RU2790669C1 - New leuconostoc mesenteroides dextran producer strain - Google Patents
New leuconostoc mesenteroides dextran producer strain Download PDFInfo
- Publication number
- RU2790669C1 RU2790669C1 RU2022132991A RU2022132991A RU2790669C1 RU 2790669 C1 RU2790669 C1 RU 2790669C1 RU 2022132991 A RU2022132991 A RU 2022132991A RU 2022132991 A RU2022132991 A RU 2022132991A RU 2790669 C1 RU2790669 C1 RU 2790669C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dextran
- strain
- leuconostoc mesenteroides
- new
- vkpm
- Prior art date
Links
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 title claims abstract description 51
- 241000192130 Leuconostoc mesenteroides Species 0.000 title claims abstract description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims abstract description 6
- -1 dextran polysaccharide Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 7
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 5
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 108010042194 dextransucrase Proteins 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 235000015193 tomato juice Nutrition 0.000 description 2
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 229910016876 Fe(NH4)2(SO4)2 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 241001468155 Lactobacillaceae Species 0.000 description 1
- 241000192132 Leuconostoc Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108091006629 SLC13A2 Proteins 0.000 description 1
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- IMBKASBLAKCLEM-UHFFFAOYSA-L ferrous ammonium sulfate (anhydrous) Chemical compound [NH4+].[NH4+].[Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O IMBKASBLAKCLEM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- KJLLKLRVCJAFRY-UHFFFAOYSA-N mebutizide Chemical compound ClC1=C(S(N)(=O)=O)C=C2S(=O)(=O)NC(C(C)C(C)CC)NC2=C1 KJLLKLRVCJAFRY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000003058 plasma substitute Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 235000021108 sauerkraut Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и касается штамма-продуцента декстрана.The invention relates to the field of microbiology and biotechnology and concerns a strain-producer of dextran.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION
Декстран представляет собой внеклеточный бактериальный полисахарид, для которого было найдено промышленное применение в различных областях. Dextran is an extracellular bacterial polysaccharide that has found commercial use in various fields.
Декстран - это разветвлённый полимер глюкозы, главная цепь которого состоит из молекул, связанных связью α-1,6, а боковые ветви присоединены связями α-1,3.Dextran is a branched polymer of glucose, the main chain of which consists of molecules linked by an α-1,6 bond, and the side branches are attached by α-1,3 bonds.
Декстран синтезируется из сахарозы уксуснокислыми бактериями, в частности Leuconostoc mesenteroides и Streptococcus mutans.Dextran is synthesized from sucrose by acetic acid bacteria, in particular Leuconostoc mesenteroides and Streptococcus mutans .
Декстран представляет собой бактериальный полисахарид, который используется в качестве лекарственного средства, особенно в качестве расширителя объема плазмы крови. Декстран нашел промышленное применение в пищевой, фармацевтической и химической промышленности в качестве вспомогательного вещества, эмульгатора, химического носителя и стабилизатора (AK Goulas, et al., Synthesis of isomaltooligosaccharides and oligodextrans by the combined use of dextransucrase and dextranas \\ Enzyme and Microbial Technology, V. 35, Issue 4. - 2004. - P. 327-338).Dextran is a bacterial polysaccharide that is used as a drug, especially as a plasma expander. Dextran has found industrial use in the food, pharmaceutical, and chemical industries as an excipient, emulsifier, chemical carrier, and stabilizer (AK Goulas, et al., Synthesis of isomaltooligosaccharides and oligodextrans by the combined use of dextransucrase and dextranas \\ Enzyme and Microbial Technology, V. 35, Issue 4. - 2004. - P. 327-338).
Декстран является биосовместимым, нетоксичным и неиммуногенным биологическим веществом, поэтому представляет собой интерес для использования в наноразмерных системах доставки лекарственных средств (Huang G, Huang H. Application of dextran as nanoscale drug carriers. Nanomedicine (Lond). - 2018 Dec. - 13(24):3149-3158).Dextran is a biocompatible, non-toxic and non-immunogenic biological substance, therefore it is of interest for use in nanoscale drug delivery systems (Huang G, Huang H. Application of dextran as nanoscale drug carriers. Nanomedicine (Lond). - 2018 Dec. - 13(24 ):3149-3158).
