 0,788max. Y24 0.788 max. S 9 0,966max. S 9 0.966 среднее S 1-23 0,935average S 1-23 0.935 D 1-23 0,867 0,450 ДАD 1-23 0.867 0.450 YES Наименование=Последовательность SP='ДА' Сайт расщепления между положениями 23 и 24: SLG-FA D=0,867 D-отсечка=0,450 Сети=SignalP-безТМ Name=Sequence SP= ' YES ' Cleavage site between positions 23 and 24: SLG-FA D=0.867 D-cut=0.450 Networks=SignalP-noTM >sp|P03420|FUS_HRSVA Слитый гликопротеин F0 OS= Респираторный синцитиальный вирус A человека (штамм A2) OX=11259 GN=F PE=1 SV=1
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPPTNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEINLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGMDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN (SEQ ID NO: 104)>sp|P03420|FUS_HRSVA Fusion glycoprotein F0 OS= Human respiratory syncytial virus A (strain A2) OX=11259 GN=F PE=1 SV=1
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPPTNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNY IDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEINLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDV (SEQ ID NO: 104) Сигнальный пептид из белка, указанного в соответствующем левом столбце, показан ниже ЗАГЛАВНЫМИ БУКВАМИ. N-конец FimH изображен строчными буквами.
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGfacktangtaipigggsanvyvnlapvvnvgqnlvvdls (SEQ ID NO: 105)The signal peptide from the protein listed in the corresponding left column is shown below in CAPITAL LETTERS. The N-terminus of FimH is shown in lowercase letters.
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGfacktangtaipigggsanvyvnlapvvnvgqnlvvdls (SEQ ID NO: 105) # Измерение Положение Значение Отсечка сигнальный пептид?
Max. С 28 0,188
Max. Y 28 0,263
Max. S 11 0,478
среднее S 1-27 0,387
D 1-27 0,312 0,500 НЕТ
Название=Последовательность SP='НЕТ' D=0,312 D-отсечка=0,500 Сети=SignalP-TM # Measurement Position Value Signal peptide cutoff?
Max. C 28 0.188
Max. Y 28 0.263
Max. S 11 0.478
average S 1-27 0.387
D 1-27 0.312 0.500 NO
Name=Sequence SP= ' NO ' D=0.312 D-cut=0.500 Networks=SignalP-TM >tr|Q6FGW4|Q6FGW4_HUMAN Белок IL10 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=IL10 PE=2 SV=1
MHSSALLCCLVLLTGVRASPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 106)>tr|Q6FGW4|Q6FGW4_HUMAN Protein IL10 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=IL10 PE=2 SV=1
MHSSALLCCLVLLTGVRASPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 106) Сигнальный пептид из белка, указанного в соответствующем левом столбце, показан ниже ЗАГЛАВНЫМИ БУКВАМИ. N-конец FimH изображен строчными буквами.
MHSSALLCCLVLLTGVRAfacktangtaipigggsanvyvnlapvvnvgqnlvvdls (SEQ ID NO: 107)The signal peptide from the protein listed in the corresponding left column is shown below in CAPITAL LETTERS. The N-terminus of FimH is shown in lowercase letters.
MHSSALLCCLVLLTGVRAfacktangtaipigggsanvyvnlapvvnvgqnlvvdls (SEQ ID NO: 107) # Измерение Положение Значение Отсечка сигнальный пептид?
Max. С 19 0,726
Max. Y 19 0,829
Max. S 4 0,973
среднее S 1-18 0,947
D 1-18 0,893 0,450 ДА
Наименование=Последовательность SP='ДА' Сайт расщепления между положениями 18 и 19: VRA-FA D=0,893 D-отсечка=0,450 Сети=SignalP-безТМ # Measurement Position Value Signal peptide cutoff?
Max. C 19 0.726
Max. Y 19 0.829
Max. S 4 0.973
average S 1-18 0.947
D 1-18 0.893 0.450 YES
Name=Sequence SP= ' YES ' Cleavage site between positions 18 and 19: VRA-FA D=0.893 D-cut=0.450 Networks=SignalP-noTM >sp|P03451|HEMA_I57A0 Гемагглютинин OS=Вирус гриппа А (штамм A/Japan/305/1957 H2N2) OX=387161 GN=HA PE=1 SV=1
MAIIYLILLFTAVRGDQICIGYHANNSTEKVDTNLERNVTVTHAKDILEKTHNGKLCKLNGIPPLELGDCSIAGWLLGNPECDRLLSVPEWSYIMEKENPRDGLCYPGSFNDYEELKHLLSSVKHFEKVKILPKDRWTQHTTTGGSRACAVSGNPSFFRNMVWLTKEGSDYPVAKGSYNNTSGEQMLIIWGVHHPIDETEQRTLYQNVGTYVSVGTSTLNKRSTPEIATRPKVNGQGGRMEFSWTLLDMWDTINFESTGNLIAPEYGFKISKRGSSGIMKTEGTLENCETKCQTPLGAINTTLPFHNVHPLTIGECPKYVKSEKLVLATGLRNVPQIESRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNDQGSGYAADKESTQKAFDGITNKVNSVIEKMNTQFEAVGKEFGNLERRLENLNKRMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRMQLRDNVKELGNGCFEFYHKCDDECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSMGVYQILAIYATVAGSLSLAIMMAGISFWMCSNGSLQCRICI (SEQ ID NO: 108)>sp|P03451|HEMA_I57A0 Hemagglutinin OS=Influenza A virus (strain A/Japan/305/1957 H2N2) OX=387161 GN=HA PE=1 SV=1
MAIIYLILLFTAVRGDQICIGYHANNSTEKVDTNLERNVTVTHAKDILEKTHNGKLCKLNGIPPLELGDCSIAGWLLGNPECDRLLSVPEWSYIMEKENPRDGLCYPGSFNDYEELKHLLSSVKHFEKVKILPKDRWTQHTTTGGSRACAVSGNPSFFRNMVWLTKEGSDYPVAKGSYNNTSGEQMLIIWGVHHPIDETEQ RTLYQNVGTYVSVGTSTLNKRSTPEIATRPKVNGQGGRMEFSWTLLDMWDTINFESTGNLIAPEYGFKISKRGSSGIMKTEGTLENCETKCQTPLGAINTTLPFHNVHPLTIGECPKYVKSEKLVLATGLRRNVPQIESRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNDQGSGYAADKESTQKAFDGITNKVNSVIEKMNT QFEAVGKEFGNLERRLENLNKRMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRMQLRDNVKELGNGCFEFYHKCDDECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSMGVYQILAIYATVAGSLSLAIMMAGISFWMCSNGSLQCRICI (SEQ ID NO: 108) Сигнальный пептид из белка, указанного в соответствующем левом столбце, показан ниже ЗАГЛАВНЫМИ БУКВАМИ. N-конец FimH изображен строчными буквами.
MAIIYLILLFTAVRGfacktangtaipigggsanvyvnlapvvnvgqnlvvdls (SEQ ID NO: 109)The signal peptide from the protein listed in the corresponding left column is shown below in CAPITAL LETTERS. The N-terminus of FimH is shown in lowercase letters.
MAIIYLILLFTAVRGfacktangtaipigggsanvyvnlapvvnvgqnlvvdls (SEQ ID NO: 109) # Измерение Положение Значение Отсечка сигнальный пептид?
Max. С 18 0,524
Max. Y 18 0,690
Max. S 1 0,951
среднее S 1-17 0,895
D 1-17 0,800 0,450 ДА
Наименование=Последовательность SP='ДА' Сайт расщепления между положениями 17 и 18: GFA-CK D=0,800 D-отсечка=0,450 Сети=SignalP-безТМ # Measurement Position Value Signal peptide cutoff?
Max. C 18 0.524
Max. Y 18 0.690
Max. S 1 0.951
average S 1-17 0.895
D 1-17 0.800 0.450 YES
Name=Sequence SP= ' YES ' Cleavage site between positions 17 and 18: GFA-CK D=0.800 D-cut=0.450 Networks=SignalP-noTM

ПРИМЕР 4: Экспрессия слияния комплемента донорной цепи FimH с пептидом FimG у млекопитающих.EXAMPLE 4: Expression of FimH donor strand complement fusion with FimG peptide in mammals.

Тестируют несколько длин линкера. Получают рекомбинантную экспрессию с этими линкерами, слитыми FimH с N-концевым пептидом FimG как в FimH дикого типа, так и в сигнальном пептиде mIgK, слитом с F22 FimH.Several linker lengths are tested. Recombinant expression is obtained with these linkers fused FimH to the N-terminal FimG peptide in both wild-type FimH and the mIgK signal peptide fused to F22 FimH.

Также показано, что конструкции FimG комплемента донорной цепи FimH обладают устойчивой экспрессией в клетках EXPI293.FimG constructs complementing the FimH donor chain have also been shown to have robust expression in EXPI293 cells.

Для комплементарных конструкций донорной цепи конструируют олигонуклеотиды для получения базовых конструкций в pcDNA3.1(+), которые содержат различные линкеры и пептид FimG. Уникальный сайт BstEII вставляют на остатках G294 V295 T296 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1 FimH. Тот же самый сайт BstEII вставляют в линкеры для получения базовых конструкций.For complementary donor strand constructs, oligonucleotides are designed to generate base constructs in pcDNA3.1(+), which contain various linkers and the FimG peptide. A unique BstEII site is inserted at residues G294 V295 T296 according to SEQ ID NO: 1 FimH. The same BstEII site is inserted into the linkers to generate base constructs.

Конструируют базовые конструкции для pSB01882-01895. Праймеры используют для ПЦР-амплификации pcDNA3.1(+) с ДНК полимеразой ACCUPRIME PFX (Thermo Fisher), расщепления продуктов ПЦР с помощью NdeI (в промоторе CMV) и BamHI и клонирования в pcDNA3.1(+), который расщепляют с помощью NdeI и BamHI и гель выделяют для удаления фрагмента.Construct basic structures for pSB01882-01895. Primers are used to PCR amplify pcDNA3.1(+) with ACCUPRIME PFX DNA polymerase (Thermo Fisher), digest the PCR products with NdeI (in the CMV promoter) and BamHI, and clone into pcDNA3.1(+), which is digested with NdeI and BamHI and the gel is isolated to remove the fragment.

Другую временную трансфекцию проводят с pSB01877, 01878, 01879, 01880, 01885 и 01892 вместе с клетками EXPI293 в качестве контроля.Another transient transfection was performed with pSB01877, 01878, 01879, 01880, 01885, and 01892 along with EXPI293 cells as a control.

Конструкции pSB01882 - pSB01895 используют при тестировании экспрессии временной трансфекции в клетках EXPI293 от Thermo Fisher в соответствии с протоколом производителя. См. ФИГ. 3, которая показывает результаты после экспрессии в 20 мл клеток EXPI293, 72 часа, с 10 мкл загруженной кондиционированной среды; наблюдается высокий уровень экспрессии; комплекс FimH/FimC присутствует после экспрессии из конструкций pSB01879 и pSB01880; 20 мл партии кондиционированных сред, связанных с Nickel Excel, промывка 40 CV, элюирование имдидазолом.Constructs pSB01882 to pSB01895 were used in transient transfection expression assays in EXPI293 cells from Thermo Fisher according to the manufacturer's protocol. See FIG. 3, which shows results after expression in 20 ml EXPI293 cells, 72 hours, with 10 µl loaded conditioned medium; there is a high level of expression; the FimH/FimC complex is present after expression from constructs pSB01879 and pSB01880; 20 ml batch of Nickel Excel bound conditioned media, 40 CV wash, imdidazole elution.

Получают дополнительные конструкции комплемента FimH-донорной цепи. См., например, конструкции pSB02198, pSB02199, pSB02200, pSB02304, pSB02305, pSB02306, pSB02307, pSB02308. Экспрессия конструкции замкнутого мутанта pSB2198 FimH dscG показана на ФИГ. 7. Замкнутый мутант pSB2198 FimH dscG дает 12 мг/л в результате временной экспрессии.Additional FimH-donor strand complement constructs are obtained. See, for example, designs pSB02198, pSB02199, pSB02200, pSB02304, pSB02305, pSB02306, pSB02307, pSB02308. Expression of the closed mutant construct pSB2198 FimH dscG is shown in FIG. 7. The closed mutant pSB2198 FimH dscG produces 12 mg/L upon transient expression.

В соответствии с Vi-CELL XR 2.04 (Beckman Coulter, Inc.) наблюдается следующее (фактический тип клеток, используемых для экспрессии, представляет собой клетки HEK):According to Vi-CELL XR 2.04 (Beckman Coulter, Inc.) the following is observed (the actual cell type used for expression is HEK cells):

Таблица 8Table 8 ОбразецSample Введенный параметр типа клеткиEntered cell type parameter Жизнеспособность (%)Viability (%) Всего клеток/мл (x10⁶)Total cells/ml (x10 ⁶ ) Жизнеспособные клетки/мл (x10⁶)Viable cells/ml (x10 ⁶ ) Сред. диаметр (микрон)Avg. diameter (micron) EXPI P13EXPI P13 CHOCHO 97,897.8 3,563.56 3,483.48 19,3319.33 pSB01882pSB01882 CHOCHO 90,990.9 4,984.98 4,534.53 17,3917.39 pSB01889pSB01889 CHOCHO 89,289.2 5,235.23 4,674.67 17,1417.14 клеткиcells CHOCHO 88,988.9 6,666.66 5,925.92 16,9116.91 Начало expiStart expi CHOCHO 93,793.7 3,353.35 3,143.14 18,7218.72 Образцы при сборе через ~ 85-86 часов после трансфекции:Samples when collected ~85-86 hours after transfection: 18771877 SF-9SF-9 57,357.3 4,324.32 2,482.48 16,0016.00 pSB01878pSB01878 SF-9SF-9 57,657.6 3,883.88 2,242.24 15,4915.49 pSB01879pSB01879 SF-9SF-9 59,159.1 5,245.24 3,103.10 15,3215.32 pSB01880pSB01880 SF-9SF-9 56,856.8 5,975.97 3,393.39 15,1015.10 pSB01885pSB01885 SF-9SF-9 63,163.1 6,956.95 4,394.39 16,0816.08 pSB01892pSB01892 SF-9SF-9 56,256.2 4,894.89 2,752.75 15,9115.91 187772187772 SF-9SF-9 79,579.5 5,145.14 4,094.09 18,3618.36 187872187872 SF-9SF-9 72,672.6 5,265.26 3,813.81 17,3517.35 expicontexpicont SF-9SF-9 75,575.5 4,954.95 3,743.74 18,6218.62

ПРИМЕР 5: Фрагменты молекулярной массы с обработанным сигнальным пептидомEXAMPLE 5: Signal Peptide Treated Molecular Weight Fragments

Таблица 9Table 9 pSB01877 FimH J96 ELL41155.1 [E. coli J96]pSB01877 FimH J96 ELL41155.1 [E. coli J96] АнализAnalysis АнализAnalysis Фрагмент 15-189Fragment 15-189 Весь белокWhole protein ДлинаLength 175 а.к.175 a.k. 189 а.к.189 a.k. Молекулярная массаMolecular mass 18948,3418948.34 20522,36 м.м.20522.36 m.m. 1 микрограмм =1 microgram = 52,775 пМоль52.775 pmol 48,727 пМоль48.727 pmol Молекулярный коэффициент экстинкцииMolecular extinction coefficient 3580035800 3580035800 1 А(280) корр. к:1 A(280) corr. To: 0,53 мг/мл0.53 mg/ml 0,57 мг/мл0.57 mg/ml А[280] 1 мг/млA[280] 1 mg/ml 1,89 ЕОП1.89 EOP 1,74 ЕОП1.74 EOP Изоэлектрическая точкаIsoelectric point 6,816.81 88 Зарядка при pH7Charging at pH7 -0,48-0.48 1,521.52 pSB01878 FimH J96 ELL41155.1 [E. coli J96]pSB01878 FimH J96 ELL41155.1 [E. coli J96] АнализAnalysis АнализAnalysis Фрагмент 21-188Fragment 21-188 Весь белокWhole protein ДлинаLength 168 а.к.168 a.k. 188 а.к.188 a.k. Молекулярная массаMolecular mass 18117,4818117.48 20344,08 м.м.20344.08 m.m. 1 микрограмм =1 microgram = 55,195 пМоль55.195 pmol 49,154 пМоль49.154 pmol Молекулярный коэффициент экстинкцииMolecular extinction coefficient 2442024420 3580035800 1 А(280) корр. к:1 A(280) corr. To: 0,74 мг/мл0.74 mg/ml 0,57 мг/мл0.57 mg/ml А[280] 1 мг/млA[280] 1 mg/ml 1,35 ЕОП1.35 EOP 1,76 ЕОП1.76 EOP Изоэлектрическая точкаIsoelectric point 6,816.81 6,296.29 Зарядка при pH7Charging at pH7 -0,48-0.48 -2,47-2.47 pSB01885 FimH J96 ELL41155.1 [E. coli J96]pSB01885 FimH J96 ELL41155.1 [E. coli J96] АнализAnalysis АнализAnalysis Фрагмент 20-331Fragment 20-331 Весь белокWhole protein ДлинаLength 312 а.к.312 a.k. 331 а.к.331 a.k. Молекулярная массаMolecular mass 32406,1932406.19 34537,79 м.м.34537.79 m.m. 1 микрограмм =1 microgram = 30,858 пМоль30.858 pmol 28,954 пМоль28.954 pmol Молекулярный коэффициент экстинкцииMolecular extinction coefficient 3803038030 4372043720 1 А(280) корр. к:1 A(280) corr. To: 0,85 мг/мл0.85 mg/ml 0,79 мг/мл0.79 mg/ml А[280] 1 мг/млA[280] 1 mg/ml 1,17 ЕОП1.17 EOP 1,27 ЕОП1.27 EOP Изоэлектрическая точкаIsoelectric point 7,257.25 8,328.32 Зарядка при pH7Charging at pH7 0,50.5 2,52.5 pSB01892 FimH J96 ELL41155.1 [E. coli J96]pSB01892 FimH J96 ELL41155.1 [E. coli J96] АнализAnalysis АнализAnalysis Фрагмент 21-330Fragment 21-330 Весь белокWhole protein ДлинаLength 310 а.к.310 a.k. 330 а.к.330 a.k. Молекулярная массаMolecular mass 32132,9132132.91 34359,51 м.м.34359.51 m.m. 1 микрограмм =1 microgram = 31,121 пМоль31.121 pmol 29,104 пМоль29.104 pmol Молекулярный коэффициент экстинкцииMolecular extinction coefficient 3234032340 4372043720 1 А(280) корр. к:1 A(280) corr. To: 0,99 мг/мл0.99 mg/ml 0,79 мг/мл0.79 mg/ml А[280] 1 мг/млA[280] 1 mg/ml 1,01 ЕОП1.01 EOP 1,27 ЕОП1.27 EOP Изоэлектрическая точкаIsoelectric point 7,257.25 6,516.51 Зарядка при pH7Charging at pH7 0,50.5 -1,49-1.49 pSB01893 FimH J96 ELL41155.1 [E. coli J96]pSB01893 FimH J96 ELL41155.1 [E. coli J96] АнализAnalysis АнализAnalysis Весь белокWhole protein ДлинаLength 331 а.к.331 a.k. Молекулярная массаMolecular mass 34416,5634416.56 1 микрограмм =1 microgram = 29,056 пМоль29.056 pmol Молекулярный коэффициент экстинкцииMolecular extinction coefficient 4372043720 1 А(280) корр. к:1 A(280) corr. To: 0,79 мг/мл0.79 mg/ml А[280] 1 мг/млA[280] 1 mg/ml 1,27 ЕОП1.27 EOP Изоэлектрическая точкаIsoelectric point 6,516.51 Зарядка при pH7Charging at pH7 -1,49-1.49 pSB01894 FimH J96 ELL41155.1 [E. coli J96]pSB01894 FimH J96 ELL41155.1 [E. coli J96] АнализAnalysis АнализAnalysis Фрагмент 21-332Fragment 21-332 Весь белокWhole protein ДлинаLength 312 а.к.312 a.k. 332 а.к.332 a.k. Молекулярная массаMolecular mass 32247,0132247.01 34473,61 м.м.34473.61 m.m. 1 микрограмм =1 microgram = 31,011 пМоль31.011 pmol 29,008 пмоль29.008 pmol Молекулярный коэффициент экстинкцииMolecular extinction coefficient 3234032340 4372043720 1 А(280) корр. к:1 A(280) corr. To: 1,00 мг/мл1.00 mg/ml 0,79 мг/мл0.79 mg/ml А[280] 1 мг/млA[280] 1 mg/ml 1,00 ЕОП1.00 EOP 1,27 ЕОП1.27 EOP Изоэлектрическая точкаIsoelectric point 7,257.25 6,516.51 Зарядка при pH7Charging at pH7 0,50.5 -1,49-1.49

pSB02083pSB02083

АнализAnalysis Фрагмент 21-188Fragment 21-188 Весь белокWhole protein ДлинаLength 168 а.к.168 a.k. 188 а.к.188 a.k. Молекулярная массаMolecular mass 18063,4218063.42 20290,02 м.м.20290.02 m.m. 1 микрограмм =1 microgram = 55,361 пМоль55.361 pmol 49,285 пМоль49.285 pmol Молярный коэффициент экстинкцииMolar extinction coefficient 2442024420 3580035800 1 А(280) корр. к:1 A(280) corr. To: 0,74 мг/мл0.74 mg/ml 0,57 мг/мл0.57 mg/ml А[280] 1 мг/млA[280] 1 mg/ml 1,35 ЕОП1.35 EOP 1,76 ЕОП1.76 EOP Изоэлектрическая точкаIsoelectric point 6,816.81 6,296.29 Зарядка при pH 7Charging at pH 7 -0,48-0.48 -2,47-2.47

pSB02198pSB02198

ОбразецSample FimH PSB 2198FimH PSB 2198
1,45 мг/мл1.45 mg/ml
5 мл5 ml
20190918 SS20190918 SS Объем (мл)Volume (ml) 2525 Конц. (мг/мл)Conc. (mg/ml) 1,451.45 Общее количество (мг)Total amount (mg) 36,2536.25 АликвотыAliquots 5мл х55ml x5 ВыходExit 12 мг/л12 mg/l Буфер: 50 мМ TrisCl, pH 8,0, 300 мМ NaClBuffer: 50 mM TrisCl, pH 8.0, 300 mM NaCl

pSB02307pSB02307

Наименование образцаSample name Fim Н 2307Fim N 2307
0,48 мг/мл0.48 mg/ml
5 мл5 ml
20190918 SS20190918 SS Объем (мл)Volume (ml) 22,5 мл22.5 ml Конц. (мг/мл)Conc. (mg/ml) 0,48 мг/мл0.48 mg/ml Общее количество (мг)Total amount (mg) 10,8 мг10.8 mg ВыходExit 3,6 мг/л3.6 mg/l Буфер: 50 мМ TrisCl, pH 8,0, 300 мМ NaClBuffer: 50 mM TrisCl, pH 8.0, 300 mM NaCl

ПРИМЕР 6: N-концевая α-аминогруппа Phe1 (в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2) в зрелом белке FimH обеспечивает критическое полярное распознавание D-маннозы.EXAMPLE 6: The N-terminal α-amino group of Phe1 (as assigned to SEQ ID NO: 2) in the mature FimH protein provides critical polar recognition of D-mannose.

Не привязываясь к какой-либо теорией или механизму, предполагается, что правильное расщепление сигнального пептида непосредственно перед Phe1 (согласно нумерации SEQ ID NO: 2) зрелого белка FimH важно для экспрессии функционального белка FimH. Изменения в N-концевой α-аминогруппе, такие как добавление аминокислоты на N-конце перед Phe1 белка FimH, могут отменить взаимодействия водородных связей с атомами O2, O5 и O6 D-маннозы и ввести стерическое отталкивание с D-маннозой, тем самым блокируя связывание маннозы. Это подтверждается нашим экспериментальным наблюдением, что добавление дополнительного остатка Gly перед Phe1 в SEQ ID NO: 2 не приводит к обнаружению связывания маннозы.Without being bound by any theory or mechanism, it is believed that proper cleavage of the signal peptide immediately upstream of Phe1 (as assigned to SEQ ID NO: 2) of the mature FimH protein is important for the expression of a functional FimH protein. Changes in the N-terminal α-amino group, such as the addition of an amino acid at the N-terminus before Phe1 of the FimH protein, can abolish hydrogen bonding interactions with the O2, O5 and O6 atoms of D-mannose and introduce steric repulsion with D-mannose, thereby blocking binding mannose. This is supported by our experimental observation that the addition of an additional Gly residue before Phe1 in SEQ ID NO: 2 does not result in detection of mannose binding.

После анализа кристаллической структуры FimH, связанного с D-маннозой, наблюдается следующее: N-концевая α-аминогруппа Phe1 вместе с боковыми цепями Asp54 FimH в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2 и Gln133 FimH в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2 обеспечивают критические полярные мотивы распознавания для D-маннозы, и мутации и изменения этих полярных взаимодействий приводят к отсутствию связывания маннозы.Upon analysis of the crystal structure of FimH bound to D-mannose, the following is observed: The N-terminal α-amino group of Phe1 along with the Asp54 side chains of FimH as assigned to SEQ ID NO: 2 and Gln133 of FimH as assigned to SEQ ID NO: 2 provide critical polar recognition motifs for D-mannose, and mutations and changes in these polar interactions result in a lack of mannose binding.

ПРИМЕР 7: Боковая цепь Phe1 в FimH не взаимодействует напрямую с D-маннозой, а скорее спрятана внутри FimH, что позволяет предположить, что Phe1 может быть заменен другими остатками, например алифатическими гидрофобными остатками (Ile, Leu или Val)EXAMPLE 7: The Phe1 side chain of FimH does not interact directly with D-mannose, but rather is hidden within FimH, suggesting that Phe1 may be replaced by other residues, such as aliphatic hydrophobic residues (Ile, Leu or Val)

Анализ кристаллических структур FimH в комплексе с D-маннозой и ее аналогами (например, PDB ID: 1QUN) показывает, что боковая цепь Phe1 (согласно нумерации SEQ ID NO: 2) взаимодействует не напрямую с D-маннозой, а скорее стабилизирует карман связывания путем укладки его ароматических колец с боковыми цепями Val56, Tyr95, Gln133 и Phe144 (в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2).Analysis of the crystal structures of FimH in complex with D -mannose and its analogues (e.g. PDB ID: 1QUN) shows that the side chain of Phe1 (as assigned to SEQ ID NO: 2) does not interact directly with D-mannose, but rather stabilizes the binding pocket by stacking its aromatic rings with side chains Val56, Tyr95, Gln133 and Phe144 (as assigned to SEQ ID NO: 2).

Альтернативный N-концевой остаток вместо Phe может стабилизировать белок FimH, обеспечивать связывание маннозы и обеспечивать правильное расщепление сигнального пептида. Такие остатки могут быть идентифицированы подходящим способом, известным в данной области техники, например, путем визуального осмотра кристаллической структуры FimH или более количественного отбора с использованием программного обеспечения для компьютерного дизайна белков, такого как BioLuminate™ [BioLuminate, Schrodinger LLC, New York, 2017], Discovery Studio™ [Discovery Studio Modeling Environment, Dassault Systèmes, San Diego, 2017], MOE™ [Molecular Operating Environment, Chemical Computing Group Inc., Montreal, 2017] и Rosetta™ [Rosetta, University of Washington, Seattle, 2017]. Иллюстративный пример показан на ФИГ. 9А-9С. Замещающие аминокислоты могут быть алифатическими гидрофобными аминокислотами (например, Ile, Leu и Val). На ФИГ. 11 показано компьютерное сканирование мутагенеза Phe1 с другими аминокислотами, имеющими алифатические гидрофобные боковые цепи, например, Ile, Leu и Val, которые могут стабилизировать белок FimH и обеспечить связывание маннозы.An alternative N-terminal residue instead of Phe may stabilize the FimH protein, mediate mannose binding, and ensure proper cleavage of the signal peptide. Such residues can be identified by a suitable method known in the art, for example, by visual inspection of the FimH crystal structure or more quantitative screening using computer-aided protein design software such as BioLuminate™ [BioLuminate, Schrodinger LLC, New York, 2017] , Discovery Studio™ [ Discovery Studio Modeling Environment, Dassault Systèmes, San Diego, 2017 ], MOE™ [Molecular Operating Environment, Chemical Computing Group Inc., Montreal, 2017] and Rosetta™ [Rosetta, University of Washington, Seattle, 2017] . An illustrative example is shown in FIG. 9A-9C. Substituting amino acids can be aliphatic hydrophobic amino acids (eg, Ile, Leu and Val). In FIG. 11 shows computer scan mutagenesis of Phe1 with other amino acids having aliphatic hydrophobic side chains, such as Ile, Leu and Val, which can stabilize the FimH protein and mediate mannose binding.

ПРИМЕР 8: Мутации Asn7 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2 в белке FimH могут удалять предполагаемый сайт N-гликозилирования и предотвращать дезамидирование, не влияя на связывание маннозы, mAb21 или mAb475EXAMPLE 8: Asn7 mutations according to SEQ ID NO: 2 in the FimH protein can remove a putative N-glycosylation site and prevent deamidation without affecting the binding of mannose, mAb21 or mAb475

Сверхэкспрессия секретируемого E. coli FimH из клеточных линий млекопитающих, может приводить к N-связанному гликозилированию по остатку Asn7 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 2. Кроме того, остаток Asn7 подвергается воздействию растворителя, и за ним следует остаток Gly, делая его очень склонным к дезамидированию.Overexpression of secreted E. coli FimH from mammalian cell lines can result in N-linked glycosylation at the Asn7 residue according to SEQ ID NO: 2. In addition, the Asn7 residue is solvent exposed and is followed by a Gly residue, making it very prone to deamidation.

Анализ кристаллических структур FimH в комплексе с D-маннозой и ее аналогами (например, PDB ID: 1QUN) показывает, что Asn7 находится более чем в 20 Å от сайта связывания маннозы, и мутация в этом сайте не должна влиять на связывание маннозы. Таким образом, мутации Asn7 в другие аминокислоты (например, Ser, Asp и Gln) могут эффективно удалять предполагаемый сайт N-гликозилирования и предотвращать дезамидирование.Analysis of the crystal structures of FimH in complex with D -mannose and its analogs (e.g. PDB ID: 1QUN) shows that Asn7 is more than 20 Å from the mannose binding site, and mutation at this site should not affect mannose binding. Thus, mutations of Asn7 to other amino acids (e.g., Ser, Asp, and Gln) can effectively remove the putative N-glycosylation site and prevent deamidation.

ПРИМЕР 9: Штаммы EXAMPLE 9: Strains E.coli E.coli и And S.entericaS. enterica

Клинические штаммы и производные перечислены в Таблице 10. Дополнительные эталонные штаммы включают: O25K5H1, и клинический штамм серотипа O25a; и штамм LT2 серовара Typhimurium S. enterica. Clinical strains and derivatives are listed in Table 10. Additional reference strains include: O25K5H1, and serotype O25a clinical strain; and S. enterica serovar Typhimurium strain LT2.

Конструируют нокауты генов в штаммах E. coli, удаляющие таргетируемую открытую рамку считывания, но оставляющие короткую рубцовую последовательность.Gene knockouts are constructed in E. coli strains that remove the targeted open reading frame but leave a short scar sequence.

Гидролизованная цепь O-антигена и основные сахара обозначены далее как O-полисахарид (OPS) для простоты.The hydrolyzed O-antigen chain and basic sugars are hereafter referred to as O-polysaccharide (OPS) for simplicity.

Таблица 10 Штаммы Table 10 Strains E. coliE. coli ШтаммStrain Условное название штаммаConventional name of the strain ГенотипGenotype СеротипSerotype GAR2401GAR2401 PFEEC0100PFEEC0100 wt (изолят крови)wt (blood isolate) O25bO25b '2401ΔwzzB'2401ΔwzzB ---- ΔwzzBΔwzzB O25bO25b '2401ΔAraAΔ(OPS)'2401ΔAraAΔ(OPS) ---- ΔAraA Δ(rflB-wzzB)ΔAraA Δ(rflB-wzzB) OPS-OPS- O25K5H1O25K5H1 PFEEC0101PFEEC0101 wtwt О25аO25a O25K5H1ΔwzzBO25K5H1ΔwzzB ΔwzzBΔwzzB О25аO25a BD559BD559 ---- W3110 ΔAraA ΔfhuA ΔrecAW3110 ΔAraA ΔfhuA ΔrecA OPS-OPS- BD559ΔwzzBBD559ΔwzzB ---- W3110ΔAraA ΔfhuA ΔrecAΔwzzBW3110ΔAraA ΔfhuA ΔrecAΔwzzB OPS-OPS- BD559Δ(OPS)BD559Δ(OPS) ---- BD559 Δ(rflB-wzzB)BD559Δ(rflB-wzzB) OPS-OPS- GAR2831GAR2831 PFEEC0102PFEEC0102 wt (изолят крови)wt (blood isolate) O25bO25b GAR865GAR865 PFEEC0103PFEEC0103 wt (изолят крови)wt (blood isolate) О2O2 GAR868GAR868 PFEEC0104PFEEC0104 wt (изолят крови)wt (blood isolate) О2O2 GAR869GAR869 PFEEC0105PFEEC0105 wt (изолят крови)wt (blood isolate) О15O15 GAR872GAR872 PFEEC0106PFEEC0106 wt (изолят крови)wt (blood isolate) О1O1 GAR878GAR878 PFEEC0107PFEEC0107 wt (изолят крови)wt (blood isolate) О75O75 GAR896GAR896 PFEEC0108PFEEC0108 wt (изолят крови)wt (blood isolate) О15O15 GAR1902GAR1902 PFEEC0109PFEEC0109 wt (изолят крови)wt (blood isolate) О6O6 Atlas187913Atlas187913 PFEEC0068PFEEC0068 wt (изолят крови)wt (blood isolate) O25bO25b Salmonella enterica серовар Typhimurium
штамм LT2 Salmonella enterica serovar Typhimurium
strain LT2 ---- wtwt Н/ДN/A

ПРИМЕР 10:EXAMPLE 10: Олигонуклеотидные праймеры для клонирования кластера генов Oligonucleotide primers for cloning a gene cluster wzzB,wzzB, fepE fepE и О-антигенаand O-antigen

Таблица 11 Олигонуклеотидные праймерыTable 11 Oligonucleotide primers НаименованиеName Последовательность праймераPrimer sequence КомментарииComments LT2wzzB_SLT2wzzB_S GAAGCAAACCGTACGCGTAAAG (SEQ ID NO: 40)GAAGCAAACCGTACGCGTAAAG (SEQ ID NO: 40) на основе Genbank GCA_000006945.2
Salmonella enterica, серовар Typhimurium, штамм LT2 based on Genbank GCA_000006945.2
Salmonella enterica, serovar Typhimurium, strain LT2 LT2wzzB_ASLT2wzzB_AS CGACCAGCTCTTACACGGCG (SEQ ID NO: 41)CGACCAGCTCTTACACGGCG (SEQ ID NO: 41) O25bFepE_SO25bFepE_S GAAATAGGACCACTAATAAATACACAAATTAATAAC (SEQ ID NO: 42)GAAATAGGACCACTAATAAATACACAAATTAATAAC (SEQ ID NO: 42) На основе Genbank GCA_000285655.3
Сборка штамма ST131 O25b EC958 и данные WGS O25b GAR2401Based on Genbank GCA_000285655.3
Assembly of strain ST131 O25b EC958 and WGS data O25b GAR2401 O25bFepE_AO25bFepE_A ATAATTGACGATCCGGTTGCC (SEQ ID NO: 43)ATAATTGACGATCCGGTTGCC (SEQ ID NO: 43) wzzB P1_SwzzB P1_S GCTATTTACGCCCTGATTGTCTTTTGT (SEQ ID NO: 44)GCTATTTACGCCCTGATTGTCTTTTGT (SEQ ID NO: 44) На основе последовательности штамма E. coli K-12, сборки Genbank MG1655 NC_000913.3 или W3110 GCA_000010245.1Based on the sequence of E. coli strain K-12, Genbank assembly MG1655 NC_000913.3 or W3110 GCA_000010245.1 wzzB P2_ASwzzB P2_AS ATTGAGAACCTGCGTAAACGGC (SEQ ID NO: 45)ATTGAGAACCTGCGTAAAACGGC (SEQ ID NO: 45) wzzB P3_SwzzB P3_S TGAAGAGCGGTTCAGATAACTTCC (SEQ ID NO: 46)
(UDP-глюкоза-6-дегидрогеназа)TGAAGAGCGGTTCAGATAACTTCC (SEQ ID NO: 46)
(UDP-glucose-6-dehydrogenase) wzzB P4_ASwzzB P4_AS CGATCCGGAAACCTCCTACAC (SEQ ID NO:47)
(Фосфорибозил-AMP циклогидролаза/фосфорибозил-ATP пирофосфогидролаза)CGATCCGGAAACCTCCTACAC (SEQ ID NO:47)
(Phosphoribosyl-AMP cyclohydrolase/phosphoribosyl-ATP pyrophosphohydrolase) O157 FepE_SO157 FepE_S GATTATTCGCGCAACGCTAAACAGAT (SEQ ID NO: 48)GATTATTCGCGCCAACGCTAAACAGAT (SEQ ID NO: 48) E. coli O157 fepE (на основе штамма Genbank EDL933 GCA_000732965.1) E. coli O157 fepE (based on Genbank strain EDL933 GCA_000732965.1) O157 FepE_ASO157 FepE_AS TGATCATTGACGATCCGGTAGCC (SEQ ID NO: 49)TGATCATTGACGATCCGGTAGCC (SEQ ID NO: 49) pBAD33_адаптер_SpBAD33_adapter_S CGGTAGCTGTAAAGCCAGGGGCGGTAGCGTGGTTTAAACCCAAGCAACAGATCGGCGTCGTCGGTATGGA (SEQ ID NO: 50)CGGTAGCTGTAAAGCCAGGGGCGGTAGCGTGGTTTTAAACCCAAGCAACAGATCGGCGTCGTCGGTATGGA (SEQ ID NO: 50) Адаптер имеет центральный сайт Pme I и гомологию с консервативным промотором оперона 5' OAg и последовательностями гена 3' gnd The adapter has a central Pme I site and homology to the conserved promoter of the 5' OAg operon and 3' gnd gene sequences pBAD33_адаптер_ASpBAD33_adapter_AS AGCTTCCATACCGACGACGCCGATCTGTTGCTTGGGTTTAAACCACGCTACCGCCCCTGGCTTTACAGCTACCGAGCT (SEQ ID NO: 51)AGCTTCCATACCGACGACGCCGATCTGTTGCTTGGGTTTTAAACCACGCTACCGCCCCTGGCTTTACAGCTACCGAGCT (SEQ ID NO: 51) JUMPSTART_rJUMPSTART_r GGTAGCTGTAAAGCCAGGGGCGGTAGCGTG (SEQ ID NO: 52)GGTAGCTGTAAAGCCAGGGGGCGGTAGCGTG (SEQ ID NO: 52) Universal Jumpstart (промотор оперона OAg)Universal Jumpstart (OAg operon promoter) gnd_fgnd_f CCATACCGACGACGCCGATCTGTTGCTTGG (SEQ ID NO: 53)CCATACCGACGACGCCGATCTGTTGCTTGG (SEQ ID NO: 53) Универсальный антисмысловой праймер оперона 3' OAg (gnd)Universal antisense primer of the 3' OAg operon (gnd)

ПРИМЕР 11: ПлазмидыEXAMPLE 11: Plasmids

Плазмидные векторы и субклоны перечислены в таблице 12. Фрагменты ПЦР, содержащие различные гены E. coli и Salmonella wzzB и fepE амплифицируют из очищенной геномной ДНК и субклонируют в высококопийную плазмиду, представленную в наборе для клонирования Invitrogen PCR®Blunt. Фиг. 12А-12В. Эта плазмида основана на репликоне pUC. Праймеры P3 и P4 используют для амплификации генов wzzB E. coli с их нативным промотором, и они предназначены для связывания с областями в проксимальных и дистальных генах, кодирующих UDP-глюкоза-6-дегидрогеназу и фосфорибозиладениннуклеотидгидролазу, соответственно (аннотации в Genbank MG1655 NC_000913. 3). Фрагмент ПЦР, содержащий ген Salmonella fepE и промотор, амплифицируют с использованием ранее описанных праймеров. Аналогичные праймеры fepE E. coli разрабатывают на основе доступных последовательностей генома Genbank или данных о полном геноме, полученных внутри (в случае GAR2401 и O25K5H1). Низкокопийную плазмиду pBAD33 используют для экспрессии генов биосинтеза О-антигена под контролем промотора арабинозы. Плазмиду сначала модифицируют для облегчения клонирования (методом Гибсона) длинных ПЦР фрагментов, амплифицированных с использованием универсальных праймеров, гомологичных 5'-промотору и гену 3'-6-фосфоглюконатдегидрогеназы (gnd). Таблица 12. Субклон pBAD33, содержащий оперон биосинтеза O25b, показан на ФИГ. 12А-12В.Plasmid vectors and subclones are listed in Table 12. PCR fragments containing various E. coli and Salmonella wzzB and fepE genes are amplified from purified genomic DNA and subcloned into the high copy number plasmid provided in the Invitrogen PCR®Blunt Cloning Kit. Fig. 12A-12B. This plasmid is based on the pUC replicon. Primers P3 and P4 are used to amplify the E. coli wzzB genes from their native promoter and are designed to bind to regions in the proximal and distal genes encoding UDP-glucose 6-dehydrogenase and phosphoribosyladenine nucleotide hydrolase, respectively (Genbank annotations MG1655 NC_000913.3 ). The PCR fragment containing the Salmonella fepE gene and promoter was amplified using previously described primers. Similar E. coli fepE primers are designed based on available Genbank genome sequences or internally generated whole genome data (in the case of GAR2401 and O25K5H1). The low-copy plasmid pBAD33 is used to express the O-antigen biosynthesis genes under the control of the arabinose promoter. The plasmid is first modified to facilitate cloning (by the Gibson method) of long PCR fragments amplified using universal primers homologous to the 5' promoter and the 3'-6-phosphogluconate dehydrogenase ( gnd ) gene. Table 12. Subclone pBAD33 containing the O25b biosynthesis operon is shown in FIG. 12A-12B.

Таблица 12Table 12 ПлазмидыPlasmids НаименованиеName РепликонReplicon Маркер резистентностиResistance marker КомментарииComments PCR®Blunt II TOPOPCR®Blunt II TOPO pUCpUC KanRKanR Вектор клонирования ПЦР InvitrogenInvitrogen PCR cloning vector pBAD33pBAD33 Р15аР15а CamRCamR Вектор, индуцируемый арабинозойArabinose-inducible vector pBAD33-OAgpBAD33-OAg Р15аР15а CamRCamR Вектор клонирования оперона Гибсона OAgGibson OAg operon cloning vector pBAD33-O25bpBAD33-O25b Р15аР15а CamRCamR Плазмида экспрессии O25b OAgO25b OAg expression plasmid pBAD33-O21pBAD33-O21 Р15аР15а CamRCamR Плазмида экспрессии O21 OAgO21 OAg expression plasmid pBAD33-O16pBAD33-O16 Р15аР15а CamRCamR Плазмида экспрессии O16 OAgO16 OAg expression plasmid pBAD33-O75pBAD33-O75 Р15аР15а CamRCamR Плазмида экспрессии O75 OAgO75 OAg expression plasmid pBAD33-O1pBAD33-O1 Р15аР15а CamRCamR Плазмида экспрессии O1 OAgO1 OAg expression plasmid pBAD33-O2pBAD33-O2 Р15аР15а CamRCamR Плазмида экспрессии O2 OAgO2 OAg expression plasmid pTOPO-O25b 2401 wzzBpTOPO-O25b 2401 wzzB pUCpUC KanRKanR Шаблон гДНК GAR 2401GAR 2401 gDNA Template pTOPO-O25b 2401 fepEpTOPO-O25b 2401 fepE pUCpUC KanRKanR pTOPO-K12 wzzBpTOPO-K12 wzzB pUCpUC KanRKanR Матрица гДНК штамма E. coli K-12gDNA matrix of E. coli strain K-12 pTOPO-O25a wzzBpTOPO-O25a wzzB pUCpUC KanRKanR E. coli O25a штамм O25K5H1
Матрица гДНК E. coli O25a strain O25K5H1
gDNA matrix pTOPO-O25a fepEpTOPO-O25a fepE pUCpUC KanRKanR pTOPO-сальмонелла LT2 wzzBpTOPO-salmonella LT2 wzzB pUCpUC KanRKanR Матрица гДНК штамма LT2 серовара Typhimurium Salmonella enterica gDNA matrix of Salmonella enterica serovar Typhimurium strain LT2 pTOPO-сальмонелла LT2 fepEpTOPO-salmonella LT2 fepE pUCpUC KanRKanR pTOPO-O25a ETEC wzzBpTOPO-O25a ETEC wzzB pUCpUC KanRKanR гДНК штамма O25a ETEC, приобретенная в ATCC («NR-5» E2539-C1)ETEC strain O25a gDNA purchased from ATCC (“NR-5” E2539-C1) pTOPO-O25a ETEC fepEpTOPO-O25a ETEC fepE pUCpUC KanRKanR pTOPO-O157fepEpTOPO-O157fepE pUCpUC KanRKanR O157:H7:K-гДНК штамма токсина шигеллы, приобретенная в ATCC (EDL933 #43895D-5)O157:H7:K-gDNA of Shigella toxin strain purchased from ATCC (EDL933 #43895D-5)

ПРИМЕР EXAMPLE 1212 : Очистка О-антигена: O-antigen purification

Ферментативный бульон обрабатывают уксусной кислотой до конечной концентрации 1-2% (конечный рН 4,1). Экстракцию OAg и делипидирование проводят путем нагревания обработанного кислотой бульона до 100°C в течение 2 часов. В конце кислотного гидролиза смесь охлаждают до температуры окружающей среды и добавляют 14% NH₄OH до конечного значения pH 6,1. Нейтрализованный бульон центрифугируют и собирают центрифугат. К центрифугату добавляют CaCl₂ в фосфате натрия, и полученную взвесь инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре. Твердые вещества удаляют центрифугированием, и фугат 12-кратно концентрируют с использованием мембраны 10 кДа с последующими двумя диафильтрациями против воды. Затем ретентат, содержащий OAg, очищают с помощью угольного фильтра. Угольный фильтрат разводят 1:1 (об./об.) 4,0М сульфатом аммония. Конечная концентрация сульфата аммония составляет 2М. Угольный фильтрат, обработанный сульфатом аммония, дополнительно очищают с использованием мембраны с 2М сульфатом аммония в качестве рабочего буфера. OAg собирают в потоке. Для длинного OAg, фильтрат HIC концентрируют, и затем заменяют буфер на воду (20 диаобъемов) с использованием мембраны 5 кДа. Для короткого (нативного) полисахарида OAg, MWCO дополнительно снижают для увеличения выхода.The fermentation broth is treated with acetic acid to a final concentration of 1-2% (final pH 4.1). OAg extraction and delipidation is carried out by heating the acid-treated broth to 100°C for 2 hours. At the end of the acid hydrolysis, the mixture is cooled to ambient temperature and 14% NH ₄ OH is added to a final pH of 6.1. The neutralized broth is centrifuged and the centrifugate is collected. CaCl ₂ in sodium phosphate is added to the centrifugate, and the resulting suspension is incubated for 30 minutes at room temperature. Solids are removed by centrifugation and the centrate is concentrated 12-fold using a 10 kDa membrane, followed by two diafiltrations against water. The retentate containing OAg is then purified using a carbon filter. The carbon filtrate is diluted 1:1 (v/v) with 4.0 M ammonium sulfate. The final concentration of ammonium sulfate is 2M. The ammonium sulfate treated carbon filtrate is further purified using a membrane with 2M ammonium sulfate as a running buffer. OAg is collected in the flow. For long OAg, the HIC filtrate is concentrated and then buffer exchanged to water (20 diavol) using a 5 kDa membrane. For short (native) OAg polysaccharide, MWCO is further reduced to increase yield.

ПРИМЕР 13: Конъюгация длинного О-антигена O25b с CRMEXAMPLE 13: Conjugation of long O-antigen O25b to CRM ₁₉₇₁₉₇

Первый набор конъюгатов длинноцепочечного полисахарида O25b-CRM₁₉₇ получают с использованием периодатного окисления с последующим конъюгированием с использованием химии восстановительного аминирования (RAC) (таблица 14). Конъюгированные варианты с тремя уровнями активации (низкий, средний и высокий) за счет варьирования уровней окисления. Конъюгаты получают реакцией лиофилизированных активированных полисахаридов с лиофилизированным CRM₁₉₇, восстановленным в среде ДМСО, с использованием цианоборогидрида натрия в качестве восстанавливающего агента. Реакции конъюгации проводят при 23℃ в течение 24 часов с последующим кэпированием с применением боргидрида натрия в течение 3 ч. После стадии гашения конъюгации, конъюгаты очищают ультрафильтрацией/диафильтрацией с регенерированной целлюлозной мембраной 100K MWCO, используя 5 мМ сукцината/0,9% NaCl, pH 6,0. Окончательную фильтрацию конъюгатов проводят с использованием мембраны 0,22 мкм.The first set of long chain polysaccharide O25b-CRM ₁₉₇ conjugates are prepared using periodate oxidation followed by conjugation using reductive amination chemistry (RAC) (Table 14). Conjugated variants with three activation levels (low, medium and high) by varying oxidation levels. The conjugates are prepared by reacting lyophilized activated polysaccharides with lyophilized CRM ₁₉₇ reconstituted in DMSO using sodium cyanoborohydride as a reducing agent. Conjugation reactions are carried out at 23℃ for 24 hours followed by capping with sodium borohydride for 3 hours. After the conjugation quenching step, the conjugates are purified by ultrafiltration/diafiltration with a 100K MWCO regenerated cellulose membrane using 5 mM succinate/0.9% NaCl, pH 6.0. Final filtration of the conjugates is carried out using a 0.22 µm membrane.

Если прямо не указано иное, конъюгаты, описанные в следующих примерах, включают коровую сахаридную группу.Unless otherwise expressly stated, the conjugates described in the following examples include a core saccharide group.

1.1. Экспрессия длинного О-антигена, обеспечиваемая регуляторами длины цепи гетерологичной полимеразы1.1. Long O-antigen expression mediated by heterologous polymerase chain length regulators

Первоначальная конструкция штамма E. coli сфокусирована на серотипе O25. Цель состоит в том, чтобы сверхэкспрессировать гетерологичные гены wzzB или fepE, чтобы увидеть, придают ли они большую длину цепи в нокаутных штаммах O25 wzzB. Сначала изоляты крови подвергают скринингу с помощью ПЦР для идентификации штаммов подтипов O25a и O25b. Далее штаммы подвергают скринингу на чувствительность к ампициллину. Идентифицируют единственный чувствительный к ампициллину изолят O25b, GAR2401, в который введена делеция wzzB. Точно так же, делецию wzzB проводят в штамме O25a, O25K5H1. Для генетической комплементарности этих мутаций, гены wzzB из GAR 2401 и O25K5H1 субклонируют в высококопийный клонирующий вектор PCR-Blunt II и вводят в оба штамма электропорацией. Аналогичным образом клонируют и переносят дополнительные гены wzzB из E. coli K-12 и S. enterica серовара Typhimurium LT2; аналогично, гены fepE из E. coli O25K5H1, GAR 2401, O25a ETEC NR-5, O157: H7: K- и S. enterica серовара Typhimurium LT2.Initial E. coli strain design focused on serotype O25. The goal is to overexpress heterologous wzzB or fepE genes to see if they confer greater chain length in O25 wzzB knockout strains. Blood isolates are first screened by PCR to identify strains of the O25a and O25b subtypes. Next, the strains are screened for sensitivity to ampicillin. A single ampicillin-susceptible O25b isolate, GAR2401, which introduced a wzzB deletion, was identified. Similarly, deletion of wzzB was carried out in strain O25a, O25K5H1. To genetically complement these mutations, the wzzB genes from GAR 2401 and O25K5H1 were subcloned into the high copy number PCR-Blunt II cloning vector and introduced into both strains by electroporation. Additional wzzB genes from E. coli K-12 and S. enterica serovar Typhimurium LT2 were cloned and transferred in a similar manner; similarly, fepE genes from E. coli O25K5H1, GAR 2401, O25a ETEC NR-5, O157:H7:K- and S. enterica serovar Typhimurium LT2.

Бактерии выращивают в течение ночи в среде LB, и LPS экстрагируют фенолом, разделяют с помощью SDS PAGE (4-12% акриламида) и окрашивают. В каждую лунку геля загружают LPS, экстрагированный из одинакового количества бактериальных клеток (приблизительно 2 единицы OD₆₀₀). Размер LPS оценивают по внутреннему нативному стандарту LPS E. coli и путем подсчета лестницы, различимой в подмножестве образцов, показывающих широкое распределение длин цепей (отличающихся одной повторяющейся единицей). На левой стороне ФИГ. 13A показаны профили LPS плазмидных трансформантов O25a O25K5HΔwzzB; и справа, аналогичные профили трансформантов O25b GAR 2401ΔwzzB. Иммуноблот репликата геля, зондированного O25-специфической сывороткой, показан на ФИГ. 13В. Bacteria are grown overnight in LB medium and LPS is extracted with phenol, separated by SDS PAGE (4-12% acrylamide) and stained. Each well of the gel is loaded with LPS extracted from the same amount of bacterial cells (approximately 2 OD ₆₀₀ units). LPS size is estimated from the internal native standard E. coli LPS and by counting the ladder discernible in a subset of samples showing a broad distribution of chain lengths (differing by a single repeat unit). On the left side of FIG. 13A shows the LPS profiles of the O25a O25K5HΔ wzzB plasmid transformants; and right, similar profiles of O25b GAR 2401Δ wzzB transformants. An immunoblot of a replicate gel probed with O25-specific serum is shown in FIG. 13V.

Результаты этого эксперимента показывают, что введение гомологичного гена wzzB в хозяина E. coli O25aΔwzzB восстанавливает экспрессию короткого O25 LPS (10-20x), как это делает Salmonella LT2 wzzB. Введение гена O25b wzzB из GAR2401 не дает, что позволяет предположить, что фермент WzzB из этого штамма является дефектным. Сравнение аминокислотных последовательностей WzzB E. coli позволяет предположить, что за это могут быть ответственны замены A210E и P253S. Примечательно, что Salmonella LT2 fepE и E. coli fepE из O25a O25K5H1 придают способность экспрессировать очень длинные (VL) OAg LPS, при этом Salmonella LT2 fepE приводит к OAg, превышающему по размеру размер, придаваемый E. coli fepE. The results of this experiment show that introduction of the homologous wzzB gene into the E. coli O25aΔ wzzB host restores the expression of the short O25 LPS (10-20x), as does Salmonella LT2 wzzB. Insertion of the O25b gene does not produce wzzB from GAR2401, suggesting that the WzzB enzyme from this strain is defective. Comparison of the amino acid sequences of E. coli WzzB suggests that the A210E and P253S substitutions may be responsible. Notably, Salmonella LT2 fepE and E. coli fepE from O25a O25K5H1 confer the ability to express very long (VL) OAg LPS, with Salmonella LT2 fepE resulting in an OAg larger than that conferred by E. coli fepE.

Аналогичная картина экспрессии наблюдается с трансформантами GAR2401Δ wzzB: E. coli O25a или штамм K12 wzzB восстанавливают способность продуцировать короткие LPS. Salmonella LT2 fepE создает самый длинный LPS, E. coli fepE немного короче LPS, тогда как Salmonella LT2 wzzB дает длинный LPS среднего размера (L). Способность других генов fepE E. coli продуцировать очень длинные LPS оценивают в отдельном эксперименте с трансформантами E. coli O25aΔwzzB. Гены fepE из GAR2401, штамма O25a ETEC и штамма-продуцента токсина Shigella O157 также придают способность создавать очень длинный LPS, но не такой длинный, как LPS, создаваемый Salmonella LT2 fepE (ФИГ. 14).A similar expression pattern is observed with GAR2401Δ transformants wzzB: E. coliO25a or strain K12 wzzBrestore the ability to produce short LPS. Salmonella LT2 fepE creates the longest LPS, E. coli fepEslightly shorter than LPS, whereas Salmonella LT2 wzzBproduces a medium sized long LPS (L). Ability of other genes fepE E. coliproduce very long LPS assessed in a separate experiment with transformants E. coliO25aΔwzzB. Genes fepEfrom GAR2401, O25a ETEC strain and toxin-producing strain ShigellaO157 also imparts the ability to create a very long LPS, but not as long as the LPS created by Salmonella LT2 fepE(FIG. 14).

Установив на штаммах серотипа O25a и O25b, что Salmonella LT2 fepE создает самый длинный LPS среди изученных регуляторов полимеразы, мы попытались определить, будет ли он также продуцировать очень длинный LPS у других серотипов E. coli. Изоляты бактериемии дикого типа серотипов O1, O2, O6, O15 и O75 трансформируют плазмидой Salmonella fepE и экстрагируют LPS. Результаты, показанные на ФИГ. 15, подтверждают, что Salmonella fepE может придавать способность очень долго вырабатывать LPS в других распространенных серотипах, связанных с инфекциями крови. Результаты также показывают, что экспрессия Salmonella fepE на основе плазмиды, по-видимому, подавляет контроль длины цепи, обычно осуществляемый эндогенным wzzB в этих штаммах.Having established in serotype O25a and O25b strains that Salmonella LT2 fepE produces the longest LPS among the polymerase regulators studied, we sought to determine whether it would also produce a very long LPS in other E. coli serotypes. Wild-type bacteremia isolates of serotypes O1, O2, O6, O15, and O75 were transformed with the Salmonella fepE plasmid and extracted with LPS. The results shown in FIG. 15 suggest that Salmonella fepE may confer the ability to produce LPS for a very long time in other common serotypes associated with blood infections. The results also indicate that plasmid-based expression of Salmonella fepE appears to suppress chain length control normally exerted by endogenous wzzB in these strains.

1.2. Плазмидная экспрессия О-антигенов в обычном штамме хозяина E. coli.1.2. Plasmid expression of O-antigens in a common host strain of E. coli.

С точки зрения развития биопроцессов, возможность продуцировать О-антигены разных серотипов в общем хозяине E. coli вместо нескольких штаммов значительно упростила бы производство индивидуальных антигенов. С этой целью кластеры генов О-антигена из разных серотипов амплифицируют с помощью ПЦР и клонируют в низкокопийную плазмиду (pBAD33) под контролем промотора, регулируемого арабинозой. Эта плазмида совместима (может сосуществовать) с плазмидой Salmonella LT2 fepE в E. coli, поскольку она содержит другой репликон (p15a) и другой селектируемый маркер (хлорамфеникол или канамицин). В первом эксперименте, субклон плазмиды оперона pBAD33 O25b котрансфицируют плазмидой Salmonella LT2 fepE в GAR 2401ΔwzzB, и трансформанты, выращенные в присутствии или в отсутствие 0,2% арабинозы. Результаты, показанные на ФИГ. 16A-16B, демонстрируют, что очень длинный LPS О-антигена продуцируется арабинозозависимым образом.From a bioprocess development perspective, the ability to produce O-antigens of different serotypes in a common host E. coli instead of multiple strains would greatly simplify the production of individual antigens. For this purpose, O-antigen gene clusters from different serotypes are amplified by PCR and cloned into a low-copy number plasmid (pBAD33) under the control of an arabinose-regulated promoter. This plasmid is compatible (can coexist) with the Salmonella LT2 fepE plasmid in E. coli because it contains a different replicon (p15a) and a different selectable marker (chloramphenicol or kanamycin). In the first experiment, a subclone of the pBAD33 O25b operon plasmid was cotransfected with the Salmonella LT2 fepE plasmid into GAR 2401ΔwzzB, and the transformants were grown in the presence or absence of 0.2% arabinose. The results shown in FIG. 16A-16B demonstrate that the very long O-antigen LPS is produced in an arabinose-dependent manner.

Аналогичным образом оценивают кластеры генов О-антигена, клонированные из других серотипов, и результаты, показаны на ФИГ. 17. Совместная экспрессия плазмид Salmonella LT2 fepE и pBAD33-OAg приводит к обнаруживаемому длинноцепочечному LPS, соответствующему серотипам O1, O2 (для двух из четырех клонов), O16, O21 и O75. По неизвестным причинам, плазмида pBAD33-O6 не дает обнаруживаемых LPS во всех четырех обработанных изолятах. Хотя уровень экспрессии был переменным, результаты показывают, что экспрессия длинноцепочечных О-антигенов возможна у обычного хозяина. Однако в некоторых случаях может потребоваться дополнительная оптимизация для улучшения экспрессии, например, путем модификации последовательностей плазмидного промотора.O-antigen gene clusters cloned from other serotypes were evaluated in a similar manner, and the results are shown in FIG. 17. Coexpression of the Salmonella LT2 fepE and pBAD33-OAg plasmids results in detectable long-chain LPS corresponding to serotypes O1, O2 (for two of the four clones), O16, O21, and O75. For unknown reasons, plasmid pBAD33-O6 did not produce detectable LPS in all four treated isolates. Although the level of expression was variable, the results indicate that expression of long-chain O antigens is possible in a common host. However, in some cases, additional optimization may be required to improve expression, for example by modifying plasmid promoter sequences.

