RU2821896C1 - NUCLEOTIDE SEQUENCE CODING FUSED PROTEIN CONSISTING OF FUNCTIONAL FRAGMENT OF HUMAN IL-1RA AND CONSTANT PART OF HEAVY CHAIN OF HUMAN IgG4 - Google Patents
NUCLEOTIDE SEQUENCE CODING FUSED PROTEIN CONSISTING OF FUNCTIONAL FRAGMENT OF HUMAN IL-1RA AND CONSTANT PART OF HEAVY CHAIN OF HUMAN IgG4 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2821896C1 RU2821896C1 RU2023133994A RU2023133994A RU2821896C1 RU 2821896 C1 RU2821896 C1 RU 2821896C1 RU 2023133994 A RU2023133994 A RU 2023133994A RU 2023133994 A RU2023133994 A RU 2023133994A RU 2821896 C1 RU2821896 C1 RU 2821896C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- insdseq
- insdqualifier
- sequence
- insdfeature
- human
- Prior art date
Links
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims abstract description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 34
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title description 13
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 19
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims abstract description 10
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 25
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 12
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 30
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 25
- 101710144554 Interleukin-1 receptor antagonist protein Proteins 0.000 description 24
- 102100026018 Interleukin-1 receptor antagonist protein Human genes 0.000 description 23
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 22
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 20
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 18
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 7
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000051628 Interleukin-1 receptor antagonist Human genes 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 108700015048 receptor decoy activity proteins Proteins 0.000 description 6
- HMLGSIZOMSVISS-ONJSNURVSA-N (7r)-7-[[(2z)-2-(2-amino-1,3-thiazol-4-yl)-2-(2,2-dimethylpropanoyloxymethoxyimino)acetyl]amino]-3-ethenyl-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid Chemical compound N([C@@H]1C(N2C(=C(C=C)CSC21)C(O)=O)=O)C(=O)\C(=N/OCOC(=O)C(C)(C)C)C1=CSC(N)=N1 HMLGSIZOMSVISS-ONJSNURVSA-N 0.000 description 5
- 108700021006 Interleukin-1 receptor antagonist Proteins 0.000 description 5
- 229960004238 anakinra Drugs 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 4
- 101001076407 Homo sapiens Interleukin-1 receptor antagonist protein Proteins 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 102000046824 human IL1RN Human genes 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 230000007112 pro inflammatory response Effects 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 208000011594 Autoinflammatory disease Diseases 0.000 description 3
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 102000039996 IL-1 family Human genes 0.000 description 3
- 108091069196 IL-1 family Proteins 0.000 description 3
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 description 3
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 3
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 3
- 238000009117 preventive therapy Methods 0.000 description 3
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 2
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 230000009862 primary prevention Effects 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000009863 secondary prevention Effects 0.000 description 2
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 17-β-hydroxy-5-α-Androstan-3-one Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 0.000 description 1
- 241000588625 Acinetobacter sp. Species 0.000 description 1
- 241000132734 Actinomyces oris Species 0.000 description 1
- 208000026326 Adult-onset Still disease Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000606124 Bacteroides fragilis Species 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 241000056141 Chryseobacterium sp. Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000921549 Cryptosporangium Species 0.000 description 1
- 102000010907 Cyclooxygenase 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010037462 Cyclooxygenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241001508479 Dermabacter hominis Species 0.000 description 1
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 1
- 241001212789 Dynamis Species 0.000 description 1
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 1
- 241000289669 Erinaceus europaeus Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 206010018634 Gouty Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 206010059176 Juvenile idiopathic arthritis Diseases 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241001675579 Plasmodium ovale curtisi Species 0.000 description 1
- 241000223810 Plasmodium vivax Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000221523 Rhodotorula toruloides Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 241000223997 Toxoplasma gondii Species 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 206010069351 acute lung injury Diseases 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229960001838 canakinumab Drugs 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 208000002849 chondrocalcinosis Diseases 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 1
- 239000003407 interleukin 1 receptor blocking agent Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000002864 mononuclear phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- -1 nucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 1
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007331 pathological accumulation Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 208000037920 primary disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 208000005069 pulmonary fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 108010046141 rilonacept Proteins 0.000 description 1
- 229960001886 rilonacept Drugs 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 208000037921 secondary disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 208000020408 systemic-onset juvenile idiopathic arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Description
Область техникиField of technology
Изобретение относится к области биомолекулярной фармакологии, биотехнологии и генетической инженерии и касается молекул нуклеиновых кислот и кодируемых ими новых растворимых белков – функциональных антагонистов IL-1 человека, способных блокировать провоспалительный ответ, а также способа их получения. В основе изобретения лежит использование белка IL-1RA (Interleukin-1 receptor antagonist protein), являющегося естественным функциональным антагонистом IL-1, в составе молекулы рецептора-ловушки.The invention relates to the field of biomolecular pharmacology, biotechnology and genetic engineering and concerns nucleic acid molecules and new soluble proteins encoded by them - functional antagonists of human IL-1, capable of blocking the pro-inflammatory response, as well as a method for their production. The invention is based on the use of the IL-1RA protein (Interleukin-1 receptor antagonist protein), which is a natural functional antagonist of IL-1, as part of a decoy receptor molecule.
Уровень техникиState of the art
Цитокины включают класс белков, которые опосредуют воспаление и модулируют иммунитет. Одна группа цитокинов, интерлейкины, носит это название, поскольку считалось, что они опосредуют передачу сигналов между лейкоцитами (отсюда и название интерлейкины) (Dinarello et al., 2011). Цитокины играют решающую роль в развитии многих воспалительных заболеваний (Feldmann, 2008).Cytokines include a class of proteins that mediate inflammation and modulate immunity. One group of cytokines, interleukins, bear this name because they were thought to mediate signaling between leukocytes (hence the name interleukins) (Dinarello et al., 2011). Cytokines play a crucial role in the development of many inflammatory diseases (Feldmann, 2008).
Интерлейкин IL-1 входит в число первых признанных цитокинов. Ген IL-1 кодирует две родственные, но функционально различные изоформы: IL-1α и IL-1β (Dinarello, 2011). Эта пара медиаторов оказывает множественное влияние на защитные силы хозяина и играет роль в патогенезе широкого спектра заболеваний. Заметные эффекты IL-1 на многие типы клеток включают следующие события: индукция продукции простагландинов посредством индукции циклооксигеназы-2; выработка оксида азота путем повышения уровней индуцибельной изоформы NO; индукция экспрессии многих цитокинов, в том числе усиление транскрипции собственных генов; повышение экспрессии молекул адгезии лейкоцитов и медиаторов тромбообразования; и активация клеток, участвующих во врожденном иммунитете, в первую очередь мононуклеарных фагоцитов (Dinarello, 2009)Interleukin IL-1 is among the first recognized cytokines. The IL-1 gene encodes two related but functionally distinct isoforms: IL-1α and IL-1β (Dinarello, 2011). This pair of mediators has multiple effects on host defenses and plays a role in the pathogenesis of a wide range of diseases. The notable effects of IL-1 on many cell types include the following events: induction of prostaglandin production through induction of cyclooxygenase-2; production of nitric oxide by increasing levels of the inducible isoform of NO; induction of the expression of many cytokines, including increased transcription of its own genes; increased expression of leukocyte adhesion molecules and thrombus mediators; and activation of cells involved in innate immunity, primarily mononuclear phagocytes (Dinarello, 2009)
Действие IL-1 контролируется несколькими уровнями регуляции. Семейство IL-1 включает структурно родственный антагонист рецептора IL-1 (IL-1RA). Баланс между провоспалительными изоформами IL-1α и IL-1β и этим эндогенным ингибитором (IL-1RA) представляет собой один из важных уровней контроля. Изоформы IL-1α и IL-1β имеют разные функциональные профили. IL-1α обычно находится на поверхности клетки и передает сигналы на короткие расстояния при прямом контакте. Напротив, IL-1β может действовать на расстоянии (Dinarello, 2011).The action of IL-1 is controlled by several levels of regulation. The IL-1 family includes the structurally related IL-1 receptor antagonist (IL-1RA). The balance between the proinflammatory isoforms IL-1α and IL-1β and this endogenous inhibitor (IL-1RA) represents one important level of control. IL-1α and IL-1β isoforms have different functional profiles. IL-1α typically resides on the cell surface and transmits signals over short distances upon direct contact. In contrast, IL-1β can act at a distance (Dinarello, 2011).
