RU2800137C1

RU2800137C1 - Конъюгат антитело-лекарственное средство, промежуточное соединение для его получения, способ его получения и его применение

Info

Publication number: RU2800137C1
Application number: RU2022101976A
Authority: RU
Inventors: Бинь БАО; Цинсун ГО; Бэй ГАО; Ифань ЧЖАН; Сюэфэй ЦЮ; Тун ЯН; Ицзюнь ШЭНЬ; Вэньбо ЧЖАН; Вэй Лв; Лэй Ван
Original assignee: Шанхай Фудань-Чжанцзян Био-Фармасьютикал Ко., Лтд.
Priority date: 2019-06-28
Filing date: 2020-06-05
Publication date: 2023-07-19

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к конъюгату антитело-лекарственное средство (ADC), представляющему собой Ab-(L₃-L₂-L₁-D)_m, где Ab представляет собой антитело; антитело представляет собой антитело к HER2 трастузумаб или его вариант, антитело к В7-Н3 Р2Е5 или его вариант или антитело к клаудину 18.2 IMAB362 или его вариант, промежуточное соединение для его получения, способ его получения и его применение. ADC обладает лучшей биологической активностью, стабильностью и однородностью, характеризуется сниженными токсичными и побочными эффектами, а также более быстрой скоростью высвобождения фермента расщепления в опухолевых клетках. Использование нового ADC может обеспечить широкое применение цитотоксического лекарственного средства, в частности камптотецина, в области ADC при лечении пациентов с опухолями, устойчивыми к ADC, воздействующему на микротрубочки. 6 н. и 11 з.п. ф-лы, 13 табл.

Description

[1] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно заявке на патент Китая CN2019105779096, поданной 28 июня 2019 г. Полное раскрытие вышеупомянутой заявки на патент Китая включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Область техники

[2] Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности относится к конъюгатуантитело-лекарственное средство, промежуточному соединению для его получения, способу его получения и его применению.

Уровень техники

[3] Конъюгатантитело-лекарственное средство (ADC) в последние годы был одной из актуальных тем в фармацевтической промышленности. Из-за неудовлетворительной клинической эффективности многих лекарственных препаратов на основе антител многие промышленные гиганты все чаще обращают их внимание на лекарственные препараты на основе ADC. На сегодняшний день для продажи за границей одобрено семь лекарственных препаратов на основе ADC. 17 мая 2000 г. Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) одобрена регистрация гемтузумабаозогамицина (торговое наименование Милотарг (Mylotarg)) от Pfizer для лечения пациентов с острым миелоидным лейкозом (ОМЛ), впервые испытавших рецидив, возрастом старше 60 лет, с экспрессией CD33+, и которым не подходит цитотоксическая химиотерапия. Гемтузумабозогамицин был отозван с рынка в 2010 г., но был повторно введен в 2017 г. В том же году инотузумабозогамицин (торговое наименование Беспонза (Besponsa)) от Pfizer также был одобрен FDA для лечения рецидивирующего и рефрактерного B-клеточного ОЛЛ у взрослых.19 августа 2011 г. FDA одобрена регистрация брентуксимабаведотина (торговое наименование Адцетрис (Adcetris)), разработанного SeattleGenetics, для лечения CD30-положительнойлимфомыХоджкина (ЛХ) и редкого заболевания - системной анапластической крупноклеточной лимфомы (сАККЛ). 22 февраля 2013 г. адо-трастузумабэмтанзин (T-DM1, торговое наименование Кадсила (Kadcyla)), разработанный Genentech, был одобрен FDA для продажи и в основном применяется для лечения Her2-положительного распространенного (метастатического) рака молочной железы. Только в 2019 г. были последовательно одобрены для продажи полатузумабведотин (торговое наименование Поливи (Polivy)), энфортумабведотин (торговое наименование Падсев (Padcev)) и фам-трастузумабдерукстекан (торговое наименование Энхерту (Enhertu)). Кроме того, более 100 лекарственных препаратов на основе ADC находятся на клинической и доклинической стадии разработки по всему миру.

[4] Основные функциональные элементы конъюгатаантитело-лекарственное средство включают антитело, линкер и эффекторную молекулу. Антитело применяется для переноса эффекторной молекулы в опухоль для обогащения, что приводит к уничтожению опухолевых клеток. Общепринятые эффекторные молекулы в большинстве случаев представляют собой высокоактивные ингибиторы тубулина, которые обычно характеризуются относительно сильными токсичными и побочными эффектами, ограничивающими применение ADC. Недавно компания Immunomedics изобрела новый тип лекарственного препарата на основе ADC - IMMU-132 (ZL200980156218) - с содержанием камптотецинового соединения в качестве эффекторной молекулы, демонстрирующего хороший противоопухолевый эффект. В DaiichiSankyo изобрели другой лекарственный препарат на основе ADC - DS-8201a (ZL201380053256) - с содержанием камптотецинового соединения в качестве эффекторной молекулы, также демонстрирующий хорошие противоопухолевые эффекты. В существующей технологии ADC линкер, применяемый для соединения камптотецинового соединения и антитела, изучается редко. В целом идеальный линкер в ADC должен соответствовать следующим требованиям: во-первых, обеспечивать то, чтобы низкомолекулярное лекарственное средство не отделялось от антитела в плазме крови, после попадания в клетку линкер разрушался в подходящих условиях с быстрым высвобождением активного низкомолекулярного лекарственного средства; во-вторых, линкер должен обладать хорошими физическими и химическими свойствами, чтобы он мог присоединиться к антителу с образованием конъюгата; и линкер должно быть несложно получать, чтобы заложить основу для крупномасштабного производства ADC. В IMMU-132 применяется pH-чувствительный линкер, который характеризуется низкой стабильностью. В DS-8201a применяется тетрапептидная структура, содержащая глицин-глицин-фенилаланин-глицин, по сравнению с общей последовательностью субстрата катепсина B (такой как валин-цитруллин), при этом реакция ферментного расщепления является медленной, имеют место плохие физические и химические свойства и затруднения в синтезе.

Сущность изобретения

[5] Техническая проблема, подлежащая решению в настоящем изобретении, заключается в преодолении недостатка одного типа существующего конъюгатаантитело-лекарственное средство и обеспечение нового конъюгата антитело-лекарственное средство, промежуточного соединения для его получения, способа его получения и его применения. Конъюгат антитело-лекарственное средство может обеспечить широкое применение цитотоксических лекарственных средств в области ADC и лечение пациентов с опухолями, которые устойчивы к ADC, воздействующим на микротрубочки.

[6] В настоящем изобретении предусматриваются конъюгатыантитело-лекарственное средство с рядом различных специфичных структурных линкеров, при этом конъюгаты антитело-лекарственное средство подавляют рост опухолей у млекопитающих и могут использоваться для лечения разных видов рака. Конъюгатыантитело-лекарственное средство обладают лучшей биологической активностью, стабильностью и однородностью, характеризуются сниженными токсичными и побочными эффектами, а также более быстрой скоростью высвобождения фермента расщепления в опухолевых клетках.

[7] В настоящем изобретении решаются вышеупомянутые технические проблемы посредством следующих технических решений.

[8] Настоящее изобретение предусматривает конъюгатантитело-лекарственное средство, при этом общая структурная формула конъюгата антитело-лекарственное средство представляет собой Ab-(L₃-L₂-L₁-D)_m;

[9] где Ab представляет собой антитело;

[10] D представляет собой цитотоксическое лекарственное средство;

[11] m равняется 2-8;

[12] структура L₁ является такой, как показано в формуле I, II, III или IV, a-конец L₁соединен с цитотоксическим лекарственным средством, и e-конец L₁ соединен с c-концом L₂;

, , , ;

[13] где L независимо представляет собой остаток фенилаланина, остаток аланина, остаток глицина, остаток глутаминовой кислоты, остаток аспарагиновой кислоты, остаток цистеина, остаток гистидина, остаток изолейцина, остаток лейцина, остаток лизина, остаток метионина, остаток пролина, остаток серина, остаток треонина, остаток триптофана, остаток тирозина или остаток валина; p равняется 2-4;

[14] R¹ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный -NR^1-1R^1-2, C₁-C₆алкил, замещенный R^1-3S(O)₂-, C₁-C₆алкил, C₃-C₁₀циклоалкил, C₆-C₁₄арил или 5-14-членный гетероарил; при этом гетероатомы в 5-14-членном гетероариле выбраны из одного или более N, O и S, и количество гетероатомов составляет 1, 2, 3 или 4;

[15] R^1-1, R^1-2 и R^1-3 независимо представляют собой C₁-C₆алкил;

[16] L₂ представляет собой , , , ,,,,,,,,,, ,, или , где n независимо равняется 1-12, c-конец L₂соединен с e-концом L₁, f-конец L₂ соединен с d-концом L₃;

[17] L₃ представляет собой или , где b-конец L₃соединен с Ab, d-конец L₃ соединен с f-концом L₂;

[18] если структура L₁ является такой, как показано в формуле I, L₃ представляет собой ; L₂ не представляет собой .

[19] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в конъюгатахантитело-лекарственное средство некоторые группы имеют нижеприведенные определения, а определения неуказанных групп являются такими, как описано в любом из приведенных выше объяснений (содержание данного абзаца по тексту передается как «в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения»):

[20] антитело может представлять собой общепринятое в области противоопухолевых ADC антитело, предпочтительно антитело к HER2 трастузумаб или его вариант, антитело к B7-H3 P2E5 или его вариант, антитело к клаудину 18.2 IMAB362 или его вариант или антитело к Trop2 RS7, или его вариант, более предпочтительно антитело к HER2 трастузумаб или его вариант, антитело к B7-H3 P2E5 или его вариант или антитело кклаудину 18.2 IMAB362 или его вариант, еще более предпочтительно антитело к HER2 трастузумаб или его вариант или антитело к клаудину 18.2 IMAB362 или его вариант и наиболее предпочтительно антитело к HER2 трастузумаб или антитело к клаудину 18.2 IMAB362. Аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к HER2 трастузумаба предпочтительно представлена под SEQ ID No. 5 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к HER2 трастузумаба предпочтительно представлена под SEQ ID No. 6 в перечне последовательностей. Аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к B7-H3 P2E5 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 7 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к B7-H3 P2E5 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 8 в перечне последовательностей. Аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к клаудину 18.2 IMAB362 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 1 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к клаудину 18.2 IMAB362 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 2 в перечне последовательностей. Аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к Trop2 RS7 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 3 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к Trop2 RS7 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 4 в перечне последовательностей. Вариант антитела к HER2 трастузумабахарактеризуется по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% гомологией по сравнению с антителом к HER2 трастузумабом. Вариант антитела к B7-H3 P2E5 характеризуется по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% гомологией по сравнению с антителом к B7-H3 P2E5. Вариант антитела к Trop2 RS7 характеризуется по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% гомологией по сравнению с антителом к Trop2 RS7. Вариант антитела к клаудину 18.2 IMAB362 характеризуется по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% гомологией по сравнению с антителом к клаудину 18.2 IMAB362.

[21] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения b-конец L₃ предпочтительно соединен с сульфгидрилом в антителе посредством тиоэфирной связи. Принимая в качестве примера, форма связи с остатком цистеина в антителе представляет собой .

[22] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения цитотоксическое лекарственное средство может представлять собой общепринятое в области ADC цитотоксическое лекарственное средство, в частности, предпочтительно ингибитор топоизомеразы, содержащий гидроксильную группу, и более предпочтительно ингибитор топоизомеразы I, содержащий гидроксильную группу, еще более предпочтительно камптотецин или его производные и наиболее предпочтительно .

[23] L₁ предпочтительно соединен с гидроксильной группой в цитотоксическом лекарственном средстве посредством эфирной связи. После присоединения L₁к фрагмент цитотоксического лекарственного средства, оставшийся в конъюгате антитело-лекарственное средство, предпочтительно представляет собой или .

Принимая и

в качестве примеров, -L₁-D может представлять собой или .

[24] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, если R¹ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный -NR^1-1R^1-2, C₁-C₆алкил предпочтительно представляет собой C₁-C₄алкил, более предпочтительно метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил или трет-бутил, наиболее предпочтительно этил. Каждый из R^1-1 и R^1-2 независимо предпочтительно представляет собой C₁-C₄алкил, более предпочтительно метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил или трет-бутил, наиболее предпочтительно метил.

[25] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в случае, если R¹ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный R^1-3S(O)₂-, C₁-C₆алкил предпочтительно представляет собой C₁-C₄алкил, более предпочтительно метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил или трет-бутил, наиболее предпочтительно этил. R^1-3 предпочтительно представляет собой C₁-C₄алкил, более предпочтительно метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил или трет-бутил, наиболее предпочтительно метил.

[26] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, если R¹ представляет собой C₁-C₆алкил, C₁-C₆алкил предпочтительно представляет собой C₁-C₄алкил, более предпочтительно метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил или трет-бутил, наиболее предпочтительно метил или этил.