Профили LPS из различных штаммов E.coli серотипа O25 с или без плазмиды Salmonella LT2 fepE показаны на ФИГ. 18. Изучают два штамма для ферментации, экстракции и очистки О-антигенов: GAR2831, для продуцирования нативного короткого O25b OAg; и GAR2401ΔwzzB/fepE для продуцирования длинного O25b OAg. Соответствующие короткие и длинные формы LPS, показанные на ФИГ. 18 геля SDS-PAGE, выделены красным цветом. Полисахариды экстрагируют непосредственно из ферментированных бактерий уксусной кислотой и очищают. Профили эксклюзионной хроматографии очищенных коротких и длинных или очень длинных полисахаридов O25b показаны на ФИГ. 19А-19В. Свойства двух партий короткого полисахарида (из GAR2831) сравнивают с одним препаратом очень длинного полисахарида (из штамма GAR2401ΔwzzB/fepE). Молекулярная масса длинного О-антигена в 3,3 раза больше, чем у короткого О-антигена, и количество повторяющихся единиц оценивают как ~65 (очень длинные) против ~20. См. Таблицу 13.LPS profiles from various E. coli serotype O25 strains with or without the Salmonella LT2 fepE plasmid are shown in FIG. 18. Two strains are being studied for fermentation, extraction and purification of O-antigens: GAR2831, for the production of native short O25b OAg; and GAR2401Δ wzzB/fepE to produce long O25b OAg. The corresponding short and long forms of LPS shown in FIG. 18 SDS-PAGE gels, highlighted in red. Polysaccharides are extracted directly from the fermented bacteria with acetic acid and purified. Size exclusion chromatography profiles of purified short and long or very long O25b polysaccharides are shown in FIG. 19A-19B. The properties of two batches of a short polysaccharide (from GAR2831) are compared with one preparation of a very long polysaccharide (from strain GAR2401Δ wzzB/fepE) . The molecular weight of the long O antigen is 3.3 times greater than that of the short O antigen, and the number of repeat units is estimated to be ~65 (very long) versus ~20. See Table 13.

Таблица 13Table 13 Поли № партииPoly lot no. НативныйNative НативныйNative Модифицированный (длинная цепь)Modified (long chain) Поли № партииPoly lot no. 709766-24А709766-24A 709722-24В709722-24V 709766-25А709766-25A Поли ММ (кДа)Poly MM (kDa) 17,317.3 16,316.3 55,355.3 # Повторяющихся единиц# Repeating units 2020 1919 6464

Очень длинный полисахарид O25b O-антигена конъюгируют с дифтерийным токсоидом CRM₁₉₇ с использованием обычного процесса восстановительного аминирования. Получают три разные партии гликоконъюгата с разной степенью активации периодатом: средняя (5,5%), низкая (4,4%) и высокая (8,3%). Было показано, что полученные препараты и неконъюгированный полисахарид не содержат эндотоксин (таблица 14).The very long O-antigen polysaccharide O25b is conjugated to the diphtheria toxoid CRM ₁₉₇ using a conventional reductive amination process. Three different batches of glycoconjugate are obtained with different degrees of periodate activation: medium (5.5%), low (4.4%) and high (8.3%). It was shown that the resulting preparations and the unconjugated polysaccharide do not contain endotoxin (Table 14).

Каждую группа из четырех кроликов (самки New Zealand White) вакцинируют 10 мкг гликоконъюгата и 20 мкг адъюванта QS21, и берут образцы сыворотки (VAC-2017-PRL-EC-0723) в соответствии со схемой, показанной на ФИГ. 20А. Стоит отметить, что доза 10 мкг находится на нижней границе диапазона, обычно назначаемого кроликам при оценке бактериальных гликоконъюгатов (более типично, 20-50 мкг). Группу кроликов также вакцинируют в отдельном исследовании (VAC-2017-PRL-GB-0698) неконъюгированным полисахаридом с использованием той же дозы (10 мкг полисахарида+20 мкг адъюванта QS21) и идентичной схемы введения.Each group of four rabbits (New Zealand White females) was vaccinated with 10 μg of glycoconjugate and 20 μg of QS21 adjuvant, and serum samples were collected (VAC-2017-PRL-EC-0723) according to the schedule shown in FIG. 20A. It is worth noting that the 10 mcg dose is at the lower end of the range typically given to rabbits when evaluating bacterial glycoconjugates (more typically, 20-50 mcg). A group of rabbits were also vaccinated in a separate study (VAC-2017-PRL-GB-0698) with unconjugated polysaccharide using the same dose (10 μg polysaccharide + 20 μg QS21 adjuvant) and identical administration schedule.

Реакции антител кроликов на три препарата гликоконъюгатов O25b оценивают в анализе LUMINEX, в котором карбоксигранулы покрывают метилированным сывороточным альбумином человека, предварительно связанным с неконъюгированным длинным полисахаридом O25b. Присутствие O25b-специфических IgG-антител в образцах сыворотки определяют с помощью вторичных анти-IgG-антител, меченных фикоэритрином (PE). Профили иммунного ответа, наблюдаемые в сыворотке, взятой на неделе 0 (до иммунизации), неделе 6 (после введения дозы 2, PD2), неделе 8 (после введения дозы 3, PD3) и неделе 12 (после введения дозы 4, PD4) у наиболее отвечающих кроликов (по одному из каждой группы из четырех) показаны на ФИГ. 21А-21С. Ни у одного из 12 кроликов не было обнаружено значительных титров IgG в сыворотке до иммунизации. В отличие от этого, ответы антигенспецифических антител O25b обнаружены в поствакцинальной сыворотке кроликов во всех трех группах, при этом ответы группы с низкой активацией гликоконъюгата имеют более высокую тенденцию, чем группы со средней или высокой активацией гликоконъюгата. Максимальные ответы наблюдаются в момент времени после введения дозы 3. Один кролик из группы с низкой активацией и один кролик из группы с высокой активацией не ответили на вакцинацию (пациенты, не ответившие на лечение).Rabbit antibody responses to three preparations of O25b glycoconjugates are assessed in the LUMINEX assay, in which carboxy beads are coated with methylated human serum albumin pre-coupled to an unconjugated long O25b polysaccharide. The presence of O25b-specific IgG antibodies in serum samples is determined using phycoerythrin (PE)-labeled secondary anti-IgG antibodies. Immune response profiles observed in sera collected at week 0 (pre-immunization), week 6 (post-dose 2, PD2), week 8 (post-dose 3, PD3) and week 12 (post-dose 4, PD4) in the most responsive rabbits (one from each group of four) are shown in FIG. 21A-21C. None of the 12 rabbits had significant serum IgG titers before immunization. In contrast, O25b antigen-specific antibody responses were detected in the postvaccination serum of rabbits in all three groups, with the responses of the low glycoconjugate activation group trending higher than those of the moderate or high glycoconjugate activation groups. Maximum responses were observed at post-dose time point 3. One rabbit from the low activation group and one rabbit from the high activation group did not respond to vaccination (non-responders).

Для оценки влияния конъюгации белка-носителя CRM₁₉₇ на иммуногенность длинного полисахарида O25b OAg, присутствие антител в сыворотке кроликов, вакцинированных неконъюгированным полисахаридом, сравнивают с сывороткой кроликов, вакцинированных гликоконъюгатом CRM₁₉₇ низкой активации, ФИГ. 22А-22F. Примечательно, что свободный полисахарид не является иммуногенным, практически не вызывая ответов IgG в иммунных и предиммунных сыворотках (ФИГ. 22А). Напротив, средние значения интенсивности флуоресценции (MFI) O25b OAg-специфических IgG, примерно в десять раз превышающие уровни в сыворотке до иммунизации, наблюдают в сыворотках PD4 от трех из четырех кроликов, вакцинированных O25b OAg-CRM₁₉₇, в диапазоне разведения сывороток (от 1:100 до 1:6400). Эти результаты демонстрируют необходимость конъюгации белка-носителя для получения антител IgG к полисахариду O25b OAg при уровне дозы 10 мкг.To evaluate the effect of CRM ₁₉₇ carrier protein conjugation on the immunogenicity of the long O25b OAg polysaccharide, the presence of antibodies in the serum of rabbits vaccinated with the unconjugated polysaccharide was compared with the serum of rabbits vaccinated with the low activation CRM ₁₉₇ glycoconjugate, FIG. 22A-22F. Notably, the free polysaccharide is not immunogenic, eliciting virtually no IgG responses in immune and preimmune sera (FIG. 22A). In contrast, mean fluorescence intensity (MFI) values of O25b OAg-specific IgG, approximately ten times higher than pre-immunization serum levels, are observed in PD4 sera from three of four rabbits vaccinated with O25b OAg-CRM ₁₉₇ over a range of serum dilutions (from 1 :100 to 1:6400). These results demonstrate the requirement for carrier protein conjugation to generate IgG antibodies to the O25b OAg polysaccharide at the 10 μg dose level.

Бактерии, выращенные на TSA планшетах, суспендируют в PBS, доводят до OD₆₀₀ 2,0, и фиксируют в 4% параформальдегиде в PBS. После блокирования в 4% BSA/PBS в течение 1 ч, бактерии инкубируют с серийными разведениями предиммунной сыворотки и иммунной сыворотки PD3 в 2% BSA/PBS и определяют связанный IgG с помощью PE-меченого вторичного F(ab) антитела.Bacteria grown on TSA plates are suspended in PBS, adjusted to an OD ₆₀₀ of 2.0, and fixed in 4% paraformaldehyde in PBS. After blocking in 4% BSA/PBS for 1 h, bacteria are incubated with serial dilutions of preimmune serum and PD3 immune serum in 2% BSA/PBS and bound IgG is detected using a PE-labeled secondary F(ab) antibody.

Специфичность антител O25b, индуцированных O25b OAg-CRM₁₉₇, демонстрируют в экспериментах по проточной цитометрии с интактными бактериями. Связывание IgG с целыми клетками определяют с помощью PE-конъюгированного фрагмента F(ab')₂ антикроличьего IgG козы в проточном цитометре Accuri.The specificity of O25b antibodies induced by O25b OAg-CRM ₁₉₇ is demonstrated in flow cytometry experiments with intact bacteria. IgG binding to whole cells was determined using PE-conjugated goat anti-rabbit IgG F(ab') ₂ fragment in an Accuri flow cytometer.

Как показано на ФИГ. 23A-23C, предиммунные кроличьи антитела не связываются с изолятами серотипа O25b дикого типа GAR2831 и GAR2401 или со штаммом K-12 E. coli, тогда как соответствующие PD3 антитела окрашивают бактерии O25b зависимым от концентрации образом. Отрицательный контрольный штамм К-12, у которого отсутствует способность экспрессировать OAg, показывает очень слабое связывание PD3 антител, скорее всего, из-за присутствия на его поверхности открытых эпитопов внутренних коровых олигосахаридов. Введение плазмиды Salmonella fepE в изоляты O25b дикого типа приводит к значительному усилению окрашивания, что согласуется с более высокой плотностью иммуногенных эпитопов, обеспечиваемой более длинным полисахаридом OAg.As shown in FIG. 23A-23C, rabbit preimmune antibodies do not bind wild-type O25b serotype isolates GAR2831 and GAR2401 or E. coli strain K-12, whereas the corresponding PD3 antibodies stain O25b bacteria in a concentration-dependent manner. The negative control strain K-12, which lacks the ability to express OAg, shows very weak PD3 antibody binding, most likely due to the presence of exposed internal core oligosaccharide epitopes on its surface. Introduction of the Salmonella fepE plasmid into wild-type O25b isolates results in a significant increase in staining, consistent with the higher density of immunogenic epitopes provided by the longer OAg polysaccharide.

Вывод: Описанные результаты показывают, что Salmonella fepE не только является детерминантой очень длинных полисахаридов О-антигена у видов Salmonella, но также может придавать штаммам E. coli различных серотипов О-антигена способность производить очень длинные OAg. Это свойство можно использовать для получения вакцинных полисахаридов О-антигена с улучшенными свойствами для разработки биопроцессов, облегчая очистку и химическую конъюгацию с соответствующими белками-носителями, и потенциально повышая иммуногенность за счет образования комплексов с более высокой молекулярной массой.Conclusion: The results described indicate that Salmonella fepE is not only a determinant of very long O-antigen polysaccharides in Salmonella species, but may also confer the ability of E. coli strains of different O-antigen serotypes to produce very long OAgs. This property can be exploited to produce O-antigen vaccine polysaccharides with improved properties for bioprocess development, facilitating purification and chemical conjugation to appropriate carrier proteins, and potentially increasing immunogenicity through the formation of higher molecular weight complexes.

ПРИМЕР EXAMPLE 1414 : Первоначальные исследования на кроликах позволяют получить первые реагенты поликлональных антител и ответы IgG на RAC O25b OAg-CRM: Initial studies in rabbits provide first polyclonal antibody reagents and IgG responses to RAC O25b OAg-CRM ₁₉₇₁₉₇

Конъюгаты длинноцепочечного полисахарида O25b-CRM₁₉₇ получают с использованием периодатного окисления с последующим конъюгированием с использованием химии восстановительного аминирования (RAC) (таблица 14). См. также таблицу 24.Long chain polysaccharide O25b-CRM ₁₉₇ conjugates are prepared using periodate oxidation followed by conjugation using reductive amination chemistry (RAC) (Table 14). See also table 24.

Таблица 14Table 14 Конъюгат CRMCRM conjugate ₁₉₇₁₉₇ 132242-28132242-28
Средняя активация 5,5%Average activation 5.5% 132242-27132242-27
Низкая активация 4,5%Low activation 4.5% 132242-29132242-29
Высокая активация 8,3%High activation 8.3% 709766-29709766-29
Свободный полисахарид O25bFree polysaccharide O25b Концентрация полисахаридов (мг/мл)Polysaccharide concentration (mg/ml) 0,70.7 0,60.6 0,670.67 11 Эндотоксин (ЕС/мкг)Endotoxin (EC/µg) 0,020.02 0,020.02 0,020.02 <0,6 ЕОП<0.6 EOP МатрицаMatrix 5 мкм сукцинатного буфера/солевого раствора, pH 6,05 µM succinate buffer/saline, pH 6.0

В исследовании на кроликах 1 (VAC-2017-PRL-EC-0723) (также описанном выше в примере 13) - пять (5) кроликов/группу с 10 мкг L-, M- или H-активацией RAC (+QS21) получают композиции по схеме, показанной на ФИГ. 20А. Было обнаружено, что неконъюгированный свободный полисахарид O25b не является иммуногенным в последующем исследовании на кроликах (VAC-2017-PRL-GB-0698) (см. ФИГ. 25).In Rabbit Study 1 (VAC-2017-PRL-EC-0723) (also described in Example 13 above), five (5) rabbits/group with 10 μg L-, M-, or H-activated RAC (+QS21) received composition according to the scheme shown in FIG. 20A. The unconjugated free polysaccharide O25b was found to be non-immunogenic in a subsequent study in rabbits (VAC-2017-PRL-GB-0698) (see FIG. 25).

В исследовании на кроликах 2 (VAC-2018-PRL-EC-077) - 2 кролика/группу с L-RAC (AlOH₃, QS21 или без адъюванта) получают композицию в соответствии со схемой, показанной на ФИГ. 20В.In Rabbit Study 2 (VAC-2018-PRL-EC-077) - 2 rabbits/group with L-RAC (AlOH ₃ , QS21 or no adjuvant) were formulated according to the schedule shown in FIG. 20V.

Кролики 4-1, 4-2, 5-1, 5-2, 6-1 и 6-2 получают очень длинный неконъюгированный полисахарид O25b, описанный в примере 13, и тестируют сыворотку на 18 неделе.Rabbits 4-1, 4-2, 5-1, 5-2, 6-1 and 6-2 receive the very long unconjugated polysaccharide O25b described in Example 13 and have serum tested at 18 weeks.

Более конкретно, кролику 4-1 вводят композицию, включающую 50 мкг неконъюгированного O25b, 100 мкг адъюванта AlOH₃. Кролику 4-2 вводят композицию, включающую 50 мкг неконъюгированного O25b, 100 мкг адъюванта AlOH₃. Кролику 5-1 вводят композицию, включающую 50 мкг неконъюгированного O25b, 50 мкг адъюванта QS-21. Кролику 5-2 вводят композицию, включающую 50 мкг неконъюгированного O25b, 50 мкг адъюванта QS-21. Кролику 6-1 вводят композицию, включающую 50 мкг неконъюгированного O25b без адъюванта. Кролику 6-2 вводят композицию, включающую 50 мкг неконъюгированного O25b без адъюванта.More specifically, rabbit 4-1 was administered a composition comprising 50 μg of unconjugated O25b, 100 μg of AlOH ₃ adjuvant. Rabbit 4-2 is administered a composition including 50 μg of unconjugated O25b, 100 μg of AlOH ₃ adjuvant. Rabbit 5-1 is administered a composition including 50 μg of unconjugated O25b, 50 μg of QS-21 adjuvant. Rabbit 5-2 is administered a composition including 50 μg of unconjugated O25b, 50 μg of QS-21 adjuvant. Rabbit 6-1 is administered a composition comprising 50 μg of unconjugated O25b without adjuvant. Rabbit 6-2 is administered a composition comprising 50 μg of unconjugated O25b without adjuvant.

ПРИМЕР 15: Исследования на кроликах с конъюгатом O25b RAC: титры разведения сыворотки dLIAEXAMPLE 15: Rabbit studies with O25b RAC conjugate: dLIA serum dilution titers

Исследование 2 на кроликах (VAC-2018-PRL-EC-077) титры разведения сыворотки O25b dLIA по сравнению с кроликами с наилучшим ответом из исследования 1 (VAC-2017-PRL-EC-0723). Для этих экспериментов проводят модифицированный анализ прямого связывания Luminex, в котором полилизиновый конъюгат O25b длинного O-антигена пассивно адсорбируют на карбоксигранулах Luminex вместо смеси метилированного сывороточного альбумина длинного O-антигена, описанной ранее. Использование конъюгата полилизин-O25b улучшает чувствительность анализа и качество ответов, зависящих от концентрации IgG, что позволяет определить титры разведения сыворотки с помощью аппроксимации кривой (нелинейное уравнение с четырьмя параметрами). Титры IgG O25b в сыворотке кролика с самым высоким титром из первого исследования сравнивают с сывороткой кролика из второго исследования в таблице 15.Study 2 in rabbits (VAC-2018-PRL-EC-077) serum O25b dLIA dilution titers compared to best-responding rabbits from Study 1 (VAC-2017-PRL-EC-0723). For these experiments, a modified Luminex direct binding assay was performed in which the long O antigen polylysine conjugate O25b was passively adsorbed onto Luminex carboxybeads in place of the long O antigen methylated serum albumin mixture described previously. The use of a polylysine-O25b conjugate improves the sensitivity of the assay and the quality of IgG concentration-dependent responses, allowing serum dilution titers to be determined using curve fitting (a nonlinear four-parameter equation). The IgG O25b titers in the highest titer rabbit serum from the first study are compared with the rabbit serum from the second study in Table 15.

Таблица 15Table 15 Конъюгат низкой активации O25b-CRM с адъювантом из квасцов (ECLow activation conjugate O25b-CRM with alum adjuvant (EC ₅₀₅₀ как разведение сыворотки) as serum dilution) Конъюгат низкой активации O25b-CRM с адъювантом QS21 (ECLow activation conjugate O25b-CRM with adjuvant QS21 (EC ₅₀₅₀ как разведения сыворотки) as serum dilutions) Конъюгат низкой активации O25b-CRM без адъюванта (ECLow activation O25b-CRM conjugate without adjuvant (EC ₅₀₅₀ как разведения сыворотки) as serum dilutions) Кролик 1-1Rabbit 1-1 Кролик 1-2Rabbit 1-2 Кролик 2-1Rabbit 2-1 Кролик 2-2Rabbit 2-2 Кролик 3-1Rabbit 3-1 Кролик 3-2Rabbit 3-2 Неделя 3 Антисыворотка (3 недели после первичной)Week 3 Antiserum (3 weeks after primary) ~1:200~1:200 ~1:200~1:200 <1:100<1:100 <1:100<1:100 ~1:200~1:200 ~1:200~1:200 Неделя 7 Антисыворотка (1 неделя после ревакцинации 1)Week 7 Antiserum (1 week after booster 1) 1:16001:1600 1:40001:4000 1:2501:250 1:5001:500 1:2501:250 1:15001:1500 Неделя 10 Антисыворотка (1 неделя после ревакцинации 2)Week 10 Antiserum (1 week after booster 2) 1:11001:1100 1:19001:1900 1:2501:250 1:5001:500 1:8001:800 1:12001:1200 Неделя 18 Антисыворотка (1 неделя после ревакцинации 4)Week 18 Antiserum (1 week after booster 4) 1:16001:1600 1:40001:4000 1:13001:1300 1:12001:1200 1:14001:1400 1:16001:1600 Среднее значение 6 повторов лучшей антисыворотки от кролика 2-3 (стандарт анализа из первого исследования) ECAverage of 6 replicates of the best rabbit antiserum 2-3 (assay standard from first study) EC ₅₀₅₀ =1:1700=1:1700

Более высокие дозы во втором исследовании на кроликах (50/20 мкг против 10 мкг) не улучшают титры IgG.Higher doses in the second rabbit study (50/20 mcg vs. 10 mcg) did not improve IgG titers.

Двухмесячный отдых усиливает ответы IgG (не наблюдается при более коротких интервалах).A two-month rest increases IgG responses (not observed at shorter intervals).

По-видимому, квасцы усиливают ответ IgG у кроликов по сравнению с QS21 или без адъюванта.Alum appears to enhance the IgG response in rabbits compared to QS21 or without adjuvant.

Опсонофагоцитарный анализ (OPA) с комплементом крольчат (BRC) и клетками HL60 в качестве источника нейтрофилов проводят для измерения функциональной иммуногенности гликоконъюгатов O-антигена. Предварительно замороженные бактериальные исходные E. coli GAR2831 выращивают в бульоне Луриа (LB) при 37°С. Клетки осаждают и суспендируют до концентрации 1 OD₆₀₀ единиц на мл в PBS с добавлением 20% глицерина и замораживают. Предварительно титрованные размороженные бактерии разводят до 0,5х10⁵ КОЕ/мл в HBSS (сбалансированный солевой раствор Хэнка) с 1% желатина) и 10 мкл (10³ КОЕ) в сочетании с 20 мкл серийно разведенной сыворотки в микропланшете для тканевых культур с U-образным дном, и смесь встряхивают (700 об/мин на шейкере BELLCO) в течение 30 мин при 37℃ в инкубаторе с 5% CO₂. 10 мкл 2,5% комплемента (сыворотка Baby Rabbit Serum, PEL-FREEZ 31061-3, предварительно разведенная в HBG) и 20 мкл клеток HL-60 (0,75х10⁷/мл) и 40 мкл HBG добавляют к микропланшет с U-образным дном для культивирования ткани, и смесь встряхивают на шейкере BELLCO со скоростью 700 об/мин в течение 45 мин при 37°С в инкубаторе с 5% CO₂. Затем 10 мкл каждых 100 мкл реакционной смеси переносят в соответствующие лунки предварительно смоченного фильтровального планшета MILLIPORE MULTISCREENHTS HV, приготовленного путем нанесения 100 мкл воды, фильтр вакуумируют и наносят 150 мкл 50% LB. Фильтровальный планшет фильтруют под вакуумом и инкубируют в течение ночи при 37°С в инкубаторе с 5% CO₂. На следующий день колонии подсчитывают после фиксации, окрашивания и обесцвечивания красителем COOMASSIE и растворами Destain с использованием анализатора IMMUNOSPOT® и программного обеспечения IMMUNOCAPTURE. Чтобы установить специфичность активности OPA, иммунную сыворотку предварительно инкубируют со 100 мкг/мл очищенного длинного O-антигена O25b перед объединением с другими компонентами анализа в реакции OPA. Анализ OPA включает контрольные реакции без клеток HL60 или комплемента, чтобы продемонстрировать зависимость любого наблюдаемого уничтожения от этих компонентов.An opsonophagocytic assay (OPA) with baby rabbit complement (BRC) and HL60 cells as a source of neutrophils was performed to measure the functional immunogenicity of O-antigen glycoconjugates. Prefrozen bacterial stocks of E. coli GAR2831 were grown in Luria broth (LB) at 37°C. Cells are pelleted and suspended to a concentration of 1 OD ₆₀₀ units per ml in PBS supplemented with 20% glycerol and frozen. Pre-titrated thawed bacteria are diluted to 0.5 x ^{10 5} CFU/ml in HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) with 1% gelatin) and 10 µl (10 ³ CFU) combined with 20 µl serially diluted serum in a tissue culture microplate with U- shaped bottom, and the mixture is shaken (700 rpm on a BELLCO shaker) for 30 min at 37℃ in a 5% CO ₂ incubator. 10 µl of 2.5% complement (Baby Rabbit Serum, PEL-FREEZ 31061-3, pre-diluted in HBG) and 20 µl of HL-60 cells (0.75x10 ⁷ /ml) and 40 µl of HBG are added to the microplate with U- shaped bottom for tissue culture, and the mixture is shaken on a BELLCO shaker at 700 rpm for 45 minutes at 37°C in a 5% CO ₂ incubator. Then 10 µl of every 100 µl of the reaction mixture is transferred to the appropriate wells of a pre-wetted MILLIPORE MULTISCREENHTS HV filter plate prepared by applying 100 µl of water, the filter is evacuated and applied with 150 µl of 50% LB. The filter plate is vacuum filtered and incubated overnight at 37°C in a 5% CO ₂ incubator. The next day, colonies are counted after fixation, staining and destaining with COOMASSIE and Destain solutions using the IMMUNOSPOT® analyzer and IMMUNOCAPTURE software. To establish the specificity of OPA activity, the immune serum is preincubated with 100 μg/ml purified O25b long O antigen before combining with other assay components in the OPA reaction. The OPA assay includes control reactions without HL60 cells or complement to demonstrate the dependence of any observed killing on these components.

Совпадающие образцы сыворотки до и после вакцинации от типовых кроликов из обоих исследований на кроликах оценивают в анализе и определяют титры разведения сыворотки (таблица 16, ФИГ. 26A-26B). Предварительная инкубация с неконъюгированным полисахаридом длинного O-антигена O25b блокирует бактерицидную активность, демонстрируя специфичность OPA (ФИГ. 19C). Таблица 16, титры ОРА.Matched pre- and post-vaccination serum samples from representative rabbits from both rabbit studies were evaluated in the assay and serum dilution titers were determined (Table 16, FIGS. 26A-26B). Preincubation with the unconjugated long O antigen polysaccharide O25b blocks bactericidal activity, demonstrating OPA specificity (FIG. 19C). Table 16, OPA titers.

Кролика 2-3 дозируют следующим образом: дозирование кролика 2-3: 10/10/10/10 мкг конъюгата RAC+QS21, после введения дозы (PD) 4 сбора крови. Кролику 1-2 вводят следующие дозы: 50/20/20/20 мкг конъюгата RAC+Al(OH)3, PD4 сбор крови.Rabbit 2-3 is dosed as follows: Rabbit 2-3 dosing: 10/10/10/10 μg RAC+QS21 conjugate, post dose (PD) 4 blood collections. Rabbit 1-2 is administered the following doses: 50/20/20/20 μg of RAC+Al(OH)3 conjugate, PD4 blood collection.

Таблица 16Table 16 ОбразецSample ТитрTiter Кролик 2-3 Предиммунная сывороткаRabbit 2-3 Pre-immune serum 537537 Сыворотка кролика 2-3 на 13 неделе (последний сбор крови)Rabbit serum 2-3 at week 13 (last blood collection) 1368613686 Кролик 1-2 Предиммунная сывороткаRabbit 1-2 Pre-immune serum <200<200 Сыворотка кролика 1-2 на 19 неделе (последний сбор крови)Rabbit serum 1-2 at week 19 (last blood collection) 2276822768

ПРИМЕР 16. Уровни IgG О-антигена O25b, вызванные неконъюгированным полисахаридом длинного О-антигена O25b и полученным гликоконъюгатом длинного О-антигена O25b RAC/ДМСОEXAMPLE 16 O25b O-antigen IgG levels induced by unconjugated O25b long O-antigen polysaccharide and the resulting O25b long O-antigen glycoconjugate RAC/DMSO

Группам из десяти мышей CD-1 путем подкожной инъекции вводят 0,2 или 2,0 мкг/животное гликоконъюгата длинного О-антигена O25b RAC/ДМСО на 0, 5 и 13 неделях с взятием крови на 3 неделе (после введения дозы 1, PD1), 6 неделе (после введения дозы 2, PD2) и 13 неделе (после введения дозы 3, PD3) для тестирования иммуногенности. Уровни антигенспецифического IgG определяют количественным анализом Luminex (подробности см. в примере 15) с O25b-специфическим mAb мыши в качестве внутреннего стандарта. Исходные уровни IgG (пунктирная линия) определяют в сыворотке крови 20 случайно выбранных невакцинированных мышей. Свободный неконъюгированный полисахаридный иммуноген длинного О-антигена O25b не индуцирует IgG выше исходного уровня ни в какой момент времени. В отличие от этого, ответы IgG наблюдаются после двух доз гликоконъюгата длинного конъюгата O25b-CRM197 RAC: сильные однородные ответы IgG наблюдаются при PD3 с промежуточными и более вариабельными уровнями IgG при PD2. Значения GMT IgG (нг/мл) указаны с погрешностями 95% ДИ. См. ФИГ. 27А-27С.Groups of ten CD-1 mice were given 0.2 or 2.0 μg/animal of O25b long O-antigen RAC/DMSO glycoconjugate by subcutaneous injection at weeks 0, 5, and 13, with blood drawn at week 3 (post-dose 1, PD1 ), week 6 (post dose 2, PD2) and week 13 (post dose 3, PD3) for immunogenicity testing. Antigen-specific IgG levels were determined by Luminex quantification assay (see Example 15 for details) with O25b-specific mouse mAb as internal standard. Baseline IgG levels (dashed line) were determined in the serum of 20 randomly selected unvaccinated mice. The free unconjugated polysaccharide immunogen long O antigen O25b did not induce IgG above baseline levels at any time point. In contrast, IgG responses are observed after two doses of the O25b-CRM197 RAC long conjugate glycoconjugate: strong, uniform IgG responses are observed in PD3, with intermediate and more variable IgG levels in PD2. IgG GMT values (ng/mL) are reported with 95% CI errors. See FIG. 27A-27C.

ПРИМЕР 17: Специфичность комплемента крольчат O25b (BRC) OPAEXAMPLE 17: Specificity of O25b Rabbit Complement (BRC) OPA

A-B) Постиммунная сыворотка O25b RAC/ДМСО с длинным О-антигеном от кроликов 2-3 и 1-2 (но не соответствующая предиммунной контрольной сыворотке) проявляет бактерицидную ОРА активность. C) Активность OPA иммунной сыворотки кролика 1-2 блокируют путем предварительной инкубации с 100 мкг/мл длинного полисахарида O-антигена O25b. Бактерии штамма GAR2831 инкубируют с HL60, 2,5% BRC и серийными разведениями сыворотки в течение 1 ч при 37℃, и выжившие бактерии подсчитывают путем подсчета микроколоний (КОЕ) на фильтровальных планшетах. См. ФИГ. 26А-26С.A-B) Post-immune serum O25b RAC/DMSO with long O-antigen from rabbits 2-3 and 1-2 (but not matched to the pre-immune control serum) exhibits OPA bactericidal activity. C) OPA activity of rabbit immune serum 1-2 was blocked by preincubation with 100 μg/ml long O-antigen polysaccharide O25b. Bacteria strain GAR2831 were incubated with HL60, 2.5% BRC and serial dilutions of serum for 1 h at 37℃, and surviving bacteria were enumerated by microcolony counting (CFU) on filter plates. See FIG. 26A-26C.

ПРИМЕР 18: Длинные гликоконъюгаты RAC и eTEC O25b являются более иммуногенными, чем гликоконъюгаты с одним концомEXAMPLE 18: Long RAC and eTEC O25b glycoconjugates are more immunogenic than single-end glycoconjugates

Анализ BRC OPA с резистентным к карбапенему, резистентным к фторхинолону штаммом MDR Atlas187913. Группы из 20 мышей CD-1 вакцинируют 2 мкг гликоконъюгата в соответствии с той же схемой, которая показана на ФИГ. 28A-28B, и ответы OPA определяют в моменты времени после введения дозы 2 (PD2) (ФИГ. 28A) и после введения дозы 3 (PD3) (ФИГ. 28B). Столбцы обозначают GMT с 95% ДИ. Указаны показатели пациентов, ответивших на лечение, выше исходного уровня без вакцинации. Log преобразованные данные из разных групп оценивают, чтобы определить, были ли различия статистически значимыми, с использованием непарного t-критерия с поправкой Уэлча (Graphpad Prism). Результаты суммированы в таблице 17. См. ФИГ. 28А-28В. У мышей, вакцинированных 2 мкг длинных гликоконъюгатов eTEC O1a, титры ОРА против O1a, PD2 и PD3 (данные не показаны) превышают титры ОРА против O25b, PD2 и PD3, соответственно, как показано в таблице 17.BRC OPA assay with carbapenem-resistant, fluoroquinolone-resistant strain MDR Atlas187913. Groups of 20 CD-1 mice are vaccinated with 2 μg of glycoconjugate according to the same schedule as shown in FIG. 28A-28B, and OPA responses are determined at post-dose 2 (PD2) (FIG. 28A) and post-dose 3 (PD3) (FIG. 28B) time points. Bars indicate GMT with 95% CI. Rates of patients responding to treatment above baseline without vaccination are indicated. Log transformed data from different groups were assessed to determine whether the differences were statistically significant using an unpaired t test with Welch's correction (Graphpad Prism). The results are summarized in Table 17. See FIG. 28A-28B. In mice vaccinated with 2 μg of long eTEC O1a glycoconjugates, OPA titers against O1a, PD2, and PD3 (data not shown) exceeded OPA titers against O25b, PD2, and PD3, respectively, as shown in Table 17.

Таблица 17Table 17 ОПИСАНИЕDESCRIPTION % пациентов, ответивших на лечение (n/N)*% of patients who responded to treatment (n/N)* СР. ГЕОМ. ТИТР PD2SR. GEOM. TITLE PD2 % пациентов, ответивших на лечение (n/N)*% of patients who responded to treatment (n/N)* СР. ГЕОМ. ТИТР PD3SR. GEOM. TITLE PD3 Одноконцевой короткий, 2 мкгSingle-terminal short, 2 µg 45 (9/20)45 (9/20) 15521552 85 (17/20)85 (17/20) 1707017070 Одноконцевой длинный, 2 мкгSingle-terminal long, 2 µg 30 (6/20)30 (6/20) 763763 85 (17/20)85 (17/20) 1083810838 RAC/ДМСО длинный, 2 мкгRAC/DMSO long, 2 mcg 65 (13/20)65 (13/20) 82978297 95 (19/20)95 (19/20) 163210163210 eTEC (10%) длинный, 2 мкгeTEC (10%) long, 2 µg 90 (18/20)90 (18/20) 2736827368 100 (19/19)100 (19/19) 161526161526

ПРИМЕР 19: Иммуногенность OPA в химии eTEC можно улучшить путем изменения уровней активации полисахаридаEXAMPLE 19: OPA Immunogenicity in eTEC Chemistry Can Be Improved by Changing Polysaccharide Activation Levels

Анализ BRC OPA с резистентным к карбапенему, резистентным к фторхинолону штаммом MDR Atlas187913. Группы из 20 мышей CD-1 вакцинируют 0,2 мкг или 2 мкг указанного длинного гликоконъюгата O25b eTEC, и ответы OPA определяют в момент времени PD2. Совокупные log преобразованные данные для групп с 4% активацией по сравнению с 17% активацией оценивают для подтверждения того, что различия в ответах OPA были статистически значимыми, с использованием непарного t-критерия с поправкой Уэлча (Graphpad Prism). GMT и долю пациентов, ответивших на лечение, для отдельных групп приведены в таблице 18. См. ФИГ. 29.BRC OPA assay with carbapenem-resistant, fluoroquinolone-resistant strain MDR Atlas187913. Groups of 20 CD-1 mice are vaccinated with 0.2 μg or 2 μg of the indicated O25b eTEC long glycoconjugate, and OPA responses are determined at the PD2 time point. Cumulative log transformed data for the 4% activation versus 17% activation groups were assessed to confirm that differences in OPA responses were statistically significant using an unpaired t test with Welch's correction (Graphpad Prism). GMT and proportion of patients responding to treatment for individual groups are shown in Table 18. See FIG. 29.

Таблица 18Table 18 ОписаниеDescription % пациентов, ответивших на лечение (n/N)% of patients who responded to treatment (n/N) Ср. геом. титрWed. geom. titer eTEC длинный 4% активация (0,2 мкг)eTEC long 4% activation (0.2 µg) 35 (7/20)35 (7/20) 628628 eTEC длинный 4% активация (0,2 мкг)eTEC long 4% activation (0.2 µg) 65 (13/20)65 (13/20) 81858185 eTEC длинный 10% активация (0,2 мкг)eTEC long 10% activation (0.2 µg) 45 (9/20)45 (9/20) 10851085 eTEC длинный 10% активация (0,2 мкг)eTEC long 10% activation (0.2 µg) 90 (18/20)90 (18/20) 2736827368 eTEC длинный 17% активация (0,2 мкг)eTEC long 17% activation (0.2 µg) 70 (14/20)70 (14/20) 37343734 eTEC длинный 17% активация (0,2 мкг)eTEC long 17% activation (0.2 µg) 80 (16/20)80 (16/20) 2546125461

ПРИМЕР 20: Исследование заражения показывает, что длинные конъюгаты EXAMPLE 20: Contamination study shows that long conjugates E. coli O25b E. coli O25b eTEC вызывают защиту после трех дозeTECs induce protection after three doses

Группы из 20 мышей CD-1, иммунизированных дозой 2 мкг в соответствии с указанным графиком, подвергают внутрибрюшинному заражению 1х10⁹ бактериями штамма GAR2831. Последующую выживаемость отслеживают в течение шести дней. Группы мышей, вакцинированных гликоконъюгатами eTEC, активированными на уровне 4%, 10% или 17%, защищены от летальной инфекции, тогда как невакцинированные контрольные мыши или мыши, вакцинированные 2 мкг неконъюгированного длинного полисахарида O25b, не защищены. См. ФИГ. 30А-30В.Groups of 20 CD-1 mice, immunized with a dose of 2 μg according to the indicated schedule, were challenged intraperitoneally with 1 x 10 ⁹ bacteria strain GAR2831. Subsequent survival is monitored for six days. Groups of mice vaccinated with eTEC glycoconjugates activated at 4%, 10%, or 17% are protected from lethal infection, whereas unvaccinated control mice or mice vaccinated with 2 μg of unconjugated O25b long polysaccharide are not protected. See FIG. 30A-30B.

ПРИМЕР 21: Способ получения eTEC-связанных гликоконъюгатовEXAMPLE 21: Method for preparing eTEC-linked glycoconjugates

Активация сахарида и тиолирование дигидрохлоридом цистамина. Сахарид восстанавливают в безводном диметилсульфоксиде (ДМСО). Содержание влаги в растворе определяют с помощью анализа Карла Фишера (KF) и доводят до содержания влаги 0,1 и 1,0%, обычно 0,5%. Saccharide activation and thiolation with cystamine dihydrochloride. The saccharide is reduced in anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO). The moisture content of the solution is determined by Karl Fischer (KF) analysis and adjusted to moisture contents of 0.1 and 1.0%, typically 0.5%.

Для инициации активации готовят свежеприготовленный раствор 1,1'-карбонил-ди-1,2,4-триазола (CDT) или 1,1'-карбонилдиимидазола (CDI) в концентрации 100 мг/мл в ДМСО. Сахарид активируют различными количествами CDT/CDI (1-10 молярных эквивалентов) и дают возможность протекать реакции в течение 1-5 часов при комнатной температуре или 35℃. Добавляют воду, чтобы погасить любой остаточный CDI/CDT в растворе реакции активации. Расчеты выполняют для определения добавляемого количества воды и допущения конечного содержания влаги в пределах 2-3% от общего количества воды. Реакции дают протекать в течение 0,5 часа при комнатной температуре. Дигидрохлорид цистамина готовят на месте в безводном ДМСО в концентрации 50 мг/мл. Активированный сахарид подвергают реакции с 1-2 мол. экв. дигидрохлорида цистамина. Альтернативно активированный сахарид подвергают реакции с 1-2 мол. экв. гидрохлорида цистеамина. Реакция тиолирования протекает в течение 5-20 часов при комнатной температуре с получением тиолированного сахарида. Уровень тиолирования определяют добавленным количеством CDT/CDI.To initiate activation, prepare a freshly prepared solution of 1,1'-carbonyl-di-1,2,4-triazole (CDT) or 1,1'-carbonyldiimidazole (CDI) at a concentration of 100 mg/ml in DMSO. The saccharide is activated with varying amounts of CDT/CDI (1-10 molar equivalents) and allowed to react for 1-5 hours at room temperature or 35℃. Water is added to quench any residual CDI/CDT in the activation reaction solution. Calculations are made to determine the amount of water to be added and to allow the final moisture content to be within 2-3% of the total water. The reaction is allowed to proceed for 0.5 hours at room temperature. Cystamine dihydrochloride is prepared in situ in anhydrous DMSO at a concentration of 50 mg/mL. The activated saccharide is reacted with 1-2 mol. eq. cystamine dihydrochloride. Alternatively, the activated saccharide is reacted with 1-2 mol. eq. cysteamine hydrochloride. The thiolation reaction proceeds for 5-20 hours at room temperature to produce a thiolated saccharide. The level of thiolation is determined by the added amount of CDT/CDI.

Восстановление и очистка активированного тиолированного сахарида. К реакционной смеси тиолированного сахарида добавляют раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР), 3-6 мол. экв. и оставляют на 3-5 часов при кт. Реакционную смесь затем разводят 5-10-кратно добавлением предварительно охлажденного 10 мМ одноосновного фосфата натрия и фильтруют через 5 мкм фильтр. Дифильтрацию тиолированного сахарида проводят против 30-40-кратного диаобъема предварительно охлажденного 10 мМ одноосновного фосфата натрия. Аликвоту ретентата активированного тиолированного сахарида отбирают для определения концентрации сахарида и анализа содержания тиола (Эллман). Reduction and purification of activated thiolated saccharide. A solution of tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP), 3-6 mol, is added to the reaction mixture of the thiolated saccharide. eq. and leave for 3-5 hours at CT. The reaction mixture is then diluted 5-10-fold by adding pre-cooled 10 mM sodium phosphate monobasic and filtered through a 5 μm filter. Difiltration of the thiolated saccharide is carried out against a 30-40-fold volume of pre-cooled 10 mM sodium phosphate monobasic. An aliquot of the activated thiolated saccharide retentate is removed for determination of saccharide concentration and thiol content analysis (Ellman).

Активация и очистка бромацетилированного белка-носителя. Свободные аминогруппы белка-носителя бромацетилируют реакцией с бромацетилирующим агентом, таким как N-гидроксисукцинимидный эфир бромуксусной кислоты (BAANS), бромацетилбромид или другим подходящим реагентом. Activation and purification of bromoacetylated carrier protein. The free amino groups of the carrier protein are bromoacetylated by reaction with a bromoacetylation agent such as N-hydroxybromoacetic acid succinimide ester (BAANS), bromoacetyl bromide, or other suitable reagent.

Белок-носитель (в 0,1 М фосфате натрия, pH 8,0 ± 0,2) сначала выдерживают при 8 ± 3°С, примерно при pH 7 перед активацией. К белковому раствору добавляют N-гидроксисукцинимидный эфир бромуксусной кислоты (BAANS) в виде исходного раствора диметилсульфоксида (ДМСО) (20 мг/мл) в соотношении 0,25-0,5 BAANS: белок (масс./масс.). Реакционную смесь осторожно перемешивают при 5 ± 3°С в течение 30-60 минут. Полученный бромацетилированный (активированный) белок очищают, например, ультрафильтрацией/диафильтрацией с использованием 10 кДа мембраны MWCO с использованием 10 мМ фосфатного (pH 7,0) буфера. После очистки, концентрацию белка в бромацетилированном белке-носителе оценивают с помощью анализа белка по Лоури.The carrier protein (in 0.1 M sodium phosphate, pH 8.0 ± 0.2) is first maintained at 8 ± 3°C, approximately pH 7, before activation. Bromoacetic acid N-hydroxysuccinimide ester (BAANS) is added to the protein solution as dimethyl sulfoxide (DMSO) stock solution (20 mg/ml) at a ratio of 0.25-0.5 BAANS:protein (w/w). The reaction mixture is gently stirred at 5 ± 3°C for 30-60 minutes. The resulting bromoacetylated (activated) protein is purified, for example, by ultrafiltration/diafiltration using a 10 kDa MWCO membrane using 10 mM phosphate (pH 7.0) buffer. After purification, the protein concentration of the bromoacetylated carrier protein is assessed using the Lowry protein assay.

Степень активации определяют анализом общего содержания бромида с помощью ионообменной жидкостной хроматографии в сочетании с обнаружением по подавленной электропроводности (ионная хроматография). Связанный бромид на активированном бромацетилированном белке отщепляют от белка в образце для анализа и количественно определяют вместе с любым свободным бромидом, который может присутствовать. Любой оставшийся ковалентно связанный бром на белке высвобождают путем превращения в ионный бромид при нагревании образца в щелочном 2-меркаптоэтаноле.The degree of activation is determined by total bromide analysis using ion exchange liquid chromatography combined with suppressed conductivity detection (ion chromatography). The bound bromide on the activated bromoacetylated protein is cleaved from the protein in the assay sample and quantified along with any free bromide that may be present. Any remaining covalently bound bromine on the protein is released by conversion to the ionic bromide by heating the sample in alkaline 2-mercaptoethanol.

Активация и очистка бромацетилированного CRM ₁₉₇ . CRM₁₉₇ разводят до 5 мг/мл 10 мМ фосфатом, забуференным 0,9% NaCl, pH 7 (PBS), и затем готовят 0,1 М NaHCO₃, pH 7,0, используя 1 М исходный раствор. BAANS добавляют в соотношении СО₁₉₇:BAANS 1:0,35 (масс.:масс.), используя исходный раствор BAANS 20 мг/мл ДМСО. Реакционную смесь инкубируют при температуре от 3°C до 11°C в течение 30 минут - 1 часа, затем очищают ультрафильтрацией/диафильтрацией с использованием 10K мембраны MWCO и 10 мМ фосфата натрия/0,9% NaCl, pH 7,0. Очищенный активированный CRM₁₉₇ анализируют с помощью анализа Лоури для определения концентрации белка, и затем разводят PBS до 5 мг/мл. Добавляют сахарозу до 5% масс./об. в качестве криопротектора, и активированный белок замораживают и хранят при -25°С до тех пор, пока он не потребуется для конъюгации. Activation and purification of bromoacetylated CRM ₁₉₇ . CRM ₁₉₇ is diluted to 5 mg/ml with 10 mM phosphate buffered 0.9% NaCl, pH 7 (PBS), and then prepared with 0.1 M NaHCO ₃ , pH 7.0, using a 1 M stock solution. BAANS are added at a CO ₁₉₇ :BAANS ratio of 1:0.35 (wt:wt) using a BAANS stock solution of 20 mg/mL DMSO. The reaction mixture is incubated at 3°C to 11°C for 30 minutes to 1 hour, then purified by ultrafiltration/diafiltration using a 10K MWCO membrane and 10 mM sodium phosphate/0.9% NaCl, pH 7.0. Purified activated CRM ₁₉₇ is analyzed using the Lowry assay to determine protein concentration and then diluted with PBS to 5 mg/ml. Add sucrose to 5% w/v. as a cryoprotectant, and the activated protein is frozen and stored at -25°C until needed for conjugation.

Бромацетилирование лизиновых остатков CRM₁₉₇ является очень последовательным, приводя к активации от 15 до 25 лизинов из 39 доступных лизинов. Реакция дает высокие выходы активированного белка.Bromoacetylation of the lysine residues of CRM ₁₉₇ is very consistent, resulting in the activation of 15 to 25 lysines out of 39 available lysines. The reaction gives high yields of activated protein.

Конъюгация активированного тиолированного сахарида с бромацетилированным белком-носителем. Затем добавляют бромацетилированный белок-носитель и активированный тиолированный сахарид. Исходное соотношение сахарид/белок составляет 0,8 ± 0,2. рН реакции доводят до 9,0 ± 0,1 с помощью 1 М раствора NaOH. Реакции конъюгации дают протекать при 5°С в течение 20 ± 4 часов. Conjugation of an activated thiolated saccharide to a bromoacetylated carrier protein. The bromoacetylated carrier protein and the activated thiolated saccharide are then added. The initial saccharide/protein ratio is 0.8 ± 0.2. The reaction pH is adjusted to 9.0 ± 0.1 using 1 M NaOH solution. The conjugation reaction is allowed to proceed at 5°C for 20 ± 4 hours.

Кэпирование остаточных реакционноспособных функциональных групп. Непрореагировавшие бромацетилированные остатки на белке-носителе гасят реакцией с 2 мол. экв. N-ацетил-L-цистеина в качестве кэпирующего реагента в течение 3-5 часов при 5°C. Остаточные свободные сульфгидрильные группы кэпируют 4 мол. экв. йодацетамида (IAA) в течение 20-24 часов при 5°C. Capping of residual reactive functional groups.Unreacted bromoacetylated residues on the carrier protein are quenched by reaction with 2 mol. eq. N-acetyl-L-cysteine as a capping reagent for 3-5 hours at 5°C. Residual free sulfhydryl groups are capped with 4 mol. eq. iodoacetamide (IAA) for 20-24 hours at 5°C.

Очистка eTEC-связанного гликоконъюгата. Смесь реакции конъюгации (после IAA-кэпирования) фильтруют через фильтр 0,45 мкм. Ультрафильтрацию/диафильтрацию гликоконъюгата проводят против 5 мМ сукцината - 0,9% солевого раствора, рН 6,0. Затем ретентат гликоконъюгата фильтруют через 0,2 мкм фильтр. Аликвоту гликоконъюгата берут для анализов. Оставшийся гликоконъюгат хранят при 5°С. См. таблицу 21, таблицу 22, таблицу 23, таблицу 24 и таблицу 25. Purification of eTEC-bound glycoconjugate. The conjugation reaction mixture (after IAA capping) is filtered through a 0.45 μm filter. Ultrafiltration/diafiltration of the glycoconjugate is carried out against 5 mM succinate - 0.9% saline solution, pH 6.0. The glycoconjugate retentate is then filtered through a 0.2 μm filter. An aliquot of the glycoconjugate is taken for analysis. The remaining glycoconjugate is stored at 5°C. See Table 21, Table 22, Table 23, Table 24 and Table 25.

ПРИМЕР 22: ПОЛУЧЕНИЕ КОНЮГАТОВ EXAMPLE 22: PREPARATION OF CONJUGATES E.COLIE.COLI -O25B ETEC-O25B ETEC

Процесс активации - Активация липополисахарида E. coli -O25b. Лиофилизированный полисахарид E. coli-O25b восстанавливают в безводном диметилсульфоксиде (ДМСО). Содержание влаги в лиофилизированном растворе O25b/ДМСО определяют с помощью анализа Карла Фишера (KF). Содержание влаги регулируют добавлением воды для инъекций к раствору O25b/ДМСО до достижения содержания влаги 0,5%. Activation process - Activation of E. coli lipopolysaccharide -O25b. Lyophilized E. coli -O25b polysaccharide is reconstituted in anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO). The moisture content of the lyophilized O25b/DMSO solution was determined using the Karl Fischer (KF) assay. The moisture content is adjusted by adding water for injection to the O25b/DMSO solution until the moisture content is 0.5%.

Для инициации активации, на месте получают 1,1'-карбонилдиимидазол (CDI) в виде 100 мг/мл в растворе ДМСО. Полисахарид E. coli-O25b активируют различными количествами CDI перед стадией тиолирования. Активацию CDI проводят при комнатной температуре или 35°C в течение 1-3 часов. Добавляют воду, чтобы погасить любой остаточный CDI в реакционном растворе для активации. Расчеты выполняют для определения добавляемого количества воды и допущения конечного содержания влаги в пределах 2-3% от общего количества воды. Реакции дают протекать в течение 0,5 часа при комнатной температуре.To initiate activation, 1,1'-carbonyldiimidazole (CDI) is prepared in situ at 100 mg/mL in DMSO solution. E. coli -O25b polysaccharide is activated with varying amounts of CDI before the thiolation step. CDI activation is carried out at room temperature or 35°C for 1-3 hours. Water is added to quench any residual CDI in the activation reaction solution. Calculations are made to determine the amount of water to be added and to allow the final moisture content to be within 2-3% of the total water. The reaction is allowed to proceed for 0.5 hours at room temperature.

Тиолирование активированного полисахарида E. coli -O25b. Цистамин-дигидрохлорид получают на месте в безводном ДМСО, и 1-2 мол. экв. дигидрохлорида цистамина добавляют к реакционному раствору активированного полисахарида. Реакции дают протекать в течение 20 ± 4 часов при кт. Thiolation of activated polysaccharide E. coli -O25b. Cystamine dihydrochloride is prepared on site in anhydrous DMSO, and 1-2 mol. eq. Cystamine dihydrochloride is added to the activated polysaccharide reaction solution. The reaction is allowed to proceed for 20 ± 4 hours at rt.

Восстановление и очистка активированного тиолированного полисахарида E. coli -O25b. К реакционной смеси тиолированного сахарида добавляют раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР), добавляют 3-6 мол. экв. и оставляют на 3-5 часов при комнатной температуре. Затем реакционную смесь разводят 5-10-кратно добавлением предварительно охлажденного 10 мМ одноосновного фосфата натрия и фильтруют через 5 мкм фильтр. Диафильтрацию тиолированного сахарида проводят против 40-кратного диаобъема предварительно охлажденного 10 мМ одноосновного фосфата натрия с кассетами ультрафильтрационных мембран 5K MWCO. Ретентат тиолированного полисахарида O25b берут как для анализа концентрации сахарида, так и для анализа тиола (Эллман). Блок-схема процесса активации представлена на ФИГ. 32А). Recovery and purification of activated thiolated polysaccharide E. coli -O25b. A solution of tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) is added to the reaction mixture of the thiolated saccharide, 3-6 mol. eq. and leave for 3-5 hours at room temperature. Then the reaction mixture is diluted 5-10 times by adding pre-cooled 10 mM sodium phosphate monobasic and filtered through a 5 μm filter. Diafiltration of the thiolated saccharide is carried out against 40 times the diavolume of pre-cooled 10 mM sodium phosphate monobasic with 5K MWCO ultrafiltration membrane cassettes. The O25b thiolated polysaccharide retentate is taken for both saccharide concentration and thiol analysis (Ellman). A flow diagram of the activation process is shown in FIG. 32A ).

Процесс конъюгации - конъюгация тиолированного полисахарида E. coli -O25b с бромацетилированным CRM ₁₉₇. Белок-носитель CRM₁₉₇ отдельно активируют бромацетилированием, как описано в примере 21, и затем подвергают реакции с активированным полисахаридом E. coli-O25b для реакции конъюгации. Бромацетилированный CRM₁₉₇ и тиолированный полисахарид O25b смешивают вместе в реакционном сосуде. Соотношение входа сахарид/белок составляет 0,8 ± 0,2. рН реакции доводят до 8,0-10,0. Реакции конъюгации дают протекать при 5°C в течение 20 ± 4 часов. Conjugation process - conjugation of thiolated polysaccharide E. coli -O25b with bromoacetylated CRM ₁₉₇. Carrier protein CRM₁₉₇ separately activated by bromoacetylation as described in example 21, and then reacted with the activated polysaccharide E. coli-O25b for the conjugation reaction. Bromoacetylated CRM₁₉₇ and thiolated polysaccharide O25b are mixed together in a reaction vessel. The saccharide/protein input ratio is 0.8 ± 0.2. The pH of the reaction is adjusted to 8.0-10.0. The conjugation reaction is allowed to proceed at 5°C for 20 ± 4 hours.

Кэпирование реакционноспособных групп на бромацетилированном CRM ₁₉₇ и тиолированном полисахариде E. coli -O25b. Непрореагировавшие бромацетилированные остатки на белках CRM₁₉₇ кэпируют, подвергая реакции с 2 мол. экв. N-ацетил-L-цистеина в течение 3-5 часов при 5°C с последующим кэпированием любых остаточных свободных сульфгидрильных групп тиолированного O25b-полисахарида с 4 мол. экв. йодацетамида (IAA) в течение 20-24 часов при 5°C. Capping of reactive groups on bromoacetylated CRM ₁₉₇ and thiolated polysaccharide E. coli -O25b.Unreacted bromoacetylated residues on CRM proteins₁₉₇ capped by reacting with 2 mol. eq. N-acetyl-L-cysteine for 3-5 hours at 5°C followed by capping any remaining free sulfhydryl groups of the thiolated O25b-polysaccharide with 4 mol. eq. iodoacetamide (IAA) for 20-24 hours at 5°C.

Очистка eTEC-связанного гликоконъюгата E. coli -O25b. Раствор конъюгации фильтруют через 0,45 мкм или 5 мкм фильтр. Диафильтрацию гликоконъюгата O25b проводят с использованием кассет ультрафильтрационных мембран 100K MWCO. Диафильтрацию проводят против 5 мМ сукцината - 0,9% солевого раствора, рН 6,0. Затем 100K ретентат гликоконъюгата E. coli-O25b фильтруют через 0,22 мкм фильтр и хранят при 5°C. Purification of eTEC-bound E. coli -O25b glycoconjugate. The conjugation solution is filtered through a 0.45 μm or 5 μm filter. Diafiltration of the O25b glycoconjugate is carried out using 100K MWCO ultrafiltration membrane cassettes. Diafiltration is carried out against 5 mM succinate - 0.9% saline solution, pH 6.0. The 100K E. coli -O25b glycoconjugate retentate is then filtered through a 0.22 μm filter and stored at 5°C.

Блок-схема процесса конъюгации представлена на ФИГ. 32В.A flow diagram of the conjugation process is shown in FIG. 32V.

Результатыresults

Параметры реакции и данные о характеристиках для нескольких партий гликоконъюгатов E. coli-O25b eTEC показаны в таблице 19. Активация-тиолирование CDI с дигидрохлоридом цистамина приводит к получению гликоконъюгатов с выходом сахаридов от 41 до 92% и содержанием свободных сахаридов от <5 до 14%. См. также Таблицу 21, Таблицу 22, Таблицу 23, Таблицу 24 и Таблицу 25.Reaction parameters and characterization data for multiple batches of glycoconjugates E. coli-O25b eTEC are shown in table 19. Activation-thiolation of CDI with cystamine dihydrochloride results in glycoconjugates with saccharide yields ranging from 41 to 92% and free saccharide contents ranging from <5 to 14%. See also Table 21, Table 22, Table 23, Table 24 and Table 25.

Таблица 19 Экспериментальные параметры и данные характеризации конъюгатов eTEC Table 19 Experimental parameters and characterization data of eTEC conjugates E. coliE. coli -O25b-O25b Конъюгированная партияConjugate party O25b-1AO25b-1A O25b-2BO25b-2B O25b-3CO25b-3C O25b-4DO25b-4D O25b-5EO25b-5E O25b-6FO25b-6F Уровень активации (моль тиола/моль полисахарида),%Activation level (mol thiol/mol polysaccharide),% 1010 2020 2222 1717 2525 2424 Входное соотношение сахарид/белокInput saccharide/protein ratio 0,80.8 0,80.8 0,80.8 0,80.8 0,80.8 0,80.8 Выход сахарида (%)Saccharide yield (%) 5656 5757 7979 9292 4141 5959 Выходное соотношение сахарид/белокOutput saccharide/protein ratio 0,880.88 11 1,181.18 1,321.32 2,92.9 1,41.4 Свободный сахарид,%Free saccharide,% 88 €5€5 66 55 1414 55 Свободный белок,%Free protein,% <1<1 <1<1 <1<1 <1<1 <1<1 <1<1 Молекулярная масса конъюгата, кДаMolecular mass of the conjugate, kDa 10571057 41244124 22592259 23062306 18251825 15371537 Всего CMCATotal CMCA 33 ндnd ндnd 7,27.2 ндnd ндnd

ПРИМЕР 23: Процедура приготовления конъюгатов полисахарида-CRM197 eTEC О-антигена EXAMPLE 23: Procedure for preparing polysaccharide-CRM197 eTEC O-antigen conjugates E. coli E. coli (применительно к О-антигенам из(in relation to O-antigens from серотипов O25b, O1a, O2 и O6serotypes O25b, O1a, O2 and O6 E. coli E. coli

Активация полисахаридов.Activation of polysaccharides.

О-антиген E. coli восстанавливают в безводном диметилсульфоксиде (ДМСО). Чтобы инициировать активацию, к раствору полисахарида добавляют различные количества 1,1'-карбонилдиимидазола (CDI) (1-10 молярных эквивалентов) и выдерживают реакцию в течение 1-5 часов при комнатной температуре или 35°С. Затем добавляют воду (2-3%, об./об.) для гашения любого остаточного CDI в реакционном растворе активации. После того как реакции дают возможность протекать в течение 0,5 часа при кт, добавляют 1-2 мол. экв. дигидрохлорида цистамина. Реакции дают протекать в течение 5-20 часов при кт, и затем обрабатывают 3-6 мол. экв. трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) с получением тиолированного сахарида. Уровень тиолирования определяют добавленным количеством CDI. E. coli O-antigen is reduced in anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO). To initiate activation, varying amounts of 1,1'-carbonyldiimidazole (CDI) (1-10 molar equivalents) are added to the polysaccharide solution and reacted for 1-5 hours at room temperature or 35°C. Water (2-3%, v/v) is then added to quench any residual CDI in the activation reaction solution. After the reaction is allowed to proceed for 0.5 hours at rt, add 1-2 mol. eq. cystamine dihydrochloride. The reaction is allowed to proceed for 5-20 hours at rt, and then treated with 3-6 mol. eq. tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) to produce a thiolated saccharide. The level of thiolation is determined by the added amount of CDI.

Реакционную смесь затем разводят 5-10-кратно добавлением предварительно охлажденного 10 мМ одноосновного фосфата натрия и фильтруют через 5 мкм фильтр. Дифильтрацию тиолированного сахарида проводят против 30-40-кратного диаобъема предварительно охлажденного 10 мМ одноосновного фосфата натрия. Аликвоту ретентата активированного тиолированного сахарида отбирают для определения концентрации сахарида и содержания тиола (Эллман).The reaction mixture is then diluted 5-10-fold by adding pre-cooled 10 mM sodium phosphate monobasic and filtered through a 5 μm filter. Difiltration of the thiolated saccharide is carried out against a 30-40-fold volume of pre-cooled 10 mM sodium phosphate monobasic. An aliquot of the activated thiolated saccharide retentate is removed to determine the saccharide concentration and thiol content (Ellman).