Два рецептора связывают основные члены семейства IL-1. Рецептор I IL-1 (IL-1RI) передает сигнал IL-1β. Напротив, рецептор II IL-1 (IL-1RII) связывает лиганды, но не передает сигнал, поскольку у него отсутствует цитоплазматический домен. Таким образом, IL-1RII действует как «приманка», или рецептор-ловушка, обеспечивая еще один уровень негативной регуляции передачи сигналов IL-1. IL-1 может индуцировать экспрессию собственного гена во многих типах клеток (Beltrami-Moreira, Vromman et al., 2016).The two receptors bind the major members of the IL-1 family. IL-1 receptor I (IL-1RI) signals IL-1β. In contrast, IL-1 receptor II (IL-1RII) binds ligands but does not transmit a signal because it lacks a cytoplasmic domain. Thus, IL-1RII acts as a decoy receptor, providing another layer of negative regulation of IL-1 signaling. IL-1 can induce self-gene expression in many cell types (Beltrami-Moreira, Vromman et al., 2016).
Семейство цитокинов IL-1 играет важную роль во врожденных иммунных реакциях, в особенности IL-1α и IL-1β являются основными медиаторами аутовоспалительных заболеваний и провоспалительной активности (Dinarello, 2009; Dinarello, 2011). IL-1β считается ключевым цитокином в патогенезе острого подагрического артрита и ряда других аутовоспалительных заболеваний, а блокирование передачи сигналов IL-1β оказывает терапевтический эффект (Schlesinger, 2014). The IL-1 family of cytokines plays an important role in innate immune responses, in particular IL-1α and IL-1β are major mediators of autoinflammatory diseases and pro-inflammatory activity (Dinarello, 2009; Dinarello, 2011). IL-1β is considered a key cytokine in the pathogenesis of acute gouty arthritis and several other autoinflammatory diseases, and blocking IL-1β signaling has a therapeutic effect (Schlesinger, 2014).
IL-1β опосредует провоспалительную реакцию при ревматоидном артрите посредством нескольких механизмов, включая активацию остеокластов, синовиальных фибробластов и эндотелиальных клеток (McInnes and Schett, 2011). Описан антагонист рецептора IL-1, анакинра. Анакинра представляет собой рекомбинантный не гликозилированный IL-1RA белок, соответвующий естественной последовательности IL-1RA с дополнительным метионином на N-конце, который получают путем продукции в E.coli. Препарат одобрен для лечения ревматоидного артрита, но имеет относительно умеренную эффективность. Анакинра, канакинумаб и рилонацепт оказывают выраженное противовоспалительное действие при наследственных системных аутовоспалительных заболеваниях, характеризующихся повышенной выработкой IL-1β. Анакинра эффективна у некоторых пациентов с системными воспалительными заболеваниями, включая ювенильный идиопатический артрит с системным началом, болезнь Стилла у взрослых и другие аутовоспалительные состояния. Клинические испытания дали обнадеживающие результаты при артритах, вызванных патологическим накоплением кристаллов солей, таких как подагра и хондрокальциноз. Сообщалось также об обнадеживающих результатах применения анакинры при сахарном диабете 2-го типа и вялотекущей/ вялотекущей множественной миеломе (Igel, Toprover et al., 2019).IL-1β mediates the proinflammatory response in rheumatoid arthritis through several mechanisms, including activation of osteoclasts, synovial fibroblasts, and endothelial cells (McInnes and Schett, 2011). An IL-1 receptor antagonist, anakinra, has been described. Anakinra is a recombinant non-glycosylated IL-1RA protein corresponding to the natural sequence of IL-1RA with an additional methionine at the N-terminus, which is produced by production in E. coli . The drug is approved for the treatment of rheumatoid arthritis, but has relatively moderate effectiveness. Anakinra, canakinumab and rilonacept have significant anti-inflammatory effects in inherited systemic autoinflammatory diseases characterized by increased production of IL-1β. Anakinra is effective in some patients with systemic inflammatory diseases, including systemic-onset juvenile idiopathic arthritis, adult-onset Still's disease, and other autoinflammatory conditions. Clinical trials have shown encouraging results for arthritis caused by pathological accumulation of salt crystals, such as gout and chondrocalcinosis. Promising results have also been reported with anakinra in type 2 diabetes mellitus and smoldering/sluggish multiple myeloma (Igel, Toprover et al., 2019).
Fc-слитые белки хорошо зарекомендовали себя в качестве терапевтических и профилактических средств. Полученные с помощью этой технологии белки имеют эффекторную часть, связанную с Fc-доменом, который заметно удлиняет период полувыведения белков из плазмы крови, что продлевает их терапевтическую активность, а также приводит к более медленному почечному клиренсу для молекул большего размера. Также, молекулы обладают довольно низкой иммуногенностью, так как составляющие их части представляют собой естественные белки организма человека. Вместе с тем, такие молекулы обладают значительным терапевтическим потенциалом, так как способны связывать необходимые лиганды и, таким образом, блокировать цепочки передачи сигналов. В последнее время ведется активная разработка терапевтических средств на основе Fc-слитых белков (см. например, RU2689522, 28.05.2019; WO2023063842, 20.04.2023 (RU2787060)). Fc fusion proteins have proven themselves as therapeutic and prophylactic agents. Proteins produced using this technology have an effector portion associated with an Fc domain, which markedly lengthens the plasma half-life of proteins, which prolongs their therapeutic activity and also leads to slower renal clearance for larger molecules. Also, the molecules have a fairly low immunogenicity, since their constituent parts are natural proteins of the human body. At the same time, such molecules have significant therapeutic potential, since they are able to bind the necessary ligands and, thus, block signal transduction chains. Recently, there has been active development of therapeutic agents based on Fc-fusion proteins (see, for example, RU2689522, 05/28/2019; WO2023063842, 04/20/2023 (RU2787060)).
Целью изобретения является разработка эффективных антагонистов IL-1 на основе технологии Fc-слитых белков.The purpose of the invention is to develop effective IL-1 antagonists based on Fc-fusion protein technology.
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала технических средств для лечения воспалительных и аутоиммунных заболеваний. В частности, задача касается получения полипептидных препаратов – антагонистов IL-1, обладающих высокой аффинностью к рецептору IL-1RI; также задача касается разработки нуклеотидных последовательностей, кодирующих такие полипептиды и являющихся экспрессионной основой для их получения. The objective of the present invention is to expand the arsenal of technical means for the treatment of inflammatory and autoimmune diseases. In particular, the task concerns the production of polypeptide drugs – IL-1 antagonists with high affinity for the IL-1RI receptor; The task also concerns the development of nucleotide sequences encoding such polypeptides and being the expression basis for their production.
Решение поставленной задачи осуществляется путем создания слитого белка IL-1RA-hFc, являющегося антагонистом IL-1, в структуру которого входит IL-1RA человека, представленный аминокислотами 26-177, соответствующих естественной последовательности IL-1RA (SEQ ID NO: 1), а также константная часть тяжелой цепи (Fc-фрагмент) IgG4 человека, представленная последовательностью SEQ ID NO: 3. При этом Fc-фрагмент IgG4 человека присоединен к фрагменту белка IL-1RA с С-конца посредством линкерной последовательности RS. The solution to this problem is carried out by creating a fusion protein IL-1RA-hFc, which is an IL-1 antagonist, the structure of which includes human IL-1RA, represented by amino acids 26-177, corresponding to the natural sequence of IL-1RA (SEQ ID NO: 1), and also the constant part of the heavy chain (Fc fragment) of human IgG4, represented by the sequence SEQ ID NO: 3. In this case, the Fc fragment of human IgG4 is attached to the IL-1RA protein fragment from the C-terminus through the linker sequence RS.
В некоторых вариантах осуществления изобретения слитый белок дополнительно включает сигнальную последовательность, локализованную на N-конце слитого белка. В частных вариантах изобретения сигнальная последовательность представлена в последовательности SEQ ID NO: 4.In some embodiments, the fusion protein further includes a signal sequence located at the N-terminus of the fusion protein. In particular embodiments of the invention, the signal sequence is presented in the sequence SEQ ID NO: 4.
В некоторых частных вариантах изобретения слитый белок имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2.In some particular embodiments of the invention, the fusion protein has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
Поставленная задача также решается путем создания изолированной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей такой слитый белок.This problem is also solved by creating an isolated nucleic acid molecule encoding such a fusion protein.
В некоторых частных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты имеет последовательность SEQ ID NO: 5.In some particular embodiments of the invention, the nucleic acid molecule has the sequence SEQ ID NO: 5.
Указанная задача также решается путем создания экспрессирующего вектора, несущего нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности изолированной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей такой слитый белок, под контролем регуляторных элементов, необходимых для экспрессии данной нуклеотидной последовательности в клетке-хозяине; а также путем создания клетки-хозяина, включающей экспрессирующий вектор, описанный в настоящей заявке, обеспечивающей эффективную продукцию такого слитого белка с использованием вышеуказанной молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах воплощения изобретения в качестве таких клеток выступают клетки млекопитающих (в некоторых частных вариантах воплощения изобретения – клетки яичников китайских хомячков (CHO)). This problem is also solved by creating an expression vector carrying a nucleotide sequence corresponding to the sequence of an isolated nucleic acid molecule encoding such a fusion protein, under the control of regulatory elements necessary for the expression of this nucleotide sequence in the host cell; and by creating a host cell comprising an expression vector as described herein, allowing efficient production of such a fusion protein using the above nucleic acid molecule. In some embodiments, such cells are mammalian cells (in some particular embodiments, Chinese hamster ovary (CHO) cells).