[27] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения m предпочтительно равняется 4-8, более предпочтительно 7-8 (например, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 8,0).

[28] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения L предпочтительно представляет собой остаток валина или остаток аланина, и p предпочтительно равняется 2.(L)p более предпочтительно представляет собой , где амино-конец (L)p соединен с карбонильным концом в формуле III.

[29] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения n предпочтительно равняется 8-12 (например, 8 и 12).

[30] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения R^1-1, R^1-2 и R^1-3 независимо предпочтительно представляют собой C₁-C₄алкил, более предпочтительно метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил или трет-бутил, наиболее предпочтительно метил.

[31] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения R¹ предпочтительно представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный -NR^1-1R^1-2, C₁-C₆алкил, замещенный R^1-3S(O)₂-, или C₁-C₆алкил, более предпочтительно C₁-C₆алкил, замещенный -NR^1-1R^1-2, или C₁-C₆алкил, замещенный R^1-3S(O)₂-, наиболее предпочтительно C₁-C₆алкил, замещенный R^1-3S(O)₂-. Если R¹представляет собой C₁-C₆алкил, C₁-C₆алкил предпочтительно представляет собой метил или этил. C₁-C₆алкил, замещенный R^1-3S(O)₂-, предпочтительно представляет собой . C₁-C₆алкил, замещенный -NR^1-1R^1-2, предпочтительно представляет собой .

[32] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предпочтительно представляет собой , или .

[33] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения L₃ предпочтительно представляет собой .

[34] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, если структура L₁ является такой, как показано в формуле I, L₂ предпочтительно представляет собой ,,,, , , или , L₃ предпочтительно представляет собой .

[35] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, если структура L₁ является такой, как показано в формуле II, L₂ предпочтительно представляет собой , или ; L₃ предпочтительно представляет собой .

[36] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, если структура L₁ является такой, как показано в формуле III, L₂ предпочтительно представляет собой , , , , или ; L₃ предпочтительно представляет собой .

[37] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, если структура L₁ является такой, как показано в формуле IV, L₂ предпочтительно представляет собой или ; L₃ предпочтительно представляет собой .

[38] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения структура L₁ предпочтительно является такой, как показано в формуле I или III.

[39] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, если структура L₁ является такой, как показано в формуле I, L₂ предпочтительно представляет собой , , , , или .

[40] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, если структура L₁ является такой, как показано в формуле I, L₂ предпочтительно представляет собой .

[41] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, если структура L₁ является такой, как показано в формуле III, L₂ предпочтительно представляет собой , , , или .

[42] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, если структура L₁ является такой, как показано в формуле III, L₂ предпочтительно представляет собой , , или .

[43] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, если структура L₁ является такой, как показано в формуле III, L₂ представляет собой .

[44] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, если структура L₁ является такой, как показано в формуле III, L₁предпочтительно представляет собой .

[45] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в конъюгатеантитело-лекарственное средство Ab представляет собой антитело к HER2 трастузумаб, антитело к B7-H3 P2E5 или его вариант или антитело к клаудину 18.2 IMAB362 или его вариант; D представляет собой цитотоксическое лекарственное средство; m равняется 2-8;

[46] структура L₁ является такой, как показано в формуле I, II, III или IV,

,,,;

[47] L₂ представляет собой , , , , , , , , , , , , , , , или , n независимо равняется 8-12;

[48] L₃ представляет собой ;

[49] L независимо представляет собой остаток валина или остаток аланина; p равняется от 2 до 4;

[50] R¹ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный -NR^1-1R^1-2, C₁-C₆алкил, замещенный R^1-3S(O)₂-, или C₁-C₆алкил;

[51] каждый из R^1-1, R^1-2 и R^1-3 независимо представляет собой C₁-C₆алкил;

[52] где аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к HER2 трастузумаба предпочтительно представлена под SEQ ID No. 5 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к HER2 трастузумаба предпочтительно представлена под SEQ ID No. 6 в перечне последовательностей; аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к B7-H3 P2E5 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 7 в перечне последовательностей и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к B7-H3 P2E5 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 8 в перечне последовательностей; аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к клаудину 18.2 IMAB362 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 1 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к клаудину 18.2 IMAB362 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 2 в перечне последовательностей.

[53] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в конъюгатеантитело-лекарственное средство Ab представляет собой антитело к HER2 трастузумаб, антитело к B7-H3 P2E5 или его вариант или антитело к клаудину 18.2 IMAB362 или его вариант; D представляет собой ; m равняется 7-8;

[54] структура L₁ является такой, как показано в формуле I или III,

, ;

[55] если структура L₁ является такой, как показано в формуле I, L₂ представляет собой , , , , или ; n независимо равняется 8-12;

[56] если структура L₁ является такой, как показано в формуле III, L₂ представляет собой , , , или ; n независимо равняется 8-12;

[57] L₃ представляет собой ;

[58] L независимо представляет собой остаток валина или остаток аланина; p равняется от 2 до 4;

[59] R¹ представляет собой C₁-C₄алкил, замещенный -NR^1-1R^1-2, C₁-C₄алкил, замещенный R^1-3S(O)₂-, или C₁-C₄алкил; R^1-1, R^1-2 и R^1-3 независимо представляют собой C₁-C₄алкил;

[60] аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к HER2 трастузумаба предпочтительно представлена под SEQ ID No. 5 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к HER2 трастузумаба предпочтительно представлена под SEQ ID No. 6 в перечне последовательностей; аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к B7-H3 P2E5 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 7 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к B7-H3 P2E5 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 8 в перечне последовательностей; аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к клаудину 18.2 IMAB362 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 1 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к клаудину 18.2 IMAB362 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 2 в перечне последовательностей.

[61] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, где Ab представляет собой антитело; D представляет собой ;

[62] L₁ представляет собой ; где L представляет собой остаток валина или остаток аланина, p равняется 2, (L)p предпочтительно представляет собой ; R¹ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный -NR^1-1R^1-2, C₁-C₆алкил, замещенный R^1-3S(O)₂-, или C₁-C₆алкил, предпочтительно C₁-C₆алкил, замещенный -NR^1-1R^1-2, или C₁-C₆алкил, замещенный R^1-3S(O)₂-, более предпочтительно C₁-C₆алкил, замещенный R^1-3S(O)₂-; R^1-1, R^1-2 и R^1-3 независимо представляют собой C₁-C₄алкил, предпочтительно метил; C₁-C₆алкил, замещенный -NR^1-1R^1-2, предпочтительно представляет собой ; C₁-C₆алкил, замещенный R^1-3S(O)₂-, предпочтительно представляет собой ;

[63] L₂ представляет собой , , или , где n предпочтительно равняется 8; L₂ предпочтительно представляет собой ; L₃ представляет собой .

[64] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения L₂ представляет собой .

[65] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения L₂ представляет собой .

[66] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения L₂ представляет собой .

[67] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения L₂ представляет собой .

[68] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения L₂ представляет собой .

[69] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения L₂ представляет собой .

[70] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения L₂ представляет собой .

[71] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения L₂ представляет собой .

[72] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения L₂ представляет собой .

[73] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения L₂ представляет собой .

[74] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения L₂ представляет собой .

[75] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения L₂ представляет собой .

[76] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения L₂ представляет собой .

[77] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения L₂представляет собой .

[78] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения L₂ представляет собой .

[79] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения L₂ представляет собой .

[80] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения L₂ представляет собой .

[81] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения структура L₁ является такой, как показано в формуле III, L₂ представляет собой .

[82] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгатантитело-лекарственное средство предпочтительно представляет собой любое из соединений, представленных ниже:

,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, или ,

[83] где m равняется 2-8, предпочтительно 7-8, например, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8 или 8,0;

[84] Ab представляет собой антитело к HER2 трастузумаб, антитело к B7-H3 P2E5 или антитело к клаудину 18.2 IMAB362; аминокислотная последовательность легкой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 5 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 6 в перечне последовательностей; аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к B7-H3 P2E5 представлена под SEQ ID No. 7 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к B7-H3 P2E5 представлена под SEQ ID No. 8 в перечне последовательностей; аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к клаудину 18.2 IMAB362 представлена под SEQ ID No. 1 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к клаудину 18.2 IMAB362 представлена под SEQ ID No. 2 в перечне последовательностей.

[85] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгатантитело-лекарственное средство предпочтительно представляет собой любое из соединений, представленных ниже:

, , , ,,,,,,,, или ;

[86] где Ab представляет собой антитело к HER2 трастузумаб; или аминокислотная последовательность легкой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 5 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 6 в перечне последовательностей; где m равняется 2-8, предпочтительно 7-8, например, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8 или 8,0.

[87] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгатантитело-лекарственное средство предпочтительно представляет собой любое из соединений, представленных ниже:

[88] где Ab представляет собой антитело к HER2 трастузумаб; или аминокислотная последовательность легкой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 5 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 6 в перечне последовательностей.

[89] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат антитело-лекарственное средство предпочтительно представляет собой любое из соединений, представленных ниже:

[90] где Ab представляет собой антитело к HER2 трастузумаб; или аминокислотная последовательность легкой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 5 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 6 в перечне последовательностей.

[91] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат антитело-лекарственное средство предпочтительно представляет собой любое из соединений, представленных ниже:

, , , , , , , , , или ,

[92] где Ab представляет собой антитело к B7-H3 P2E5; или аминокислотная последовательность легкой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 7 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 8 в перечне последовательностей, где m равняется 2-8, предпочтительно 7-8, например, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8 или 8,0.

[93] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат антитело-лекарственное средство предпочтительно представляет собой любое из соединений, представленных ниже:

[94] где Ab представляет собой антитело к B7-H3 P2E5; или аминокислотная последовательность легкой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 7 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 8 в перечне последовательностей.

[95] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат антитело-лекарственное средство предпочтительно представляет собой любое из соединений, представленных ниже:

, ,, ,, ,, , или ,

[96] где Ab представляет собой антитело к клаудину 18.2 IMAB362; или аминокислотная последовательность легкой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 1 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 2 в перечне последовательностей; где m равняется 2-8, предпочтительно 7-8, например, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8 или 8,0.

[97] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат антитело-лекарственное средство предпочтительно представляет собой любое из соединений, представленных ниже:

[98] Ab представляет собой антитело к клаудину 18.2 IMAB362; или аминокислотная последовательность легкой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 1 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 2 в перечне последовательностей.

[99] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат антитело-лекарственное средство предпочтительно представляет собой любое из соединений, представленных ниже:

, ,, ,

[100] где Ab, m и R¹ являются такими, как определено выше.

[101] В настоящем изобретении также предусмотрен конъюгат линкер-лекарственное средство, при этом общая структурная формула конъюгата линкер-лекарственное средство представляет собой L₄-L₂-L₁-D; где L₄ представляет собой или ; L₂, L₁ и D являются такими, как определено выше, f-конец L₂ соединен с d-концом L₄; если L₄ представляет собой , если L₁ представляет собой , L₂ не представляет собой .

[102] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат линкер-лекарственное средство предпочтительно представляет собой любое из соединений, представленных ниже:

, ,, ,

[103] где R¹ является таким, как определено выше.

[104] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат линкер-лекарственное средство предпочтительно представляет собой любое из соединений, представленных ниже:

, ,, ,, ,, , , , , , , , , , , , , , , , или .

[105] Настоящее изобретение также предусматривает следующее соединение:

,

[106] где R¹ является таким, как определено выше;

[107] R² представляет собой -N₃, -NH₂, или .

[108] Настоящее изобретение также предусматривает следующие соединения:

, , , , , , или .

[109] Настоящее изобретение предусматривает конъюгат антитело-лекарственное средство, при этом общая структурная формула конъюгата антитело-лекарственное средство представляет собой Ab-(L₃-L₂-L₁-D)_m;

[110] где Ab представляет собой антитело;

[111] D представляет собой цитотоксическое лекарственное средство;

[112] m равняется 2-8;

[113] структура L₁ является такой, как показано в формуле I, II, III или IV, a-конец L₁соединен с цитотоксическим лекарственным средством, и e-конец L₁ соединен с c-концом L₂;

, , , ;

[114] L₂ представляет собой , , , , , , , , , , , , , , , или , где n независимо равняется 1-12, c-конец L₂соединен с e-концом L₁, f-конец L₂ соединен с d-концом L₃;

[115] L₃ представляет собой или , где b-конец L₃соединен с Ab, d-конец L₃ соединен с f-концом L₂;

[116] где L независимо представляет собой остаток фенилаланина, остаток глицина, остаток глутаминовой кислоты, остаток аспарагиновой кислоты, остаток цистеина, остаток гистидина, остаток изолейцина, остаток лейцина, остаток лизина, остаток метионина, остаток пролина, остаток серина, остаток треонина, остаток триптофана, остаток тирозина или остаток валина; p равняется 2-4;

[117] R¹ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный -NR^1-1R^1-2, C₁-C₆алкил, замещенный R^1-3S(O)₂-, C₁-C₆алкил, C₃-C₁₀циклоалкил, C₆-C₁₄арил или 5-14-членный гетероарил; при этом гетероатомы в 5-14-членном гетероариле выбраны из одного или более N, O и S, и количество гетероатомов составляет 1, 2, 3 или 4;

[118] R^1-1, R^1-2 и R^1-3 независимо представляют собой C₁-C₆алкил;

[119] если структура L₁ является такой, как показано в формуле I, L₃представляет собой , L₂ не представляет собой .