Было обнаружено, что декстран оказывает иммуностимулирующее действие за счет введения фосфатных групп. Выяснилось, что экспрессия CD86 на клетках CD8α-CD11c- и CD8α-CD11c+ усиливалась фосфорилированным декстраном. Уровни экспрессии мРНК гамма-интерферона и интерлейкина-10 на мышиных спленоцитах также повышались при стимуляции (Sato T, et al., Dextran from Leuconostoc mesenteroides augments immunostimulatory effects by the introduction of phosphate groups. J Food Prot.- 2004 Aug.- 67(8):1719-24).Dextran has been found to have an immunostimulatory effect through the introduction of phosphate groups. It turned out that CD86 expression on CD8α-CD11c- and CD8α-CD11c+ cells was enhanced by phosphorylated dextran. Interferon-gamma and interleukin-10 mRNA expression levels on mouse splenocytes also increased upon stimulation (Sato T, et al., Dextran from Leuconostoc mesenteroides augments immunostimulatory effects by the introduction of phosphate groups. J Food Prot.- 2004 Aug.- 67( 8):1719-24).
Известен штамм Vickersia anguisorpha продуцент декстрана, депонированный под номером NCIMB 42196 также описан способ получения декстрана путем культивирования Vickersia anguisorpha и очистки декстрана из культуральной жидкости (CN106460021, 22.02.2017).A known strain of Vickersia anguisorpha is a dextran producer deposited under the number NCIMB 42196. A method for obtaining dextran by cultivating Vickersia anguisorpha and purifying dextran from the culture liquid is also described (CN106460021, 22.02.2017).
Наиболее близким аналогом изобретения является штамм Leuconostoc mesenteroides BD1710, который способен синтезировать примерно 32 г/л декстрана. (Han J, et al., Dextran synthesized by Leuconostoc mesenteroides BD1710 in tomato juice supplemented with sucrose. Carbohydr Polym.- 2014 Nov 4.- 112:556-62).The closest analogue of the invention is a strainLeuconostoc mesenteroides BD1710, which is able to synthesize approximately 32 g/l of dextran. (Han J, et al., Dextran synthesized by Leuconostoc mesenteroides BD1710 in tomato juice supplemented with sucrose. Carbohydr Polym.- 2014 Nov 4.- 112:556-62).
Описан высокопродуктивный штамм Leuconostoc mesenteroides DRP105, выделенный из сока китайской квашеной капусты. Исследователи выявили, что штамм Leuconostoc mesenteroides DRP105 содержит ген декстрансукразы (dsr), участвующий в производстве декстрана (Du R, et al., Functional Identification of the Dextransucrase Gene of Leuconostoc mesenteroides DRP105. Int J Mol Sci.- 2020 Sep 9.- 21(18):6596).A highly productive Leuconostoc mesenteroides DRP105 strain isolated from Chinese sauerkraut juice is described. The researchers found that the Leuconostoc mesenteroides DRP105 strain contains the dextransucrase (dsr) gene involved in the production of dextran (Du R, et al., Functional Identification of the Dextransucrase Gene of Leuconostoc mesenteroides DRP105. Int J Mol Sci.- 2020 Sep 9.-21 (18):6596).
Также известен штамм L. mesenteroides CMG713, выделенный из винограда Vitis vinifera L. - продуцент высокомолекулярного декстрана, который можно гидролизовать до различных фракций с различной молекулярной массой, что позволяет его широко использовать в соответствии с потребностями различных отраслей промышленности (Sarwat F et al., Production & characterization of a unique dextran from an indigenous Leuconostoc mesenteroides CMG713. Int J Biol Sci.- 2008.- 4(6):379-86).Also known strainL. mesenteroides CMG713 isolated from grapesVitis vinifera L. - producer of high molecular weight dextran, which can be hydrolyzed to various fractions with different molecular weight, which allows it to be widely used in accordance with the needs of various industries (Sarwat F et al., Production & characterization of a unique dextran from an indigenous Leuconostoc mesenteroides CMG713. Int J Biol Sci.- 2008.- 4(6):379-86).
Цель настоящего изобретения - получение нового штамма микроорганизма, превосходящего по уровню накопления декстрана известные ранее штаммы.The purpose of the present invention is to obtain a new strain of a microorganism that is superior in terms of dextran accumulation to previously known strains.