Активация белка-носителя (CRMActivation of carrier protein (CRM ₁₉₇₁₉₇ ))

CRM₁₉₇ (в 0,1 М фосфате натрия, pH 8,0 ± 0,2) перед активацией сначала выдерживают при 8 ± 3°С примерно при pH 8. К белковому раствору добавляют N-гидроксисукцинимидный эфир бромуксусной кислоты (BAANS) в виде исходного раствора диметилсульфоксида (ДМСО) (20 мг/мл) в соотношении 0,25-0,5 BAANS:белок (масс./масс.). Реакционную смесь осторожно перемешивают при 5 ± 3°С в течение 30-60 минут. Полученный бромацетилированный (активированный) белок очищают, например, ультрафильтрацией/диафильтрацией с использованием 10 кДа мембраны MWCO с использованием 10 мМ фосфатного (pH 7,0) буфера. После очистки, концентрацию белка в бромацетилированном белке-носителе оценивают с помощью анализа белка по Лоури.CRM ₁₉₇ (in 0.1 M sodium phosphate, pH 8.0 ± 0.2) is first kept at 8 ± 3°C at approximately pH 8 before activation. Bromoacetic acid N-hydroxysuccinimide ester (BAANS) is added to the protein solution as dimethyl sulfoxide (DMSO) stock solution (20 mg/ml) in a ratio of 0.25-0.5 BAANS:protein (w/w). The reaction mixture is gently stirred at 5 ± 3°C for 30-60 minutes. The resulting bromoacetylated (activated) protein is purified, for example, by ultrafiltration/diafiltration using a 10 kDa MWCO membrane using 10 mM phosphate (pH 7.0) buffer. After purification, the protein concentration of the bromoacetylated carrier protein is assessed using the Lowry protein assay.

КонъюгацияConjugation

Затем в реактор добавляют активированный CRM₁₉₇ и активированный полисахарид O-антигена E. coli и перемешивают. Входящее соотношение сахаридов/белков составляет 1 ± 0,2. рН реакции доводят до 9,0 ± 0,1 с 1 М раствором NaOH. Реакции конъюгации дают протекать при 5°С в течение 20 ± 4 часов. Непрореагировавшие бромацетилированные остатки на белке-носителе гасят реакцией с 2 мол. экв. N-ацетил-L-цистеина в качестве кэпирующего реагента в течение 3-5 часов при 5°C. Остаточные свободные сульфгидрильные группы кэпируют 4 мол. экв. йодацетамида (IAA) в течение 20-24 часов при 5°C. Затем реакционную смесь очищают с помощью ультрафильтрации/диафильтрации, проводимой против 5 мМ сукцината - 0,9% солевого раствора, рН 6,0. Затем очищенный конъюгат фильтруют через 0,2 мкм фильтр. См. Таблицу 21, Таблицу 22, Таблицу 23, Таблицу 24 и Таблицу 25.Activated CRM is then added to the reactor₁₉₇ and activated O-antigen polysaccharide E. coli and mix. The incoming saccharide/protein ratio is 1 ± 0.2. The reaction pH is adjusted to 9.0 ± 0.1 with 1 M NaOH solution. The conjugation reaction is allowed to proceed at 5°C for 20 ± 4 hours. Unreacted bromoacetylated residues on the carrier protein are quenched by reaction with 2 mol. eq. N-acetyl-L-cysteine as a capping reagent for 3-5 hours at 5°C. Residual free sulfhydryl groups are capped with 4 mol. eq. iodoacetamide (IAA) for 20-24 hours at 5°C. The reaction mixture is then purified by ultrafiltration/diafiltration against 5 mM succinate - 0.9% saline, pH 6.0. The purified conjugate is then filtered through a 0.2 μm filter. See Table 21, Table 22, Table 23, Table 24 and Table 25.

ПРИМЕР 24: Общая методика - Конъюгация О-антигена (из серотипов O1, O2, O6, 25bEXAMPLE 24: General procedure - O-antigen conjugation (from serotypes O1, O2, O6, 25b E. coli E. coli ) с полисахаридом с помощью восстановительного химического анализа (RAC)) with polysaccharide by reductive chemical analysis (RAC)

Конъюгация в диметилсульфоксиде (RAC/ДМСО)Conjugation in dimethyl sulfoxide (RAC/DMSO)

Активирующий полисахаридActivating polysaccharide

Окисление полисахаридов проводят в 100 мМ натрий-фосфатном буфере (рН 6,0 ± 0,2) путем последовательного добавления расчетного количества 500 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 6,0) и воды для инъекций (WFI) до конечной концентрации полисахарида 2,0 г/л. При необходимости pH реакции доводят приблизительно до pH 6,0. После корректировки рН, температуру реакции снижают до 4°С. Окисление инициируют добавлением примерно 0,09-0,13 молярных эквивалентов периодата натрия. Реакцию окисления проводят при 5 ± 3°С в течение приблизительно 20 ± 4 ч.Oxidation of polysaccharides is carried out in 100 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0 ± 0.2) by sequentially adding a calculated amount of 500 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0) and water for injection (WFI) to a final concentration of polysaccharide 2, 0 g/l. If necessary, the reaction pH is adjusted to approximately pH 6.0. After adjusting the pH, the reaction temperature is reduced to 4°C. Oxidation is initiated by adding about 0.09-0.13 molar equivalents of sodium periodate. The oxidation reaction is carried out at 5 ± 3°C for approximately 20 ± 4 hours.

Концентрирование и диафильтрацию активированного полисахарида проводят с использованием ультрафильтрационных кассет 5K MWCO. Диафильтрацию проводят против 20-кратного диаобъема WFI. Затем очищенный активированный полисахарид хранят при 5 ± 3°С. Очищенный активированный сахарид характеризуется, среди прочего, (i) концентрацией сахарида по колориметрическому анализу; (ii) концентрацией альдегида по колориметрическому анализу; (iii) степенью окисления; и (iv) молекулярной массой по SEC-MALLS.Concentration and diafiltration of the activated polysaccharide is carried out using 5K MWCO ultrafiltration cassettes. Diafiltration is carried out against 20 times the WFI diavolume. The purified activated polysaccharide is then stored at 5 ± 3°C. The purified activated saccharide is characterized, among other things, by (i) the concentration of the saccharide by colorimetric analysis; (ii) aldehyde concentration by colorimetric analysis; (iii) degree of oxidation; and (iv) SEC-MALLS molecular weight.

Смешивание активированного полисахарида с сахарозным эксципиентом и лиофилизацияMixing the activated polysaccharide with sucrose excipient and lyophilization

Активированный полисахарид смешивают с сахарозой в соотношении 25 граммов сахарозы на грамм активированного полисахарида. Бутылку с перемешанной смесью затем лиофилизируют. После лиофилизации, флаконы, содержащие лиофилизированный активированный полисахарид, хранят при температуре -20 ± 5°С. Рассчитанное количество белка CRM₁₉₇ замораживают в резервуаре и отдельно лиофилизируют. Лиофилизированный CRM₁₉₇ хранят при -20 ± 5°С.The activated polysaccharide is mixed with sucrose in a ratio of 25 grams of sucrose per gram of activated polysaccharide. The bottle containing the mixed mixture is then lyophilized. After lyophilization, the vials containing the lyophilized activated polysaccharide are stored at -20 ± 5°C. The calculated amount of CRM ₁₉₇ protein is frozen in a reservoir and separately lyophilized. Lyophilized CRM ₁₉₇ is stored at -20 ± 5°C.

Восстановление лиофилизированного активированного полисахарида и белка-носителяRecovery of lyophilized activated polysaccharide and carrier protein

Лиофилизированный активированный полисахарид восстанавливают в безводном диметилсульфоксиде (ДМСО). После полного растворения полисахарида к лиофилизированному CRM₁₉₇ добавляют равное количество безводного ДМСО для восстановления.The lyophilized activated polysaccharide is reconstituted in anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO). After complete dissolution of the polysaccharide, an equal amount of anhydrous DMSO is added to the lyophilized CRM ₁₉₇ for reconstitution.

Конъюгация и кэпированиеConjugation and capping

Восстановленный активированный полисахарид объединяют с восстановленным CRM₁₉₇ в реакционном сосуде с последующим тщательным перемешиванием с получением прозрачного раствора перед началом конъюгации с цианоборгидридом натрия. Конечная концентрация полисахарида в реакционном растворе составляет примерно 1 г/л. Конъюгацию инициируют добавлением к реакционной смеси 0,5-2,0 МЭкв цианоборгидрида натрия и инкубацией при 23 ± 2°C в течение 20-48 ч. Реакцию конъюгации останавливают добавлением 2 МЭкв боргидрида натрия (NaBH₄), чтобы кэпировать непрореагировавшие альдегиды. Эта реакция кэпирования продолжается при 23 ± 2°С в течение 3 ± 1 часа.The reduced activated polysaccharide is combined with the reduced CRM ₁₉₇ in a reaction vessel, followed by thorough mixing to obtain a clear solution before conjugation with sodium cyanoborohydride begins. The final concentration of polysaccharide in the reaction solution is approximately 1 g/L. Conjugation is initiated by adding 0.5-2.0 MEq of sodium cyanoborohydride to the reaction mixture and incubating at 23 ± 2°C for 20-48 hours. The conjugation reaction is stopped by adding 2 MEQ of sodium borohydride (NaBH ₄ ) to cap unreacted aldehydes. This capping reaction is continued at 23 ± 2°C for 3 ± 1 hour.

Очистка конъюгатаPurification of the conjugate

Раствор конъюгата разводят 1:10 охлажденным 5 мМ сукцинатом - 0,9% солевым раствором (pH 6,0) при подготовке к очистке тангенциальной проточной фильтрацией с использованием мембран 100-300K MWCO. Разведенный раствор конъюгата пропускают через 5-мкм фильтр и проводят диафильтрацию с использованием 5 мМ сукцината/0,9% солевого раствора (pH 6,0) в качестве среды. После завершения диафильтрации, ретентат конъюгата пропускают через фильтр 0,22 мкм. Конъюгат дополнительно разводят 5 мМ сукцинатом/0,9% солевым раствором (pH 6) до целевой концентрации сахарида приблизительно 0,5 мг/мл. Альтернативно, конъюгат очищают, используя 20 мМ гистидина - 0,9% солевого раствора (pH 6,5) путем фильтрации с тангенциальным потоком с использованием мембран 100-300 K MWCO. Заключительную стадию фильтрации через 0,22 мкм проводят с получением иммуногенного конъюгата. См. Таблицу 21, Таблицу 22, Таблицу 23, Таблицу 24 и Таблицу 25.The conjugate solution is diluted 1:10 with chilled 5 mM succinate - 0.9% saline (pH 6.0) in preparation for purification by tangential flow filtration using 100-300K MWCO membranes. The diluted conjugate solution is passed through a 5 μm filter and diafiltrated using 5 mM succinate/0.9% saline (pH 6.0) as the medium. After completion of diafiltration, the retentate conjugate is passed through a 0.22 μm filter. The conjugate is further diluted with 5 mM succinate/0.9% saline (pH 6) to a target saccharide concentration of approximately 0.5 mg/ml. Alternatively, the conjugate is purified using 20 mM histidine - 0.9% saline (pH 6.5) by tangential flow filtration using 100-300 K MWCO membranes. The final stage of filtration through 0.22 μm is carried out to obtain an immunogenic conjugate. See Table 21, Table 22, Table 23, Table 24 and Table 25.

ПРИМЕР 25: Конъюгация в водном буфере (RAC/водный), применительно к серотипам O25B, O1A, O2 и O6EXAMPLE 25: Conjugation in aqueous buffer (RAC/aq) for serotypes O25B, O1A, O2 and O6 E. coli E. coli

Активацию полисахаридов и диафильтрацию проводят так же, как и для конъюгации на основе ДМСО.Activation of polysaccharides and diafiltration are carried out in the same way as for DMSO-based conjugation.

Отфильтрованный активированный сахарид смешивают с CRM₁₉₇ при массовом отношении полисахарида к белку в диапазоне от 0,4 до 2 масс./масс. в зависимости от серотипа. Это входное соотношение выбрано для регулирования отношения полисахарида к CRM₁₉₇ в полученном конъюгате.The filtered activated saccharide is mixed with CRM ₁₉₇ at a polysaccharide to protein weight ratio ranging from 0.4 to 2 w/w. depending on the serotype. This input ratio was chosen to control the ratio of polysaccharide to CRM ₁₉₇ in the resulting conjugate.

Полученную смесь затем лиофилизируют. После конъюгации, смесь полисахарида и белка растворяют в 0,1 М натрий-фосфатном буфере с концентрацией полисахарида в диапазоне от 5 до 25 г/л в зависимости от серотипа, рН доводят от 6,0 до 8,0 в зависимости от серотипа. Конъюгацию инициируют добавлением к реакционной смеси 0,5-2,0 МЭкв цианоборгидрида натрия и инкубацией при 23 ± 2°C в течение 20-48 часов. Реакцию конъюгации останавливают добавлением 1-2 МЭкв боргидрида натрия (NaBH₄), чтобы кэпировать непрореагировавшие альдегиды.The resulting mixture is then lyophilized. After conjugation, the mixture of polysaccharide and protein is dissolved in 0.1 M sodium phosphate buffer with a polysaccharide concentration ranging from 5 to 25 g/l depending on the serotype, the pH is adjusted from 6.0 to 8.0 depending on the serotype. Conjugation is initiated by adding 0.5-2.0 MEq of sodium cyanoborohydride to the reaction mixture and incubating at 23 ± 2°C for 20-48 hours. The conjugation reaction is stopped by adding 1-2 MEq of sodium borohydride (NaBH ₄ ) to cap unreacted aldehydes.

Альтернативно, отфильтрованный активированный сахарид и расчетное количество белка CRM₁₉₇ замораживают и лиофилизируют по отдельности, и затем объединяют при растворении в 0,1 М фосфатно-натриевом буфере, затем проводят последующую конъюгацию, как описано выше.Alternatively, the filtered activated saccharide and the calculated amount of CRM ₁₉₇ protein are frozen and lyophilized separately and then combined while dissolved in 0.1 M sodium phosphate buffer, followed by subsequent conjugation as described above.

Таблица 20 суммирует результаты обоих конъюгаций, проведенных в ДМСО и водном буфере.Table 20 summarizes the results of both conjugations carried out in DMSO and aqueous buffer. RAC/ДМСОRAC/DMSO RAC/ВодныйRAC/Water Поли ММ (кДа)Poly MM (kDa) 48К48K 46К46K Степень окисления (DO)Oxidation State (DO) 1212 1212 Соотношение сахарид/белокSaccharide/protein ratio 0,80.8 1,01.0 % свободного сахарида% free saccharide <5%<5% 32%32% ММ конъюгата по SEC-MALLS, кДаMW of conjugate according to SEC-MALLS, kDa 79507950 260260

ПРИМЕР 26: Процедура получения односторонних конъюгатов полисахаридEXAMPLE 26: Procedure for preparing one-way polysaccharide conjugates -- CRMCRM ₁₉₇₁₉₇ О-антигена O-antigen E. coli E. coli

Липополисахариды (LPS), которые являются обычными компонентами внешней мембраны грамотрицательных бактерий, содержат липид А, коровую область и О-антиген (также называемый О-специфическим полисахаридом или О-полисахаридом). Различные серотипы повторяющихся единиц О-антигена различаются по своему составу, структуре и серологическим особенностям. О-антиген, используемый в настоящем изобретении, присоединен к коровому домену, который содержит сахарную единицу, называемую 2-кето-3-дезоксиоктановой кислотой (KDO), на конце своей цепи. В отличие от некоторых способов конъюгации, основанных на случайной активации полисахаридной цепи (например, активации периодатом натрия или карбодиимидом). Это изобретение описывает процесс конъюгации, включающий селективную активацию KDO с помощью дисульфид-аминового линкера, после демаскирования тиоловой функциональной группы, он затем конъюгируется с активированным бромом белком CRM₁₉₇, как показано на ФИГ. 31 (Получение односторонних конъюгатов).Lipopolysaccharides (LPS), which are common components of the outer membrane of Gram-negative bacteria, contain lipid A, core region, and O-antigen (also called O-specific polysaccharide or O-polysaccharide). The different serotypes of O-antigen repeat units differ in their composition, structure and serological features. The O-antigen used in the present invention is attached to a core domain, which contains a sugar unit called 2-keto-3-deoxyoctanoic acid (KDO) at the end of its chain. This is in contrast to some conjugation methods that rely on random activation of the polysaccharide chain (for example, activation with sodium periodate or carbodiimide). This invention describes a conjugation process involving selective activation of KDO by a disulfide-amine linker, after unmasking of the thiol functionality, it is then conjugated to the bromine activated protein CRM ₁₉₇ , as shown in FIG. 31 (Preparation of one-way conjugates).

Конъюгация на основе цистаминового линкера (А1)Conjugation based on cystamine linker (A1)

Полисахарид О-антигена и цистамин (50-250 мол. экв. KDO) смешивают в фосфатном буфере, доводя рН до 6,0-7,0. К смеси добавляют цианоборгидрид натрия (NaCNBH₃) (5-30 мол. экв. KDO) и смесь перемешивают при 37°С в течение 48-72 ч. После охлаждения до комнатной температуры и разведения равным объемом фосфатного буфера, смесь обрабатывают трис(2-карбоксиэтил)фосфином (TCEP) (добавляют 1,2 моль, экв. цистамина). Затем смесь очищают посредством диафильтрации с использованием 5 кДа мембраны MWCO против 10 мМ одноосновного раствора фосфата натрия с получением тиолсодержащего полисахарида О-антигена. Содержание тиола определяют с помощью анализа Эллмана.O-antigen polysaccharide and cystamine (50-250 mol equiv. KDO) are mixed in phosphate buffer, adjusting the pH to 6.0-7.0. Sodium cyanoborohydride (NaCNBH ₃ ) (5-30 mol equiv. KDO) is added to the mixture and the mixture is stirred at 37°C for 48-72 hours. After cooling to room temperature and diluting with an equal volume of phosphate buffer, the mixture is treated with Tris(2 -carboxyethyl)phosphine (TCEP) (add 1.2 mol, cystamine equivalent). The mixture is then purified by diafiltration using a 5 kDa MWCO membrane against 10 mM sodium phosphate monobasic solution to obtain the thiol-containing O-antigen polysaccharide. Thiol content was determined using the Ellman assay.

Затем проводят конъюгацию путем смешивания полисахарида О-антигена, активированного тиолом, с активированным бромом белком CRM₁₉₇ в соотношении 0,5-2,0. рН реакционной смеси доводят до 8,0-10,0 с помощью 1 М раствора NaOH. Реакцию конъюгации проводят при 5°С в течение 24 ± 4 ч. Непрореагировавшие остатки брома на белке-носителе гасят взаимодействием с 2 мол. экв. N-ацетил-L-цистеина в течение 3-5 часов при 5°С. Затем добавляют 3 мол. экв. йодацетамида (относительно добавленного N-ацетил-L-цистеина) для кэпирования оставшихся свободных сульфгидрильных групп. Эта реакция кэпирования продолжается в течение еще 3-5 часов при 5°C, и рН обеих стадий кэпирования поддерживают на уровне 8,0-10,0 добавлением 1М NaOH. Полученный конъюгат получали после ультрафильтрации/диафильтрации с использованием 30 кДа мембраны MWCO против 5 мМ сукцината - 0,9% солевого раствора, рН 6,0. См. Таблицу 21, Таблицу 22, Таблицу 23, Таблицу 24 и Таблицу 25.Conjugation is then carried out by mixing the thiol-activated O-antigen polysaccharide with the bromine-activated CRM protein₁₉₇ in a ratio of 0.5-2.0. The pH of the reaction mixture is adjusted to 8.0-10.0 using a 1 M NaOH solution. The conjugation reaction is carried out at 5°C for 24 ± 4 hours. Unreacted bromine residues on the carrier protein are quenched by interaction with 2 mol. eq. N-acetyl-L-cysteine for 3-5 hours at 5°C. Then add 3 mol. eq. iodoacetamide (relative to added N-acetyl-L-cysteine) to cap the remaining free sulfhydryl groups. This capping reaction is continued for a further 3-5 hours at 5°C and the pH of both capping steps is maintained at 8.0-10.0 by the addition of 1M NaOH. The resulting conjugate was obtained after ultrafiltration/diafiltration using a 30 kDa MWCO membrane against 5 mM succinate - 0.9% saline, pH 6.0. See Table 21, Table 22, Table 23, Table 24 and Table 25.

ПРИМЕР 27: Конъюгация на основе линкера 3,3'-дитиобис(пропанового дигидразида) (А4) EXAMPLE 27: Conjugation based on 3,3' - dithiobis(propane dihydrazide) linker (A4)

Полисахарид О-антигена и 3,3'-дитиобис(пропановый дигидразид) (5-50 мол. экв. KDO) смешивают в ацетатном буфере, доводят рН до 4,5-5,5. К смеси добавляют цианоборогидрид натрия (NaCNBH₃) (5-30 мол. экв. KDO) и смесь перемешивают при 23-37°С в течение 24-72 часов. Затем смесь обрабатывают трис(2-карбоксиэтил)фосфином (TCEP) (добавляют 1,2 моль, экв. линкера 3,3'-дитиобис(пропанового дигидразида)). Затем смесь очищают посредством диафильтрации с использованием 5 кДа мембраны MWCO против 10 мМ одноосновного раствора фосфата натрия с получением тиолсодержащего полисахарида О-антигена. Содержание тиола определяют с помощью анализа Эллмана.O-antigen polysaccharide and 3,3'-dithiobis(propane dihydrazide) (5-50 mol equiv. KDO) are mixed in acetate buffer, the pH is adjusted to 4.5-5.5. Sodium cyanoborohydride (NaCNBH ₃ ) (5-30 mol equiv. KDO) is added to the mixture and the mixture is stirred at 23-37°C for 24-72 hours. The mixture is then treated with tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) (add 1.2 mol equivalent of 3,3'-dithiobis(propane dihydrazide) linker). The mixture is then purified by diafiltration using a 5 kDa MWCO membrane against 10 mM sodium phosphate monobasic solution to obtain the thiol-containing O-antigen polysaccharide. Thiol content was determined using the Ellman assay.

Затем проводят конъюгацию путем смешивания полисахарида О-антигена, активированного тиолом, с активированным бромом белком CRM₁₉₇ в соотношении 0,5-2,0. рН реакционной смеси доводят до 8,0-10,0 1 М раствором NaOH. Реакцию конъюгации проводят при 5°С в течение 24 ± 4 часов. Непрореагировавшие остатки брома на белке-носителе гасят взаимодействием с 2 мол. экв. N-ацетил-L-цистеина в течение 3-5 часов при 5°С. Затем добавляют 3 мол. экв. йодацетамида (относительно добавленного N-ацетил-L-цистеина) для кэпирования оставшихся свободных сульфгидрильных групп. Эту реакцию кэпирования проводят в течение еще 3-5 часов при 5°C, и рН обеих стадий кэпирования поддерживают на уровне 8,0-10,0 добавлением 1М NaOH. Полученный конъюгат получают после ультрафильтрации/диафильтрации с использованием 30 кДа мембраны MWCO против 5 мМ сукцината - 0,9% солевого раствора, рН 6,0.Conjugation is then carried out by mixing the thiol-activated O-antigen polysaccharide with the bromine-activated CRM protein₁₉₇ in a ratio of 0.5-2.0. The pH of the reaction mixture is adjusted to 8.0-10.0 with 1 M NaOH solution. The conjugation reaction is carried out at 5°C for 24 ± 4 hours. Unreacted bromine residues on the carrier protein are quenched by interaction with 2 mol. eq. N-acetyl-L-cysteine for 3-5 hours at 5°C. Then add 3 mol. eq. iodoacetamide (relative to added N-acetyl-L-cysteine) to cap the remaining free sulfhydryl groups. This capping reaction is carried out for a further 3-5 hours at 5°C, and the pH of both capping steps is maintained at 8.0-10.0 by the addition of 1M NaOH. The resulting conjugate is obtained after ultrafiltration/diafiltration using a 30 kDa MWCO membrane against 5 mM succinate - 0.9% saline, pH 6.0.

ПРИМЕР 28: Конъюгация на основе линкера 2,2'-дитио-N,N'-бис(этан-2,1-диил)бис(2-(аминоокси)ацетамид) (А6) EXAMPLE 28: Conjugation based on the linker 2,2' - dithio-N,N' - bis(ethane-2,1-diyl)bis(2-(aminooxy)acetamide) (A6)

Полисахарид O-антигена и 2,2'-дитио-N,N'-бис(этан-2,1-диил)бис(2-(аминоокси)ацетамид) (5-50 мол. экв. KDO) смешивают в ацетатном буфере, доводят pH до 4,5-5,5. Затем смесь перемешивают при 23-37℃ в течение 24-72 часов с последующим добавлением цианоборгидрида натрия (NaCNBH₃) (5-30 мол. экв. KDO), и смесь перемешивают еще 3-24 часа. Затем смесь обрабатывают трис(2-карбоксиэтил)фосфином (TCEP) (1,2 моль, экв. добавленного линкера). Затем смесь очищают посредством диафильтрации с использованием 5 кДа мембраны MWCO против 10 мМ одноосновного раствора фосфата натрия с получением тиолсодержащего полисахарида О-антигена. Содержание тиола определяют с помощью анализа Эллмана.O-antigen polysaccharide and 2,2'-dithio-N,N'-bis(ethane-2,1-diyl)bis(2-(aminooxy)acetamide) (5-50 mol equiv KDO) are mixed in acetate buffer , adjust the pH to 4.5-5.5. The mixture is then stirred at 23-37℃ for 24-72 hours, followed by the addition of sodium cyanoborohydride (NaCNBH ₃ ) (5-30 mol equiv. KDO), and the mixture is stirred for another 3-24 hours. The mixture is then treated with tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) (1.2 mol eq. added linker). The mixture is then purified by diafiltration using a 5 kDa MWCO membrane against 10 mM sodium phosphate monobasic solution to obtain the thiol-containing O-antigen polysaccharide. Thiol content was determined using the Ellman assay.

Затем проводят конъюгацию путем смешивания полисахарида О-антигена, активированного тиолом, с активированным бромом белком CRM₁₉₇ в соотношении 0,5-2,0. рН реакционной смеси доводят до 8,0-10,0 1 М раствором NaOH. Реакцию конъюгации проводят при 5°С в течение 24 ± 4 ч. Непрореагировавшие остатки брома на белке-носителе гасят взаимодействием с 2 мол. экв. N-ацетил-L-цистеина в течение 3-5 часов при 5°С. Затем добавляют 3 мол. экв. йодацетамида (относительно добавленного N-ацетил-L-цистеина) для кэпирования остаточных свободных сульфгидрильных групп. Эту реакцию кэпирования продолжают в течение еще 3-5 часов при 5°C, и рН обеих стадий кэпирования поддерживают на уровне 8,0-10,0 добавлением 1М NaOH. Полученный конъюгат получают после ультрафильтрации/диафильтрации с использованием 30 кДа мембраны MWCO против 5 мМ сукцината - 0,9% солевого раствора, рН 6,0.Conjugation is then carried out by mixing the thiol-activated O-antigen polysaccharide with the bromine-activated CRM protein₁₉₇ in a ratio of 0.5-2.0. The pH of the reaction mixture is adjusted to 8.0-10.0 with 1 M NaOH solution. The conjugation reaction is carried out at 5°C for 24 ± 4 hours. Unreacted bromine residues on the carrier protein are quenched by interaction with 2 mol. eq. N-acetyl-L-cysteine for 3-5 hours at 5°C. Then add 3 mol. eq. iodoacetamide (relative to added N-acetyl-L-cysteine) to cap residual free sulfhydryl groups. This capping reaction is continued for an additional 3-5 hours at 5°C, and the pH of both capping steps is maintained at 8.0-10.0 by the addition of 1M NaOH. The resulting conjugate is obtained after ultrafiltration/diafiltration using a 30 kDa MWCO membrane against 5 mM succinate - 0.9% saline, pH 6.0.

ПРИМЕР 29: Получение активированного бромом CRMEXAMPLE 29: Preparation of Bromine Activated CRM ₁₉₇₁₉₇

CRM₁₉₇ получают в 0,1 М растворе фосфата натрия, pH 8,0 ± 0,2, и охлаждают до 5 ± 3°С. К раствору белка добавляют N-гидроксисукцинимидный эфир бромуксусной кислоты (BAANS) в виде исходного раствора диметилсульфоксида (ДМСО) (20 мг/мл) в соотношении 0,25-0,5 BAANS:белок (масс./масс.). Реакцию осторожно перемешивают при 5 ± 3°С в течение 30-60 минут. Полученный бромацетилированный (активированный) белок очищают, например, ультрафильтрацией/диафильтрацией с использованием 10 кДа мембраны MWCO с использованием 10 мМ фосфатного (pH 7,0) буфера. После очистки, концентрацию белка в бромацетилированном белке-носителе оценивают с помощью анализа белка по Лоури.CRM ₁₉₇ is prepared in 0.1 M sodium phosphate solution, pH 8.0 ± 0.2, and cooled to 5 ± 3°C. Bromoacetic acid N-hydroxysuccinimide ester (BAANS) is added to the protein solution as a dimethyl sulfoxide (DMSO) stock solution (20 mg/ml) at a ratio of 0.25-0.5 BAANS:protein (w/w). The reaction is stirred gently at 5 ± 3°C for 30-60 minutes. The resulting bromoacetylated (activated) protein is purified, for example, by ultrafiltration/diafiltration using a 10 kDa MWCO membrane using 10 mM phosphate (pH 7.0) buffer. After purification, the protein concentration of the bromoacetylated carrier protein is assessed using the Lowry protein assay.

Таблица 21: Конъюгаты O1aTable 21: O1a conjugates Конъюгат № партииConjugate Lot No. 132240-112-2132240-112-2 132242-106132242-106 132242-124132242-124 132242-127132242-127 132242-130132242-130 Поли № партииPoly lot no. 709756-160709756-160 709756-160709756-160 709756-160709756-160 710958-116710958-116 710958-116710958-116 Поли типPoly type Длинная цепьLong chain Короткая цепьShort chain Поли ММ (кДа)Poly MM (kDa) 3333 3333 3333 11eleven 11eleven ВариантOption eTECeTEC одностороннийunilateral RAC/ДМСОRAC/DMSO одностороннийunilateral RAC/ДМСОRAC/DMSO АктивацияActivation 8% SH8% SH 2,1% SH2.1% SH DO: 13DO: 13 6,4% SH6.4% SH DO: 16DO: 16 Данные конъюгатаConjugate data Выход (%)Exit (%) 30thirty 2626 7777 4545 3535 SP отношениеSP ratio 0,60.6 0,50.5 1,01.0 0,70.7 0,60.6 Свободный сахарид (%)Free saccharide (%) 99 99 2020 55 66 ММ (кДа)MM (kDa) 10351035 331331 12841284 280280 22662266 Конц. сахарид (мг.мл)Conc. saccharide (mg.ml) 0,310.31 0,370.37 0,580.58 0,590.59 0,370.37 Эндотоксин (ЕОП/мкг)Endotoxin (EOP/µg) 0,030.03 0,020.02 0,010.01 0,010.01 0,010.01 БуферBuffer 5 мМ сахарид/солевой раствор, pH 6,05 mM saccharide/saline, pH 6.0

Таблица 22: конъюгаты О2Table 22: O2 conjugates Конъюгат № партииConjugate Lot No. 00709749-0003-100709749-0003-1 132242-161132242-161 132242-152132242-152 132242-159132242-159 132242-157132242-157 Поли № партииPoly lot no. 709766-33709766-33 709766-65709766-65 710958-141-2710958-141-2 Поли типPoly type Длинная цепьLong chain Короткая цепьShort chain Поли ММ (кДа)Poly MM (kDa) 3636 3939 1414 ВариантOption eTECeTEC одностороннийunilateral RAC/ДМСОRAC/DMSO одностороннийunilateral RAC/ДМСОRAC/DMSO АктивацияActivation 6,8% SH6.8% SH 1,6% SH1.6% SH DO: 17DO: 17 6,3% SH6.3% SH DO: 19DO: 19 Данные конъюгатаConjugate data Выход (%)Exit (%) 2626 3333 5050 3838 3636 SP отношениеSP ratio 1,51.5 0,80.8 0,80.8 1,01.0 0,60.6 Свободный сахарид (%)Free saccharide (%) 11eleven 24%24% <5<5 <5<5 66 ММ (кДа)MM (kDa) 11611161 422422 30823082 234234 11201120 Эндотоксин (ЕОП/мкг)Endotoxin (EOP/µg) 0,0250.025 0,020.02 0,010.01 0,010.01 0,010.01 БуферBuffer 5 мМ сахарид/солевой раствор, pH 6,05 mM saccharide/saline, pH 6.0

Таблица 23: конъюгаты O6Table 23: O6 conjugates Конъюгат № партииConjugate Lot No. 132240-117-1132240-117-1 132242-134132242-134 132242-137132242-137 132242-146132242-146 132242-145132242-145 Поли № партииPoly lot no. 710958-121-1710958-121-1 710958-143-3710958-143-3 Поли типPoly type Длинная цепьLong chain Короткая цепьShort chain Поли ММ (кДа)Poly MM (kDa) 4444 1515 ВариантOption eTECeTEC одностороннийunilateral RAC/ДМСОRAC/DMSO одностороннийunilateral RAC/ДМСОRAC/DMSO АктивацияActivation 18% SH18%SH 2,2% SH2.2% SH DO: 16,5DO: 16.5 6,1% SH6.1% SH DO: 22DO: 22 Данные конъюгатаConjugate data Выход (%)Exit (%) 2727 2323 5858 4848 30thirty SP отношениеSP ratio 0,780.78 0,60.6 0,820.82 0,70.7 0,60.6 Свободный сахарид (%)Free saccharide (%) 99 44 44 <5<5 88 ММ (кДа)MM (kDa) 10501050 340340 1910 г.1910 256256 20582058 Конц. сахарида (мг.мл)Conc. saccharide (mg.ml) 0,390.39 0,450.45 0,590.59 0,880.88 0,410.41 Эндотоксин (ЕОП/мкг)Endotoxin (EOP/µg) 0,030.03 0,020.02 0,010.01 0,0040.004 0,0050.005 БуферBuffer 5 мМ сахарид/солевой раствор, pH 6,05 mM saccharide/saline, pH 6.0

Таблица 24: конъюгаты O25bTable 24: O25b conjugates Конъюгат № партииConjugate Lot No. 132242-28132242-28 132242-98132242-98 132240-73-1-1132240-73-1-1 132240-62-1132240-62-1 132240-81132240-81 132242-116132242-116 132242-121132242-121 132242-27132242-27 132242-29132242-29 Поли № партииPoly lot no. 709766-28709766-28 709766-29709766-29 709766-30709766-30 709766-30709766-30 709766-30709766-30 710958-117/118710958-117/118 710958-117/118710958-117/118 709766-28709766-28 709766-28709766-28 Поли типPoly type Длинная цепьLong chain Короткая цепьShort chain Длинная цепьLong chain Длинная цепьLong chain Поли ММ (кДа)Poly MM (kDa) 5151 4848 4848 4848 4848 1414 1414 5151 5151 ВариантOption RAC/ ДМСОRAC/DMSO Односто роннийSingle sided eTECeTEC eTECeTEC eTECeTEC Односто роннийSingle sided RAC/ ДМСОRAC/DMSO RAC/ ДМСОRAC/DMSO RAC/ ДМСОRAC/DMSO АктивацияActivation DO: 18DO: 18 2,4% SH2.4% SH 10% SH10% SH 4% SH4% SH 17% SH17% SH 6,6% SH6.6% SH DO: 17DO: 17 2121 1212 Данные конъюгатаConjugate data Выход (%)Exit (%) 8282 2626 5656 3232 9292 2828 1818 7171 8080 SP отношениеSP ratio 0,90.9 0,820.82 0,880.88 0,640.64 1,321.32 0,70.7 0,360.36 0,810.81 0,840.84 Свободный сахарид (%)Free saccharide (%) 7,27.2 55 < 5< 5 11eleven < 5< 5 < 5< 5 < 5< 5 8,38.3 <5<5 ММ конъюгата (кДа)MW of conjugate (kDa) 44154415 840840 10571057 10291029 23062306 380380 91149114 33033303 79537953 Конц. сахарида (мг.мл)Conc. saccharide (mg.ml) 0,70.7 0,40.4 0,430.43 0,360.36 0,90.9 0,450.45 0,190.19 0,60.6 0,670.67 Эндотоксин (ЕОП/мкг)Endotoxin (EOP/µg) 0,010.01 0,020.02 0,080.08 0,080.08 0,010.01 0,010.01 0,010.01 0,020.02 0,220.22 Конъюгат (DS) буфер матрицаConjugate (DS) buffer matrix 5 мМ сахарид/солевой раствор, pH 6,05 mM saccharide/saline, pH 6.0

Таблица 25: конъюгаты O25b K-12Table 25: O25b K-12 conjugates Конъюгат № партииConjugate Lot No. 709749-015-2709749-015-2 709744-0016709744-0016 Поли № партииPoly lot no. 710958-137710958-137 Поли типPoly type Длинная цепь(K12)Long chain(K12) Поли ММ (кДа)Poly MM (kDa) 4444 ВариантOption eTECeTEC RAC/ДМСОRAC/DMSO АктивацияActivation SH: 24%SH: 24% DO: 19DO: 19 Данные конъюгатаConjugate data Выход (%)Exit (%) 59%59% 33%33% SP отношениеSP ratio 1,41.4 0,830.83 Свободный сахарид (%)Free saccharide (%) 5%5% 5,2%5.2% ММ (кДа)MM (kDa) 15371537 47754775 Конц. сахарида (мг.мл)Conc. saccharide (mg.ml) 0,910.91 0,290.29 Эндотоксин (ЕОП/мкг)Endotoxin (EOP/µg) 0,080.08 0,010.01 БуферBuffer 5 мМ сахарид/солевой раствор, pH 6,05 mM saccharide/saline, pH 6.0

ПРИМЕР 29: Получение конъюгатов EXAMPLE 29: Preparation of conjugates E. coli E. coli O-Ag-TTO-Ag-TT

Длинный полисахарид серотипа O25b E. coli, партия № 709766-30 (примерно 6,92 мг/мл, ММ: примерно 39 кДа), 50 мг, лиофилизированный, используют для конъюгации столбнячного анатоксина (ТТ). E. coli serotype O25b long polysaccharide, lot no. 709766-30 (approximately 6.92 mg/ml, MW: approximately 39 kDa), 50 mg, lyophilized, used for tetanus toxoid (TT) conjugation.

Длинный полисахарид серотипа O1a E. coli, 710958-142-3 (примерно 6,3 мг/мл, ММ: примерно 44,3 кДа) (50 мг, 7,94 мл) лиофилизируют. E. coli serotype O1a long polysaccharide, 710958-142-3 (about 6.3 mg/ml, MW: about 44.3 kDa) (50 mg, 7.94 ml) was lyophilized.

Длинный полисахарид серотипа O6 E. coli, 710758-121-1 (примерно 16,8 мг/мл, ММ: примерно 44 кДа) (50 мг, 2,98 мл) лиофилизируют. E. coli serotype O6 long polysaccharide, 710758-121-1 (approximately 16.8 mg/ml, MW: approximately 44 kDa) (50 mg, 2.98 ml) was lyophilized.

Каждый из перечисленных выше лиофилизированных полисахаридов растворяют в воде для инъекций с получением примерно 5-10 мг/мл, добавляют 0,5 мл (100 мг раствора (1-циано-4-диметиламинопиридина тетрафторбората (CDAP) в 1 мл ацетонитрила) и перемешивают при КТ. Добавляют 0,2 М триэтиламина (TEA) (2 мл) и перемешивают при КТ.Each of the above lyophilized polysaccharides is dissolved in water for injection to give approximately 5-10 mg/ml, add 0.5 ml (100 mg solution of (1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (CDAP) in 1 ml acetonitrile) and stir at RT. Add 0.2 M triethylamine (TEA) (2 ml) and stir at RT.

Приготовление столбнячного анатоксина (ТТ): ТТ (100 мг, 47 мл) концентрируют приблизительно до 20 мл и дважды промывают солевым раствором (2х50 мл) с использованием фильтровальных пробирок. После этого его разводят HEPES и солевым раствором, чтобы получить конечную концентрацию HEPES примерно 0,25 М.Preparation of tetanus toxoid (TT): TT (100 mg, 47 ml) is concentrated to approximately 20 ml and washed twice with saline (2 x 50 ml) using filter tubes. It is then diluted with HEPES and saline to give a final HEPES concentration of approximately 0.25 M.

ТТ готовят, как описано выше, и pH реакционной смеси доводят примерно до 9,1-9,2. Реакционную смесь перемешивают при КТ.TT is prepared as described above and the pH of the reaction mixture is adjusted to approximately 9.1-9.2. The reaction mixture is stirred at RT.

Через 20-24 часа реакцию гасят глицином (0,5 мл). После этого ее концентрируют с использованием мембран из регенерированной целлюлозы MWCO и проводят диафильтрацию против солевого раствора. Фильтруют и анализируют. См. таблицу 26.After 20-24 hours, the reaction is quenched with glycine (0.5 ml). It is then concentrated using MWCO regenerated cellulose membranes and diafiltrated against brine. Filter and analyze. See Table 26.

Таблица 26Table 26 Типовые варианты осуществления:Typical embodiments: Конъюгат серотипа O25bSerotype O25b conjugate E. coli - E. coli - ТТTT серотип O6serotype O6 E. coli E. coli - TT - TT Объем: 41 мл
Конц. сахарида (Anthrone): 1,122 мг/мл (выход 92%).
Концентрация белка (Lowry): 1,133 мг/мл
SP отношение: 0,99
Свободный сахарид (DOC): 74,7%
Полученный продукт концентрируют до 15 мл, используя мембраны из регенерированной целлюлозы MWCO, и проводят диафильтрацию против солевого раствора (диаобъемы 40X). Фильтруют через фильтр 0,22 мкм и анализируют.
Объем: 27 мл
Конц. сахарида (Anthrone): 1,041 мг/мл (выход 56%).
Концентрация белка (Lowry): 1,012 мг/мл
SP отношение: 1,03
Свободный сахарид (DOC): 60,6% (восстановление поли 100%) Volume: 41 ml
Conc. saccharide (Anthrone) : 1.122 mg/ml (92% yield).
Protein concentration (Lowry) : 1.133 mg/ml
SP ratio : 0.99
Free saccharide (DOC) : 74.7%
The resulting product is concentrated to 15 ml using MWCO regenerated cellulose membranes and diafiltrated against saline (40X dia). Filter through a 0.22 µm filter and analyze.
Volume: 27 ml
Conc. saccharide (Anthrone) : 1.041 mg/ml (yield 56%).
Protein concentration (Lowry) : 1.012 mg/ml
SP ratio : 1.03
Free saccharide (DOC) : 60.6% (100% poly recovery) Объем: 42 мл
Конц. сахарида (Anthrone): 0,790 мг/мл (выход 66%).
Концентрация белка (Lowry): 1,895 мг/мл
SP отношение: 0,42
Свободный сахарид (DOC): <5%
ММ (кДа): 1192
Эндотоксин (ЕОП/мкг): 0,022 Volume: 42 ml
Conc. saccharide (Anthrone) : 0.790 mg/ml (yield 66%).
Protein concentration (Lowry) : 1.895 mg/ml
SP ratio : 0.42
Free saccharide (DOC) : <5%
MM (kDa) : 1192
Endotoxin (EOP/µg ): 0.022

ПРИМЕР 30: Дополнительные результаты ферментации, очистки и конъюгации О-антигенаEXAMPLE 30: Additional results of fermentation, purification and O-antigen conjugation

Типовые процессы, описанные ниже, обычно применимы ко всем серотипам E. coli. Получение каждого полисахарида включает периодическую ферментацию с последующей химической инактивацией перед последующей очисткой.The typical processes described below generally apply to all serotypes of E. coli. The production of each polysaccharide involves batch fermentation followed by chemical inactivation before subsequent purification.

Штаммы и хранение. Штаммы, используемые для биосинтеза короткоцепочечного О-антигена, представляют собой клинические штаммы E. coli дикого типа. Длинноцепочечный О-антиген получают с производными короткоцепочечных продуцентов, которые сконструированы методом Ваннера-Даценко с делецией нативного гена wzzb и комплементированы «длинноцепочечной» удлиняющей функцией fepE из Salmonella. Функция fepE экспрессируется из его нативного промотора либо на высококопийном векторе «topo» на основе colE1, либо на низкокопийном производном вектора pET30a на основе colE1, из которого была удалена промоторная область Т7. Strains and storage. The strains used for short-chain O-antigen biosynthesis are clinical wild-type E. coli strains. The long-chain O-antigen is obtained with derivatives of short-chain producers, which are constructed by the Wanner-Datsenko method with deletion of the native wzzb gene and complemented with the “long-chain” extension function fepE from Salmonella. fepE is expressed from its native promoter on either a high-copy colE1-based “topo” vector or a low-copy derivative of the colE1-based pET30a vector from which the T7 promoter region has been deleted.

Банки клеток получают путем выращивания клеток либо в среде LB без животных компонентов, либо в минимальной среде до OD₆₀₀, по меньшей мере, 3,0. Затем бульон разводят свежей средой и смешивают с 80% глицерином для получения конечной концентрации глицерина 20% с 2,0 OD₆₀₀/мл.Cell banks are prepared by growing cells either in LB medium without animal components or in minimal medium to an OD ₆₀₀ of at least 3.0. The broth is then diluted with fresh medium and mixed with 80% glycerol to obtain a final glycerol concentration of 20% with 2.0 OD ₆₀₀ /ml.

Среда, используемая для культивирования посева и ферментации. Используемая среда для посева и ферментации имеет следующий состав: KH₂PO₄, K₂HPO₄, (NH₄)₂SO₄, цитрат натрия, Na₂SO₄, аспарагиновая кислота, глюкоза, MgSO₄, FeSO₄-7H₂O, Na₂MoO₄-2H₂O, H₃BO₃, CoCl₂-6H₂O, CuCl₂-2H₂O, MnCl₂-4H₂O, ZnCl₂ и CaCl₂-2H₂O. Medium used for seed culture and fermentation. The inoculation and fermentation medium used has the following composition: KH ₂ PO ₄ , K ₂ HPO ₄ , (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , sodium citrate, Na ₂ SO ₄ , aspartic acid, glucose, MgSO ₄ , FeSO ₄ -7H ₂ O , Na ₂ MoO ₄ -2H ₂ O, H ₃ BO ₃ , CoCl ₂ -6H ₂ O, CuCl ₂ -2H ₂ O, MnCl ₂ -4H ₂ O, ZnCl ₂ and CaCl ₂ -2H ₂ O.

Условия посева и ферментации. Затравку инокулируют при 0,1% из одной пробирки с затравкой. Колбу с затравкой инкубируют при 37℃ в течение 16-18 часов и обычно получают 10-20 OD₆₀₀/мл. Sowing and fermentation conditions. The primer is inoculated at 0.1% from one primer tube. The seeded flask is incubated at 37℃ for 16-18 hours and usually 10-20 OD ₆₀₀ /ml is obtained.

Ферментацию проводят в 10-литровом ферментере из нержавеющей стали с паром на месте.Fermentation is carried out in a 10-liter stainless steel fermenter with on-site steam.

Инокуляцию ферментера обычно проводят в соотношении 1:1000 из 10 OD₆₀₀ затравки. Порционная фаза, представляющая собой период, в течение которого происходит рост на 10 г/л порционной глюкозе, обычно длится 8 часов. После истощения глюкозы, происходит внезапное повышение содержания растворенного кислорода, и в этот момент глюкоза питается до ферментации. Затем ферментация обычно продолжается в течение 16-18 часов с выходом >120 OD₆₀₀/мл.The fermenter is usually inoculated at a ratio of 1:1000 of 10 OD ₆₀₀ seed. The batch phase, which is the period during which growth occurs on 10 g/L batch glucose, typically lasts 8 hours. Once glucose is depleted, there is a sudden increase in dissolved oxygen, at which point glucose is fed to fermentation. Fermentation then typically continues for 16-18 hours with a yield of >120 OD ₆₀₀ /ml.

Первоначальная оценка продуцирования О-антигена с короткой/длинной цепью для серотипов O1a, O2, O6 и O25b. Штаммы дикого типа для O1a, O2, O6 и O25b ферментируют в дополненной минимальной среде в периодическом режиме до OD₆₀₀=15-20. При истощении глюкозы, приводящем к резкому снижению потребления кислорода, в течение 16-18 часов вводили ограничивающую рост подкормку глюкозой из раствора глюкозы. Достигают плотности клеток 124-145 OD₆₀₀единиц/мл. pH бульона для сбора затем доводят до примерно 3,8 и нагревают до 95°С в течение 2 часов. Затем гидролизованный бульон охлаждают до 25°С, доводят до pH 6,0 и центрифугируют для удаления твердых веществ. Полученный супернатант затем наносят на колонку эксклюзионной ВЭЖХ для количественного определения О-антигена. Получают продуктивность в диапазоне 2240-4180 мг/л. Обнаруживают, что молекулярная масса очищенного короткоцепочечного О-антигена из этих партий находится в диапазоне 10-15 кДа. Также отмечают, что эксклюзионная хроматография гидролизатов O2 и O6 выявила отчетливый и отделимый загрязняющий полисахарид, который не был очевиден в гидролизатах O1a и O25b. Initial assessment of short/long chain O-antigen production for serotypes O1a, O2, O6 and O25b. Wild type strains for O1a, O2, O6 and O25b are fermented in supplemented minimal medium in batch mode to OD ₆₀₀ = 15-20. When glucose depletion resulted in a sharp decrease in oxygen consumption, a growth-limiting feeding of glucose from a glucose solution was introduced for 16-18 hours. Reach cell density 124-145 OD ₆₀₀ units/ml. The pH of the collection broth is then adjusted to approximately 3.8 and heated to 95°C for 2 hours. The hydrolyzed broth is then cooled to 25°C, adjusted to pH 6.0 and centrifuged to remove solids. The resulting supernatant is then applied to a size exclusion HPLC column for O-antigen quantification. Productivity in the range of 2240-4180 mg/l is obtained. The molecular weight of the purified short chain O antigen from these batches was found to be in the range of 10-15 kDa. It is also noted that size exclusion chromatography of hydrolysates O2 and O6 revealed a distinct and separable contaminant polysaccharide that was not evident in hydrolysates O1a and O25b.

Длинноцепочечные версии O-антигенов O1a, O2, O6 и O25b получают путем ферментации версии с делецией wzzb каждого штамма, несущего гетерологичный, комплементарный ген fepE на высококопийной, селективной к канамицину topo плазмиде. Ферментацию проводят так же, как и для короткоцепочечных, хотя и с селекцией канамицина. Конечная плотность клеток, наблюдаемая при 124-177 OD₆₀₀/мл, связана с продуктивностью О-антигена 3500-9850 мг/л. Основанный на комплементации синтез длинноцепочечного О-антигена является, по меньшей мере, таким же продуктивным, как и у родительского штамма с короткой цепью, и в некоторых случаях, даже более продуктивным. Молекулярная масса очищенного полисахарида О-антигена составляет 33-49 кДа или примерно в 3 раза превышает размер соответствующей короткой цепи.Long-chain versions of the O antigens O1a, O2, O6, and O25b are produced by fermenting a wzzb deletion version of each strain carrying a heterologous, complementary fepE gene on a high-copy, kanamycin-selective topo plasmid. Fermentation is carried out in the same way as for short-chain, although with kanamycin selection. The final cell density observed at 124-177 OD ₆₀₀ /ml is associated with O-antigen productivity of 3500-9850 mg/l. Complementation-based synthesis of the long-chain O-antigen is at least as productive as that of the short-chain parental strain, and in some cases, even more productive. The molecular weight of the purified O-antigen polysaccharide is 33-49 kDa, or approximately 3 times the size of the corresponding short chain.

Отмечено, что гидролизаты с длинной цепью для О2 и О6 демонстрируют признаки загрязняющего полисахаридного пика, который в случае длинноцепочечного антигена наблюдается как плечо на основном пике О-антигена; O1 и O25b не показывают признаков продуцирования загрязняющего полисахарида, как это было замечено ранее с короткоцепочечным родительским белком.It is noted that the long chain hydrolysates for O2 and O6 show evidence of a contaminating polysaccharide peak, which in the case of the long chain antigen is observed as a shoulder on the main peak of the O antigen; O1 and O25b show no evidence of producing a contaminating polysaccharide, as previously seen with the short-chain parent protein.

Обнаружено, что подавление скорости роста связано с наличием topo-репликона в отсутствие fepE. Кроме того, мутация Δwzzb сама по себе не оказывает неблагоприятного воздействия на скорость роста, что указывает на то, что нарушенная скорость роста передается плазмидным вектором.It was found that the suppression of growth rate is associated with the presence of topo replicon in the absence of fepE. In addition, the Δ wzzb mutation itself does not adversely affect growth rate, indicating that the impaired growth rate is transmitted by the plasmid vector.

Оценка штаммов на продуцирование О-антигенов О11, О13, О16, О21 и О75. Несколько штаммов дикого типа серотипов O11, O13, O16, O21 и O75 оценивают на их склонность к продуцированию нежелательных полисахаридов при ферментации с помощью эксклюзионной ВЭЖХ. Штаммы для О11, О13, О16, О21 и О75 отобраны по отсутствию загрязняющего полисахарида, а также по их способности продуцировать >1000 мг/л О-антигена и по проявлению профиля чувствительности к антибиотикам, что позволяет рекомбинацию Ваннера-Даценко для введения признака Δwzzb. Evaluation of strains for the production of O-antigens O11, O13, O16, O21 and O75. Several wild-type strains of serotypes O11, O13, O16, O21, and O75 were evaluated for their propensity to produce undesirable polysaccharides when fermented by size-exclusion HPLC. Strains for O11, O13, O16, O21 and O75 were selected for the absence of a contaminating polysaccharide, as well as for their ability to produce >1000 mg/l O-antigen and for exhibiting an antibiotic sensitivity profile that allows Wanner-Datsenko recombination to introduce the Δ wzzb trait .

Конструируют селектируемые по хлорамфениколу версии topo-fepE и pET-fepE, что позволяет ввести fepE в штаммы O11, O13, O16, O21 и O75 Δwzzb, которые в целом являются резистентными к канамицину. Полученные штаммы, несущие topo-fepE и pET-fepE, ферментируют с селекцией по хлорамфениколу, и надосадочную жидкость из кислотно-гидролизованного бульона оценивают с помощью эксклюзионной ВЭЖХ. Конструкции как с высоко- (topo), так и с низкокопийным (pET) fepE направляют синтез О-антигена с продуктивностью для каждой из них, которая эквивалентна родительскому дикому типу. Экспрессии потенциально мешающих полисахаридов не наблюдается.Chloramphenicol-selectable versions of topo- fepE and pET- fepE were constructed, allowing fepE to be introduced into O11, O13, O16, O21 and O75 Δwzzb strains, which are generally resistant to kanamycin. The resulting strains carrying topo- fepE and pET- fepE were fermented with chloramphenicol selection, and the supernatant from the acid hydrolyzed broth was assessed by size exclusion HPLC. Both high- (topo) and low-copy (pET) fepE constructs direct O-antigen synthesis with productivity for each that is equivalent to the wild-type parent. No expression of potentially interfering polysaccharides was observed.

Оценка скоростей роста штаммов, несущих плазмиду wzzb, показывает, что O11, O13 и O21 замедляются в присутствии topo-fepE, но не pET-fepE; штаммы O16 и O75 показывают приемлемую скорость роста независимо от выбора репликона.An assessment of the growth rates of strains carrying the wzzb plasmid shows that O11, O13, and O21 are retarded in the presence of topo-fepE, but not pET-fepE; strains O16 and O75 show acceptable growth rates regardless of replicon choice.

Таблица 27Table 27 Тип О-антигенаO-antigen type Тип IHMAType IHMA Корот кая (SC) или длин ная цепь (LC)Short (SC) or long chain (LC) Тип плазмиды fep EPlasmid type fep E Мар керMarker Конечная плотность клеток ODFinal cell density OD ₆₀₀₆₀₀ Конечная производитель ность OAG (мг/л)Final OAG productivity (mg/l) ММ - кДаMM - kDa При месь SECSEC admixture O1aO1a wtwt SCS.C. НетNo НетNo 125125 25502550 11eleven NN O1aO1a Δwzzb/fepEΔwzzb/fepE LCL.C. topotopo KanaKana 130130 55305530 3333 NN O1aO1a Δwzzb/fepEΔwzzb/fepE LCL.C. pETpET KanaKana Не выполнено (НВ)Not completed (NV) НВNV НВNV НВNV O2O2 wtwt SCS.C. НетNo НетNo 127127 22402240 1313 YY O2O2 Δwzzb/fepEΔwzzb/fepE LCL.C. topotopo KanaKana 177177 37503750 4949 YY O2O2 xx LCL.C. pETpET xx НДND НДND НДND НДND O6O6 wtwt SCS.C. НетNo НетNo 145145 41804180 1616 YY O6O6 Δwzzb/fepEΔwzzb/fepE LCL.C. topotopo KanaKana 124124 98509850 4444 YY O6O6 Δwzzb/fepEΔwzzb/fepE LCL.C. pETpET KanaKana НВNV НВNV НВNV НВNV O11O11 wtwt SCS.C. НетNo НетNo 194194 47204720 xx NN O11O11 Δwzzb/fepEΔwzzb/fepE LCL.C. topotopo KanaKana 142142 72207220 xx NN O11O11 xx LCL.C. pETpET xx НДND НДND НДND НДND O13O13 wtwt SCS.C. НетNo xx 113113 47704770 xx NN O13O13 Δwzzb/fepEΔwzzb/fepE LCL.C. topotopo camcam 101101 46804680 xx NN O13O13 Δwzzb/fepEΔwzzb/fepE LCL.C. pETpET camcam 108108 46004600 xx NN O16O16 wtwt SCS.C. НетNo xx 154154 18701870 xx NN O16O16 Δwzzb/fepEΔwzzb/fepE LCL.C. topotopo camcam 129129 11801180 xx NN O16O16 Δwzzb/fepEΔwzzb/fepE LCL.C. pETpET camcam 137137 12801280 xx NN O21O21 wtwt SCS.C. НетNo xx 140140 11801180 xx NN O21O21 Δwzzb/fepEΔwzzb/fepE LCL.C. topotopo camcam НВNV НВNV xx NN O21O21 Δwzzb/fepEΔwzzb/fepE LCL.C. pETpET camcam 131131 820820 xx NN O25bO25b 28312831 SCS.C. НетNo НетNo 126126 35503550 1010 NN O25bO25b Δwzzb/fepEΔwzzb/fepE LCL.C. topotopo KanaKana 152152 35003500 4949 NN O25bO25b xx LCL.C. pETpET xx НДND НДND НДND НДND O75O75 wtwt SCS.C. НетNo xx 149149 16901690 xx NN O75O75 Δwzzb/fepEΔwzzb/fepE LCL.C. topotopo camcam 132132 15001500 xx NN O75O75 Δwzzb/fepEΔwzzb/fepE LCL.C. pETpET camcam 138138 15201520 xx NN

Процесс очистки полисахаридов включает кислотный гидролиз для высвобождения О-антигенов. Неочищенную суспензию серотипспецифичной культуры E. coli в ферментационном реакторе непосредственно обрабатывают уксусной кислотой до конечного рН 3,5 ± 0,5 и нагревают подкисленный бульон до температуры 95 ± 5°С в течение, по меньшей мере, одного часа. Эта обработка расщепляет лабильную связь между KDO на проксимальном конце олигосахарида и липида А, таким образом высвобождая цепь O-Ag. Подкисленный бульон, содержащий высвободившийся O-Ag, охлаждают до 20 ± 10℃ перед нейтрализацией до pH 7 ± 1,0 с использованием NH₄OH. Процесс дополнительно включает несколько стадий центрифугирования, фильтрации и концентрирования/диафильтрации.The polysaccharide purification process involves acid hydrolysis to release O-antigens. The crude suspension of the serotype-specific culture of E. coli in the fermentation reactor is directly treated with acetic acid to a final pH of 3.5 ± 0.5 and the acidified broth is heated to a temperature of 95 ± 5°C for at least one hour. This treatment cleaves the labile bond between KDO at the proximal end of the oligosaccharide and lipid A, thereby releasing the O-Ag chain. The acidified broth containing the liberated O-Ag is cooled to 20 ± 10℃ before being neutralized to pH 7 ± 1.0 using NH ₄ OH. The process further includes several steps of centrifugation, filtration and concentration/diafiltration.