[120] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в конъюгатах антитело-лекарственное средство некоторые группы имеют нижеприведенные определения, а определения неуказанных групп являются такими, как описано в любом из приведенных выше объяснений (содержание данного абзаца по тексту передается как «в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения»):

[121] антитело может представлять собой общепринятое в области противоопухолевых ADC антитело, предпочтительно антитело к HER2 трастузумаб или его вариант, антитело к B7-H3 P2E5 или его вариант, антитело к клаудину 18.2 IMAB362 или его вариант или антитело к Trop2 RS7, или его вариант, более предпочтительно антитело к HER2 трастузумаб или его вариант, антитело к B7-H3 P2E5 или его вариант или антитело кклаудину 18.2 IMAB362 или его вариант, еще более предпочтительно антитело к HER2 трастузумаб или его вариант или антитело к клаудину 18.2 IMAB362 или его вариант и наиболее предпочтительно антитело к HER2 трастузумаб или антитело к клаудину 18.2 IMAB362. Аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к HER2 трастузумаба предпочтительно представлена под SEQ ID No. 5 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к HER2 трастузумаба предпочтительно представлена под SEQ ID No. 6 в перечне последовательностей. Аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к B7-H3 P2E5 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 7 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к B7-H3 P2E5 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 8 в перечне последовательностей. Аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к клаудину 18.2 IMAB362 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 1 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к клаудину 18.2 IMAB362 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 2 в перечне последовательностей. Аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к Trop2 RS7 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 3 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к Trop2 RS7 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 4 в перечне последовательностей.

[122] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения b-конец L₃ предпочтительно соединен с сульфгидрилом в антителе посредством тиоэфирной связи. Принимая в качестве примера, форма связи с остатком цистеина в антителе представляет собой .

[123] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения цитотоксическое лекарственное средство может представлять собой общепринятое в области ADC цитотоксическое лекарственное средство, в частности, предпочтительно ингибитор топоизомеразы, содержащий гидроксильную группу, и более предпочтительно ингибитор топоизомеразы I, содержащий гидроксильную группу, еще более предпочтительно камптотецин или его производные и наиболее предпочтительно .

[124] L₁ предпочтительно соединен с гидроксильной группой в цитотоксическом лекарственном средстве посредством эфирной связи. После присоединения L₁к фрагмент цитотоксического лекарственного средства, оставшийся в конъюгате антитело-лекарственное средство, предпочтительно представляет собой или . Принимая и в качестве примеров, -L₁-D может представлять собой или .

[125] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, если R¹ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный -NR^1-1R^1-2, C₁-C₆алкил предпочтительно представляет собой C₁-C₄алкил, более предпочтительно метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил или трет-бутил, наиболее предпочтительно этил. Каждый из R^1-1 и R^1-2 независимо предпочтительно представляет собой C₁-C₄алкил, более предпочтительно метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил или трет-бутил, наиболее предпочтительно метил.

[126] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, если R¹ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный R^1-3S(O)₂-, C₁-C₆алкил предпочтительно представляет собой C₁-C₄алкил, более предпочтительно метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил или трет-бутил, наиболее предпочтительно этил. R^1-3 предпочтительно представляет собой C₁-C₄алкил, более предпочтительно метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил или трет-бутил, наиболее предпочтительно метил.

[127] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, если R¹ представляет собой C₁-C₆алкил, C₁-C₆алкил предпочтительно представляет собой C₁-C₄алкил, более предпочтительно метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил или трет-бутил, наиболее предпочтительно метил.

[128] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения m предпочтительно равняется 4-8, более предпочтительно 7-8 (например, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8).

[129] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения L предпочтительно представляет собой остаток валина или остаток аланина, и p предпочтительно равняется 2. Более предпочтительно (L)p представляет собой , где амино-конец (L)p соединен с карбонильным концом в формуле III.

[130] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения n предпочтительно равняется 8-12 (например, 8 и 12).

[131] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения R^1-1, R^1-2 и R^1-3 независимо предпочтительно представляют собой C₁-C₄алкил, более предпочтительно метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил или трет-бутил, наиболее предпочтительно метил.

[132] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предпочтительно представляет собой или .

[133] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения L₃предпочтительно представляет собой .

[134] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, если структура L₁ является такой, как показано в формуле I, L₂ предпочтительно представляет собой , , , , , , или .

[135] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, если структура L₁ является такой, как показано в формуле II, L₂ предпочтительно представляет собой , или ; L₃ предпочтительно представляет собой .

[136] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, если структура L₁ является такой, как показано в формуле III, L₂ предпочтительно представляет собой , , , , или ; L₃ предпочтительно представляет собой .

[137] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, если структура L₁ является такой, как показано в формуле IV, L₂ предпочтительно представляет собой или ; L₃ предпочтительно представляет собой .

[138] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения R¹ предпочтительно представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный -NR^1-1R^1-2, C₁-C₆алкил, замещенный R^1-3S(O)₂-, или C₁-C₆алкил.

[139] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в конъюгате антитело-лекарственное средство Ab представляет собой антитело к HER2 трастузумаб, антитело к B7-H3 P2E5 или его вариант, антитело к клаудину 18.2 IMAB362 или его вариант; D представляет собой цитотоксическое лекарственное средство; m равняется 2-8;

[140] структура L₁ является такой, как показано в формуле I, II, III или IV,

,, , ;

[141] L₂ представляет собой , , , , , , , , , , , , , , , или , n независимо равняется 8-12;

[142] L₃ представляет собой ;

[143] L независимо представляет собой остаток валина или остаток аланина; p равняется 2-4;

[144] R¹ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный -NR^1-1R^1-2, C₁-C₆алкил, замещенный R^1-3S(O)₂-, или C₁-C₆алкил;

[145] R^1-1, R^1-2 и R^1-3 независимо представляют собой C₁-C₆алкил;

[146] где аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к HER2 трастузумаба предпочтительно представлена под SEQ ID No. 5 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к HER2 трастузумаба предпочтительно представлена под SEQ ID No. 6 в перечне последовательностей; аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к B7-H3 P2E5 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 7 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к B7-H3 P2E5 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 8 в перечне последовательностей; аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к клаудину 18.2 IMAB362 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 1 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к клаудину 18.2 IMAB362 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 2 в перечне последовательностей.

[147] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в конъюгате антитело-лекарственное средство Ab представляет собой антитело к HER2 трастузумаб, антитело к B7-H3 P2E5 или его вариант, антитело к клаудину18.2 IMAB362 или его вариант; D представляет собой ; m равняется 7-8;

[148] если структура L₁ является такой, как показано в формуле I, L₂ представляет собой , , , , , , или ; n независимо представляет собой 8-12;

[149] если структура L₁ является такой, как показано в формуле II, L₂ представляет собой , или ; n равняется 8-12;

[150] если структура L₁ является такой, как показано в формуле III, L₂ представляет собой , , , , или ; n равняется 8-12;

[151] если структура L₁ является такой, как показано в формуле IV, L₂ представляет собой или ;

[152] L₃ представляет собой ;

[153] L независимо представляет собой остаток валина или остаток аланина; p равняется от 2 до 4;

[154] R¹ представляет собой C₁-C₄алкил, замещенный -NR^1-1R^1-2, C₁-C₄алкил, замещенный R^1-3S(O)₂-, или C₁-C₄алкил; R^1-1, R^1-2 и R^1-3 независимо представляют собой C₁-C₄алкил;

[155] аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к HER2 трастузумаба предпочтительно представлена под SEQ ID No. 5 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к HER2 трастузумаба предпочтительно представлена под SEQ ID No. 6 в перечне последовательностей; аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к B7-H3 P2E5 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 7 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к B7-H3 P2E5 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 8 в перечне последовательностей; аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к клаудину 18.2 IMAB362 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 1 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к клаудину 18.2 IMAB362 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 2 в перечне последовательностей.

[156] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгатантитело-лекарственное средство предпочтительно представляет собой любое из соединений, представленных ниже:

, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , или , где Ab представляет собой антитело к HER2 трастузумаб, антитело к B7-H3 P2E5 или антитело к клаудину 18.2 IMAB362, m равняется 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7 или 7,8; аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к HER2 трастузумаба предпочтительно представлена под SEQ ID No. 5 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к HER2 трастузумаба предпочтительно представлена под SEQ ID No. 6 в перечне последовательностей; аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к B7-H3 P2E5 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 7 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к B7-H3 P2E5 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 8 в перечне последовательностей; аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к клаудину 18.2 IMAB362 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 1 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к клаудину 18.2 IMAB362 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 2 в перечне последовательностей.

[157] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат антитело-лекарственное средство предпочтительно представляет собой любое из соединений, представленных ниже:

Ab представляет собой антитело к HER2 трастузумаб; аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к HER2 трастузумаба предпочтительно представлена под SEQ ID No. 5 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к HER2 трастузумаба предпочтительно представлена под SEQ ID No. 6 в перечне последовательностей.

[158] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат антитело-лекарственное средство предпочтительно представляет собой любое из соединений, представленных ниже:

где Ab представляет собой антитело к HER2 трастузумаб; аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к HER2 трастузумаба предпочтительно представлена под SEQ ID No. 5 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к HER2 трастузумаба предпочтительно представлена под SEQ ID No. 6 в перечне последовательностей.

[159] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат антитело-лекарственное средство предпочтительно представляет собой любое из соединений, представленных ниже:

7,5

7,6

7,6
где Ab представляет собой антитело к B7-H3 P2E5; аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к B7-H3 P2E5 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 7 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к B7-H3 P2E5 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 8 в перечне последовательностей.

[160] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат антитело-лекарственное средство предпочтительно представляет собой любое из соединений, представленных ниже:

где Ab представляет собой антитело к клаудину 18.2 IMAB362; аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к клаудину 18.2 IMAB362 представлена под SEQ ID No. 1 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к клаудину 18.2 IMAB362 представлена под SEQ ID No. 2 в перечне последовательностей.

[161] Настоящее изобретение также предусматривает конъюгат линкер-лекарственное средство, при этом общая структурная формула конъюгата линкер-лекарственное средство представляет собой L₄-L₂-L₁-D; где L₄ представляет собой или ; L₂, L₁ и D являются такими, как определено выше, f-конец L₂соединен с d-концом L₄; если L₄ представляет собой , L₁ представляет собой ; L₂ не представляет собой .

[162] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат линкер-лекарственное средство предпочтительно представляет собой любое из соединений, представленных ниже:

, ,, ,, ,, , , , , , , , , , , , , , , , или .

[163] Настоящее изобретение также предусматривает следующие соединения:

, .

[164] Настоящее изобретение предусматривает способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство, включающий следующие стадии: проведения сочетания конъюгата линкер-лекарственное средство с антителом.

[165] В настоящем изобретении условия проведения сочетания и действия для его проведения могут представлять собой общепринятые в уровне техники условия и действия для проведения сочетания.

[166] Настоящее изобретение также предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую конъюгат антитело-лекарственное средство и фармацевтически приемлемый носитель.

[167] Настоящее изобретение также предусматривает применение конъюгата антитело-лекарственное средство или фармацевтической композиции в получении лекарственного препарата для предупреждения или лечения рака. Рак предпочтительно представляет собой рак желудка, рак молочной железы, немелкоклеточный рак легкого, рак уротелия или рак поджелудочной железы.

[168] Настоящее изобретение также предусматривает способ предупреждения и/или лечения рака, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества конъюгата антитело-лекарственное средство или фармацевтической композиции. Рак предпочтительно представляет собой рак желудка, рак молочной железы, немелкоклеточный рак легкого, рак уротелия или рак поджелудочной железы.

[169] В настоящем изобретении m представляет собой молярное соотношение молекулы цитотоксического лекарственного средства и Ab (также известное как DAR, то есть соотношение лекарственного средства и антитела при их сочетании), причем m может быть целым числом или десятичным числом, и предпочтительно его следует понимать как среднее значение молярного соотношения молекулы лекарственного средства и молекулы моноклонального антитела в конъюгате антитело-лекарственное средство, полученном путем сочетания одной молекулы моноклонального антитела с цитотоксическим лекарственным средством, причем в целом оно может быть измерено с помощью хроматографии с гидрофобным взаимодействием (HIC), электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE, электрофорез), жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS) и других способов.