Решение поставленной задачи также может достигаться при применении вышеуказанного слитого белка для лечения и профилактики широкого спектра воспалительных состояний и аутоиммунных заболеваний. Результатом изобретения является создание ингибитора IL-1, что достигается за счет использования фрагмента IL-1RA в составе слитого белка IL-1RA-hFc, который является рецептором-ловушкой, направленной на снижение способности изоформ IL-1 взаимодействовать с клеточным рецептором IL-1 RI и активировать передачу сигнала. Белок IL-1RA-hFc может вводиться пациенту в терапевтически эффективном количестве, предпочтительно в составе фармацевтической композиции. The solution to this problem can also be achieved by using the above fusion protein for the treatment and prevention of a wide range of inflammatory conditions and autoimmune diseases. The result of the invention is the creation of an IL-1 inhibitor, which is achieved through the use of an IL-1RA fragment as part of the IL-1RA-hFc fusion protein, which is a decoy receptor aimed at reducing the ability of IL-1 isoforms to interact with the cellular IL-1 receptor RI and activate signal transmission. The IL-1RA-hFc protein may be administered to a patient in a therapeutically effective amount, preferably as part of a pharmaceutical composition.
При осуществлении изобретения достигаются следующие технические результаты: When implementing the invention, the following technical results are achieved:
- создан вариант терапевтического агента на основе слитого (гибридного) белка IL-1RA-hFc, содержащего функциональную часть IL-1RA, слитую с константной частью (Fc-доменом) иммуноглобулина человека IgG4, и способного блокировать передачу сигнала изоформ IL-1 (провоспалительный ответ), а также - a variant of the therapeutic agent was created based on the fusion (hybrid) protein IL-1RA-hFc, containing the functional part of IL-1RA fused with the constant part (Fc domain) of human immunoglobulin IgG4, and capable of blocking signal transmission of IL-1 isoforms (proinflammatory response ), and
- разработаны нуклеотидные последовательности, кодирующие такие слитые белки и являющиеся экспрессионной основой для их получения;- nucleotide sequences have been developed that encode such fusion proteins and serve as the expression basis for their production;
- благодаря особенностям конструкции, разработанный рекомбинантный полипептид имеет потенциально высокую степень безопасности терапевтического применения в сочетании с улучшенными фармакокинетическими свойствами.- due to the design features, the developed recombinant polypeptide has a potentially high degree of safety for therapeutic use in combination with improved pharmacokinetic properties.
Краткое описание рисунковBrief description of the drawings
Фиг.1. Схема экспрессирующего вектора, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5, кодирующую слитый белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.Fig.1. Schematic of an expression vector containing the nucleotide sequence SEQ ID NO: 5 encoding a fusion protein having the amino acid sequence SEQ ID NO: 2.
Определения и терминыDefinitions and terms
Следующие термины и определения применяются в данном документе, если иное не указано явно. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.The following terms and definitions apply throughout this document unless otherwise expressly stated. References to techniques used in the description of this invention refer to well known techniques, including modifications of these techniques and replacement thereof with equivalent techniques known to those skilled in the art.
В документах данного изобретения термины «включает», «включающий» и т.п., а также «содержит», «содержащий» и т.п. интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего» (или «содержит, помимо всего прочего»). Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».As used herein, the terms “includes,” “including,” and the like, as well as “comprises,” “comprising,” and the like are used herein. are interpreted to mean “includes, but is not limited to” (or “contains, among other things”). These terms are not intended to be construed as “consisting only of.”
Термины «полипептид», «белок» и «пептид» используют в настоящем документе взаимозаменяемо, и все они означают полимер из аминокислотных остатков. Эти термины также могут использоваться в настоящем описании взаимозаменяемо при обозначении конечного продукта, получаемого в результате экспрессии в клетке-хозяине последовательности нуклеиновой кислоты. The terms "polypeptide", "protein" and "peptide" are used interchangeably herein and all refer to a polymer of amino acid residues. These terms may also be used interchangeably herein to refer to the end product resulting from expression of a nucleic acid sequence in a host cell.
Под «слитым белком» («гибридным белком», «рекомбинантным белком», «слитым полипептидом», «рекомбинантным полипептидом», «гибридной конструкцией») понимают конструкцию из двух или более частей полипептидной природы, ковалентно связанных между собой, образующейся в результате экспрессии рекомбинантной молекулы ДНК, в которой соединены друг с другом в одной рамке считывания кодирующие участки, соответственно, двух или нескольких разных генов или их фрагментов.By “fusion protein” (“hybrid protein”, “recombinant protein”, “fusion polypeptide”, “recombinant polypeptide”, “hybrid construct”) is meant a construct of two or more parts of a polypeptide nature, covalently linked to each other, resulting from the expression a recombinant DNA molecule in which the coding regions of two or more different genes or their fragments are connected to each other in one reading frame.
Термин «изолированный» («выделенный») имеет свое общепринятое значение, известное среднему специалисту в данной области техники, и при использовании в отношении выделенной нуклеиновой кислоты или выделенного полипептида используется без ограничения для обозначения нуклеиновой кислоты или полипептида, которые, благодаря человеку, существуют отдельно от своего нативного окружения и поэтому не являются продуктом природы. Выделенная нуклеиновая кислота или полипептид могут существовать в очищенной форме или могут существовать в ненативном окружении, в таком как, например, клетка-хозяин.The term “isolated” (“isolated”) has its common meaning known to one of ordinary skill in the art, and when used in relation to an isolated nucleic acid or isolated polypeptide, is used without limitation to refer to a nucleic acid or polypeptide that, thanks to a person, exists separately from their native environment and are therefore not a product of nature. The isolated nucleic acid or polypeptide may exist in purified form or may exist in a non-native environment, such as, for example, a host cell.
Термин «синонимичная замена» относится к нуклеотидной последовательности, имеющей последовательность нуклеотидов, которая может отличаться от референсной последовательности нуклеиновой кислоты на одну или более замен, которые не ведут к изменению аминокислотной последовательности белка, кодируемой данной молекулой нуклеиновой кислоты. В связи с тем, что генетический код является «вырожденным», то есть различные по нуклеотидной последовательности триплеты могут кодировать одну и ту же аминокислоту, синонимичные замены в нуклеотидной последовательности не приводят к изменению аминокислотной последовательности белка.The term “synonymous substitution” refers to a nucleotide sequence having a nucleotide sequence that may differ from a reference nucleic acid sequence by one or more substitutions that do not result in a change in the amino acid sequence of the protein encoded by the nucleic acid molecule. Due to the fact that the genetic code is “degenerate”, that is, triplets with different nucleotide sequences can encode the same amino acid, synonymous substitutions in the nucleotide sequence do not lead to a change in the amino acid sequence of the protein.
Термин «рецептор-ловушка» (от англ. Decoy receptor, также трап) относится к гибридным белкам, состоящим из внеклеточного домена молекулы (рецептора) и Fc-домена иммуноглобулина. Внеклеточный домен рецептора отвечает за связывание мишени, а Fc-домен осуществляет димеризацию гибридного белка. Последнее необходимо для увеличения эффективности связывания и обеспечения большей стабильности высокомолекулярного комплекса. В рамках настоящего изобретения «рецептор-ловушка» состоит из функционального фрагмента человеческого белка IL-1RA и константной части тяжелой цепи IgG4 человека. The term “decoy receptor” (from the English Decoy receptor, also trap) refers to hybrid proteins consisting of the extracellular domain of a molecule (receptor) and the Fc domain of an immunoglobulin. The extracellular domain of the receptor is responsible for binding the target, and the Fc domain dimerizes the hybrid protein. The latter is necessary to increase the binding efficiency and ensure greater stability of the high-molecular complex. In the context of the present invention, the decoy receptor consists of a functional fragment of the human IL-1RA protein and a constant portion of the human IgG4 heavy chain.