Таблица 28Table 28 СеротипSerotype
(основ ной)(basic) Описа ниеDescription Ожида емый размер ПолиExpected Poly Size Титр (г/л)Titer (g/l) ММ очищенного поли (кДа)MM of purified poly (kDa) Количество повторяю щихся единицNumber of repeating units Увеличение ММ (кДа) в течение короткогоIncrease in MW (kDa) over a short period of time ЯМРNMR ММ очищенного конъюгата (кДа)MW of purified conjugate (kDa) Конъюгат № партииConjugate Lot No. O25b (R1)O25b (R1) ΔwzzB+LT2FepEΔwzzB+LT2FepE Длин ныйLong 5,35.3 4747 5555 3434 53655365 132242-28 (RAC/ДМСО)132242-28 (RAC/DMSO) 14231423 132242-98 (Односторон ний)132242-98 (Single-sided) 12581258 132240-73-1-1 (еТЕС)132240-73-1-1 (eTES) ΔwzzB +
O25a wzzBΔwzzB +
O25a wzzB Корот кийShort 2,32.3 13/1413/14 1515 НДND 380380 132242-116 (Односторон ний)132242-116 (Single-sided) 91149114 132242-121 (RAC/ДМСО)132242-121 (RAC/DMSO) О25б (К12)O25b (K12) ΔwzzB+LT2FepEΔwzzB+LT2FepE Длин ныйLong 3,53.5 4444 5151 2727 15371537 709749-015-2 (еТЕС)709749-015-2 (eTES) 47754775 709744-0016 (RAC/ДМСО709744-0016 (RAC/DMSO wtwt Корот кийShort 3,53.5 1717 1717 НДND О1а (R1)O1a (R1) ΔwzzB+LT2FepEΔwzzB+LT2FepE Длин ныйLong 5,55.5 3333 3939 10351035 132240-112-2 (еТЕС)132240-112-2 (eTES) 2222 331331 132242-106 (Односторонний)132242-106 (Single-sided) 12841284 132242-124
(RAC/ДМСО)132242-124
(RAC/DMSO) wtwt Корот кийShort 2,52.5 11eleven 1313 НДND 280280 132242-127 (Односторон ний)132242-127 (Single sided) 22662266 132242-130 (RAC/ДМСО)132242-130 (RAC/DMSO) О2 (Р1)O2 (P1) ΔwzzB+LT2FepEΔwzzB+LT2FepE Длин ныйLong 4,94.9 3636 4343 2222 11611161 00707947-0003-1 (еТЕС)00707947-0003-1 (eTES) 3939 4747 2525 422422 132242-161 (односторон ний)132242-161 (one-sided) 30823082 132242-152 (RAC/ДМСО)132242-152 (RAC/DMSO) wtwt Корот кийShort 2,82.8 1414 1717 НДND 234234 132242-159 (односторон ний)132242-159 (one-sided) 11201120 1322421-157 (RAC/ДМСО)1322421-157 (RAC/DMSO) О2 (Р4)O2 (P4) ΔwzzB+LT2FepEΔwzzB+LT2FepE Длин ныйLong 5,15.1 НДND НДND НДND НДND wtwt Корот кийShort 2,12.1 14,714.7 1818 НДND О6 (R1)O6 (R1) ΔwzzB+LT2FepEΔwzzB+LT2FepE Длин ныйLong 6,96.9 37,237.2 4242 22,222.2 wtwt Корот кийShort 3,53.5 1515 1717 НДND 256256 132242-146 (Односторон ний)132242-146 (Single-sided) 20582058 123342-145 (RAC/ДМСО)123342-145 (RAC/DMSO) О6 (R1)O6 (R1) ΔwzzB+LT2FepEΔwzzB+LT2FepE Длин ныйLong 8,48.4 44,444.4 5050 28,228.2 10501050 132240-117-1 (еТЕС)132240-117-1 (eTES) 340340 132242-134 (Односторон ний)
132242-137132242-134 (Single-sided)
132242-137 19101910 (RAC/ДМСО)(RAC/DMSO) wtwt Корот кийShort 3,63.6 16.216.2 1818 НДND

Пример 31: Исследованная конъюгация с О-антигеном (О4, О11, О21, О75) (RAC/ДМСО)Example 31: Conjugation to O-antigen (O4, O11, O21, O75) tested (RAC/DMSO)

Таблица 29Table 29 Конъюгаты О4O4 conjugates Конъюгат № партииConjugate Lot No. 709744-70709744-70 709744-73709744-73 709744-72709744-72 Поли № партииPoly lot no. 709740-168709740-168 Поли ММ (кДа)Poly MM (kDa) 5252 DODO 2626 1919 1515 Акт. поли Мм (кДа)Act. poly Mm (kDa) 5151 КонъюгацияConjugation Вход SPSP input 1,01.0 1,01.0 1,01.0 SP отношениеSP ratio 0,850.85 1,01.0 1,01.0 Свободный сахарид (%)Free saccharide (%) <5%<5% <5%<5% <5%<5% ММ (кДа)MM (kDa) 47644764 47584758 34233423 Выход (%)Exit (%) 7272 8080 8282 Эндотоксин (ЕОП/мкг)Endotoxin (EOP/µg) 0,0030.003 0,0010.001 0,0050.005

Таблица 30Table 30 Конъюгаты О11O11 conjugates Конъюгат № партииConjugate Lot No. 709744-64709744-64 709744-66709744-66 709744-65709744-65 709744-67709744-67 Поли № партииPoly lot no. 709740-162709740-162 Поли ММ (кДа)Poly MM (kDa) 3939 DODO 2121 1414 Акт. поли Мм (кДа)Act. poly Mm (kDa) 4040 КонъюгатConjugate Вход SPSP input 1,01.0 1,31.3 1,01.0 1,31.3 SP отношениеSP ratio 0,50.5 0,640.64 0,650.65 0,750.75 Свободный сахарид (%)Free saccharide (%) <5%<5% <5%<5% <5%<5% <5%<5% ММ (кДа)MM (kDa) 1052010520 75807580 48144814 43384338 Выход (%)Exit (%) 30thirty 30thirty 4444 3838 Эндотоксин (ЕОП/мкг)Endotoxin (EOP/µg) 0,0050.005 0,0050.005 0,0050.005 0,0050.005

Таблица 31Table 31 Конъюгаты О21O21 conjugates Конъюгат № партииConjugate Lot No. 709749-113709749-113 709749-111709749-111 709749-112709749-112 709749-115709749-115 709749-116709749-116 Поли № партииPoly lot no. 709740-165709740-165 Поли ММ (кДа)Poly MM (kDa) 4040 DODO 2525 1818 1515 Акт. поли Мм (КДа)Act. poly Mm (KDa) 4040 4141 4040 КонъюгатConjugate Вход SPSP input 1,01.0 1,01.0 0,80.8 1,01.0 1,251.25 SP отношениеSP ratio 0,60.6 0,60.6 0,50.5 0,90.9 1,11.1 Свободный сахарид (%)Free saccharide (%) 6%6% 5%5% <5%<5% 12%12% 7%7% ММ (кДа)MM (kDa) 69206920 59615961 97299729 24032403 19601960 Выход (%)Exit (%) 3131 3636 3737 5252 5454 Эндотоксин (ЕОП/мкг)Endotoxin (EOP/µg) 0,020.02 0,020.02 0,030.03 0,010.01 0,0090.009

Таблица 32Table 32 Конъюгаты O75O75 conjugates Конъюгат № партииConjugate Lot No. 709749-101709749-101 709749-102709749-102 709749-103709749-103 Поли № партииPoly lot no. 709766-080В709766-080В Поли ММ (кДа)Poly MM (kDa) 4848 DODO 1818 2525 Акт. поли Мм (кДа)Act. poly Mm (kDa) 4343 4444 КонъюгатConjugate Вход SPSP input 1,01.0 0,80.8 1,01.0 SP отношениеSP ratio 0,940.94 0,760.76 0,780.78 Свободный сахарид (%)Free saccharide (%) <5%<5% 6%6% 6%6% ММ (кДа)MM (kDa) 23042304 24272427 52295229 Выход (%)Exit (%) 6262 6565 4545 Эндотоксин (ЕОП/мкг)Endotoxin (EOP/µg) 0,020.02 0,010.01 0,010.01

Пример 32: Получение конъюгатов PLLExample 32: Preparation of PLL Conjugates

Таблица 33Table 33 СеротипSerotype О11O11 О75O75 О21O21 О4O4 Конъюгат № партииConjugate Lot No. 00707779-041300707779-0413 00707779-041400707779-0414 00707779-041500707779-0415 00707779-041600707779-0416 Поли № партииPoly lot no. 709740-162709740-162 709766-080В709766-080В 709740-165709740-165 709740-168709740-168 Поли ММ (кДа)Poly MM (kDa) 3939 4848 4040 5252 Данные конъюгатаConjugate data SP отношениеSP ratio 13,513.5 16,816.8 18,118.1 21,221.2 Свободный сахарид (%)Free saccharide (%) 9,8%9.8% <5%<5% <5%<5% 6,9%6.9% Конц. сахаридаConc. saccharide 789 мкг/мл789 µg/ml 676 мкг/мл676 µg/ml 978 мкг/мл978 µg/ml 837 мкг/мл837 µg/ml Конц. PLLConc. PLL 58,3 мкг/мл58.3 µg/ml 40,3 мкг/мл40.3 µg/ml 54,0 мкг/мл54.0 µg/ml 39,4 мкг/мл39.4 µg/ml Эндотоксин (ЕОП/мкг)Endotoxin (EOP/µg) 0,0020.002 0,0020.002 0,0050.005 0,0040.004 Матрица конъюгата (DS)Conjugate matrix (DS) 1X PBS, 1M NaCl1X PBS, 1M NaCl

Пример 33: Стабильная экспрессия полипептидов E. coli в клетках млекопитающихExample 33: Stable expression of E. coli polypeptides in mammalian cells

Стабильные клоны CHO, экспрессирующие FimH GSD или FimH LD, создают с использованием системы стабильной экспрессии SSI (сайт-специфической интеграции).Stable CHO clones expressing FimH GSD or FimH LD are generated using the SSI (site-specific integration) stable expression system.

Клетка-хозяин CHO представляет собой сконструированную клеточную линию из фона CHOK1SV GS-KO (см., например, патентную заявку США 20200002727 для описания линии клеток-хозяев CHOK1SV GS-KO). Коротко, посадочную площадку с геном зеленого флуоресцентного белка (GFP), окруженную двумя сайтами FRT, таргетируют в «горячую точку» транскрипции в геноме клетки-хозяина. Ген GFP можно заменить геном GS и представляющим интерес геном, которые также окружены сайтами FRT из вектора LVEC, коэкспрессируемого с рекомбиназой флиппазы (FLPe). Эта система не только имеет профили роста и продуктивности, которые выгодно отличаются от случайной интеграции, но также демонстрирует генотипическую и фенотипическую стабильность, по меньшей мере, в 100 поколениях.The CHO host cell is an engineered cell line from the CHOK1SV GS-KO background (see, for example, US Patent Application 20200002727 for a description of the CHOK1SV GS-KO host cell line). Briefly, a green fluorescent protein (GFP) gene landing pad flanked by two FRT sites is targeted to a transcriptional hotspot in the host cell genome. The GFP gene can be replaced by a GS gene and a gene of interest, which are also flanked by FRT sites from an LVEC vector coexpressed with flippase recombinase (FLPe). This system not only has growth and performance profiles that compare favorably with random integration, but also exhibits genotypic and phenotypic stability over at least 100 generations.

Как упоминается в настоящем документе, термин «сайт FRT» относится к нуклеотидной последовательности, при которой продукт гена флиппазы (FLP) 2 мкм плазмиды дрожжей, рекомбиназа FLP, может катализировать сайт-специфическую рекомбинацию. В данной области техники известно множество неидентичных сайтов FRT. Последовательности различных сайтов FRT сходны тем, что все они содержат идентичные инвертированные повторы из 13 пар оснований, фланкирующие асимметричную коровую область из 8 пар оснований, в которой происходит рекомбинация. Именно асимметричная коровая область отвечает за направленность сайта и за различия между различными сайтами FRT. Их иллюстративные (не ограничивающие) примеры включают встречающийся в природе FRT (F) и несколько мутантных или вариантных сайтов FRT, таких как FRT F1 и FRT F2.As referred to herein, the term “FRT site” refers to the nucleotide sequence at which the flippase (FLP) gene product of the yeast 2 μm plasmid, FLP recombinase, can catalyze site-specific recombination. Many non-identical FRT sites are known in the art. The sequences of the different FRT sites are similar in that they all contain identical 13-bp inverted repeats flanking the asymmetric 8-bp core region where recombination occurs. It is the asymmetric core region that is responsible for site directionality and for the differences between different FRT sites. Illustrative (non-limiting) examples include the naturally occurring FRT (F) and several mutant or variant FRT sites, such as FRT F1 and FRT F2.

Как упоминается в настоящем документе, термин «посадочная площадка» относится к последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей первый сайт-мишень рекомбинации, хромосомно интегрированный в клетку-хозяин. В некоторых вариантах осуществления, сайт посадки содержит два или несколько сайтов-мишеней рекомбинации, хромосомно интегрированных в клетку-хозяин. В некоторых вариантах осуществления, клетка содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 посадочных площадок. В некоторых вариантах осуществления, клетка содержит 1, 2 или 3 посадочные площадки. В некоторых вариантах осуществления, клетка содержит 4 посадочные площадки. В некоторых вариантах осуществления, посадочные площадки интегрированы в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 различных хромосомных локусов. В некоторых вариантах осуществления, посадочные площадки интегрированы в 1, 2 или 3 различных хромосомных локуса. В некоторых вариантах осуществления, посадочные площадки встроены в 4 различных хромосомных локуса.As referred to herein, the term “landing site” refers to a nucleic acid sequence containing a first recombination target site chromosomally integrated into a host cell. In some embodiments, the landing site comprises two or more recombination target sites chromosomally integrated into the host cell. In some embodiments, the cage contains 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8 landing pads. In some embodiments, the cage contains 1, 2, or 3 landing pads. In some embodiments, the cage contains 4 landing pads. In some embodiments, the landing sites are integrated into 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8 different chromosomal loci. In some embodiments, the landing sites are integrated into 1, 2, or 3 different chromosomal loci. In some embodiments, the landing sites are integrated into 4 different chromosomal loci.

Вектор экспрессии LVEC для FimH GSD или FimH LD и вектор экспрессии FLPe совместно трансфицируют в клетку-хозяин SSI путем электропорации либо с помощью BioRad Gene Pulser Xcell, либо с помощью Amaxa 4D-Nucleofector. Затем клетки культивируют в среде без глутамина, чтобы селектировать клетки, которые имеют ген GS, интегрированный в сайт посадочной площадки. Обычно клетки восстанавливаются через 2-3 недели. Затем проводят клонирование одиночных клеток в 96-луночных планшетах либо с помощью FACS, либо с помощью лимитирующих разведений. Титры из лунок с клетками ранжируют, чтобы сузить до 48 лучших клонов. Проводят второй раунд скрининга с подпиткой в 24 глубоколуночных планшетах, чтобы сузить количество клонов до 12 лучших. Третий раунд скрининга с подпиткой в Ambr15 проводят, чтобы сузить количество клонов до 3 лучших. Эксперименты с Ambr250 используют для идентификации лучшего клона. Основной банк клеток и рабочий банк клеток создают для лучшего клона после его идентификации.The LVEC expression vector for FimH GSD or FimH LD and the FLPe expression vector were co-transfected into an SSI host cell by electroporation with either a BioRad Gene Pulser Xcell or an Amaxa 4D-Nucleofector. The cells are then cultured in glutamine-free media to select for cells that have the GS gene integrated into the landing site. Cells usually recover within 2-3 weeks. Single-cell cloning is then performed in 96-well plates either by FACS or by limiting dilutions. The titers from the cell wells are ranked to narrow down to the top 48 clones. A second round of fed-batch screening was carried out in 24 deep well plates to narrow down the number of clones to the top 12. A third round of boosted screening in Ambr15 is performed to narrow down the number of clones to the top 3. Ambr250 experiments are used to identify the best clone. A master cell bank and a working cell bank are created for the best clone after its identification.

Пример 34: Разработка линии клеток и экспрессия в продуцирующем реакторе белков FimH-DSG WT и FimHExample 34: Cell Line Development and Production Reactor Expression of FimH-DSG WT and FimH Proteins _LDLD WT W.T.

Пример, описанный в настоящем документе, описывает типовое продуцирование обоих, FimH-DSG WT и FimH_LD WT из стабильных клеточных линий CHO, где кодирующие последовательности для каждого белка стабильно интгерированы в геном CHO.The example described herein describes the exemplary production of both FimH-DSG WT and FimH _LD WT from stable CHO cell lines where the coding sequences for each protein are stably integrated into the CHO genome.

В условиях продуцирующего биореактора, выбранные стабильные клеточные линии CHO способны продуцировать белок-мишень в количестве примерно 1 грамм на литр культуры для FimH-DSG WT и 250 миллиграммов на литр культуры для FimH_LD WT. Систему посевных ферментеров для продуцирующего реактора непрерывно увеличивают в масштабе после размораживания флаконов рабочего банка клеток и размножают во встряхиваемых колбах с использованием плотности жизнеспособных клеток для инокуляции 0,3×10⁶ клеток/мл в течение трех циклов пассажей во встряхиваемых колбах, чтобы обеспечить достаточное количество клеток для продуцирующего реактора. Клетки выращивают при 36,5°С, 5% СО₂ в течение трех-четырех дней.Under production bioreactor conditions, selected stable CHO cell lines are capable of producing target protein at levels of approximately 1 gram per liter of culture for FimH-DSG WT and 250 milligrams per liter of culture for FimH _LD WT. The production reactor seed fermenter system is continuously scaled up after thawing the working cell bank vials and propagated in shake flasks using a viable cell inoculation density of 0.3 x 10 ⁶ cells/mL over three shake flask passage cycles to ensure sufficient numbers cells for the production reactor. Cells are grown at 36.5°C, 5% CO ₂ for three to four days.

Продуцирующий реактор засевают из последней встряхиваемой колбы с целевой плотностью инокуляции клеток 1×10⁶ клеток/мл. Продуцирующий реактор выращивают при 36,5°C в течение семи дней, используя pH 7,05 (+/-0,15) и ориентируясь на насыщение CO₂ 5-10%. pH контролируют бикарбонатом натрия/калия для контроля основания, и барботажем CO₂ для контроля кислоты. Растворенный кислород контролируют на заданном уровне 40% с использованием чистого кислорода через барботаж. Температуру доводят до 31°С на седьмой день. Реактор подпитывают в первый день с использованием стратегии подпитки, при которой подпитку добавляют в соответствии с плотностью жизнеспособных клеток. Это достигается за счет использования коэффициента подпитки 0,75, чтобы гарантировать, что компоненты подпитки не закончатся во время цикла. Затем подпитку добавляют непрерывно, чтобы обеспечить желаемый объем подпитки в течение дня.The production reactor is seeded from the last shake flask at a target cell inoculation density of 1×10 ⁶ cells/ml. The production reactor is grown at 36.5°C for seven days using a pH of 7.05 (+/-0.15) and targeting a CO ₂ saturation of 5-10%. The pH is controlled with sodium/potassium bicarbonate to control base, and CO ₂ sparging to control acid. Dissolved oxygen is controlled at a target level of 40% using pure oxygen through sparging. The temperature is brought to 31°C on the seventh day. The reactor is fed on the first day using a feeding strategy in which feed is added according to the density of viable cells. This is achieved by using a recharge factor of 0.75 to ensure that recharge components do not run out during a cycle. Recharge is then added continuously to provide the desired amount of recharge throughout the day.

Продуцирующий реактор собирают на 13 день, собранную культуру центрифугируют и фильтруют через 0,22 мкм фильтр перед последующей обработкой.The production reactor is harvested on day 13, and the harvested culture is centrifuged and filtered through a 0.22 μm filter before further processing.

Пример 35. Антитела, индуцированные CRM197. Конъюгаты O-антигенов E.coli серотипов O8 и O9 проявляют перекрестную защитную бактерицидную активность против инвазивных изолятов серотипов O5 и O3 K.pneumoniaeExample 35 Antibodies induced by CRM197. O-antigen conjugates of E. coli serotypes O8 and O9 exhibit cross-protective bactericidal activity against invasive isolates of K. pneumoniae serotypes O5 and O3

Этот пример демонстрирует, что антитела, индуцированные короткими односторонними нативными CRM₁₉₇ полиманнановыми конъюгатами O-антигенов серотипов O8 и O9 E. coli, являются бактерицидными и перекрестно защищающими от штаммов O5 и O3 Klebsiella, которые экспрессируют эквивалентные или родственные O-антигены.This example demonstrates that antibodies raised by short one-way native CRM ₁₉₇ polymannan conjugates of E. coli serotypes O8 and O9 O-antigens are bactericidal and cross-protective against Klebsiella O5 and O3 strains that express equivalent or related O-antigens.

E. coli и K. pneumoniae имеют общие полиманнановые О-антигены, которые синтезируются ферментами, кодируемыми высоко гомологичными кластерами биосинтетических генов. Полисахариды O-антигена O8 и O9 E. coli представляют собой линейные гомополимеры маннозы, повторяющиеся единицы которых отличаются моносахаридными связями и количеством остатков. Их аналогами в K. pneumoniae являются О-антигены серотипов О5 и О3. Биосинтез полиманнановых О-антигенов E. coli и K. pneumoniae включает другой механизм транслокации О-единиц и синтеза цепи, чем у других О-антигенов E. coli. В этом случае, удлинение цепи регулируется биосинтетическим комплексом WbdA-WbdD (King JD, Berry S, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences 2014; 111:6407-12), который отличается от Wzx/Wzy-зависимого пути, где длина цепи контролируется ферментами WzzB или FepE. Как следствие, нативные полиманнановые О-антигены могут быть получены только в их короткой форме, что требует иных методов биопроцессов для очистки и конъюгации белков-носителей, чем для сконструированных длинных О-антигенов E. coli. Тот же механизм и ограничения относятся к преобладающим O-антигенам серотипов O1 и O2K. pneumoniae, которые представляют собой полигалактаны, состоящие из остатков галактозы. E. coli and K. pneumoniae share polymannan O-antigens, which are synthesized by enzymes encoded by highly homologous biosynthetic gene clusters. The O-antigen polysaccharides O8 and O9 of E. coli are linear homopolymers of mannose, the repeating units of which differ in monosaccharide linkages and number of residues. Their counterparts in K. pneumoniae are the O-antigens of serotypes O5 and O3. The biosynthesis of the polymannan O-antigens of E. coli and K. pneumoniae involves a different mechanism of O-unit translocation and chain synthesis than other E. coli O-antigens. In this case, chain elongation is regulated by the WbdA-WbdD biosynthetic complex (King JD, Berry S, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences 2014; 111:6407-12), which differs from the Wzx/Wzy-dependent pathway, where the length the chain is controlled by the enzymes WzzB or FepE. As a consequence, native polymannan O-antigens can only be produced in their short form, requiring different bioprocessing methods for purification and conjugation of carrier proteins than for engineered long E. coli O-antigens. The same mechanism and limitations apply to the predominant O-antigens of K. pneumoniae serotypes O1 and O2, which are polygalactans composed of galactose residues.

Структурная взаимосвязь между этими О-антигенами и их подтипами показана на ФИГ. 33. О-антигены O8 E.coli и O5 K.pneumoniae идентичны (Vinogradov E, et al. J Biol Chem 2002; 277:25070-81). O-антигены E. coli O9 и K. pneumoniae O3 имеют общие тетрамерные O9a/O3a и пентамерные O9/O3 подтипы повторяющихся единиц, в то время как тримерный подтип O3b обнаружен только у K. pneumoniae. Эти подтипы можно идентифицировать серологически и генотипически (Guachalla LM, et al. Scientific Reports 2017; 7:6635). Локусы серотипа O3a отличаются единственной точечной мутацией в wbdA (C80R). Аналогичная точечная мутация в ферменте E. coli O9 wbdA (C55R) превращает полисахарид O9 в O9a (Kido N, Kobayashi H. Journal of bacteriology 2000; 182:2567-73). Подтип O3b имеет достаточную дивергенцию нуклеотидов в последовательности фермента WbdD, что требует отдельной эталонной последовательности. Веб-алгоритм Kaptive (Wick RR, et al. J Clin Microbiol 2018; 56), реализованный в конвейере Pfizer BigSdb для полногеномного секвенирования (WGS), обозначает локусы O3 либо как O3/O3a (охватываемые одной и той же эталонной последовательностью), либо как O3b.The structural relationship between these O-antigens and their subtypes is shown in FIG. 33. O-antigens O8 of E. coli and O5 of K. pneumoniae are identical (Vinogradov E, et al. J Biol Chem 2002; 277:25070-81). The E. coli O9 and K. pneumoniae O3 O antigens share tetrameric O9a/O3a and pentameric O9/O3 repeat unit subtypes, while the trimeric O3b subtype is found only in K. pneumoniae. These subtypes can be identified serologically and genotypically (Guachalla LM, et al. Scientific Reports 2017;7:6635). Serotype O3a loci are distinguished by a single point mutation in wbdA (C80R). A similar point mutation in the E. coli O9 enzyme wbdA (C55R) converts the O9 polysaccharide to O9a (Kido N, Kobayashi H. Journal of bacteriology 2000; 182:2567-73). The O3b subtype has sufficient nucleotide divergence in the WbdD enzyme sequence to require a separate reference sequence. The Kaptive web algorithm (Wick RR, et al. J Clin Microbiol 2018;56), implemented in the Pfizer BigSdb whole genome sequencing (WGS) pipeline, designates O3 loci as either O3/O3a (covered by the same reference sequence) or like O3b.

Материалы и способыMaterials and methods

а. Получение иммунных сывороток E. coli серотипов O8 и O9 CRM₁₉₇ у кроликовA. Preparation of immune sera of E. coli serotypes O8 and O9 CRM ₁₉₇ in rabbits

Две группы по четыре самки кроликов New Zealand White в каждой используют для проведения исследования в Covance. Животные получают 10 мкг/животное конъюгата серотипа O8 или O9 CRM₁₉₇ на дозу с CFA/IFA в качестве адъюванта. Нативные О-антигены О8 и О9 конъюгируют с использованием односторонней химии. Каждую 1 мл дозу 10 мкг антигена делят на два участка подкожной вакцинации. Вакцинации проводят на 0, 6 и 14 неделях с забором крови на 7 и 15 неделях, что соответствует временным точкам после введения второй дозы (PD2) и после введения третьей дозы (PD3).Two groups of four female New Zealand White rabbits each are being used for the study at Covance. Animals receive 10 μg/animal of serotype O8 or O9 conjugate CRM ₁₉₇ per dose with CFA/IFA as an adjuvant. The native O antigens O8 and O9 are conjugated using one-way chemistry. Each 1 ml dose of 10 μg of antigen is divided into two subcutaneous vaccination sites. Vaccinations are administered at weeks 0, 6, and 14, with blood collections at weeks 7 and 15, corresponding to the post-second dose (PD2) and post-third dose (PD3) time points.

b. Бактериальные штаммыb. Bacterial strains

E. coli и K. pneumoniae получают из спонсируемой Pfizer коллекции Antimicrobial Testing Leadership and Surveillance (ATLAS), которая поддерживается клинической лабораторией International Health Management Associates (IHMA). Штаммы генотипически характеризуют полногеномным секвенированием (WGS) с использованием платформы Miseq (Illumina). Данные WGS используют для получения информации о многолокусных последовательностях (MLST) с использованием установленных схем E. coli и K. pneumoniae, интегрированных в платформу BigDdb (Wirth T, et al. Molecular microbiology 2006; 60:1136-51; Jolley KA, et al. Wellcome Open Res 2018; 3:124; Diancourt L, et al. Journal of clinical microbiology 2005; 43:4178-82). Встроенные in silico алгоритмы серотипирования E. coli и K. pneumoniae используют для прогнозирования серотипа О-антигена (Wick RR, et al. J Clin Microbiol 2018; 56; Joensen KG, et al. J Clin Microbiol 2015; 53:2410-26). E. coli and K. pneumoniae are obtained from the Pfizer-sponsored Antimicrobial Testing Leadership and Surveillance (ATLAS) collection, which is supported by the International Health Management Associates (IHMA) clinical laboratory. Strains were genotypically characterized by whole genome sequencing (WGS) using the Miseq platform (Illumina). WGS data is used to generate multilocus sequence information (MLST) using established E. coli and K. pneumoniae patterns integrated into the BigDdb platform (Wirth T, et al. Molecular microbiology 2006; 60:1136-51; Jolley KA, et al Wellcome Open Res 2018; 3:124; Diancourt L, et al. Journal of clinical microbiology 43:4178-82. Built-in in silico serotyping algorithms for E. coli and K. pneumoniae are used to predict O-antigen serotype (Wick RR, et al. J Clin Microbiol 2018;56; Joensen KG, et al. J Clin Microbiol 2015;53:2410-26) .

Таблица 34. Клинические изоляты, используемые для продуцирования О-антигена или разработки бактерицидных анализов Table 34. Clinical isolates used for O-antigen production or development of bactericidal assays IDID ВидView MLST STMLST ST Серотип (подтип)Serotype (subtype) ИсточникSource EC0130EC0130 E. coliE. coli 162162 О8O8 КровьBlood EC0423EC0423 E. coliE. coli 4646 О9аO9a КровьBlood EC0305EC0305 E. coliE. coli 448448 О8O8 КровьBlood KP0121KP0121 K. pneumoniaeK. pneumoniae 279279 О5O5 КровьBlood EC0611EC0611 E. coliE. coli НовыйNew О9аO9a UTI, почкиUTI, kidneys KP0009KP0009 K. pneumoniaeK. pneumoniae 3737 O3bO3b UTI, мочевой пузырьUTI, bladder

c. Конъюгаты E. coli O8 и O9 CRM₁₉₇ c. E. coli O8 and O9 conjugates CRM ₁₉₇

Полисахариды O-антигена серотипа O8 и O9a экстрагируют и очищают из штаммов EC0130 и EC0423, соответственно (таблица 34). Процесс конъюгации включает селективную активацию моносахарида Kdo, присутствующего на восстанавливающем конце коротких нативных O-антигенов O8 и O9 E. coli, с помощью дисульфид-аминового линкера. После демаскирования тиоловой функциональной группы, ее затем конъюгируют с активированным бромом белком CRM₁₉₇, как описано в примере 26, изложенном в настоящем документе.O-antigen polysaccharides of serotype O8 and O9a were extracted and purified from strains EC0130 and EC0423, respectively (Table 34). The conjugation process involves the selective activation of the Kdo monosaccharide present at the reducing end of the short native O-antigens O8 and O9 of E. coli by a disulfide-amine linker. Once the thiol functionality is unmasked, it is then conjugated to bromine activated protein CRM ₁₉₇ as described in Example 26 herein.

d. Бактерицидные анализыd. Bactericidal tests

Предварительно замороженные исходные растворы E. coli и K. pneumoniae готовят путем выращивания штаммов в средах DMEM или LB до OD₆₀₀ от 0,5 до 1,0, и перед замораживанием добавляют глицерин до конечной концентрации 20%. Конкретные условия анализа варьируются в зависимости от условий, оптимизированных для каждого бактериального штамма. Предварительно титрованные размороженные бактерии разводят до 1х10⁵ КОЕ/мл в ОРА-буфере (сбалансированный солевой раствор Хэнкса (Life Technologies) и 0,1% желатина), и 20 мкл (10³ КОЕ) бактериальной суспензии опсонизируют с 20 мкл серийно разбавленной сыворотки в течение 30 мин при комнатной температуре в микропланшете для тканевых культур. Затем, 10 мкл комплемента (сыворотка крольчат или сыворотка человека, обедненная IgG/IgM, Pel-Freez) и 20 мкл клеток HL-60 (в соотношении 100-200:1) добавляют в каждую лунку с ОРА буфером до конечного объема 100 мкл. Реакционную смесь встряхивают в течение 60 мин при 37°С в инкубаторе с 5% СО₂. В некоторых случаях, бактерии напрямую объединяют с комплементом и HL60 без стадии предварительной опсонизации и встряхивают в течение 60 мин при 37°C в атмосфере 5% CO₂. После инкубации, 10 мкл каждой реакционной смеси переносят в соответствующие лунки предварительно смоченного фильтрующего планшета Millipore MultiScreen HTS HV, содержащего 100 мкл воды. После вакуумной фильтрации жидкости, применяют 100 мкл 50% среды для роста бактерий и фильтруют, и планшет инкубируют в течение ночи при 37°С в герметичном пакете с застежкой-молнией. На следующий день подсчитывают микроколонии после окрашивания красителем Coomassie с использованием анализатора ImmunoSpot® и программного обеспечения ImmunoCapture. В случае анализа серотипа O9 E. coli, OPA миниатюризируют для реакционных объемов 50 мкл в 384-луночном формате. Для установления специфичности активности ОРА, иммунные сыворотки предварительно инкубируют с очищенным полисахаридом О-антигена перед стадией опсонизации. Анализ OPA включает контрольные реакции без клеток HL60 или комплемента, чтобы продемонстрировать зависимость любого наблюдаемого уничтожения от этих компонентов. Для анализа серотипа O5 Klebsiella, где присутствие HL60 не оказывает влияния, бактерицидные реакции в сыворотке проводят в отсутствие эффекторных клеток.Pre-frozen stock solutions of E. coli and K. pneumoniae are prepared by growing the strains in DMEM or LB media to an OD ₆₀₀ of 0.5 to 1.0, and adding glycerol to a final concentration of 20% before freezing. Specific assay conditions vary depending on the conditions optimized for each bacterial strain. Pre-titrated thawed bacteria are diluted to 1x10 ⁵ CFU/ml in OPA buffer (Hank's balanced salt solution (Life Technologies) and 0.1% gelatin), and 20 μl (10 ³ CFU) of the bacterial suspension is opsonized with 20 μl of serially diluted serum in for 30 min at room temperature in a tissue culture microplate. Then, 10 μl of complement (rabbit serum or human serum depleted of IgG/IgM, Pel-Freez) and 20 μl of HL-60 cells (at a ratio of 100-200:1) are added to each well of OPA buffer to a final volume of 100 μl. The reaction mixture is shaken for 60 minutes at 37°C in an incubator with 5% CO ₂ . In some cases, bacteria are directly combined with complement and HL60 without a pre-opsonization step and shaken for 60 min at 37°C in an atmosphere of 5% CO ₂ . After incubation, 10 μl of each reaction mixture was transferred to the corresponding wells of a pre-wetted Millipore MultiScreen HTS HV filter plate containing 100 μl of water. After vacuum filtering the liquid, 100 μl of 50% bacterial growth medium is applied and filtered, and the plate is incubated overnight at 37°C in a sealed zip-lock bag. The next day, microcolonies are counted after staining with Coomassie dye using the ImmunoSpot® analyzer and ImmunoCapture software. For E. coli serotype O9 assays, OPA is miniaturized to 50 μL reaction volumes in a 384-well format. To establish the specificity of OPA activity, immune sera are preincubated with purified O-antigen polysaccharide before the opsonization step. The OPA assay includes control reactions without HL60 cells or complement to demonstrate the dependence of any observed killing on these components. For the analysis of Klebsiella serotype O5, where the presence of HL60 has no effect, serum bactericidal reactions are performed in the absence of effector cells.

Результатыresults

а. Селекция штаммов E. coli и K. pneumoniae для бактерицидных анализовA. Selection of E. coli and K. pneumoniae strains for bactericidal assays

Бактериальные клинические штаммы первоначально отбирают после подтверждения экспрессии О-антигена с помощью профилирования LPS (путем эксклюзионной ВЭЖХ) и доступности поверхности О-антигена с помощью проточной цитометрии с О-антиген-специфической антисывороткой кролика. Затем проводят эмпирический скрининг сывороточного комплемента для определения отдельных совместимых партий в диапазоне концентраций, которые обеспечивают подходящий баланс низких уровней неспецифического уничтожения в сочетании с высокой степенью чувствительности в присутствии иммунных сывороток. Дополнительные параметры оптимизации анализа включают корректировку соотношения эффекторных клеток HL60 и бактерий, скорость шейкера, наличие/отсутствие герметика для планшетов и включение стадии предварительной инкубации с опсонизацией.Bacterial clinical strains are initially selected after confirmation of O-antigen expression by LPS profiling (by size-exclusion HPLC) and O-antigen surface accessibility by flow cytometry with O-antigen-specific rabbit antiserum. Empirical serum complement screening is then performed to identify individual compatible lots within a concentration range that provides an appropriate balance of low levels of nonspecific killing coupled with a high degree of sensitivity in the presence of immune sera. Additional assay optimization parameters include adjusting the ratio of HL60 effector cells to bacteria, shaker speed, presence/absence of plate sealant, and inclusion of a preincubation opsonization step.

b. Перекрестная защита и специфичность О-антигена иммунной сыворотки O8 E. coli и O5 K. pneumoniae b. Cross-protection and specificity of immune serum O-antigen O8 E. coli and O5 K. pneumoniae

O8 EC0305 E. coli и штамм O5 KP0121 K. pneumoniae выбирают для разработки анализа. Оба являются изолятами крови. EC0305 является резистентным к цефалоспоринам и тетрациклину, и KP0121 является резистентным к ампициллину. Анализ OPA разрабатывают для штамма O8 EC0305 E. coli с условиями, включающими 3,0% BRC, соотношение бактерий к HL60 1:100 и одностадийную 60-минутную реакцию инкубации OPA. Поскольку обнаружено, что бактерицидная активность штамма KP0121 O5 K. pneumoniae в присутствии иммунных сывороток не зависит от эффекторных клеток HL60, разрабатывают SBA. В этом случае, реакция SBA требует использования 10% обедненной сыворотки человека в качестве источника комплемента. Результаты бактерицидных анализов с этими штаммами O8 E. coli и O5 K. pneumoniae показаны на ФИГ. 34А-34В. В OPA серотипа O8 E. coli, кроличья иммунная сыворотка, полученная после двух доз конъюгата O8-CRM₁₉₇, показывает сильное специфическое уничтожение O-антигена, которое заблокировано предварительной адсорбцией иммунной сыворотки свободным полисахаридом O8 O-антигена. Полное уничтожение наблюдается при разведении сыворотки менее 1:1000. Совпадающие предиммунные сыворотки от того же кролика оказались неактивными. Ту же кроличью сыворотку оценивают в SBA O5 K. pneumoniae и находят, что она аналогично бактерицидная при разведении сыворотки 1:2000. Уничтожение блокируется свободным O8 О-антигеном и отсутствует с предиммунной сывороткой. В этом случае, сывороточная матрица прозона маскирует активность SBA при разведении сыворотки менее 1:1000. E. coli O8 EC0305 and K. pneumoniae strain O5 KP0121 are selected for assay development. Both are blood isolates. EC0305 is resistant to cephalosporins and tetracycline, and KP0121 is resistant to ampicillin. The OPA assay is developed for E. coli strain O8 EC0305 with conditions including 3.0% BRC, a bacteria to HL60 ratio of 1:100, and a one-step 60-minute OPA incubation reaction. Because the bactericidal activity of K. pneumoniae strain KP0121 O5 in the presence of immune sera was found to be independent of HL60 effector cells, SBAs were developed. In this case, the SBA reaction requires the use of 10% depleted human serum as a source of complement. The results of bactericidal assays with these E. coli O8 and K. pneumoniae O5 strains are shown in FIG. 34A-34B. In OPA serotype O8 E. coli, rabbit immune serum obtained after two doses of the O8-CRM conjugate ₁₉₇ shows strong specific killing of O-antigen, which is blocked by preadsorption of the immune serum to free O8 O-antigen polysaccharide. Complete destruction is observed when the serum is diluted less than 1:1000. Matched preimmune sera from the same rabbit were inactive. The same rabbit serum was evaluated for SBA O5 K. pneumoniae and found to be similarly bactericidal at a serum dilution of 1:2000. Killing is blocked by free O8 O antigen and is absent with preimmune serum. In this case, the serum prozone matrix masks SBA activity at serum dilutions less than 1:1000.

с. перекрестная защита и специфичность иммунной сыворотки O9 E. coli и O3 K. pneumoniae OPA O-антигенаWith. cross-protection and specificity of immune serum O9 E. coli and O3 K. pneumoniae OPA O-antigen

O9a EC0611 E. coli и штамм O3b KP0009 K. pneumoniae выбирают для разработки анализа. EC0611 является резистентным к ампициллину, и KP0009 является резистентным к цефалоспоринам, фторхинолонам и тетрациклину. Оба являются изолятами UTI из инфекций почек и мочевого пузыря соответственно. O-антиген O9a, использованный для создания конъюгата CRM₁₉₇ и полученной иммунной сыворотки, имеет структуру тетраметического полиманнанового повтора и идентичен O-антигену штамма O9a EC0611 для анализа; однако он структурно гетерологичен тестируемому штамму O3b O-антигена KP0009 K. pneumoniae, который, как предполагается, экспрессирует более короткую трехмерную повторяющуюся единицу на основании последовательности его гена wbdD (см. ФИГ. 33). Результаты OPA со штаммами O9a E.coli и O3b K.pneumoniae показывают, что иммунная сыворотка против O9a E.coli эффективна против обоих (ФИГ. 35A-35B). Полное уничтожение ОРА наблюдается при разведении сыворотки менее 1:8000 для штамма O9a E. coli и менее 1:1600 для штамма O3b Klebsiella. Специфичность демонстрируют отсутствием активности при преадсорбции сыворотки со свободным О-антигеном О9а и с соответствующей предиммунной сывороткой. E. coli O9a EC0611 and K. pneumoniae strain O3b KP0009 are selected for assay development. EC0611 is resistant to ampicillin, and KP0009 is resistant to cephalosporins, fluoroquinolones and tetracycline. Both are UTI isolates from kidney and bladder infections, respectively. The O9a O-antigen used to create the conjugate of CRM ₁₉₇ and the resulting immune serum has a tetrametic polymannan repeat structure and is identical to the O-antigen of the O9a strain EC0611 assay; however, it is structurally heterologous to the K. pneumoniae O-antigen test strain O3b KP0009, which is predicted to express a shorter three-dimensional repeat unit based on the sequence of its wbdD gene (see FIG. 33) . OPA results with E. coli O9a and K. pneumoniae O3b strains indicate that anti-E . coli O9a immune serum is effective against both ( FIGS. 35A-35B) . Complete destruction of OPA is observed at serum dilutions less than 1:8000 for the O9a E. coli strain and less than 1:1600 for the O3b Klebsiella strain. Specificity is demonstrated by the lack of activity upon preadsorption of serum with free O-antigen O9a and with the corresponding preimmune serum.

ВыводConclusion

Конъюгаты серотипа O8 и O9 E. coli полиманнана CRM₁₉₇ вырабатывают функциональные антитела, которые способны убивать не только гомологичные клинические штаммы E. coli, но и штаммы серотипа O5 и O3 Klebsiella в бактерицидных анализах. Результаты подтверждают, что эти конъюгаты продуцируют антитела, обладающие перекрестной защитой против изолятов обоих видов, экспрессирующих структурно родственные полиманнановые О-антигены.Serotype O8 and O9 conjugates E. colipolymannan CRM₁₉₇ produce functional antibodies that are capable of killing not only homologous clinical strains E. coli, but also strains serotypes O5 and O3 Klebsiellain bactericidal assays. The results confirm that these conjugates produce antibodies that are cross-protective against isolates of both species expressing structurally related polymannan O-antigens.

Следующие пункты описывают дополнительные варианты осуществления изобретения:The following paragraphs describe additional embodiments of the invention:

С. Композиция, содержащая полипептид, полученный из FimH, или его фрагмент; и сахарид, имеющий структуру, выбранную из Формулы O1 (например, Формулы O1A, Формулы O1B и Формулы O1C), Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4 (например, Формулы O4:K52 и Формулы O4:K6), Формулы O5 (например, Формулы O5ab и Формулы O5ac (штамм 180/C3)), Формулы O6 (например, Формулы O6:K2; K13; K15 и Формулы O6:K54), Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18 (например, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B и Формулы O18B1), Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23 (например, Формулы O23A), Формулы O24, Формулы O25 (например, Формулы O25a и Формулы O25b), Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45 (например, Формулы O45 и Формулы O45rel), Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы 62D₁, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73 (например, Формулы O73 (штамм 73-1)), Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186 и Формулы O187, где n представляет собой целое число от 1 до 100. C. A composition containing a polypeptide derived from FimH, or a fragment thereof; and a saccharide having a structure selected from Formula O1 (for example, Formula O1A, Formula O1B and Formula O1C), Formula O2, Formula O3, Formula O4 (for example, Formula O4:K52 and Formula O4:K6), Formula O5 (for example, Formulas O5ab and Formulas O5ac (strain 180/C3)), Formulas O6 (e.g. Formulas O6:K2; K13; K15 and Formulas O6:K54), Formulas O7, Formulas O8, Formulas O9, Formulas O10, Formulas O11, Formulas O12 , Formulas O13, Formulas O14, Formulas O15, Formulas O16, Formulas O17, Formulas O18 (for example, Formulas O18A, Formulas O18ac, Formulas O18A1, Formulas O18B and Formulas O18B1), Formulas O19, Formulas O20, Formulas O21, Formulas O22, Formulas O23 (for example, Formula O23A), Formula O24, Formula O25 (for example, Formula O25a and Formula O25b), Formula O26, Formula O27, Formula O28, Formula O29, Formula O30, Formula O32, Formula O33, Formula O34, Formula O35, Formula O36, Formula O37, Formula O38, Formula O39, Formula O40, Formula O41, Formula O42, Formula O43, Formula O44, Formula O45 (e.g. Formula O45 and Formula O45rel), Formula O46, Formula O48, Formula O49, Formula O50 , Formulas O51, Formulas O52, Formulas O53, Formulas O54, Formulas O55, Formulas O56, Formulas O57, Formulas O58, Formulas O59, Formulas O60, Formulas O61, Formulas O62, Formulas 62D ₁ , Formulas O63, Formulas O64, Formulas O65, Formulas O66, Formulas O68, Formulas O69, Formulas O70, Formulas O71, Formulas O73 (e.g. Formulas O73 (strain 73-1)), Formulas O74, Formulas O75, Formulas O76, Formulas O77, Formulas O78, Formulas O79, Formulas O80 , Formulas O81, Formulas O82, Formulas O83, Formulas O84, Formulas O85, Formulas O86, Formulas O87, Formulas O88, Formulas O89, Formulas O90, Formulas O91, Formulas O92, Formulas O93, Formulas O95, Formulas O96, Formulas O97, Formulas O98, Formulas O99, Formulas O100, Formulas O101, Formulas O102, Formulas O103, Formulas O104, Formulas O105, Formulas O106, Formulas O107, Formulas O108, Formulas O109, Formulas O110, Formulas 0111, Formulas O112, Formulas O113 , Formulas O114, Formulas O115, Formulas O116, Formulas O117, Formulas O118, Formulas O119, Formulas O120, Formulas O121, Formulas O123, Formulas O124, Formulas O125, Formulas O126, Formulas O127, Formulas O128, Formulas O129, Formulas O130, O131, Formulas O132 , Formulas O133, Formulas O134, Formulas O135, Formulas O136, Formulas O137, Formulas O138, Formulas O139, Formulas O140, Formulas O141, Formulas O142, Formulas O143, Formulas O144, Formulas O145, Formulas O146, Formulas O147, Formulas O148, Formulas O149, Formulas O150, Formulas O151, Formulas O152, Formulas O153, Formulas O154, Formulas O155, Formulas O156, Formulas O157, Formulas O158, Formulas O159, Formulas O160, Formulas O161, Formulas O162, Formulas O163, Formulas O16 4, Formula O165, Formulas O166, Formulas O167, Formulas O168, Formulas O169, Formulas O170, Formulas O171, Formulas O172, Formulas O173, Formulas O174, Formulas O175, Formulas O176, Formulas O177, Formulas O178, Formulas O179, Formulas O180, O181, Formulas O182 , Formulas O183, Formulas O184, Formulas O185, Formulas O186, and Formulas O187, where n is an integer between 1 and 100.

С2. Композиция по п. С1, отличающаяся тем, что сахарид имеет структуру, выбранную из Формулы O1 (например, Формулы O1A, Формулы O1B и Формулы O1C), Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4 (например, Формулы O4:K52 и Формулы O4:K6), Формулы O5 (например, Формулы O5ab и Формулы O5ac (штамм 180/C3)), Формулы O6 (например, Формулы O6:K2; K13; K15 и Формулы O6:K54), Формулы O7, Формулы O10, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18 (например, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B и Формулы O18B1), Формулы O21, Формулы O23 (например, Формулы O23A), Формулы O24, Формулы O25 (например, Формулы O25a и Формулы O25b), Формулы O26, Формулы O28, Формулы O44, Формулы O45 (например, Формулы O45 и Формулы O45rel), Формулы O55, Формулы O56, Формулы O58, Формулы O64, Формулы O69, Формулы O73 (например, Формулы O73 (штамм 73-1)), Формулы O75, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O86, Формулы O88, Формулы O90, Формулы O98, Формулы O104, Формулы 0111, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O119, Формулы O121, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O136, Формулы O138, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O147, Формулы O149, Формулы O152, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O164, Формулы O173, Формулы 62D₁, Формулы O22, Формулы O35, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O83, Формулы O91, Формулы O105, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O139, Формулы O153, Формулы O167 и Формулы O172, где n представляет собой целое число. от 20 до 100.C2. The composition according to claim C1, characterized in that the saccharide has a structure selected from Formula O1 (for example, Formula O1A, Formula O1B and Formula O1C), Formula O2, Formula O3, Formula O4 (for example, Formula O4:K52 and Formula O4: K6), Formulas O5 (for example, Formulas O5ab and Formulas O5ac (strain 180/C3)), Formulas O6 (for example, Formulas O6:K2; K13; K15 and Formulas O6:K54), Formulas O7, Formulas O10, Formulas O16, Formula O17, Formula O18 (for example, Formula O18A, Formula O18ac, Formula O18A1, Formula O18B and Formula O18B1), Formula O21, Formula O23 (for example, Formula O23A), Formula O24, Formula O25 (for example, Formula O25a and Formula O25b) , Formulas O26, Formulas O28, Formulas O44, Formulas O45 (for example, Formulas O45 and Formulas O45rel), Formulas O55, Formulas O56, Formulas O58, Formulas O64, Formulas O69, Formulas O73 (for example, Formulas O73 (strain 73-1) ), Formulas O75, formulas O77, formulas O78, formulas O86, formulas O88, formulas O90, formula O98, formulas O104, formula 0111, formula O114, formula O119, formula O121, formula O124, formulas O125, formulas O126, formulas, formulas, formulas, formulas, formulas O126, formulas. Formulas O127, Formulas O128, Formulas O136, Formulas O138, Formulas O141, Formulas O142, Formulas O143, Formulas O147, Formulas O149, Formulas O152, Formulas O157, Formulas O158, Formulas O159, Formulas O164, Formulas O173, 62D ₁ , Formulas O22, Formula O35, Formula O65, Formula O66, Formula O83, Formula O91, Formula O105, Formula O116, Formula O117, Formula O139, Formula O153, Formula O167 and Formula O172, where n is an integer. from 20 to 100.

С3. Композиция по п. С2, отличающаяся тем, что сахарид имеет структуру, выбранную из Формулы O1 (например, Формулы O1A, Формулы O1B и Формулы O1C), Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4 (например, Формулы O4:K52 и Формулы O4:K6), Формулы O5 (например, Формулы O5ab и Формулы O5ac (штамм 180/C3)), Формулы O6 (например, Формулы O6:K2; K13; K15 и Формулы O6:K54), Формулы O7, Формулы O10, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18 (например, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B и Формулы O18B1), Формулы O21, Формулы O23 (например, Формулы O23A), Формулы O24, Формулы O25 (например, Формулы O25a и Формулы O25b), Формулы O26, Формулы O28, Формулы O44, Формулы O45 (например, Формулы O45 и Формулы O45rel), Формулы O55, Формулы O56, Формулы O58, Формулы O64, Формулы O69, Формулы O73 (например, Формулы O73 (штамм 73-1)), Формулы O75, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O86, Формулы O88, Формулы O90, Формулы O98, Формулы O104, Формулы 0111, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O119, Формулы O121, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O136, Формулы O138, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O147, Формулы O149, Формулы O152, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O164, Формулы O173 и Формулы 62D₁, где n представляет собой целое число от 20 до 100.C3. The composition of claim C2, wherein the saccharide has a structure selected from Formula O1 (for example, Formula O1A, Formula O1B and Formula O1C), Formula O2, Formula O3, Formula O4 (for example, Formula O4:K52 and Formula O4: K6), Formulas O5 (for example, Formulas O5ab and Formulas O5ac (strain 180/C3)), Formulas O6 (for example, Formulas O6:K2; K13; K15 and Formulas O6:K54), Formulas O7, Formulas O10, Formulas O16, Formula O17, Formula O18 (for example, Formula O18A, Formula O18ac, Formula O18A1, Formula O18B and Formula O18B1), Formula O21, Formula O23 (for example, Formula O23A), Formula O24, Formula O25 (for example, Formula O25a and Formula O25b) , Formulas O26, Formulas O28, Formulas O44, Formulas O45 (for example, Formulas O45 and Formulas O45rel), Formulas O55, Formulas O56, Formulas O58, Formulas O64, Formulas O69, Formulas O73 (for example, Formulas O73 (strain 73-1) ), Formulas O75, formulas O77, formulas O78, formulas O86, formulas O88, formulas O90, formula O98, formulas O104, formula 0111, formula O114, formula O119, formulas O121, formula O124, formulas O125, formulas O126, formulas, formulas, formulas, formulas, formulas, formulas O126, formulas. Formulas O127, Formulas O128, Formulas O136, Formulas O138, Formulas O141, Formulas O142, Formulas O143, Formulas O147, Formulas O149, Formulas O152, Formulas O157, Formulas O158, Formulas O159, Formulas O164, Formulas O173 and 62D ₁ , where n is an integer between 20 and 100.

С4. Композиция по п. С2, содержащая структуру, выбранную из Формулы O1 (например, Формулы O1A, Формулы O1B и Формулы O1C), Формулы O2, Формулы O6 (например, Формулы O6:K2; K13; K15 и Формулы O6:K54), Формулы O15, Формулы O16, Формулы O21, Формулы O25 (например, Формулы O25a и Формулы O25b) и Формулы O75.C4. The composition of claim C2, comprising a structure selected from Formula O1 (for example, Formula O1A, Formula O1B and Formula O1C), Formula O2, Formula O6 (for example, Formula O6:K2; K13; K15 and Formula O6:K54), Formula O15, Formula O16, Formula O21, Formula O25 (eg Formula O25a and Formula O25b) and Formula O75.

С5. Композиция по п. С2, содержащая структуру, выбранную из Формулы O4, Формулы O11, Формулы O21 и Формулы O75.C5. The composition of claim C2, comprising a structure selected from Formula O4, Formula O11, Formula O21 and Formula O75.

С6. Композиция по п. С1, отличающаяся тем, что сахарид не имеет структуру, выбранную из Формулы O8, Формулы O9a, Формулы O9, Формулы O20ab, Формулы O20ac, Формулы O52, Формулы O97 и Формулы O101.C6. The composition according to claim C1, characterized in that the saccharide does not have a structure selected from Formula O8, Formula O9a, Formula O9, Formula O20ab, Formula O20ac, Formula O52, Formula O97 and Formula O101.

С7. Композиция по п. С1, отличающаяся тем, что сахарид не имеет структуру, выбранную из Формулы O12.C7. Composition according to claim C1, characterized in that the saccharide does not have a structure selected from Formula O12.

С8. Композиция по п. С4, отличающаяся тем, что сахарид получают путем экспрессии белка семейства wzz в грамотрицательной бактерии с образованием указанного сахарида.C8. The composition according to claim C4, characterized in that the saccharide is obtained by expressing a protein of the wzz family in a gram-negative bacterium to form said saccharide.

С9. Композиция по п. С8, отличающаяся тем, что белок семейства wzz выбран из группы, состоящей из wzzB, wzz, wzz_SF, wzz_ST, fepE, wzz_fepE, wzz1 и wzz2.C9. The composition according to claim C8, characterized in that the wzz family protein is selected from the group consisting of wzzB, wzz, wzz _SF , wzz _ST , fepE, wzz _fepE , wzz1 and wzz2.

С10. Композиция по п. С8, отличающаяся тем, что белок семейства wzz представляет собой wzzB.C10. The composition according to claim C8, characterized in that the wzz family protein is wzzB.

С11. Композиция по п. С8, отличающаяся тем, что белок семейства wzz представляет собой fepE.C11. The composition according to claim C8, characterized in that the wzz family protein is fepE.

С12. Композиция по п. С8, отличающаяся тем, что белок семейства wzz представляет собой wzzB и fepE.C12. The composition according to item C8, characterized in that the wzz family protein is wzzB and fepE.

С13. Композиция по п. С8, отличающаяся тем, что белок семейства wzz получен из Salmonella enterica. C13. The composition according to claim C8, characterized in that the protein of the wzz family is obtained from Salmonella enterica.

С14. Композиция по п. С8, отличающаяся тем, что белок семейства wzz содержит последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39.C14. The composition according to claim C8, characterized in that the wzz family protein contains a sequence selected from any of SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 39.

С15. Композиция по п. С8, отличающаяся тем, что белок семейства wzz содержит последовательность, по меньшей мере, на 90% идентичную любой из последовательностей SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34.C15. The composition according to claim C8, characterized in that the wzz family protein contains a sequence at least 90% identical to any of the sequences of SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 , SEQ ID NO: 34.

С16. Композиция по п. С8, отличающаяся тем, что белок семейства wzz содержит последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39.C16. The composition according to claim C8, characterized in that the wzz family protein contains a sequence selected from any of SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 39.

С17. Композиция по п. С1, отличающаяся тем, что сахарид синтезирован синтетическим путем. C17. Composition according to claim C1, characterized in that the saccharide is synthesized synthetically.

С18. Композиция по любому из пп. С1-С17, отличающаяся тем, что сахарид дополнительно содержит группу R1 E. coli. C18. The composition according to any one of paragraphs. C1-C17, characterized in that the saccharide additionally contains the R1 E. coli group.

С19. Композиция по любому из пп. С1-С17, отличающаяся тем, что сахарид дополнительно содержит группу R2 E. coli. C19. The composition according to any one of paragraphs. C1-C17, characterized in that the saccharide additionally contains an E. coli R2 group.

С20. Композиция по любому из пп. С1-С17, отличающаяся тем, что сахарид дополнительно содержит группу R3 E. coli. C20. The composition according to any one of paragraphs. C1-C17, characterized in that the saccharide additionally contains the R3 group of E. coli.

С21. Композиция по любому из пп. С1-С17, отличающаяся тем, что сахарид дополнительно содержит группу R4 E. coli. C21. The composition according to any one of paragraphs. C1-C17, characterized in that the saccharide additionally contains the R4 E. coli group.

С22. Композиция по любому из пп. С1-С17, отличающаяся тем, что сахарид дополнительно содержит группу K-12 E. coli. C22. The composition according to any one of paragraphs. C1-C17, characterized in that the saccharide additionally contains the K-12 E. coli group.

С23. Композиция по любому из пп. С1-С22, отличающаяся тем, что сахарид дополнительно содержит группу 3-дезокси-d-манно-окт-2-улозоновой кислоты (KDO).C23. The composition according to any one of paragraphs. C1-C22, characterized in that the saccharide additionally contains a 3-deoxy-d-manno-oct-2-ulosonic acid (KDO) group.

С24. Композиция по любому из пп. С1-С17, отличающаяся тем, что сахарид дополнительно не содержит группу R1 E. coli. C24. The composition according to any one of paragraphs. C1-C17, characterized in that the saccharide additionally does not contain the R1 group of E. coli.

С25. Композиция по любому из пп. С1-С17, отличающаяся тем, что сахарид дополнительно не содержит группу R2 E. coli. C25. The composition according to any one of paragraphs. C1-C17, characterized in that the saccharide additionally does not contain the R2 group of E. coli.

С26. Композиция по любому из пп. С1-С17, отличающаяся тем, что сахарид дополнительно не содержит группу R3 E. coli. C26. The composition according to any one of paragraphs. C1-C17, characterized in that the saccharide additionally does not contain the R3 group of E. coli.

С27. Композиция по любому из пп. С1-С17, отличающаяся тем, что сахарид дополнительно не содержит группу R4 E. coli. C27. The composition according to any one of paragraphs. C1-C17, characterized in that the saccharide additionally does not contain the R4 group of E. coli.

С28. Композиция по любому из пп. С1-С17, отличающаяся тем, что сахарид дополнительно не содержит группу K-12 E. coli. C28. The composition according to any one of paragraphs. C1-C17, characterized in that the saccharide additionally does not contain the K-12 group of E. coli.

С29. Композиция по любому из пп. С1-С22, отличающаяся тем, что сахарид дополнительно не содержит группу 3-дезокси-d-манно-окт-2-улозоновой кислоты (KDO).C29. The composition according to any one of paragraphs. C1-C22, characterized in that the saccharide additionally does not contain a 3-deoxy-d-manno-oct-2-ulosonic acid (KDO) group.

С30. Композиция по любому из пунктов С1-С23, отличающаяся тем, что сахарид не содержит липид А.C30. The composition according to any one of claims C1-C23, characterized in that the saccharide does not contain lipid A.

С31. Композиция по любому из пп. С1-С30, отличающаяся тем, что полисахарид имеет молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа или от 50 кДа до 2000 кДа.C31. The composition according to any one of paragraphs. C1-C30, characterized in that the polysaccharide has a molecular weight from 10 kDa to 2000 kDa or from 50 kDa to 2000 kDa.

С32. Композиция по любому из пп. С1-С31, отличающаяся тем, что сахарид имеет среднюю молекулярную массу 20-40 кДа.C32. The composition according to any one of paragraphs. C1-C31, characterized in that the saccharide has an average molecular weight of 20-40 kDa.

С33. Композиция по любому из пп. С1-С32, отличающаяся тем, что сахарид имеет среднюю молекулярную массу от 40000 до 60000 кДа.C33. The composition according to any one of paragraphs. C1-C32, characterized in that the saccharide has an average molecular weight from 40,000 to 60,000 kDa.

С34. Композиция по любому из пунктов С1-С33, где n равно целому числу от 31 до 90.C34. The composition according to any of paragraphs C1-C33, where n is an integer from 31 to 90.

С35. Композиция, содержащая полипептид, полученный из FimH, или его фрагмент; и конъюгат, содержащий сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем, где сахарид получен из E. coli. C35. A composition containing a polypeptide derived from FimH, or a fragment thereof; and a conjugate containing a saccharide covalently linked to a carrier protein, wherein the saccharide is derived from E. coli.

С36. Композиция, содержащая полипептид, полученный из FimH, или его фрагмент; и конъюгат, содержащий сахарид по любому из пунктов С1-С, ковалентно связанный с белком-носителем.C36. A composition containing a polypeptide derived from FimH, or a fragment thereof; and a conjugate containing a saccharide according to any one of points C1-C, covalently linked to a carrier protein.

С37. Композиция, содержащая полипептид, полученный из FimH, или его фрагмент; и конъюгат по любому из пунктов С35-С36, отличающийся тем, что белок-носитель выбран из любого из поли(L-лизина), CRM₁₉₇, фрагмента дифтерийного токсина B (DTFB), DTFB C8, дифтерийного анатоксина (DT), столбнячного анатоксина (TT), фрагмента C TT, коклюшного анатоксина, холерного анатоксина или экзотоксина A из Pseudomonas aeruginosa; детоксицированного экзотоксина A P. aeruginosa (EPA), белка, связывающего мальтозу (MBP), детоксицированного гемолизина A S. aureus, фактора слипания A, фактора слипания B, субъединицы B холерного токсина (CTB), пневмолизина Streptococcus pneumoniae и его детоксицированных вариантов, AcrA C. jejuni, природных гликопротеинов C. jejuni и стрептококковой пептидазы C5a (SCP).C37. A composition containing a polypeptide derived from FimH, or a fragment thereof; and a conjugate according to any one of claims C35-C36, characterized in that the carrier protein is selected from any of poly(L-lysine), CRM ₁₉₇ , diphtheria toxin fragment B (DTFB), DTFB C8, diphtheria toxoid (DT), tetanus toxoid (TT), TT fragment C, pertussis toxoid, cholera toxoid or exotoxin A from Pseudomonas aeruginosa; detoxified P. aeruginosa exotoxin A (EPA), maltose binding protein (MBP), detoxified S. aureus hemolysin A, clumping factor A, clumping factor B, cholera toxin subunit B (CTB), Streptococcus pneumoniae pneumolysin and its detoxified variants, AcrA C. jejuni , natural C. jejuni glycoproteins, and streptococcal C5a peptidase (SCP).