[170] В настоящем изобретении термин «C₁-C₆алкил» отдельно или в комбинации означает насыщенную линейную или разветвленную алкильную группу, содержащую от 1 до 6, в частности от 1 до 4 атомов углерода, такую как метил и этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил или трет-бутил, предпочтительно «C₁-C₆алкил» означает метил или этил.

[171] Антитело по настоящему изобретению можно получить с помощью хорошо известных в уровне техники методик, таких как гибридомные тохнологии, методики рекомбинантной ДНК, методики фагового дисплея, методики синтеза, или комбинаций таких методик, или с помощью других методик, известных из уровня техники.

[172] Варианты относятся к мутантам антитела по аминокислотной последовательности и ковалентным производным природных полипептидов при условии, что сохраняется биологическая активность, эквивалентная таковой у природных полипептидов. Отличие между мутантными аминокислотными последовательностями и природными аминокислотными последовательностями обычно заключается в том, что одна или более аминокислот в природной аминокислотной последовательности заменены или одна или более аминокислот удалены из полипептидной последовательности и/или вставлены в нее. Мутанты с делецией включают фрагменты природных полипептидов и мутанты с усечением N-концевой и/или C-концевой части. Обычно мутантные аминокислотные последовательности характеризуются по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% гомологией по сравнению с природной последовательностью.

[173] Термин «лечение» или эквивалентные ему выражения применительно, например, к раку относятся к процедуре или процессу, применяемым для уменьшения или устранения некоторого количества раковых клеток в организме пациента или облегчения симптомов рака. «Лечение» рака или других пролиферативных нарушений не обязательно означает, что раковые клетки или другие нарушения будут фактически устранены, количество клеток или нарушений будет фактически уменьшено, или симптомы рака или других нарушений будут фактически облегчены. Обычно, даже при низкой вероятности успеха, способ лечения рака будет применяться, но с учетом истории болезни пациента и предполагаемых ожиданий в отношении его выживания, и он все же будет считаться обеспечивающим общее благоприятное воздействие.

[174] Термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к любому составу или среде-носителю, которые могут осуществлять доставку эффективного количества активного вещества по настоящему изобретению, не оказывают отрицательного воздействия на биологическую активность активного вещества и не оказывают токсичных побочных эффектов в отношении хозяина или пациента. Иллюстративные носители включают воду, масла, растительные и минеральные, основу для крема, основу для лосьона, основу для мази и т.д. Такие основы включают суспендирующие средства, вещества, придающие клейкость, вещества, способствующие проникновению, и т.п. Их составы хорошо известны специалистам в области косметических средств или лекарственных препаратов для местного применения.

[175] Основываясь на недопущении нарушения общеизвестных знаний в данной области техники, предпочтительные условия могут быть произвольным образом объединены с получением предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения.

[176] Все реагенты и исходные материалы, используемые в настоящем изобретении, являются коммерчески доступными.

[177] Положительный и прогрессивный эффект настоящего изобретения заключается в следующем: конъюгат антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению обладает лучшей биологической активностью, стабильностью и однородностью, характеризуется сниженными токсичными и побочными эффектами, а также более быстрой скоростью высвобождения фермента расщепления в опухолевых клетках. Путем применения данного нового типа конъюгата антитело-лекарственное средство можно достичь широкого применения цитотоксических лекарственных средств, в частности камптотециновых соединений, в области ADC и лечения пациентов с опухолями, которые устойчивы к ADC, воздействующим на микротрубочки.

Подробное описание предпочтительного варианта осуществления

[178] Таблица 1. Описание сокращений

[179] Следующие варианты осуществления дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение, однако настоящее изобретение ими не ограничивается. В следующих вариантах осуществления экспериментальные способы без конкретных условий выбраны в соответствии с общепринятыми способами и условиями или в соответствии со спецификацией продукта.

[180] Вариант осуществления 1. Синтез LE 01

[181] Коммерчески доступный SMCC (1 ммоль, 0,32 г) и соединение A (0,5 ммоль, 0,42 г) растворяли в 10 мл DMF, смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч и растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении, неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле [хлороформ - хлороформ:метанол = 9:1 (об./об.)] с получением указанного в заголовке соединения (0,5 г, 0,47 ммоль) в виде бледно-желтого твердого вещества, выход: 94%, ESI-MS масса/заряд: 1060,3 (M+H); где соединение A можно синтезировать в соответствии с известным способом, описанным в WO2015146132A1.

[182] Соединение GGFG-Dxd (структура приведена ниже) также синтезировали в соответствии с известным способом, описанным в WO2015146132A1, ESI-MS масса/заряд: 1034,5 (M+H), ¹H-ЯМР (400 MГц, DMSO-d ₆) δ 8,61 (t, J = 6,4 Гц, 1H), 8,50 (d, J = 8,5 Гц, 1H), 8,28 (t, J = 5,1 Гц, 1H), 8,11 (d, J = 7,5 Гц, 1H), 8,05 (t, J = 5,7 Гц, 1H), 7,99 (t, J = 5,9 Гц, 1H), 7,77 (d, J = 11,0 Гц, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,25 - 7,16 (m, 5H), 6,98 (s, 2H), 6,51 (s, 1H), 5,59 (dt, J = 7,4, 4,1 Гц, 1H), 5,41 (s, 2H), 5,20 (s, 2H), 4,64 (d, J = 6,1 Гц, 2H), 4,53 - 4,40 (m, 1H), 4,02 (s, 2H), 3,74 - 3,37 (m, 8H), 3,18 - 3,00 (m, 2H), 3,04 - 2,97 (m, 1H), 2,77 (dd, J = 13,5, 9,4 Гц, 1H), 2,38 (s, 3H), 2,19 (dd, J = 14,9, 8,5 Гц, 2H), 2,11 - 2,05 (m, 2H), 1,86 (dd, J = 14,0, 6,7 Гц, 2H), 1,45 (s, 4H), 1,20 - 1,14 (m, 2H), 0,87 (t, J = 7,1 Гц, 3H).

[183] Вариант осуществления 2. Синтез LE02-LE06 и LE08

, ,, ,, .

[184] Ссылаясь на вариант осуществления 1, соединения получали путем осуществления реакции конденсации (LE02, LE03 и LE06 необходимо подкислить после реакции конденсации) между подходящими малеамидными фрагментами и соединением A. Структуры конкретных применяемых малеамидных фрагментов представлены в таблице 2. Соединение LE02: бледно-желтое твердое вещество, ESI-MS масса/заряд: 1114,2 (M+H); соединение LE03: бледно-желтое твердое вещество, ESI-MS масса/заряд: 1007,2 (M+H); соединение LE04: слегка-желтое твердое вещество, ESI-MS масса/заряд: 1344,5 (M+H); соединение LE05: желтое твердое вещество, ESI-MS масса/заряд: 1112,3 (M+H); соединение LE06: желтое твердое вещество, ESI-MS масса/заряд: 1162,5 (M+H); соединение LE08: бледно-желтое масло, ESI-MS масса/заряд: 1719,1 (M+H).

[185] Таблица 2. Структуры малеамидных фрагментов, применяемых в синтезе LE02-LE06 и LE08

[186] Вариант осуществления 3. Синтез LE07

[187] Коммерчески доступный LE07-S (1 ммоль, 0,34 г) и соединение B (0,5 ммоль, 0,38 г) растворяли в 10 мл DMF; добавляли HATU (0,5 ммоль, 0,19 г), 0,5 мл триэтиламина и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч., добавляли 0,5 мл трифторуксусной кислоты, затем смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин., растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении и полученный неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле [хлороформ - хлороформ:метанол = 9:1 (об./об.)] с получением соли трифторуксусной кислоты и указанного в заголовке соединения (0,33 г, 0,3 ммоль) в виде бледно-желтого твердого вещества, выход: 60%, ESI-MS масса/заряд: 1105,3 (M+H). Соединение B можно синтезировать в соответствии с известным способом, описанным в WO2015146132A1.

[188] Вариант осуществления 4. Синтез LE09-LE11

, ,.

[189] Ссылаясь на способ в варианте осуществления 3, соединения получали путем осуществления реакции конденсации между соединением B и подходящими фрагментами карбоновой кислоты (коммерчески доступны) с помощью конденсирующего средства. Структуры конкретных применяемых фрагментов карбоновой кислоты продемонстрированы в таблице 3. Соединение LE09: масло от бледно-желтого до светло-желтого цвета, ESI-MS масса/заряд: 1705,9 (M+H). Соединение LE10: ESI-MS: масса/заряд: 1115,9 (M+H), ¹H-ЯМР (400 MГц, DMSO-d ₆) δ 8,66 (t, J = 6,7 Гц, 1H), 8,53 (d, J = 9,0 Гц, 1H), 8,47 (t, J = 5,2 Гц, 1H), 8,37 (t, J = 5,8 Гц, 1H), 8,30 (d, J = 8,4 Гц, 2H), 7,81 (s, 1H), 7,78 (d, J = 11,1 Гц, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,20 (dd, J = 21,9, 7,3 Гц, 5H), 7,00 (d, J = 5,3 Гц, 2H), 6,54 (s, 1H), 5,60 (dd, J = 13,7, 6,8 Гц, 1H), 5,42 (s, 2H), 5,20 (s, 2H), 5,10 (s, 2H), 4,64 (d, J = 6,3 Гц, 2H), 4,55 - 4,45 (m, 1H), 4,26 (d, J = 5,3 Гц, 2H), 4,02 (s, 2H), 3,74 (ddd, J = 31,4, 16,7, 5,6 Гц, 6H), 3,17 (dd, J = 14,3, 8,5 Гц, 2H), 3,02 (dd, J = 14,1, 4,3 Гц, 1H), 2,74 (dd, J = 13,4, 10,0 Гц, 1H), 2,38 (s, 3H), 2,23 - 2,15 (m, 2H), 2,05 ( t, J = 7,4 Гц, 2H), 1,90 - 1,80 (m, 2H), 1,46 (dd, J = 14,7, 7,3 Гц, 4H), 1,19 - 1,14 (m, 2H), 0,87 (t, J = 7,2 Гц, 3H). Соединение LE11: бледно-желтое твердое вещество, ESI-MS масса/заряд: 1141,5 (M+H).

[190] Таблица 3. Структуры фрагментов карбоновой кислоты, применяемых в синтезе LE09-LE11

[191] Вариант осуществления 5. Синтез LE23-LE24

[192] Коммерчески доступное соединение LE23-S или LE24-S (2 эквивалента) и соединение C (1 эквивалент) растворяли в подходящем количестве DMF, смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч., растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении и полученный неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле [хлороформ - хлороформ:метанол = 10:1 (об./об.)] с получением указанного в заголовке соединения в виде бледно-желтого твердого вещества. При этом соединение C можно синтезировать в соответствии с известным способом, описанным в WO2015146132A1. Соединение LE23: желтое твердое вещество, ESI-MS масса/заряд: 1090,2 (M+H); соединение LE24: желтое твердое вещество, ESI-MS масса/заряд: 1122,1 (M+H).

[193] Вариант осуществления 6. Синтез LE12

[194] Синтез промежуточного соединения 2

[195] (S)-2-Азидопропановую кислоту (10 г, 86,9 ммоль) и 4-аминобензиловый спирт (21,40 г, 173,8 ммоль) растворяли в 300 мл смешанного растворителя, состоящего из дихлорметана и метанола (объемное соотношение: 2:1), добавляли 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин (21,49 г, 86,9 ммоль), обеспечивали осуществление реакции в реакционной среде при комнатной температуре в течение 5 часов, растворитель выпаривали при пониженном давлении и затем полученный остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле [дихлорметан:этилацетат = 1:1 (об./об.)] с получением промежуточного соединения 2 (16,3 г, выход: 85%), ESI-MS масса/заряд: 221 (M+H).

[196] Синтез промежуточного соединения 3

[197] Промежуточное соединение 2 (15 г, 68,2 ммоль) и бис(п-нитрофенил)карбонат (22,82 г, 75,02 ммоль) смешивали и растворяли в 200 мл безводного N,N-диметилформамида и добавляли 25 мл триэтиламина, обеспечивали осуществление реакции в смеси при комнатной температуре в течение 2 часов. После завершения реакции исходные материалы контролировали с помощью жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии, добавляли метиламина гидрохлорид (6,91 г, 102,3 ммоль) и обеспечивали продолжение реакции в течение 1 часа. После завершения реакции большую часть растворителя удаляли путем перегонки при пониженном давлении и затем добавляли 200 мл воды и 200 мл этилацетата. После разделения фаз органическую фазу собирали, высушивали и концентрировали. Полученный неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле [дихлорметан:этилацетат = 10:1 (об./об.)] с получением промежуточного соединения 3 (18,9 г, выход: 100%), ESI-MS масса/заряд: 278 (M+H).