Техническим результатом заявленного изобретения является увеличение продуктивности нового штамма-продуцента декстрана, сокращение времени культивирования, снижение количества примеси в субстанции, высокая биохимическая активность и повышенная устойчивость нового штамма к неблагоприятным факторам, в том числе, при хранении и культивировании.The technical result of the claimed invention is to increase the productivity of the new dextran-producing strain, reduce the cultivation time, reduce the amount of impurities in the substance, high biochemical activity and increased resistance of the new strain to adverse factors, including during storage and cultivation.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION
Для повышения секреции декстрана родительский штамм, который был выбран из коллекционных образцов АО «Биохимик», подвергался процессу индуцированного мутагенеза путем воздействия на него ультрафиолета при низких температурах. To increase the secretion of dextran, the parental strain, which was selected from the collection samples of JSC "Biochemist", was subjected to the process of induced mutagenesis by exposure to ultraviolet light at low temperatures.
Полученный новый высокопродуктивный штамм, который получил внутреннее наименование ВХ-98, был идентифицирован по макро- и микроморфологическим признакам, а родовая принадлежность была подтверждена секвенированием гена 16S рДНК.The resulting new highly productive strain, which received the internal name VX-98, was identified by macro- and micromorphological features, and the genus was confirmed by sequencing the 16S rDNA gene.
По результатам анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм ВХ-98 оказался наиболее близок к виду Leuconostoc mesenteroides. According to the results of the analysis of the sequences of the variable regions of the genes encoding 16S rRNA, the tested strain VX-98 was the closest to the species Leuconostoc mesenteroides.
Продуктивность нового штамма определялась гравиметрическим методом путем двойного осаждения нативного декстрана из ферментационной массы 96 % раствором этилового спирта.The productivity of the new strain was determined gravimetrically by double precipitation of native dextran from the fermentation mass with 96% ethanol solution.
Полученный новый штамм Leuconostoc mesenteroides депонирован в Национальный Биоресурсный Центр Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» под номером ВКПМ В-14022.The resulting new strain of Leuconostoc mesenteroides was deposited with the National Bioresource Center All-Russian Collection of Industrial Microorganisms of the National Research Center "Kurchatov Institute" under the number VKPM V-14022.
Таким образом, одним из вариантов настоящего изобретения является штамм продуцент декстрана Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-14022. Другим вариантом настоящего изобретения является применение штамма Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-14022 для получения декстрана. Еще одним из вариантов настоящего изобретения является способ получения полисахарида декстрана, который заключается в том, что осуществляют культивирование штамма Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-14022 и выделение декстрана из ферментационной среды (Фиг.1).Thus, one of the variants of the present invention is the dextran producer strain Leuconostoc mesenteroides VKPM B-14022. Another variant of the present invention is the use of a strain of Leuconostoc mesenteroides VKPM B-14022 for the production of dextran. Another option of the present invention is a method for producing dextran polysaccharide, which consists in culturing a strain of Leuconostoc mesenteroides VKPM B-14022 and isolating dextran from a fermentation medium (Figure 1).
ТЕРМИНЫ и ОПРЕДЕЛЕНИЯTerms and Definitions
Ниже приведены термины, которые могут использоваться при описании настоящего изобретения. Если не указано иное, все технические и специальные термины, использованные в описании, имеют общепринятое в данной области техники значение.The following are terms that may be used in describing the present invention. Unless otherwise indicated, all technical and technical terms used in the description have the meaning generally accepted in the art.
Термин «биомасса» в контексте настоящего изобретения относится к совокупной массе клеток Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-14022, отделенных в процессе центрифугирования от супернатанта культуральной жидкости, полученной в результате культивирования, в том числе, в качалочных колбах или биореакторах (например, при культивировании батарейным способом).The term "biomass" in the context of the present invention refers to the total mass of Leuconostoc mesenteroides VKPM B-14022 cells separated during centrifugation from the supernatant of the culture liquid obtained as a result of cultivation, including in shake flasks or bioreactors (for example, when culturing with a battery method ).