С38. Композиция по любому из пунктов C35-C37, отличающаяся тем, что белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.C38. The composition according to any one of claims C35-C37, characterized in that the carrier protein is CRM ₁₉₇ .

С39. Композиция по любому из пунктов C35-C37, отличающаяся тем, что белок-носитель представляет собой столбнячный анатоксин (ТТ).C39. The composition according to any one of claims C35-C37, characterized in that the carrier protein is tetanus toxoid (TT).

С40. Композиция по любому из пунктов C35-C37, отличающаяся тем, что белок-носитель представляет собой поли(L-лизин).C40. The composition according to any one of claims C35-C37, characterized in that the carrier protein is poly(L-lysine).

С41. Композиция по любому из пунктов C35-C39, отличающаяся тем, что конъюгат получают восстановительным аминированием.C41. The composition according to any one of claims C35-C39, characterized in that the conjugate is obtained by reductive amination.

С42. Композиция по любому из пп. C35-C39, отличающаяся тем, что конъюгат получен с помощью химии CDAP.C42. The composition according to any one of paragraphs. C35-C39, characterized in that the conjugate is obtained using CDAP chemistry.

С43. Композиция по любому из пунктов C35-C39, отличающаяся тем, что конъюгат представляет собой односторонне-связанный конъюгированный сахарид.C43. The composition according to any one of claims C35-C39, characterized in that the conjugate is a one-way linked conjugated saccharide.

С44. Композиция по любому из пп. C35-C39, отличающаяся тем, что сахарид конъюгирован с белком-носителем через спейсер (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбамат (eTEC).C44. The composition according to any one of paragraphs. C35-C39, characterized in that the saccharide is conjugated to the carrier protein through a spacer (2-((2-oxoethyl)thio)ethyl)carbamate (eTEC).

С45. Композиция по п. C44, отличающаяся тем, что сахарид конъюгирован с белком-носителем через спейсер (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбамат (eTEC), где сахарид ковалентно связан со спейсером eTEC через карбаматную связь, и где белок-носитель ковалентно связан со спейсером eTEC посредством амидной связи.C45. The composition according to claim C44, characterized in that the saccharide is conjugated to a carrier protein through a spacer (2-((2-oxoethyl)thio)ethyl)carbamate (eTEC), where the saccharide is covalently linked to the eTEC spacer through a carbamate bond, and where the protein -carrier is covalently linked to the eTEC spacer via an amide bond.

С46. Композиция по любому из пп. C44-C45, отличающаяся тем, что CRM₁₉₇ содержит от 2 до 20 или от 4 до 16 лизиновых остатков, ковалентно связанных с полисахаридом через спейсер eTEC.C46. The composition according to any one of paragraphs. C44-C45, characterized in that CRM ₁₉₇ contains from 2 to 20 or from 4 to 16 lysine residues covalently linked to the polysaccharide through the eTEC spacer.

С47. Композиция по любому из пунктов C35-C46, отличающаяся тем, что соотношение сахарид:белок-носитель (масс./масс.) составляет от 0,2 до 4.C47. Composition according to any one of claims C35-C46, characterized in that the saccharide:carrier protein (w/w) ratio is from 0.2 to 4.

С48. Композиция по любому из пп. C35-C46, отличающаяся тем, что отношение сахарида к белку составляет, по меньшей мере, 0,5 и не более 2.C48. The composition according to any one of paragraphs. C35-C46, characterized in that the saccharide to protein ratio is at least 0.5 and not more than 2.

С49. Композиция по любому из пп. C35-C46, отличающаяся тем, что отношение сахарида к белку составляет от 0,4 до 1,7.C49. The composition according to any one of paragraphs. C35-C46, characterized in that the saccharide to protein ratio is from 0.4 to 1.7.

С50. Композиция по любому из пп. C43-C49, отличающаяся тем, что сахарид конъюгирован с белком-носителем через остаток 3-дезокси-d-манно-окт-2-улозоновой кислоты (KDO).C50. The composition according to any one of paragraphs. C43-C49, characterized in that the saccharide is conjugated to the carrier protein through a 3-deoxy-d-manno-oct-2-ulosonic acid (KDO) residue.

С51. Композиция, содержащая полипептид, полученный из FimH, или его фрагмент; и конъюгат, содержащий сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем, где сахарид имеет структуру, выбранную из Формулы O8, Формулы O9a, Формулы O9, Формулы O20ab, Формулы O20ac, Формулы O52, Формулы O97 и Формулы O101, где n представляет собой целое число. от 1 до 10.C51. A composition containing a polypeptide derived from FimH, or a fragment thereof; and a conjugate containing a saccharide covalently linked to a carrier protein, wherein the saccharide has a structure selected from Formula O8, Formula O9a, Formula O9, Formula O20ab, Formula O20ac, Formula O52, Formula O97 and Formula O101, where n is an integer . from 1 to 10.

С52. Композиция, содержащая полипептид, полученный из FimH, или его фрагмент; и сахарид по любому из пп. C1-C34, и фармацевтически приемлемый разбавитель.C52. A composition containing a polypeptide derived from FimH, or a fragment thereof; and a saccharide according to any one of paragraphs. C1-C34, and a pharmaceutically acceptable diluent.

С53. Композиция, содержащая полипептид, полученный из FimH, или его фрагмент; и конъюгат по любому из пп. C35-C51 и фармацевтически приемлемый разбавитель.C53. A composition containing a polypeptide derived from FimH, or a fragment thereof; and the conjugate according to any one of paragraphs. C35-C51 and a pharmaceutically acceptable diluent.

С54. Композиция по п. C53, содержащая не более примерно 25% свободного сахарида по сравнению с общим количеством сахарида в композиции.C54. The composition of claim C53, comprising no more than about 25% free saccharide relative to the total amount of saccharide in the composition.

С55. Композиция по любому из пп. C52-C53, дополнительно содержащая адъювант.C55. The composition according to any one of paragraphs. C52-C53, additionally containing an adjuvant.

С56. Композиция по любому из пп. C52-C53, дополнительно содержащая алюминий.C56. The composition according to any one of paragraphs. C52-C53, additionally containing aluminum.

С57. Композиция по любому из пп. C52-C53, дополнительно содержащая QS-21.C57. The composition according to any one of paragraphs. C52-C53, additionally containing QS-21.

С58. Композиция по любому из пп. C52-C53, дополнительно содержащая олигонуклеотид CpG.C58. The composition according to any one of paragraphs. C52-C53, additionally containing a CpG oligonucleotide.

С59. Композиция по любому из пп. C52-C53, отличающаяся тем, что композиция не включает адъювант.C59. The composition according to any one of paragraphs. C52-C53, characterized in that the composition does not include an adjuvant.

С60. Композиция, содержащая полипептид, полученный из FimH, или его фрагмент; и сахарид, полученный из E. coli, конъюгированный с белком-носителем через спейсер (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбамат (eTEC), где полисахарид ковалентно связан со спейсером eTEC через карбаматную связь, и где белок-носитель ковалентно связан со спейсером eTEC через амидную связь.C60. A composition containing a polypeptide derived from FimH, or a fragment thereof; and a saccharide derived from E. coli conjugated to a carrier protein through a spacer (2-((2-oxoethyl)thio)ethyl)carbamate (eTEC), where the polysaccharide is covalently linked to the eTEC spacer through a carbamate bond, and where the carrier protein covalently linked to the eTEC spacer via an amide bond.

С61. Композиция по п. C60, отличающаяся тем, что сахарид представляет собой О-антиген, полученный из E. coli.C61. Composition according to claim C60, characterized in that the saccharide is an O-antigen obtained from E. coli .

С62. Композиция по п. C60, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель.C62. The composition of claim C60, further comprising a pharmaceutically acceptable excipient, carrier or diluent.

С63. Композиция по п. C60, отличающаяся тем, что сахарид представляет собой О-антиген, полученный из E. coli.C63. Composition according to claim C60, characterized in that the saccharide is an O-antigen obtained from E. coli .

С64. Композиция, содержащая полипептид, полученный из FimH, или его фрагмент; и сахарид по любому из пунктов C1-C17, конъюгированный с белком-носителем через спейсер (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбамат (eTEC), где полисахарид ковалентно связан со спейсером eTEC через карбаматную связь, и где белок-носитель ковалентно связан со спейсером eTEC через амидную связь.C64. A composition containing a polypeptide derived from FimH, or a fragment thereof; and a saccharide as claimed in any one of C1 to C17, conjugated to a carrier protein via a (2-((2-oxoethyl)thio)ethyl)carbamate (eTEC) spacer, wherein the polysaccharide is covalently linked to the eTEC spacer via a carbamate bond, and wherein the protein is the carrier is covalently linked to the eTEC spacer via an amide bond.

С65. Композиция, содержащая полипептид, полученный из FimH, или его фрагмент; и (i) конъюгат антигена O25B E. coli, ковалентно связанный с белком-носителем, (ii) конъюгат антигена O1A E. coli, ковалентно связанный с белком-носителем, (iii) конъюгат антигена O2 E. coli, ковалентно связанный с белком-носителем, и (iv) конъюгат антигена O6, ковалентно связанный с белком-носителем, где антиген O25B E. coli имеет структуру Формулы O25B, где n представляет собой целое число больше 30.C65. A composition containing a polypeptide derived from FimH, or a fragment thereof; and (i) an E. coli O25B antigen conjugate covalently linked to a carrier protein, (ii) an E. coli O1A antigen conjugate covalently linked to a carrier protein, (iii) an E. coli O2 antigen conjugate covalently linked to a carrier protein a carrier, and (iv) an O6 antigen conjugate covalently linked to a carrier protein, wherein the E. coli O25B antigen has the structure of Formula O25B, where n is an integer greater than 30.

С66. Композиция по пп. C65, отличающаяся тем, что белок-носитель выбран из любого из поли(L-лизина), CRM₁₉₇, фрагмента B дифтерийного токсина (DTFB), DTFB C8, дифтерийного анатоксина (DT), столбнячного анатоксина (TT), фрагмента C TT, коклюшного анатоксина, холерного анатоксина или экзотоксина A из Pseudomonas aeruginosa; детоксицированного экзотоксина A P. aeruginosa (EPA), белка, связывающего мальтозу (MBP), детоксицированного гемолизина A S. aureus, фактора слипания A, фактора слипания B, субъединицы холерного токсина B (CTB), Пневмолизина Streptococcus pneumoniae и его детоксицированных вариантов, AcrA C. jejuni и природных гликопротеинов C. jejuni.C66. Composition according to claims C65, characterized in that the carrier protein is selected from any of poly(L-lysine), CRM ₁₉₇ , diphtheria toxoid fragment B (DTFB), DTFB C8, diphtheria toxoid (DT), tetanus toxoid (TT), TT fragment C, pertussis toxoid, cholera toxoid or exotoxin A from Pseudomonas aeruginosa; detoxified P. aeruginosa exotoxin A (EPA), maltose binding protein (MBP), detoxified S. aureus hemolysin A, clumping factor A, clumping factor B, cholera toxin subunit B (CTB), Streptococcus pneumoniae pneumolysin and its detoxified variants, AcrA C. jejuni and natural C. jejuni glycoproteins.

С67. Композиция, содержащая полипептид, полученный из FimH, или его фрагмент; и (i) конъюгат антигена O25B E. coli, ковалентно связанный с белком-носителем, (ii) конъюгат антигена O4 E. coli, ковалентно связанный с белком-носителем, (iii) конъюгат антигена O11 E. coli, ковалентно связанный с белком-носителем, и (iv) конъюгат антигена O21, ковалентно связанный с белком-носителем, где антиген O25B E. coli имеет структуру Формулы O75, где n представляет собой целое число больше 30.C67. A composition containing a polypeptide derived from FimH, or a fragment thereof; and (i) an E. coli O25B antigen conjugate covalently linked to a carrier protein, (ii) an E. coli O4 antigen conjugate covalently linked to a carrier protein, (iii) an E. coli O11 antigen conjugate covalently linked to a carrier protein a carrier, and (iv) an O21 antigen conjugate covalently linked to a carrier protein, wherein the E. coli O25B antigen has the structure of Formula O75, where n is an integer greater than 30.

С68. Композиция по п. C67, отличающаяся тем, что белок-носитель выбран из любого из поли(L-лизина), CRM₁₉₇, фрагмента B дифтерийного токсина (DTFB), DTFB C8, дифтерийного анатоксина (DT), столбнячного анатоксина (TT), фрагмента C TT, коклюшного анатоксина, холерного анатоксина, или экзотоксина A из Pseudomonas aeruginosa; детоксицированного экзотоксина A P. aeruginosa (EPA), белка, связывающего мальтозу (MBP), детоксицированного гемолизина A S. aureus, фактора слипания A, фактора слипания B, субъединицы холерного токсина B (CTB), пневмолизина Streptococcus pneumoniae и его детоксицированных вариантов, AcrA C. jejuni, природных гликопротеинов C. jejuni и стрептококковой пептидазы C5a (SCP).C68. The composition of claim C67, wherein the carrier protein is selected from any of poly(L-lysine), CRM ₁₉₇ , diphtheria toxoid fragment B (DTFB), DTFB C8, diphtheria toxoid (DT), tetanus toxoid (TT), fragment C TT, pertussis toxoid, cholera toxoid, or exotoxin A from Pseudomonas aeruginosa; detoxified P. aeruginosa exotoxin A (EPA), maltose binding protein (MBP), detoxified S. aureus hemolysin A, clumping factor A, clumping factor B, cholera toxin subunit B (CTB), Streptococcus pneumoniae pneumolysin and its detoxified variants, AcrA C. jejuni , natural C. jejuni glycoproteins, and streptococcal C5a peptidase (SCP).

С69. Способ получения композиции, содержащей полипептид, полученный из FimH, или его фрагмент; и конъюгат, содержащий сахарид, конъюгированный с белком-носителем через спейсер (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбамат (eTEC), включающий стадии а) взаимодействия сахарида с 1,1'-карбонил-ди-(1,2,4-триазолом) (CDT) или 1,1'-карбонилдиимидазолом (CDI) в органическом растворителе с получением активированного сахарида; b) взаимодействия активированного сахарида с цистамином или цистеамином или их солью с получением тиолированного сахарида; c) взаимодействия тиолированного сахарида с восстанавливающим агентом с получением активированного тиолированного сахарида, содержащего один или несколько свободных сульфгидрильных остатков; d) взаимодействия активированного тиолированного сахарида с активированным белком-носителем, содержащим одну или несколько α-галогенацетамидных групп, с получением конъюгата тиолированный сахарид-белок-носитель; и e) взаимодействия конъюгата тиолированный сахарид-белок-носитель с (i) первым кэпирующим реагентом, способным кэпировать неконъюгированные α-галогенацетамидные группы активированного белка-носителя; и/или (ii) вторым кэпирующим реагентом, способным кэпировать неконъюгированные свободные сульфгидрильные остатки; где получают гликоконъюгат, связанный с eTEC, где сахарид получают из E. coli; дополнительно включающий экспрессию полинуклеотида, кодирующего полипептид, полученный из FimH, или его фрагмента в рекомбинантной клетке млекопитающего, и выделение указанного полипептида или его фрагмента.C69. A method for producing a composition containing a polypeptide derived from FimH, or a fragment thereof; and a conjugate containing a saccharide conjugated to a carrier protein through a spacer (2-((2-oxoethyl)thio)ethyl)carbamate (eTEC), comprising steps a) reacting the saccharide with 1,1'-carbonyl-di-(1, 2,4-triazole) (CDT) or 1,1'-carbonyldiimidazole (CDI) in an organic solvent to obtain an activated saccharide; b) reacting the activated saccharide with cystamine or cysteamine or a salt thereof to produce a thiolated saccharide; c) reacting the thiolated saccharide with a reducing agent to produce an activated thiolated saccharide containing one or more free sulfhydryl residues; d) reacting the activated thiolated saccharide with an activated carrier protein containing one or more α-haloacetamide groups to produce a thiolated saccharide-carrier protein conjugate; and e) reacting the thiolated saccharide-carrier protein conjugate with (i) a first capping reagent capable of capping unconjugated α-haloacetamide groups of the activated carrier protein; and/or (ii) a second capping reagent capable of capping unconjugated free sulfhydryl residues; where the glycoconjugate associated with eTEC is obtained, where the saccharide is obtained from E. coli ; further comprising expressing a polynucleotide encoding a polypeptide derived from FimH, or a fragment thereof, in a recombinant mammalian cell, and isolating said polypeptide or fragment thereof.

С70. Способ по п. C69, включающий приготовление композиции по любому из пп. C1-C34.C70. The method according to claim C69, including preparing a composition according to any one of claims. C1-C34.

С71. Способ по любому из пп. C69-C70, отличающийся тем, что стадия кэпирования е) включает реакцию конъюгата тиолированный сахарид-белок-носитель с (i) N-ацетил-L-цистеином в качестве первого кэпирующего реагента, и/или (ii) йодацетамидом в качестве второго кэпирующего реагента. C71. The method according to any one of paragraphs. C69-C70, characterized in that the capping step e) involves reacting a thiolated saccharide-carrier protein conjugate with (i) N-acetyl-L-cysteine as a first capping reagent, and/or (ii) iodoacetamide as a second capping reagent .

С72. Способ по любому из пп. C69-C71, дополнительно включающий стадию смешивания сахарида путем взаимодействия с триазолом или имидазолом с получением смешанного сахарида, где смешанный сахарид замораживают, лиофилизируют и восстанавливают в органическом растворителе перед стадией а).C72. The method according to any one of paragraphs. C69-C71, further comprising the step of mixing the saccharide by reacting with a triazole or imidazole to produce a mixed saccharide, wherein the mixed saccharide is frozen, lyophilized and reconstituted in an organic solvent before step a).

С73. Способ по любому из пп. C69-C72, дополнительно включающий очистку тиолированного полисахарида, полученного на стадии c), где стадия очистки включает диафильтрацию. C73. The method according to any one of paragraphs. C69-C72, further comprising purifying the thiolated polysaccharide obtained in step c), wherein the purification step includes diafiltration.

С74. Способ по любому из пп. C69-C73, отличающийся тем, что способ дополнительно включает очистку гликоконъюгата, связанного с eTEC, путем диафильтрации.C74. The method according to any one of paragraphs. C69-C73, characterized in that the method further includes purification of the glycoconjugate associated with eTEC by diafiltration.

С75. Способ по любому из пп. C69-C74, отличающийся тем, что органический растворитель на стадии а) представляет собой полярный апротонный растворитель, выбранный из любого из следующих: диметилсульфоксида (ДМСО), диметилформамида (ДМФ), диметилацетамида (ДМА), N-метил-2-пирролидона (NMP), ацетонитрила, 1,3-диметил-3,4,5,6-тетрагидро-2(1H)-пиримидинона (DMPU) и гексаметилфосфорамида (HMPA) или их смеси.C75. The method according to any one of paragraphs. C69-C74, characterized in that the organic solvent in step a) is a polar aprotic solvent selected from any of the following: dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethylformamide (DMF), dimethylacetamide (DMA), N-methyl-2-pyrrolidone (NMP ), acetonitrile, 1,3-dimethyl-3,4,5,6-tetrahydro-2(1H)-pyrimidinone (DMPU) and hexamethylphosphoramide (HMPA) or mixtures thereof.

С76. Среда, содержащая KH₂PO₄, K₂HPO₄, (NH₄)₂SO₄, цитрат натрия, Na₂SO₄, аспарагиновую кислоту, глюкозу, MgSO₄, FeSO₄-7H₂O, Na₂MoO₄-2H₂O, H₃BO₃, CoCl₂-6H₂O, CuCl₂-2H₂O, MnCl₂-4H₂O, ZnCl₂ и CaCl₂-2H₂O.C76. A medium containing KH ₂ PO ₄ , K ₂ HPO ₄ , (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , sodium citrate, Na ₂ SO ₄ , aspartic acid, glucose, MgSO ₄ , FeSO ₄ -7H ₂ O, Na ₂ MoO ₄ -2H ₂ O, H ₃ BO ₃ , CoCl ₂ -6H ₂ O, CuCl ₂ -2H ₂ O, MnCl ₂ -4H ₂ O, ZnCl ₂ and CaCl ₂ -2H ₂ O.

С77. Среда по п. C76, отличающаяся тем, что указанная среда используется для культивирования E. coli.C77. Medium according to claim C76, characterized in that said medium is used for cultivating E. coli .

С78. Способ получения сахарида по любому из пп. C1-C34, включающий культивирование рекомбинантной E. coli в среде; получение указанного сахарида путем культивирования указанной клетки в указанной среде; где указанная клетка продуцирует указанный сахарид.C78. A method for producing saccharide according to any one of claims. C1-C34, comprising culturing recombinant E. coli in a medium; obtaining said saccharide by culturing said cell in said medium; wherein said cell produces said saccharide.

С79. Способ по п. C78, отличающийся тем, что среда содержит элемент, выбранный из любого из KH₂PO₄, K₂HPO₄, (NH₄)₂SO₄, цитрата натрия, Na₂SO₄, аспарагиновой кислоты, глюкозы, MgSO₄, FeSO₄-7H₂O, Na₂MoO₄-2H₂O, H₃BO₃, CoCl₂-6H₂O, CuCl₂-2H₂O, MnCl₂-4H₂O, ZnCl₂ и CaCl₂-2H₂O.C79. The method according to claim C78, characterized in that the medium contains an element selected from any of KH ₂ PO ₄ , K ₂ HPO ₄ , (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , sodium citrate, Na ₂ SO ₄ , aspartic acid, glucose, MgSO ₄ , FeSO ₄ -7H ₂ O, Na ₂ MoO ₄ -2H ₂ O, H ₃ BO ₃ , CoCl ₂ -6H ₂ O, CuCl ₂ -2H ₂ O, MnCl ₂ -4H ₂ O, ZnCl ₂ and CaCl ₂ - _2H2O .

С80. Способ по п. C78, отличающийся тем, что среда содержит гидролизат сои.C80. Method according to claim C78, characterized in that the medium contains soybean hydrolysate.

С81. Способ по п. C78, отличающийся тем, что среда содержит дрожжевой экстракт.C81. Method according to claim C78, characterized in that the medium contains yeast extract.

С82. Способ по п. C78, отличающийся тем, что среда дополнительно не содержит гидролизат сои и дрожжевой экстракт.C82. The method according to claim C78, characterized in that the medium additionally does not contain soybean hydrolysate and yeast extract.

С83. Способ по п. C78, отличающийся тем, что клетка E. coli содержит гетерологичный белок семейства wzz, выбранный из любого из wzzB, wzz, wzz_SF, wzz_ST, fepE, wzz_fepE, wzz1 и wzz2.C83. The method according to claim C78, characterized in that the E. coli cell contains a heterologous wzz family protein selected from any of wzzB, wzz, wzz _SF , wzz _ST , fepE, wzz _fepE , wzz1 and wzz2.

С84. Способ по п. C78, отличающийся тем, что клетка E. coli содержит белок семейства wzz Salmonella enterica, выбранный из любого из wzzB, wzz, wzz_SF, wzz_ST, fepE, wzz_fepE, wzz1 и wzz2.C84. The method according to claim C78, characterized in that the E. coli cell contains a Salmonella enterica wzz family protein selected from any of wzzB, wzz, wzz _SF , wzz _ST , fepE, wzz _fepE , wzz1 and wzz2.

С85. Способ по п. C84, отличающийся тем, что белок семейства wzz содержит последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19.C85. The method according to claim C84, characterized in that the wzz family protein contains a sequence selected from any of SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19.

С86. Способ по п. C78, отличающийся тем, что культивирование дает выход >120 OD₆₀₀/мл.C86. Method according to claim C78, characterized in that the cultivation gives a yield of >120 OD ₆₀₀ /ml.

С87. Способ по п. C78, дополнительно включающий очистку сахарида.C87. The method according to claim C78, further comprising purifying the saccharide.

С88. Способ по п. C78, отличающийся тем, что стадия очистки включает любую из следующих: диализа, операций концентрирования, операций диафильтрации, фильтрации с тангенциальным потоком, осаждения, элюирования, центрифугирования, осаждения, ультрафильтрации, глубинной фильтрации и колоночной хроматографии (ионообменной хроматографии, мультимодальной ионообменной хроматографии, DEAE и хроматографии гидрофобного взаимодействия).C88. The method according to claim C78, characterized in that the purification step includes any of the following: dialysis, concentration steps, diafiltration steps, tangential flow filtration, sedimentation, elution, centrifugation, sedimentation, ultrafiltration, depth filtration and column chromatography (ion exchange chromatography, multimodal ion exchange chromatography, DEAE and hydrophobic interaction chromatography).

С89. Способ индукции иммунного ответа у млекопитающего, включающий введение субъекту композиции по любому из пп. C1-C68.C89. A method of inducing an immune response in a mammal, comprising administering to the subject a composition according to any one of claims. C1-C68.

С90. Способ по п. C89, отличающийся тем, что иммунный ответ включает индукцию анти-E. coli O-специфических полисахаридных сывороточных антител.C90. The method according to claim C89, characterized in that the immune response includes the induction of anti -E. coli O-specific polysaccharide serum antibodies.

С91. Способ по п. C89, отличающийся тем, что иммунный ответ включает индукцию анти-E. coli антитела IgG.C91. The method according to claim C89, characterized in that the immune response includes the induction of an anti -E. coli IgG antibody.

С92. Способ по п.С89, отличающийся тем, что иммунный ответ включает индукцию бактерицидной активности против E.coli.C92. The method according to claim C89, characterized in that the immune response includes the induction of bactericidal activity against E. coli .

С93. Способ по п. C89, отличающийся тем, что иммунный ответ включает индукцию опсонофагоцитарных антител против E. coli.C93. The method according to claim C89, characterized in that the immune response includes the induction of opsonophagocytic antibodies against E. coli .

С94. Способ по п. C89, отличающийся тем, что иммунный ответ включает уровень среднего геометрического титра (GMT) по меньшей мере, от 1000 до 200000 после первоначального дозирования.C94. The method of claim C89, wherein the immune response comprises a geometric mean titer (GMT) level of at least 1,000 to 200,000 after initial dosing.

С95. Способ по п. C89, отличающийся тем, что композиция содержит сахарид, содержащий Формулу O25, где n представляет собой целое число от 40 до 100, где иммунный ответ включает уровень среднего геометрического титра (GMT), по меньшей мере, от 1000 до 200000 после первоначального дозирования.C95. The method of claim C89, wherein the composition contains a saccharide containing Formula O25, where n is an integer from 40 to 100, wherein the immune response includes a geometric mean titer (GMT) level of at least 1000 to 200,000 after initial dosing.

С96. Способ по п. C89, отличающийся тем, что млекопитающее подвержено риску любого из состояний, выбранных из инфекции мочевыводящих путей, холецистита, холангита, диареи, гемолитико-уремического синдрома, неонатального менингита, уросепсиса, внутрибрюшинной инфекции, менингита, осложненной пневмонии, раневой инфекции, инфекцией, связанной с биопсией простаты, неонатального/младенческого сепсиса, нейтропенической лихорадки и других инфекций кровотока; пневмонии, бактериемии и сепсиса.C96. The method of claim C89, wherein the mammal is at risk of any of the conditions selected from urinary tract infection, cholecystitis, cholangitis, diarrhea, hemolytic uremic syndrome, neonatal meningitis, urosepsis, intraperitoneal infection, meningitis, complicated pneumonia, wound infection, infection associated with prostate biopsy, neonatal/infant sepsis, neutropenic fever and other bloodstream infections; pneumonia, bacteremia and sepsis.

С97. Способ по п. C89, отличающийся тем, что у млекопитающего имеется одно из состояний, выбранных из инфекции мочевыводящих путей, холецистита, холангита, диареи, гемолитико-уремического синдрома, неонатального менингита, уросепсиса, внутрибрюшинной инфекции, менингита, осложненной пневмонии, раневой инфекции, инфекции, связанной с биопсией простаты, неонатального/младенческого сепсиса, нейтропенической лихорадки и других инфекций кровотока; пневмонии, бактериемии и сепсиса.C97. The method of claim C89, wherein the mammal has one of the conditions selected from urinary tract infection, cholecystitis, cholangitis, diarrhea, hemolytic uremic syndrome, neonatal meningitis, urosepsis, intraperitoneal infection, meningitis, complicated pneumonia, wound infection, infection associated with prostate biopsy, neonatal/infant sepsis, neutropenic fever and other bloodstream infections; pneumonia, bacteremia and sepsis.

С98. Способ (i) индукции иммунного ответа у субъекта против внекишечной патогенной Escherichia coli, (ii) индукции иммунного ответа у субъекта против внекишечной патогенной Escherichia coli, или (iii) индукции продуцирования опсонофагоцитарных антител у субъекта, которые специфичны в отношении внекишечной патогенной Escherichia coli, где способ включает введение субъекту эффективного количества композиции в соответствии с любым из пп. C1-С68.C98. A method of (i) inducing an immune response in a subject against extraintestinal pathogenic Escherichia coli , (ii) inducing an immune response in a subject against extraintestinal pathogenic Escherichia coli , or (iii) inducing the production of opsonophagocytic antibodies in a subject that are specific for extraintestinal pathogenic Escherichia coli , wherein the method includes administering to the subject an effective amount of a composition in accordance with any one of paragraphs. C1-C68.

С99. Способ по п. С98, отличающийся тем, что у субъекта имеется риск развития инфекции мочевыводящих путей.C99. The method according to claim C98, characterized in that the subject is at risk of developing a urinary tract infection.

С100. Способ по п. С98, отличающийся тем, что у субъекта имеется риск развития бактериемии.C100. The method according to claim C98, characterized in that the subject is at risk of developing bacteremia.

С101. Способ по п. С98, отличающийся тем, что у субъекта существует риск развития сепсиса.C101. The method according to claim C98, characterized in that the subject is at risk of developing sepsis.

С102. Композиция, содержащая полипептид, полученный из FimH, или его фрагмент; и (i) конъюгат антигена O25B E. coli, ковалентно связанный с белком-носителем, (ii) конъюгат антигена O1A E. coli, ковалентно связанный с белком-носителем, (iii) конъюгат O2 E. coli, ковалентно связанный с белком-носителем, и (iv) конъюгат O6-антигена, ковалентно связанный с белком-носителем, где антиген O25B E. coli имеет структуру Формулы O25B, где n представляет собой целое число больше 30.C102. A composition containing a polypeptide derived from FimH, or a fragment thereof; and (i) an E. coli O25B antigen conjugate covalently linked to a carrier protein, (ii) an E. coli O1A antigen conjugate covalently linked to a carrier protein, (iii) an E. coli O2 conjugate covalently linked to a carrier protein and (iv) an O6 antigen conjugate covalently linked to a carrier protein, wherein the E. coli O25B antigen has the structure of Formula O25B, where n is an integer greater than 30.

С103. Композиция по п. С102, отличающаяся тем, что белок-носитель выбран из группы, состоящей из поли(L-лизина), детоксицированного экзотоксина А P. aeruginosa (EPA), CRM₁₉₇, белка, связывающего мальтозу (MBP), дифтерийного анатоксина, столбнячного анатоксина, детоксицированного гемолизина A S. aureus, фактора слипания A, фактора слипания B, субъединицы B холерного токсина (CTB), холерного токсина, детоксицированных вариантов холерного токсина, пневмолизина Streptococcus pneumoniae и его детоксицированных вариантов, AcrA C. jejuni и природных гликопротеинов C. jejuni.C103. The composition according to claim C102, characterized in that the carrier protein is selected from the group consisting of poly(L-lysine), detoxified P. aeruginosa exotoxin A (EPA), CRM ₁₉₇ , maltose binding protein (MBP), diphtheria toxoid, tetanus toxoid, S. aureus detoxified hemolysin A, clumping factor A, clumping factor B, cholera toxin subunit B (CTB), cholera toxin, detoxified cholera toxin variants, Streptococcus pneumoniae pneumolysin and its detoxified variants, C. jejuni AcrA and natural glycoproteins C jejuni.

С104. Способ (i) индукции иммунного ответа у субъекта против внекишечной патогенной Escherichia coli, (ii) индукции иммунного ответа у субъекта против внекишечной патогенной Escherichia coli или (iii) индукции продуцирования опсонофагоцитарных антител у субъекта, специфичных к внекишечной патогенной Escherichia coli, где способ включает введение субъекту эффективного количества композиции по п. С1.C104. A method of (i) inducing an immune response in a subject against extraintestinal pathogenic Escherichia coli, (ii) inducing an immune response in a subject against extraintestinal pathogenic Escherichia coli , or (iii) inducing the production of opsonophagocytic antibodies in a subject specific for extraintestinal pathogenic Escherichia coli, wherein the method includes administering to the subject an effective amount of the composition according to claim C1.

С105. Способ по п. С104, отличающийся тем, что у субъекта имеется риск развития инфекции мочевыводящих путей.C105. The method according to claim C104, characterized in that the subject is at risk of developing a urinary tract infection.

С106. Способ по п. С104, отличающийся тем, что у субъекта имеется риск развития бактериемии.C106. The method according to claim C104, characterized in that the subject is at risk of developing bacteremia.

С107. Способ по п. С104, отличающийся тем, что у субъекта существует риск развития сепсиса.C107. The method according to claim C104, characterized in that the subject is at risk of developing sepsis.

С108. Композиция, содержащая полипептид, полученный из FimH, или его фрагмент; и сахарид, имеющий увеличение, по меньшей мере, на 5 повторяющихся единиц по сравнению с соответствующим O-полисахаридом дикого типа E. coli. C108. A composition containing a polypeptide derived from FimH, or a fragment thereof; and a saccharide having an increase of at least 5 repeat units compared to the corresponding wild-type E. coli O-polysaccharide.

С109. Композиция по п. С108, отличающаяся тем, что сахарид содержит Формулу O25a, и E. coli представляет собой серотип O25a E. coli.C109. The composition according to claim C108, characterized in that the saccharide contains Formula O25a, and the E. coli is an E. coli serotype O25a.

С110. Композиция по п. С108, отличающаяся тем, что сахарид содержит Формулу O25b, и E. coli представляет собой серотип O25b E. coli.C110. The composition according to claim C108, characterized in that the saccharide contains Formula O25b, and the E. coli is E. coli serotype O25b.

С111. Композиция по п. С108, отличающаяся тем, что сахарид содержит Формулу O2, и E. coli представляет собой серотип O2 E. coli.C111. The composition according to claim C108, characterized in that the saccharide contains Formula O2, and the E. coli is a serotype O2 of E. coli .

С112. Композиция по п. С108, отличающаяся тем, что сахарид содержит Формулу O6, и E. coli представляет собой серотип O6 E. coli.C112. The composition according to claim C108, characterized in that the saccharide contains Formula O6, and the E. coli is E. coli serotype O6.

С113. Композиция по п. С108, отличающаяся тем, что сахарид содержит Формулу O1, и E. coli представляет собой серотип O1 E. coli.C113. The composition according to claim C108, characterized in that the saccharide contains Formula O1, and the E. coli is E. coli serotype O1.

С114. Композиция по п. С108, отличающаяся тем, что сахарид содержит Формулу O17, и E. coli представляет собой серотип O17 E. coli.C114. The composition according to claim C108, characterized in that the saccharide contains Formula O17, and the E. coli is an E. coli serotype O17.

С115. Композиция по п. С108, отличающаяся тем, что сахарид имеет структуру, выбранную из: Формулы O1, Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4, Формулы O5, Формулы O6, Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18, Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23, Формулы O24, Формулы O25, Формулы O25b, Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45, Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73, Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144,O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186 и Формулы O187, где n представляет собой целое число от 5 до 1000.C115. The composition according to claim C108, characterized in that the saccharide has a structure selected from: Formula O1, Formula O2, Formula O3, Formula O4, Formula O5, Formula O6, Formula O7, Formula O8, Formula O9, Formula O10, Formula O11, Formulas O12, Formulas O13, Formulas O14, Formulas O15, Formulas O16, Formulas O17, Formulas O18, Formulas O19, Formulas O20, Formulas O21, Formulas O22, Formulas O23, Formulas O24, Formulas O25, Formulas O25b, Formulas O26, Formulas O27 , Formulas O28, Formulas O29, Formulas O30, Formulas O32, Formulas O33, Formulas O34, Formulas O35, Formulas O36, Formulas O37, Formulas O38, Formulas O39, Formulas O40, Formulas O41, Formulas O42, Formulas O43, Formulas O44, Formulas O45, Formula O46, Formula O48, Formula O49, Formula O50, Formula O51, Formula O52, Formula O53, Formula O54, Formula O55, Formula O56, Formula O57, Formula O58, Formula O59, Formula O60, Formula O61, Formula O62, Formulas O63, Formulas O64, Formulas O65, Formulas O66, Formulas O68, Formulas O69, Formulas O70, Formulas O71, Formulas O73, Formulas O74, Formulas O75, Formulas O76, Formulas O77, Formulas O78, Formulas O79, Formulas O80, Formulas O81 , Formulas O82, Formulas O83, Formulas O84, Formulas O85, Formulas O86, Formulas O87, Formulas O88, Formulas O89, Formulas O90, Formulas O91, Formulas O92, Formulas O93, Formulas O95, Formulas O96, Formulas O97, Formulas O98, Formulas O99, Formulas O100, Formulas O101, Formulas O102, Formulas O103, Formulas O104, Formulas O105, Formulas O106, Formulas O107, Formulas O108, Formulas O109, Formulas O110, Formulas 0111, Formulas O112, Formulas O113, Formulas O11 4, Formula O115, Formulas O116, Formulas O117, Formulas O118, Formulas O119, Formulas O120, Formulas O121, Formulas O123, Formulas O124, Formulas O125, Formulas O126, Formulas O127, Formulas O128, Formulas O129, Formulas O130, Formulas O131, O132, Formulas O133 , Formulas O134, Formulas O135, Formulas O136, Formulas O137, Formulas O138, Formulas O139, Formulas O140, Formulas O141, Formulas O142, Formulas O143, Formulas O144,O145, Formulas O146, Formulas O147, Formulas O148, Formulas O 149, Formulas O150 , Formulas O151, Formulas O152, Formulas O153, Formulas O154, Formulas O155, Formulas O156, Formulas O157, Formulas O158, Formulas O159, Formulas O160, Formulas O161, Formulas O162, Formulas O163, Formulas O164, Formulas O165, Formulas O166, Formulas O167, Formulas O168, Formulas O169, Formulas O170, Formulas O171, Formulas O172, Formulas O173, Formulas O174, Formulas O175, Formulas O176, Formulas O177, Formulas O178, Formulas O179, Formulas O180, Formulas O181, Formulas O18 2, Formulas O183, Formulas O184, Formulas O185, Formulas O186, and Formulas O187, where n is an integer between 5 and 1000.

С116. Композиция по п. С108, отличающаяся тем, что E.coli представляет собой E.coli серотипа, выбранного из группы, состоящей из: O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19, O20, O21, O22, O23, O24, O25, O25b, O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41, O42, O43, O44, O45, O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, O63, O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73, O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86, O87, O88, O89, O90, O91, O92, O93, O95, O96, O97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106, O107, O108, O109, O110, 0111, O112, O113, O114, O115, O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, O142, O143, O144,O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158, O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, O167, O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, O185, O186 и O187.C116. The composition according to claim C108, characterized in that the E. coli is an E. coli serotype selected from the group consisting of: O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12 , O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19, O20, O21, O22, O23, O24, O25, O25b, O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37 , O38, O39, O40, O41, O42, O43, O44, O45, O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, O63 , O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73, O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86, O87, O88, O89, O90 , O91, O92, O93, O95, O96, O97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106, O107, O108, O109, O110, 0111, O112, O113, O114, O115, O116 , O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, 142 , O143, O144,O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158, O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, 167 , O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, O185, O186 and O187.

С117. Композиция по п. С108, отличающаяся тем, что сахарид получают путем увеличения количества повторяющихся единиц О-полисахаридов, продуцируемых грамотрицательной бактерией в культуре, включающей сверхэкспрессию белков семейства wzz в грамотрицательной бактерии, с получением указанного сахарида.C117. The composition according to claim C108, characterized in that the saccharide is obtained by increasing the number of repeating units of O-polysaccharides produced by a gram-negative bacterium in a culture including overexpression of wzz family proteins in the gram-negative bacterium, to obtain said saccharide.

С118. Композиция по п. С117, отличающаяся тем, что сверхэкспрессированный белок семейства wzz выбран из группы, состоящей из wzzB, wzz, wzz_SF, wzz_ST, fepE, wzz_fepE, wzz1 и wzz2.C118. The composition according to claim C117, characterized in that the overexpressed protein of the wzz family is selected from the group consisting of wzzB, wzz, wzz _SF , wzz _ST , fepE, wzz _fepE , wzz1 and wzz2.

С119. Композиция по п. С117, отличающаяся тем, что белок семейства wzz со сверхэкспрессией представляет собой wzzB.C119. The composition according to claim C117, characterized in that the overexpressed wzz family protein is wzzB.

С120. Композиция по п. С117, отличающаяся тем, что сверхэкспрессированный белок семейства wzz представляет собой fepE.C120. The composition according to claim C117, characterized in that the overexpressed protein of the wzz family is fepE.

С121. Композиция по п. С117, отличающаяся тем, что сверхэкспрессированный белок семейства wzz представляет собой wzzB и fepE.C121. The composition according to claim C117, characterized in that the overexpressed wzz family protein is wzzB and fepE.

С122. Композиция по п. С108, отличающаяся тем, что сахарид синтезирован синтетическим путем.C122. Composition according to item C108, characterized in that the saccharide is synthesized synthetically.

С123. Композиция, содержащая полипептид, полученный из FimH, или его фрагмент; и конъюгат, содержащий сахарид по п. С108, ковалентно связанный с белком-носителем.C123. A composition containing a polypeptide derived from FimH, or a fragment thereof; and a conjugate containing a saccharide according to clause C108, covalently linked to a carrier protein.

С124. Композиция по п. С123, отличающаяся тем, что белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.C124. Composition according to claim C123, characterized in that the carrier protein is CRM ₁₉₇ .

С125. Композиция по п. С123, отличающаяся тем, что сахарид имеет структуру, выбранную из: Формулы O1, Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4, Формулы O5, Формулы O6, Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18, Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23, Формулы O24, Формулы O25, Формулы O25b, Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45, Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73, Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144,O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186 и Формулы O187, где n представляет собой целое число от 5 до 1000.C125. The composition according to claim C123, characterized in that the saccharide has a structure selected from: Formula O1, Formula O2, Formula O3, Formula O4, Formula O5, Formula O6, Formula O7, Formula O8, Formula O9, Formula O10, Formula O11, Formulas O12, Formulas O13, Formulas O14, Formulas O15, Formulas O16, Formulas O17, Formulas O18, Formulas O19, Formulas O20, Formulas O21, Formulas O22, Formulas O23, Formulas O24, Formulas O25, Formulas O25b, Formulas O26, Formulas O27 , Formulas O28, Formulas O29, Formulas O30, Formulas O32, Formulas O33, Formulas O34, Formulas O35, Formulas O36, Formulas O37, Formulas O38, Formulas O39, Formulas O40, Formulas O41, Formulas O42, Formulas O43, Formulas O44, Formulas O45, Formulas O46, Formulas O48, Formulas O49, Formulas O50, Formulas O51, Formulas O52, Formulas O53, Formulas O54, Formulas O55, Formulas O56, Formulas O57, Formulas O58, Formulas O59, Formulas O60, Formulas O61, Formulas O62, Formulas O63, Formulas O64, Formulas O65, Formulas O66, Formulas O68, Formulas O69, Formulas O70, Formulas O71, Formulas O73, Formulas O74, Formulas O75, Formulas O76, Formulas O77, Formulas O78, Formulas O79, Formulas O80, Formulas O81 , Formulas O82, Formulas O83, Formulas O84, Formulas O85, Formulas O86, Formulas O87, Formulas O88, Formulas O89, Formulas O90, Formulas O91, Formulas O92, Formulas O93, Formulas O95, Formulas O96, Formulas O97, Formulas O98, Formulas O99, Formulas O100, Formulas O101, Formulas O102, Formulas O103, Formulas O104, Formulas O105, Formulas O106, Formulas O107, Formulas O108, Formulas O109, Formulas O110, Formulas 0111, Formulas O112, Formulas O113, Formulas O11 4, Formula O115, Formulas O116, Formulas O117, Formulas O118, Formulas O119, Formulas O120, Formulas O121, Formulas O123, Formulas O124, Formulas O125, Formulas O126, Formulas O127, Formulas O128, Formulas O129, Formulas O130, Formulas O131, O132, Formulas O133 , Formulas O134, Formulas O135, Formulas O136, Formulas O137, Formulas O138, Formulas O139, Formulas O140, Formulas O141, Formulas O142, Formulas O143, Formulas O144,O145, Formulas O146, Formulas O147, Formulas O148, Formulas O 149, Formulas O150 , Formulas O151, Formulas O152, Formulas O153, Formulas O154, Formulas O155, Formulas O156, Formulas O157, Formulas O158, Formulas O159, Formulas O160, Formulas O161, Formulas O162, Formulas O163, Formulas O164, Formulas O165, Formulas O166, Formulas O167, Formulas O168, Formulas O169, Formulas O170, Formulas O171, Formulas O172, Formulas O173, Formulas O174, Formulas O175, Formulas O176, Formulas O177, Formulas O178, Formulas O179, Formulas O180, Formulas O181, Formulas O18 2, Formulas O183, Formulas O184, Formulas O185, Formulas O186, and Formulas O187, where n is an integer between 5 and 1000.

С126. Композиция по п. С123, отличающаяся тем, что указанный сахарид содержит увеличение, по меньшей мере, на 5 повторяющихся единиц по сравнению с соответствующим O-полисахаридом дикого типа.C126. The composition according to claim C123, characterized in that said saccharide contains an increase of at least 5 repeating units compared to the corresponding wild-type O-polysaccharide.

С127. Композиция по п. С1, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый разбавитель. C127. The composition according to claim C1, additionally containing a pharmaceutically acceptable diluent.

С128. Композиция по п. С127, дополнительно содержащая адъювант.C128. The composition according to clause C127, additionally containing an adjuvant.

С129. Композиция по п. С127, дополнительно содержащая алюминий.C129. Composition according to clause C127, additionally containing aluminum.

С130. Композиция по п. С127, дополнительно содержащая QS-21.C130. Composition according to clause C127, additionally containing QS-21.

С131. Композиция по п. С127, отличающаяся тем, что композиция не включает адъювант.C131. The composition according to claim C127, characterized in that the composition does not include an adjuvant.

С132. Способ индукции иммунного ответа у субъекта, включающий введение субъекту композиции по п. С127.C132. A method of inducing an immune response in a subject, comprising administering to the subject a composition according to claim C127.

С133. Композиция по п. С123, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый разбавитель.C133. The composition according to claim C123, additionally containing a pharmaceutically acceptable diluent.

С134. Способ индукции иммунного ответа у субъекта, включающий введение субъекту композиции по п. С133.C134. A method of inducing an immune response in a subject, comprising administering to the subject a composition according to claim C133.

С135. Способ по п. С132 или С134, отличающийся тем, что иммунный ответ включает индукцию сывороточного антитела против O-специфического полисахарида E. coli. C135. The method according to claim C132 or C134, characterized in that the immune response includes the induction of a serum antibody against the O-specific polysaccharide of E. coli.

С136. Способ по п. С135, отличающийся тем, что сывороточное антитело против O-специфического полисахарида E. coli представляет собой антитело IgG.C136. The method according to claim C135, characterized in that the serum antibody against E. coli O-specific polysaccharide is an IgG antibody.

С137. Способ по п. С135, отличающийся тем, что сывороточное антитело против O-специфического полисахарида E. coli представляет собой антитело IgG, обладающее бактерицидной активностью против E. coli. C137. The method according to claim C135, characterized in that the serum antibody against E. coli O-specific polysaccharide is an IgG antibody having bactericidal activity against E. coli.

С138. Иммуногенная композиция, содержащая полипептид, полученный из FimH, или его фрагмент; и сахарид, полученный из E. coli, конъюгированный с белком-носителем через спейсер (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбамат (eTEC), где полисахарид ковалентно связан со спейсером eTEC через карбаматную связь, и где белок-носитель ковалентно связан со спейсером eTEC через амидную связь.C138. An immunogenic composition containing a polypeptide derived from FimH, or a fragment thereof; and a saccharide derived from E. coli conjugated to a carrier protein through a spacer (2-((2-oxoethyl)thio)ethyl)carbamate (eTEC), where the polysaccharide is covalently linked to the eTEC spacer through a carbamate bond, and where the carrier protein covalently linked to the eTEC spacer via an amide bond.

С139. Иммуногенная композиция по п. С138, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель.C139. An immunogenic composition according to claim C138, further comprising a pharmaceutically acceptable excipient, carrier or diluent.

С140. Иммуногенная композиция по п. С138, отличающаяся тем, что сахарид представляет собой О-антиген, полученный из E. coli. C140. Immunogenic composition according to item C138, characterized in that the saccharide is an O-antigen obtained from E. coli.

С141. Иммуногенная композиция по п. С138, отличающаяся тем, что сахарид имеет структуру, выбранную из: Формулы O1, Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4, Формулы O5, Формулы O6, Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18, Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23, Формулы O24, Формулы O25, Формулы O25b, Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45, Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73, Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144,O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186 и Формулы O187, где n представляет собой целое число от 5 до 1000.C141. Immunogenic composition according to claim C138, characterized in that the saccharide has a structure selected from: Formula O1, Formula O2, Formula O3, Formula O4, Formula O5, Formula O6, Formula O7, Formula O8, Formula O9, Formula O10, Formula O11 , Formulas O12, Formulas O13, Formulas O14, Formulas O15, Formulas O16, Formulas O17, Formulas O18, Formulas O19, Formulas O20, Formulas O21, Formulas O22, Formulas O23, Formulas O24, Formulas O25, Formulas O25b, Formulas O26, Formulas O27, Formulas O28, Formulas O29, Formulas O30, Formulas O32, Formulas O33, Formulas O34, Formulas O35, Formulas O36, Formulas O37, Formulas O38, Formulas O39, Formulas O40, Formulas O41, Formulas O42, Formulas O43, Formulas O44, Formulas O45, Formulas O46, Formulas O48, Formulas O49, Formulas O50, Formulas O51, Formulas O52, Formulas O53, Formulas O54, Formulas O55, Formulas O56, Formulas O57, Formulas O58, Formulas O59, Formulas O60, Formulas O61, Formulas O62 , Formulas O63, Formulas O64, Formulas O65, Formulas O66, Formulas O68, Formulas O69, Formulas O70, Formulas O71, Formulas O73, Formulas O74, Formulas O75, Formulas O76, Formulas O77, Formulas O78, Formulas O79, Formulas O80, Formulas O81, Formulas O82, Formulas O83, Formulas O84, Formulas O85, Formulas O86, Formulas O87, Formulas O88, Formulas O89, Formulas O90, Formulas O91, Formulas O92, Formulas O93, Formulas O95, Formulas O96, Formulas O97, Formulas O98, Formulas O99, Formulas O100, Formulas O101, Formulas O102, Formulas O103, Formulas O104, Formulas O105, Formulas O106, Formulas O107, Formulas O108, Formulas O109, Formulas O110, Formulas 0111, Formulas O112, Formulas O113, O114, Formulas O115 , Formulas O116, Formulas O117, Formulas O118, Formulas O119, Formulas O120, Formulas O121, Formulas O123, Formulas O124, Formulas O125, Formulas O126, Formulas O127, Formulas O128, Formulas O129, Formulas O130, Formulas O131, Formulas O132, Formulas O133, Formulas O134, Formulas O135, Formulas O136, Formulas O137, Formulas O138, Formulas O139, Formulas O140, Formulas O141, Formulas O142, Formulas O143, Formulas O144, O145, Formulas O146, Formulas O147, Formulas O148, Formulas O149, Formulas O150, Formulas O151, Formulas O152, Formulas O153, Formulas O154, Formulas O155, Formulas O156, Formulas O157, Formulas O158, Formulas O159, Formulas O160, Formulas O161, Formulas O162, Formulas O163, Formulas O164, Formulas O16 5, Formulas O166, Formulas O167, Formulas O168, Formulas O169, Formulas O170, Formulas O171, Formulas O172, Formulas O173, Formulas O174, Formulas O175, Formulas O176, Formulas O177, Formulas O178, Formulas O179, Formulas O180, Formulas O181, O182, Formulas O183 , Formulas O184, Formulas O185, Formulas O186, and Formulas O187, where n is an integer between 5 and 1000.

С142. Иммуногенная композиция по п. С138, отличающаяся тем, что сахарид имеет степень O-ацетилирования от 75 до 100%.C142. Immunogenic composition according to item C138, characterized in that the saccharide has a degree of O-acetylation from 75 to 100%.

С143. Иммуногенная композиция по п. С138, отличающаяся тем, что белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.C143. Immunogenic composition according to item C138, characterized in that the carrier protein is CRM ₁₉₇ .

С144. Иммуногенная композиция по п. С143, отличающаяся тем, что CRM₁₉₇ содержит от 2 до 20 лизиновых остатков, ковалентно связанных с полисахаридом через спейсер eTEC.C144. An immunogenic composition according to item C143, characterized in that CRM ₁₉₇ contains from 2 to 20 lysine residues covalently linked to the polysaccharide through the eTEC spacer.

С145. Иммуногенная композиция по п. С143, отличающаяся тем, что CRM₁₉₇ содержит от 4 до 16 лизиновых остатков, ковалентно связанных с полисахаридом через спейсер eTEC.C145. An immunogenic composition according to item C143, characterized in that CRM ₁₉₇ contains from 4 to 16 lysine residues covalently linked to the polysaccharide through the eTEC spacer.

С146. Иммуногенная композиция по п. С138, дополнительно содержащая дополнительный антиген.C146. Immunogenic composition according to clause C138, additionally containing an additional antigen.

С147. Иммуногенная композиция по п. С138, дополнительно содержащая адъювант.C147. Immunogenic composition according to clause C138, additionally containing an adjuvant.

С148. Иммуногенная композиция по п. С147, отличающаяся тем, что адъювант представляет собой адъювант на основе алюминия, выбранный из группы, состоящей из фосфата алюминия, сульфата алюминия и гидроксида алюминия.C148. An immunogenic composition according to claim C147, characterized in that the adjuvant is an aluminum-based adjuvant selected from the group consisting of aluminum phosphate, aluminum sulfate and aluminum hydroxide.

С149. Иммуногенная композиция по п. С138, отличающаяся тем, что композиция не содержит адъювант.C149. Immunogenic composition according to item C138, characterized in that the composition does not contain an adjuvant.

С150. Иммуногенная композиция, содержащая полипептид, полученный из FimH, или его фрагмент; и гликоконъюгат, содержащий сахарид, полученный из E. coli, конъюгированный с белком-носителем, где гликоконъюгат получают с использованием восстановительного аминирования. C150. An immunogenic composition containing a polypeptide derived from FimH, or a fragment thereof; and a glycoconjugate containing a saccharide derived from E. coli conjugated to a carrier protein, wherein the glycoconjugate is produced using reductive amination.

С151. Иммуногенная композиция по п. С150, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель.C151. The immunogenic composition of claim C150, further comprising a pharmaceutically acceptable excipient, carrier or diluent.

С152. Иммуногенная композиция по п. С150, отличающаяся тем, что сахарид представляет собой О-антиген, полученный из E. coli. C152. Immunogenic composition according to claim C150, characterized in that the saccharide is an O-antigen obtained from E. coli.

С153. Иммуногенная композиция по п. С150, отличающаяся тем, что сахарид имеет структуру, выбранную из: Формулы O1, Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4, Формулы O5, Формулы O6, Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18, Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23, Формулы O24, Формулы O25, Формулы O25b, Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45, Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73, Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144,O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186 и Формулы O187, где n представляет собой целое число от 5 до 1000.C153. Immunogenic composition according to claim C150, characterized in that the saccharide has a structure selected from: Formula O1, Formula O2, Formula O3, Formula O4, Formula O5, Formula O6, Formula O7, Formula O8, Formula O9, Formula O10, Formula O11 , Formulas O12, Formulas O13, Formulas O14, Formulas O15, Formulas O16, Formulas O17, Formulas O18, Formulas O19, Formulas O20, Formulas O21, Formulas O22, Formulas O23, Formulas O24, Formulas O25, Formulas O25b, Formulas O26, Formulas O27, Formulas O28, Formulas O29, Formulas O30, Formulas O32, Formulas O33, Formulas O34, Formulas O35, Formulas O36, Formulas O37, Formulas O38, Formulas O39, Formulas O40, Formulas O41, Formulas O42, Formulas O43, Formulas O44, Formulas O45, Formulas O46, Formulas O48, Formulas O49, Formulas O50, Formulas O51, Formulas O52, Formulas O53, Formulas O54, Formulas O55, Formulas O56, Formulas O57, Formulas O58, Formulas O59, Formulas O60, Formulas O61, Formulas O62 , Formulas O63, Formulas O64, Formulas O65, Formulas O66, Formulas O68, Formulas O69, Formulas O70, Formulas O71, Formulas O73, Formulas O74, Formulas O75, Formulas O76, Formulas O77, Formulas O78, Formulas O79, Formulas O80, Formulas O81, Formulas O82, Formulas O83, Formulas O84, Formulas O85, Formulas O86, Formulas O87, Formulas O88, Formulas O89, Formulas O90, Formulas O91, Formulas O92, Formulas O93, Formulas O95, Formulas O96, Formulas O97, Formulas O98, Formulas O99, Formulas O100, Formulas O101, Formulas O102, Formulas O103, Formulas O104, Formulas O105, Formulas O106, Formulas O107, Formulas O108, Formulas O109, Formulas O110, Formulas 0111, Formulas O112, Formulas O113, O114, Formulas O115 , Formulas O116, Formulas O117, Formulas O118, Formulas O119, Formulas O120, Formulas O121, Formulas O123, Formulas O124, Formulas O125, Formulas O126, Formulas O127, Formulas O128, Formulas O129, Formulas O130, Formulas O131, Formulas O132, Formulas O133, Formulas O134, Formulas O135, Formulas O136, Formulas O137, Formulas O138, Formulas O139, Formulas O140, Formulas O141, Formulas O142, Formulas O143, Formulas O144, O145, Formulas O146, Formulas O147, Formulas O148, Formulas O149, Formulas O150, Formulas O151, Formulas O152, Formulas O153, Formulas O154, Formulas O155, Formulas O156, Formulas O157, Formulas O158, Formulas O159, Formulas O160, Formulas O161, Formulas O162, Formulas O163, Formulas O164, Formulas O16 5, Formulas O166, Formulas O167, Formulas O168, Formulas O169, Formulas O170, Formulas O171, Formulas O172, Formulas O173, Formulas O174, Formulas O175, Formulas O176, Formulas O177, Formulas O178, Formulas O179, Formulas O180, Formulas O181, O182, Formulas O183 , Formulas O184, Formulas O185, Formulas O186, and Formulas O187, where n is an integer between 5 and 1000.

С154. Иммуногенная композиция по п. С150, отличающаяся тем, что сахарид имеет степень O-ацетилирования от 75 до 100%.C154. Immunogenic composition according to item C150, characterized in that the saccharide has a degree of O-acetylation from 75 to 100%.

С155. Иммуногенная композиция по п. С150, отличающаяся тем, что белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.C155. Immunogenic composition according to item C150, characterized in that the carrier protein is CRM ₁₉₇ .

С156. Иммуногенная композиция по п. С150, дополнительно содержащая дополнительный антиген.C156. Immunogenic composition according to clause C150, additionally containing an additional antigen.

С157. Иммуногенная композиция по п. С150, дополнительно содержащая адъювант.C157. Immunogenic composition according to clause C150, additionally containing an adjuvant.

С158. Иммуногенная композиция по п. С157, отличающаяся тем, что адъювант представляет собой адъювант на основе алюминия, выбранный из группы, состоящей из фосфата алюминия, сульфата алюминия и гидроксида алюминия.C158. The immunogenic composition according to claim C157, characterized in that the adjuvant is an aluminum-based adjuvant selected from the group consisting of aluminum phosphate, aluminum sulfate and aluminum hydroxide.

С159. Иммуногенная композиция по п. С150, отличающаяся тем, что композиция не содержит адъювант.C159. An immunogenic composition according to claim C150, characterized in that the composition does not contain an adjuvant.

С160. Способ индукции иммунного ответа у субъекта, включающий введение субъекту композиции по любому из пп. С138-С159.C160. A method of inducing an immune response in a subject, comprising administering to the subject a composition according to any one of claims. C138-C159.

С161. Способ по п. С160, отличающийся тем, что иммунный ответ включает индукцию сывороточного антитела, специфичного к O-специфическому полисахариду E. coli. C161. The method according to claim C160, characterized in that the immune response includes the induction of a serum antibody specific for the O-specific polysaccharide of E. coli.

С162. Способ по п. С135, отличающийся тем, что сывороточное антитело против O-специфического полисахарида E. coli представляет собой антитело IgG.C162. The method according to claim C135, characterized in that the serum antibody against E. coli O-specific polysaccharide is an IgG antibody.

С163. Способ по п. С135, отличающийся тем, что сывороточное антитело против O-специфического полисахарида E. coli представляет собой антитело IgG, обладающее бактерицидной активностью против E. coli. C163. The method according to claim C135, characterized in that the serum antibody against E. coli O-specific polysaccharide is an IgG antibody having bactericidal activity against E. coli.