Термин «лечение» означает излечение, замедление, остановку, либо реверсию прогрессирования заболевания или нарушения. В настоящем документе «лечение» также означает смягчение симптомов, ассоциированных с заболеванием или нарушением. Слитый белок по изобретению может быть использован для применения в лечении заболеваний, опосредованных IL-1. В частности, такое заболевание может выбрано из артрита, энтерита, астмы, легочного фиброза, гломерулонефрита, реакции трансплантат против хозяина, острого повреждения легких, ревматоидного артрита, атопического дерматита и др.The term “treatment” means to cure, slow, stop, or reverse the progression of a disease or disorder. As used herein, “treating” also means alleviating symptoms associated with a disease or disorder. The fusion protein of the invention can be used for use in the treatment of diseases mediated by IL-1. In particular, such disease may be selected from arthritis, enteritis, asthma, pulmonary fibrosis, glomerulonephritis, graft-versus-host disease, acute lung injury, rheumatoid arthritis, atopic dermatitis, etc.
Термин «профилактика», «предотвращение», «превентивная терапия» охватывает устранение факторов риска, а также профилактическое лечение субклинических стадий заболевания у человека, направленное на уменьшение вероятности возникновения клинических стадий заболевания. Пациенты для профилактической терапии отбираются на основе факторов, которые, на основании известных данных, влекут увеличение риска возникновения клинических стадий заболевания по сравнению с общим населением. К профилактической терапии относится а) первичная профилактика и б) вторичная профилактика. Первичная профилактика определяется как профилактическое лечение у пациентов, клиническая стадия заболевания у которых ещё не наступила. Вторичная профилактика – это предотвращение повторного наступления того же или близкого клинического состояния заболевания.The term “prophylaxis”, “avoidance”, “preventive therapy” covers the elimination of risk factors, as well as prophylactic treatment of subclinical stages of the disease in humans, aimed at reducing the likelihood of the occurrence of clinical stages of the disease. Patients for prophylactic therapy are selected based on factors known to increase the risk of clinical stage disease compared with the general population. Preventive therapy includes a) primary prevention and b) secondary prevention. Primary prevention is defined as preventive treatment in patients who have not yet reached the clinical stage of the disease. Secondary prevention is the prevention of reoccurrence of the same or similar clinical condition of the disease.
Термин «уменьшение риска» охватывает терапию, которая снижает частоту возникновения клинической стадии заболевания. Примерами уменьшения риска заболевания является первичная и вторичная профилактика заболевания.The term "risk reduction" covers therapies that reduce the incidence of clinical disease. Examples of disease risk reduction are primary and secondary disease prevention.
Под «терапевтически/профилактически эффективным количеством (терапевтической дозой)» подразумевается количество лекарственного средства, вводимого пациенту, при котором у него с наибольшей вероятностью проявится ожидаемый терапевтический (профилактический) эффект. Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от многочисленных факторов, таких как тяжесть заболевания, возраст, масса тела, общее состояние организма, комбинированное лечение с другими препаратами и др. Введение лекарственного средства по изобретению субъекту, нуждающемуся в лечении и/или профилактике заболевания или состояния, осуществляется в дозе, достаточной для достижения терапевтического эффекта. При проведении лечения и/или профилактики введение может осуществляться как разово, так и несколько раз в день, чаще в виде курсового введения на протяжении времени, достаточного для достижения терапевтического эффекта (от нескольких дней до недели, нескольких недель и до месяцев), при этом курсы введения лекарственного средства могут проводиться повторно. В частности, при среднетяжелых формах заболевания разовая доза, кратность и/или длительность введения лекарственного средства по изобретению могут быть увеличены. Предпочтительно слитый белок по изобретению вводят пациенту в составе фармацевтической композиции, включающей, помимо активного компонента, фармацевтически приемлемые носители и/или наполнители.By “therapeutically/prophylactically effective amount (therapeutic dose)” is meant the amount of drug administered to a patient that is most likely to produce the intended therapeutic (prophylactic) effect. The exact amount required may vary from subject to subject depending on numerous factors such as the severity of the disease, age, body weight, general condition of the body, combination treatment with other drugs, etc. Administration of a medicinal product of the invention to a subject in need of treatment and/or prevention of a disease or condition, carried out in a dose sufficient to achieve a therapeutic effect. When carrying out treatment and/or prophylaxis, administration can be carried out either once or several times a day, more often in the form of a course of administration for a time sufficient to achieve a therapeutic effect (from several days to a week, several weeks and up to months), while courses of drug administration can be repeated. In particular, in moderate forms of the disease, the single dose, frequency and/or duration of administration of the drug according to the invention can be increased. Preferably, the fusion protein of the invention is administered to a patient in a pharmaceutical composition comprising, in addition to the active ingredient, pharmaceutically acceptable carriers and/or excipients.
Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.Unless otherwise defined, technical and scientific terms in this application have their standard meanings commonly accepted in the scientific and technical literature.
Номера последовательностей нуклеотидов и аминокислот, упоминаемых в настоящей заявке, соответствуют номеру в Перечне последовательностей (SEQ ID NO) согласно Стандарту ST.26, являющемуся частью настоящего описания изобретения. В случае наличия разночтений в структуре последовательностей между упоминанием в тексте описания и соответствующей последовательностью в Перечне последовательностей согласно стандарту ST.26, приоритетными являются данные, приведенные в тексте описания.The nucleotide and amino acid sequence numbers mentioned in this application correspond to the number in the Sequence Listing (SEQ ID NO) according to Standard ST.26, which is part of the present description of the invention. If there are discrepancies in the sequence structure between a reference in the description text and the corresponding sequence in the Sequence List according to ST.26, the data given in the description text takes precedence.
Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention
В настоящем изобретении предлагаются конструкции ДНК, кодирующие слитые белки (рекомбинантные полипептиды) – антагонисты IL-1, блокирующие провоспалительный ответ, индуцируемый изоформами α и β IL-1. The present invention provides DNA constructs encoding IL-1 antagonist fusion proteins (recombinant polypeptides) that block the proinflammatory response induced by the α and β isoforms of IL-1.
Более конкретно, изобретение относится к нуклеотидным конструкциям, кодирующим полипептиды, содержащие IL-1RA, слитый с константной частью (Fc-доменом) иммуноглобулина человека IgG4 (IL-1RA-hFc). More specifically, the invention relates to nucleotide constructs encoding polypeptides containing IL-1RA fused to the constant portion (Fc domain) of human immunoglobulin IgG4 (IL-1RA-hFc).
Естественная последовательность белка IL-1RA человека состоит из 177 аминокислот (ак) (SEQ ID NO: 1). В состав нативного белка входит сигнальный пептид (1—25 ак SEQ ID NO: 1) и функциональный домен (26-177 ак SEQ ID NO: 1). The natural sequence of the human IL-1RA protein consists of 177 amino acids (aa) (SEQ ID NO: 1). The native protein includes a signal peptide (1-25 aa SEQ ID NO: 1) and a functional domain (26-177 aa SEQ ID NO: 1).