Термин «культуральная жидкость» в контексте настоящего изобретения означает газожидкостную питательную (или ферментационную) среду, в которую в процессе глубинного культивирования микроорганизмы выделяют продукты метаболизма (в т.ч. вторичные метаболиты). The term "culture liquid" in the context of the present invention means a gas-liquid nutrient (or fermentation) medium into which, during submerged cultivation, microorganisms excrete metabolic products (including secondary metabolites).
Термин «биореактор» в контексте настоящего изобретения относится к сосуду или устройству, в котором осуществляются процесс глубинного культивирования микроорганизмов для наработки целевого продукта.The term "bioreactor" in the context of the present invention refers to a vessel or device in which the process of submerged cultivation of microorganisms is carried out to produce the target product.
Термин «продуктивность штамма» в контексте настоящего изобретения относится к количеству полученного декстрана, рассчитанному на единицу объема культуральной жидкости, при глубинном культивировании штамма Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-14022 в условиях биореактора, выраженному в граммах декстрана на литр культуральной жидкости.The term "strain productivity" in the context of the present invention refers to the amount of dextran obtained, calculated per unit volume of culture fluid, during deep cultivation of the strain Leuconostoc mesenteroides VKPM B-14022 under bioreactor conditions, expressed in grams of dextran per liter of culture fluid.
При использовании в описании термина «примерно», «приблизительно», «около» следует считать, что он характеризует плюс минус десять процентов от указанной величины.When used in the description of the term "about", "approximately", "about" it should be considered that it characterizes plus or minus ten percent of the specified value.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано посредством Фиг. 1. The present invention is further illustrated by FIG. 1.
На Фиг. 1 изображены основные этапы получения декстрана из культуры штамма Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-14022On FIG. 1 shows the main stages of obtaining dextran from a culture of the strain Leuconostoc mesenteroides VKPM B-14022
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDISCLOSURE OF THE INVENTION
Согласно настоящему изобретению предложен новый штамм продуцент декстрана - штамм Leuconostoc mesenteroides депонирован в Национальный Биоресурсный Центр Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» под номером ВКПМ В-14022.According to the present invention, a new dextran-producing strain, the Leuconostoc mesenteroides strain, was deposited with the National Bioresource Center All-Russian Collection of Industrial Microorganisms of the National Research Center "Kurchatov Institute" under the number VKPM V-14022.
Культурально-морфологические признаки: При поверхностном культивировании на агаризованной среде колонии на 3 сутки культивирования - слизистые, гладкие округлые, выпуклые, прозрачные, диаметром 4-6 мм. Cultural and morphological characteristics : During surface cultivation on an agar medium, colonies on the 3rd day of cultivation are mucous, smooth, rounded, convex, transparent, with a diameter of 4-6 mm.
Для хранения и приготовления посевного материала используется среда следующего состава, г/л: сахароза - 100,0-160,0; агар-агар - 10,0-30,0; соль Мора (Fe(NH4)2(SO4)2) - 0,005-0,020; пептон - 0,1-0,5; ПАБК (пара-аминобензойная кислота) - 0,01-0,07; NH4C1 - 0,1-1,0; NaC1 - 0,01-0,20; MgSO4⋅7H2O - 0,1-0,7; КН3РО4 - 1,0-8,0; Na2HPO4 - 1,0-5,0; CaCl2 - 0,01-0,05; дрожжевой экстракт - 0,01-0,10; pH среды - 5,5 - 7,2; Т - 23-30°С, аэробные условия.For storage and preparation of inoculum, the medium of the following composition is used, g/l: sucrose - 100.0-160.0; agar-agar - 10.0-30.0; Mohr's salt (Fe(NH 4 ) 2 (SO 4 ) 2 ) - 0.005-0.020; peptone - 0.1-0.5; PABA (para-aminobenzoic acid) - 0.01-0.07; NH 4 C1 - 0.1-1.0; NaC1 - 0.01-0.20; MgSO 4 ⋅ 7H 2 O - 0.1-0.7; KN 3 RO 4 - 1.0-8.0; Na 2 HPO 4 - 1.0-5.0; CaCl 2 - 0.01-0.05; yeast extract - 0.01-0.10; medium pH - 5.5 - 7.2; T - 23-30°C, aerobic conditions.