С164. Композиция, содержащая полипептид, полученный из FimH, или его фрагмент; и сахарид, имеющий структуру, выбранную из Формулы O1, Формулы O1A, Формулы O1B, Формулы O1C, Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4, Формулы O4:K52, Формулы O4:K6, Формулы O5, Формулы O5ab, Формулы O5ac, Формулы O6, Формулы O6:K2; K13; K15, Формулы O6:K54, Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B, Формулы O18B1, Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23, Формулы O23A, Формулы O24, Формулы O25, Формулы O25a, Формулы O25b, Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45, Формулы O45, Формулы O45rel, Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы 62D₁, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73, Формулы O73, Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186, Формулы O187, где n больше, чем число повторяющихся единиц в соответствующем полисахариде E. coli дикого типа.C164. A composition containing a polypeptide derived from FimH, or a fragment thereof; and a saccharide having a structure selected from Formula O1, Formula O1A, Formula O1B, Formula O1C, Formula O2, Formula O3, Formula O4, Formula O4:K52, Formula O4:K6, Formula O5, Formula O5ab, Formula O5ac, Formula O6 , Formulas O6:K2; K13; K15, Formulas O6:K54, Formulas O7, Formulas O8, Formulas O9, Formulas O10, Formulas O11, Formulas O12, Formulas O13, Formulas O14, Formulas O15, Formulas O16, Formulas O17, Formulas O18, Formulas O18A, Formulas O18ac, Formulas O18A1, Formulas O18B, Formulas O18B1, Formulas O19, Formulas O20, Formulas O21, Formulas O22, Formulas O23, Formulas O23A, Formulas O24, Formulas O25, Formulas O25a, Formulas O25b, Formulas O26, Formulas O27, Formulas O28, Formulas O29 , Formulas O30, Formulas O32, Formulas O33, Formulas O34, Formulas O35, Formulas O36, Formulas O37, Formulas O38, Formulas O39, Formulas O40, Formulas O41, Formulas O42, Formulas O43, Formulas O44, Formulas O45, Formulas O45, Formulas O45rel , Formulas O46, Formulas O48, Formulas O49, Formulas O50, Formulas O51, Formulas O52, Formulas O53, Formulas O54, Formulas O55, Formulas O56, Formulas O57, Formulas O58, Formulas O59, Formulas O60, Formulas O61, Formulas O62, Formulas 62D ₁ , Formulas O63, Formulas O64, Formulas O65, Formulas O66, Formulas O68, Formulas O69, Formulas O70, Formulas O71, Formulas O73, Formulas O73, Formulas O74, Formulas O75, Formulas O76, Formulas O77, Formulas O78, Formulas O79 , Formulas O80, Formulas O81, Formulas O82, Formulas O83, Formulas O84, Formulas O85, Formulas O86, Formulas O87, Formulas O88, Formulas O89, Formulas O90, Formulas O91, Formulas O92, Formulas O93, Formulas O95, Formulas O96, Formulas O97, Formulas O98, Formulas O99, Formulas O100, Formulas O101, Formulas O102, Formulas O103, Formulas O104, Formulas O105, Formulas O106, Formulas O107, Formulas O108, Formulas O109, Formulas O110, Formulas 0111, Formulas O112, Formulas O113, Formulas O114, Formulas O115, Formulas O116, Formulas O117, Formulas O118, Formulas O119, Formulas O120, Formulas O121, Formulas O123, Formulas O124, Formulas O126, Formulas O127, Formulas O128, Formulas O129, O130, Formulas O131 , Formulas O132, Formulas O133, Formulas O134, Formulas O135, Formulas O136, Formulas O137, Formulas O138, Formulas O139, Formulas O140, Formulas O141, Formulas O142, Formulas O143, Formulas O144, Formulas O145, Formulas O146, Formulas O147, Formulas O148, Formulas O149, Formulas O150, Formulas O151, Formulas O152, Formulas O153, Formulas O154, Formulas O155, Formulas O156, Formulas O157, Formulas O158, Formulas O159, Formulas O160, Formulas O161, Formulas O162, Formulas O16 3, Formulas O164, Formulas O165, Formulas O166, Formulas O167, Formulas O168, Formulas O169, Formulas O170, Formulas O171, Formulas O172, Formulas O173, Formulas O174, Formulas O175, Formulas O176, Formulas O177, Formulas O178, Formulas O179, O180, Formulas O181 , Formulas O182, Formulas O183, Formulas O184, Formulas O185, Formulas O186, Formulas O187, where n is greater than the number of repeat units in the corresponding wild-type E. coli polysaccharide.

С165. Композиция по п. С164, где n представляет собой целое число от 31 до 100.C165. The composition according to claim C164, where n is an integer from 31 to 100.

С166. Композиция по п. С164, отличающаяся тем, что сахарид имеет структуру, соответствующую любой из Формулы O1A, Формулы O1B и Формулы O1C, Формулы O2, Формулы O6 и Формулы O25B.C166. The composition according to claim C164, characterized in that the saccharide has a structure corresponding to any of Formula O1A, Formula O1B and Formula O1C, Formula O2, Formula O6 and Formula O25B.

С167. Композиция по п. С164, отличающаяся тем, что сахарид продуцируется в рекомбинантной клетке-хозяине, которая экспрессирует белок семейства wzz, имеющий по меньшей мере, 90% идентичность последовательности любой из SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39.C167. The composition of claim C164, wherein the saccharide is produced in a recombinant host cell that expresses a wzz family protein having at least 90% sequence identity to any of SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 39.

С168. Композиция по п. С167, отличающаяся тем, что белок содержит любую из SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34.C168. The composition according to claim C167, characterized in that the protein contains any of SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34.

С169. Сахарид по п. С164, отличающийся тем, что сахарид синтезирован синтетическим путем.C169. Saccharide according to item C164, characterized in that the saccharide is synthesized synthetically.

С170. Композиция, содержащая полипептид, полученный из FimH, или его фрагмент; и конъюгат, содержащий белок-носитель, ковалентно связанный с сахаридом, где указанный сахарид имеет структуру, выбранную из Формулы O1, Формулы O1A, Формулы O1B, Формулы O1C, Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4, Формулы O4:K52, Формулы O4:K6, Формулы O5, Формулы O5ab, Формулы O5ac, Формулы O6, Формулы O6:K2; K13; K15, Формулы O6:K54, Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B, Формулы O18B1, Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23, Формулы O23A, Формулы O24, Формулы O25, Формулы O25a, Формулы O25b, Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45, Формулы O45, Формулы O45rel, Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы 62D₁, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73, Формулы O73, Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186, Формулы O187, где n представляет собой целое число от 1 до 100.C170. A composition containing a polypeptide derived from FimH, or a fragment thereof; and a conjugate containing a carrier protein covalently linked to a saccharide, wherein said saccharide has a structure selected from Formula O1, Formula O1A, Formula O1B, Formula O1C, Formula O2, Formula O3, Formula O4, Formula O4:K52, Formula O4: K6, Formulas O5, Formulas O5ab, Formulas O5ac, Formulas O6, Formulas O6:K2; K13; K15, Formulas O6:K54, Formulas O7, Formulas O8, Formulas O9, Formulas O10, Formulas O11, Formulas O12, Formulas O13, Formulas O14, Formulas O15, Formulas O16, Formulas O17, Formulas O18, Formulas O18A, Formulas O18ac, Formulas O18A1, Formulas O18B, Formulas O18B1, Formulas O19, Formulas O20, Formulas O21, Formulas O22, Formulas O23, Formulas O23A, Formulas O24, Formulas O25, Formulas O25a, Formulas O25b, Formulas O26, Formulas O27, Formulas O28, Formulas O29 , Formulas O30, Formulas O32, Formulas O33, Formulas O34, Formulas O35, Formulas O36, Formulas O37, Formulas O38, Formulas O39, Formulas O40, Formulas O41, Formulas O42, Formulas O43, Formulas O44, Formulas O45, Formulas O45, Formulas O45rel , Formulas O46, Formulas O48, Formulas O49, Formulas O50, Formulas O51, Formulas O52, Formulas O53, Formulas O54, Formulas O55, Formulas O56, Formulas O57, Formulas O58, Formulas O59, Formulas O60, Formulas O61, Formulas O62, Formulas 62D ₁ , Formulas O63, Formulas O64, Formulas O65, Formulas O66, Formulas O68, Formulas O69, Formulas O70, Formulas O71, Formulas O73, Formulas O73, Formulas O74, Formulas O75, Formulas O76, Formulas O77, Formulas O78, Formulas O79 , Formulas O80, Formulas O81, Formulas O82, Formulas O83, Formulas O84, Formulas O85, Formulas O86, Formulas O87, Formulas O88, Formulas O89, Formulas O90, Formulas O91, Formulas O92, Formulas O93, Formulas O95, Formulas O96, Formulas O97, Formulas O98, Formulas O99, Formulas O100, Formulas O101, Formulas O102, Formulas O103, Formulas O104, Formulas O105, Formulas O106, Formulas O107, Formulas O108, Formulas O109, Formulas O110, Formulas 0111, Formulas O112, Formulas O113, Formulas O114, Formulas O115, Formulas O116, Formulas O117, Formulas O118, Formulas O119, Formulas O120, Formulas O121, Formulas O123, Formulas O124, Formulas O126, Formulas O127, Formulas O128, Formulas O129, O130, Formulas O131 , Formulas O132, Formulas O133, Formulas O134, Formulas O135, Formulas O136, Formulas O137, Formulas O138, Formulas O139, Formulas O140, Formulas O141, Formulas O142, Formulas O143, Formulas O144, Formulas O145, Formulas O146, Formulas O147, Formulas O148, Formulas O149, Formulas O150, Formulas O151, Formulas O152, Formulas O153, Formulas O154, Formulas O155, Formulas O156, Formulas O157, Formulas O158, Formulas O159, Formulas O160, Formulas O161, Formulas O162, Formulas O16 3, Formulas O164, Formulas O165, Formulas O166, Formulas O167, Formulas O168, Formulas O169, Formulas O170, Formulas O171, Formulas O172, Formulas O173, Formulas O174, Formulas O175, Formulas O176, Formulas O177, Formulas O178, Formulas O179, O180, Formulas O181 , Formulas O182, Formulas O183, Formulas O184, Formulas O185, Formulas O186, Formulas O187, where n is an integer from 1 to 100.

С171. Композиция по п. С170, отличающаяся тем, что сахарид включает любую из следующих Формулы O25b, Формулы O1A, Формулы O2 и Формулы O6.C171. The composition of claim C170, wherein the saccharide comprises any of the following Formula O25b, Formula O1A, Formula O2 and Formula O6.

С172. Композиция по п. С170, отличающаяся тем, что сахарид дополнительно содержит любой из группы R1 E. coli, группы R2 E. coli, группы R3 E. coli, группы R4 E. coli и группы K-12 E. coli. C172. The composition of claim C170, wherein the saccharide further comprises any one of E. coli group R1, E. coli group R2, E. coli group R3, E. coli group R4 and E. coli group K-12.

С173. Композиция по п. С170, отличающаяся тем, что сахарид дополнительно не содержит какой-либо из группы R1 E. coli, группы R2 E. coli, группы R3 E. coli, группы R4 E. coli и группы K-12 E. coli. Композиция по п. С170, отличающаяся тем, что сахарид дополнительно не содержит группу R2 E. coli. C173. The composition according to claim C170, wherein the saccharide further does not contain any of E. coli group R1, E. coli group R2, E. coli group R3, E. coli group R4 and E. coli group K-12. The composition according to claim C170, characterized in that the saccharide additionally does not contain the R2 group of E. coli.

С174. Композиция по п. С170, отличающаяся тем, что сахарид дополнительно содержит фрагмент 3-дезокси-d-манно-окт-2-улозоновой кислоты (KDO).C174. The composition according to item C170, characterized in that the saccharide additionally contains a fragment of 3-deoxy-d-manno-oct-2-ulosonic acid (KDO).

С175. Композиция по п. С170, отличающаяся тем, что белок-носитель выбран из любого из CRM₁₉₇, группы B дифтерийного токсина (DTFB), DTFB C8, дифтерийного анатоксина (DT), столбнячного анатоксина (TT), фрагмента C TT, коклюшного анатоксина, холерного анатоксина или экзотоксина А из Pseudomonas aeruginosa; детоксицированного экзотоксина A P. aeruginosa (EPA), белка, связывающего мальтозу (MBP), детоксицированного гемолизина A S. aureus, фактора слипания A, фактора слипания B, субъединицы холерного токсина B (CTB), пневмолизина Streptococcus pneumoniae и его детоксицированных вариантов, AcrA C. jejuni, природных гликопротеинов C. jejuni.C175. The composition of claim C170, wherein the carrier protein is selected from any of CRM ₁₉₇ , diphtheria toxoid group B (DTFB), DTFB C8, diphtheria toxoid (DT), tetanus toxoid (TT), TT fragment C, pertussis toxoid, cholera toxoid or exotoxin A from Pseudomonas aeruginosa; detoxified P. aeruginosa exotoxin A (EPA), maltose binding protein (MBP), detoxified S. aureus hemolysin A, clumping factor A, clumping factor B, cholera toxin subunit B (CTB), Streptococcus pneumoniae pneumolysin and its detoxified variants, AcrA C. jejuni , natural glycoproteins of C. jejuni .

С176. Композиция по п. С170, отличающаяся тем, что белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.C176. Composition according to claim C170, characterized in that the carrier protein is CRM ₁₉₇ .

С177. Композиция по п. С170, отличающаяся тем, что белок-носитель представляет собой столбнячный анатоксин.C177. The composition according to claim C170, characterized in that the carrier protein is a tetanus toxoid.

С178. Композиция по п. С170, отличающаяся тем, что отношение сахарида к белку составляет от, по меньшей мере, 0,5 до не более 2.C178. Composition according to claim C170, characterized in that the saccharide to protein ratio is from at least 0.5 to at most 2.

С179. Композиция по п. С170, отличающаяся тем, что конъюгат получен восстановительным аминированием.C179. Composition according to item C170, characterized in that the conjugate is obtained by reductive amination.

С180. Композиция по п. С170, отличающаяся тем, что сахарид конъюгирован с белком-носителем через спейсер (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбамат (eTEC).C180. The composition according to claim C170, characterized in that the saccharide is conjugated to a carrier protein through a spacer (2-((2-oxoethyl)thio)ethyl)carbamate (eTEC).

С181. Композиция по п. С170, отличающаяся тем, что сахарид представляет собой односторонне-связанный конъюгированный сахарид.C181. The composition according to claim C170, characterized in that the saccharide is a one-way linked conjugated saccharide.

С182. Композиция по п. С174, отличающаяся тем, что сахарид конъюгирован с белком-носителем через остаток 3-дезокси-d-манно-окт-2-улозоновой кислоты (KDO).C182. The composition according to item C174, characterized in that the saccharide is conjugated to the carrier protein through a 3-deoxy-d-manno-oct-2-ulosonic acid (KDO) residue.

С183. Композиция по п. С170, отличающаяся тем, что конъюгат получают с помощью химии CDAP.C183. Composition according to claim C170, characterized in that the conjugate is obtained using CDAP chemistry.

С184. Композиция, содержащая полипептид, полученный из FimH, или его фрагмент; и (а) конъюгат, содержащий белок-носитель, ковалентно связанный с сахаридом, включающим Формулу O25b, где n представляет собой целое число от 31 до 90, (b) конъюгат, содержащий белок-носитель, ковалентно связанный с сахаридом, включающим Формулу O1A, где n представляет собой целое число от 31 до 90, (c) конъюгат, содержащий белок-носитель, ковалентно связанный с сахаридом, включающим Формулу O2, где n представляет собой целое число от 31 до 90, и (d) конъюгат, содержащий белок-носитель, ковалентно связанный с сахаридом, включающим Формулу O6, где n представляет собой целое число от 31 до 90.C184. A composition containing a polypeptide derived from FimH, or a fragment thereof; and (a) a conjugate comprising a carrier protein covalently linked to a saccharide comprising Formula O25b, wherein nis an integer from 31 to 90, (b) a conjugate containing a carrier protein covalently linked to a saccharide comprising Formula O1A, where nis an integer from 31 to 90, (c) a conjugate containing a carrier protein covalently linked to a saccharide comprising Formula O2, where nis an integer from 31 to 90, and (d) a conjugate containing a carrier protein covalently linked to a saccharide comprising Formula O6, Where nrepresents an integer from 31 to 90.

С185. Композиция по п. С184, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий белок-носитель, ковалентно связанный с сахаридом, имеющий структуру, выбранную из любой из следующих: Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18 и Формулы O75, где n представляет собой целое число от 31 до 90.C185. The composition of claim C184, further comprising a conjugate comprising a carrier protein covalently linked to a saccharide having a structure selected from any of the following: Formula O15, Formula O16, Formula O17, Formula O18 and Formula O75, where n is an integer from 31 to 90.

С186. Композиция по п. С184, содержащая не более 25% свободного сахарида по сравнению с общим количеством сахарида в композиции. C186. The composition according to claim C184, containing no more than 25% free saccharide compared to the total amount of saccharide in the composition.

С187. Способ индукции иммунного ответа против Escherichia coli у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества композиции по любому из пп. С184-С186.C187. A method of inducing an immune response against Escherichia coli in a mammal, comprising administering to the mammal an effective amount of a composition according to any one of claims. C184-C186.

С188. Способ по п. С187, отличающийся тем, что иммунный ответ включает опсонофагоцитарные антитела против E. coli. C188. The method according to claim C187, characterized in that the immune response includes opsonophagocytic antibodies against E. coli.

С189. Способ по п. С187, отличающийся тем, что иммунный ответ защищает млекопитающее от инфекции E. coli. C189. The method of claim C187, wherein the immune response protects the mammal from E. coli infection.

С190. Клетка млекопитающего, содержащая (а) первый представляющий интерес ген, кодирующий полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент, где ген интегрирован, по меньшей мере, между двумя сайтами-мишенями рекомбинации (RTS).C190. A mammalian cell containing (a) a first gene of interest encoding a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof, wherein the gene is integrated between at least two recombination target sites (RTS).

С191. Вариант осуществления по п. С190, отличающийся тем, что два RTS являются хромосомно интегрированными в локус NL1 или локус NL2.C191. The embodiment of claim C190, wherein the two RTS are chromosomally integrated into the NL1 locus or the NL2 locus.

С192. Вариант осуществления по п. С190, отличающийся тем, что первый представляющий интерес ген дополнительно содержит репортерный ген, ген, кодирующий трудно экспрессируемый белок, вспомогательный ген или их комбинацию.C192. The embodiment of claim C190, wherein the first gene of interest further comprises a reporter gene, a gene encoding a difficult to express protein, an accessory gene, or a combination thereof.

С193. Вариант осуществления по п. С190, дополнительно содержащий второй представляющий интерес ген, интегрированный во второй хромосомный локус, отличный от локуса (a), где второй представляющий интерес ген содержит репортерный ген, ген, кодирующий трудно экспрессируемый белок, вспомогательный ген или их комбинацию.C193. The embodiment of claim C190, further comprising a second gene of interest integrated into a second chromosomal locus other than locus (a), wherein the second gene of interest comprises a reporter gene, a gene encoding a difficult to express protein, an accessory gene, or a combination thereof.

С194. Рекомбинантная клетка млекопитающего, содержащая полинуклеотид, кодирующий полипептид, полученный из E. coli, или его фрагмент.C194. A recombinant mammalian cell containing a polynucleotide encoding a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof.

С195. Рекомбинантная клетка по С194, отличающаяся тем, что полипептид получен из фимбриального H E. coli (FimH).C195. A recombinant cell at C194, characterized in that the polypeptide is derived from E. coli fimbrial H (FimH).

С196. Рекомбинантная клетка по С195, отличающаяся тем, что полипептид содержит остаток фенилаланина на N-конце полипептида.C196. Recombinant cell according to C195, characterized in that the polypeptide contains a phenylalanine residue at the N-terminus of the polypeptide.

С197. Рекомбинантная клетка по С195, отличающаяся тем, что полипептид содержит остаток фенилаланина в пределах первых 20 положений остатков на N-конце.C197. A recombinant cell at C195, characterized in that the polypeptide contains a phenylalanine residue within the first 20 residue positions at the N-terminus.

С198. Рекомбинантная клетка по С195, отличающаяся тем, что полипептид содержит остаток фенилаланина в положении 1 полипептида.C198. Recombinant cell according to C195, characterized in that the polypeptide contains a phenylalanine residue in position 1 of the polypeptide.

С199. Рекомбинантная клетка по С198, отличающаяся тем, что полипептид не содержит глициновый остаток непосредственно перед фенилаланиновым остатком в положении 1 полипептида.C199. A recombinant cell according to C198, characterized in that the polypeptide does not contain a glycine residue immediately before the phenylalanine residue at position 1 of the polypeptide.

С200. Рекомбинантная клетка по С195, отличающаяся тем, что полипептид не содержит сайт N-гликозилирования в положении 7 полипептида.S200. A recombinant cell according to C195, characterized in that the polypeptide does not contain an N-glycosylation site at position 7 of the polypeptide.

С201. Рекомбинантная клетка по С199, где полипептид не содержит остаток Asn в положении 7 полипептида.S201. A recombinant cell at C199, where the polypeptide does not contain an Asn residue at position 7 of the polypeptide.

С202. Рекомбинантная клетка по C201, отличающаяся тем, что полипептид содержит остаток, выбранный из группы, состоящей из Ser, Asp, Thr и Gln в положении 7.S202. A recombinant cell according to C201, characterized in that the polypeptide contains a residue selected from the group consisting of Ser, Asp, Thr and Gln at position 7.

С203. Рекомбинантная клетка по С198, отличающаяся тем, что полипептид не содержит сайт N-гликозилирования в положении 70 полипептида.S203. A recombinant cell according to C198, characterized in that the polypeptide does not contain an N-glycosylation site at position 70 of the polypeptide.

С204. Рекомбинантная клетка по C203, отличающаяся тем, что полипептид не содержит остаток Asn в положении 70 полипептида.S204. A recombinant cell according to C203, characterized in that the polypeptide does not contain an Asn residue at position 70 of the polypeptide.

С205. Рекомбинантная клетка по C203, где полипептид не содержит остаток Ser в положении 70 полипептида.S205. A recombinant cell at C203, where the polypeptide does not contain a Ser residue at position 70 of the polypeptide.

С206. Рекомбинантная клетка по C194, отличающаяся тем, что полипептид содержит замену остатка, выбранного из группы, состоящей из Ser, Asp, Thr и Gln в сайте N-гликозилирования полипептида.S206. A recombinant cell at C194, characterized in that the polypeptide contains a substitution of a residue selected from the group consisting of Ser, Asp, Thr and Gln at the N-glycosylation site of the polypeptide.

С207. Рекомбинантная клетка по С206, где сайт N-гликозилирования содержит положение N235 полипептида.S207. Recombinant cell at C206, where the N-glycosylation site contains the N235 position of the polypeptide.

С208. Рекомбинантная клетка по С206, где сайт N-гликозилирования содержит положение N228 полипептида.S208. Recombinant cell at C206, where the N-glycosylation site contains the N228 position of the polypeptide.

С209. Рекомбинантная клетка по С206, отличающаяся тем, что сайт N-гликозилирования содержит положения N235 и положения N228 полипептида.S209. A recombinant cell at C206, characterized in that the N-glycosylation site contains positions N235 and positions N228 of the polypeptide.

С210. Рекомбинантная клетка по C195, отличающаяся тем, что полипептид содержит SEQ ID NO: 3.S210. A recombinant cell at C195, characterized in that the polypeptide contains SEQ ID NO: 3.

С211. Рекомбинантная клетка по C195, отличающаяся тем, что полипептид содержит SEQ ID NO: 2.S211. A recombinant cell at C195, characterized in that the polypeptide contains SEQ ID NO: 2.

С212. Рекомбинантная клетка по С194, отличающаяся тем, что полипептид содержит алифатический гидрофобный аминокислотный остаток в положении 1 полипептида.S212. Recombinant cell according to C194, characterized in that the polypeptide contains an aliphatic hydrophobic amino acid residue at position 1 of the polypeptide.

С213. Рекомбинантная клетка по C212, отличающаяся тем, что алифатический гидрофобный аминокислотный остаток выбран из группы, состоящей из Ile, Leu и Val.C213. A recombinant cell at C212, characterized in that the aliphatic hydrophobic amino acid residue is selected from the group consisting of Ile, Leu and Val.

С214. Рекомбинантная клетка по C194, где полипептид содержит фрагмент FimH.C214. Recombinant cell at C194, where the polypeptide contains the FimH fragment.

С215. Рекомбинантная клетка по C214, отличающаяся тем, что полипептид содержит лектиновый домен FimH.C215. A recombinant cell at C214, characterized in that the polypeptide contains the FimH lectin domain.

С216. Рекомбинантная клетка по C215, отличающаяся тем, что лектиновый домен имеет массу примерно 17022 дальтон.C216. A recombinant cell at C215, characterized in that the lectin domain has a mass of approximately 17,022 daltons.

С217. Рекомбинантная клетка по С194, где полипептид находится в комплексе с полипептидом FimC или его фрагментом.C217. Recombinant cell at C194, where the polypeptide is in complex with the FimC polypeptide or its fragment.

С218. Рекомбинантная клетка по C217, отличающаяся тем, что полипептид FimC или его фрагмент содержит глициновый остаток в положении 37 полипептида FimC или его группы.C218. A recombinant cell according to C217, characterized in that the FimC polypeptide or a fragment thereof contains a glycine residue at position 37 of the FimC polypeptide or a group thereof.

С219. Рекомбинантная клетка по С195, где полипептид находится в конформации с низким сродством.C219. Recombinant cell at C195, where the polypeptide is in a low-affinity conformation.

С220. Рекомбинантная клетка по С195, отличающаяся тем, что полипептид стабилизирован с помощью FimG.C220. Recombinant cell according to C195, characterized in that the polypeptide is stabilized with FimG.

С221. Рекомбинантная клетка по C195, где полипептид стабилизирован пептидом донорной цепи FimG (DsG).C221. Recombinant cell at C195, where the polypeptide is stabilized by the donor chain peptide FimG (DsG).

С222. Рекомбинантная клетка по C221, отличающаяся тем, что полинуклеотидная последовательность дополнительно кодирует линкерную последовательность.C222. A recombinant cell according to C221, characterized in that the polynucleotide sequence additionally encodes a linker sequence.

С223. Рекомбинантная клетка по C222, отличающаяся тем, что линкер содержит, по меньшей мере, 4 аминокислотных остатка и не более 15 аминокислотных остатков.C223. Recombinant cell according to C222, characterized in that the linker contains at least 4 amino acid residues and no more than 15 amino acid residues.

С224. Рекомбинантная клетка по C222, отличающаяся тем, что линкер содержит, по меньшей мере, 5 аминокислотных остатков и не более 10 аминокислотных остатков.C224. A recombinant cell according to C222, characterized in that the linker contains at least 5 amino acid residues and no more than 10 amino acid residues.

С225. Рекомбинантная клетка по C222, отличающаяся тем, что линкер содержит 7 аминокислотных остатков.C225. Recombinant cell according to C222, characterized in that the linker contains 7 amino acid residues.

С226. Рекомбинантная клетка по C194, отличающаяся тем, что полипептид не содержит сигнальный пептид, выбранный из группы, состоящей из нативного лидерного пептида FimH, сигнального пептида гемагглютинина гриппа и сигнального пептида слияния гликопротеина F0 респираторно-синцитиального вируса A (штамм A2) человека.C226. A recombinant cell according to C194, characterized in that the polypeptide does not contain a signal peptide selected from the group consisting of the native leader peptide FimH, the signal peptide of influenza hemagglutinin and the signal peptide of the fusion glycoprotein F0 of human respiratory syncytial virus A (strain A2).

С227. Рекомбинантная клетка по C194, отличающаяся тем, что указанный полипептид содержит последовательность сигнального пептида IgK мыши.C227. A recombinant cell at C194, characterized in that said polypeptide contains the sequence of a mouse IgK signal peptide.

С228. Рекомбинантная клетка по C194, отличающаяся тем, что полипептид содержит любую последовательность сигнального пептида, выбранную из сигнального пептида большой субъединицы p51 FcRn рецептора IgG человека и сигнального пептида белка IL10 человека.C228. A recombinant cell according to C194, characterized in that the polypeptide contains any signal peptide sequence selected from the signal peptide of the large subunit p51 FcRn of the human IgG receptor and the signal peptide of the human IL10 protein.

С229. Рекомбинантная клетка по C195, отличающаяся тем, что полипептид содержит мутацию аргинина в пролин в положении аминокислоты 60 (R60P) в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 3.C229. A recombinant cell at C195, characterized in that the polypeptide contains an arginine to proline mutation at amino acid position 60 (R60P) in accordance with SEQ ID NO: 3.

С230. Рекомбинантная клетка по С194, отличающаяся тем, что уровень экспрессии полипептида превышает уровень экспрессии соответствующего полипептида дикого типа, экспрессируемого в периплазме клетки E.coli дикого типа.C230. A recombinant cell according to C194, characterized in that the level of expression of the polypeptide exceeds the level of expression of the corresponding wild-type polypeptide expressed in the periplasm of a wild-type E. coli cell.

С231. Рекомбинантная клетка по С194, отличающаяся тем, что уровень экспрессии полипептида превышает 10 мг/л.C231. Recombinant cell according to C194, characterized in that the level of expression of the polypeptide exceeds 10 mg/l.

С232. Рекомбинантная клетка по С194, отличающаяся тем, что полинуклеотидная последовательность интегрирована в геномную ДНК указанной клетки млекопитающего.C232. A recombinant cell according to C194, characterized in that the polynucleotide sequence is integrated into the genomic DNA of the specified mammalian cell.

С233. Рекомбинантная клетка по C194, отличающаяся тем, что полинуклеотидная последовательность кодон-оптимизирована для экспрессии в клетке.C233. Recombinant cell according to C194, characterized in that the polynucleotide sequence is codon-optimized for expression in the cell.

С234. Рекомбинантная клетка по С194, где клетка представляет собой клетку почки эмбриона человека.C234. A recombinant cell at C194, where the cell is a human embryonic kidney cell.

С235. Рекомбинантная клетка по C234, отличающаяся тем, что клетка почки эмбриона человека содержит клетку HEK293.C235. A recombinant cell at C234, characterized in that the human embryonic kidney cell contains a HEK293 cell.

С236. Рекомбинантная клетка по C235, отличающаяся тем, что клетка HEK293 выбрана из любой из клеток HEK293T, клеток HEK293TS и клеток HEK293E.C236. A C235 recombinant cell, wherein the HEK293 cell is selected from any of HEK293T cells, HEK293TS cells, and HEK293E cells.

С237. Рекомбинантная клетка по С195, где клетка представляет собой клетку СНО.C237. A recombinant cell at C195, where the cell is a CHO cell.

С238. Рекомбинантная клетка по C237, где указанная клетка CHO представляет собой клетку CHO-K1, клетку CHO-DUXB11, CHO-DG44 или клетку CHO-S.C238. A C237 recombinant cell, wherein said CHO cell is a CHO-K1 cell, a CHO-DUXB11 cell, a CHO-DG44 cell, or a CHO-S cell.

С239. Рекомбинантная клетка по С194, отличающаяся тем, что полипептид является растворимым.C239. Recombinant cell according to C194, characterized in that the polypeptide is soluble.

С240. Рекомбинантная клетка по С194, где полипептид секретируется из клетки.C240. A recombinant cell at C194, where the polypeptide is secreted from the cell.

С241. Рекомбинантная клетка по C195, где полипептид содержит замену N28Q в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1.C241. Recombinant cell at C195, where the polypeptide contains the N28Q substitution in accordance with SEQ ID NO: 1.

С242. Рекомбинантная клетка по C195, отличающаяся тем, что полипептид содержит замену N28D в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1.C242. A recombinant cell at C195, characterized in that the polypeptide contains the N28D substitution in accordance with SEQ ID NO: 1.

С243. Рекомбинантная клетка в соответствии с C195, где полипептид содержит замену N28S в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1.C243. A recombinant cell in accordance with C195, where the polypeptide contains the N28S substitution in accordance with the numbering of SEQ ID NO: 1.

С244. Рекомбинантная клетка по C195, где полипептид содержит замену, выбранную из любой из N28Q, V48C и L55C, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1.C244. A C195 recombinant cell, wherein the polypeptide contains a substitution selected from any of N28Q, V48C, and L55C, as designated by SEQ ID NO: 1.

С245. Рекомбинантная клетка в соответствии с C195, где полипептид содержит замену N92S в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1.C245. A recombinant cell in accordance with C195, where the polypeptide contains the N92S substitution in accordance with the numbering of SEQ ID NO: 1.

С246. Рекомбинантная клетка по C194, отличающаяся тем, что полипептид, полученный из FimH, или его фрагмент содержит замену, выбранную из любой из V48C и L55C, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1.C246. A C194 recombinant cell, wherein the FimH-derived polypeptide or fragment thereof contains a substitution selected from any of V48C and L55C, as designated by SEQ ID NO: 1.

С247. Культура, содержащая рекомбинантную клетку по C194, где указанная культура имеет размер, по меньшей мере, 5 литров.C247. A culture containing a C194 recombinant cell, wherein said culture is at least 5 liters in size.

С248. Культура по С242, отличающаяся тем, что выход полипептида или его группы составляет, по меньшей мере, 0,05 г/л.C248. Culture according to C242, characterized in that the yield of the polypeptide or its group is at least 0.05 g/l.

С249. Культура по С248, отличающаяся тем, что выход полипептида или его группы составляет, по меньшей мере, 0,10 г/л.C249. Culture according to C248, characterized in that the yield of the polypeptide or its group is at least 0.10 g/l.

С250. Способ получения полипептида, полученного из E.coli, или его фрагмента, включающий культивирование рекомбинантной клетки млекопитающего по C194 в подходящих условиях, тем самым экспрессируя полипептид или его фрагмент; и сбор полипептида или его фрагмента.C250. A method of producing a polypeptide derived from E. coli, or a fragment thereof, comprising culturing a recombinant mammalian cell at C194 under suitable conditions, thereby expressing the polypeptide or fragment thereof; and collecting the polypeptide or fragment thereof.

С251. Способ по С250, дополнительно включающий очистку полипептида или его фрагмента.S251. The method of C250, further comprising purifying the polypeptide or fragment thereof.

С252. Способ по C250, отличающийся тем, что клетка содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую любую из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 27.C252. The method of C250, wherein the cell contains a nucleic acid encoding any of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 27.

С253. Способ по С250, отличающийся тем, что выход полипептида или его фрагмента составляет, по меньшей мере, 0,05 г/л.C253. Method according to C250, characterized in that the yield of the polypeptide or its fragment is at least 0.05 g/l.

С254. Способ по С250, отличающийся тем, что выход полипептида или его группы составляет, по меньшей мере, 0,10 г/л.C254. Method according to C250, characterized in that the yield of the polypeptide or group thereof is at least 0.10 g/l.

С255. Композиция, содержащая полипептид, имеющий, по меньшей мере, 70% идентичность любой из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 29.C255. A composition comprising a polypeptide having at least 70% identity to any of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29.

С256. Композиция по C255, дополнительно содержащая сахарид, имеющий структуру, выбранную из любой Формулы в таблице 1.C256. The composition of C255 further comprising a saccharide having a structure selected from any of the Formulas in Table 1.

С257. Композиция по C256, отличающаяся тем, что сахарид ковалентно связан с белком-носителем.C257. Composition according to C256, characterized in that the saccharide is covalently linked to a carrier protein.

С258. Композиция по C257, отличающаяся тем, что белок-носитель выбран из любого из поли(L-лизина), CRM₁₉₇, группы дифтерийного токсина B (DTFB), DTFB C8, дифтерийного анатоксина (DT), столбнячного анатоксина (TT), группы C TT, коклюшного анатоксина, холерного анатоксина или экзотоксина A из Pseudomonas aeruginosa; детоксицированного экзотоксина A P. aeruginosa (EPA), белка, связывающего мальтозу (MBP), детоксицированного гемолизина A S. aureus, фактора слипания A, фактора слипания B, субъединицы B холерного токсина (CTB), пневмолизина Streptococcus pneumoniae и его детоксицированных вариантов, AcrA C. jejuni и природных гликопротеинов C. jejuni. C258. Composition according to C257, characterized in that the carrier protein is selected from any of poly(L-lysine), CRM ₁₉₇ , diphtheria toxoid group B (DTFB), DTFB C8, diphtheria toxoid (DT), tetanus toxoid (TT), group C TT, pertussis toxoid, cholera toxoid or exotoxin A from Pseudomonas aeruginosa; detoxified P. aeruginosa exotoxin A (EPA), maltose binding protein (MBP), detoxified S. aureus hemolysin A, clumping factor A, clumping factor B, cholera toxin subunit B (CTB), Streptococcus pneumoniae pneumolysin and its detoxified variants, AcrA C. jejuni and natural glycoproteins of C. jejuni.

С259. Композиция по C257, отличающаяся тем, что белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.C259. Composition according to C257, characterized in that the carrier protein is CRM ₁₉₇ .

С260. Композиция по С257, отличающаяся тем, что белок-носитель представляет собой столбнячный анатоксин (ТТ).C260. Composition according to C257, characterized in that the carrier protein is tetanus toxoid (TT).

С261. Композиция по C257, отличающаяся тем, что белок-носитель представляет собой поли(L-лизин).C261. Composition according to C257, characterized in that the carrier protein is poly(L-lysine).

С262. Композиция по C257, отличающаяся тем, что сахарид ковалентно связан с белком-носителем посредством восстановительного аминирования.C262. Composition according to C257, characterized in that the saccharide is covalently linked to a carrier protein through reductive amination.

С263. Композиция по C257, отличающаяся тем, что сахарид ковалентно связан с белком-носителем с помощью CDAP химии.C263. Composition according to C257, characterized in that the saccharide is covalently linked to a carrier protein using CDAP chemistry.

С264. Композиция по C257, отличающаяся тем, что сахарид ковалентно связан с белком-носителем посредством односторонне-связанной конъюгации.C264. Composition according to C257, characterized in that the saccharide is covalently linked to a carrier protein through one-way conjugation.

С265. Композиция по C257, отличающаяся тем, что сахарид ковалентно связан с белком-носителем через спейсер (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбамат (eTEC).C265. Composition according to C257, characterized in that the saccharide is covalently linked to a carrier protein through a spacer (2-((2-oxoethyl)thio)ethyl)carbamate (eTEC).

С266. Полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 27.C266. A polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 27.

С267. Композиция, содержащая полипептид, полученный из FimH, или его фрагмент; и сахарид, имеющий структуру, выбранную из Формулы O1, Формулы O1A, Формулы O1B, Формулы O1C, Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4, Формулы O4:K52, Формулы O4:K6, Формулы O5, Формулы O5ab, Формулы O5ac, Формулы O6, Формулы O6:K2; K13; K15, Формулы O6:K54, Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B, Формулы O18B1, Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23, Формулы O23A, Формулы O24, Формулы O25, Формулы O25a, Формулы O25b, Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45, Формулы O45, Формулы O45rel, Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы 62D1, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73, Формулы O73, Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186, Формулы O187.C267. A composition containing a polypeptide derived from FimH, or a fragment thereof; and a saccharide having a structure selected from Formula O1, Formula O1A, Formula O1B, Formula O1C, Formula O2, Formula O3, Formula O4, Formula O4:K52, Formula O4:K6, Formula O5, Formula O5ab, Formula O5ac, Formula O6 , Formulas O6:K2; K13; K15, Formulas O6:K54, Formulas O7, Formulas O8, Formulas O9, Formulas O10, Formulas O11, Formulas O12, Formulas O13, Formulas O14, Formulas O15, Formulas O16, Formulas O17, Formulas O18, Formulas O18A, Formulas O18ac, Formulas O18A1, Formulas O18B, Formulas O18B1, Formulas O19, Formulas O20, Formulas O21, Formulas O22, Formulas O23, Formulas O23A, Formulas O24, Formulas O25, Formulas O25a, Formulas O25b, Formulas O26, Formulas O27, Formulas O28, Formulas O29 , Formulas O30, Formulas O32, Formulas O33, Formulas O34, Formulas O35, Formulas O36, Formulas O37, Formulas O38, Formulas O39, Formulas O40, Formulas O41, Formulas O42, Formulas O43, Formulas O44, Formulas O45, Formulas O45, Formulas O45rel , Formulas O46, Formulas O48, Formulas O49, Formulas O50, Formulas O51, Formulas O52, Formulas O53, Formulas O54, Formulas O55, Formulas O56, Formulas O57, Formulas O58, Formulas O59, Formulas O60, Formulas O61, Formulas O62, Formulas 62D1, Formula O63, Formula O64, Formula O65, Formula O66, Formula O68, Formula O69, Formula O70, Formula O71, Formula O73, Formula O73, Formula O74, Formula O75, Formula O76, Formula O77, Formula O78, Formula O79, Formulas O80, Formulas O81, Formulas O82, Formulas O83, Formulas O84, Formulas O85, Formulas O86, Formulas O87, Formulas O88, Formulas O89, Formulas O90, Formulas O91, Formulas O92, Formulas O93, Formulas O95, Formulas O96, Formulas O97 , Formulas O98, Formulas O99, Formulas O100, Formulas O101, Formulas O102, Formulas O103, Formulas O104, Formulas O105, Formulas O106, Formulas O107, Formulas O108, Formulas O109, Formulas O110, Formulas 0111, Formulas O112, s O113, Formulas O114, Formulas O115, Formulas O116, Formulas O117, Formulas O118, Formulas O119, Formulas O120, Formulas O121, Formulas O123, Formulas O124, Formulas O125, Formulas O126, Formulas O127, Formulas O128, Formulas O129, Formulas O13 0, Formulas O131, Formulas O132, Formulas O133, Formulas O134, Formulas O135, Formulas O136, Formulas O137, Formulas O138, Formulas O139, Formulas O140, Formulas O141, Formulas O142, Formulas O143, Formulas O144, Formulas O145, Formulas O146, O147, Formulas O148 , Formulas O149, Formulas O150, Formulas O151, Formulas O152, Formulas O153, Formulas O154, Formulas O155, Formulas O156, Formulas O157, Formulas O158, Formulas O159, Formulas O160, Formulas O161, Formulas O162, Formulas O163, Formulas O164, Formulas O165, Formulas O166, Formulas O167, Formulas O168, Formulas O169, Formulas O170, Formulas O171, Formulas O172, Formulas O173, Formulas O174, Formulas O175, Formulas O176, Formulas O177, Formulas O178, Formulas O179, Formulas O18 0, Formulas O181, Formulas O182, Formulas O183, Formulas O184, Formulas O185, Formulas O186, Formulas O187.

С268. Композиция по п. C267, дополнительно содержащая, по меньшей мере, один сахарид, полученный из любого типа K. pneumoniae, выбранного из группы, состоящей из O1, O2, O3 и O5.C268. The composition of claim C267, further comprising at least one saccharide derived from any type of K. pneumoniae selected from the group consisting of O1, O2, O3 and O5.

С269. Композиция по п. C267, дополнительно содержащая сахарид, полученный из Klebsiella pneumoniae типа O1.C269. The composition according to claim C267, further containing a saccharide obtained from Klebsiella pneumoniae type O1.

С270. Композиция по п. C267, дополнительно содержащая сахарид, полученный из K. pneumoniae типа O2.C270. The composition according to claim C267, further containing a saccharide obtained from K. pneumoniae type O2.

С271. Композиция по п. C267, дополнительно содержащая сахарид, полученный из K. pneumoniae типа O3.C271. The composition according to claim C267, further containing a saccharide obtained from K. pneumoniae type O3.

С272. Композиция по п. C267, дополнительно содержащая сахарид, полученный из K. pneumoniae типа O5.S272. The composition according to claim C267, further containing a saccharide obtained from K. pneumoniae type O5.

С273. Композиция по п. C267, дополнительно содержащая сахарид, полученный из K. pneumoniae типа O1, и сахарид, полученный из K. pneumoniae типа O2.C273. The composition of claim C267 further comprising a saccharide derived from K. pneumoniae type O1 and a saccharide derived from K. pneumoniae type O2.

С274. Композиция по п. C268, отличающаяся тем, что сахарид, полученный из K. pneumoniae, конъюгирован с белком-носителем; и сахарид, полученный из E. coli, конъюгирован с белком-носителем.C274. The composition according to claim C268, characterized in that the saccharide obtained from K. pneumoniae is conjugated to a carrier protein; and a saccharide derived from E. coli is conjugated to a carrier protein.

С275. Композиция по п. C267, дополнительно содержащая полипептид, полученный из K. pneumoniae.C275. The composition according to claim C267, further containing a polypeptide derived from K. pneumoniae.

С276. Композиция, содержащая полипептид, полученный из FimH, или его фрагмент; и, по меньшей мере, один сахарид, полученный из любого типа K. pneumoniae, выбранного из группы, состоящей из O1, O2, O3 и O5.C276. A composition containing a polypeptide derived from FimH, or a fragment thereof; and at least one saccharide derived from any type of K. pneumoniae selected from the group consisting of O1, O2, O3 and O5.

С277. Композиция по п. C276, дополнительно содержащая по меньшей мере, один сахарид, имеющий структуру, выбранную из Формулы O1, Формулы O1A, Формулы O1B, Формулы O1C, Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4, Формулы O4:K52, Формулы O4:K6, Формулы O5, Формулы O5ab, Формулы O5ac, Формулы O6, Формулы O6:K2; K13; K15, Формулы O6:K54, Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B, Формулы O18B1, Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23, Формулы O23A, Формулы O24, Формулы O25, Формулы O25a, Формулы O25b, Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45, Формулы O45, Формулы O45rel, Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы 62D1, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73, Формулы O73, Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186, Формулы O187.C277. The composition of claim C276, further comprising at least one saccharide having a structure selected from Formula O1, Formula O1A, Formula O1B, Formula O1C, Formula O2, Formula O3, Formula O4, Formula O4:K52, Formula O4:K6 , Formulas O5, Formulas O5ab, Formulas O5ac, Formulas O6, Formulas O6:K2; K13; K15, Formulas O6:K54, Formulas O7, Formulas O8, Formulas O9, Formulas O10, Formulas O11, Formulas O12, Formulas O13, Formulas O14, Formulas O15, Formulas O16, Formulas O17, Formulas O18, Formulas O18A, Formulas O18ac, Formulas O18A1, Formulas O18B, Formulas O18B1, Formulas O19, Formulas O20, Formulas O21, Formulas O22, Formulas O23, Formulas O23A, Formulas O24, Formulas O25, Formulas O25a, Formulas O25b, Formulas O26, Formulas O27, Formulas O28, Formulas O29 , Formulas O30, Formulas O32, Formulas O33, Formulas O34, Formulas O35, Formulas O36, Formulas O37, Formulas O38, Formulas O39, Formulas O40, Formulas O41, Formulas O42, Formulas O43, Formulas O44, Formulas O45, Formulas O45, Formulas O45rel , Formulas O46, Formulas O48, Formulas O49, Formulas O50, Formulas O51, Formulas O52, Formulas O53, Formulas O54, Formulas O55, Formulas O56, Formulas O57, Formulas O58, Formulas O59, Formulas O60, Formulas O61, Formulas O62, Formulas 62D1, Formula O63, Formula O64, Formula O65, Formula O66, Formula O68, Formula O69, Formula O70, Formula O71, Formula O73, Formula O73, Formula O74, Formula O75, Formula O76, Formula O77, Formula O78, Formula O79, Formulas O80, Formulas O81, Formulas O82, Formulas O83, Formulas O84, Formulas O85, Formulas O86, Formulas O87, Formulas O88, Formulas O89, Formulas O90, Formulas O91, Formulas O92, Formulas O93, Formulas O95, Formulas O96, Formulas O97 , Formulas O98, Formulas O99, Formulas O100, Formulas O101, Formulas O102, Formulas O103, Formulas O104, Formulas O105, Formulas O106, Formulas O107, Formulas O108, Formulas O109, Formulas O110, Formulas 0111, Formulas O112, s O113, Formulas O114, Formulas O115, Formulas O116, Formulas O117, Formulas O118, Formulas O119, Formulas O120, Formulas O121, Formulas O123, Formulas O124, Formulas O125, Formulas O126, Formulas O127, Formulas O128, Formulas O129, Formulas O13 0, Formulas O131, Formulas O132, Formulas O133, Formulas O134, Formulas O135, Formulas O136, Formulas O137, Formulas O138, Formulas O139, Formulas O140, Formulas O141, Formulas O142, Formulas O143, Formulas O144, Formulas O145, Formulas O146, O147, Formulas O148 , Formulas O149, Formulas O150, Formulas O151, Formulas O152, Formulas O153, Formulas O154, Formulas O155, Formulas O156, Formulas O157, Formulas O158, Formulas O159, Formulas O160, Formulas O161, Formulas O162, Formulas O163, Formulas O164, Formulas O165, Formulas O166, Formulas O167, Formulas O168, Formulas O169, Formulas O170, Formulas O171, Formulas O172, Formulas O173, Formulas O174, Formulas O175, Formulas O176, Formulas O177, Formulas O178, Formulas O179, Formulas O18 0, Formulas O181, Formulas O182, Formulas O183, Formulas O184, Formulas O185, Formulas O186, Formulas O187.

С278. Композиция по п. C277, отличающаяся тем, что сахарид, полученный из K. pneumoniae, конъюгирован с белком-носителем; и сахарид, полученный из E. coli, конъюгирован с белком-носителем.C278. The composition according to claim C277, characterized in that the saccharide obtained from K. pneumoniae is conjugated to a carrier protein; and a saccharide derived from E. coli is conjugated to a carrier protein.

С279. Композиция по п. C277, дополнительно содержащая полипептид, полученный из K. pneumoniae.C279. The composition according to claim C277, further containing a polypeptide derived from K. pneumoniae.

С280. Композиция, содержащая по меньшей мере, один сахарид, полученный из любого типа K. pneumoniae, выбранного из группы, состоящей из O1, O2, O3 и O5; и, по меньшей мере, один сахарид, имеющий структуру, выбранную из Формулы O1, Формулы O1A, Формулы O1B, Формулы O1C, Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4, Формулы O4:K52, Формулы O4:K6, Формулы O5, Формулы O5ab, Формулы O5ac, Формулы O6, Формулы O6:K2; K13; K15, Формулы O6:K54, Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B, Формулы O18B1, Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23, Формулы O23A, Формулы O24, Формулы O25, Формулы O25a, Формулы O25b, Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45, Формулы O45, Формулы O45rel, Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы 62D1, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73, Формулы O73, Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186, Формулы O187.S280. A composition containing at least one saccharide derived from any type of K. pneumoniae selected from the group consisting of O1, O2, O3 and O5; and at least one saccharide having a structure selected from Formula O1, Formula O1A, Formula O1B, Formula O1C, Formula O2, Formula O3, Formula O4, Formula O4:K52, Formula O4:K6, Formula O5, Formula O5ab , Formulas O5ac, Formulas O6, Formulas O6:K2; K13; K15, Formulas O6:K54, Formulas O7, Formulas O8, Formulas O9, Formulas O10, Formulas O11, Formulas O12, Formulas O13, Formulas O14, Formulas O15, Formulas O16, Formulas O17, Formulas O18, Formulas O18A, Formulas O18ac, Formulas O18A1, Formulas O18B, Formulas O18B1, Formulas O19, Formulas O20, Formulas O21, Formulas O22, Formulas O23, Formulas O23A, Formulas O24, Formulas O25, Formulas O25a, Formulas O25b, Formulas O26, Formulas O27, Formulas O28, Formulas O29 , Formulas O30, Formulas O32, Formulas O33, Formulas O34, Formulas O35, Formulas O36, Formulas O37, Formulas O38, Formulas O39, Formulas O40, Formulas O41, Formulas O42, Formulas O43, Formulas O44, Formulas O45, Formulas O45, Formulas O45rel , Formulas O46, Formulas O48, Formulas O49, Formulas O50, Formulas O51, Formulas O52, Formulas O53, Formulas O54, Formulas O55, Formulas O56, Formulas O57, Formulas O58, Formulas O59, Formulas O60, Formulas O61, Formulas O62, Formulas 62D1, Formula O63, Formula O64, Formula O65, Formula O66, Formula O68, Formula O69, Formula O70, Formula O71, Formula O73, Formula O73, Formula O74, Formula O75, Formula O76, Formula O77, Formula O78, Formula O79, Formulas O80, Formulas O81, Formulas O82, Formulas O83, Formulas O84, Formulas O85, Formulas O86, Formulas O87, Formulas O88, Formulas O89, Formulas O90, Formulas O91, Formulas O92, Formulas O93, Formulas O95, Formulas O96, Formulas O97 , Formulas O98, Formulas O99, Formulas O100, Formulas O101, Formulas O102, Formulas O103, Formulas O104, Formulas O105, Formulas O106, Formulas O107, Formulas O108, Formulas O109, Formulas O110, Formulas 0111, Formulas O112, s O113, Formulas O114, Formulas O115, Formulas O116, Formulas O117, Formulas O118, Formulas O119, Formulas O120, Formulas O121, Formulas O123, Formulas O124, Formulas O125, Formulas O126, Formulas O127, Formulas O128, Formulas O129, Formulas O13 0, Formulas O131, Formulas O132, Formulas O133, Formulas O134, Formulas O135, Formulas O136, Formulas O137, Formulas O138, Formulas O139, Formulas O140, Formulas O141, Formulas O142, Formulas O143, Formulas O144, Formulas O145, Formulas O146, O147, Formulas O148 , Formulas O149, Formulas O150, Formulas O151, Formulas O152, Formulas O153, Formulas O154, Formulas O155, Formulas O156, Formulas O157, Formulas O158, Formulas O159, Formulas O160, Formulas O161, Formulas O162, Formulas O163, Formulas O164, Formulas O165, Formulas O166, Formulas O167, Formulas O168, Formulas O169, Formulas O170, Formulas O171, Formulas O172, Formulas O173, Formulas O174, Formulas O175, Formulas O176, Formulas O177, Formulas O178, Formulas O179, Formulas O18 0, Formulas O181, Formulas O182, Formulas O183, Formulas O184, Formulas O185, Formulas O186, Formulas O187.

С281. Композиция по п. C280, дополнительно содержащая полипептид, полученный из FimH, или его фрагмент.C281. The composition of claim C280, further comprising a polypeptide derived from FimH or a fragment thereof.

С282. Композиция по п. C280, отличающаяся тем, что сахарид E. coli содержит Формулу O8.C282. Composition according to claim C280, characterized in that the E. coli saccharide contains Formula O8.

С283. Композиция по п. C280, отличающаяся тем, что сахарид E. coli содержит Формулу O9.C283. Composition according to claim C280, characterized in that the E. coli saccharide contains Formula O9.

С284. Композиция по п. C280, дополнительно содержащая полипептид, полученный из K. pneumoniae.C284. The composition of claim C280, further comprising a polypeptide derived from K. pneumoniae.

С285. Композиция по любому из пп. C267-C284, отличающаяся тем, что сахарид ковалентно связан с белком-носителем.C285. The composition according to any one of paragraphs. C267-C284, characterized in that the saccharide is covalently linked to a carrier protein.

С286. Композиция по п. C285, отличающаяся тем, что сахарид дополнительно содержит группу 3-дезокси-d-манно-окт-2-улозоновой кислоты (KDO).C286. Composition according to claim C285, characterized in that the saccharide additionally contains a 3-deoxy-d-manno-oct-2-ulosonic acid (KDO) group.

С2987. Композиция по п. C285, отличающаяся тем, что сахарид содержит липид А.S2987. Composition according to claim C285, characterized in that the saccharide contains lipid A.

С288. Композиция по любому из пп. C285-C287, отличающаяся тем, что сахарид синтезирован синтетическим путем.C288. The composition according to any one of paragraphs. C285-C287, characterized in that the saccharide is synthesized synthetically.

С289. Композиция по п. C285, отличающаяся тем, что белок-носитель выбран из любого из CRM₁₉₇, группы B дифтерийного токсина (DTFB), DTFB C8, дифтерийного анатоксина (DT), столбнячного анатоксина (TT), фрагмента C TT, коклюшного анатоксина, холерного анатоксина или экзотоксина А из Pseudomonas aeruginosa; детоксицированного экзотоксина A P. aeruginosa (EPA), белка, связывающего мальтозу (MBP), детоксицированного гемолизина A S. aureus, фактора слипания A, фактора слипания B, субъединицы холерного токсина B (CTB), пневмолизина Streptococcus pneumoniae и его детоксицированных вариантов, AcrA C. jejuni, природных гликопротеинов C. jejuni и стрептококковой пептидазы C5a (SCP).C289. The composition of claim C285, wherein the carrier protein is selected from any of CRM ₁₉₇ , diphtheria toxoid group B (DTFB), DTFB C8, diphtheria toxoid (DT), tetanus toxoid (TT), TT fragment C, pertussis toxoid, cholera toxoid or exotoxin A from Pseudomonas aeruginosa; detoxified P. aeruginosa exotoxin A (EPA), maltose binding protein (MBP), detoxified S. aureus hemolysin A, clumping factor A, clumping factor B, cholera toxin subunit B (CTB), Streptococcus pneumoniae pneumolysin and its detoxified variants, AcrA C. jejuni, natural C. jejuni glycoproteins, and streptococcal C5a peptidase (SCP).

С290. Способ индукции иммунного ответа против Escherichia coli у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества композиции по любому из пп. C267-C289.S290. A method of inducing an immune response against Escherichia coli in a mammal, comprising administering to the mammal an effective amount of a composition according to any one of claims. C267-C289.

С291. Способ по п. C290, отличающийся тем, что иммунный ответ включает опсонофагоцитарные антитела против E. coli.S291. The method according to claim C290, characterized in that the immune response includes opsonophagocytic antibodies against E. coli.

С292. Способ по п. C290, отличающийся тем, что иммунный ответ защищает млекопитающее от инфекции E. coli.S292. The method of claim C290, wherein the immune response protects the mammal from E. coli infection.

С293. Способ индукции иммунного ответа против Klebsiella pneumoniae у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества композиции по любому из пп. C267-C289.S293. A method of inducing an immune response against Klebsiella pneumoniae in a mammal, comprising administering to the mammal an effective amount of a composition according to any one of claims. C267-C289.

С294. Способ по п. C293, отличающийся тем, что иммунный ответ включает опсонофагоцитарные антитела против Klebsiella pneumoniae.S294. The method according to claim C293, characterized in that the immune response includes opsonophagocytic antibodies against Klebsiella pneumoniae.

С295. Способ по п. C293, отличающийся тем, что иммунный ответ защищает млекопитающее от инфекции Klebsiella pneumoniae.S295. The method of claim C293, wherein the immune response protects the mammal from Klebsiella pneumoniae infection.

С296. Композиции и способы по любому из пп. C1-C266, дополнительно содержащие, по меньшей мере, один сахарид, полученный из любого одного типа K. pneumoniae, выбранного из группы, состоящей из O1, O2, O3 и O5.S296. Compositions and methods according to any one of paragraphs. C1-C266, further comprising at least one saccharide derived from any one type of K. pneumoniae selected from the group consisting of O1, O2, O3 and O5.

С297. Композиции и способы по п. C296, отличающиеся тем, что K. pneumoniae типа O1 содержит вариант O1V1 или O1V2.S297. Compositions and methods according to claim C296, characterized in that K. pneumoniae type O1 contains the O1V1 or O1V2 variant.

С298. Композиции и способы по п. C296, отличающиеся тем, что K. pneumoniae типа O2 содержит вариант O2V1 или O2V2.S298. Compositions and methods according to claim C296, characterized in that K. pneumoniae type O2 contains the O2V1 or O2V2 variant.

С299. Использование композиций, указанных в любом из пп. C1-C298, как указано в настоящем документе.S299. Use of compositions specified in any of paragraphs. C1-C298 as specified herein.

--->--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙLIST OF SEQUENCES

<110> Pfizer Inc.<110> Pfizer Inc.

Donald, Robert G.K. Donald, Robert G.K.