[198] Синтез промежуточного соединения 5

[199] Промежуточное соединение 3 (10 г, 36,1 ммоль) и параформальдегид (1,63 г, 54,2 ммоль) растворяли в 150 мл безводного дихлорметана, медленно добавляли триметилхлорсилан (6,28 г, 57,76 ммоль) и обеспечивали осуществление реакции в смеси при комнатной температуре в течение 2 часов с получением раствора неочищенного продукта, представлявшего собой промежуточное соединение 4. После отбора образца реакционной смеси ее гасили путем добавления метанола и реакцию отслеживали с помощью LC/MS. После завершения реакции реакционный раствор фильтровали и затем к фильтрату добавляли трет-бутилгликолят (9,54 г, 72,2 ммоль) и триэтиламин (10 мл, 72,2 ммоль) и обеспечивали осуществление реакции в смеси при комнатной температуре в течение 2 часов. После завершения реакции большую часть растворителя удаляли путем перегонки при пониженном давлении и полученный неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле [петролейныйэфир:этилацетат = 3:1 (об./об.)] с получением промежуточного соединения 5 (11,2 г, выход: 74%), ESI-MS масса/заряд: 422 (M+H).

[200] Синтез промежуточного соединения 6

[201] Промежуточное соединение 5 (10 г, 23,8 ммоль) растворяли в 80 мл безводного тетрагидрофурана, добавляли 80 мл воды, затем добавляли трис(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлорид (13,6 г, 47,6 ммоль) и обеспечивали осуществление реакции в смеси при комнатной температуре в течение 4 часов. После завершения реакции тетрагидрофуран удаляли путем перегонки при пониженном давлении и затем остаток экстрагировали этилацетатом. После высушивания полученной органической фазы растворитель выпаривали при пониженном давлении и полученный неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле [дихлорметан:метанол = 10:1 (об./об.)] с получением промежуточного соединения 6 (8,1 г, выход: 86%), ESI-MS масса/заряд: 396 (M+H).

[202] Синтез промежуточного соединения 8

[203] Промежуточное соединение 6 (5 г, 12,7 ммоль) растворяли в 60 мл смешанного растворителя, состоящего из дихлорметана и метанола (об./об. = 2:1), медленно добавляли 3 мл трифторуксусной кислоты и обеспечивали осуществление реакции в смеси при комнатной температуре в течение 30 минут. После завершения реакции добавляли равные объемы воды и этилацетата, органическую фазу высушивали и затем концентрировали, и полученный неочищенный продукт непосредственно применяли на следующей стадии.

[204] Неочищенный продукт, полученный на предыдущей стадии, растворяли в 50 мл безводного N,N-диметилформамида, добавляли сложный гидроксисукцинимидный эфир Fmoc-валина (8,3 г, 19,1 ммоль), триэтиламин (5 мл), обеспечивали осуществление реакции в смеси при комнатной температуре в течение 2 часов. После завершения реакции большую часть растворителя удаляли путем перегонки при пониженном давлении. Полученный неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле [дихлорметан:метанол = 10:1 (об./об.)] с получением промежуточного соединения 8 (5,4 г, выход: 64%), ESI-MS масса/заряд: 661 (M+H).

[205] Синтез промежуточного соединения 9

[206] Промежуточное соединение 8 (1 г, 1,5 ммоль) и экзатеканаметансульфонат (0,568 г, 1 ммоль) смешивали в 30 мл безводного N,N-диметилформамида и добавляли 2-(7-азабензoтриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурониягексафторфосфат (1,14 г, 3,0 ммоль), 2 мл триэтиламина, обеспечивали осуществление реакции в смеси при комнатной температуре в течение 2 ч. После завершения реакции растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении и полученный неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле [хлороформ:метанол = 10:1 (об./об.)] с получением промежуточного соединения 9 (0,94 г, выход 87%), ESI-MS масса/заряд: 1078 (M+H).

[207] Синтез соединения LE12

[208] Промежуточное соединение 9 (1 г, 0,929 ммоль) растворяли в 20 мл безводного DMF, добавляли 0,5 мл 1,8-диазабициклоундец-7-ена и обеспечивали осуществление реакции в смеси при комнатной температуре в течение 1 часа. После завершения реакции исходных материалов непосредственно добавляли сложный сукцинимидиловый эфир 6-(малеимидо)гексановой кислоты (428,5 мг, 1,39 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении и полученный неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле [хлороформ:метанол = 8:1 (об./об.)] с получением указанного в заголовке соединения (0,7 г, выход: 73%), ESI-MS масса/заряд: 1035 (M+H).

[209] Вариант осуществления 7. Синтез LE13-LE20

[210] Промежуточное соединение VI можно получить путем использования Fmoc-L-валин-L-аланина в качестве исходного материала, ссылаясь на стадии 6a и 6b в способе синтеза промежуточного соединения 3 в варианте осуществления 6, где метиламина гидрохлорид на стадии 6b заменяется соответствующим коммерчески доступным аминосоединением. Последующие стадии начинали с промежуточного соединения VI в соответствии с таким же способом, как и на стадиях 6c, 6d, 6f и 6h в варианте осуществления 6, с получением промежуточного соединения IX, подобного промежуточному соединению 9, и затем в соответствии с такими же стадиями, как и стадии 6i и 6j в варианте осуществления 6, для обработки, удаления защитной группы для аминогруппы, и затем остаток конденсировали с разными коммерчески доступными малеимидами с получением конечного продукта. Применяемые аминосоединения и структуры малеимидов представлены в таблице 4. Соединение LE13: бледно-желтое твердое вещество, ESI-MS масса/заряд: 1106,5 (M+H); соединение LE14: бледно-желтое твердое вещество, ESI-MS масса/заряд: 1141,4 (M+H); соединение LE15: грязно-белое твердое вещество, ESI-MS масса/заряд: 1121,2 (M+H); соединение LE16: бледно-желтое твердое вещество, ESI-MS масса/заряд: 1167,1 (M+H); соединение LE17: желтое твердое вещество, ESI-MS масса/заряд: 1132,3 (M+H); соединение LE18: бледно-желтое твердое вещество, ESI-MS масса/заряд: 1305,4 (M+H); соединение LE19: бледно-желтое твердое вещество, ESI-MS масса/заряд: 1307,4 (M+H); соединение LE20: бледно-желтое твердое вещество, ESI-MS масса/заряд: 1337,6 (M+H).

[211] Таблица 4. Промежуточные соединения, применяемые в синтезе LE13-LE20

, , , , , , , .

[212] Вариант осуществления 8. Синтез LE21-LE22

R’ представляет собой или .

[213] Синтез соединения DXD-1

[214] Коммерчески доступный экзатеканаметансульфонат (0,568 г, 1 ммоль) и 2-(трет-бутилдиметилсилокси)уксусную кислоту (CAS: 105459-05-0, 0,38 г, 2 ммоль) растворяли в 20 мл безводного дихлорметана, добавляли конденсирующее средство HATU (0,76 г, 2 ммоль) и 1 мл пиридина и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. После завершения реакции растворитель выпаривали до сухого состояния при пониженном давлении и полученный неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии [дихлорметан:метанол = 50:1 (об./об.)] с получением указанного в заголовке соединения DXD-1 (0,55 г, выход: 90%), ESI-MS масса/заряд: 608,1 (M+H).¹H ЯМР (400 MГц, CDCl₃) δ 7,73 (d, J = 10,5 Гц, 1H), 7,64 (s, 1H), 7,05 (d, J = 9,2 Гц, 1H), 5,80 - 5,62 (m, 2H), 5,41 - 5,14 (m, 4H), 4,29 - 4,15 (m, 2H), 4,08 - 4,03 (m, 1H), 3,27 - 3,07 (m, 2H), 2,45 (s, 3H), 2,38 - 2,28 (m, 2H), 1,96 - 1,81 (m, 2H), 1,04 (t, J = 7,4 Гц, 3H), 0,80 (s, 9H), 0,11 (s, 3H), 0,03 (s, 3H).

[215] Получение промежуточного соединения V

[216] Промежуточное соединение V можно получить, ссылаясь на способ получения соединения 4 в варианте осуществления 6, где метиламина гидрохлорид на стадии 6b заменяется соответствующим коммерчески доступным аминосоединением.

[217] Синтез LE21-LE22

[218] Промежуточное соединение V вводили в реакцию с DXD-1, затем остаток обрабатывали с помощью 10% раствора трифторуксусной кислоты/дихлорметана с получением промежуточного соединения X, и затем промежуточное соединение X вводили в реакцию согласно последующим стадиям 6e, 6g, 6i и 6j для соединения 5 в варианте осуществления 6: промежуточное соединение X подвергали реакции восстановления с получением аминосоединения, полученное аминосоединение подвергали реакции конденсации со сложным гидроксисукцинимидным эфиром Fmoc-валина и затем защитную группу Fmoc аминогруппы в полученном продукте удаляли, а полученный аминопродукт вводили в реакцию со сложным сукцинимидиловым эфиром 6-(малеимидо)гексановой кислоты с получением конечного продукта. Соединение LE21: желтое твердое вещество, ESI-MS масса/заряд: 1141,2 (M+H); соединение LE22: желтое твердое вещество, ESI-MS масса/заряд: 1106,6 (M+H).

[219] Вариант осуществления 9. Синтез соединения LE13

[220] Соединение LE13 можно получить в соответствии со следующим путем синтеза:

[221] Конкретные стадии получения были следующими.

[222] Синтез промежуточного соединения 14

[223] Коммерчески доступное промежуточное соединение 12 (267 мг, 0,8 ммоль) и параформальдегид (50 мг, 1,6 ммоль) растворяли в 20 мл безводного дихлорметана и медленно добавляли триметилхлорсилан (0,3 мл, 3,4 ммоль), обеспечивали осуществление реакции в смеси при комнатной температуре в течение 2 часов после завершения добавления. Затем отбирали образец реакционной смеси и гасили ее путем добавления метанола с отслеживанием реакции с помощью жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии. После завершения реакции реакционный раствор фильтровали и затем к фильтрату добавляли трет-бутилгликолят (211 мг, 1,6 ммоль) и 0,5 мл пемпидина и обеспечивали осуществление реакции в смеси при комнатной температуре в течение приблизительно 2 часов. После завершения реакции большую часть растворителя удаляли путем перегонки при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле [дихлорметан:метанол = 20:1 (об./об.)] с получением промежуточного соединения 14 (260 мг, выход: 68%), ESI-MS масса/заряд: 479 (M+H).

[224] Синтез промежуточного соединения 15

[225] Промежуточное соединение 14 (238 мг, 0,50 ммоль) растворяли в 6 мл смешанного растворителя, состоящего из дихлорметана и метанола (об./об. = 2:1), медленно добавляли 0,3 мл трифторуксусной кислоты и обеспечивали осуществление реакции в смеси при комнатной температуре в течение 30 минут. После завершения реакции добавляли равные объемы воды и этилацетата, органическую фазу высушивали и концентрировали и полученный неочищенный продукт непосредственно применяли на следующей стадии.

[226] Синтез промежуточного соединения 16

[227] Неочищенный продукт, полученный на предыдущей стадии, и экзатеканаметансульфонат (170 мг, 0,30 ммоль) смешивали в 5 мл безводного N,N-диметилформамида и добавляли 2-(7-азабензoтриазол-1-ил)-N,N,N’,N’-тетраметилурониягексафторфосфат (341 мг, 0,90 ммоль), 0,60 мл триэтиламина, обеспечивали осуществление реакции в смеси при комнатной температуре в течение 2 ч. После завершения реакции растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении и полученный неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле [хлороформ:метанол = 10:1 (об./об.)] с получением промежуточного соединения 16 (210 мг, 83%), ESI-MS масса/заряд: 840 (M+H).

[228] Синтез промежуточного соединения 17

[229] Промежуточное соединение 16 (100 мг, 0,12 ммоль) растворяли в 15 мл безводного тетрагидрофурана, добавляли 3 мл воды, затем добавляли 0,3 мл водного раствора триэтилфосфина, 1 моль/л, и обеспечивали осуществление реакции в смеси при комнатной температуре в течение 4 часов. Реакцию отслеживали до ее завершения, реакционный раствор перегоняли при пониженном давлении с удалением тетрагидрофурана, к оставшемуся водному раствору добавляли бикарбонат натрия для регулирования pH до нейтрального значения и затем добавляли дихлорметан для экстрагирования. Полученную органическую фазу высушивали и растворитель выпаривали при пониженном давлении, неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле [дихлорметан:метанол = 10:1 (об./об.)] с получением промежуточного соединения 17 (69 мг, выход: 71%), ESI-MS масса/заряд: 814 (M+H).

[230] Синтез LE13

[231] Промежуточное соединение 17 (120 мг, 0,15 ммоль), полученное на предыдущей стадии, и коммерчески доступный исходный материал MC-V (102 мг, 0,33 ммоль) смешивали в 40 мл дихлорметана, добавляли конденсирующее средство 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин (82 мг, 0,33 ммоль) и обеспечивали осуществление реакции в смеси при комнатной температуре в течение ночи. После завершения реакции растворитель выпаривали до сухого состояния при пониженном давлении. Полученный неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле [дихлорметан:метанол = 10:1 (об./об.)] с получением соединения LE13 (116 мг, выход: 70%), ESI-MS масса/заряд: 1106,5 (M+H).