ПРИМЕРЫEXAMPLES
Изобретение поясняется следующими иллюстративными примерами, которые не ограничивают заявленный объем охраны.The invention is illustrated by the following illustrative examples, which do not limit the claimed scope of protection.
Пример 1. Получение нового высокопродуктивного штамма-продуцента декстрана. Example 1. Obtaining a new highly productive strain-producer of dextran.
Путем многоступенчатой селекции с применением мутагенных факторов и направленных методов отбора модификантов родительского штамма-продуцента декстрана был получен новый высокопродуктивный штамм ВХ-98 - продуцент декстрана. By means of multi-stage selection with the use of mutagenic factors and directed methods of selection of modifiers of the parent strain-producer of dextran, a new highly productive strain VKh-98, a producer of dextran, was obtained.
Для этого проводили воздействие УФ с длиной волны 250,0 нм (лампа Mineralight) водной суспензии клеток родительского штамма, размещенного на расстоянии 55 см от лампы, в течение 20 минут при температуре 0°C. Полученному штамму был присвоен внутренний номер ВХ-98.To do this, exposure to UV with a wavelength of 250.0 nm (Mineralight lamp) was carried out with an aqueous suspension of cells of the parent strain, placed at a distance of 55 cm from the lamp, for 20 minutes at a temperature of 0°C. The resulting strain was assigned the internal number BX-98.
Пример 2. Идентификация штамма ВХ-98 до вида с помощью анализа 16s РНК. Example 2 Identification of strain BX-98 to species by 16s RNA analysis.
Выделение ДНК штамма ВХ-98 для ПЦР проводили по стандартной методике (PCR Protocols. A Guide to methods and applications. Innis M, Gelfand D., Sninsky J.p.14-15).Isolation of DNA strain BX-98 for PCR was carried out according to the standard method (PCR Protocols. A Guide to methods and applications. Innis M, Gelfand D., Sninsky J.p.14-15).
Для секвенирования использовались консервативные праймеры для наработки 16S rDNA:For sequencing, conservative primers were used to generate 16S rDNA:
8f - AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG8f - AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG
926r - CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT926r - CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT
Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе АЕ3000 с режимами реакции:Sequencing was performed on an AE3000 automatic sequencer with reaction modes:
1. 95°С - 3мин.1. 95°C - 3 min.
2. 35 циклов2. 35 cycles
95°С - 30 сек.95°C - 30 sec.
57°С - 30 сек.57°C - 30 sec.
72°С - 1 мин. 30 сек. 72°C - 1 min. 30 sec.
3. 72°С - 5мин3. 72°C - 5min
Для анализа секвенированных последовательностей использовали специализированные филогенетические компьютерные программы. Для стабильности воспроизведения результатов проводили не менее трех повторов ПЦР-реакций.For the analysis of sequenced sequences, specialized phylogenetic computer programs were used. For the stability of reproducing the results, at least three repetitions of PCR reactions were performed.
Далее проводили электрофорез ПЦР исследуемых образцов в 1,0% агарозном геле, при напряженности электрического поля 5 В/см.Next, PCR electrophoresis of the studied samples was carried out in 1.0% agarose gel, at an electric field strength of 5 V/cm.
Первичный скрининг по базе данных GenBank показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующим систематическим группам: Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Lactobacillaceae; Leuconostoc.Primary screening in the GenBank database showed that the studied strain belongs to the following systematic groups: Bacteria; Firmicutes; bacilli; Lactobacillaceae; Leuconostoc .
Последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий, доступными из базы данных GenBank.The sequences were aligned with the corresponding sequences of the closest bacterial species available from the GenBank database.
Обработку секвенированных последовательностей проводили при помощи биоинформатического программного обеспечения, находящегося в открытом доступе - программы Blast (Basic Local Alignment Search Tool), предназначенной в т.ч. для определения степени филогенетической близости живых организмов.Processing of the sequenced sequences was carried out using bioinformatics software that is in the public domain - the Blast program (Basic Local Alignment Search Tool), designed incl. to determine the degree of phylogenetic proximity of living organisms.
По результатам анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм ВХ-98 оказался наиболее близок к виду Leuconostoc mesenteroides. According to the results of the analysis of the sequences of the variable regions of the genes encoding 16S rRNA, the tested strain VX-98 was the closest to the species Leuconostoc mesenteroides.
Пример 3. Методика культивирования. Example 3. Method of cultivation.
Проводили подготовку посевного материала путем посева культуры Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-14022 на чашках Петри. Для этого агаризованную среду засевали исходной посевной культурой, и выдерживали в термостате от 3 до 7 суток, при температуре 23-30°С. The seed material was prepared by seeding the Leuconostoc mesenteroides VKPM B-14022 culture on Petri dishes. To do this, the agar medium was seeded with the original seed culture, and kept in a thermostat for 3 to 7 days, at a temperature of 23-30°C.
Далее проводили наработку культуры в колбах в жидкой среде при 20-30°С в течение 24-60 часов в термостатируемом орбитальном шейкере при 200-300 об/мин. Next, the culture was processed in flasks in a liquid medium at 20–30°C for 24–60 hours in a thermostatically controlled orbital shaker at 200–300 rpm.
Далее проводили наработку посевной культуры в ферментере объемом 15/100 л, для этого проводили засев ферментера путем внесения посевной культуры в количестве 5-15% от объема среды в ферментере, при непрерывной подаче стерильного воздуха во время процесса культивирования при перемешивании в течении 60-150 часов.Next, the seed culture was worked up in a fermenter with a volume of 15/100 l, for this, the fermenter was seeded by introducing the seed culture in an amount of 5-15% of the volume of the medium in the fermenter, with a continuous supply of sterile air during the cultivation process with stirring for 60-150 hours.
Контроль содержания декстрана проводили гравиметрическим методом после двойного осаждения 96% раствором этанола. The dextran content was controlled gravimetrically after double precipitation with 96% ethanol solution.
При максимальном накоплении декстрана на 3-6 сутки процесс культивирования прекращали.With the maximum accumulation of dextran for 3-6 days, the cultivation process was stopped.
Пример 4. Определение содержания декстрана в культуральной жидкости. Example 4. Determination of the content of dextran in the culture liquid.
Содержание декстрана определяли гравиметрическим методом путем осаждения нативного декстрана из ферментационной массы 96 % раствором этилового спирта и высушивании осадка в сушильном шкафу при температуре (100-130°С) до постоянной массы.The content of dextran was determined gravimetrically by precipitating native dextran from the fermentation mass with 96% ethanol solution and drying the precipitate in an oven at a temperature (100–130°C) to constant weight.
Полученные данные представлены в таблице 1.The data obtained are presented in table 1.
70,3
69,267.7
70.3
69.2
79,9
80,677.8
79.9
80.6
Согласно литературным данным продуктивность известного штамма Leuconostoc mesenteroides BD1710 составляла не более 32,15 г/л (Han J, et al., Dextran synthesized by Leuconostoc mesenteroides BD1710 in tomato juice supplemented with sucrose. Carbohydr Polym.- 2014 Nov 4.- 112:556-62). А продуктивность штамма Leuconostoc mesenteroides DRP105 не превышала 25 г/л (Du R, et al., Functional Identification of the Dextransucrase Gene of Leuconostoc mesenteroides DRP105. Int J Mol Sci.- 2020 Sep 9.- 21(18):6596).According to the literature data, the productivity of the known strainLeuconostoc mesenteroides BD1710was no more than 32.15 g/l (Han J, et al., Dextran synthesized by Leuconostoc mesenteroides BD1710 in tomato juice supplemented with sucrose. Carbohydr Polym.- 2014 Nov 4.- 112:556-62). And the productivity of the strainLeuconostoc mesenteroides DRP105did not exceed 25 g/l (Du R, et al., Functional Identification of the Dextransucrase Gene ofLeuconostoc mesenteroides DRP105. Int J Mol Sci.- 2020 Sep 9.-21(18):6596).
Результаты исследований позволяют сделать вывод о том, что штамм микроорганизма по настоящему изобретению обладает высоким биотехнологическим потенциалом, значительно увеличенной продуктивностью, и может применяться для промышленного производства полисахарида декстрана.The research results allow us to conclude that the strain of the microorganism according to the present invention has a high biotechnological potential, significantly increased productivity, and can be used for the industrial production of dextran polysaccharide.
Пример 5. Методика выделения декстрана. Example 5 . Method for isolating dextran.
После завершения культивирования микроорганизма Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-14022 биомассу отделяли путем центрифугирования. Очищенную от биомассы культуральную жидкость переносили на стадию дальнейшей очистки. Далее проводили осаждение нативного декстрана из ферментационной массы 96 % раствором этилового спирта и высушивали осадок в сушильном шкафу при температуре (100-130) °С до постоянной массы.After completion of the cultivation of the microorganism Leuconostoc mesenteroides VKPM B-14022, the biomass was separated by centrifugation. The culture liquid purified from biomass was transferred to the stage of further purification. Next, the native dextran was precipitated from the fermentation mass with a 96% ethanol solution and the precipitate was dried in an oven at a temperature of (100-130) °C to a constant weight.
Claims (3)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2790669C1 true RU2790669C1 (en) | 2023-02-28 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2147316C1 (en) * | 1998-12-08 | 2000-04-10 | Суханов Юрий Семенович | Strain of bacterium leuconostoc mesenteroides - producer of protein-containing complex |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2147316C1 (en) * | 1998-12-08 | 2000-04-10 | Суханов Юрий Семенович | Strain of bacterium leuconostoc mesenteroides - producer of protein-containing complex |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JIN HAN et al, Dextran synthesized by Leuconostoc mesenteroides BD1710 in tomato juice supplemented with sucrose, Carbohydrate Polymers, 2014, Nov 4, 112, p.556-562. * |
| ХУСАИНОВ И.А. и др. Культивирование Leuconostoc mesenteroides на гидролизате биомассы кукурузы, Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий, Воронежский государственный университет инженерных технологий, Т.80, N 3 (77), 2018, с.205-211. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103695341B (en) | A kind of algin catenase secreted by marine bacteria and preparation method thereof | |
| CN106635920B (en) | Marine alternans for high yield of fucosidase and application thereof | |
| CN110195032B (en) | Myceliophthora LXL-PQ-409 and its application | |
| CN111518710B (en) | Enterobacter strain and application thereof in preparation of microbial polysaccharide | |
| RU2790669C1 (en) | New leuconostoc mesenteroides dextran producer strain | |
| KR20120119060A (en) | Streptococcus equisubsp. zooepidemicus and method for preparing hyaluronic acid using the same | |
| CN106754486B (en) | Pseudomonas for high-yield trehalose synthase and fermentation enzyme production method thereof | |
| CN111518711B (en) | Enterobacter strain and application thereof in coproduction of microbial exopolysaccharide and 2,3-butanediol | |
| CN114480177B (en) | Levan Levan-producing microbacterium capable of producing Levan with high yield and application of Levan | |
| CN105087427A (en) | Vibrio natriegens for producing agarase and application of vibrio natriegens | |
| JP7592093B2 (en) | Bacillus xiaoxiensis and its uses | |
| CN101955895B (en) | rose bacillus and application thereof in preparation of agar oligosaccharide | |
| CN113564079B (en) | Paenibacillus polymyxa for producing sucrose phosphorylase and application thereof | |
| CN104774794A (en) | Strain capable of producing D-mannose isomerase and method for producing D-mannose isomerase by using same | |
| CN105624067B (en) | Marine bacterium Pseudomonas sp SC127 and ulva sulfate rhamnosidase prepared by same | |
| JPH07246097A (en) | Method for producing trehalose | |
| RU2802575C1 (en) | Streptomyces baarnensis, a new daptomycin producer | |
| RU2801749C1 (en) | New producer strain of vancomycin amycolatopsis keratiniphila | |
| RU2788347C1 (en) | New producer strain of chloreremomycin kyibdelosporangium aridum | |
| CN113564080B (en) | Bacillus subtilis for producing sucrose phosphorylase and application thereof | |
| CN109312298B (en) | Thiamine miehei bacillus strain and application thereof | |
| CN113956999B (en) | Bacillus belgii for producing sucrose phosphorylase and application thereof | |
| CN111607548B (en) | Recombinant escherichia coli for producing mannan and application thereof | |
| CN1450162A (en) | Fungus strain for high yield chitinase and use thereof | |
| Retnaningrum et al. | Molecular identification and optimization culture conditions of amylase producing bacteria isolated from green algae in the coast side of southern sea, Yogyakarta, Indonesia |