<120> КОМПОЗИЦИИ ESCHERICHIA COLI И СПОСОБЫ НА ИХ ОСНОВЕ<120> COMPOSITIONS OF ESCHERICHIA COLI AND METHODS BASED ON THEM

<130> PC072591A<130>PC072591A

<160> 109 <160> 109

<170> PatentIn version 3.5<170> Patent In version 3.5

<210> 1<210> 1

<211> 300<211> 300

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 1<400> 1

Met Lys Arg Val Ile Thr Leu Phe Ala Val Leu Leu Met Gly Trp Ser Met Lys Arg Val Ile Thr Leu Phe Ala Val Leu Leu Met Gly Trp Ser

1 5 10 15 1 5 10 15

Val Asn Ala Trp Ser Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Val Asn Ala Trp Ser Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile

20 25 30 20 25 30

Pro Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Pro Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val

35 40 45 35 40 45

Val Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Val Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe

50 55 60 50 55 60

Cys His Asn Asp Tyr Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Cys His Asn Asp Tyr Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln

65 70 75 80 65 70 75 80

Arg Gly Ser Ala Tyr Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val Arg Gly Ser Ala Tyr Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val

85 90 95 85 90 95

Lys Tyr Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Lys Tyr Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro

100 105 110 100 105 110

Arg Val Val Tyr Asn Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Arg Val Val Tyr Asn Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu

115 120 125 115 120 125

Tyr Leu Thr Pro Val Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Tyr Leu Thr Pro Val Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly

130 135 140 130 135 140

Ser Leu Ile Ala Val Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Ser Leu Ile Ala Val Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser

145 150 155 160 145 150 155 160

Asp Asp Phe Gln Phe Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Asp Asp Phe Gln Phe Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val

165 170 175 165 170 175

Val Pro Thr Gly Gly Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Val Pro Thr Gly Gly Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr

180 185 190 180 185 190

Leu Pro Asp Tyr Pro Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Leu Pro Asp Tyr Pro Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys

195 200 205 195 200 205

Ala Lys Ser Gln Asn Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Lys Ser Gln Asn Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp

210 215 220 210 215 220

Ala Gly Asn Ser Ile Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Ala Gly Asn Ser Ile Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln

225 230 235 240 225 230 235 240

Gly Val Gly Val Gln Leu Thr Arg Asn Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Gly Val Gly Val Gln Leu Thr Arg Asn Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn

245 250 255 245 250 255

Asn Thr Val Ser Leu Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Asn Thr Val Ser Leu Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly

260 265 270 260 265 270

Leu Thr Ala Asn Tyr Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Leu Thr Ala Asn Tyr Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn

275 280 285 275 280 285

Val Gln Ser Ile Ile Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln Val Gln Ser Ile Ile Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln

290 295 300 290 295 300

<210> 2<210> 2

<211> 279<211> 279

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 2<400> 2

Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln

20 25 30 20 25 30

Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr

35 40 45 35 40 45

Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr

50 55 60 50 55 60

Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser

65 70 75 80 65 70 75 80

Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn

85 90 95 85 90 95

Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val

100 105 110 100 105 110

Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val

115 120 125 115 120 125

Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe

130 135 140 130 135 140

Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly

145 150 155 160 145 150 155 160

Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr Pro Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr Pro

165 170 175 165 170 175

Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gln Asn Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gln Asn

180 185 190 180 185 190

Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Gly Asn Ser Ile Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Gly Asn Ser Ile

195 200 205 195 200 205

Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val Gln Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val Gln

210 215 220 210 215 220

Leu Thr Arg Asn Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Leu Leu Thr Arg Asn Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Leu

225 230 235 240 225 230 235 240

Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Tyr Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Tyr

245 250 255 245 250 255

Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Gln Ser Ile Ile Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Gln Ser Ile Ile

260 265 270 260 265 270

Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln

275 275

<210> 3<210> 3

<211> 156<211> 156

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 3<400> 3

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val

145 150 155 145 150 155

<210> 4<210> 4

<211> 120<211> 120

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 4<400> 4

Gly Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr Gly Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr

1 5 10 15 1 5 10 15

Pro Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gln Pro Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gln

20 25 30 20 25 30

Asn Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Gly Asn Ser Asn Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Gly Asn Ser

35 40 45 35 40 45

Ile Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val Ile Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val

50 55 60 50 55 60

Gln Leu Thr Arg Asn Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Asn Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser

65 70 75 80 65 70 75 80

Leu Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Leu Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn

85 90 95 85 90 95

Tyr Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Gln Ser Ile Tyr Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Gln Ser Ile

100 105 110 100 105 110

Ile Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln Ile Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln

115 120 115 120

<210> 5<210> 5

<211> 330<211> 330

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 5<400> 5

Val Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Gly Ser Thr Gly Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro

20 25 30 20 25 30

Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Cys Val Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Cys Val

35 40 45 35 40 45

Asn Val Gly Gln Asn Cys Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys Asn Val Gly Gln Asn Cys Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys

50 55 60 50 55 60

His Asn Asp Tyr Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg His Asn Asp Tyr Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg

65 70 75 80 65 70 75 80

Gly Ser Ala Tyr Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Gly Ser Ala Tyr Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys

85 90 95 85 90 95

Tyr Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Tyr Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg

100 105 110 100 105 110

Val Val Tyr Asn Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Val Val Tyr Asn Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr

115 120 125 115 120 125

Leu Thr Pro Val Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Thr Pro Val Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser

130 135 140 130 135 140

Leu Ile Ala Val Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Leu Ile Ala Val Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp

145 150 155 160 145 150 155 160

Asp Phe Gln Phe Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Asp Phe Gln Phe Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val

165 170 175 165 170 175

Pro Thr Gly Gly Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Thr Gly Gly Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu

180 185 190 180 185 190

Pro Asp Tyr Pro Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Pro Asp Tyr Pro Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala

195 200 205 195 200 205

Lys Ser Gln Asn Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Lys Ser Gln Asn Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala

210 215 220 210 215 220

Gly Asn Ser Ile Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Gly Asn Ser Ile Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly

225 230 235 240 225 230 235 240

Val Gly Val Gln Leu Thr Arg Gln Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Val Gly Val Gln Leu Thr Arg Gln Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn

245 250 255 245 250 255

Thr Val Ser Leu Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Val Ser Leu Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu

260 265 270 260 265 270

Thr Ala Asn Tyr Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Thr Ala Asn Tyr Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val

275 280 285 275 280 285

Gln Ser Ile Ile Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln Gly Gly Ser Ser Gly Gln Ser Ile Ile Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln Gly Gly Ser Ser Gly

290 295 300 290 295 300

Gly Gly Ala Asp Val Thr Ile Thr Val Asn Gly Lys Val Val Ala Lys Gly Gly Ala Asp Val Thr Ile Thr Val Asn Gly Lys Val Val Ala Lys

305 310 315 320 305 310 315 320

Gly Gly His His His His His His His His Gly Gly His His His His His His

325 330 325 330

<210> 6<210> 6

<211> 330<211> 330

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 6<400> 6

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val

35 40 45 35 40 45

Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160 145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240 225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320 305 310 315 320

Gly Gly His His His His His His His His Gly Gly His His His His His His

325 330 325 330

<210> 7<210> 7

<211> 188<211> 188

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 7<400> 7

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160 145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

Pro Thr Gly Gly His His His His His His His His Pro Thr Gly Gly His His His His His His His

180 185 180 185

<210> 8<210> 8

<211> 188<211> 188

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 8<400> 8

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160 145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 180 185

<210> 9<210> 9

<211> 14<211> 14

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 9<400> 9

Ala Asp Val Thr Ile Thr Val Asn Gly Lys Val Val Ala Lys Ala Asp Val Thr Ile Thr Val Asn Gly Lys Val Val Ala Lys

1 5 10 1 5 10

<210> 10<210> 10

<211> 241<211> 241

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 10<400> 10

Met Ser Asn Lys Asn Val Asn Val Arg Lys Ser Gln Glu Ile Thr Phe Met Ser Asn Lys Asn Val Asn Val Arg Lys Ser Gln Glu Ile Thr Phe

1 5 10 15 1 5 10 15

Cys Leu Leu Ala Gly Ile Leu Met Phe Met Ala Met Met Val Ala Gly Cys Leu Leu Ala Gly Ile Leu Met Phe Met Ala Met Met Val Ala Gly

20 25 30 20 25 30

Arg Ala Glu Ala Gly Val Ala Leu Gly Ala Thr Arg Val Ile Tyr Pro Arg Ala Glu Ala Gly Val Ala Leu Gly Ala Thr Arg Val Ile Tyr Pro

35 40 45 35 40 45

Ala Gly Gln Lys Gln Val Gln Leu Ala Val Thr Asn Asn Asp Glu Asn Ala Gly Gln Lys Gln Val Gln Leu Ala Val Thr Asn Asn Asp Glu Asn

50 55 60 50 55 60

Ser Thr Tyr Leu Ile Gln Ser Trp Val Glu Asn Ala Asp Gly Val Lys Ser Thr Tyr Leu Ile Gln Ser Trp Val Glu Asn Ala Asp Gly Val Lys

65 70 75 80 65 70 75 80

Asp Gly Arg Phe Ile Val Thr Pro Pro Leu Phe Ala Met Lys Gly Lys Asp Gly Arg Phe Ile Val Thr Pro Pro Leu Phe Ala Met Lys Gly Lys

85 90 95 85 90 95

Lys Glu Asn Thr Leu Arg Ile Leu Asp Ala Thr Asn Asn Gln Leu Pro Lys Glu Asn Thr Leu Arg Ile Leu Asp Ala Thr Asn Asn Gln Leu Pro

100 105 110 100 105 110

Gln Asp Arg Glu Ser Leu Phe Trp Met Asn Val Lys Ala Ile Pro Ser Gln Asp Arg Glu Ser Leu Phe Trp Met Asn Val Lys Ala Ile Pro Ser

115 120 125 115 120 125

Met Asp Lys Ser Lys Leu Thr Glu Asn Thr Leu Gln Leu Ala Ile Ile Met Asp Lys Ser Lys Leu Thr Glu Asn Thr Leu Gln Leu Ala Ile Ile

130 135 140 130 135 140

Ser Arg Ile Lys Leu Tyr Tyr Arg Pro Ala Lys Leu Ala Leu Pro Pro Ser Arg Ile Lys Leu Tyr Tyr Arg Pro Ala Lys Leu Ala Leu Pro Pro

145 150 155 160 145 150 155 160

Asp Gln Ala Ala Glu Lys Leu Arg Phe Arg Arg Ser Ala Asn Ser Leu Asp Gln Ala Ala Glu Lys Leu Arg Phe Arg Arg Ser Ala Asn Ser Leu

165 170 175 165 170 175

Thr Leu Ile Asn Pro Thr Pro Tyr Tyr Leu Thr Val Thr Glu Leu Asn Thr Leu Ile Asn Pro Thr Pro Tyr Tyr Leu Thr Val Thr Glu Leu Asn

180 185 190 180 185 190

Ala Gly Thr Arg Val Leu Glu Asn Ala Leu Val Pro Pro Met Gly Glu Ala Gly Thr Arg Val Leu Glu Asn Ala Leu Val Pro Pro Met Gly Glu

195 200 205 195 200 205

Ser Thr Val Lys Leu Pro Ser Asp Ala Gly Ser Asn Ile Thr Tyr Arg Ser Thr Val Lys Leu Pro Ser Asp Ala Gly Ser Asn Ile Thr Tyr Arg

210 215 220 210 215 220

Thr Ile Asn Asp Tyr Gly Ala Leu Thr Pro Lys Met Thr Gly Val Met Thr Ile Asn Asp Tyr Gly Ala Leu Thr Pro Lys Met Thr Gly Val Met

225 230 235 240 225 230 235 240

Glu Glu

<210> 11<210> 11

<211> 4<211> 4

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 11<400> 11

Asp Asn Lys Gln Asp Asn Lys Gln

1 1

<210> 12<210> 12

<211> 5<211> 5

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 12<400> 12

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 15

<210> 13<210> 13

<211> 6<211> 6

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 13<400> 13

Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly

1 5 15

<210> 14<210> 14

<211> 7<211> 7

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 14<400> 14

Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly

1 5 15

<210> 15<210> 15

<211> 8<211> 8

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 15<400> 15

Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly

1 5 15

<210> 16<210> 16

<211> 9<211> 9

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 16<400> 16

Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly

1 5 15

<210> 17<210> 17

<211> 10<211> 10

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 17<400> 17

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly

1 5 10 1 5 10

<210> 18<210> 18

<211> 21<211> 21

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 18<400> 18

1 5 10 15 1 5 10 15

Val Asn Ala Trp Ser Val Asn Ala Trp Ser

20 20

<210> 19<210> 19

<211> 20<211> 20

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 19<400> 19

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Gly Ser Thr Gly

20 20

<210> 20<210> 20

<211> 279<211> 279

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 20<400> 20

Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly Phe Ala Cys Lys Thr Ala Ser Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Cys Val Asn Val Gly Gln Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Cys Val Asn Val Gly Gln

20 25 30 20 25 30

Asn Cys Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr Asn Cys Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160 145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Leu Thr Arg Gln Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Leu Leu Thr Arg Gln Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Leu

225 230 235 240 225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln

275 275

<210> 21<210> 21

<211> 24<211> 24

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 21<400> 21

Ala Asp Val Thr Ile Thr Val Asn Gly Lys Val Val Ala Lys Gly Gly Ala Asp Val Thr Ile Thr Val Asn Gly Lys Val Val Ala Lys Gly Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

His His His His His His His His His His His His His His His

20 20

<210> 22<210> 22

<211> 20<211> 20

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 22<400> 22

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Gly Ser Thr Gly

20 20

<210> 23<210> 23

<211> 279<211> 279

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 23<400> 23

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160 145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240 225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln

275 275

<210> 24<210> 24

<211> 160<211> 160

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 24<400> 24

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160 145 150 155 160

<210> 25<210> 25

<211> 8<211> 8

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 25<400> 25

His His His His His His His His His His His His His His His

1 5 15

<210> 26<210> 26

<211> 160<211> 160

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 26<400> 26

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160 145 150 155 160

<210> 27<210> 27

<211> 168<211> 168

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 27<400> 27

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160 145 150 155 160

His His His His His His His His His His His His His His His

165 165

<210> 28<210> 28

<211> 279<211> 279

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 28<400> 28

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160 145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240 225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln

275 275

<210> 29<210> 29

<211> 279<211> 279

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 29<400> 29

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Ala Val Asn Val Gly Gln Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Ala Val Asn Val Gly Gln

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ala Ala Tyr Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ala Ala Tyr

50 55 60 50 55 60

Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Asn Gly Ser Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Asn Gly Ser

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160 145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240 225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln

275 275

<210> 30<210> 30

<211> 325<211> 325

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 30<400> 30

Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn His Asp Pro Glu Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn His Asp Pro Glu

1 5 10 15 1 5 10 15

Gln Ile Asp Leu Ile Asp Leu Leu Val Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met Gln Ile Asp Leu Ile Asp Leu Leu Val Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met

20 25 30 20 25 30

Thr Ile Ile Ile Ser Val Ile Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr Thr Ile Ile Ile Ser Val Ile Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr

35 40 45 35 40 45

Leu Ala Val Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln Leu Ala Val Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln

50 55 60 50 55 60

Pro Asp Val Gly Gln Ile Ala Gly Tyr Asn Asn Ala Met Asn Val Ile Pro Asp Val Gly Gln Ile Ala Gly Tyr Asn Asn Ala Met Asn Val Ile

65 70 75 80 65 70 75 80

Tyr Gly Gln Ala Ala Pro Lys Val Ser Asp Leu Gln Glu Thr Leu Ile Tyr Gly Gln Ala Ala Pro Lys Val Ser Asp Leu Gln Glu Thr Leu Ile

85 90 95 85 90 95

Gly Arg Phe Ser Ser Ala Phe Ser Ala Leu Ala Glu Thr Leu Asp Asn Gly Arg Phe Ser Ser Ala Phe Ser Ala Leu Ala Glu Thr Leu Asp Asn

100 105 110 100 105 110

Gln Glu Glu Pro Glu Lys Leu Thr Ile Glu Pro Ser Val Lys Asn Gln Gln Glu Glu Pro Glu Lys Leu Thr Ile Glu Pro Ser Val Lys Asn Gln

115 120 125 115 120 125

Gln Leu Pro Leu Thr Val Ser Tyr Val Gly Gln Thr Ala Glu Gly Ala Gln Leu Pro Leu Thr Val Ser Tyr Val Gly Gln Thr Ala Glu Gly Ala

130 135 140 130 135 140

Gln Met Lys Leu Ala Gln Tyr Ile Gln Gln Val Asp Asp Lys Val Asn Gln Met Lys Leu Ala Gln Tyr Ile Gln Gln Val Asp Asp Lys Val Asn

145 150 155 160 145 150 155 160

Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu Lys Asp Asn Ile Ala Leu Gly Arg Lys Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu Lys Asp Asn Ile Ala Leu Gly Arg Lys

165 170 175 165 170 175

Asn Leu Gln Asp Ser Leu Arg Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln Asn Leu Gln Asp Ser Leu Arg Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln

180 185 190 180 185 190

Lys Asp Leu Arg Ile Arg Gln Ile Gln Glu Ala Leu Gln Tyr Ala Asn Lys Asp Leu Arg Ile Arg Gln Ile Gln Glu Ala Leu Gln Tyr Ala Asn

195 200 205 195 200 205

Gln Glu Gln Val Thr Lys Pro Gln Val Gln Gln Thr Glu Asp Val Thr Gln Glu Gln Val Thr Lys Pro Gln Val Gln Gln Thr Glu Asp Val Thr

210 215 220 210 215 220

Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met Ile Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met Ile

225 230 235 240 225 230 235 240

Lys His Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Ser Asn Tyr Tyr Gln Lys His Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Ser Asn Tyr Tyr Gln

245 250 255 245 250 255

Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Ser Leu Lys Val Asp Asp Leu Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Ser Leu Lys Val Asp Asp Leu

260 265 270 260 265 270

Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Ile Arg Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Ile Arg

275 280 285 275 280 285

Arg Asp Ser Pro Lys Lys Ala Ile Thr Leu Ile Leu Ala Val Leu Leu Arg Asp Ser Pro Lys Lys Ala Ile Thr Leu Ile Leu Ala Val Leu Leu

290 295 300 290 295 300

Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu Arg Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu Arg

305 310 315 320 305 310 315 320

Asn Tyr Asn Ala Lys Asn Tyr Asn Ala Lys

325 325

<210> 31<210> 31

<211> 326<211> 326

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 31<400> 31

Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn Asn Asp Pro Glu Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn Asn Asp Pro Glu

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gln Asp Glu Pro Glu Lys Leu Thr Ile Glu Pro Ser Val Lys Asn Gln Gln Asp Glu Pro Glu Lys Leu Thr Ile Glu Pro Ser Val Lys Asn Gln

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160 145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

Gln Ala Gln Val Thr Lys Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gly Glu Asp Ile Gln Ala Gln Val Thr Lys Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gly Glu Asp Ile

210 215 220 210 215 220

Thr Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met Thr Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met

225 230 235 240 225 230 235 240

Ile Lys His Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Asn Tyr Tyr Ile Lys His Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Asn Tyr Tyr

245 250 255 245 250 255

Gln Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Ser Leu Lys Val Asp Asp Gln Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Ser Leu Lys Val Asp Asp

260 265 270 260 265 270

Leu Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Ile Leu Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Ile

275 280 285 275 280 285

Arg Arg Asp Ser Pro Lys Lys Ala Ile Thr Leu Ile Leu Ala Val Leu Arg Arg Asp Ser Pro Lys Lys Ala Ile Thr Leu Ile Leu Ala Val Leu

290 295 300 290 295 300

Leu Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu Leu Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu

305 310 315 320 305 310 315 320

Arg Asn Tyr Asn Ala Lys Arg Asn Tyr Asn Ala Lys

325 325

<210> 32<210> 32

<211> 326<211> 326

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 32<400> 32

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Thr Ile Ile Ile Ser Val Val Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr Thr Ile Ile Ile Ser Val Val Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Gly Arg Phe Ser Phe Ala Phe Ser Ala Leu Ala Glu Thr Leu Asp Asn Gly Arg Phe Ser Phe Ala Phe Ser Ala Leu Ala Glu Thr Leu Asp Asn

100 105 110 100 105 110

Gln Lys Glu Pro Glu Lys Leu Thr Ile Glu Pro Ser Val Lys Asn Gln Gln Lys Glu Pro Glu Lys Leu Thr Ile Glu Pro Ser Val Lys Asn Gln

115 120 125 115 120 125

Gln Leu Pro Leu Thr Val Ser Tyr Val Gly Gln Thr Ala Glu Asp Ala Gln Leu Pro Leu Thr Val Ser Tyr Val Gly Gln Thr Ala Glu Asp Ala

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160 145 150 155 160

Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu Lys Asp Asn Leu Ala Leu Gly Arg Lys Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu Lys Asp Asn Leu Ala Leu Gly Arg Lys

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240 225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

Gln Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Asn Leu Lys Val Asp Asp Gln Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Asn Leu Lys Val Asp Asp

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320 305 310 315 320

Arg Asn Tyr Asn Ser Lys Arg Asn Tyr Asn Ser Lys

325 325

<210> 33<210> 33

<211> 326<211> 326

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 33<400> 33

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gln Glu Glu Arg Glu Lys Leu Thr Ile Glu Pro Ser Val Lys Asn Gln Gln Glu Glu Arg Glu Lys Leu Thr Ile Glu Pro Ser Val Lys Asn Gln

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160 145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240 225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

Leu Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Met Leu Pro Ile Leu Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Met Leu Pro Ile

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320 305 310 315 320

Arg Asn Tyr Asn Ala Lys Arg Asn Tyr Asn Ala Lys

325 325

<210> 34<210> 34

<211> 327<211> 327

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 34<400> 34

Met Thr Val Asp Ser Asn Thr Ser Ser Gly Arg Gly Asn Asp Pro Glu Met Thr Val Asp Ser Asn Thr Ser Ser Gly Arg Gly Asn Asp Pro Glu

1 5 10 15 1 5 10 15

Gln Ile Asp Leu Ile Glu Leu Leu Leu Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met Gln Ile Asp Leu Ile Glu Leu Leu Leu Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met

20 25 30 20 25 30

Thr Ile Ile Val Ala Val Ile Ile Ala Ile Leu Leu Ala Val Gly Tyr Thr Ile Ile Val Ala Val Ile Ile Ala Ile Leu Leu Ala Val Gly Tyr

35 40 45 35 40 45

Leu Met Ile Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln Leu Met Ile Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln

50 55 60 50 55 60

Pro Asp Ala Ala Gln Val Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Leu Asn Val Leu Pro Asp Ala Ala Gln Val Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Leu Asn Val Leu

65 70 75 80 65 70 75 80

Tyr Gly Gly Asn Ala Pro Lys Ile Ser Glu Val Gln Ala Asn Phe Ile Tyr Gly Gly Asn Ala Pro Lys Ile Ser Glu Val Gln Ala Asn Phe Ile

85 90 95 85 90 95

Ser Arg Phe Ser Ser Ala Phe Ser Ala Leu Ser Glu Val Leu Asp Asn Ser Arg Phe Ser Ser Ala Phe Ser Ala Leu Ser Glu Val Leu Asp Asn

100 105 110 100 105 110

Gln Lys Glu Arg Glu Lys Leu Thr Ile Glu Gln Ser Val Lys Gly Gln Gln Lys Glu Arg Glu Lys Leu Thr Ile Glu Gln Ser Val Lys Gly Gln

115 120 125 115 120 125

Ala Leu Pro Leu Ser Val Ser Tyr Val Ser Thr Thr Ala Glu Gly Ala Ala Leu Pro Leu Ser Val Ser Tyr Val Ser Thr Thr Ala Glu Gly Ala

130 135 140 130 135 140

Gln Arg Arg Leu Ala Glu Tyr Ile Gln Gln Val Asp Glu Glu Val Ala Gln Arg Arg Leu Ala Glu Tyr Ile Gln Gln Val Asp Glu Glu Val Ala

145 150 155 160 145 150 155 160

Lys Glu Leu Glu Val Asp Leu Lys Asp Asn Ile Thr Leu Gln Thr Lys Lys Glu Leu Glu Val Asp Leu Lys Asp Asn Ile Thr Leu Gln Thr Lys

165 170 175 165 170 175

Thr Leu Gln Glu Ser Leu Glu Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln Thr Leu Gln Glu Ser Leu Glu Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln

180 185 190 180 185 190

Lys Asp Leu Arg Ile Lys Gln Ile Glu Glu Ala Leu Arg Tyr Ala Asp Lys Asp Leu Arg Ile Lys Gln Ile Glu Glu Ala Leu Arg Tyr Ala Asp

195 200 205 195 200 205

Glu Ala Lys Ile Thr Gln Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gln Asp Val Thr Glu Ala Lys Ile Thr Gln Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gln Asp Val Thr

210 215 220 210 215 220

Gln Asp Thr Met Phe Leu Leu Gly Ser Asp Ala Leu Lys Ser Met Ile Gln Asp Thr Met Phe Leu Leu Gly Ser Asp Ala Leu Lys Ser Met Ile

225 230 235 240 225 230 235 240

Gln Asn Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Ala Tyr Tyr Gln Gln Asn Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Ala Tyr Tyr Gln

245 250 255 245 250 255

Thr Lys Gln Thr Leu Leu Asp Ile Lys Asn Leu Lys Val Thr Ala Asp Thr Lys Gln Thr Leu Leu Asp Ile Lys Asn Leu Lys Val Thr Ala Asp

260 265 270 260 265 270

Thr Val His Val Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Val Arg Thr Val His Val Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Val Arg

275 280 285 275 280 285

Arg Asp Ser Pro Lys Thr Ala Ile Thr Leu Val Leu Ala Val Leu Leu Arg Asp Ser Pro Lys Thr Ala Ile Thr Leu Val Leu Ala Val Leu Leu

290 295 300 290 295 300

Gly Gly Met Ile Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu Arg Gly Gly Met Ile Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu Arg

305 310 315 320 305 310 315 320

Ser Tyr Lys Pro Lys Ala Leu Ser Tyr Lys Pro Lys Ala Leu

325 325

<210> 35<210> 35

<211> 377<211> 377

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 35<400> 35

Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Asp Ala His Phe Pro Asp Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Asp Ala His Phe Pro Asp

1 5 10 15 1 5 10 15

Tyr Pro Leu Ala Ser Pro Ser Asn Asn Glu Ile Asp Leu Leu Asn Leu Tyr Pro Leu Ala Ser Pro Ser Asn Asn Glu Ile Asp Leu Leu Asn Leu

20 25 30 20 25 30

Ile Ser Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe Ile Ser Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe

35 40 45 35 40 45

Ala Phe Ala Cys Ala Gly Leu Leu Ile Ser Phe Ile Leu Pro Gln Lys Ala Phe Ala Cys Ala Gly Leu Leu Ile Ser Phe Ile Leu Pro Gln Lys

50 55 60 50 55 60

Trp Thr Ser Ala Ala Val Val Thr Pro Pro Glu Pro Val Gln Trp Gln Trp Thr Ser Ala Ala Val Val Thr Pro Pro Glu Pro Val Gln Trp Gln

65 70 75 80 65 70 75 80

Glu Leu Glu Lys Ser Phe Thr Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp Ile Glu Leu Glu Lys Ser Phe Thr Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp Ile

85 90 95 85 90 95

Lys Ile Asp Arg Thr Glu Ala Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Gln Lys Ile Asp Arg Thr Glu Ala Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Gln

100 105 110 100 105 110

Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met

115 120 125 115 120 125

Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Glu Leu Asp Leu His Arg Ala Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Glu Leu Asp Leu His Arg Ala

130 135 140 130 135 140

Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser

145 150 155 160 145 150 155 160

Lys Lys Lys Asp Glu Pro Ser Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe Lys Lys Lys Asp Glu Pro Ser Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe

165 170 175 165 170 175

Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Thr Val Leu Ser Gly Tyr Ile Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Thr Val Leu Ser Gly Tyr Ile

180 185 190 180 185 190

Asp Tyr Ile Ser Thr Leu Val Val Lys Glu Ser Leu Glu Asn Val Arg Asp Tyr Ile Ser Thr Leu Val Val Lys Glu Ser Leu Glu Asn Val Arg

195 200 205 195 200 205

Asn Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gln Phe Glu Lys Glu Lys Leu Ala Gln Asn Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gln Phe Glu Lys Glu Lys Leu Ala Gln

210 215 220 210 215 220

Asp Arg Ile Lys Thr Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu Asp Arg Ile Lys Thr Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu

225 230 235 240 225 230 235 240

Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val

245 250 255 245 250 255

Tyr Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser Tyr Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser

260 265 270 260 265 270

Leu Gly Ala Asp Gly Ile Glu Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Ala Val Leu Gly Ala Asp Gly Ile Glu Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Ala Val

275 280 285 275 280 285

Thr Asp Val Ala Glu Leu Asn Gly Glu Leu Arg Asn Arg Gln Tyr Leu Thr Asp Val Ala Glu Leu Asn Gly Glu Leu Arg Asn Arg Gln Tyr Leu

290 295 300 290 295 300

Val Glu Gln Leu Thr Lys Ala His Val Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro Val Glu Gln Leu Thr Lys Ala His Val Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro

305 310 315 320 305 310 315 320

Phe Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro Phe Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro

325 330 335 325 330 335

Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Ile Gly Gly Met Val Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Ile Gly Gly Met Val

340 345 350 340 345 350

Ala Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg Tyr Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln Ala Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg Tyr Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln

355 360 365 355 360 365

Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val

370 375 370 375

<210> 36<210> 36

<211> 377<211> 377

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 36<400> 36

Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Glu Ala His Phe Pro Glu Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Glu Ala His Phe Pro Glu

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Ile Glu Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe Ile Glu Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

Glu Leu Glu Lys Thr Phe Thr Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp Ile Glu Leu Glu Lys Thr Phe Thr Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp Ile

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Pro Leu Asp Leu His Arg Ala Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Pro Leu Asp Leu His Arg Ala

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160 145 150 155 160

Lys Lys Lys Asp Glu Ser Ala Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe Lys Lys Lys Asp Glu Ser Ala Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe

165 170 175 165 170 175

Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Lys Val Leu Ala Gly Tyr Ile Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Lys Val Leu Ala Gly Tyr Ile

180 185 190 180 185 190

Asp Tyr Ile Ser Ala Leu Val Val Lys Glu Ser Ile Glu Asn Val Arg Asp Tyr Ile Ser Ala Leu Val Val Lys Glu Ser Ile Glu Asn Val Arg

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240 225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

Val Glu Gln Leu Thr Lys Thr Asn Ile Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro Val Glu Gln Leu Thr Lys Thr Asn Ile Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro

305 310 315 320 305 310 315 320

Phe Lys Tyr Gln Leu Arg Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Gln Phe Lys Tyr Gln Leu Arg Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Gln

325 330 335 325 330 335

Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Val Gly Gly Met Val Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Val Gly Gly Met Val

340 345 350 340 345 350

Ala Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg His Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln Ala Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg His Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln

355 360 365 355 360 365

Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val

370 375 370 375

<210> 37<210> 37

<211> 377<211> 377

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 37<400> 37

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160 145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240 225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320 305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val

370 375 370 375

<210> 38<210> 38

<211> 377<211> 377

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 38<400> 38

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160 145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Asp Arg Ile Lys Met Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu Asp Arg Ile Lys Met Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu

225 230 235 240 225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

Val Glu Gln Leu Thr Lys Ala Asn Ile Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro Val Glu Gln Leu Thr Lys Ala Asn Ile Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro

305 310 315 320 305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

Ala Cys Gly Ser Val Leu Leu Arg Tyr Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln Ala Cys Gly Ser Val Leu Leu Arg Tyr Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln

355 360 365 355 360 365

Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val

370 375 370 375

<210> 39<210> 39

<211> 378<211> 378

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 39<400> 39

Met Pro Ser Leu Asn Val Lys Gln Glu Lys Asn Gln Ser Phe Ala Gly Met Pro Ser Leu Asn Val Lys Gln Glu Lys Asn Gln Ser Phe Ala Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Tyr Ser Leu Pro Pro Ala Asn Ser His Glu Ile Asp Leu Phe Ser Leu Tyr Ser Leu Pro Pro Ala Asn Ser His Glu Ile Asp Leu Phe Ser Leu

20 25 30 20 25 30

Ile Glu Val Leu Trp Gln Ala Lys Arg Arg Ile Leu Ala Thr Val Phe Ile Glu Val Leu Trp Gln Ala Lys Arg Arg Ile Leu Ala Thr Val Phe

35 40 45 35 40 45

Ala Phe Ala Cys Val Gly Leu Leu Leu Ser Phe Leu Leu Pro Gln Lys Ala Phe Ala Cys Val Gly Leu Leu Leu Ser Phe Leu Leu Pro Gln Lys

50 55 60 50 55 60

Trp Thr Ser Gln Ala Ile Val Thr Pro Ala Glu Ser Val Gln Trp Gln Trp Thr Ser Gln Ala Ile Val Thr Pro Ala Glu Ser Val Gln Trp Gln

65 70 75 80 65 70 75 80

Gly Leu Glu Arg Thr Leu Thr Ala Leu Arg Val Leu Asp Met Glu Val Gly Leu Glu Arg Thr Leu Thr Ala Leu Arg Val Leu Asp Met Glu Val

85 90 95 85 90 95

Ser Val Asp Arg Gly Ser Val Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Ser Ser Val Asp Arg Gly Ser Val Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Ser

100 105 110 100 105 110

Ser Pro Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met Ser Pro Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met

115 120 125 115 120 125

Asp Gln Leu Lys Gly Ala Gln Ile Asp Glu Gln Asp Leu His Arg Ala Asp Gln Leu Lys Gly Ala Gln Ile Asp Glu Gln Asp Leu His Arg Ala

130 135 140 130 135 140

Ile Val Leu Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Ser Asn Val Gly Ile Val Leu Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Ser Asn Val Gly

145 150 155 160 145 150 155 160

Lys Lys Asn Glu Thr Ser Leu Phe Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe Thr Lys Lys Asn Glu Thr Ser Leu Phe Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe Thr

165 170 175 165 170 175

Ala Pro Thr Arg Glu Glu Ala Gln Lys Val Leu Ala Gly Tyr Ile Gln Ala Pro Thr Arg Glu Glu Ala Gln Lys Val Leu Ala Gly Tyr Ile Gln

180 185 190 180 185 190

Tyr Ile Ser Asp Ile Val Val Lys Glu Thr Leu Glu Asn Ile Arg Asn Tyr Ile Ser Asp Ile Val Val Lys Glu Thr Leu Glu Asn Ile Arg Asn

195 200 205 195 200 205

Gln Leu Glu Ile Lys Thr Arg Tyr Glu Gln Glu Lys Leu Ala Met Asp Gln Leu Glu Ile Lys Thr Arg Tyr Glu Gln Glu Lys Leu Ala Met Asp

210 215 220 210 215 220

Arg Val Arg Leu Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu His Arg Val Arg Leu Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu His

225 230 235 240 225 230 235 240

Tyr Ser Leu Glu Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Arg Pro Val Tyr Tyr Ser Leu Glu Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Arg Pro Val Tyr

245 250 255 245 250 255

Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser Leu Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser Leu

260 265 270 260 265 270

Gly Ala Asp Gly Ile Ser Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Gly Val Thr Gly Ala Asp Gly Ile Ser Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Gly Val Thr

275 280 285 275 280 285

Asp Val Ala Glu Ile Asp Gly Asp Leu Arg Asn Arg Gln Tyr His Val Asp Val Ala Glu Ile Asp Gly Asp Leu Arg Asn Arg Gln Tyr His Val

290 295 300 290 295 300

Glu Gln Leu Ala Ala Met Asn Val Ser Asp Val Lys Phe Thr Pro Phe Glu Gln Leu Ala Ala Met Asn Val Ser Asp Val Lys Phe Thr Pro Phe

305 310 315 320 305 310 315 320

Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro Gly Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro Gly

325 330 335 325 330 335

Lys Ala Ile Ile Ile Ile Leu Ala Ala Leu Ile Gly Gly Met Met Ala Lys Ala Ile Ile Ile Ile Leu Ala Ala Leu Ile Gly Gly Met Met Ala

340 345 350 340 345 350

Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg His Ala Met Val Ser Arg Lys Met Glu Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg His Ala Met Val Ser Arg Lys Met Glu

355 360 365 355 360 365

Asn Ala Leu Ala Ile Asp Glu Arg Leu Val Asn Ala Leu Ala Ile Asp Glu Arg Leu Val

370 375 370 375

<210> 40<210> 40

<211> 22<211> 22

<212> DNA<212> DNA

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 40<400> 40

gaagcaaacc gtacgcgtaa ag 22gaagcaaacc gtacgcgtaa ag 22

<210> 41<210> 41

<211> 20<211> 20

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 41<400> 41

cgaccagctc ttacacggcg 20cgaccagctc ttacacggcg 20

<210> 42<210> 42

<211> 36<211> 36

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 42<400> 42

gaaataggac cactaataaa tacacaaatt aataac 36gaaataggac cactaataaa tacacaaatt aataac 36

<210> 43<210> 43

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 43<400> 43

ataattgacg atccggttgc c 21ataattgacg atccggttgc from 21

<210> 44<210> 44

<211> 27<211> 27

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 44<400> 44

gctatttacg ccctgattgt cttttgt 27gctatttacg ccctgattgt cttttgt 27

<210> 45<210> 45

<211> 22<211> 22

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 45<400> 45

attgagaacc tgcgtaaacg gc 22attgagaacc tgcgtaaacg gc 22

<210> 46<210> 46

<211> 24<211> 24

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 46<400> 46

tgaagagcgg ttcagataac ttcc 24tgaagagcgg ttcagataac ttcc 24

<210> 47<210> 47

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 47<400> 47

cgatccggaa acctcctaca c 21cgatccggaa acctcctaca from 21

<210> 48<210> 48

<211> 26<211> 26

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 48<400> 48

gattattcgc gcaacgctaa acagat 26gattattcgc gcaacgctaa acagat 26

<210> 49<210> 49

<211> 23<211> 23

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 49<400> 49

tgatcattga cgatccggta gcc 23tgatcattga cgatccggta gcc 23

<210> 50<210> 50

<211> 70<211> 70

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 50<400> 50

cggtagctgt aaagccaggg gcggtagcgt ggtttaaacc caagcaacag atcggcgtcg 60cggtagctgt aaagccaggg gcggtagcgt ggtttaaacc caagcaacag atcggcgtcg 60

tcggtatgga 70tcggtatgga 70

<210> 51<210> 51

<211> 78<211> 78

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 51<400> 51

agcttccata ccgacgacgc cgatctgttg cttgggttta aaccacgcta ccgcccctgg 60agcttccata ccgacgacgc cgatctgttg cttgggttta aaccacgcta ccgcccctgg 60

ctttacagct accgagct 78ctttacagct accgagct 78

<210> 52<210> 52

<211> 30<211> 30

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 52<400> 52

ggtagctgta aagccagggg cggtagcgtg 30ggtagctgta aagccagggg cggtagcgtg 30

<210> 53<210> 53

<211> 30<211> 30

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 53<400> 53

ccataccgac gacgccgatc tgttgcttgg 30ccataccgac gacgccgatc tgttgcttgg 30

<210> 54<210> 54

<211> 19<211> 19

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 54<400> 54

Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Thr Gly Ser Thr Gly

<210> 55<210> 55

<211> 23<211> 23

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 55<400> 55

Met Gly Val Pro Arg Pro Gln Pro Trp Ala Leu Gly Leu Leu Leu Phe Met Gly Val Pro Arg Pro Gln Pro Trp Ala Leu Gly Leu Leu Leu Phe

1 5 10 15 1 5 10 15

Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly

20 20

<210> 56<210> 56

<211> 18<211> 18

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 56<400> 56

Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val

1 5 10 15 1 5 10 15

Arg Ala Arg Ala

<210> 57<210> 57

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Респираторный синцитиальный вирус А человека (штамм A2)<213> Human respiratory syncytial virus A (strain A2)

<400> 57<400> 57

Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr

1 5 10 15 1 5 10 15

Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly

20 25 20 25

<210> 58<210> 58

<211> 15<211> 15

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Вирус гриппа A (штамм A/Japan/305/1957 H2N2)<213> Influenza A virus (strain A/Japan/305/1957 H2N2)

<400> 58<400> 58

Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

<210> 59<210> 59

<211> 207<211> 207

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 59<400> 59

Met Glu Gly Met Asp Pro Leu Ala Val Leu Ala Glu Ser Arg Leu Leu Met Glu Gly Met Asp Pro Leu Ala Val Leu Ala Glu Ser Arg Leu Leu

1 5 10 15 1 5 10 15

Pro Leu Leu Thr Val Arg Gly Gly Glu Asp Leu Ala Gly Leu Ala Thr Pro Leu Leu Thr Val Arg Gly Gly Glu Asp Leu Ala Gly Leu Ala Thr

20 25 30 20 25 30

Val Leu Glu Leu Met Gly Val Gly Ala Leu Glu Ile Thr Leu Arg Thr Val Leu Glu Leu Met Gly Val Gly Ala Leu Glu Ile Thr Leu Arg Thr

35 40 45 35 40 45

Glu Lys Gly Leu Glu Ala Leu Lys Ala Leu Arg Lys Ser Gly Leu Leu Glu Lys Gly Leu Glu Ala Leu Lys Ala Leu Arg Lys Ser Gly Leu Leu

50 55 60 50 55 60

Leu Gly Ala Gly Thr Val Arg Ser Pro Lys Glu Ala Glu Ala Ala Leu Leu Gly Ala Gly Thr Val Arg Ser Pro Lys Glu Ala Glu Ala Ala Leu

65 70 75 80 65 70 75 80

Glu Ala Gly Ala Ala Phe Leu Val Ser Pro Gly Leu Leu Glu Glu Val Glu Ala Gly Ala Ala Phe Leu Val Ser Pro Gly Leu Leu Glu Glu Val

85 90 95 85 90 95

Ala Ala Leu Ala Gln Ala Arg Gly Val Pro Tyr Leu Pro Gly Val Leu Ala Ala Leu Ala Gln Ala Arg Gly Val Pro Tyr Leu Pro Gly Val Leu

100 105 110 100 105 110

Thr Pro Thr Glu Val Glu Arg Ala Leu Ala Leu Gly Leu Ser Ala Leu Thr Pro Thr Glu Val Glu Arg Ala Leu Ala Leu Gly Leu Ser Ala Leu

115 120 125 115 120 125

Lys Phe Phe Pro Ala Glu Pro Phe Gln Gly Val Arg Val Leu Arg Ala Lys Phe Phe Pro Ala Glu Pro Phe Gln Gly Val Arg Val Leu Arg Ala

130 135 140 130 135 140

Tyr Ala Glu Val Phe Pro Glu Val Arg Phe Leu Pro Thr Gly Gly Ile Tyr Ala Glu Val Phe Pro Glu Val Arg Phe Leu Pro Thr Gly Gly Ile

145 150 155 160 145 150 155 160

Lys Glu Glu His Leu Pro His Tyr Ala Ala Leu Pro Asn Leu Leu Ala Lys Glu Glu His Leu Pro His Tyr Ala Ala Leu Pro Asn Leu Leu Ala

165 170 175 165 170 175

Val Gly Gly Ser Trp Leu Leu Gln Gly Asp Leu Ala Ala Val Met Lys Val Gly Gly Ser Trp Leu Leu Gln Gly Asp Leu Ala Ala Val Met Lys

180 185 190 180 185 190

Lys Val Lys Ala Ala Lys Ala Leu Leu Ser Pro Gln Ala Pro Gly Lys Val Lys Ala Ala Lys Ala Leu Leu Ser Pro Gln Ala Pro Gly

195 200 205 195 200 205

<210> 60<210> 60

<211> 156<211> 156

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 60<400> 60

Met Thr Lys Lys Val Gly Ile Val Asp Thr Thr Phe Ala Arg Val Asp Met Thr Lys Lys Val Gly Ile Val Asp Thr Thr Phe Ala Arg Val Asp

1 5 10 15 1 5 10 15

Met Ala Glu Ala Ala Ile Arg Thr Leu Lys Ala Leu Ser Pro Asn Ile Met Ala Glu Ala Ala Ile Arg Thr Leu Lys Ala Leu Ser Pro Asn Ile

20 25 30 20 25 30

Lys Ile Ile Arg Lys Thr Val Pro Gly Ile Lys Asp Leu Pro Val Ala Lys Ile Ile Arg Lys Thr Val Pro Gly Ile Lys Asp Leu Pro Val Ala

35 40 45 35 40 45

Cys Lys Lys Leu Leu Glu Glu Glu Gly Cys Asp Ile Val Met Ala Leu Cys Lys Lys Leu Leu Glu Glu Glu Gly Cys Asp Ile Val Met Ala Leu

50 55 60 50 55 60

Gly Met Pro Gly Lys Ala Glu Lys Asp Lys Val Cys Ala His Glu Ala Gly Met Pro Gly Lys Ala Glu Lys Asp Lys Val Cys Ala His Glu Ala

65 70 75 80 65 70 75 80

Ser Leu Gly Leu Met Leu Ala Gln Leu Met Thr Asn Lys His Ile Ile Ser Leu Gly Leu Met Leu Ala Gln Leu Met Thr Asn Lys His Ile Ile

85 90 95 85 90 95

Glu Val Phe Val His Glu Asp Glu Ala Lys Asp Asp Asp Glu Leu Asp Glu Val Phe Val His Glu Asp Glu Ala Lys Asp Asp Asp Glu Leu Asp

100 105 110 100 105 110

Ile Leu Ala Leu Val Arg Ala Ile Glu His Ala Ala Asn Val Tyr Tyr Ile Leu Ala Leu Val Arg Ala Ile Glu His Ala Ala Asn Val Tyr Tyr

115 120 125 115 120 125

Leu Leu Phe Lys Pro Glu Tyr Leu Thr Arg Met Ala Gly Lys Gly Leu Leu Leu Phe Lys Pro Glu Tyr Leu Thr Arg Met Ala Gly Lys Gly Leu

130 135 140 130 135 140

Arg Gln Gly Arg Glu Asp Ala Gly Pro Ala Arg Glu Arg Gln Gly Arg Glu Asp Ala Gly Pro Ala Arg Glu

145 150 155 145 150 155

<210> 61<210> 61

<211> 156<211> 156

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 61<400> 61

1 5 10 15 1 5 10 15

Met Ala Ser Ala Ala Ile Leu Thr Leu Lys Met Glu Ser Pro Asn Ile Met Ala Ser Ala Ala Ile Leu Thr Leu Lys Met Glu Ser Pro Asn Ile

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Glu Val Phe Val His Glu Asp Glu Ala Lys Asp Asp Ala Glu Leu Lys Glu Val Phe Val His Glu Asp Glu Ala Lys Asp Asp Ala Glu Leu Lys

100 105 110 100 105 110

Ile Leu Ala Ala Arg Arg Ala Ile Glu His Ala Leu Asn Val Tyr Tyr Ile Leu Ala Ala Arg Arg Ala Ile Glu His Ala Leu Asn Val Tyr Tyr

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

Arg Gln Gly Phe Glu Asp Ala Gly Pro Ala Arg Glu Arg Gln Gly Phe Glu Asp Ala Gly Pro Ala Arg Glu

145 150 155 145 150 155

<210> 62<210> 62

<211> 209<211> 209

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 62<400> 62

Met Ser Thr Ile Asn Asn Gln Leu Lys Ala Leu Lys Val Ile Pro Val Met Ser Thr Ile Asn Asn Gln Leu Lys Ala Leu Lys Val Ile Pro Val

1 5 10 15 1 5 10 15

Ile Ala Ile Asp Asn Ala Glu Asp Ile Ile Pro Leu Gly Lys Val Leu Ile Ala Ile Asp Asn Ala Glu Asp Ile Ile Pro Leu Gly Lys Val Leu

20 25 30 20 25 30

Ala Glu Asn Gly Leu Pro Ala Ala Glu Ile Thr Phe Arg Ser Ser Ala Ala Glu Asn Gly Leu Pro Ala Ala Glu Ile Thr Phe Arg Ser Ser Ala

35 40 45 35 40 45

Ala Val Lys Ala Ile Met Leu Leu Arg Ser Ala Gln Pro Glu Met Leu Ala Val Lys Ala Ile Met Leu Leu Arg Ser Ala Gln Pro Glu Met Leu

50 55 60 50 55 60

Ile Gly Ala Gly Thr Ile Leu Asn Gly Val Gln Ala Leu Ala Ala Lys Ile Gly Ala Gly Thr Ile Leu Asn Gly Val Gln Ala Leu Ala Ala Lys

65 70 75 80 65 70 75 80

Glu Ala Gly Ala Thr Phe Val Val Ser Pro Gly Phe Asn Pro Asn Thr Glu Ala Gly Ala Thr Phe Val Val Ser Pro Gly Phe Asn Pro Asn Thr

85 90 95 85 90 95

Val Arg Ala Cys Gln Ile Ile Gly Ile Asp Ile Val Pro Gly Val Asn Val Arg Ala Cys Gln Ile Ile Gly Ile Asp Ile Val Pro Gly Val Asn

100 105 110 100 105 110

Asn Pro Ser Thr Val Glu Ala Ala Leu Glu Met Gly Leu Thr Thr Leu Asn Pro Ser Thr Val Glu Ala Ala Leu Glu Met Gly Leu Thr Thr Leu

115 120 125 115 120 125

Lys Phe Phe Pro Ala Glu Ala Ser Gly Gly Ile Ser Met Val Lys Ser Lys Phe Phe Pro Ala Glu Ala Ser Gly Gly Ile Ser Met Val Lys Ser

130 135 140 130 135 140

Leu Val Gly Pro Tyr Gly Asp Ile Arg Leu Met Pro Thr Gly Gly Ile Leu Val Gly Pro Tyr Gly Asp Ile Arg Leu Met Pro Thr Gly Gly Ile

145 150 155 160 145 150 155 160

Thr Pro Ser Asn Ile Asp Asn Tyr Leu Ala Ile Pro Gln Val Leu Ala Thr Pro Ser Asn Ile Asp Asn Tyr Leu Ala Ile Pro Gln Val Leu Ala

165 170 175 165 170 175

Cys Gly Gly Thr Trp Met Val Asp Lys Lys Leu Val Thr Asn Gly Glu Cys Gly Gly Thr Trp Met Val Asp Lys Lys Leu Val Thr Asn Gly Glu

180 185 190 180 185 190

Trp Asp Glu Ile Ala Arg Leu Thr Arg Glu Ile Val Glu Gln Val Asn Trp Asp Glu Ile Ala Arg Leu Thr Arg Glu Ile Val Glu Gln Val Asn

195 200 205 195 200 205

Pro Pro

<210> 63<210> 63

<211> 114<211> 114

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 63<400> 63

Met Pro Ile Phe Thr Leu Asn Thr Asn Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro Met Pro Ile Phe Thr Leu Asn Thr Asn Ile Lys Ala Thr Asp Val Pro

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Asp Phe Leu Ser Leu Thr Ser Arg Leu Val Gly Leu Ile Leu Ser Ser Asp Phe Leu Ser Leu Thr Ser Arg Leu Val Gly Leu Ile Leu Ser

20 25 30 20 25 30

Lys Pro Gly Ser Tyr Val Ala Val His Ile Asn Thr Asp Gln Gln Leu Lys Pro Gly Ser Tyr Val Ala Val His Ile Asn Thr Asp Gln Gln Leu

35 40 45 35 40 45

Ser Phe Gly Gly Ser Thr Asn Pro Ala Ala Phe Gly Thr Leu Met Ser Ser Phe Gly Gly Ser Thr Asn Pro Ala Ala Phe Gly Thr Leu Met Ser

50 55 60 50 55 60

Ile Gly Gly Ile Glu Pro Ser Lys Asn Arg Asp His Ser Ala Val Leu Ile Gly Gly Ile Glu Pro Ser Lys Asn Arg Asp His Ser Ala Val Leu

65 70 75 80 65 70 75 80

Phe Asp His Leu Asn Ala Met Leu Gly Ile Pro Lys Asn Arg Met Tyr Phe Asp His Leu Asn Ala Met Leu Gly Ile Pro Lys Asn Arg Met Tyr

85 90 95 85 90 95

Ile His Phe Val Asn Leu Asn Gly Asp Asp Val Gly Trp Asn Gly Thr Ile His Phe Val Asn Leu Asn Gly Asp Asp Val Gly Trp Asn Gly Thr

100 105 110 100 105 110

Thr Phe Thr Phe

<210> 64<210> 64

<211> 157<211> 157

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 64<400> 64

Met Asn Gln His Ser His Lys Asp Tyr Glu Thr Val Arg Ile Ala Val Met Asn Gln His Ser His Lys Asp Tyr Glu Thr Val Arg Ile Ala Val

1 5 10 15 1 5 10 15

Val Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Ala Cys Val Glu Ala Val Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Ala Cys Val Glu Ala

20 25 30 20 25 30

Phe Glu Ile Ala Met Ala Ala Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp Phe Glu Ile Ala Met Ala Ala Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp

35 40 45 35 40 45

Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr

50 55 60 50 55 60

Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val

65 70 75 80 65 70 75 80

Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile

85 90 95 85 90 95

Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Ser Thr Gly Val Pro Val Leu Ser Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Ser Thr Gly Val Pro Val Leu Ser

100 105 110 100 105 110

Ala Val Leu Thr Pro His Arg Tyr Arg Asp Ser Ala Glu His His Arg Ala Val Leu Thr Pro His Arg Tyr Arg Asp Ser Ala Glu His His Arg

115 120 125 115 120 125

Phe Phe Ala Ala His Phe Ala Val Lys Gly Val Glu Ala Ala Arg Ala Phe Phe Ala Ala His Phe Ala Val Lys Gly Val Glu Ala Ala Arg Ala

130 135 140 130 135 140

Cys Ile Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala Cys Ile Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala

145 150 155 145 150 155

<210> 65<210> 65

<211> 205<211> 205

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 65<400> 65

Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu

1 5 10 15 1 5 10 15

Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe

20 25 30 20 25 30

Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala

35 40 45 35 40 45

Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile

50 55 60 50 55 60

Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val

65 70 75 80 65 70 75 80

Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile

85 90 95 85 90 95

Ser Gln Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met Ser Gln Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met

100 105 110 100 105 110

Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Thr Ile Leu Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Thr Ile Leu

115 120 125 115 120 125

Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met

130 135 140 130 135 140

Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn

145 150 155 160 145 150 155 160

Leu Asp Asn Val Cys Glu Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly Leu Asp Asn Val Cys Glu Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly

165 170 175 165 170 175

Val Gly Ser Ala Leu Val Lys Gly Thr Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys Val Gly Ser Ala Leu Val Lys Gly Thr Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys

180 185 190 180 185 190

Ala Lys Ala Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu Ala Lys Ala Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu

195 200 205 195 200 205

<210> 66<210> 66

<211> 157<211> 157

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 66<400> 66

1 5 10 15 1 5 10 15

Val Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala Val Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala

20 25 30 20 25 30

Phe Glu Ala Ala Met Ala Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp Phe Glu Ala Ala Met Ala Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Ala Val Leu Thr Pro His Arg Tyr Arg Asp Ser Asp Ala His Thr Leu Ala Val Leu Thr Pro His Arg Tyr Arg Asp Ser Asp Ala His Thr Leu

115 120 125 115 120 125

Leu Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala Leu Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala

130 135 140 130 135 140

Cys Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala Cys Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala

145 150 155 145 150 155

<210> 67<210> 67

<211> 177<211> 177

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 67<400> 67

Met Phe Thr Lys Ser Gly Asp Asp Gly Asn Thr Asn Val Ile Asn Lys Met Phe Thr Lys Ser Gly Asp Asp Gly Asn Thr Asn Val Ile Asn Lys

1 5 10 15 1 5 10 15

Arg Val Gly Lys Asp Ser Pro Leu Val Asn Phe Leu Gly Asp Leu Asp Arg Val Gly Lys Asp Ser Pro Leu Val Asn Phe Leu Gly Asp Leu Asp

20 25 30 20 25 30

Glu Leu Asn Ser Phe Ile Gly Phe Ala Ile Ser Lys Ile Pro Trp Glu Glu Leu Asn Ser Phe Ile Gly Phe Ala Ile Ser Lys Ile Pro Trp Glu

35 40 45 35 40 45

Asp Met Lys Lys Asp Leu Glu Arg Val Gln Val Glu Leu Phe Glu Ile Asp Met Lys Lys Asp Leu Glu Arg Val Gln Val Glu Leu Phe Glu Ile

50 55 60 50 55 60

Gly Glu Asp Leu Ser Thr Gln Ser Ser Lys Lys Lys Ile Asp Glu Ser Gly Glu Asp Leu Ser Thr Gln Ser Ser Lys Lys Lys Ile Asp Glu Ser

65 70 75 80 65 70 75 80

Tyr Val Leu Trp Leu Leu Ala Ala Thr Ala Ile Tyr Arg Ile Glu Ser Tyr Val Leu Trp Leu Leu Ala Ala Thr Ala Ile Tyr Arg Ile Glu Ser

85 90 95 85 90 95

Gly Pro Val Lys Leu Phe Val Ile Pro Gly Gly Ser Glu Glu Ala Ser Gly Pro Val Lys Leu Phe Val Ile Pro Gly Gly Ser Glu Glu Ala Ser

100 105 110 100 105 110

Val Leu His Val Thr Arg Ser Val Ala Arg Arg Val Glu Arg Asn Ala Val Leu His Val Thr Arg Ser Val Ala Arg Arg Val Glu Arg Asn Ala

115 120 125 115 120 125

Val Lys Tyr Thr Lys Glu Leu Pro Glu Ile Asn Arg Met Ile Ile Val Val Lys Tyr Thr Lys Glu Leu Pro Glu Ile Asn Arg Met Ile Ile Val

130 135 140 130 135 140

Tyr Leu Asn Arg Leu Ser Ser Leu Leu Phe Ala Met Ala Leu Val Ala Tyr Leu Asn Arg Leu Ser Ser Leu Leu Phe Ala Met Ala Leu Val Ala

145 150 155 160 145 150 155 160

Asn Lys Arg Arg Asn Gln Ser Glu Lys Ile Tyr Glu Ile Gly Lys Ser Asn Lys Arg Arg Asn Gln Ser Glu Lys Ile Tyr Glu Ile Gly Lys Ser

165 170 175 165 170 175

Trp Trp

<210> 68<210> 68

<211> 157<211> 157

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 68<400> 68

1 5 10 15 1 5 10 15

Val Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Gln Cys Val Arg Ala Val Arg Ala Arg Trp His Ala Asp Ile Val Asp Gln Cys Val Arg Ala

20 25 30 20 25 30

Phe Glu Glu Ala Met Ala Asp Ala Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp Phe Glu Glu Ala Met Ala Asp Ala Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Ala Val Leu Thr Pro His Arg Tyr Arg Ser Ser Arg Glu His His Glu Ala Val Leu Thr Pro His Arg Tyr Arg Ser Ser Arg Glu His His Glu

115 120 125 115 120 125

Phe Phe Arg Glu His Phe Met Val Lys Gly Val Glu Ala Ala Ala Ala Phe Phe Arg Glu His Phe Met Val Lys Gly Val Glu Ala Ala Ala Ala

130 135 140 130 135 140

Cys Ile Thr Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala Cys Ile Thr Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala

145 150 155 145 150 155

<210> 69<210> 69

<211> 201<211> 201

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 69<400> 69

Met Gly His Thr Lys Gly Pro Thr Pro Gln Gln His Asp Gly Ser Ala Met Gly His Thr Lys Gly Pro Thr Pro Gln Gln His Asp Gly Ser Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Leu Arg Ile Gly Ile Val His Ala Arg Trp Asn Lys Thr Ile Ile Met Leu Arg Ile Gly Ile Val His Ala Arg Trp Asn Lys Thr Ile Ile Met

20 25 30 20 25 30

Pro Leu Leu Ile Gly Thr Ile Ala Lys Leu Leu Glu Cys Gly Val Lys Pro Leu Leu Ile Gly Thr Ile Ala Lys Leu Leu Glu Cys Gly Val Lys

35 40 45 35 40 45

Ala Ser Asn Ile Val Val Gln Ser Val Pro Gly Ser Trp Glu Leu Pro Ala Ser Asn Ile Val Val Gln Ser Val Pro Gly Ser Trp Glu Leu Pro

50 55 60 50 55 60

Ile Ala Val Gln Arg Leu Tyr Ser Ala Ser Gln Leu Gln Thr Pro Ser Ile Ala Val Gln Arg Leu Tyr Ser Ala Ser Gln Leu Gln Thr Pro Ser

65 70 75 80 65 70 75 80

Ser Gly Pro Ser Leu Ser Ala Gly Asp Leu Leu Gly Ser Ser Thr Thr Ser Gly Pro Ser Leu Ser Ala Gly Asp Leu Leu Gly Ser Ser Thr Thr

85 90 95 85 90 95

Asp Leu Thr Ala Leu Pro Thr Thr Thr Ala Ser Ser Thr Gly Pro Phe Asp Leu Thr Ala Leu Pro Thr Thr Thr Ala Ser Ser Thr Gly Pro Phe

100 105 110 100 105 110

Asp Ala Leu Ile Ala Ile Gly Val Leu Ile Lys Gly Glu Thr Met His Asp Ala Leu Ile Ala Ile Gly Val Leu Ile Lys Gly Glu Thr Met His

115 120 125 115 120 125

Phe Glu Tyr Ile Ala Asp Ser Val Ser His Gly Leu Met Arg Val Gln Phe Glu Tyr Ile Ala Asp Ser Val Ser His Gly Leu Met Arg Val Gln

130 135 140 130 135 140

Leu Asp Thr Gly Val Pro Val Ile Phe Gly Val Leu Thr Val Leu Thr Leu Asp Thr Gly Val Pro Val Ile Phe Gly Val Leu Thr Val Leu Thr

145 150 155 160 145 150 155 160

Asp Asp Gln Ala Lys Ala Arg Ala Gly Val Ile Glu Gly Ser His Asn Asp Asp Gln Ala Lys Ala Arg Ala Gly Val Ile Glu Gly Ser His Asn

165 170 175 165 170 175

His Gly Glu Asp Trp Gly Leu Ala Ala Val Glu Met Gly Val Arg Arg His Gly Glu Asp Trp Gly Leu Ala Ala Val Glu Met Gly Val Arg Arg

180 185 190 180 185 190

Arg Asp Trp Ala Ala Gly Lys Thr Glu Arg Asp Trp Ala Ala Gly Lys Thr Glu

195 200 195 200

<210> 70<210> 70

<211> 237<211> 237

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 70<400> 70

Met Tyr Glu Val Asp His Ala Asp Val Tyr Asp Leu Phe Tyr Leu Gly Met Tyr Glu Val Asp His Ala Asp Val Tyr Asp Leu Phe Tyr Leu Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Arg Gly Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Ala Ser Asp Ile Ala Asp Leu Val Arg Gly Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Ala Ser Asp Ile Ala Asp Leu Val

20 25 30 20 25 30

Arg Ser Arg Thr Pro Glu Ala Ser Ser Leu Leu Asp Val Ala Cys Gly Arg Ser Arg Thr Pro Glu Ala Ser Ser Leu Leu Asp Val Ala Cys Gly

35 40 45 35 40 45

Thr Gly Thr His Leu Glu His Phe Thr Lys Glu Phe Gly Asp Thr Ala Thr Gly Thr His Leu Glu His Phe Thr Lys Glu Phe Gly Asp Thr Ala

50 55 60 50 55 60

Gly Leu Glu Leu Ser Glu Asp Met Leu Thr His Ala Arg Lys Arg Leu Gly Leu Glu Leu Ser Glu Asp Met Leu Thr His Ala Arg Lys Arg Leu

65 70 75 80 65 70 75 80

Pro Asp Ala Thr Leu His Gln Gly Asp Met Arg Asp Phe Gln Leu Gly Pro Asp Ala Thr Leu His Gln Gly Asp Met Arg Asp Phe Gln Leu Gly

85 90 95 85 90 95

Arg Lys Phe Ser Ala Val Val Ser Met Phe Ser Ser Val Gly Tyr Leu Arg Lys Phe Ser Ala Val Val Ser Met Phe Ser Ser Val Gly Tyr Leu

100 105 110 100 105 110

Lys Thr Val Ala Glu Leu Gly Ala Ala Val Ala Ser Phe Ala Glu His Lys Thr Val Ala Glu Leu Gly Ala Ala Val Ala Ser Phe Ala Glu His

115 120 125 115 120 125

Leu Glu Pro Gly Gly Val Val Val Val Glu Pro Trp Trp Phe Pro Glu Leu Glu Pro Gly Gly Val Val Val Val Glu Pro Trp Trp Phe Pro Glu

130 135 140 130 135 140

Thr Phe Ala Asp Gly Trp Val Ser Ala Asp Val Val Arg Arg Asp Gly Thr Phe Ala Asp Gly Trp Val Ser Ala Asp Val Val Arg Arg Asp Gly

145 150 155 160 145 150 155 160

Arg Thr Val Ala Arg Val Ser His Ser Val Arg Glu Gly Asn Ala Thr Arg Thr Val Ala Arg Val Ser His Ser Val Arg Glu Gly Asn Ala Thr

165 170 175 165 170 175

Arg Met Glu Val His Phe Thr Val Ala Asp Pro Gly Lys Gly Val Arg Arg Met Glu Val His Phe Thr Val Ala Asp Pro Gly Lys Gly Val Arg

180 185 190 180 185 190

His Phe Ser Asp Val His Leu Ile Thr Leu Phe His Gln Arg Glu Tyr His Phe Ser Asp Val His Leu Ile Thr Leu Phe His Gln Arg Glu Tyr

195 200 205 195 200 205

Glu Ala Ala Phe Met Ala Ala Gly Leu Arg Val Glu Tyr Leu Glu Gly Glu Ala Ala Phe Met Ala Ala Gly Leu Arg Val Glu Tyr Leu Glu Gly

210 215 220 210 215 220

Gly Pro Ser Gly Arg Gly Leu Phe Val Gly Val Pro Ala Gly Pro Ser Gly Arg Gly Leu Phe Val Gly Val Pro Ala

225 230 235 225 230 235

<210> 71<210> 71

<211> 138<211> 138

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 71<400> 71

Met Gly Met Lys Glu Lys Phe Val Leu Ile Ile Thr His Gly Asp Phe Met Gly Met Lys Glu Lys Phe Val Leu Ile Ile Thr His Gly Asp Phe

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly Lys Gly Leu Leu Ser Gly Ala Glu Val Ile Ile Gly Lys Gln Glu Gly Lys Gly Leu Leu Ser Gly Ala Glu Val Ile Ile Gly Lys Gln Glu

20 25 30 20 25 30

Asn Val His Thr Val Gly Leu Asn Leu Gly Asp Asn Ile Glu Lys Val Asn Val His Thr Val Gly Leu Asn Leu Gly Asp Asn Ile Glu Lys Val

35 40 45 35 40 45

Ala Lys Glu Val Met Arg Ile Ile Ile Ala Lys Leu Ala Glu Asp Lys Ala Lys Glu Val Met Arg Ile Ile Ile Ala Lys Leu Ala Glu Asp Lys

50 55 60 50 55 60

Glu Ile Ile Ile Val Val Asp Leu Phe Gly Gly Ser Pro Phe Asn Ile Glu Ile Ile Ile Val Val Asp Leu Phe Gly Gly Ser Pro Phe Asn Ile

65 70 75 80 65 70 75 80

Ala Leu Glu Met Met Lys Thr Phe Asp Val Lys Val Ile Thr Gly Ile Ala Leu Glu Met Met Lys Thr Phe Asp Val Lys Val Ile Thr Gly Ile

85 90 95 85 90 95

Asn Met Pro Met Leu Val Glu Leu Leu Thr Ser Ile Asn Val Tyr Asp Asn Met Pro Met Leu Val Glu Leu Leu Thr Ser Ile Asn Val Tyr Asp

100 105 110 100 105 110

Thr Thr Glu Leu Leu Glu Asn Ile Ser Lys Ile Gly Lys Asp Gly Ile Thr Thr Glu Leu Leu Glu Asn Ile Ser Lys Ile Gly Lys Asp Gly Ile

115 120 125 115 120 125

Lys Val Ile Glu Lys Ser Ser Leu Lys Met Lys Val Ile Glu Lys Ser Ser Leu Lys Met

130 135 130 135

<210> 72<210> 72

<211> 154<211> 154

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 72<400> 72

Met Lys Tyr Asp Gly Ser Lys Leu Arg Ile Gly Ile Leu His Ala Arg Met Lys Tyr Asp Gly Ser Lys Leu Arg Ile Gly Ile Leu His Ala Arg

1 5 10 15 1 5 10 15

Trp Asn Leu Glu Ile Ile Ala Ala Leu Val Ala Gly Ala Ile Lys Arg Trp Asn Leu Glu Ile Ile Ala Ala Leu Val Ala Gly Ala Ile Lys Arg

20 25 30 20 25 30

Leu Gln Glu Phe Gly Val Lys Ala Glu Asn Ile Ile Ile Glu Thr Val Leu Gln Glu Phe Gly Val Lys Ala Glu Asn Ile Ile Ile Glu Thr Val

35 40 45 35 40 45

Pro Gly Ser Phe Glu Leu Pro Tyr Gly Ser Lys Leu Phe Val Glu Lys Pro Gly Ser Phe Glu Leu Pro Tyr Gly Ser Lys Leu Phe Val Glu Lys

50 55 60 50 55 60

Gln Lys Arg Leu Gly Lys Pro Leu Asp Ala Ile Ile Pro Ile Gly Val Gln Lys Arg Leu Gly Lys Pro Leu Asp Ala Ile Ile Pro Ile Gly Val

65 70 75 80 65 70 75 80

Leu Ile Lys Gly Ser Thr Met His Phe Glu Tyr Ile Cys Asp Ser Thr Leu Ile Lys Gly Ser Thr Met His Phe Glu Tyr Ile Cys Asp Ser Thr

85 90 95 85 90 95

Thr His Gln Leu Met Lys Leu Asn Phe Glu Leu Gly Ile Pro Val Ile Thr His Gln Leu Met Lys Leu Asn Phe Glu Leu Gly Ile Pro Val Ile

100 105 110 100 105 110

Phe Gly Val Leu Thr Cys Leu Thr Asp Glu Gln Ala Glu Ala Arg Ala Phe Gly Val Leu Thr Cys Leu Thr Asp Glu Gln Ala Glu Ala Arg Ala

115 120 125 115 120 125

Gly Leu Ile Glu Gly Lys Met His Asn His Gly Glu Asp Trp Gly Ala Gly Leu Ile Glu Gly Lys Met His Asn His Gly Glu Asp Trp Gly Ala

130 135 140 130 135 140

Ala Ala Val Glu Met Ala Thr Lys Phe Asn Ala Ala Val Glu Met Ala Thr Lys Phe Asn

145 150 145 150

<210> 73<210> 73

<211> 164<211> 164

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 73<400> 73

Met Ala Val Lys Gly Leu Gly Glu Val Asp Gln Lys Tyr Asp Gly Ser Met Ala Val Lys Gly Leu Gly Glu Val Asp Gln Lys Tyr Asp Gly Ser

1 5 10 15 1 5 10 15

Lys Leu Arg Ile Gly Ile Leu His Ala Arg Trp Asn Arg Lys Ile Ile Lys Leu Arg Ile Gly Ile Leu His Ala Arg Trp Asn Arg Lys Ile Ile

20 25 30 20 25 30

Leu Ala Leu Val Ala Gly Ala Val Leu Arg Leu Leu Glu Phe Gly Val Leu Ala Leu Val Ala Gly Ala Val Leu Arg Leu Leu Glu Phe Gly Val

35 40 45 35 40 45

Lys Ala Glu Asn Ile Ile Ile Glu Thr Val Pro Gly Ser Phe Glu Leu Lys Ala Glu Asn Ile Ile Ile Glu Thr Val Pro Gly Ser Phe Glu Leu

50 55 60 50 55 60

Pro Tyr Gly Ser Lys Leu Phe Val Glu Lys Gln Lys Arg Leu Gly Lys Pro Tyr Gly Ser Lys Leu Phe Val Glu Lys Gln Lys Arg Leu Gly Lys

65 70 75 80 65 70 75 80

Pro Leu Asp Ala Ile Ile Pro Ile Gly Val Leu Ile Lys Gly Ser Thr Pro Leu Asp Ala Ile Ile Pro Ile Gly Val Leu Ile Lys Gly Ser Thr

85 90 95 85 90 95

Met His Phe Glu Tyr Ile Cys Asp Ser Thr Thr His Gln Leu Met Lys Met His Phe Glu Tyr Ile Cys Asp Ser Thr Thr His Gln Leu Met Lys

100 105 110 100 105 110

Leu Asn Phe Glu Leu Gly Ile Pro Val Ile Phe Gly Val Leu Thr Cys Leu Asn Phe Glu Leu Gly Ile Pro Val Ile Phe Gly Val Leu Thr Cys

115 120 125 115 120 125

Leu Thr Asp Glu Gln Ala Glu Ala Arg Ala Gly Leu Ile Glu Gly Lys Leu Thr Asp Glu Gln Ala Glu Ala Arg Ala Gly Leu Ile Glu Gly Lys

130 135 140 130 135 140

Met His Asn His Gly Glu Asp Trp Gly Ala Ala Ala Val Glu Met Ala Met His Asn His Gly Glu Asp Trp Gly Ala Ala Ala Val Glu Met Ala

145 150 155 160 145 150 155 160

Thr Lys Phe Asn Thr Lys Phe Asn

<210> 74<210> 74

<211> 175<211> 175

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 74<400> 74

Met Gly Ala Asn Trp Tyr Leu Asp Asn Glu Ser Ser Arg Leu Ser Phe Met Gly Ala Asn Trp Tyr Leu Asp Asn Glu Ser Ser Arg Leu Ser Phe

1 5 10 15 1 5 10 15

Thr Ser Thr Lys Asn Ala Asp Ile Ala Glu Val His Arg Phe Leu Val Thr Ser Thr Lys Asn Ala Asp Ile Ala Glu Val His Arg Phe Leu Val

20 25 30 20 25 30

Leu His Gly Lys Val Asp Pro Lys Gly Leu Ala Glu Val Glu Val Glu Leu His Gly Lys Val Asp Pro Lys Gly Leu Ala Glu Val Glu Val Glu

35 40 45 35 40 45

Thr Glu Ser Ile Ser Thr Gly Ile Pro Leu Arg Asp Met Leu Leu Arg Thr Glu Ser Ile Ser Thr Gly Ile Pro Leu Arg Asp Met Leu Leu Arg

50 55 60 50 55 60

Val Leu Val Phe Gln Val Ser Lys Phe Pro Val Ala Gln Ile Asn Ala Val Leu Val Phe Gln Val Ser Lys Phe Pro Val Ala Gln Ile Asn Ala

65 70 75 80 65 70 75 80

Gln Leu Asp Met Arg Pro Ile Asn Asn Leu Ala Pro Gly Ala Gln Leu Gln Leu Asp Met Arg Pro Ile Asn Asn Leu Ala Pro Gly Ala Gln Leu

85 90 95 85 90 95

Glu Leu Arg Leu Pro Leu Thr Val Ser Leu Arg Gly Lys Ser His Ser Glu Leu Arg Leu Pro Leu Thr Val Ser Leu Arg Gly Lys Ser His Ser

100 105 110 100 105 110

Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Ala Thr Arg Leu Asp Glu Arg Arg Phe Gln Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Ala Thr Arg Leu Asp Glu Arg Arg Phe Gln

115 120 125 115 120 125

Val Val Thr Leu Glu Pro Leu Val Ile His Ala Gln Asp Phe Asp Met Val Val Thr Leu Glu Pro Leu Val Ile His Ala Gln Asp Phe Asp Met

130 135 140 130 135 140

Val Arg Ala Phe Asn Ala Leu Arg Leu Val Ala Gly Leu Ser Ala Val Val Arg Ala Phe Asn Ala Leu Arg Leu Val Ala Gly Leu Ser Ala Val

145 150 155 160 145 150 155 160

Ser Leu Ser Val Pro Val Gly Ala Val Leu Ile Phe Thr Ala Arg Ser Leu Ser Val Pro Val Gly Ala Val Leu Ile Phe Thr Ala Arg

165 170 175 165 170 175

<210> 75<210> 75

<211> 208<211> 208

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 75<400> 75

Met Thr Asp Tyr Ile Arg Asp Gly Ser Ala Ile Lys Ala Leu Ser Phe Met Thr Asp Tyr Ile Arg Asp Gly Ser Ala Ile Lys Ala Leu Ser Phe

1 5 10 15 1 5 10 15

Ala Ile Ile Leu Ala Glu Ala Asp Leu Arg His Ile Pro Gln Asp Leu Ala Ile Ile Leu Ala Glu Ala Asp Leu Arg His Ile Pro Gln Asp Leu

20 25 30 20 25 30

Gln Arg Leu Ala Val Arg Val Ile His Ala Cys Gly Met Val Asp Val Gln Arg Leu Ala Val Arg Val Ile His Ala Cys Gly Met Val Asp Val

35 40 45 35 40 45

Ala Asn Asp Leu Ala Phe Ser Glu Gly Ala Gly Lys Ala Gly Arg Asn Ala Asn Asp Leu Ala Phe Ser Glu Gly Ala Gly Lys Ala Gly Arg Asn

50 55 60 50 55 60

Ala Leu Leu Ala Gly Ala Pro Ile Leu Cys Asp Ala Arg Met Val Ala Ala Leu Leu Ala Gly Ala Pro Ile Leu Cys Asp Ala Arg Met Val Ala

65 70 75 80 65 70 75 80

Glu Gly Ile Thr Arg Ser Arg Leu Pro Ala Asp Asn Arg Val Ile Tyr Glu Gly Ile Thr Arg Ser Arg Leu Pro Ala Asp Asn Arg Val Ile Tyr

85 90 95 85 90 95

Thr Leu Ser Asp Pro Ser Val Pro Glu Leu Ala Lys Lys Ile Gly Asn Thr Leu Ser Asp Pro Ser Val Pro Glu Leu Ala Lys Lys Ile Gly Asn

100 105 110 100 105 110

Thr Arg Ser Ala Ala Ala Leu Asp Leu Trp Leu Pro His Ile Glu Gly Thr Arg Ser Ala Ala Ala Leu Asp Leu Trp Leu Pro His Ile Glu Gly

115 120 125 115 120 125

Ser Ile Val Ala Ile Gly Asn Ala Pro Thr Ala Leu Phe Arg Leu Phe Ser Ile Val Ala Ile Gly Asn Ala Pro Thr Ala Leu Phe Arg Leu Phe

130 135 140 130 135 140

Glu Leu Leu Asp Ala Gly Ala Pro Lys Pro Ala Leu Ile Ile Gly Met Glu Leu Leu Asp Ala Gly Ala Pro Lys Pro Ala Leu Ile Ile Gly Met

145 150 155 160 145 150 155 160

Pro Val Gly Phe Val Gly Ala Ala Glu Ser Lys Asp Glu Leu Ala Ala Pro Val Gly Phe Val Gly Ala Ala Glu Ser Lys Asp Glu Leu Ala Ala

165 170 175 165 170 175

Asn Ser Arg Gly Val Pro Tyr Val Ile Val Arg Gly Arg Arg Gly Gly Asn Ser Arg Gly Val Pro Tyr Val Ile Val Arg Gly Arg Arg Gly Gly

180 185 190 180 185 190

Ser Ala Met Thr Ala Ala Ala Val Asn Ala Leu Ala Ser Glu Arg Glu Ser Ala Met Thr Ala Ala Ala Val Asn Ala Leu Ala Ser Glu Arg Glu

195 200 205 195 200 205

<210> 76<210> 76

<211> 128<211> 128

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 76<400> 76

Met Ile Thr Val Phe Gly Leu Lys Ser Lys Leu Ala Pro Arg Arg Glu Met Ile Thr Val Phe Gly Leu Lys Ser Lys Leu Ala Pro Arg Arg Glu

1 5 10 15 1 5 10 15

Lys Leu Ala Glu Val Ile Tyr Ser Ser Leu His Leu Gly Leu Asp Ile Lys Leu Ala Glu Val Ile Tyr Ser Ser Leu His Leu Gly Leu Asp Ile

20 25 30 20 25 30

Pro Lys Gly Lys His Ala Ile Arg Phe Leu Cys Leu Glu Lys Glu Asp Pro Lys Gly Lys His Ala Ile Arg Phe Leu Cys Leu Glu Lys Glu Asp

35 40 45 35 40 45

Phe Tyr Tyr Pro Phe Asp Arg Ser Asp Asp Tyr Thr Val Ile Glu Ile Phe Tyr Tyr Pro Phe Asp Arg Ser Asp Asp Tyr Thr Val Ile Glu Ile

50 55 60 50 55 60

Asn Leu Met Ala Gly Arg Ser Glu Glu Thr Lys Met Leu Leu Ile Phe Asn Leu Met Ala Gly Arg Ser Glu Glu Thr Lys Met Leu Leu Ile Phe

65 70 75 80 65 70 75 80

Leu Leu Phe Ile Ala Leu Glu Arg Lys Leu Gly Ile Arg Ala His Asp Leu Leu Phe Ile Ala Leu Glu Arg Lys Leu Gly Ile Arg Ala His Asp

85 90 95 85 90 95

Val Glu Ile Thr Ile Lys Glu Gln Pro Ala His Cys Trp Gly Phe Arg Val Glu Ile Thr Ile Lys Glu Gln Pro Ala His Cys Trp Gly Phe Arg

100 105 110 100 105 110

Gly Arg Thr Gly Asp Ser Ala Arg Asp Leu Asp Tyr Asp Ile Tyr Val Gly Arg Thr Gly Asp Ser Ala Arg Asp Leu Asp Tyr Asp Ile Tyr Val

115 120 125 115 120 125

<210> 77<210> 77

<211> 235<211> 235

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 77<400> 77

Met Gly Ser Asp Leu Gln Lys Leu Gln Arg Phe Ser Thr Cys Asp Ile Met Gly Ser Asp Leu Gln Lys Leu Gln Arg Phe Ser Thr Cys Asp Ile

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Asp Gly Leu Leu Asn Val Tyr Asn Ile Pro Thr Gly Gly Tyr Phe Ser Asp Gly Leu Leu Asn Val Tyr Asn Ile Pro Thr Gly Gly Tyr Phe

20 25 30 20 25 30

Pro Asn Leu Thr Ala Ile Ser Pro Pro Gln Asn Ser Ser Ile Val Gly Pro Asn Leu Thr Ala Ile Ser Pro Pro Gln Asn Ser Ser Ile Val Gly

35 40 45 35 40 45

Thr Ala Tyr Thr Val Leu Phe Ala Pro Ile Asp Asp Pro Arg Pro Ala Thr Ala Tyr Thr Val Leu Phe Ala Pro Ile Asp Asp Pro Arg Pro Ala

50 55 60 50 55 60

Val Asn Tyr Ile Asp Ser Val Pro Pro Asn Ser Ile Leu Val Leu Ala Val Asn Tyr Ile Asp Ser Val Pro Pro Asn Ser Ile Leu Val Leu Ala

65 70 75 80 65 70 75 80

Leu Glu Pro His Leu Gln Ser Gln Phe His Pro Phe Ile Lys Ile Thr Leu Glu Pro His Leu Gln Ser Gln Phe His Pro Phe Ile Lys Ile Thr

85 90 95 85 90 95

Gln Ala Met Tyr Gly Gly Leu Met Ser Thr Arg Ala Gln Tyr Leu Lys Gln Ala Met Tyr Gly Gly Leu Met Ser Thr Arg Ala Gln Tyr Leu Lys

100 105 110 100 105 110

Ser Asn Gly Thr Val Val Phe Gly Arg Ile Arg Asp Val Asp Glu His Ser Asn Gly Thr Val Val Phe Gly Arg Ile Arg Asp Val Asp Glu His

115 120 125 115 120 125

Arg Thr Leu Asn His Pro Val Phe Ala Tyr Gly Val Gly Ser Cys Ala Arg Thr Leu Asn His Pro Val Phe Ala Tyr Gly Val Gly Ser Cys Ala

130 135 140 130 135 140

Pro Lys Ala Val Val Lys Ala Val Gly Thr Asn Val Gln Leu Lys Ile Pro Lys Ala Val Val Lys Ala Val Gly Thr Asn Val Gln Leu Lys Ile

145 150 155 160 145 150 155 160

Leu Thr Ser Asp Gly Val Thr Gln Thr Ile Cys Pro Gly Asp Tyr Ile Leu Thr Ser Asp Gly Val Thr Gln Thr Ile Cys Pro Gly Asp Tyr Ile

165 170 175 165 170 175

Ala Gly Asp Asn Asn Gly Ile Val Arg Ile Pro Val Gln Glu Thr Asp Ala Gly Asp Asn Asn Gly Ile Val Arg Ile Pro Val Gln Glu Thr Asp

180 185 190 180 185 190

Ile Ser Lys Leu Val Thr Tyr Ile Glu Lys Ser Ile Glu Val Asp Arg Ile Ser Lys Leu Val Thr Tyr Ile Glu Lys Ser Ile Glu Val Asp Arg

195 200 205 195 200 205

Leu Val Ser Glu Ala Ile Lys Asn Gly Leu Pro Ala Lys Ala Ala Gln Leu Val Ser Glu Ala Ile Lys Asn Gly Leu Pro Ala Lys Ala Ala Gln

210 215 220 210 215 220

Thr Ala Arg Arg Met Val Leu Lys Asp Tyr Ile Thr Ala Arg Arg Met Val Leu Lys Asp Tyr Ile

225 230 235 225 230 235

<210> 78<210> 78

<211> 162<211> 162

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 78<400> 78

Met Ser Gly Met Arg Val Tyr Leu Gly Ala Asp His Ala Gly Tyr Glu Met Ser Gly Met Arg Val Tyr Leu Gly Ala Asp His Ala Gly Tyr Glu

1 5 10 15 1 5 10 15

Leu Lys Gln Ala Ile Ile Ala Phe Leu Lys Met Thr Gly His Glu Pro Leu Lys Gln Ala Ile Ile Ala Phe Leu Lys Met Thr Gly His Glu Pro

20 25 30 20 25 30

Ile Asp Cys Gly Ala Leu Arg Tyr Asp Ala Asp Asp Asp Tyr Pro Ala Ile Asp Cys Gly Ala Leu Arg Tyr Asp Ala Asp Asp Asp Tyr Pro Ala

35 40 45 35 40 45

Phe Cys Ile Ala Ala Ala Thr Arg Thr Val Ala Asp Pro Gly Ser Leu Phe Cys Ile Ala Ala Ala Thr Arg Thr Val Ala Asp Pro Gly Ser Leu

50 55 60 50 55 60

Gly Ile Val Leu Gly Gly Ser Gly Asn Gly Glu Gln Ile Ala Ala Asn Gly Ile Val Leu Gly Gly Ser Gly Asn Gly Glu Gln Ile Ala Ala Asn

65 70 75 80 65 70 75 80

Lys Val Pro Gly Ala Arg Cys Ala Leu Ala Trp Ser Val Gln Thr Ala Lys Val Pro Gly Ala Arg Cys Ala Leu Ala Trp Ser Val Gln Thr Ala

85 90 95 85 90 95

Ala Leu Ala Arg Glu His Asn Asn Ala Gln Leu Ile Gly Ile Gly Gly Ala Leu Ala Arg Glu His Asn Asn Ala Gln Leu Ile Gly Ile Gly Gly

100 105 110 100 105 110

Arg Met His Thr Leu Glu Glu Ala Leu Arg Ile Val Lys Ala Phe Val Arg Met His Thr Leu Glu Glu Ala Leu Arg Ile Val Lys Ala Phe Val

115 120 125 115 120 125

Thr Thr Pro Trp Ser Lys Ala Gln Arg His Gln Arg Arg Ile Asp Ile Thr Thr Pro Trp Ser Lys Ala Gln Arg His Gln Arg Arg Ile Asp Ile

130 135 140 130 135 140

Leu Ala Glu Tyr Glu Arg Thr His Glu Ala Pro Pro Val Pro Gly Ala Leu Ala Glu Tyr Glu Arg Thr His Glu Ala Pro Pro Val Pro Gly Ala

145 150 155 160 145 150 155 160

Pro Ala Pro Ala

<210> 79<210> 79

<211> 157<211> 157

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 79<400> 79

Met Gly Asp Asp Ala Arg Ile Ala Ala Ile Gly Asp Val Asp Glu Leu Met Gly Asp Asp Ala Arg Ile Ala Ala Ile Gly Asp Val Asp Glu Leu

1 5 10 15 1 5 10 15

Asn Ser Gln Ile Gly Val Leu Leu Ala Glu Pro Leu Pro Asp Asp Val Asn Ser Gln Ile Gly Val Leu Leu Ala Glu Pro Leu Pro Asp Asp Val

20 25 30 20 25 30

Arg Ala Ala Leu Ser Ala Ile Gln His Asp Leu Phe Asp Leu Gly Gly Arg Ala Ala Leu Ser Ala Ile Gln His Asp Leu Phe Asp Leu Gly Gly

35 40 45 35 40 45

Glu Leu Cys Ile Pro Gly His Ala Ala Ile Thr Glu Asp His Leu Leu Glu Leu Cys Ile Pro Gly His Ala Ala Ile Thr Glu Asp His Leu Leu

50 55 60 50 55 60

Arg Leu Ala Leu Trp Leu Val His Tyr Asn Gly Gln Leu Pro Pro Leu Arg Leu Ala Leu Trp Leu Val His Tyr Asn Gly Gln Leu Pro Pro Leu

65 70 75 80 65 70 75 80

Glu Glu Phe Ile Leu Pro Gly Gly Ala Arg Gly Ala Ala Leu Ala His Glu Glu Phe Ile Leu Pro Gly Gly Ala Arg Gly Ala Ala Leu Ala His

85 90 95 85 90 95

Val Cys Arg Thr Val Cys Arg Arg Ala Glu Arg Ser Ile Lys Ala Leu Val Cys Arg Thr Val Cys Arg Arg Ala Glu Arg Ser Ile Lys Ala Leu

100 105 110 100 105 110

Gly Ala Ser Glu Pro Leu Asn Ile Ala Pro Ala Ala Tyr Val Asn Leu Gly Ala Ser Glu Pro Leu Asn Ile Ala Pro Ala Ala Tyr Val Asn Leu

115 120 125 115 120 125

Leu Ser Asp Leu Leu Phe Val Leu Ala Arg Val Leu Asn Arg Ala Ala Leu Ser Asp Leu Leu Phe Val Leu Ala Arg Val Leu Asn Arg Ala Ala

130 135 140 130 135 140

Gly Gly Ala Asp Val Leu Trp Asp Arg Thr Arg Ala His Gly Gly Ala Asp Val Leu Trp Asp Arg Thr Arg Ala His

145 150 155 145 150 155

<210> 80<210> 80

<211> 157<211> 157

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 80<400> 80

Met Ile Leu Ser Ala Glu Gln Ser Phe Thr Leu Arg His Pro His Gly Met Ile Leu Ser Ala Glu Gln Ser Phe Thr Leu Arg His Pro His Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Gln Ala Ala Ala Leu Ala Phe Val Arg Glu Pro Ala Ala Ala Leu Ala Gln Ala Ala Ala Leu Ala Phe Val Arg Glu Pro Ala Ala Ala Leu Ala

20 25 30 20 25 30

Gly Val Gln Arg Leu Arg Gly Leu Asp Ser Asp Gly Glu Gln Val Trp Gly Val Gln Arg Leu Arg Gly Leu Asp Ser Asp Gly Glu Gln Val Trp

35 40 45 35 40 45

Gly Glu Leu Leu Val Arg Val Pro Leu Leu Gly Glu Val Asp Leu Pro Gly Glu Leu Leu Val Arg Val Pro Leu Leu Gly Glu Val Asp Leu Pro

50 55 60 50 55 60

Phe Arg Ser Glu Ile Val Arg Thr Pro Gln Gly Ala Glu Leu Arg Pro Phe Arg Ser Glu Ile Val Arg Thr Pro Gln Gly Ala Glu Leu Arg Pro

65 70 75 80 65 70 75 80

Leu Thr Leu Thr Gly Glu Arg Ala Trp Val Ala Val Ser Gly Gln Ala Leu Thr Leu Thr Gly Glu Arg Ala Trp Val Ala Val Ser Gly Gln Ala

85 90 95 85 90 95

Thr Ala Ala Glu Gly Gly Glu Met Ala Phe Ala Phe Gln Phe Gln Ala Thr Ala Ala Glu Gly Gly Glu Met Ala Phe Ala Phe Gln Phe Gln Ala

100 105 110 100 105 110

His Leu Ala Thr Pro Glu Ala Glu Gly Glu Gly Gly Ala Ala Phe Glu His Leu Ala Thr Pro Glu Ala Glu Gly Glu Gly Gly Ala Ala Phe Glu

115 120 125 115 120 125

Val Met Val Gln Ala Ala Ala Gly Val Thr Leu Leu Leu Val Ala Met Val Met Val Gln Ala Ala Ala Gly Val Thr Leu Leu Leu Val Ala Met

130 135 140 130 135 140

Ala Leu Pro Gln Gly Leu Ala Ala Gly Leu Pro Pro Ala Ala Leu Pro Gln Gly Leu Ala Ala Gly Leu Pro Pro Ala

145 150 155 145 150 155

<210> 81<210> 81

<211> 156<211> 156

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 81<400> 81

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Gly Met Pro Gly Lys Lys Glu Lys Asp Lys Val Cys Ala His Glu Ala Gly Met Pro Gly Lys Lys Glu Lys Asp Lys Val Cys Ala His Glu Ala

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 145 150 155

<210> 82<210> 82

<211> 209<211> 209

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 82<400> 82

Met Asp Asp Ile Asn Asn Gln Leu Lys Arg Leu Lys Val Ile Pro Val Met Asp Asp Ile Asn Asn Gln Leu Lys Arg Leu Lys Val Ile Pro Val

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

Glu Ala Gly Ala Asp Phe Val Val Ser Pro Gly Phe Asn Pro Asn Thr Glu Ala Gly Ala Asp Phe Val Val Ser Pro Gly Phe Asn Pro Asn Thr

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Asn Pro Ser Thr Val Glu Gln Ala Leu Glu Met Gly Leu Thr Thr Leu Asn Pro Ser Thr Val Glu Gln Ala Leu Glu Met Gly Leu Thr Thr Leu

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160 145 150 155 160

Thr Pro Asp Asn Ile Asp Asn Tyr Leu Ala Ile Pro Gln Val Leu Ala Thr Pro Asp Asn Ile Asp Asn Tyr Leu Ala Ile Pro Gln Val Leu Ala

165 170 175 165 170 175

Cys Gly Gly Thr Trp Met Val Asp Lys Lys Leu Val Arg Asn Gly Glu Cys Gly Gly Thr Trp Met Val Asp Lys Lys Leu Val Arg Asn Gly Glu

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

Pro Pro

<210> 83<210> 83

<211> 114<211> 114

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 83<400> 83

Met Pro Ile Phe Thr Leu Asn Thr Asn Ile Lys Ala Asp Asp Val Pro Met Pro Ile Phe Thr Leu Asn Thr Asn Ile Lys Ala Asp Asp Val Pro

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Ile Gly Gly Ile Glu Pro Asp Lys Asn Arg Asp His Ser Ala Val Leu Ile Gly Gly Ile Glu Pro Asp Lys Asn Arg Asp His Ser Ala Val Leu

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Thr Phe Thr Phe

<210> 84<210> 84

<211> 114<211> 114

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 84<400> 84

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Glu Pro Gly Ser Tyr Val Ala Val His Ile Asn Thr Asp Gln Gln Leu Glu Pro Gly Ser Tyr Val Ala Val His Ile Asn Thr Asp Gln Gln Leu

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Ile Gly Gly Ile Glu Pro Asp Lys Asn Glu Asp His Ser Ala Val Leu Ile Gly Gly Ile Glu Pro Asp Lys Asn Glu Asp His Ser Ala Val Leu

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Ile His Phe Val Asp Leu Asp Gly Asp Asp Val Gly Trp Asn Gly Thr Ile His Phe Val Asp Leu Asp Gly Asp Asp Val Gly Trp Asn Gly Thr

100 105 110 100 105 110

Thr Phe Thr Phe

<210> 85<210> 85

<211> 157<211> 157

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 85<400> 85

Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asp Thr Gly Val Pro Val Leu Ser Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asp Thr Gly Val Pro Val Leu Ser

100 105 110 100 105 110

Ala Val Leu Thr Pro His Arg Tyr Arg Asp Ser Asp Glu His His Arg Ala Val Leu Thr Pro His Arg Tyr Arg Asp Ser Asp Glu His His Arg

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

Cys Ile Glu Ile Leu Asn Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala Cys Ile Glu Ile Leu Asn Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala

145 150 155 145 150 155

<210> 86<210> 86

<211> 157<211> 157

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 86<400> 86

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

Val Asp Gly Gly Ile Tyr Asp His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile Val Asp Gly Gly Ile Tyr Asp His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Ala Val Leu Thr Pro His Glu Tyr Glu Asp Ser Asp Glu Asp His Glu Ala Val Leu Thr Pro His Glu Tyr Glu Asp Ser Asp Glu Asp His Glu

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 145 150 155

<210> 87<210> 87

<211> 205<211> 205

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 87<400> 87

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Asp Ile Leu Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Asp Ile Leu

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160 145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

Val Gly Asp Ala Leu Val Lys Gly Asp Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys Val Gly Asp Ala Leu Val Lys Gly Asp Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys

180 185 190 180 185 190

Ala Lys Lys Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu Ala Lys Lys Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu

195 200 205 195 200 205

<210> 88<210> 88

<211> 205<211> 205

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 88<400> 88

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Glu Phe Val Glu Ala Met Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Glu Phe Val Glu Ala Met

130 135 140 130 135 140

Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asp Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asp

145 150 155 160 145 150 155 160

Leu Asp Asp Val Cys Glu Trp Phe Asp Ala Gly Val Leu Ala Val Gly Leu Asp Asp Val Cys Glu Trp Phe Asp Ala Gly Val Leu Ala Val Gly

165 170 175 165 170 175

Val Gly Asp Ala Leu Val Glu Gly Asp Pro Asp Glu Val Arg Glu Asp Val Gly Asp Ala Leu Val Glu Gly Asp Pro Asp Glu Val Arg Glu Asp

180 185 190 180 185 190

Ala Lys Glu Phe Val Glu Glu Ile Arg Gly Cys Thr Glu Ala Lys Glu Phe Val Glu Glu Ile Arg Gly Cys Thr Glu

195 200 205 195 200 205

<210> 89<210> 89

<211> 205<211> 205

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 89<400> 89

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160 145 150 155 160

Leu Asp Asn Val Cys Lys Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly Leu Asp Asn Val Cys Lys Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly

165 170 175 165 170 175

Val Gly Lys Ala Leu Val Lys Gly Lys Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys Val Gly Lys Ala Leu Val Lys Gly Lys Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys

180 185 190 180 185 190

Ala Lys Lys Phe Val Lys Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu Ala Lys Lys Phe Val Lys Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu

195 200 205 195 200 205

<210> 90<210> 90

<211> 157<211> 157

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 90<400> 90

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Phe Glu Ala Ala Met Arg Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp Phe Glu Ala Ala Met Arg Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 145 150 155

<210> 91<210> 91

<211> 157<211> 157

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 91<400> 91

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Ala Val Leu Thr Pro His Glu Tyr Glu Asp Ser Asp Ala Asp Thr Leu Ala Val Leu Thr Pro His Glu Tyr Glu Asp Ser Asp Ala Asp Thr Leu

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 145 150 155

<210> 92<210> 92

<211> 157<211> 157

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 92<400> 92

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Asn Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asn Thr Gly Val Pro Val Leu Ser Asn Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asn Thr Gly Val Pro Val Leu Ser

100 105 110 100 105 110

Ala Val Leu Thr Pro His Asn Tyr Asp Lys Ser Lys Ala His Thr Leu Ala Val Leu Thr Pro His Asn Tyr Asp Lys Ser Lys Ala His Thr Leu

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 145 150 155

<210> 93<210> 93

<211> 156<211> 156

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (70)..(70)<222> (70)..(70)

<223> Xaa является A или K<223> Xaa is A or K

<400> 93<400> 93

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Gly Met Pro Gly Lys Xaa Glu Lys Asp Lys Val Cys Ala His Glu Ala Gly Met Pro Gly Lys Xaa Glu Lys Asp Lys Val Cys Ala His Glu Ala

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 145 150 155

<210> 94<210> 94

<211> 209<211> 209

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (2)..(2)<222> (2)..(2)

<223> Xaa является S или D<223> Xaa is S or D

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (3)..(3)<222> (3)..(3)

<223> Xaa является T или D<223> Xaa is T or D

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (10)..(10)<222> (10)..(10)

<223> Xaa является A или R<223> Xaa is A or R

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (85)..(85)<222> (85)..(85)

<223> Xaa является T или D<223> Xaa is T or D

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (119)..(119)<222> (119)..(119)

<223> Xaa является A или Q<223> Xaa is A or Q

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (163)..(163)<222> (163)..(163)

<223> Xaa является S или D<223> Xaa is S or D

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (189)..(189)<222> (189)..(189)

<223> Xaa является T или R<223> Xaa is T or R

<400> 94<400> 94

Met Xaa Xaa Ile Asn Asn Gln Leu Lys Xaa Leu Lys Val Ile Pro Val Met Xaa Xaa Ile Asn Asn Gln Leu Lys Xaa Leu Lys Val Ile Pro Val

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

Glu Ala Gly Ala Xaa Phe Val Val Ser Pro Gly Phe Asn Pro Asn Thr Glu Ala Gly Ala Xaa Phe Val Val Ser Pro Gly Phe Asn Pro Asn Thr

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Asn Pro Ser Thr Val Glu Xaa Ala Leu Glu Met Gly Leu Thr Thr Leu Asn Pro Ser Thr Val Glu Xaa Ala Leu Glu Met Gly Leu Thr Thr Leu

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160 145 150 155 160

Thr Pro Xaa Asn Ile Asp Asn Tyr Leu Ala Ile Pro Gln Val Leu Ala Thr Pro Xaa Asn Ile Asp Asn Tyr Leu Ala Ile Pro Gln Val Leu Ala

165 170 175 165 170 175

Cys Gly Gly Thr Trp Met Val Asp Lys Lys Leu Val Xaa Asn Gly Glu Cys Gly Gly Thr Trp Met Val Asp Lys Lys Leu Val Xaa Asn Gly Glu

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

Pro Pro

<210> 95<210> 95

<211> 114<211> 114

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (13)..(13)<222> (13)..(13)

<223> Xaa является T или D<223> Xaa is T or D

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (33)..(33)<222> (33)..(33)

<223> Xaa является K или E<223> Xaa is K or E

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (71)..(71)<222> (71)..(71)

<223> Xaa является S или D<223> Xaa is S or D

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (74)..(74)<222> (74)..(74)

<223> Xaa является R или E<223> Xaa is R or E

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (101)..(101)<222> (101)..(101)

<223> Xaa является N или D<223> Xaa is N or D

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (103)..(103)<222> (103)..(103)

<223> Xaa является N или D<223> Xaa is N or D

<400> 95<400> 95

Met Pro Ile Phe Thr Leu Asn Thr Asn Ile Lys Ala Xaa Asp Val Pro Met Pro Ile Phe Thr Leu Asn Thr Asn Ile Lys Ala Xaa Asp Val Pro

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Xaa Pro Gly Ser Tyr Val Ala Val His Ile Asn Thr Asp Gln Gln Leu Xaa Pro Gly Ser Tyr Val Ala Val His Ile Asn Thr Asp Gln Gln Leu

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Ile Gly Gly Ile Glu Pro Xaa Lys Asn Xaa Asp His Ser Ala Val Leu Ile Gly Gly Ile Glu Pro Xaa Lys Asn Xaa Asp His Ser Ala Val Leu

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Ile His Phe Val Xaa Leu Xaa Gly Asp Asp Val Gly Trp Asn Gly Thr Ile His Phe Val Xaa Leu Xaa Gly Asp Asp Val Gly Trp Asn Gly Thr

100 105 110 100 105 110

Thr Phe Thr Phe

<210> 96<210> 96

<211> 157<211> 157

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (9)..(9)<222> (9)..(9)

<223> Xaa является Y или H<223> Xaa is Y or H

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (82)..(82)<222> (82)..(82)

<223> Xaa является N или D<223> Xaa is N or D

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (87)..(87)<222> (87)..(87)

<223> Xaa является R или D<223> Xaa is R or D

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (105)..(105)<222> (105)..(105)

<223> Xaa является S или D<223> Xaa is S or D

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (119)..(119)<222> (119)..(119)

<223> Xaa является R или E<223> Xaa is R or E

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (121)..(121)<222> (121)..(121)

<223> Xaa является R или E<223> Xaa is R or E

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (124)..(124)<222> (124)..(124)

<223> Xaa является A или D<223> Xaa is A or D

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (126)..(126)<222> (126)..(126)

<223> Xaa является H или D<223> Xaa is H or D

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (128)..(128)<222> (128)..(128)

<223> Xaa является R или E<223> Xaa is R or E

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (150)..(150)<222> (150)..(150)

<223> Xaa является A или N<223> Xaa is A or N

<400> 96<400> 96

Met Asn Gln His Ser His Lys Asp Xaa Glu Thr Val Arg Ile Ala Val Met Asn Gln His Ser His Lys Asp Xaa Glu Thr Val Arg Ile Ala Val

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

Val Xaa Gly Gly Ile Tyr Xaa His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile Val Xaa Gly Gly Ile Tyr Xaa His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile

85 90 95 85 90 95

Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Xaa Thr Gly Val Pro Val Leu Ser Asp Gly Met Met Asn Val Gln Leu Xaa Thr Gly Val Pro Val Leu Ser

100 105 110 100 105 110

Ala Val Leu Thr Pro His Xaa Tyr Xaa Asp Ser Xaa Glu Xaa His Xaa Ala Val Leu Thr Pro His Xaa Tyr Xaa Asp Ser Xaa Glu Xaa His Xaa

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

Cys Ile Glu Ile Leu Xaa Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala Cys Ile Glu Ile Leu Xaa Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala

145 150 155 145 150 155

<210> 97<210> 97

<211> 205<211> 205

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (126)..(126)<222> (126)..(126)

<223> Xaa является T или D<223> Xaa is T or D

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (139)..(139)<222> (139)..(139)

<223> Xaa является Q или E<223> Xaa is Q or E

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (142)..(142)<222> (142)..(142)

<223> Xaa является K или E<223> Xaa is K or E

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (160)..(160)<222> (160)..(160)

<223> Xaa является N или D<223> Xaa is N or D

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (163)..(163)<222> (163)..(163)

<223> Xaa является N или D<223> Xaa is N or D

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (166)..(166)<222> (166)..(166)

<223> Xaa является E или K<223> Xaa is E or K

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (169)..(169)<222> (169)..(169)

<223> Xaa является D или K<223> Xaa is D or K

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (179)..(179)<222> (179)..(179)

<223> Xaa является S, D или K<223> Xaa is S, D or K

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (183)..(183)<222> (183)..(183)

<223> Xaa является K или E<223> Xaa is K or E

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (185)..(185)<222> (185)..(185)

<223> Xaa является T, D, или K<223> Xaa is T, D, or K

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (192)..(192)<222> (192)..(192)

<223> Xaa является D или K<223> Xaa is D or K

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (195)..(195)<222> (195)..(195)

<223> Xaa является A, E, или K<223> Xaa is A, E, or K

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (198)..(198)<222> (198)..(198)

<223> Xaa является E или K<223> Xaa is E or K

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (199)..(199)<222> (199)..(199)

<223> Xaa является E или K<223> Xaa is E or K

<400> 97<400> 97

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Xaa Ile Leu Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Xaa Ile Leu

115 120 125 115 120 125

Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Xaa Phe Val Xaa Ala Met Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Xaa Phe Val Xaa Ala Met

130 135 140 130 135 140

Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Xaa Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Xaa

145 150 155 160 145 150 155 160

Leu Asp Xaa Val Cys Xaa Trp Phe Xaa Ala Gly Val Leu Ala Val Gly Leu Asp Xaa Val Cys Xaa Trp Phe Xaa Ala Gly Val Leu Ala Val Gly

165 170 175 165 170 175

Val Gly Xaa Ala Leu Val Xaa Gly Xaa Pro Asp Glu Val Arg Glu Xaa Val Gly Xaa Ala Leu Val Xaa Gly Xaa Pro Asp Glu Val Arg Glu Xaa

180 185 190 180 185 190

Ala Lys Xaa Phe Val Xaa Xaa Ile Arg Gly Cys Thr Glu Ala Lys Xaa Phe Val Xaa Xaa Ile Arg Gly Cys Thr Glu

195 200 205 195 200 205

<210> 98<210> 98

<211> 157<211> 157

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (9)..(9)<222> (9)..(9)

<223> Xaa является Y или H<223> Xaa is Y or H

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (38)..(38)<222> (38)..(38)

<223> Xaa является A или R<223> Xaa is A or R

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (82)..(82)<222> (82)..(82)

<223> Xaa является N или D<223> Xaa is N or D

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (87)..(87)<222> (87)..(87)

<223> Xaa является R или D<223> Xaa is R or D

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (97)..(97)<222> (97)..(97)

<223> Xaa является N или D<223> Xaa is N or D

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (105)..(105)<222> (105)..(105)

<223> Xaa является S, N, или D<223> Xaa is S, N, or D

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (119)..(119)<222> (119)..(119)

<223> Xaa является R, E, или N<223> Xaa is R, E, or N

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (121)..(121)<222> (121)..(121)

<223> Xaa является R, E, или D<223> Xaa is R, E, or D

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (122)..(122)<222> (122)..(122)

<223> Xaa является K или D<223> Xaa is K or D

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (124)..(124)<222> (124)..(124)

<223> Xaa является K или D<223> Xaa is K or D

<220><220>

<221> ПРОЧИЙ_ПРИЗНАК<221> OTHER_CHARACTERISTIC

<222> (126)..(126)<222> (126)..(126)

<223> Xaa является H или D<223> Xaa is H or D

<400> 98<400> 98

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Phe Glu Ala Ala Met Xaa Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp Phe Glu Ala Ala Met Xaa Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Xaa Gly Met Met Asn Val Gln Leu Xaa Thr Gly Val Pro Val Leu Ser Xaa Gly Met Met Asn Val Gln Leu Xaa Thr Gly Val Pro Val Leu Ser

100 105 110 100 105 110

Ala Val Leu Thr Pro His Xaa Tyr Xaa Xaa Ser Xaa Ala Xaa Thr Leu Ala Val Leu Thr Pro His Xaa Tyr Xaa Xaa Ser Xaa Ala Xaa Thr Leu

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 145 150 155

<210> 99<210> 99

<211> 142<211> 142

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 99<400> 99

taatgcttaa gtcgaacaga aagtaatcgt attgtacacg gccgcataat cgaaattaat 60taatgcttaa gtcgaacaga aagtaatcgt attgtacacg gccgcataat cgaaattaat 60

acgactcact ataggggaat tgtgagcgga taacaattcc ccatcttagt atattagtta 120acgactcact ataggggaat tgtgagcgga taacaattcc ccatcttagt atattagtta 120

agtataagaa ggagatatac tt 142agtataagaa ggagatatac tt 142

<210> 100<210> 100

<211> 18<211> 18

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 100<400> 100

taaagaagga gatatcat 18taaagaagga gatatcat 18

<210> 101<210> 101

<211> 17<211> 17

<212> ДНК<212> DNA

<220><220>

<223> Синтетическая<223> Synthetic

<400> 101<400> 101

tgagaaggag atatcat 17tgagaaggag atatcat 17

<210> 102<210> 102

<211> 365<211> 365

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 102<400> 102

1 5 10 15 1 5 10 15

Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr

20 25 30 20 25 30

His Leu Thr Ala Val Ser Ser Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp His Leu Thr Ala Val Ser Ser Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp

35 40 45 35 40 45

Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu

50 55 60 50 55 60

Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val

65 70 75 80 65 70 75 80

Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys

85 90 95 85 90 95

Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr

100 105 110 100 105 110

Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val

115 120 125 115 120 125

Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp

130 135 140 130 135 140

Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile

145 150 155 160 145 150 155 160

Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr

165 170 175 165 170 175

Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg

180 185 190 180 185 190

Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys

195 200 205 195 200 205

Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe

210 215 220 210 215 220

Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu

225 230 235 240 225 230 235 240

Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser

245 250 255 245 250 255

Phe His Ala Ser Ser Ser Leu Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His Phe His Ala Ser Ser Ser Leu Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His

260 265 270 260 265 270

Tyr Cys Cys Ile Val Gln His Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val Tyr Cys Cys Ile Val Gln His Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val

275 280 285 275 280 285

Glu Leu Glu Ser Pro Ala Lys Ser Ser Val Leu Val Val Gly Ile Val Glu Leu Glu Ser Pro Ala Lys Ser Ser Val Leu Val Val Gly Ile Val

290 295 300 290 295 300

Ile Gly Val Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala Val Gly Gly Ala Leu Leu Ile Gly Val Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala Val Gly Gly Ala Leu Leu

305 310 315 320 305 310 315 320

Trp Arg Arg Met Arg Ser Gly Leu Pro Ala Pro Trp Ile Ser Leu Arg Trp Arg Arg Met Arg Ser Gly Leu Pro Ala Pro Trp Ile Ser Leu Arg

325 330 335 325 330 335

Gly Asp Asp Thr Gly Val Leu Leu Pro Thr Pro Gly Glu Ala Gln Asp Gly Asp Asp Thr Gly Val Leu Leu Pro Thr Pro Gly Glu Ala Gln Asp

340 345 350 340 345 350

Ala Asp Leu Lys Asp Val Asn Val Ile Pro Ala Thr Ala Ala Asp Leu Lys Asp Val Asn Val Ile Pro Ala Thr Ala

355 360 365 355 360 365

<210> 103<210> 103

<211> 62<211> 62

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 103<400> 103

1 5 10 15 1 5 10 15

Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr

20 25 30 20 25 30

Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala

35 40 45 35 40 45

Pro Val Val Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Pro Val Val Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser

50 55 60 50 55 60

<210> 104<210> 104

<211> 574<211> 574

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Респираторный синцитиальный вирус A человека (штамм A2)<213> Human respiratory syncytial virus A (strain A2)

<400> 104<400> 104

1 5 10 15 1 5 10 15

Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe

20 25 30 20 25 30

Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu

35 40 45 35 40 45

Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile

50 55 60 50 55 60

Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys

65 70 75 80 65 70 75 80

Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu

85 90 95 85 90 95

Met Gln Ser Thr Pro Pro Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro Met Gln Ser Thr Pro Pro Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro

100 105 110 100 105 110

Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr

115 120 125 115 120 125

Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val

130 135 140 130 135 140

Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu

145 150 155 160 145 150 155 160

Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys

165 170 175 165 170 175

Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val

180 185 190 180 185 190

Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn

195 200 205 195 200 205

Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln

210 215 220 210 215 220

Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn

225 230 235 240 225 230 235 240

Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu

245 250 255 245 250 255

Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys

260 265 270 260 265 270

Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile

275 280 285 275 280 285

Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro

290 295 300 290 295 300

Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro

305 310 315 320 305 310 315 320

Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg

325 330 335 325 330 335

Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe

340 345 350 340 345 350

Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp

355 360 365 355 360 365

Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Ile Asn Leu Cys Asn Val Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Ile Asn Leu Cys Asn Val

370 375 380 370 375 380

Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr

385 390 395 400 385 390 395 400

Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys

405 410 415 405 410 415

Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile

420 425 430 420 425 430

Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Met Asp Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Met Asp

435 440 445 435 440 445

Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly

450 455 460 450 455 460

Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro

465 470 475 480 465 470 475 480

Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn

485 490 495 485 490 495

Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu

500 505 510 500 505 510

Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr

515 520 525 515 520 525

Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val

530 535 540 530 535 540

Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser

545 550 555 560 545 550 555 560

Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn

565 570 565 570

<210> 105<210> 105

<211> 64<211> 64

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Респираторный синцитиальный вирус A человека(штамм A2)<213> Human respiratory syncytial virus A (strain A2)

<400> 105<400> 105

1 5 10 15 1 5 10 15

Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn

20 25 30 20 25 30

Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn

35 40 45 35 40 45

Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser

50 55 60 50 55 60

<210> 106<210> 106

<211> 178<211> 178

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 106<400> 106

1 5 10 15 1 5 10 15

Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His

20 25 30 20 25 30

Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe

35 40 45 35 40 45

Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu

50 55 60 50 55 60

Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys

65 70 75 80 65 70 75 80

Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro

85 90 95 85 90 95

Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu

100 105 110 100 105 110

Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg

115 120 125 115 120 125

Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn

130 135 140 130 135 140

Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu

145 150 155 160 145 150 155 160

Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile

165 170 175 165 170 175

Arg Asn Arg Asn

<210> 107<210> 107

<211> 57<211> 57

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 107<400> 107

1 5 10 15 1 5 10 15

Arg Ala Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Arg Ala Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly

20 25 30 20 25 30

Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val

35 40 45 35 40 45

Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser

50 55 50 55

<210> 108<210> 108

<211> 562<211> 562

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 108<400> 108

Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Asp Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Asp

1 5 10 15 1 5 10 15

Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Lys Val Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Lys Val Asp

20 25 30 20 25 30

Thr Asn Leu Glu Arg Asn Val Thr Val Thr His Ala Lys Asp Ile Leu Thr Asn Leu Glu Arg Asn Val Thr Val Thr His Ala Lys Asp Ile Leu

35 40 45 35 40 45

Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Asn Gly Ile Pro Pro Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Asn Gly Ile Pro Pro

50 55 60 50 55 60

Leu Glu Leu Gly Asp Cys Ser Ile Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro Leu Glu Leu Gly Asp Cys Ser Ile Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro

65 70 75 80 65 70 75 80

Glu Cys Asp Arg Leu Leu Ser Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Met Glu Glu Cys Asp Arg Leu Leu Ser Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Met Glu

85 90 95 85 90 95

Lys Glu Asn Pro Arg Asp Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn Asp Lys Glu Asn Pro Arg Asp Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn Asp

100 105 110 100 105 110

Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Ser Val Lys His Phe Glu Lys Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Ser Val Lys His Phe Glu Lys

115 120 125 115 120 125

Val Lys Ile Leu Pro Lys Asp Arg Trp Thr Gln His Thr Thr Thr Gly Val Lys Ile Leu Pro Lys Asp Arg Trp Thr Gln His Thr Thr Thr Gly

130 135 140 130 135 140

Gly Ser Arg Ala Cys Ala Val Ser Gly Asn Pro Ser Phe Phe Arg Asn Gly Ser Arg Ala Cys Ala Val Ser Gly Asn Pro Ser Phe Phe Arg Asn

145 150 155 160 145 150 155 160

Met Val Trp Leu Thr Lys Glu Gly Ser Asp Tyr Pro Val Ala Lys Gly Met Val Trp Leu Thr Lys Glu Gly Ser Asp Tyr Pro Val Ala Lys Gly

165 170 175 165 170 175

Ser Tyr Asn Asn Thr Ser Gly Glu Gln Met Leu Ile Ile Trp Gly Val Ser Tyr Asn Asn Thr Ser Gly Glu Gln Met Leu Ile Ile Trp Gly Val

180 185 190 180 185 190

His His Pro Ile Asp Glu Thr Glu Gln Arg Thr Leu Tyr Gln Asn Val His His Pro Ile Asp Glu Thr Glu Gln Arg Thr Leu Tyr Gln Asn Val

195 200 205 195 200 205

Gly Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Lys Arg Ser Thr Gly Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Lys Arg Ser Thr

210 215 220 210 215 220

Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Gly Gly Arg Met Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Gly Gly Arg Met

225 230 235 240 225 230 235 240

Glu Phe Ser Trp Thr Leu Leu Asp Met Trp Asp Thr Ile Asn Phe Glu Glu Phe Ser Trp Thr Leu Leu Asp Met Trp Asp Thr Ile Asn Phe Glu

245 250 255 245 250 255

Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Glu Tyr Gly Phe Lys Ile Ser Lys Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Glu Tyr Gly Phe Lys Ile Ser Lys

260 265 270 260 265 270

Arg Gly Ser Ser Gly Ile Met Lys Thr Glu Gly Thr Leu Glu Asn Cys Arg Gly Ser Ser Gly Ile Met Lys Thr Glu Gly Thr Leu Glu Asn Cys

275 280 285 275 280 285

Glu Thr Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Ala Ile Asn Thr Thr Leu Pro Glu Thr Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Ala Ile Asn Thr Thr Leu Pro

290 295 300 290 295 300

Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val

305 310 315 320 305 310 315 320

Lys Ser Glu Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val Pro Gln Lys Ser Glu Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val Pro Gln

325 330 335 325 330 335

Ile Glu Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Ile Glu Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly

340 345 350 340 345 350

Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn

355 360 365 355 360 365

Asp Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Asp Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala

370 375 380 370 375 380

Phe Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Phe Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn

385 390 395 400 385 390 395 400

Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Lys Glu Phe Gly Asn Leu Glu Arg Arg Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Lys Glu Phe Gly Asn Leu Glu Arg Arg

405 410 415 405 410 415

Leu Glu Asn Leu Asn Lys Arg Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Leu Glu Asn Leu Asn Lys Arg Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp

420 425 430 420 425 430

Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu

435 440 445 435 440 445

Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Met Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Met

450 455 460 450 455 460

Gln Leu Arg Asp Asn Val Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Gln Leu Arg Asp Asn Val Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe

465 470 475 480 465 470 475 480

Tyr His Lys Cys Asp Asp Glu Cys Met Asn Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr His Lys Cys Asp Asp Glu Cys Met Asn Ser Val Lys Asn Gly Thr

485 490 495 485 490 495

Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Glu Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Asn Glu Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Glu Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Asn Glu

500 505 510 500 505 510

Ile Lys Gly Val Lys Leu Ser Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Lys Gly Val Lys Leu Ser Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile Leu Ala

515 520 525 515 520 525

Ile Tyr Ala Thr Val Ala Gly Ser Leu Ser Leu Ala Ile Met Met Ala Ile Tyr Ala Thr Val Ala Gly Ser Leu Ser Leu Ala Ile Met Met Ala

530 535 540 530 535 540

Gly Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Gly Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile

545 550 555 560 545 550 555 560

Cys Ile Cys Ile

<210> 109<210> 109

<211> 54<211> 54

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 109<400> 109

Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Phe Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Phe

1 5 10 15 1 5 10 15

Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly Ser Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly Ser

20 25 30 20 25 30

Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln Asn Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln Asn

35 40 45 35 40 45

Leu Val Val Asp Leu Ser Leu Val Val Asp Leu Ser

50 50

<---<---

Claims

1. Composition for inducing an immune response against Escherichia coli (E. coli) and Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) in a mammal, containing a saccharide derived from E. coli, containing a Formula selected from the group consisting of

Formula O1 containing the structure [→3)-α-L-Rha-(1→3)-α-L-Rha-(1→3)-β-L-Rha-(1→4)-β-D- GlcNAc-(1→ | β-D-ManNAc-(1→2)] _n ;

Formula O2 containing the structure [→3)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Rha-(1→3)-β-L-Rha-(1→4)-β-D- GlcNAc-(1→ | α-D-Fuc3NAc-(1→2)] _n ;

Formula O6 containing the structure [→4)-α-D-GalNAc-(1→3)-β-D-Man-(1→4)-β-D-Man-(1→3)-α-D- GlcNAc-(1→ | β-D-Glc-(1→2)] _n or [→4)-α-D-GalNAc-(1→3)-β-D-Man-(1→4)-β -D-Man-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→|β-D-GlcNAc-(1→2)] _n ; and

Formula O25 containing the structure [β-d-Glc-(1→6) | →4)-α-d-Glc-(1→3)-α-l-FucNAc-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→ | α-l-Rha-(1→3)] _n or

and a saccharide derived from K. pneumoniae containing a Formula selected from the group consisting of

Formula O1 containing the structure [→3)-β-D-Gal f -(1→3)-α-D-Gal p -(1→] _n , [→3)-α-D-Gal p -(1 →3)-β-D-Gal p -(1→] _n , as [→3)-β-D-Gal f -(1→3)-α-D-Gal p -(1→] _n , so and [→3)-α-D-Gal p -(1→3)-β-D-Gal p -(1→] _n , or [→3)-β-D-Gal f -(1→3) -[α-D-Gal p -(1→4)]-α-D-Gal p -(1→] _n ;

Formula O2 containing the structure [→3)-α-ᴅ-Gal p -(1→3)-β-D -Gal f -(1→] _n or [→3)-β-D -GlcpNAc-(1→ 5)-β-D-Gal f -(1→] _n ;

Formula O3 containing the structure [→2)-α-d-Man-(1→2)-α-d-Man-(1→3)-α-d-Man-(1→3)-α-d- Man-(1→] _n ; and

Formula O5 containing the structure [→2)-α-d-Man-(1→2)-α-d-Man-(1→3)-β-d-Man-(1→] _n .

2. The composition according to claim 1, containing a saccharide obtained from Klebsiella pneumoniae containing Formula O1.

3. The composition according to claim 1, containing a saccharide obtained from K. pneumoniae containing Formula O2.

4. The composition according to claim 1, containing a saccharide obtained from K. pneumoniae containing Formula O3.

5. The composition according to claim 1, containing a saccharide obtained from K. pneumoniae containing Formula O5.

6. The composition according to claim 1, containing a saccharide obtained from K. pneumoniae containing Formula O1, and a saccharide obtained from K. pneumoniae containing Formula O2.

7. The composition of claim 1, wherein the composition comprises an E. coli saccharide structure containing each of the following Formulas: Formula O25, Formula O1A, Formula O2 and Formula O6.

8. Composition for inducing an immune response against Escherichia coli (E. coli) and Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) in a mammal, containing a saccharide derived from E. coli, containing a Formula selected from the group consisting of

Formula O2 containing the structure [→3)-α-D-Gal p -(1→3)-β-D-Gal f -(1→] _n or [→3)-β-D-GlcpNAc-(1→ 5)-β-D-Gal f -(1→] _n ;

Formula O5 containing the structure [→2)-α-d-Man-(1→2)-α-d-Man-(1→3)-β-d-Man-(1→] _n , where the saccharide obtained from K. pneumoniae is conjugated to a carrier protein, and wherein a saccharide derived from E. coli is conjugated to a carrier protein.

9. The composition according to claim 8, characterized in that the saccharide additionally contains a 3-deoxy-d-manno-oct-2-ulosonic acid (KDO) group.

10. The composition of claim 8, wherein the carrier protein is selected from any of Cross-Reacting Material 197 (CRM ₁₉₇ ), Diphtheria Toxoid Group B (DTFB), DTFB C8, Diphtheria Toxoid (DT), Tetanus Toxoid (TT) ), TT fragment C, pertussis toxoid, cholera toxoid, Pseudomonas aeruginosa exotoxin A, detoxified P. aeruginosa exotoxin A (EPA), maltose binding protein (MBP), detoxified S. aureus hemolysin A, clumping factor A, clumping factor B , cholera toxin subunit B (CTB), Streptococcus pneumoniae pneumolysin and its detoxified variants, C. jejuni AcrA, natural C. jejuni glycoproteins, and streptococcal C5a peptidase (SCP).

11. A method of inducing an immune response against Escherichia coli in a mammal, comprising administering to the mammal an effective amount of a composition according to any one of claims. 1-10.

12. The method according to claim 11, characterized in that the immune response includes opsonophagocytic antibodies against E. coli .

13. The method of claim 11, wherein the immune response protects the mammal from E. coli infection.

14. A method of inducing an immune response against Klebsiella pneumoniae in a mammal, comprising administering to the mammal an effective amount of a composition according to any one of claims. 1-10.

15. The method according to claim 14, characterized in that the immune response includes opsonophagocytic antibodies against Klebsiella pneumoniae .

16. The method according to claim 14, characterized in that the immune response protects the mammal from infection with Klebsiella pneumoniae .