[232] Вариант осуществления 10. Синтез соединения LE14

[233] Соединение LE14 можно получить в соответствии со следующим путем синтеза:

[234] Конкретные стадии получения были следующими.

[235] Синтез промежуточного соединения 19

[236] Коммерчески доступное промежуточное соединение 18 (300 мг, 0,8 ммоль) и параформальдегид (50 мг, 1,6 ммоль) растворяли в 20 мл безводного дихлорметана и медленно добавляли триметилхлорсилан (0,3 мл, 3,4 ммоль), обеспечивали осуществление реакции в смеси при комнатной температуре в течение 2 часов. Затем отбирали образец реакционной смеси и гасили ее путем добавления метанола с отслеживанием реакции с помощью жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии. После завершения реакции реакционный раствор фильтровали и затем к фильтрату добавляли трет-бутилгликолят (211 мг, 1,6 ммоль) и триэтиламин (0,22 мг, 1,6 ммоль) и обеспечивали осуществление реакции в смеси при комнатной температуре в течение приблизительно 2 часов. После завершения реакции большую часть растворителя удаляли путем перегонки при пониженном давлении. Полученный неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле [дихлорметан:метанол = 20:1 (об./об.)] с получением промежуточного соединения 19 (349 мг, выход 85%), ESI-MS масса/заряд: 514 (M+H), ¹H ЯМР (400 MГц, CDCl₃) δ 8,13 (s, 1H), 7,56 (d, J = 7,5 Гц, 2H), 7,35 (s, 2H), 5,14 (s, 2H), 4,91 (s, 2H), 4,25 (q, J = 7,1 Гц, 1H), 3,99 (d, J = 42,5 Гц, 2H), 3,85 (t, J = 6,2 Гц, 2H), 3,40 (dd, J = 18,5, 7,6 Гц, 2H), 2,89 (d, J = 48,6 Гц, 3H), 1,65 (d, J = 6,8 Гц, 3H), 1,46 (s, 9H).

[237] Синтез промежуточного соединения 20

[238] Промежуточное соединение 19 (257 мг, 0,50 ммоль) растворяли в 6 мл смешанного растворителя, состоящего из дихлорметана и метанола (об./об. = 2:1), медленно добавляли 0,3 мл трифторуксусной кислоты и обеспечивали осуществление реакции в смеси при комнатной температуре в течение 30 минут. После завершения реакции добавляли равные объемы воды и этилацетата, органическую фазу высушивали и концентрировали и полученный неочищенный продукт непосредственно применяли на следующей стадии.

[239] Полученный неочищенный продукт и экзатеканаметансульфонат (170 мг, 0,30 ммоль) смешивали в 5 мл безводного N,N-диметилформамида и добавляли 2-(7-азабензoтриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурониягексафторфосфат (341 мг, 0,90 ммоль), 0,60 мл триэтиламина, обеспечивали осуществление реакции в смеси при комнатной температуре в течение 2 ч. После завершения реакции растворитель удаляли путем перегонки при пониженном давлении и полученный неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле [хлороформ:метанол = 20:1 (об./об.)] с получением промежуточного соединения 20 (212 мг, выход: 81%), ESI-MS масса/заряд: 875 (M+H).¹H ЯМР (400 MГц, CDCl₃) δ 8,27 (d, J = 34,7 Гц, 1H), 7,63 - 7,35 (m, 5H), 7,21 - 7,10 (m, 1H), 5,71 - 5,48 (m, 2H), 5,24 - 4,95 (m, 3H), 4,95 - 4,72 (m, 4H), 4,45 (s, 1H), 4,33 - 3,97 (m, 3H), 3,75 (s, 2H), 3,39 - 2,99 (m, 4H), 2,76 (d, J = 15,3 Гц, 3H), 2,43 - 2,15 (m, 5H), 2,04 (s, 1H), 1,94 - 1,75 (m, 2H), 1,62 (d, J = 6,6 Гц, 3H), 1,11 - 0,89 (m, 3H).

[240] Синтез промежуточного соединения 21

[241] Промежуточное соединение 20 (77 мг, 0,09 ммоль) растворяли в 12 мл безводного тетрагидрофурана, добавляли 3 мл воды, а затем добавляли 0,3 мл водного раствора триэтилфосфина, 1 моль/л, и обеспечивали осуществление реакции в смеси при комнатной температуре в течение 4 часов. После завершения реакции тетрагидрофуран удаляли путем перегонки при пониженном давлении, к оставшемуся водному раствору добавляли бикарбонат натрия для регулирования pH до нейтрального значения и затем добавляли дихлорметан для экстрагирования. Полученную органическую фазу высушивали и растворитель выпаривали при пониженном давлении, полученный неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле [дихлорметан:метанол = 10:1 (об./об.)] с получением промежуточного соединения 21 (53 мг, выход: 69%), ESI-MS масса/заряд: 849 (M+H).¹H ЯМР (400 MГц, DMSO) δ 8,52 (s, 1H), 7,79 (d, J = 10,8 Гц, 1H), 7,67 - 7,55 (m, 2H), 7,47 - 7,21 (m, 3H), 6,51 (s, 1H), 5,60 (s, 1H), 5,52 - 5,32 (m, 2H), 5,30 - 5,11 (m, 2H), 5,11 - 4,94 (m, 2H), 4,94 - 4,74 (m, 2H), 4,02 (s, 2H), 3,81 - 3,66 (m, 2H), 3,60 - 3,35 (m, 4H), 3,24 - 3,08 (m, 2H), 2,94 (d, J = 30,8 Гц, 3H), 2,39 (s, 3H), 2,28 - 2,04 (m,2H), 2,00 - 1,73 (m, 2H), 1,22 (d, J= 6,6 Гц, 3H), 0,96 - 0,70 (m, 3H).

[242] Синтез соединения LE14

[243] Промежуточное соединение 21 (134 мг, 0,16 ммоль) и коммерчески доступный исходный материал MC-V (102 мг, 0,33 ммоль) смешивали в 40 мл дихлорметана, добавляли конденсирующее средство 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин (82 мг, 0,33 ммоль) и обеспечивали осуществление реакции в смеси при комнатной температуре в течение ночи. После завершения реакции растворитель выпаривали до сухого состояния при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле [дихлорметан:метанол = 10:1 (об./об.)] с получением соединения LE14 (137 мг, выход: 75%), ESI-MS масса/заряд: 1141,4 (M+H).¹H ЯМР (400 MГц, DMSO) δ 9,97 (s, 1H), 8,52 (s, 1H), 8,27 - 8,09 (m, 1H), 7,88 - 7,70 (m, 2H), 7,63 - 7,51 (m, 2H), 7,28 (s, 3H), 6,99 (s, 2H), 6,51 (s, 1H), 5,59 (s, 1H), 5,50 - 5,32 (m, 2H), 5,17 (s, 2H), 4,98 (s, 2H), 4,85 (d, J = 17,3 Гц, 2H), 4,43 - 4,33 (m, 1H), 4,21 - 4,12 (m, 1H), 4,03 (s, 2H), 3,74 - 3,64 (m, 2H), 3,20 - 3,03 (m, 3H), 3,02 - 2,84 (m, 4H), 2,36 (s, 3H), 2,23 - 2,09 (m, 4H), 2,01 - 1,90 (m, 1H), 1,90 - 1,78 (m, 2H), 1,55 - 1,39 (m, 4H), 1,30 (d, J = 6,7 Гц, 3H), 1,23 - 1,11 (m, 2H), 0,93 - 0,77 (m, 9H).

[244] Вариант осуществления 11. Синтез соединения LS13

[245] Ссылаясь на способ синтеза LE14 в варианте осуществления 7, после введения в реакцию SN-38 (7-этил-10-гидроксикамптотецин) с промежуточным соединением VII (R¹ представляет собой метилсульфонэтил) получали соединение LS13 путем удаления защитной группы, реакции конденсации и других стадий: ¹H ЯМР (400 MГц, DMSO) δ 9,92 (d, J = 22,4 Гц, 1H), 8,14 (s, 1H), 8,08 (d, J = 9,1 Гц, 1H), 7,81 (d, J = 8,0 Гц, 1H), 7,70 - 7,50 (m, 3H), 7,47 (d, J = 7,2 Гц, 1H), 7,34 (d, J = 7,2 Гц, 1H), 7,27 (s, 1H), 7,20 (s, 1H), 6,98 (s, 2H), 6,51 (s, 1H), 5,61 (s, 2H), 5,48 - 5,35 (m, 2H), 5,27 (s, 2H), 5,10 (d, J = 20,6 Гц, 2H), 4,36 (s, 1H), 4,21 - 4,07 (m, 1H), 3,84 (s, 2H), 3,48 (s, 2H), 3,21 - 2,92 (m, 6H), 2,25 - 2,04 (m, 2H), 2,04 - 1,78 (m, 3H), 1,55 - 1,36 (m, 4H), 1,36 - 1,10 (m, 9H), 0,95 - 0,71 (m, 10H).

[246] Вариант осуществления 12. Общий способ проведения сочетания конъюгатовлинкер-лекарственное средство с антителами

[247] Антитело к B7-H3 P2E5, антитело к клаудину 18.2 IMAB362 и антитело к HER2 трастузумаб (концентрация составляла 15 мг/мл) заменяли буфером, представляющим собой 50 мМ PB/1,0 мМ EDTA (pH 7,0), с помощью обессоливающей колонки G25 в указанном порядке. Добавляли 12 эквивалентов TECP и смесь перемешивали при 37°C в течение 2 часов для полного раскрытия межцепочечных дисульфидных связей антитела. Затем применяли фосфорную кислоту для регулирования pH раствора восстановленных антител до значения 6,0 и температуру водяной бани понижали до 25°C для проведения реакции сочетания. Конъюгат линкер-лекарственное средство, полученный в вариантах осуществления 1-11, и GGFG-Dxd соответствующим образом растворяли в DMSO, отбирали 12 эквивалентов конъюгата линкер-лекарственное средство и добавляли по каплям в раствор восстановленного антитела, DMSO добавляли до тех пор, пока конечная концентрация в растворе не составляла 10% (об./об.), смесь перемешивали и обеспечивали осуществление реакции при 25°C в течение 0,5 часа. После завершения реакции образец фильтровали с помощью мембраны с порами 0,22 мкм. Несвязанные небольшие молекулы очищали и удаляли с помощью ультрафильтрационной системы с тангенциальным потоком. Буфер представлял собой раствор 50 мМ PB/1,0 мМ EDTA (pH 6,0). После очищения добавляли сахарозу (конечная концентрация составляла 6%) и смесь хранили в холодильной установке при -20°C. Применяли способ с использованием УФ для измерения значений поглощения при 280 нм и 370 нм соответственно и рассчитывали значение DAR. Результаты представлены в таблице 5 ниже. Аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к HER2 трастузумаба представлена под SEQ ID No. 5 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к HER2 трастузумаба представлена под SEQ ID No. 6 в перечне последовательностей. Аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к B7-H3 P2E5 представлена под SEQ ID No. 7 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к B7-H3 P2E5 представлена под SEQ ID No. 8 в перечне последовательностей. Аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к клаудину 18.2 IMAB362 представлена под SEQ ID No. 1 в таблице последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к клаудину 18.2 IMAB362 представлена под SEQ ID No. 2 в перечне последовательностей.

[248] Таблица 5. Значения DAR для разныхконъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC), измеренные посредством метода с использованием УФ

[249] Эффективный вариант осуществления 1. Испытание на активность в клетке in vitro

[250] Клетки HEK293, стабильно трансфицированные с высокой экспрессией клаудина 18.2, клетки SK-BR-3 и NCI-N87 с высокой экспрессией HER2 были выбраны в качестве клеточных линий для определения активности in vitro в данном эксперименте. Клетки NCI-N87 также в высокой степени экспрессировали B7-H3. Наблюдали дозозависимый эффект разных конъюгатовантитело-лекарственное средство в отношении уничтожения клеток. Предварительно выбирали плотность засева планшетов для каждого типа клеток: 2×10³ клеток/лунка, и проводили испытание цитотоксической активности через 16-24 часа; во-вторых, проводили испытание конечной концентрации конъюгатаантитело-лекарственное средство, полученного в варианте осуществления 12, после загрузки, причем значение исходной концентрации устанавливали как 5000 нМ. Получали серию растворов с 10 значениями концентрации 5000-0,006 нМ (разбавленные в 4-10 раз), через 96 часов наблюдали за изменениями в отношении уничтожения (или подавления), проводили хемилюминесцентное окрашивание с помощью набора для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo®, после считывания данных флуоресценции рассчитывали IC₅₀. Исходя из результатов испытания активности (см. таблицу 6), все ADC демонстрировали определенную противоопухолевую активность, причем активность некоторых ADC была лучше, чем у ADC-8201.