В рамках настоящего изобретения в процессе разработки новых полипептидных препаратов – ингибиторов действия IL-1 было осуществлено клонирование последовательности, соответствующей функциональной части IL-1RA, и ее слияние в одной рамке считывания с последовательностью, кодирующей константную часть тяжелой цепи IgG4 человека. При конструировании гибридного белка по изобретению особое внимание было уделено линкеру, связывающему два активных фрагмента белковой конструкции. Известно, что белковые линкеры должны обеспечивать необходимый интервал между доменами гибридного белка, поддерживая правильную укладку белка в случае, когда взаимодействия N или C концов являются критическими для укладки. Кроме того, предпочтительно, чтобы используемый белковый линкер усиливал стабильность молекулы. Помимо этого, при конструировании гибридного белка по изобретению особое внимание было уделено безопасности белковой конструкции при ее введении пациенту в процессе проведения терапии. Как известно, проявление нежелательной иммуногенности биотехнологических лекарственных препаратов на основе слитых белков является серьезной проблемой, существенно влияющей на их применение в терапии, особенно при лечении заболеваний, требующих длительного системного введения лекарственных препаратов на их основе (Авдеева Ж.И. и др. Проблемы, связанные с нежелательной иммуногенностью биотехнологических лекарственных препаратов (терапевтических белков) // Иммунология т.40, № 3, 2019, с.51-64). Поэтому при конструировании гибридного белка внимание было уделено не только его стабильности и терапевтической эффективности, но и снижению риска потенциальной иммуногенности. Анализируя возможные риски развития иммуногенности, авторы изобретения обратили внимание на то, что несмотря на то, что фрагменты молекул IL-1RA и Fc-фрагмента IgG имеют человеческое происхождение и естественным образом должны иметь низкий иммуногенный профиль, последовательность, получаемая в результате слияния этих молекул, не всегда безопасна. Так, используемые в качестве линкеров длинные гибкие линкерные пептиды обычно состоят из небольших неполярных аминокислотных остатков, таких как глицин, и полярных аминокислотных остатков, таких как серин и треонин: несколько остатков глицина придают линкеру неструктурированную конформацию, что обеспечивает его гибкость, а серин или треонин предоставляют полярный участок поверхности для ограничения гидрофобного взаимодействия в пептиде или с составляющими фрагментами слитого белка. Однако такие пептидные линкеры, богатые глицином, например, повторы последовательности GGGGS, имеют общий мотив с прионовыми доменами (см, например, Kun-Hua Yu et al. The Effect of Octapeptide Repeats on Prion Folding and Misfolding // Int J Mol Sci. 2021 Feb; 22(4): 1800; Kim S. et al. Transmembrane glycine zippers: Physiological and pathological roles in membrane proteins // PNAS, October 4, 2005 vol. 102 no. 40 p. 14278 –14283), что может стать причиной нежелательных структурных изменений в белке, его агрегации, а также иммуногенности. Неструктурированные длинные гибкие пептиды, используемые в качестве линкеров, могут иметь множество поверхностных неоэпитопов, в образовании которых могут участвовать как участки линкерного пептида, так и участки молекул, участвующих в образовании слитого белка, примыкающие к линкеру в месте слияния. Такие поверхностные неоэпитопы, доступные для распознавания иммунной системой, также могут стать причиной нежелательной иммуногенности. Так, например, последовательности GGGGSGGGGS, GGGGSGG, GGGGSAE и EPKSSDK, образующиеся в линкерной части слитых белков IL-1RA-hFc, известных из уровня техники, присутствуют в большом количестве различных видов бактерий, грибов и паразитических простейших (таких как Acinetobacter sp., Cryptosporangium parvum, Bacteroides fragilis, Dermabacter hominis, Toxoplasma gondii, Chryseobacterium sp., Rhodotorula toruloides, Actinomyces oris, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale curtisi и др.), многие из которых являются патогенными или условно-патогенными для человека. Воздействие такого пептида на человека может стать причиной перекрестной реактивности с гибридным белком IL-1RA-hFc и последующей иммунной реакции. Within the framework of the present invention, in the process of developing new polypeptide drugs - inhibitors of the action of IL-1, the sequence corresponding to the functional part of IL-1RA was cloned and fused in the same reading frame with the sequence encoding the constant part of the human IgG4 heavy chain. When constructing the hybrid protein according to the invention, special attention was paid to the linker connecting the two active fragments of the protein construct. It is known that protein linkers must provide the necessary spacing between domains of a fusion protein, maintaining proper protein folding when interactions at the N or C termini are critical for folding. In addition, it is preferable that the protein linker used enhances the stability of the molecule. In addition, when constructing the hybrid protein according to the invention, special attention was paid to the safety of the protein construct when administered to a patient during therapy. As is known, the manifestation of undesirable immunogenicity of biotechnological drugs based on fusion proteins is a serious problem that significantly affects their use in therapy, especially in the treatment of diseases that require long-term systemic administration of drugs based on them (Avdeeva Zh.I. et al. Problems, associated with the undesirable immunogenicity of biotechnological drugs (therapeutic proteins) // Immunology vol. 40, no. 3, 2019, pp. 51-64). Therefore, when designing the fusion protein, attention was paid not only to its stability and therapeutic efficacy, but also to reducing the risk of potential immunogenicity. Analyzing the possible risks of developing immunogenicity, the inventors drew attention to the fact that despite the fact that fragments of the IL-1RA and IgG Fc fragment molecules are of human origin and should naturally have a low immunogenic profile, the sequence resulting from the fusion of these molecules not always safe. Thus, long flexible linker peptides used as linkers usually consist of small non-polar amino acid residues, such as glycine, and polar amino acid residues, such as serine and threonine: several glycine residues give the linker an unstructured conformation, which ensures its flexibility, and serine or threonine provide a polar surface region to limit hydrophobic interactions in the peptide or with constituent fragments of the fusion protein. However, such glycine-rich peptide linkers, such as GGGGS repeats, share a common motif with prion domains (see, e.g., Kun-Hua Yu et al. The Effect of Octapeptide Repeats on Prion Folding and Misfolding // Int J Mol Sci. 2021 Feb; 22(4): 1800; Kim S. et al. Transmembrane glycine zippers: Physiological and pathological roles in membrane proteins // PNAS, October 4, 2005 vol. 14278 –14283). the cause of undesirable structural changes in the protein, its aggregation, as well as immunogenicity. Unstructured long flexible peptides used as linkers can have many surface neo-epitopes, the formation of which can involve both sections of the linker peptide and sections of molecules involved in the formation of the fusion protein adjacent to the linker at the fusion site. Such surface neoepitopes, accessible to recognition by the immune system, can also cause undesirable immunogenicity. For example, the sequences GGGGSGGGGS, GGGGSGG, GGGGSAE and EPKSSDK, formed in the linker part of the IL-1RA-hFc fusion proteins known in the art, are present in a large number of different species of bacteria, fungi and parasitic protozoa (such as Acinetobacter sp., Cryptosporangium parvum, Bacteroides fragilis, Dermabacter hominis, Toxoplasma gondii, Chryseobacterium sp., Rhodotorula toruloides, Actinomyces oris, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale curtisi, etc.), many of which are pathogenic or opportunistic for humans. Human exposure to such a peptide may cause cross-reactivity with the IL-1RA-hFc fusion protein and a subsequent immune response.
В результате проведенной работы было обнаружено, что использование линкера RS не только обеспечивает необходимую стабильность молекулы, но и также, благодаря, по меньшей мере, его длине, обеспечивает получение слитого белка, обладающего низким риском потенциальной иммуногенности. При этом необходимая гибкость молекулы слитого белка по изобретению обеспечивается включением в конструкцию фрагмента шарнирного участка PPCPSCP константной части тяжелой цепи IgG4 человека, представленного ак 1-7 SEQ ID NO: 3, что позволяет обеспечить необходимый поворот и жесткость без излишней неструктурированности, благодаря чему функциональный домен белка IL-1RА и Fc-домен, входящие в молекулу, могут действовать независимо друг от друга за счет увеличения гибкости на данном участке. Таким образом, благодаря особенностям конструкции, рекомбинантный полипептид по изобретению обладает одновременно потенциально улучшенными фармакокинетическими свойствами и низким риском потенциальной иммуногенности. As a result of this work, it was found that the use of the RS linker not only provides the necessary stability of the molecule, but also, due to at least its length, provides a fusion protein with a low risk of potential immunogenicity. In this case, the necessary flexibility of the fusion protein molecule according to the invention is ensured by the inclusion in the design of a fragment of the hinge region PPCPSCP of the constant part of the human IgG4 heavy chain, represented by aa 1-7 SEQ ID NO: 3, which allows for the necessary rotation and rigidity without excessive unstructuredness, due to which the functional domain IL-1RA protein and the Fc domain included in the molecule can act independently of each other by increasing flexibility in this area. Thus, due to the design features, the recombinant polypeptide of the invention has both potentially improved pharmacokinetic properties and a low risk of potential immunogenicity.
Использование IgG4-изотипа Fc-фрагмента в составе слитого белка по изобретению обеспечивает дополнительные преимущества: минимальная эффекторная функция для антителозависимой клеточной цитотоксичности (antibody-dependent cellular cytotoxicity - ADCC) и отсутствие комплемент-зависимой цитотоксичности (complement-dependent cytotoxicity - CDC), что снижает возможный риск воспалительных реакций и сенсибилизацию при использовании терапевтического агента на основе гибридного белка IL-1RA-hFc.The use of the IgG4 isotype Fc fragment in the fusion protein of the invention provides additional advantages: minimal effector function for antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) and absence of complement-dependent cytotoxicity (CDC), which reduces possible risk of inflammatory reactions and sensitization when using a therapeutic agent based on the IL-1RA-hFc fusion protein.
Таким образом, гибридный белок по изобретению IL-1RA-hFc (в частном варианте изобретения представленный последовательностью SEQ ID NO: 2), состоящий из функционального домена белка IL-1RА человека, представленной аминокислотами 26-177 SEQ ID NO: 1, и Fc-фрагмента IgG4 человека, представленного последовательностью SEQ ID NO: 3 и присоединенного к фрагменту белка IL-1RА с С-конца посредством линкерной последовательности RS, обладает высокой степенью безопасности терапевтического применения. Thus, the fusion protein according to the invention IL-1RA-hFc (in a particular embodiment of the invention represented by the sequence SEQ ID NO: 2), consisting of the functional domain of the human IL-1RA protein, represented by amino acids 26-177 SEQ ID NO: 1, and Fc- human IgG4 fragment represented by the sequence SEQ ID NO: 3 and attached to the IL-1RA protein fragment from the C-terminus via the RS linker sequence has a high degree of safety for therapeutic use.
Слитый белок IL-1RA-hFc по изобретению также может необязательно содержать сигнальную последовательность, которая может включать любую последовательность, известную квалифицированному специалисту в области управления секрецией полипептида или белка из клетки, и включать природные или синтетические последовательности. Обычно сигнальная последовательность размещается на N-конце слитого белка по настоящему изобретению. В частных вариантах изобретения сигнальный пептид имеет последовательность SEQ ID NO: 4.The IL-1RA-hFc fusion protein of the invention may also optionally contain a signal sequence, which may include any sequence known to one skilled in the art of directing the secretion of a polypeptide or protein from a cell, and may include natural or synthetic sequences. Typically, the signal sequence is located at the N-terminus of the fusion protein of the present invention. In particular embodiments of the invention, the signal peptide has the sequence SEQ ID NO: 4.
Слитый белок (рекомбинантный полипептид), являющийся объектом настоящего изобретения, может быть получен следующим образом.The fusion protein (recombinant polypeptide) of the present invention can be produced as follows.
Растворимые рекомбинантные полипептиды-антагонисты IL-1 производят в результате экспрессии кодирующих их нуклеотидных последовательностей в эукариотических клеточных линиях, с последующей очисткой синтезированных рекомбинантных белков при помощи аффинной, ионобменной или гидрофобной хроматографии, применяемых по отдельности или в различных сочетаниях друг с другом, а также при помощи иных способов очистки белков. Соответствующие нуклеотидные последовательности получают при помощи комбинирования участков ДНК, кодирующих выбранные домены IL-1RA, с последовательностью ДНК, кодирующей Fc-фрагмент IgG4 человека. В некоторых частных вариантах изобретения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие такие полипептиды-антагонисты IL-1, имеют нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 5. Soluble recombinant IL-1 antagonist polypeptides are produced by expression of the nucleotide sequences encoding them in eukaryotic cell lines, followed by purification of the synthesized recombinant proteins using affinity, ion exchange or hydrophobic chromatography, used individually or in various combinations with each other, as well as using other methods of protein purification. The corresponding nucleotide sequences are obtained by combining DNA sections encoding selected domains of IL-1RA with a DNA sequence encoding the Fc fragment of human IgG4. In certain particular embodiments, the nucleic acid molecules encoding such IL-1 antagonist polypeptides have a nucleotide sequence corresponding to SEQ ID NO: 5.
Также указанная задача решается путем создания экспрессирующего вектора, содержащего данную молекулу нуклеиновой кислоты под контролем регуляторных элементов, необходимых для экспрессии данной нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. В предпочтительных вариантах изобретения в качестве клетки-хозяина, включающей такой экспрессирующий вектор, могут выступать клетки яичников китайских хомячков CHO (например, клеточные линии CHO-К1 или CHO DG44), адаптированные для производства терапевтических белков. В настоящем изобретении экспрессирующий вектор предпочтительно подбирается для экспрессии гетерологичных последовательностей в клетках млекопитающих, но в некоторых вариантах изобретения экспрессирующий вектор может быть выбран для экспрессии в других системах, таких как, например, клетки насекомых, дрожжевые или бактериальные клетки. Соответственно, каждый экспрессирующий вектор имеет свой набор регуляторных элементов, позволяющих проводить экспрессию гетерологичной последовательности (продукта) в клетке-хозяине, таких как промоторы и/или энхансеры, последовательности Козак, polyA последовательности и другие регуляторные последовательности. А также может иметь последовательности, кодирующие лидерные (сигнальные) пептиды, обеспечивающие секрецию рекомбинантных полипептидов во внеклеточную среду. Терминация синтеза белка с заданной изолированной последовательности нуклеиновой кислоты определяется добавлением к ней с 3’-конца в одной рамке считывания одного или нескольких стоп-кодонов.Also, this problem is solved by creating an expression vector containing a given nucleic acid molecule under the control of regulatory elements necessary for the expression of this nucleic acid in the host cell. In preferred embodiments, the host cell comprising such an expression vector may be CHO Chinese hamster ovary cells (eg, CHO-K1 or CHO DG44 cell lines) adapted for the production of therapeutic proteins. In the present invention, the expression vector is preferably selected for expression of heterologous sequences in mammalian cells, but in some embodiments of the invention the expression vector may be selected for expression in other systems, such as, for example, insect cells, yeast or bacterial cells. Accordingly, each expression vector has its own set of regulatory elements that allow expression of a heterologous sequence (product) in the host cell, such as promoters and/or enhancers, Kozak sequences, polyA sequences and other regulatory sequences. It may also have sequences encoding leader (signal) peptides that ensure the secretion of recombinant polypeptides into the extracellular environment. Termination of protein synthesis from a given isolated nucleic acid sequence is determined by the addition of one or more stop codons to it from the 3’ end in one reading frame.
После трансфекции вектора в клетки эукариотической клеточной линии происходит синтез рекомбинантного полипептида и его секреция в культуральную бессывороточную среду. Полученный рекомбинантный полипептид очищают из среды при помощи, как правило, аффинной хроматографии на белок протеин-A или белок протеин-G, однако могут использоваться и другие методы очистки белков.After transfection of the vector into cells of a eukaryotic cell line, the recombinant polypeptide is synthesized and secreted into a serum-free culture medium. The resulting recombinant polypeptide is purified from the medium using, as a rule, affinity chromatography for protein A or protein G, but other protein purification methods can be used.
Нижеследующие примеры приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.The following examples are provided to highlight the characteristics of the present invention and should not be construed as limiting the scope of the invention in any way.
Пример 1. Конструирование плазмидExample 1: Construction of Plasmids
Для конструирования плазмид с заявляемыми нуклеотидными последовательностями была использована последовательность, кодирующая белок человека IL-1RA, полученная из плазмиды RG218518 (OriGene, IL-1RA, Human Tagged ORF clone). Последовательность, кодирующая IL-1RA, была использована для клонирования. Для клонирования участка, соответствующему аминокислотам 26-177 для SEQ ID NO: 2 были подобраны следующие праймеры:To construct plasmids with the claimed nucleotide sequences, the sequence encoding the human IL-1RA protein, obtained from plasmid RG218518 (OriGene, IL-1RA, Human Tagged ORF clone), was used. The IL-1RA coding sequence was used for cloning. To clone the region corresponding to amino acids 26-177 for SEQ ID NO: 2, the following primers were selected:
IL-1RA_SENSE (taatgaattcgcgaccctctgggagaaaatc) (SEQ ID NO: 6)IL-1RA_SENSE (taatgaattcgcgaccctctgggagaaaatc) (SEQ ID NO: 6)
IL-1RA_ANTISENSE (TAATAGATCTCTCGTCCTCCTGGAAGTAGA) (SEQ ID NO: 7)IL-1RA_ANTISENSE (TAATAGATCTCTCGTCCTCCTGGAAGTAGA) (SEQ ID NO: 7)
Проведена ПЦР со следующими условиями: 98оС 1 мин, 30 циклов (98оС 10 сек, 59оС 10 сек, 72оС 1 мин), 72оС 5 мин. Компоненты реакции: полимераза – Phusion (Thermo), буфер, содержащий Mg2+ для Phusion-полимеразы (Thermo), по 10 пкмоль каждого из праймеров и 0,25 мM смеси трифосфатов нуклеотидов (Thermo). Амплификацию осуществляли с последовательности RG218518 (Origene). После ПЦР: ПЦР продукт очищали набором для очистки ПЦР продуктов GeneJet PCR purification kit (Fermentas). Концентрация и соответствие предсказанному молекулярному весу проверяли при помощи гель-электрофореза в 1% агарозе (ТАЕ буфер). Полученные ПЦР продукты были использованы для дальнейшего конструирования. PCR was carried out under the following conditions: 98 ° C for 1 min, 30 cycles (98 ° C for 10 sec, 59 ° C for 10 sec, 72 ° C for 1 min), 72 ° C for 5 min. Reaction components: polymerase – Phusion (Thermo), buffer containing Mg2+ for Phusion polymerase (Thermo), 10 pmol of each primer and 0.25 mM mixture of nucleotide triphosphates (Thermo). Amplification was performed from the sequence RG218518 (Origene). After PCR: The PCR product was purified using the GeneJet PCR purification kit (Fermentas). Concentration and consistency with predicted molecular weight were verified by gel electrophoresis in 1% agarose (TAE buffer). The obtained PCR products were used for further design.
Для клонирования целевых последовательностей использовался вектор pFUSE-hIgG4e-Fc2 (InvivoGen), который позволяет получить слитые с Fc-доменом IgG4 последовательности и проводить исследование их свойств. В один из праймеров был включен сайт рестрикции EcoRI (IL-1RA_SENSE), а в другой сайт рестрикции BglII (IL-1RA_ANTISENSE), что после амплификации и рестрикции позволило получить фрагмент ДНК липкими EcoRI, BglII концами. Вектор и ПЦР-продукт обрабатывали рестриктазами EcoRI (Thermo) и BglII (Thermo) в течение 1 часа при 37оС, затем очищали с помощью GeneJet PCR purification kit (Fermentas) и лигировали, используя 1 Ед (ME) лигазы (Thermo) по протоколу производителя. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli XL1-Blue и высевали на среду LB, содержащую зеоцин. To clone target sequences, the pFUSE-hIgG4e-Fc2 vector (InvivoGen) was used, which allows one to obtain sequences fused to the IgG4 Fc domain and study their properties. One of the primers included an EcoRI restriction site (IL-1RA_SENSE), and the other a BglII restriction site (IL-1RA_ANTISENSE), which, after amplification and restriction, made it possible to obtain a DNA fragment with sticky EcoRI, BglII ends. The vector and PCR product were treated with restriction enzymes EcoRI (Thermo) and BglII (Thermo) for 1 hour at 37 o C, then purified using a GeneJet PCR purification kit (Fermentas) and ligated using 1 U (ME) ligase (Thermo) according to manufacturer's protocol. Competent E. coli XL1-Blue cells were transformed with the ligase mixture and plated on LB medium containing zeocin.
Чашки инкубировали в термостате в течение ночи при 37oC. На следующий день проверяли по 20 колоний из каждой лигазной смеси на присутствие нужной вставки, для этого часть колонии разводили в 20 мкл воды и кипятили в течение 5 минут. После охлаждения смесь откручивали и использовали 1 мкл в качестве матрицы в реакции ПЦР. ПЦР осуществляли при помощи Taq ДНК-полимеразы (Fermentas) и праймеров PROMF2 и FC. Присутствие вставки проверяли после электрофореза ПЦР продуктов. Из двух колоний, содержащих вставку, выделяли плазмидную ДНК, верифицировали длины рестрикционных фрагментов при помощи рестрикции с эндонуклеазами EcoRI и HindIII и секвенировали c использованием праймеров PROMF2 и FC на секвенаторе Applied Biosystems 3500 по инструкции производителя, используя праймеры PROMF2 (прямой) и FC (обратный).The dishes were incubated in a thermostat overnight at 37 o C. The next day, 20 colonies from each ligase mixture were checked for the presence of the desired insert; for this, part of the colony was diluted in 20 μl of water and boiled for 5 minutes. After cooling, the mixture was spun and 1 μl was used as a template in the PCR reaction. PCR was performed using Taq DNA polymerase (Fermentas) and primers PROMF2 and FC. The presence of the insert was checked after electrophoresis of the PCR products. Plasmid DNA was isolated from two colonies containing the insert, the lengths of restriction fragments were verified using restriction endonucleases EcoRI and HindIII, and sequenced using primers PROMF2 and FC on an Applied Biosystems 3500 sequencer according to the manufacturer's instructions using primers PROMF2 (forward) and FC (reverse). ).
PROMF2: GCCTGACCCTGCTTGCTCAACT (SEQ ID NO: 8) PROMF2: GCCTGACCCTGCTTGCTCAACT (SEQ ID NO: 8)
FC: CTCACGTCCACCACCACGCA (SEQ ID NO: 9) FC: CTCACGTCCACCACCACGCA (SEQ ID NO: 9)
Сконструированная в результате плазмида, содержащая целевые нуклеотидные последовательности, показана на Фиг. 1.The resulting plasmid containing the target nucleotide sequences is shown in FIG. 1.
Пример 2. Продукция гибридного белкаExample 2 Hybrid Protein Production
Для продукции гибридного белка проводилась временная трансфекция клеток CHO сконструированной плазмидой, кодирующей гибридный белок. To produce the fusion protein, CHO cells were transiently transfected with a constructed plasmid encoding the fusion protein.
Линию клеток СНО культивировали на среде Dynamis, с добавлением Glutamax (6 мМ), Anticlumping reagent B (0,5%) и зеоцина (500 мкг/мл). Культивирование осуществляли в шейкере-СО2-инкубаторе Multitron Cell (Infors, Швейцария) в атмосфере 5%-ного СО2 при температуре 37°С и относительной влажности 95% в колбах Эрнленмейера (Сorning, США) объемом 125 мл (перемешивание 120 об/мин).The CHO cell line was cultured in Dynamis medium supplemented with Glutamax (6 mM), Anticlumping reagent B (0.5%) and Zeocin (500 μg/ml). Cultivation was carried out in a Multitron Cell shaker- CO2 incubator (Infors, Switzerland) in an atmosphere of 5% CO2 at a temperature of 37°C and a relative humidity of 95% in Ernlenmeyer flasks (Corning, USA) with a volume of 125 ml (stirring 120 rpm). min).
Для трансфекции клеток CHO выделяли особо чистую («transfection grade») плазмидную ДНК с помощью набора EndoFree Plasmid MaxiKit (Qiagen) по протоколу фирмы-производителя. Линеаризацию сконструированной плазмиды осуществляли по сайту NotI (Thermo). Для трансфекции добавляли 20 мкг линеаризованной плазмиды на 100 мкл клеточной суспензии с концентрацией 5х107 клеток/мл. Электропорация проводилась по протоколу: 3 импульса по 1130 В продолжительностью 20 мс. For transfection of CHO cells, especially pure (“transfection grade”) plasmid DNA was isolated using the EndoFree Plasmid MaxiKit (Qiagen) according to the manufacturer’s protocol. Linearization of the constructed plasmid was carried out at the NotI site (Thermo). For transfection, 20 μg of linearized plasmid was added per 100 μl of cell suspension with a concentration of 5x10 7 cells/ml. Electroporation was carried out according to the protocol: 3 pulses of 1130 V each with a duration of 20 ms.
Селекцию трансфицированных клеток начинали через 48 часов после трансфекции путем добавления антибиотика зеоцина в концентрации 500 мкг/мл и продолжали ее при дальнейших пересевах.Selection of transfected cells began 48 hours after transfection by adding the antibiotic zeocin at a concentration of 500 μg/ml and continued with further subcultures.
Продукцию белка анализировали при помощи стандартного гель-электрофореза в полиакриамидном геле (SDS-PAGE). Секретируемый гибридный белок визуализировали с использованием кроличьих антител против человечьего Fc-домена (Jackson Immunoresearch, США). Также целевой белок IL-1RA-hFc из культуральной жидкости очищали путем FPLC хроматографии на колонке HiTrap ProteinA HP (Cytiva) и оценивали методом гель-электрофореза. При культивировании данных пулов была подтверждена продукция слитых полипептидов IL-1RA-hFc и их секреция в культуральной жидкости.Protein production was analyzed using standard polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The secreted fusion protein was visualized using rabbit anti-human Fc domain antibodies (Jackson Immunoresearch, USA). Also, the target protein IL-1RA-hFc from the culture liquid was purified by FPLC chromatography on a HiTrap ProteinA HP column (Cytiva) and assessed by gel electrophoresis. When culturing these pools, the production of IL-1RA-hFc fusion polypeptides and their secretion in the culture liquid was confirmed.
Таким образом, в результате проведенных исследований разработана нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок IL-1RA-hFc и являющаяся экспрессионной основой для его получения, а также получен слитый белок IL-1RA-hFc, содержащий функциональный домен IL-1RA, слитый с константной частью (Fc-доменом) иммуноглобулина человека IgG4, способный эффективно блокировать IL-1, который может быть использован в терапии и предотвращении развития воспалительных и аутоиммунных заболеваний. Данное изобретение обладает рядом улучшенных свойств по сравнению с аналогами и поэтому расширяет круг имеющихся кандидатов для лечения воспалительных и аутоиммунных заболеваний, в патогенезе которых участвует IL-1.Thus, as a result of the studies, a nucleotide sequence encoding the IL-1RA-hFc fusion protein and being the expression basis for its production was developed, and an IL-1RA-hFc fusion protein was obtained containing the functional IL-1RA domain fused with the constant part ( Fc domain) of human immunoglobulin IgG4, which can effectively block IL-1, which can be used in the treatment and prevention of the development of inflammatory and autoimmune diseases. This invention has a number of improved properties compared to analogues and therefore expands the range of available candidates for the treatment of inflammatory and autoimmune diseases in the pathogenesis of which IL-1 is involved.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.Although the invention has been described with reference to the disclosed embodiments, it will be apparent to those skilled in the art that the specific experiments detailed are provided for purposes of illustrating the present invention only and should not be construed as limiting the scope of the invention in any way. It should be understood that various modifications can be made without departing from the spirit of the present invention.
--->--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing <!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="IL-1RA-hFc.xml" <ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="IL-1RA-hFc.xml"
softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"
productionDate="2023-12-13">productionDate="2023-12-13">
<ApplicantFileReference>4103762</ApplicantFileReference> <ApplicantFileReference>4103762</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Общество с ограниченной <ApplicantName languageCode="ru">Limited company
ответственностью "Пальмира Биофарма" </ApplicantName>responsibility of Palmira Biopharma </ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>"PALMIRA BIOPHARMA" Limited Liability <ApplicantNameLatin>"PALMIRA BIOPHARMA" Limited Liability
Company</ApplicantNameLatin>Company</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Нуклеотидная последовательность, <InventionTitle languageCode="en">Nucleotide sequence,
кодирующая слитый белок, состоящий из функционального фрагмента encoding a fusion protein consisting of a functional fragment
человеческого IL-1RА и константной части тяжелой цепи человеческого human IL-1RA and human heavy chain constant portion
IgG4</InventionTitle>IgG4</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>9</SequenceTotalQuantity> <SequenceTotalQuantity>9</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1"> <SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>177</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>177</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..177</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..177</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2"> <INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MEICRGLRSHLITLLLFLFHSETICRPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFY <INSDSeq_sequence>MEICRGGLRSHLITLLLFLFHSETICRPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFY
LRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQ
DKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE</INSDSeq_seDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE</INSDSeq_se
quence>quence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2"> <SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>398</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>398</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..398</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..398</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q19"> <INSDQualifier id="q19">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MYRMQLLSCIALSLALVTNSRPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQ <INSDSeq_sequence>MYRMQLLSCIALSLALVTNSRPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQ
LVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFALVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFA
FIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDERSPPCPSCPAPEFLGGPFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDERSPPCPSCPAPEFLGGP
SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTV
LHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIALHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA
VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK<VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK<
/INSDSeq_sequence>/INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3"> <SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>224</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>224</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..224</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..224</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6"> <INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>PPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPE <INSDSeq_sequence>PPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPE
VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQ
PREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTV
DKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK</INSDSeq_sequence>DKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4"> <SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8"> <INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MYRMQLLSCIALSLALVTNS</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>MYRMQLLSCIALSLALVTNS</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5"> <SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>1194</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>1194</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1194</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..1194</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10"> <INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttg <INSDSeq_sequence>atgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttg
tcacgaattcgcgaccctctgggagaaaatccagcaagatgcaagccttcagaatctgggatgttaaccatcacgaattcgcgaccctctgggagaaaatccagcaagatgcaagccttcagaatctgggatgttaacca
gaagaccttctatctgaggaacaaccaactagttgctggatacttgcaaggaccaaatgtcaatttagaagaagaccttctatctgaggaacaaccaactagttgctggatacttgcaaggaccaaatgtcaatttagaa
gaaaagatagatgtggtacccattgagcctcatgctctgttcttgggaatccatggagggaagatgtgccgaaaagatagatgtggtacccattgagcctcatgctctgttcttgggaatccatggagggaagatgtgcc
tgtcctgtgtcaagtctggtgatgagaccagactccagctggaggcagttaacatcactgacctgagcgatgtcctgtgtcaagtctggtgatgagaccagactccagctggaggcagttaacatcactgacctgagcga
gaacagaaagcaggacaagcgcttcgccttcatccgctcagacagcggccccaccaccagttttgagtctgaacagaaagcaggacaagcgcttcgccttcatccgctcagacagcggccccaccaccagttttgagtct
gccgcctgccccggttggttcctctgcacagcgatggaagctgaccagcccgtcagcctcaccaatatgcgccgcctgccccggttggttcctctgcacagcgatggaagctgaccagcccgtcagcctcaccaatatgc
ctgacgaaggcgtcatggtcaccaaattctacttccaggaggacgagagatctcccccatgcccatcatgctgacgaaggcgtcatggtcaccaaattctacttccaggaggacgagagatctcccccatgcccatcatg
cccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatg
atctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttca
actggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcac
gtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaagggagtacaagtgcaag
gtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagcgtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagc
cacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggt
caaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaag
accacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagca
ggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaa
gagcctctccctgtctccgggtaaa</INSDSeq_sequence>gagcctctccctgtctccgggtaaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6"> <SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>31</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>31</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..31</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..31</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q12"> <INSDQualifier id="q12">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>taatgaattcgcgaccctctgggagaaaatc</INSDSeq_sequence <INSDSeq_sequence>taatgaattcgcgaccctctgggagaaaatc</INSDSeq_sequence
>>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7"> <SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>30</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>30</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..30</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..30</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q14"> <INSDQualifier id="q14">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>taatagatctctcgtcctcctggaagtaga</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>taatagatctctcgtcctcctggaagtaga</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8"> <SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q16"> <INSDQualifier id="q16">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gcctgaccctgcttgctcaact</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>gcctgaccctgcttgctcaact</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="9"> <SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q18"> <INSDQualifier id="q18">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ctcacgtccaccaccacgca</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>ctcacgtccaccaccacgca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
</ST26SequenceListing></ST26SequenceListing>
<---<---
Claims (11)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2821896C1 true RU2821896C1 (en) | 2024-06-27 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6733753B2 (en) * | 1997-02-10 | 2004-05-11 | Amgen Inc. | Composition and method for treating inflammatory diseases |
| US8883134B2 (en) * | 2010-10-20 | 2014-11-11 | Handok Pharmaceuticals, Inc. | Human interleukin-1 receptor antagonist—hybrid Fc fusion protein |
| RU2020127792A (en) * | 2018-01-26 | 2022-02-28 | Дженентек, Инк. | IL-22-Fc fusion proteins AND METHODS OF APPLICATION |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6733753B2 (en) * | 1997-02-10 | 2004-05-11 | Amgen Inc. | Composition and method for treating inflammatory diseases |
| US8883134B2 (en) * | 2010-10-20 | 2014-11-11 | Handok Pharmaceuticals, Inc. | Human interleukin-1 receptor antagonist—hybrid Fc fusion protein |
| RU2020127792A (en) * | 2018-01-26 | 2022-02-28 | Дженентек, Инк. | IL-22-Fc fusion proteins AND METHODS OF APPLICATION |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| КОСОБОКОВА Е.Н. и др., Слитные белки на основе антител и цитокинов: получение, функциональность и перспективы применения в онкологии, Современные технологии в медицине, 2013, v. 5 (4), pp. 102-111. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2327409T3 (en) | IMPROVED FC FUSION PROTEINS. | |
| CN110573532B (en) | TGF-beta receptor ectodomain fusion molecules and uses thereof | |
| JP6474797B2 (en) | Interleukin 15 (IL-15) antagonists and their use for the treatment of autoimmune and inflammatory diseases | |
| EP0617126A2 (en) | Polypeptide capable of inhibiting the binding bewteen human IL-6 and its receptor | |
| CZ302303B6 (en) | Homodimeric fusion protein exhibiting inhibition activity to angiogenesis, process for preparing thereof, DNA molecule and replicated expression vector | |
| JP2002514079A (en) | Chimeric OPG polypeptide | |
| AU2005296277A1 (en) | Chimeric protein | |
| US10562954B2 (en) | Fusion protein inhibiting TACI-BAFF complex formation and preparation method therefor and use thereof | |
| JP2010513471A (en) | Fusion protein of immunoglobulin Fc and human apolipoprotein kringle fragment | |
| JP5390191B2 (en) | Soluble gp130 molecular variant useful as a medicine | |
| WO2015113494A1 (en) | Bifunctional fusion protein, preparation method therefor, and use thereof | |
| RU2821896C1 (en) | NUCLEOTIDE SEQUENCE CODING FUSED PROTEIN CONSISTING OF FUNCTIONAL FRAGMENT OF HUMAN IL-1RA AND CONSTANT PART OF HEAVY CHAIN OF HUMAN IgG4 | |
| US20080292628A1 (en) | Chimeric Protein | |
| WO2023222035A1 (en) | Fusion protein of anti-tigit antibody and il2 or variant thereof, and application thereof | |
| JP4635255B2 (en) | Antibody medicine | |
| CN113396163B (en) | Fusion protein and its preparation method and use | |
| RU2818329C1 (en) | Nucleotide sequence coding fusion protein consisting of soluble extracellular fragment of human il-6r and constant part of heavy chain of human igg4 | |
| CN119371526A (en) | Antibodies against human complement factor C2b and methods of use | |
| CN110903397B (en) | PCSK9-specific fully human antibody with reduced low-density lipoprotein and its application | |
| US9920119B2 (en) | Chimeric molecule involving oligomerized FasL extracellular domain | |
| JP7375163B2 (en) | TGF-Beta Trap | |
| RU2391353C2 (en) | Polypeptide with growth hormone receptor agonist properties, nucleic acid coding said polypeptide, expression vector thereof and cell producing said polypeptide | |
| WO2022188883A1 (en) | Fusion protein of tnfr2 and april baff receptor | |
| WO2025042305A1 (en) | Nucleotide sequence encoding a pdgfra-hfc fusion protein |