[251] Таблица 6. Цитотоксическая активность разных ADC in vitro

[252] * Эти данные получали в соответствии с такой же экспериментальной операцией, как и в данном эффективном варианте осуществления, исходя из исходной концентрации 30 мкМ.

[253] Эффективный вариант осуществления 2. Испытание на стабильность в плазме крови in vitro

[254] В данном варианте осуществления оценивается стабильность конъюгатаантитело-лекарственное средство по варианту осуществления 12 в плазме крови человека. В частности, в этом варианте осуществления часть конъюгатов антитело-лекарственное средство по варианту осуществления 12 добавляли в плазму крови человека и помещали на водяную баню с температурой 37°C на 1, 3, 7, 14, 21, 28 дней, добавляли внутренний стандарт (в качестве вещества, представляющего собой внутренний стандарт, применяли экзатекан) и смесь экстрагировали, а затем с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии определяли количество высвобожденного лекарственного средства в свободной форме. Результаты представлены в таблице 7.

[255] Таблица 7. Оценка стабильности разных ADC в плазме крови человека

[256] Результаты в отношении стабильности в плазме крови демонстрируют, что стабильность ADC, полученных с помощью нового технического решения, не хуже, чем у ADC-8201, причем некоторые из них являются более стабильными. В то же время приведенные выше результаты испытания активности также доказывают, что значения активности некоторых из впервые полученных ADC являются лучшими, чем ADC-8201.

[257] Эффективный вариант осуществления 3. Оценка разных конъюгатов линкер-лекарственное средство

[258] Если конъюгат линкер-лекарственное средство был связан с разными антителами, универсальность конъюгата линкер-лекарственное средство отражается в образовании агрегатов, скорости высвобождения и том, происходит ли осаждение, и т.д. Хотя трастузумаб и не обуславливает образование осадка в ходе процесса сочетания с конъюгатом линкер-лекарственное средство ADC-8201 (GGFG-Dxd), среди антител, перечисленных в настоящем изобретении, антитела P2E5 и IMAB362 обуславливают образование осадка в ходе процессасочетания с GGFG-Dxd. Следовательно, P2E5, IMAB362 и трастузумаб выбирали для оценки универсальности конъюгаталинкер-лекарственное средство по настоящему изобретению в данном эксперименте, реакции сочетания проводили в соответствии со способом в варианте осуществления 12, образцы готовили согласно наивысшему значению DAR (т.е. избыточное сочетание), и результаты представлены в таблице 8.

[259] Таблица 8. Обстоятельства, касающиеся разных конъюгатов линкер-лекарственное средство при сочетании с разными антителами

[260] «/» означает, что скорость восстановления не рассчитывали.

[261] В текущем исследовании также обнаружили, что образование осадка будет происходить в том случае, если конъюгатлинкер-лекарственное средство ADC-8201 (GGFG-Dxd) будет связан с другими антителами, и относительное содержание агрегатов будет высоким, что характеризует его как не универсальным. Однако, большинство конъюгатов линкер-лекарственное средство в данном техническом решении подвергали сочетанию с разными антителами, и никакого осаждения не происходило, при этом относительное содержание агрегатов находилось в нормальном диапазоне, а это указывало на то, что конъюгаты линкер-лекарственное средство по настоящему изобретению характеризуются лучшими физическими и химическими свойствами.

[262] Эффективный вариант осуществления 4. Эксперимент в отношении ферментативного расщепления конъюгатовлинкер-лекарственное средство in vitro

[263] Конъюгаты линкер-лекарственное средство (LE14 и GGFG-Dxd) и катепсин B инкубировали в буферах с тремя разными значениями pH (5,0, 6,0, 7,0) и отбирали образцы в разные моменты времени для проведения высокоэффективной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии. Процент высвобождения лекарственного средства определяли с помощью способа с использованием внешнего стандарта (с Dxd в качестве внешнего стандарта). Результаты эксперимента (представленные в таблице 9) показывают, что GGFG-Dxd характеризуется более медленной скоростью ферментативного расщепления в применяемом диапазоне значений pH, тогда как LE14 по настоящему изобретению обеспечивает быстрое расщепление в диапазоне от pH 5,0 до pH 7,0.

[264] Таблица 9. Ферментативное расщепление LE14 и GGFG-Dxd при разных значениях pH in vitro

[265] Эффективный вариант осуществления 5. Эксперимент в отношении ферментативного расщепления ADC030 in vitro

[266] В качестве экспериментальной клеточной линии выбирали клеточную линию NCI-N87. После инкубирования образца в системе на основе катепсина B (100 мМ буфер, содержащий ацетат натрия и уксусную кислоту, 4 мМдитиотреитол, pH 5,0) при 37°C в течение 4 часов полученный образец разбавляли до разных концентраций культуральной средой, подготавливали 8 концентраций (разбавленные в 1,5-10 раз растворы) от 70 нМ до 0,003 нМ согласно концентрации SN-38, в течение 144 часов наблюдали за изменениями способности к уничтожению (подавлению) для указанной клеточной линии и проводили хемилюминесцентное окрашивание с помощью набора для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo®, после считывания данных флуоресценции рассчитывали значение IC₅₀.

[267] Образец с ферментным расщеплением, полученный путем инкубирования в системе на основе катепсина B при 37°C в течение 4 часов, подвергали воздействию подходящего количества этанола для осаждения и удаления белка, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии определяли высвобожденные низкомолекулярные соединения и в качестве эталона применяли равное количество SN-38. Через 4 часа определяли степень высвобождения, результаты показали, что степень высвобождения достигала 99%.

[268] Результаты эксперимента (представленные в таблице 10) показывают, что цитотоксическая активность ADC030 после ферментативного расщепления была почти такой же, как таковая в случае эквивалентного количества SN-38, а также показывают, что ADC030 почти полностью высвобождает SN-38 и функционирует при помощи воздействия катепсина B. Однако эндоцитоз ADC030 в лизосому может обуславливать непредсказуемые изменения, заключающиеся в не эффективном функционировании SN-38.

[269] Таблица 10. Изменения активности ADC030 в отношении уничтожения клеточной линии NCI-N87 перед ферментативным расщеплением и после него посредством системы на основе катепсина B

[270] Эффективный вариант осуществления 6. Оценивание in vivo 1

[271] Самкам «голых» мышей Balb/c возрастом 6-8 недель подкожно вводили в заднюю часть шеи 5×10⁶ клеток рака поджелудочной железы человек (Capan-1), разбавленных в 100 мкл раствора PBS. Когда средний объем опухоли достигал приблизительно 160 мм³, «голых» мышей произвольным образом разбивали на группы в соответствии с размером опухоли. 36 «голых» мышей произвольным образом разделяли на 6 групп по 6 животных в каждой группе, и группам посредством инъекции вводили в хвостовую вену следующее: 01 - группа с холостым контролем и 02 - ADC-8201 (5 мг/кг), 03 - ADC-8201 (2 мг/кг), 04 - ADC-029 (5 мг/кг), 05 - ADC-029 (2 мг/кг), 06 - ADC-030 (5 мг/кг), при этом введение производили один раз. Дважды в неделю измеряли массу тела и объем опухоли экспериментальных животных, при этом в ходе эксперимента наблюдали за жизненным статусом животных. Результаты эксперимента (представлены в таблице 11) показывают, что ADC029 обладает хорошей противоопухолевой активностью invivo. Вместе с тем, все экспериментальные мыши не умирали или не теряли массу, а это указывает на то, что ADC029 характеризуется надлежащей безопасностью.

[272] Таблица 11. Результаты эксперимента по оценке эффективности ADC in vivo

[273] Эффект 7. Оценивание in vivo2

[274] Самкам «голых» мышей Balb/c возрастом 6-8 недель подкожно вводили в правую сторону задней части шеи 1×10⁷ клеток рака желудка человека (NCI-N87), разбавленных в 100 мкл раствора PBS. Когда средний объем опухоли составлял приблизительно 200 мм³, «голых» мышей произвольным образом разбивали на группы в соответствии с размером опухоли.42 «голых» мышей произвольным образом разделяли на 7 групп по 6 животных в каждой группе, и группам посредством инъекции вводили в хвостовую вену следующее: 01 - группа с холостым контролем и 02 - ADC-8201 (2 мг/кг), 03 - ADC-8201 (1 мг/кг), 04 - ADC-029 (4 мг/кг), 05 - ADC-029 (2 мг/кг), 06 - ADC-029 (1 мг/кг), 07 - ADC-030 (4 мг/кг), причем введение производили один раз. Дважды в неделю измеряли массу тела и объем опухоли экспериментальных животных, при этом в ходе эксперимента наблюдали за жизненным статусом животных. Результаты эксперимента (представлены в таблице 12) показывают, что ADC029 обладает хорошей противоопухолевой активностью in vivo. Вместе с тем все экспериментальные мыши не умирали или не теряли массу, а это указывает на то, что ADC029 характеризуется надлежащей безопасностью.

[275] Таблица 12. Результаты эксперимента по оценке эффективности ADC in vivo

[276] Эффективный вариант осуществления 8. Оценка безопасности

[277] Самцов и самок мышей ICR разделяли соразмерно на две группы. ADC-8201 и ADC029 вводили соответственно дозу 300 мг/кг, при этом на момент введения масса тела составляла 18,6-21,8 г. Мышам осуществляли введение посредством инъекции в хвостовую вену. В течение 14 дней после введения измеряли массу тела мышей в разные моменты времени. Результаты обобщены в таблице ниже. Группам 01 и 02 вводили ADC-8201, группам 03 и 04 вводили ADC029, к группам 01 и 03 относились самцы мышей, и к группам 02 и 04 относились самки мышей. Результаты испытания (представлены в таблице 13) показывают, что масса тела мышей значительно не уменьшалась, когда доза введения ADC029 мышам достигала 300 мг/кг, а это указывает на то, что ADC характеризуется надлежащей безопасностью.

[278] Таблица 13. Оценка безопасности ADC in vivo на примере мышей

[279] Хотя конкретные варианты осуществления настоящего изобретения были описаны выше, специалисту в данной области будет понятно, что они являются всего лишь вариантами осуществления, и в эти варианты осуществления можно вносить различные изменения или модификации без отступления от принципа и сути настоящего изобретения. Следовательно, объем защиты настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Шанхай Фудань-Чжанцзян Био-Фармасьютикал Ко., Лтд.

<120> Конъюгат антитело-лекарственное средство, промежуточное соединение

для его получения, способ его получения и его применение

<130> P21415844RU

<160> 8

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 220

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность легкой цепи IMAB362

<400> 1

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 2

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность тяжелой цепи IMAB362

<400> 2

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 3

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность легкой цепи RS7

<400> 3

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 4

<211> 451

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность тяжелой цепи RS7

<400> 4

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 5

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность легкой цепи трастузумаба

<400> 5

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 6

<211> 450

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность тяжелой цепи трастузумаба

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 7

<211> 217

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность легкой цепи P2E5

<400> 7

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Asn Ser Gly Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Tyr Phe Pro Ser Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr

35 40 45

Leu Ile Tyr Asn Thr Asn Thr Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala

65 70 75 80

Gln Ala Asp Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Leu Leu Tyr Met Asp Ser

85 90 95

Gly Pro His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

130 135 140

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

145 150 155 160

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

180 185 190

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

195 200 205

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 8

<211> 449

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность тяжелой цепи P2E5

<400> 8

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Met Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Met Lys Pro Asp Gly Ser Val Lys His Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Ser Leu Asp

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Ser Tyr Asp Thr Arg Trp Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Glu Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<---

Claims

1. Конъюгат антитело-лекарственное средство, при этом общая структурная формула конъюгата антитело-лекарственное средство представляет собой Ab-(L₃-L₂-L₁-D)_m,

где Ab представляет собой антитело; антитело представляет собой антитело к HER2 трастузумаб или его вариант, антитело к В7-Н3 Р2Е5 или его вариант или антитело к клаудину 18.2 IMAB362 или его вариант; вариант антитела к HER2 трастузумаба характеризуется по меньшей мере 90% гомологией по сравнению с антителом к HER2 трастузумабом; вариант антитела к В7-Н3 Р2Е5 характеризуется по меньшей мере 90% гомологией по сравнению с антителом к В7-Н3 Р2Е5; вариант антитела к клаудину 18.2 IMAB362 характеризуется по меньшей мере 90% гомологией по сравнению с антителом к клаудину 18.2 IMAB362;

D представляет собой

m равняется 2-8;

структура L₁ является такой, как показано в формуле I, II, III или IV, а-конец L₁ соединен с цитотоксическим лекарственным средством и е-конец L₁ соединен с с-концом L₂;

где L независимо представляет собой остаток фенилаланина, остаток аланина, остаток глицина, остаток глутаминовой кислоты, остаток аспарагиновой кислоты, остаток цистеина, остаток гистидина, остаток изолейцина, остаток лейцина, остаток лизина, остаток метионина, остаток пролина, остаток серина, остаток треонина, остаток триптофана, остаток тирозина или остаток валина; p равняется 2-4;

R¹ представляет собой С₁-С₆алкил, замещенный –NR^1-1R^1-2, С₁-С₆алкил, замещенный R^1-3S(O)₂- или С₁-С₆алкил;

R^1-1, R^1-2 и R^1-3 независимо представляют собой С₁-С₆алкил;

L₂ представляет собой

где n независимо равняется 1-12, с-конец L₂ соединен с е-концом L_1, f-конец L₂ соединен с d-концом L₃;

L₃ представляет собой где b-конец L₃ соединен с Ab, d-конец L₃ соединен с f-концом L₂;

если структура L₁ является такой, как показано в формуле I, L₂ представляет собой

если структура L₁ является такой, как показано в формуле II, L₂ представляет собой

если структура L₁ является такой, как показано в формуле IV, L₂ представляет собой

2. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 1, где

аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к HER2 трастузумаба предпочтительно представлена под SEQ ID No. 5 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к HER2 трастузумаба предпочтительно представлена под SEQ ID No. 6 в перечне последовательностей; аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к В7-Н3 Р2Е5 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 7 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к В7-Н3 Р2Е5 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 8 в перечне последовательностей; аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к клаудину 18.2 IMAB362 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 1 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к клаудину 18.2 IMAB362 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 2 в перечне последовательностей; аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к Trop2 RS7 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 3 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к Trop2 RS7 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 4 в перечне последовательностей; вариант антитела к HER2 трастузумаба характеризуется по меньшей мере 95%, 98% или 99% гомологией по сравнению с антителом к HER2 трастузумабом; вариант антитела к В7-Н3 Р2Е5 характеризуется по меньшей мере 95%, 98% или 99% гомологией по сравнению с антителом к В7-Н3 Р2Е5; вариант антитела к Trop2 RS7 характеризуется по меньшей мере 90%, 95%, 98% или 99% гомологией по сравнению с антителом к Trop2 RS7; вариант антитела к клаудину 18.2 IMAB362 характеризуется по меньшей мере 90%, 95%, 98% или 99% гомологией по сравнению с антителом к клаудину 18.2 IMAB362;

и/или, если R¹ представляет собой С₁-С₆алкил, замещенный -NR^1-1R^1-2, С₁-С₆алкил представляет собой С₁-С₄алкил, предпочтительно метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил или трет-бутил, наиболее предпочтительно этил; каждый из R^1-1 и R^1-2 независимо предпочтительно представляет собой С₁-С₄алкил, более предпочтительно метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил или трет-бутил, наиболее предпочтительно метил;

и/или, если R¹ представляет собой С₁-С₆алкил, замещенный R^1-3S(O)₂-, С₁-С₆алкил представляет собой С₁-С₄алкил, предпочтительно метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил или трет-бутил, более предпочтительно этил; R^1-3предпочтительно представляет собой С₁-С₄алкил, более предпочтительно метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил или трет-бутил, наиболее предпочтительно метил;

и/или, если R¹ представляет собой С₁-С₆алкил, С₁-С₆алкил представляет собой С₁-С₄алкил, более предпочтительно метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил или трет-бутил, наиболее предпочтительно метил или этил;

и/или m равняется 4-8, предпочтительно 7-8, например 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 8,0;

и/или n предпочтительно равняется 8-12.

3. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 1 или 2, где

L представляет собой остаток валина или остаток аланина, и p предпочтительно равняется 2; (L)p более предпочтительно представляет собой где амино-конец (L)p соединен с карбонильным концом в формуле III;

и/или R¹ представляет собой С₁-С₆алкил, замещенный -NR^1-1R^1-2, С₁-С₆алкил, замещенный R^1-3S(O)₂- или С₁-С₆алкил, предпочтительно С₁-С₆алкил, замещенный -NR^1-1R^1-2, или С₁-С₆алкил, замещенный R^1-3S(O)₂-, более предпочтительно С₁-С₆алкил, замещенный R^1-3S(O)₂-; если R¹ представляет собой С₁-С₆алкил, С₁-С₆алкил предпочтительно представляет собой метил или этил; при этом С₁-С₆алкил, замещенный R^1-3S(O)₂-, предпочтительно представляет собой С₁-С₆алкил, замещенный -NR^1-1R^1-2, предпочтительно представляет собой предпочтительно представляет собой или

и/или L₃ представляет собой

и/или, если структура L₁ является такой, как показано в формуле I, L₂ представляет собой L₃ предпочтительно представляет собой

и/или, если структура L₁ является такой, как показано в формуле II, L₃ предпочтительно представляет собой

и/или, если структура L₁ является такой, как показано в формуле III, L₂ представляет собой предпочтительно более предпочтительно еще более предпочтительно L₃ предпочтительно представляет собой

и/или, если структура L₁ является такой, как показано в формуле IV, L₂ представляет собой L₃ предпочтительно представляет собой

4. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 1, где D представляет собой цитотоксическое лекарственное средство

m равняется 2-8;

структура L₁ является такой, как показано в формуле I, II, III или IV,

L₂ представляет собой

или n независимо равняется 8-12;

L₃ представляет собой

L независимо представляет собой остаток валина или остаток аланина; p равняется от 2 до 4;

R¹ представляет собой С₁-С₆алкил, замещенный -NR^1-1R^1-2, С₁-С₆алкил, замещенный R^1-3S(O)₂- или С₁-С₆алкил;

каждый из R^1-1, R^1-2 и R^1-3 независимо представляет собой С₁С₆алкил;

где аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к HER2 трастузумаба предпочтительно представлена под SEQ ID No. 5 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к HER2 трастузумаба предпочтительно представлена под SEQ ID No. 6 в перечне последовательностей; аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к В7-Н3 Р2Е5 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 7 в перечне последовательностей и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к В7-Н3 Р2Е5 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 8 в перечне последовательностей; аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к клаудину 18.2 IMAB362 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 1 в перечне последовательностей и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к клаудину 18.2 IMAB362 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 2 в перечне последовательностей.

5. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-4, где D представляет собой m равняется 7-8;

структура L₁ является такой, как показано в формуле I или III,

если структура L₁ является такой, как показано в формуле I, L₂ представляет собой или n независимо равняется 8-12;

если структура L₁ является такой, как показано в формуле III, L₂ представляет собой или n независимо равняется 8-12;

L₃ представляет собой

R¹ представляет собой C₁-С₄алкил, замещенный -NR^1-1R^1-2, C₁-С₄алкил, замещенный R^1-3S(O)₂-, или С₁-С₄алкил; R^1-1, R^1-2 и R^1-3 независимо представляют собой С₁-С₄алкил;

аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к HER2 трастузумаба предпочтительно представлена под SEQ ID No. 5 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к HER2 трастузумаба предпочтительно представлена под SEQ ID No. 6 в перечне последовательностей; аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к В7-Н3 Р2Е5 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 7 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к В7-Н3 Р2Е5 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 8 в перечне последовательностей; аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к клаудину 18.2 IMAB362 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 1 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к клаудину 18.2 IMAB362 предпочтительно представлена под SEQ ID No. 2 в перечне последовательностей.

6. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 1, где Ab представляет собой антитело; антитело представляет собой антитело к HER2 трастузумаб или его вариант, антитело к В7-Н3 Р2Е5 или его вариант или антитело к клаудину 18.2 IMAB362 или его вариант; вариант антитела к HER2 трастузумаба характеризуется по меньшей мере 90% гомологией по сравнению с антителом к HER2 трастузумабом; вариант антитела к В7-Н3 Р2Е5 характеризуется по меньшей мере 90% гомологией по сравнению с антителом к В7-Н3 Р2Е5; вариант антитела к клаудину 18.2 IMAB362 характеризуется по меньшей мере 90% гомологией по сравнению с антителом к клаудину 18.2 IMAB362;

D представляет собой

L₁ представляет собой где L представляет собой остаток валина или остаток аланина, p равняется 2, (L)p предпочтительно представляет собой R¹ представляет собой С₁-С₆алкил, замещенный -NR^1-1R^1-2, С₁-С₆алкил, замещенный R^1-3S(O)₂-, или С₁С₆алкил, предпочтительно С₁-С₆алкил, замещенный -NR^1-1R^1-2, или С₁-С₆алкил, замещенный R^1-3S(O)₂-, более предпочтительно С₁-С₆алкил, замещенный R^1-3S(O)₂-; R^1-1, R^1-2 и R^1-3 независимо представляют собой С₁-С₄алкил, предпочтительно метил; при этом С₁-С₆алкил, замещенный -NR^1-1R^1-2, предпочтительно представляет собой С₁-С₆алкил, замещенный R^1-3S(O)₂-, предпочтительно представляет собой

L₂ представляет собой или где n предпочтительно равняется 8, L₂ предпочтительно представляет собой L₃ представляет собой

7. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 1, где конъюгат антитело-лекарственное средство представляет собой любое из соединений, представленных ниже:

где m равняется 2-8, предпочтительно 7-8, например 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8 или 8,0;

Ab представляет собой антитело к HER2 трастузумаб, антитело к В7-Н3 Р2Е5 или антитело к клаудину 18.2 IMAB362; аминокислотная последовательность легкой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 5 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 6 в перечне последовательностей; аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к В7-Н3 Р2Е5 представлена под SEQ ID No. 7 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к В7-Н3 Р2Е5 представлена под SEQ ID No. 8 в перечне последовательностей; аминокислотная последовательность легкой цепи у антитела к клаудину 18.2 IMAB362 представлена под SEQ ID No. 1 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у антитела к клаудину 18.2 представлена под SEQ ID No. 2 в перечне последовательностей.

8. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-7, где конъюгат антитело-лекарственное средство представляет собой любое из соединений, представленных ниже:

где Ab, m и R¹ являются такими, как определено в любом из пп. 1-7.

9. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 1, где конъюгат антитело-лекарственное средство представляет собой любое из соединений, представленных ниже:

или

где Ab представляет собой антитело к HER2 трастузумаб; или аминокислотная последовательность легкой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 5 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 6 в перечне последовательностей; где m равняется 2-8, предпочтительно 7-8, например 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8 или 8,0;

или конъюгат антитело-лекарственное средство представляет собой любое из соединений, представленных ниже:

где Ab представляет собой антитело к HER2 трастузумаб; или аминокислотная последовательность легкой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 5 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 6 в перечне последовательностей;

где Ab представляет собой антитело к В7-Н3 Р2Е5; или аминокислотная последовательность легкой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 7 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 8 в перечне последовательностей; где m равняется 2-8, предпочтительно 7-8, например 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8 или 8,0;

где Ab представляет собой антитело к В7-Н3 Р2Е5; или аминокислотная последовательность легкой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 7 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 8 в перечне последовательностей;

где Ab представляет собой антитело к клаудину 18.2 IMAB362; или аминокислотная последовательность легкой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 1 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 2 в перечне последовательностей; где m равняется 2-8, предпочтительно 7-8, например 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8 или 8,0;

где Ab представляет собой антитело к клаудину 18.2 1МАВ362; или аминокислотная последовательность легкой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 1 в перечне последовательностей, и аминокислотная последовательность тяжелой цепи у Ab представлена под SEQ ID No. 2 в перечне последовательностей.

10. Конъюгат линкер-лекарственное средство, при этом общая структурная формула конъюгата линкер-лекарственное средство представляет собой L₄-L₂-L₁-D; где L₄ представляет собой L₂, L₁ и D являются такими, как определено в любом из пп. 1-9, f-конец L₂ соединен с d-концом L₄; если L₄ представляет собой если L₁ представляет собой L₂ не представляет собой

11. Конъюгат линкер-лекарственное средство по п. 10, при этом конъюгат линкер-лекарственное средство представляет собой любое из соединений, представленных ниже:

где R¹ является таким, как определено в любом из пп. 1-9.

12. Конъюгат линкер-лекарственное средство по п. 10, где конъюгат линкер-лекарственное средство представляет собой любое из соединений, представленных ниже:

13. Способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-9, при этом способ включает следующую стадию проведения сочетания конъюгата линкер-лекарственное средство по любому из пп. 10-12 с антителом по любому из пп. 1-9.

14. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-9 и фармацевтически приемлемый носитель; при этом фармацевтическую композицию применяют для лечения рака желудка, рака молочной железы, немелкоклеточного рака легкого, рака уротелия или рака поджелудочной железы.

15. Применение конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-9 в получении лекарственного препарата для предупреждения и/или лечения рака; рак представляет собой рак желудка, рак молочной железы, немелкоклеточный рак легкого, рак уротелия или рак поджелудочной железы.

16. Соединение, представленное ниже:

где R¹ является таким, как определено в любом из пп. 1-9;

R² представляет собой -N₃, -NH₂,

17. Соединение по п. 16, при этом соединение представляет собой любое из соединений, представленных ниже: