RU2781097C1 - Pharmaceutical aerosol composition of polyvalent action - Google Patents
Pharmaceutical aerosol composition of polyvalent action Download PDFInfo
- Publication number
- RU2781097C1 RU2781097C1 RU2021113625A RU2021113625A RU2781097C1 RU 2781097 C1 RU2781097 C1 RU 2781097C1 RU 2021113625 A RU2021113625 A RU 2021113625A RU 2021113625 A RU2021113625 A RU 2021113625A RU 2781097 C1 RU2781097 C1 RU 2781097C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- aerosol
- composition
- group
- condensate
- virus
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 215
- 230000009471 action Effects 0.000 title claims abstract description 27
- 239000008249 pharmaceutical aerosol Substances 0.000 title claims abstract description 9
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 claims abstract description 253
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 85
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 66
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 claims abstract description 59
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 claims abstract description 45
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 claims abstract description 43
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims abstract description 42
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 claims abstract description 41
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims abstract description 40
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 claims abstract description 37
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- ZCGNOVWYSGBHAU-UHFFFAOYSA-N favipiravir Chemical compound NC(=O)C1=NC(F)=CNC1=O ZCGNOVWYSGBHAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 claims abstract description 27
- IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N Ribavirin Chemical compound N1=C(C(=O)N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 229950008454 favipiravir Drugs 0.000 claims abstract description 25
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 229960000329 ribavirin Drugs 0.000 claims abstract description 24
- HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N ribavirin Natural products O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1N=CN=C1 HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims abstract description 24
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims abstract description 22
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- 239000003380 propellant Substances 0.000 claims abstract description 20
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 12
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims abstract description 7
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 claims abstract description 7
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 claims abstract description 6
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 claims abstract description 6
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 229960003752 oseltamivir Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- BSYNRYMUTXBXSQ-FOQJRBATSA-N 59096-14-9 Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1[14C](O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-FOQJRBATSA-N 0.000 claims abstract description 5
- -1 chemise Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims abstract description 5
- UBCHPRBFMUDMNC-UHFFFAOYSA-N 1-(1-adamantyl)ethanamine Chemical compound C1C(C2)CC3CC2CC1(C(N)C)C3 UBCHPRBFMUDMNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108010078777 Colistin Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229960003346 colistin Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims abstract description 4
- JORAUNFTUVJTNG-BSTBCYLQSA-N n-[(2s)-4-amino-1-[[(2s,3r)-1-[[(2s)-4-amino-1-oxo-1-[[(3s,6s,9s,12s,15r,18s,21s)-6,9,18-tris(2-aminoethyl)-3-[(1r)-1-hydroxyethyl]-12,15-bis(2-methylpropyl)-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,4,7,10,13,16,19-heptazacyclotricos-21-yl]amino]butan-2-yl]amino]-3-h Chemical compound CC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)CN[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O.CCC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)CN[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O JORAUNFTUVJTNG-BSTBCYLQSA-N 0.000 claims abstract description 4
- XDJYMJULXQKGMM-UHFFFAOYSA-N polymyxin E1 Natural products CCC(C)CCCCC(=O)NC(CCN)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(CCN)C(=O)NC1CCNC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CCN)NC1=O XDJYMJULXQKGMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- KNIWPHSUTGNZST-UHFFFAOYSA-N polymyxin E2 Natural products CC(C)CCCCC(=O)NC(CCN)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(CCN)C(=O)NC1CCNC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CCN)NC1=O KNIWPHSUTGNZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229960000888 rimantadine Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 229960000707 tobramycin Drugs 0.000 claims abstract description 4
- NLVFBUXFDBBNBW-PBSUHMDJSA-N tobramycin Chemical compound N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N NLVFBUXFDBBNBW-PBSUHMDJSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims abstract description 4
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 claims abstract description 3
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 claims abstract description 3
- 102000008847 Serpin Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 108050000761 Serpin Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 101000998548 Yersinia ruckeri Alkaline proteinase inhibitor Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 239000003475 metalloproteinase inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 3
- VSZGPKBBMSAYNT-RRFJBIMHSA-N oseltamivir Chemical compound CCOC(=O)C1=C[C@@H](OC(CC)CC)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](N)C1 VSZGPKBBMSAYNT-RRFJBIMHSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 3
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims abstract description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 57
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 21
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 claims description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 11
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 6
- 238000001802 infusion Methods 0.000 claims description 6
- MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N kaempferol Natural products OC1=C(C(=O)c2cc(O)cc(O)c2O1)c3ccc(O)cc3 MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- IQPNAANSBPBGFQ-UHFFFAOYSA-N luteolin Chemical compound C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 IQPNAANSBPBGFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- LRDGATPGVJTWLJ-UHFFFAOYSA-N luteolin Natural products OC1=CC(O)=CC(C=2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C=2)=C1 LRDGATPGVJTWLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000009498 luteolin Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical class OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 4
- 239000003921 oil Substances 0.000 claims description 4
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 claims description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 3
- 244000062730 Melissa officinalis Species 0.000 claims description 3
- 235000010654 Melissa officinalis Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000006679 Mentha X verticillata Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000002899 Mentha suaveolens Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000001636 Mentha x rotundifolia Nutrition 0.000 claims description 3
- NWGKJDSIEKMTRX-AAZCQSIUSA-N Sorbitan monooleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O NWGKJDSIEKMTRX-AAZCQSIUSA-N 0.000 claims description 3
- 241000246091 Thermopsis Species 0.000 claims description 3
- LWZFANDGMFTDAV-BURFUSLBSA-N [(2r)-2-[(2r,3r,4s)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-2-hydroxyethyl] dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O LWZFANDGMFTDAV-BURFUSLBSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 3
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 claims description 3
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 claims description 3
- 229960001716 benzalkonium Drugs 0.000 claims description 3
- CYDRXTMLKJDRQH-UHFFFAOYSA-N benzododecinium Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 CYDRXTMLKJDRQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 claims description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 3
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical class OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000011067 sorbitan monolaureate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims description 3
- CXQWRCVTCMQVQX-LSDHHAIUSA-N (+)-taxifolin Chemical compound C1([C@@H]2[C@H](C(C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)=O)O)=CC=C(O)C(O)=C1 CXQWRCVTCMQVQX-LSDHHAIUSA-N 0.000 claims description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- XCGZWJIXHMSSQC-UHFFFAOYSA-N dihydroquercetin Natural products OC1=CC2OC(=C(O)C(=O)C2C(O)=C1)c1ccc(O)c(O)c1 XCGZWJIXHMSSQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 2
- BITYAPCSNKJESK-UHFFFAOYSA-N potassiosodium Chemical class [Na].[K] BITYAPCSNKJESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- OMPJBNCRMGITSC-UHFFFAOYSA-N Benzoylperoxide Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)OOC(=O)C1=CC=CC=C1 OMPJBNCRMGITSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 abstract description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 29
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 abstract description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 abstract description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 abstract description 2
- 229940083538 smallpox vaccine Drugs 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 52
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 46
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 38
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 30
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 30
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 23
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 22
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 21
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 20
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 20
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 description 20
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 19
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 17
- LERNTVKEWCAPOY-VOGVJGKGSA-N C[N+]1(C)[C@H]2C[C@H](C[C@@H]1[C@H]1O[C@@H]21)OC(=O)C(O)(c1cccs1)c1cccs1 Chemical compound C[N+]1(C)[C@H]2C[C@H](C[C@@H]1[C@H]1O[C@@H]21)OC(=O)C(O)(c1cccs1)c1cccs1 LERNTVKEWCAPOY-VOGVJGKGSA-N 0.000 description 14
- 229960000257 tiotropium bromide Drugs 0.000 description 14
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 13
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 10
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 10
- 241001500351 Influenzavirus A Species 0.000 description 9
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 9
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 9
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 8
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 7
- 210000004985 myeloid-derived suppressor cell Anatomy 0.000 description 7
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000001565 modulated differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 5
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 5
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 5
- NENPYTRHICXVCS-YNEHKIRRSA-N oseltamivir acid Chemical compound CCC(CC)O[C@@H]1C=C(C(O)=O)C[C@H](N)[C@H]1NC(C)=O NENPYTRHICXVCS-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 5
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 4
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 4
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 4
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 4
- 239000006184 cosolvent Substances 0.000 description 4
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N n-phenylnitramide Chemical compound [O-][N+](=O)NC1=CC=CC=C1 VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 4
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 4
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 229940123169 Caspase inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 3
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 3
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 238000010267 two-fold dilution method Methods 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- 108010078049 Interferon alpha-2 Proteins 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- DEOKFPFLXFNAON-UHFFFAOYSA-N N-α-Benzoyl-DL-arginine 4-nitroanilide hydrochloride Chemical compound Cl.C=1C=C([N+]([O-])=O)C=CC=1NC(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C1=CC=CC=C1 DEOKFPFLXFNAON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 238000012387 aerosolization Methods 0.000 description 2
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- NBVXSUQYWXRMNV-UHFFFAOYSA-N fluoromethane Chemical group FC NBVXSUQYWXRMNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 2
- 229960003507 interferon alfa-2b Drugs 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 2
- 238000012379 oncolytic virotherapy Methods 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- MIXCUJKCXRNYFM-UHFFFAOYSA-M sodium;diiodomethanesulfonate;n-propyl-n-[2-(2,4,6-trichlorophenoxy)ethyl]imidazole-1-carboxamide Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)C(I)I.C1=CN=CN1C(=O)N(CCC)CCOC1=C(Cl)C=C(Cl)C=C1Cl MIXCUJKCXRNYFM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 2
- JEQVYCMCKPVWJE-BSOSBYQFSA-N (2s)-n-[(2s)-2-acetamido-4-methylpentanoyl]-2-[[5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methylpentanamide Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(CCCN=C(N)N)C=O JEQVYCMCKPVWJE-BSOSBYQFSA-N 0.000 description 1
- GGXRLUDNGFFUKI-ORGXJRBJSA-N (4s)-4-[[(2s)-2-acetamido-3-carboxypropanoyl]amino]-5-[[(2s)-1-[[(2s)-3-carboxy-1-(4-nitroanilino)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 GGXRLUDNGFFUKI-ORGXJRBJSA-N 0.000 description 1
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IDVQGNMSSHPZSJ-UHFFFAOYSA-N 7-methylsulfanyl-3-nitro-6h-[1,2,4]triazolo[5,1-c][1,2,4]triazin-4-one Chemical compound N1=C([N+]([O-])=O)C(=O)N2NC(SC)=NC2=N1 IDVQGNMSSHPZSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010370 Adenoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 102100036514 Amyloid-beta A4 precursor protein-binding family A member 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710093637 Amyloid-beta A4 precursor protein-binding family A member 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000711443 Bovine coronavirus Species 0.000 description 1
- 206010006448 Bronchiolitis Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 101000793880 Homo sapiens Caspase-3 Proteins 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 208000010359 Newcastle Disease Diseases 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 229920004891 Triton X-101 Polymers 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000012084 abdominal surgery Methods 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 108010038407 acetyl-aspartyl-glutamyl-valyl-aspartic acid p-nitroanilide Proteins 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- OFCNXPDARWKPPY-UHFFFAOYSA-N allopurinol Chemical compound OC1=NC=NC2=C1C=NN2 OFCNXPDARWKPPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003459 allopurinol Drugs 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000002485 combustion reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- XUFQPHANEAPEMJ-UHFFFAOYSA-N famotidine Chemical compound NC(N)=NC1=NC(CSCCC(N)=NS(N)(=O)=O)=CS1 XUFQPHANEAPEMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001596 famotidine Drugs 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 1
- 238000002664 inhalation therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000001525 mentha piperita l. herb oil Substances 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000002663 nebulization Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 235000019477 peppermint oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 1
- 238000001050 pharmacotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N tetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000003211 trypan blue cell staining Methods 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 229960001028 zanamivir Drugs 0.000 description 1
- ARAIBEBZBOPLMB-UFGQHTETSA-N zanamivir Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)C=C(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO ARAIBEBZBOPLMB-UFGQHTETSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Описание изобретенияDescription of the invention
Настоящее изобретение относится к медицине. Изобретение раскрывает аэрозольный состав для применения в аэрозольных устройствах различных типов, в которых применяется принудительный способ распыления состава для получения аэрозоля с различным размером частиц в зависимости от целей и мишени воздействия генерируемым аэрозолем. The present invention relates to medicine. The invention discloses an aerosol composition for use in various types of aerosol devices that use a forced method of spraying the composition to obtain an aerosol with different particle sizes depending on the purpose and target of exposure to the generated aerosol.
Известны аэрозольные системы, в которых движущей выталкивающей силой служит фторкарбоновый пропеллент 134А или 227, находящийся под давлением в устройстве с клапаном [Терехова, 2014]. Для таких пропеллентных устройств на основе ингибиторов протеаз разработаны фармацевтические аэрозольные составы, в которую входят три компонента пропеллентной систем, а именно: пропеллент, этанол и глицерин, на долю которых приходится более 95% аэрозольного состава, так называемая система «Модулит», [Ganderton et ah 2002; Патенты РФ №2657523; №2711080]. Пропеллентные аэрозольные системы на основе ингибиторов протеаз могут быть приготовлены только определенным способом, чтобы добиться гомогенного смешивания с компонентами пропеллентной выталкивающей системы [Патент РФ №2657523, патент ЕАПО 034991]. Разработанные пропеллентные системы не могут использоваться в аэрозольных устройствах, таких как эжекторные, ультразвуковые небулайзеры, портативные системы «мягкого облака» и мембранного типа Micro-Air «Омрон» (устройство «смэш»), которые могут работать на растворах, не содержащих пропеллентов.Aerosol systems are known in which the driving force is fluorocarbon propellant 134A or 227, which is under pressure in a device with a valve [Terekhova, 2014]. For such propellant devices based on protease inhibitors, pharmaceutical aerosol compositions have been developed, which include three components of the propellant systems, namely: propellant, ethanol and glycerin, which account for more than 95% of the aerosol composition, the so-called Modulit system, [Ganderton et ah 2002; Patents of the Russian Federation No. 2657523; No. 2711080]. Propellant aerosol systems based on protease inhibitors can only be prepared in a certain way to achieve homogeneous mixing with the components of the propellant ejection system [RF Patent No. 2657523, EAPO patent 034991]. The developed propellant systems cannot be used in aerosol devices, such as ejector, ultrasonic nebulizers, portable "soft cloud" systems and membrane type Micro-Air "Omron" ("smash" device), which can work on solutions that do not contain propellants.
Не разработаны аэрозольные составы на основе водных растворов ингибиторов протеаз, которые скомбинированы с активными веществами, воздействующими на различные мишени патологического процесса при заболеваниях, вызванных вирусами, бактериями, токсинами и другими патологическим агентами, а также, разнообразными формами воспаления и нарушения метаболизма. Не было известно, будут ли такие смеси разнородных фармацевтических веществ смешиваться с ингибиторами протеаз и сохранять свои биологические и фармакологические свойства после распыления и перехода в аэрозольную фазу и при этом не подавлять и не денатурировать друг друга. В настоящем изобретении впервые созданы аэрозольные составы поливалентного фармацевтического действия на основе водного раствора ингибиторов протеаз и их комбинаций с включением в состав дополнительных фармацевтических активных веществ, подавляющих воспаление,Aerosol compositions based on aqueous solutions of protease inhibitors have not been developed, which are combined with active substances that act on various targets of the pathological process in diseases caused by viruses, bacteria, toxins and other pathological agents, as well as various forms of inflammation and metabolic disorders. It was not known whether such mixtures of dissimilar pharmaceutical substances would be miscible with protease inhibitors and retain their biological and pharmacological properties after nebulization and aerosolization without inhibiting or denaturing each other. In the present invention, for the first time, aerosol compositions of polyvalent pharmaceutical action based on an aqueous solution of protease inhibitors and their combinations with the inclusion of additional pharmaceutical active substances that suppress inflammation,
образование оксидных радикалов и патогенез заболевания, а также добавлением веществ, блокирующих размножение вирусов и бактерий, для использования разработанных поливалентных составов в аэрозольных устройствах непропеллентного типа.the formation of oxide radicals and the pathogenesis of the disease, as well as the addition of substances that block the reproduction of viruses and bacteria, for the use of the developed polyvalent compositions in non-propellant aerosol devices.
Технический результат разработанных аэрозольных составов обусловлен решением следующих задач. (1) Разработанные мультикомпонентные аэрозольные составы делают более удобным процесс лечения, когда при одной процедуре пациент получает комбинированный курс нескольких лекарств неинвазивного типа поливалентного фармакологического действия. (2) Разработанный поливалентный аэрозольный состав повышает фармакологический эффект используемых активных веществ, так как оказывают биологическое действие на несколько мишеней в патогенезе заболевания при более низких концентрациях, чем при индивидуальном применении отдельного вещества и позволяет получить фармакологический эффект в тех случаях, когда при применении индивидуального лекарства такой эффект не возможен. (3) Использование комбинаций активных веществ в аэрозольном составе позволяет снизить лечебные дозы, что, в свою очередь, понижает риск возникновения токсичности от побочных нежелательных реакций их действия на организм. (4) Применение двух и более активных веществ, направленных на различные мишени патогенеза болезни и различные этапы размножения вирусов, бактерий и простейших патогенных организмов, снизит риск возникновения мутантных форм этиологического агента с повышенной вирулентностью для организма и предотвращает возникновение вторичных осложнений. (5) Разработанные аэрозольные составы на водной (непропеллентной) основе дают новые возможности для их универсального медицинского использования против заболеваний с различной локализацией патологического процесса, включая кожные покровы, респираторный тракт, кишечник, органы зрения, органы слуха и т.п., когда пропеллентные аэрозольные составы применяться не могут из-за побочной токсичности пропеллентов для слизистых оболочек организма. (6) Разработка аэрозольных составов на водной основе позволяет исключить побочную токсичность, обусловленную высокой концентрацией компонентов, таких как пропеллент и этанол, необходимых для работы выталкивающей системы, используемой в аэрозольных составах на основе фторкарбоновых пропеллентов. (7) На основе ингибиторов протеаз разработан состав, содержащий активный инфекционный вирус или его субвирусные компоненты (внутренний нуклеокапсид, наружная вирусная мембрана, белковые комплексы и др.), отличающийся повышенной стабильностью и фармакологической активностью вируса и его компонентов, что создает новую лекарственную форму комбинированного лекарства в зависимости от локализации очага при лечении опухолей с помощью ингибиторов протеаз и вирусов, так называемой онколитической виротерапии, а также для приготовления, стабилизации и применения белок содержащих вакцин при инфекционных болезнях различной этиологии и локализации.The technical result of the developed aerosol compositions is due to the solution of the following problems. (1) The developed multicomponent aerosol formulations make the treatment process more convenient when, in one procedure, the patient receives a combined course of several drugs of a non-invasive type with a polyvalent pharmacological action. (2) The developed polyvalent aerosol composition increases the pharmacological effect of the active substances used, since they have a biological effect on several targets in the pathogenesis of the disease at lower concentrations than with the individual use of a single substance and allows obtaining a pharmacological effect in cases where, when using an individual drug such an effect is not possible. (3) The use of combinations of active substances in an aerosol composition allows to reduce therapeutic doses, which, in turn, reduces the risk of toxicity from adverse side effects of their action on the body. (4) The use of two or more active substances aimed at different targets of the pathogenesis of the disease and different stages of reproduction of viruses, bacteria and protozoan pathogenic organisms will reduce the risk of mutant forms of the etiological agent with increased virulence for the body and prevent the occurrence of secondary complications. (5) The developed water-based (non-propellant) aerosol compositions provide new opportunities for their universal medical use against diseases with different localization of the pathological process, including the skin, respiratory tract, intestines, organs of vision, organs of hearing, etc., when propellant aerosol formulations cannot be used due to adverse toxicity of propellants to the mucous membranes of the body. (6) The development of water-based aerosol formulations eliminates the side toxicity associated with the high concentration of components such as propellant and ethanol required to operate the propulsion system used in aerosol formulations based on fluorocarbon propellants. (7) On the basis of protease inhibitors, a composition has been developed containing an active infectious virus or its subviral components (internal nucleocapsid, outer viral membrane, protein complexes, etc.), which is characterized by increased stability and pharmacological activity of the virus and its components, which creates a new dosage form of the combined drugs depending on the localization of the focus in the treatment of tumors with protease and virus inhibitors, the so-called oncolytic virotherapy, as well as for the preparation, stabilization and use of protein-containing vaccines for infectious diseases of various etiologies and localizations.
Известны многочисленные аэрозольные системы (устройства), в которых движущей выталкивающей силой служит механическое (эжекторные) или ультразвуковое возбуждение состава и дополнительное мембранное распыление (типа "smash") в ряде устройств. К таким устройствам относятся стационарные небулайзеры эжекторного или ультразвукового типов, и ручные ингаляторы механического типа «респимат» или ручные ингаляторы мембранного типа Micro-Air «Омрон» [Терехова, 2013]. При открытии клапана и при запуске аэрозольного возбуждения происходит выталкивание аэрозольного состава и его распыление, так называемое генерирование аэрозоля. Для всех без исключения типов устройств применим разработанный аэрозольный состав поливалентного патогенетического фармакологического действия. Более того, аэрозольный состав на основе ингибиторов протеаз в комбинации с противовирусными, противомикробными и противовоспалительными веществами применим для обширного круга болезней, в которых имеет место нарушение протеазного и окислительного баланса в сочетании с вирусной и бактериальной инфекцией при таких заболеваниях, как грипп, коронавирусная инфекция, респираторно-синцитиальньш бронхиолит, муковисцидоз, респираторная инфекция вирусами парагриппа, хроническая обструктивная болезнь легких, астма, герпетическая болезнь кожных покровов и глаз, кожные и глазные деструктивные поражения при аденовирусной и бактериальной инфекции, деструктивного воспаления, возникающего при полостных хирургических операциях, образование опухоли и ее метастазов и т.д. Помимо прямого патогенетического и лечебного действия, ингибиторы протеаз будут оказывать стабилизирующее фармакологическое действие на активные фармацевтические вещества белковой природы, такие как противовирусные антитела, антитела против цитокинов, цельно вирионные и субъединичные вирусные и бактериальные вакцины и др., поскольку могут инактивировать протеазы, способные инактивировать вирус и разрушать белковые активные вещества как в аэрозольном составе, так и в реципиентом организме и особенно в местах их первоначального контакта с организмом.Numerous aerosol systems (devices) are known, in which the driving force is mechanical (ejector) or ultrasonic excitation of the composition and additional membrane spraying (of the "smash" type) in a number of devices. Such devices include stationary nebulizers of the ejector or ultrasonic types, and manual inhalers of the mechanical type "Respimat" or manual inhalers of the membrane type Micro-Air "Omron" [Terekhova, 2013]. When the valve is opened and the aerosol excitation is started, the aerosol composition is ejected and atomized, the so-called aerosol generation. For all types of devices without exception, the developed aerosol composition of polyvalent pathogenetic pharmacological action is applicable. Moreover, an aerosol formulation based on protease inhibitors in combination with antiviral, antimicrobial and anti-inflammatory agents is applicable to a wide range of diseases in which protease and oxidative imbalance occurs in combination with viral and bacterial infection in diseases such as influenza, coronavirus infection, respiratory syncytial bronchiolitis, cystic fibrosis, respiratory infection with parainfluenza viruses, chronic obstructive pulmonary disease, asthma, herpetic disease of the skin and eyes, skin and eye destructive lesions in adenovirus and bacterial infections, destructive inflammation that occurs during abdominal surgery, tumor formation and its metastases, etc. In addition to direct pathogenetic and therapeutic action, protease inhibitors will have a stabilizing pharmacological effect on active pharmaceutical substances of a protein nature, such as antiviral antibodies, antibodies against cytokines, whole virion and subunit viral and bacterial vaccines, etc., since they can inactivate proteases that can inactivate the virus and degrade protein actives both in the aerosol formulation and in the recipient organism, and especially at their initial contact with the organism.
Вместе с тем, в изобретении для более эффективного растворения и предотвращения агрегации и взаимной инактивации используемых активных веществ, часть из которых может иметь пониженную растворимость в водном растворе, а также для их стабилизации в аэрозольном составе, в аэрозольном облаке и очаге действия (органе, ткани, отдельных типах клеток и т.п.) предлагается дополнительное включение добавок в аэрозольный состав буферных солевых растворов сорастворителей и поверхностно-активных веществ из группы сурфактантов или органических растворителей, таких как твин-20, твин-80, спан-20, спан-80, нонидет-Р40, тритон Х-100, тритон Х-101, бета-октилглюкозид, этанол, диметилсульфоксид, бензалкониум, этанол, глицерин и другие. Для повышения лечебных и органолептических свойств аэрозольный состав может содержать растительные экстракты, такие как, масло мяты, настой мелисы, настой термопсиса, лютеолин и др. Композиция может быть в виде раствора на водной основе, мелкодисперсной суспензии или коллоидного раствора, но преимущественно в виде раствора.At the same time, in the invention, for more effective dissolution and prevention of aggregation and mutual inactivation of the active substances used, some of which may have reduced solubility in an aqueous solution, as well as for their stabilization in an aerosol composition, in an aerosol cloud and the focus of action (organ, tissue , individual cell types, etc.), it is proposed to additionally include additives in the aerosol composition of buffer saline solutions of co-solvents and surfactants from the group of surfactants or organic solvents, such as tween-20, tween-80, span-20, span-80 , Nonidet-P40, Triton X-100, Triton X-101, beta-octylglucoside, ethanol, dimethyl sulfoxide, benzalkonium, ethanol, glycerin and others. To improve the medicinal and organoleptic properties, the aerosol composition may contain plant extracts, such as mint oil, lemon balm infusion, thermopsis infusion, luteolin, etc. The composition may be in the form of a water-based solution, fine suspension or colloidal solution, but mainly in the form of a solution .
Решение поставленных целей достигается посредством комбинированного аэрозольного состава и следующих подходов его получения.The solution of the goals set is achieved through a combined aerosol composition and the following approaches to its production.
• Фармацевтический аэрозольный состав поливалентного действия на основе ингибиторов протеаз для устройств с аэрозольным распылением непропеллентного типа, отличающийся тем, что содержит ингибитор протеаз или их комбинации, выбранных из группы апротинин, леупептин, серпин, ингибитор металлопротеаз, камостад, в водо-содержащем растворе в диапазоне рН 4,0-9,0 с концентрацией активных веществ 0,001 мкг - 100 мг на мл состава, который дополнительно содержит активные вещества с иным механизмом фармакологического или патогенетического действия или их комбинации, а именно: гидролитических ферментов, выбранных из группы трипсин, гиалуронидаза, хемаза, каспаза, противовирусных веществ, выбранных из группы ремантадин, осельтамивир, рибавирин, фавипиравир, противовирусные антитела, противомикробных веществ, выбранных из группы тобрамицин, колистин, гентамицин, тетрациклин, противовоспалительных веществ, выбранных их группы ацетилсалициловая кислота, интерферон, антитела против цитокинов, супероксиддисмутаза, вирусы и субвирусные компоненты, выбранные из группы вирусы гриппа, парамиксовирусы, тогавирусы, флавивирусы, пикорнавирусы, аденовирусы, вирусы осповакцины, коронавирусы, вирус герпеса в конечной концентрации 0,001 мкг - 100 мг на мл состава, предназначенный для генерирования аэрозоля с дисперсностью аэрозольных частиц 0,1-300 мкм.• Pharmaceutical aerosol composition of polyvalent action based on protease inhibitors for devices with non-propellant aerosol spray, characterized in that it contains a protease inhibitor or combinations thereof, selected from the group of aprotinin, leupeptin, serpin, metalloprotease inhibitor, camostad, in an aqueous solution in the range pH 4.0-9.0 with a concentration of active substances of 0.001 μg - 100 mg per ml of the composition, which additionally contains active substances with a different mechanism of pharmacological or pathogenetic action or their combination, namely: hydrolytic enzymes selected from the group of trypsin, hyaluronidase, chemase, caspase, antiviral agents selected from the group of rimantadine, oseltamivir, ribavirin, favipiravir, antiviral antibodies, antimicrobial agents selected from the group of tobramycin, colistin, gentamicin, tetracycline, anti-inflammatory agents selected from their group acetylsalicylic acid, interferon, antibodies against cytokines, superoxy ddismutase, viruses and subviral components selected from the group of influenza viruses, paramyxoviruses, togaviruses, flaviviruses, picornaviruses, adenoviruses, vaccinia viruses, coronaviruses, herpes virus at a final concentration of 0.001 μg - 100 mg per ml of the composition, designed to generate an aerosol with dispersion of aerosol particles 0.1-300 µm.
• Состав по п. 1 отличается тем, что водный раствор активного вещества дополнительно содержит поверхностно активные сорастворители, преимущественно твин-20, твин-80, спан-20, спан-80, бета-октилглюкозид, диметилсульфоксид, глицерин, этанол, полиэтилен гликоль, бензалкониум, в концентрации 0,0001% и более.• The composition according to
• Состав по п. 1 отличается тем, что содержит солевой буферный раствор преимущественно хлорид натрия, одно- и двузамещенные натриевые-калиевые соли фосфорной кислоты, соли салициловой кислоты, в концентрации 0,1 мкМ и более.• The composition according to
• Состав по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно содержит добавки растительного происхождения и растительных экстрактов, преимущественно масло мяты, настой мелисы, настой термопсиса, лютеолин, дигидрокверцитин в концентрации 0, 0001% по объему и более.• Composition according to
Разработка стабилизированных аэрозольных составов комбинированного типа, содержащих активные вещества белковой природы, созданных методами генетической инженерии, представляет быстро развивающееся направление в современной медицинской аэрозольной биотехнологии, актуальность которого особенно возрастает в эпоху возникновения новых вирусных пандемий глобального масштаба и эпидемического роста онкологических заболеваний в мире.The development of stabilized aerosol formulations of a combined type containing active substances of a protein nature, created by genetic engineering, is a rapidly developing direction in modern medical aerosol biotechnology, the relevance of which is especially increasing in the era of the emergence of new global viral pandemics and the epidemic growth of oncological diseases in the world.
Примеры реализации изобретенияExamples of the implementation of the invention
Пример 1.Example 1
Полипептидные ингибиторы протеаз медицинского назначения и их комбинации.Polypeptide inhibitors of proteases for medical purposes and combinations thereof.
Пример иллюстрирует список различных ингибиторов протеаз полипептидной природы, а также антипротеазных олигопептидов, состоящих из двух и более аминокислотных остатков, их модифицированных производных или их комбинаций, а также ингибиторы протеаз небелковой природы, которые растворяют в водно-содержащих растворах предлагаемого фармацевтического аэрозольного состава, приготовленного согласно изобретению, для использования в качестве активного компонента в аэрозольных системах непропеллентного типа. Указанные ингибиторы протеаз могут применяться у людей и животных для коррекции патологических процессов и воспаления различной этиологии и патогенеза инфекционной, иммунной, деструктивной, онкологической природы, ингибирования опухолей и ее метастазов, усиления стабильности белковых и пептидных соединений в растворах и реципиентом организме.The example illustrates a list of various polypeptide protease inhibitors, as well as anti-protease oligopeptides consisting of two or more amino acid residues, their modified derivatives or combinations thereof, as well as non-protein protease inhibitors, which are dissolved in aqueous solutions of the proposed pharmaceutical aerosol composition, prepared according to invention, for use as an active ingredient in non-propellant type aerosol systems. These protease inhibitors can be used in humans and animals to correct pathological processes and inflammation of various etiology and pathogenesis of an infectious, immune, destructive, oncological nature, inhibition of tumors and its metastases, enhance the stability of protein and peptide compounds in solutions and in the recipient organism.
Перечисленные антипротеазные ингибиторы используют в аэрозольном составе в комбинации с фармацевтическими веществами, имеющими другой механизм противовирусного и лечебного патогенетического действия. В группу дополнительных (комбинированных) фармацевтически активных веществ включены преимущественно римантадин, рибавирин, фавипиравир, занамивир, триазавирин (группа триазидов), интерферон, ацетилсалициловая кислота, аллопуринол, фамотидин, тетрациклин, лютеолин, тобрамицин, колистин, гентамицин, антитела различной специфичности, вирусы, протеазы различной специфичности и др.The listed antiprotease inhibitors are used in aerosol composition in combination with pharmaceutical substances that have a different mechanism of antiviral and therapeutic pathogenetic action. The group of additional (combined) pharmaceutically active substances includes mainly rimantadine, ribavirin, favipiravir, zanamivir, triazavirin (a group of triazides), interferon, acetylsalicylic acid, allopurinol, famotidine, tetracycline, luteolin, tobramycin, colistin, gentamicin, antibodies of various specificities, viruses, proteases of various specificity, etc.
Пример 2.Example 2
Комбинированный аэрозольный состав апротинина (ингибитор протеаз) и рибавирина (антивирусное вещество).Combined aerosol composition of aprotinin (a protease inhibitor) and ribavirin (an antiviral agent).
Готовили серию растворов, содержащих различные концентрации апротинина и рибавирина, как указано в табл. 2. Для приготовления составов использовали буферный раствор, содержащий (3,3 mM Na2HPO4/NaH2PO4 рН 7,2; 0,9 тМ KCl; 45 тМ NaCl) (ФБ/3), в который добавляли последовательно белок апротинина и вещество рибавирина до соответствующих конечный концентраций.Prepared a series of solutions containing various concentrations of aprotinin and ribavirin, as indicated in table. 2. To prepare the formulations, a buffer solution containing (3.3 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7.2; 0.9 mM KCl; 45 mM NaCl) (FB/3) was used, to which aprotinin protein and ribavirin substance were added sequentially to the corresponding final concentrations.
После приготовления состав вносили в капсулу объемом 4,0 мл для аэрозольного устройства мягкого облака («Респимат»). Далее проводили генерирование аэрозоля посредством 30 пусков. Образовавшееся аэрозольное облако собирали посредством его конденсирования в стеклянную пробирку объемом 10 мл. Сформировавшийся конденсат облака собирали посредством центрифугирования при 1500 об/мин в течении 3 мин. В результирующем конденсате определяли количественное содержание и фармакологические и биологические активности апротинина и рибавирина по их способности ингибировать трипсиновую протеазу (для апротинина) и по способности тормозить размножение вируса гриппа в культуре клеток кишечника человека СаСо-2 (для апротинина и рибавирина). Полученные результаты показаны на Фиг. №1-№5.After preparation, the composition was introduced into a 4.0 ml capsule for a soft cloud aerosol device (Respimat). Next, the aerosol was generated by 30 starts. The resulting aerosol cloud was collected by condensing it into a 10 ml glass tube. The formed cloud condensate was collected by centrifugation at 1500 rpm for 3 min. In the resulting condensate, the quantitative content and pharmacological and biological activities of aprotinin and ribavirin were determined by their ability to inhibit trypsin protease (for aprotinin) and by their ability to inhibit the reproduction of the influenza virus in CaCo-2 human intestinal cell culture (for aprotinin and ribavirin). The results obtained are shown in Fig. #1-#5.
Пример 3.Example 3
Комбинированный аэрозольный состав леупептина (ингибитор протеаз) и фавипиравира (антивирусное вещество).Combined aerosol composition of leupeptin (a protease inhibitor) and favipiravir (an antiviral agent).
Готовили серию растворов, содержащих различные концентрации леупептина и фавипиравира, как указано в табл. 3. Для приготовления составов использовали буферный раствор ФБ/3, в который добавляли последовательно белок леупептин (ингибитор протеаз) и вещество фавипиравира (антивирусное вещество) по прописи согласно таблице 3 до соответствующих конечных концентраций.Prepared a series of solutions containing various concentrations of leupeptin and favipiravir, as indicated in table. 3. For the preparation of formulations, buffer solution FB/3 was used, to which the protein leupeptin (protease inhibitor) and the substance favipiravir (antiviral substance) were added sequentially according to the prescription according to Table 3 to the corresponding final concentrations.
После смешивания компонентов аэрозольный состав вносили в капсулу объемом 4,0 мл для аэрозольного устройства мягкого облака («Респимат»). Далее проводили генерирование аэрозоля посредством 30 пусков. Образовавшееся аэрозольное облако собирали посредством его конденсирования в стеклянную пробирку объемом 10 мл. Сформировавшийся конденсат облака собирали посредством центрифугирования при 1500 об/мин в течении 3 мин. В результирующем конденсате определяли количественное содержание и фармакологические и биологические активности леупептина и фавипиравира по их способности ингибировать трипсиновую протеазу (для леупептина) и по способности тормозить размножение коронавируса (штамм KV92) в культуре клеток кишечника человека СаСо-2 (для леупептина и фавипиравира). Полученные результаты показаны на фиг. №6 и №7.After mixing the components, the aerosol composition was introduced into a 4.0 ml capsule for a soft cloud aerosol device (Respimat). Next, aerosol generation was carried out by means of 30 launches. The resulting aerosol cloud was collected by condensing it into a 10 ml glass tube. The formed cloud condensate was collected by centrifugation at 1500 rpm for 3 min. In the resulting condensate, the quantitative content and pharmacological and biological activities of leupeptin and favipiravir were determined by their ability to inhibit trypsin protease (for leupeptin) and by their ability to inhibit the reproduction of coronavirus (strain KV92) in CaCo-2 human intestinal cell culture (for leupeptin and favipiravir). The results obtained are shown in Fig. No. 6 and No. 7.
Исследование фармакологической активности аэрозоля леупептина и фавипиравира проводили в культуре клеток млекопитающих, инфицированных коронавирусом по его накоплению в культуральной жидкости в клеточной культуре кишечника человека в присутствии аэрозольного состава. Накопление вируса оценивали методом титрования по гемагглютинирующей активности с мышиными эритроцитами, что характерно для вирусов семейства коронавирусов. формирующихся под действием патогенных коронавирусов животных и человека. Данные такого тестирования приведены на фиг. №7.The study of the pharmacological activity of the aerosol of leupeptin and favipiravir was carried out in a culture of mammalian cells infected with coronavirus by its accumulation in the cultural liquid in the cell culture of the human intestine in the presence of an aerosol composition. The accumulation of the virus was assessed by titration by hemagglutination activity with mouse erythrocytes, which is typical for viruses of the coronavirus family. formed under the influence of pathogenic coronaviruses of animals and humans. Data from this test is shown in Fig. No. 7.
Пример 4.Example 4
Ингибирование размножения коронавируса аэрозольным составом, содержащим ингибиторы протеаз и антивирусные вещества и их комбинации.Inhibition of coronavirus reproduction by an aerosol composition containing protease inhibitors and antiviral substances and combinations thereof.
Аэрозольные составы ингибиторов протеаз (апротинин и леупептин) в комбинации с антивирусными веществами, а именно: фавипиравиром, рибавирином готовили на фосфатном буферном растворе ФБ/3, содержащем 0,05% ДМСО. Далее производили распыление в устройстве мягкого облака Респимат, собирали и осаждали аэрозольный конденсат, который добавляли в клеточную питательную среду и вносили начальную дозу коронавируса (штамм KV92), равную 0,001 ФОБ на клетку, и инкубировали при 36,5 град С в CO2-атмосферном инкубаторе. Через 48-72 часов после инкубации исследовали фармакологическое действие аэрозольного состава по уровню накопления вируса в культуральной жидкости клеток.Aerosol compositions of protease inhibitors (aprotinin and leupeptin) in combination with antiviral agents, namely: favipiravir, ribavirin were prepared in a phosphate buffer solution FB/3 containing 0.05% DMSO. Next, spraying was carried out in the Respimat soft cloud device, the aerosol condensate was collected and precipitated, which was added to the cell nutrient medium and the initial dose of coronavirus (KV92 strain) equal to 0.001 FOB per cell was introduced, and incubated at 36.5 ° C in a CO2-atmospheric incubator . 48-72 hours after incubation, the pharmacological effect of the aerosol composition was studied in terms of the level of virus accumulation in the cell culture fluid.
Для тестирования фармакологической активности аэрозоля ингибиторов протеаз и их комбинаций с веществами иного механизма действия исследовали размножение коронавируса (штамм KV92) в культуре клеток млекопитающих. Уровень подавления вируса оценивали по снижению вирусного накопления в культуральной среде, используя для этого тест вирусной гемагглютинации эритроцитов мыши методом двух-кратных разведений. Результаты показаны на фиг. 8.To test the pharmacological activity of an aerosol of protease inhibitors and their combinations with substances of a different mechanism of action, the propagation of coronavirus (strain KV92) in a mammalian cell culture was studied. The level of virus suppression was assessed by the reduction of viral accumulation in the culture medium using the mouse erythrocyte viral haemagglutination test using the 2-fold dilution method. The results are shown in FIG. eight.
Пример 5.Example 5
Фармакологическая активность комбинированного аэрозольного состава, содержащего ингибиторы протеаз, антивирусные вещества, растительное вещество.Pharmacological activity of the combined aerosol composition containing protease inhibitors, antiviral substances, plant matter.
Комбинированный аэрозольный состав, содержащий апротинин (ингибитор протеаз) 50 мкгр/мл, лютеолин (растительный экстракт, ингибитор протеаз) 10 мкгр/мл, рибавирин (антивирусное вещество) 25 мкгр/мл, детергент твини-20 (10 мкгр/мл), масло мяты 1 мкгр/мл) и глицерин 0,3%, готовили на буфере ФБ/3. Далее производили распыление в устройстве мягкого облака Респимат, собирали и осаждали аэрозольный конденсат.Фармакологическую активность полученного аэрозольного конденсата исследовали по подавлению размножения коронавируса в культуре клеток почки быка (линия MDBK), ингибированию активности трипсина.Combination aerosol formulation containing aprotinin (protease inhibitor) 50 mcg/ml, luteolin (plant extract, protease inhibitor) 10 mcg/ml, ribavirin (antiviral agent) 25 mcg/ml, tweeny-20 detergent (10 mcg/ml),
Конденсат добавляли в клеточную питательную среду и вносили начальную дозу коронавируса (штамм KV92), равную 0,001 ФОБ на клетку, и инкубировали при 36,5 град С в CO2-атмосферном инкубаторе. Через 48-72 часов после инкубации исследовали фармакологическое действие аэрозольного состава по уровню накопления вируса в культуральной жидкости клеток. Уровень подавления вируса оценивали по снижению вирусного накопления в культуральной среде, используя для этого тест вирусной гемагглютинации эритроцитов мыши методом двух-кратных разведений.The condensate was added to the cell nutrient medium and an initial dose of coronavirus (KV92 strain) equal to 0.001 FOB per cell was introduced and incubated at 36.5°C in a CO2-atmospheric incubator. 48-72 hours after incubation, the pharmacological effect of the aerosol composition was studied in terms of the level of virus accumulation in the cell culture fluid. The level of virus suppression was assessed by the reduction of viral accumulation in the culture medium using the mouse erythrocyte viral haemagglutination test using the 2-fold dilution method.
Антипротеазную активность аэрозольного конденсата тестировали по ингибированию трипсина. Для этого стандартный раствор трипсина смешивали с аэрозольным конденсатом и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. После инкубации смеси конденсата с трипсином определяли остаточную активность трипсина методом гидролитического расщепления хромогенного субстрата L-ZAPA (Z-Arg-pNA), ведущего к образованию окрашенного соединения нитроанилида (NA), которое регистрируется при длине волны 405 нм (ОП/405). Для тестирования в исследуемую смесь вносят субстрат L-ZAPA (25 мкл раствора с концентрацией 1 мг/мл), инкубируют 15 мин при 20 град. С, гидролитическую реакцию останавливают добавлением 25 мкл 1М раствора соляной кислоты и измеряют величину ОП/405, которая показывает уровень остаточного активного (не ингибированного) трипсина. Результаты показаны в таблице 4.The antiprotease activity of the aerosol condensate was tested by trypsin inhibition. To do this, a standard trypsin solution was mixed with an aerosol condensate and incubated for 30 min at room temperature. After incubation of the mixture of condensate with trypsin, the residual activity of trypsin was determined by hydrolytic cleavage of the chromogenic substrate L-ZAPA (Z-Arg-pNA), leading to the formation of a colored nitroanilide compound (NA), which is recorded at a wavelength of 405 nm (OD/405). For testing, the L-ZAPA substrate (25 µl of a solution with a concentration of 1 mg/ml) is added to the test mixture, incubated for 15 minutes at 20 deg. C, the hydrolytic reaction is stopped by adding 25 μl of 1M hydrochloric acid and the OD/405 value is measured, which indicates the level of residual active (not inhibited) trypsin. The results are shown in Table 4.
(1) Фармакологическое действие на вирус оценивали по ингибированию размножения коронавируса в культуре клеток млекопитающих. Размножение вируса определяли по титру вируса в культуральной жидкости методом агглютинации эритроцитов мыши. Обозначения: «+» - титр вируса 1/4000 и выше; «+/-» - титр вируса 1/32 и ниже (ингибирование более 10 раз).(1) The pharmacological effect on the virus was evaluated by inhibiting the reproduction of coronavirus in mammalian cell culture. The reproduction of the virus was determined by the titer of the virus in the culture liquid by the method of agglutination of mouse erythrocytes. Designations: "+" -
(2) Фармакологическое действие аэрозольного состава по ингибированию гидролитической активности протеаз. Аэрозольный конденсат тестировали методом ингибирования гидролитического расщепления хромогенного субстрата L-ZAPA (Z-Arg-pNA) трипсином, которое регистрируется по нарастанию окрашивания инкубационной смеси в случае отсутствия активных ингибиторов протеаз в аэрозольном составе. Оценку окрашивания проводят при длине волны 405 нм (ОП/405). Обозначения: «+» - эффективное расщепление субстрата исходным раствором трипсина; «-» - отсутствие регистрируемой активности трипсина в инкубационной смеси.(2) Pharmacological action of the aerosol composition to inhibit the hydrolytic activity of proteases. The aerosol condensate was tested by inhibiting the hydrolytic cleavage of the chromogenic substrate L-ZAPA (Z-Arg-pNA) by trypsin, which is registered by an increase in the coloration of the incubation mixture in the absence of active protease inhibitors in the aerosol composition. Staining is evaluated at a wavelength of 405 nm (OD/405). Designations: "+" - effective cleavage of the substrate by the initial solution of trypsin; "-" - the absence of registered trypsin activity in the incubation mixture.
Пример 6Example 6
Фармакологические свойства комбинированного аэрозольного состава, содержащего ингибитор протеаз, антивирусное вещество, сорастворительPharmacological properties of a combined aerosol composition containing a protease inhibitor, an antiviral agent, a co-solvent
Комбинированный аэрозольный состав, содержащий камостад (ингибитор протеаз) 15 мкгр/мл, осельтамивир (антивирусное вещество) 10 мкгр/мл, детергент твини-20 (2 мкгр/мл), масло мяты 0,5 мкгр/мл) и глицерин 0,3%, готовили на буфере ФБ/3. Далее производили распыление в эжекторном устройстве Бореаль, собирали и осаждали аэрозольный конденсат.Фармакологическую активность полученного аэрозольного конденсата исследовали по подавлению размножения вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) в культуре клеток кишечника человека (линия Сасо-2) и ингибированию активности трипсина.Combination aerosol formulation containing camostad (protease inhibitor) 15 mcg/ml, oseltamivir (antiviral agent) 10 mcg/ml, tweeny-20 detergent (2 mcg/ml), peppermint oil 0.5 mcg/ml) and glycerin 0.3 %, prepared in FB/3 buffer. Next, spraying was carried out in a Boreal ejector device, the aerosol condensate was collected and precipitated. The pharmacological activity of the resulting aerosol condensate was studied by suppressing the reproduction of influenza virus A/Aichi/2/68 (H3N2) in human intestinal cell culture (Caco-2 line) and inhibition of trypsin activity .
Конденсат добавляли в клеточную питательную среду и вносили начальную дозу вируса гриппа, равную 0,001 ФОБ на клетку, и инкубировали при 36,5 град С в CO2-атмосферном инкубаторе. Через 72 часа после инкубации оценивали фармакологическое действие аэрозольного состава по уровню накопления вируса в культуральной жидкости клеток. Уровень подавления вируса оценивали по снижению вирусного накопления в культуральной среде, используя для этого тест вирусной гемагглютинации эритроцитов человека группы 1(0) методом двух-кратных разведений.The condensate was added to the cell nutrient medium and an initial dose of influenza virus equal to 0.001 FOB per cell was introduced and incubated at 36.5°C in a CO2-atmospheric incubator. 72 hours after incubation, the pharmacological effect of the aerosol composition was evaluated by the level of virus accumulation in the cell culture fluid. The level of virus suppression was assessed by the reduction of viral accumulation in the culture medium using the group 1(0) human erythrocyte viral haemagglutination test using the 2-fold dilution method.
Антипротеазную активность аэрозольного конденсата тестировали по ингибированию трипсина. Для этого стандартный раствор трипсина смешивали с аэрозольным конденсатом и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. После инкубации смеси конденсата с трипсином определяли остаточную активность трипсина методом гидролитического расщепления хромогенного субстрата L-ZAPA (Z-Arg-pNA), ведущего к образованию окрашенного соединения нитроанилида (NA), которое регистрировалось при длине волны 405 нм (ОП/405). Для тестирования в исследуемую смесь вносили субстрат L-ZAPA (25 мкл раствора с концентрацией 1 мг/мл), инкубировали 15 мин при 20 град. С, гидролитическую реакцию останавливали добавлением 25 мкл 1М раствора соляной кислоты и измеряли величину ОП/405, показывающую уровень остаточного активного (не ингибированного) трипсина. Результаты показаны в таблице 5.The antiprotease activity of the aerosol condensate was tested by trypsin inhibition. To do this, a standard trypsin solution was mixed with an aerosol condensate and incubated for 30 min at room temperature. After incubation of the mixture of condensate with trypsin, the residual activity of trypsin was determined by hydrolytic cleavage of the chromogenic substrate L-ZAPA (Z-Arg-pNA), leading to the formation of a colored nitroanilide compound (NA), which was recorded at a wavelength of 405 nm (OD/405). For testing, the L-ZAPA substrate (25 μl of a solution with a concentration of 1 mg/ml) was added to the test mixture, incubated for 15 min at 20°C. C, the hydrolytic reaction was stopped by adding 25 μl of 1M hydrochloric acid solution and the OD/405 value was measured, indicating the level of residual active (not inhibited) trypsin. The results are shown in Table 5.
(1) Фармакологическое действие на вирус оценивали по ингибированию размножения коронавируса в культуре клеток млекопитающих. Размножение вируса определяли по титру вируса в культуральной жидкости методом агглютинации эритроцитов мыши. Обозначения: «+» - титр вируса 1/4000 и выше; «+/-» - титр вируса 1/32 и ниже (ингибирование более 10 раз).(1) The pharmacological effect on the virus was evaluated by inhibiting the reproduction of the coronavirus in a mammalian cell culture. The reproduction of the virus was determined by the titer of the virus in the culture liquid by the method of agglutination of mouse erythrocytes. Designations: "+" -
(2) Фармакологическое действие аэрозольного состава по ингибированию гидролитической активности протеаз. Аэрозольный конденсат тестировали методом ингибирования гидролитического расщепления хромогенного субстрата L-ZAPA (Z-Arg-pNA) трипсином, которое регистрируется по нарастанию окрашивания инкубационной смеси в случае отсутствия активных ингибиторов протеаз в аэрозольном составе. Оценку окрашивания проводят при длине волны 405 нм (ОП/405). Обозначения: «+» - эффективное расщепление субстрата исходным раствором трипсина; «-» - отсутствие регистрируемой гидролитической активности трипсина в инкубационной смеси.(2) Pharmacological action of the aerosol composition to inhibit the hydrolytic activity of proteases. The aerosol condensate was tested by inhibiting the hydrolytic cleavage of the chromogenic substrate L-ZAPA (Z-Arg-pNA) by trypsin, which is registered by an increase in the coloration of the incubation mixture in the absence of active protease inhibitors in the aerosol composition. Staining is evaluated at a wavelength of 405 nm (OD/405). Designations: "+" - effective cleavage of the substrate by the initial solution of trypsin; "-" - the absence of recorded hydrolytic activity of trypsin in the incubation mixture.
Пример 7.Example 7
Фармакологическая активность аэрозольного состава ингибитора протеаз и бактериального антибиотика.Pharmacological activity of the aerosol composition of the protease inhibitor and bacterial antibiotic.
Бактерии E.Coli (штамм НВ110; XL1) культивировали в бульоне LB в течении 2 часов. Далее полученную культуру делили на 2 части. Одну часть смешивали с конденсатом аэрозольного состава в соотношении 3:1 и продолжали инкубацию при 33 град. С в течении 2 часов, после чего измеряли оптическую плотность суспензии, что отражало рост микробов. Полученные величины оценивали следующим образом: «+» - прирост ОП на 0,5 ЕД и более; «+/-» - средний уровень прироста плотности не более 0,2 ЕД; «-» - низкий уровень отсутствие прироста. Во второй части суспензии микробов осаждали при 6000 об/мин в течении 20 мин, микробный осадок суспендировали в ФБ/3 и микробы разрушали ультразвуком (Соникатор DVE/модель GS (Германия); 3 цикла по 15 сек каждый в ледяной бане). Бактериальные гомогенаты смешивали с равным объемом аэрозольного конденсата и определяли гидролитическую активность смеси по расщеплению хромогенного субстрата L-ZAPA (Z-Arg-pNA), как описано в разделе 3. Результаты оценивали по следующей шкале:E. coli bacteria (strain HB110; XL1) were cultivated in LB broth for 2 hours. Next, the resulting culture was divided into 2 parts. One part was mixed with the condensate of the aerosol composition in a ratio of 3:1 and incubation continued at 33°C. C for 2 hours, after which the optical density of the suspension was measured, which reflected the growth of microbes. The obtained values were evaluated as follows: "+" - increase in OP by 0.5 units or more; "+/-" - the average level of density increase is not more than 0.2 U; "-" - low level - no growth. In the second part of the suspension, the microbes were precipitated at 6000 rpm for 20 min, the microbial precipitate was suspended in FB/3, and the microbes were destroyed by ultrasound (Sonicator DVE/model GS (Germany); 3 cycles of 15 sec each in an ice bath). Bacterial homogenates were mixed with an equal volume of aerosol condensate and the hydrolytic activity of the mixture was determined by the cleavage of the chromogenic substrate L-ZAPA (Z-Arg-pNA), as described in
«+» - сильная гидролитическая активность в контрольной пробе без конденсата 100%;"+" - strong hydrolytic activity in the control sample without
«+/-» - средняя активность не более 30%; «-» - слабая активность не более 10%. Полученные результаты представлены в табл. 6."+/-" - average activity is not more than 30%; "-" - weak activity no more than 10%. The results obtained are presented in table. 6.
(*) Аэрозольные составы готовили на ФБ/3 с концентрациями активных веществ: леупептин (ЛЕУ) (10 мкгр/мл), тетрациклин (ТЕТ) 20 мкгр/мл), апротинин (АПР) (30 мкгр/мл).(*) Aerosol formulations were prepared on FB/3 with concentrations of active substances: leupeptin (LEU) (10 μg/ml), tetracycline (TET) 20 μg/ml), aprotinin (APR) (30 μg/ml).
Приведенные результаты показывают, что при распылении аэрозольного состава ингибитора протеаз и бактериального антибиотика сохраняется фармакологическая активность обоих активных компонентов аэрозольного состава и не происходит взаимной инактивации активных веществ в комбинированном аэрозольном составе. Результирующий аэрозоль имеет мультивалеитное фармакологическое действие.These results show that when spraying an aerosol composition of a protease inhibitor and a bacterial antibiotic, the pharmacological activity of both active components of the aerosol composition is preserved and there is no mutual inactivation of the active substances in the combined aerosol composition. The resulting aerosol has a multivalley pharmacological action.
Пример 8.Example 8
Фармакологическая активность аэрозольного состава, содержащего ингибитор протеаз, бактериальный антибиотик и сорастворитель.Pharmacological activity of an aerosol composition containing a protease inhibitor, a bacterial antibiotic and a co-solvent.
Кишечная палочка (E.Coli) штамм НВ101, либо XL1 выращивали в бульоне LB (содержит 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl на 1 литр среды) в течение 2 часов при 33 град. С.Далее одну часть микробной суспензии смешивали с конденсатом аэрозольного состава в соотношении 3:1 и продолжали инкубацию при 33 град. С в течении 2 часов, после чего измеряли ОП суспензии, как показатель роста микробов. Вторую часть микробной суспензии осаждали при 6000 об/мин в течении 20 мин, микробный осадок суспендировали в ФП/3 и микробы разрушали ультразвуком (Соникатор DVE/модель GS (Германия); 3 цикла по 15 сек в ледяной бане). Бактериальные гомогенаты смешивали с равным объемом аэрозольного конденсата и определяли протеазную активность смеси по расщеплению хромогенного субстрата - N-а-бензоил-DL-аргинин-4-нитроанилида (БАПНА), который при расщеплении приобретает окраску, которую регистрируют по интенсивности окрашивания при длине волны 405 нм. Результаты оценивали по следующей шкале: «+» - сильная протеазная активность в контрольной пробе без конденсата, 100%; «-» - слабая активность не более 20% по сравнению в контрольной пробой. Полученные результаты представлены в таблице 7.Escherichia coli (E.Coli) strain HB101 or XL1 were grown in LB broth (contains 10 g tryptone, 5 g yeast extract, 10 g NaCl per 1 liter of medium) for 2 hours at 33°C. C. Next, one part of the microbial suspension was mixed with the condensate of the aerosol composition in a ratio of 3:1 and incubation continued at 33°C. C for 2 hours, after which the OD of the suspension was measured as an indicator of microbial growth. The second part of the microbial suspension was precipitated at 6000 rpm for 20 min, the microbial precipitate was suspended in FP/3, and the microbes were destroyed by ultrasound (Sonicator DVE/model GS (Germany); 3 cycles of 15 sec in an ice bath). Bacterial homogenates were mixed with an equal volume of aerosol condensate, and the protease activity of the mixture was determined by the cleavage of the chromogenic substrate, N-a-benzoyl-DL-arginine-4-nitroanilide (BAPN), which acquires a color upon cleavage, which is recorded by the intensity of staining at a wavelength of 405 nm. The results were evaluated according to the following scale: "+" - strong protease activity in the control sample without condensate, 100%; "-" - weak activity no more than 20% compared to the control sample. The results obtained are presented in table 7.
(*) Аэрозольные составы готовили на ФБ/3 с указанными концентрациями активных веществ: леупептин (ЛБУ) (10 мкгр/мл), гентамицин (ГЕН) 15 мкгр/мл), апротинин (АПР) (30 мкгр/мл), с добавлением следующих сорастворителей: глицерин (до конечной концентрации 5%) (смесь №1), твин-20 (до конечной концентрации 0,1%) (смесь №2), диметилсульфоксид - ДМСО (до конечной концентрации 0,05%) (смесь №3).(*) Aerosol formulations were prepared on PB/3 with the indicated concentrations of active substances: leupeptin (LBU) (10 µg/ml), gentamicin (GEN) 15 µg/ml), aprotinin (APR) (30 µg/ml), with the addition the following co-solvents: glycerin (to a final concentration of 5%) (mixture No. 1), tween-20 (to a final concentration of 0.1%) (mixture No. 2), dimethyl sulfoxide - DMSO (to a final concentration of 0.05%) (mixture No. 3).
Полученные результаты показывают совместимость различных по структуре и активности веществ друг с другом и сорастворителями, отсутствие взаимной инактивации при приготовлении аэрозольных составов и при их распылении, сохранение фармакологической активности активных веществ. Результирующий аэрозоль имеет мультивалентное фармакологическое действие.The obtained results show the compatibility of substances different in structure and activity with each other and co-solvents, the absence of mutual inactivation in the preparation of aerosol compositions and their spraying, and the preservation of the pharmacological activity of active substances. The resulting aerosol has a multivalent pharmacological action.
Пример 9.Example 9
Фармакологическая активность аэрозольного состава, содержащего ингибитор протеаз, антивирусное вещество, бактериальный антибиотик и сорастворитель.Pharmacological activity of an aerosol composition containing a protease inhibitor, an antiviral agent, a bacterial antibiotic and a co-solvent.
Готовили комбинированный аэрозольный состав по схеме, представленной в примере 12 с использованием следующих компонентов: апротинин (100 мкгр/мл), рибавирин (30 мкгр/мл), тетрациклин (20 мкгр/мл). Раствор готовили на буфере ФБ/3, содержащем 1% глицерина. Полученные составы распыляли в устройстве респимат, получали конденсаты и исследовали фармакологические свойства активных веществ. Результат представлены в таблице 8.A combined aerosol composition was prepared according to the scheme presented in example 12 using the following components: aprotinin (100 μg/ml), ribavirin (30 μg/ml), tetracycline (20 μg/ml). The solution was prepared in FB/3 buffer containing 1% glycerol. The resulting compositions were sprayed in the Respimat device, condensates were obtained, and the pharmacological properties of the active substances were studied. The result is presented in table 8.
(1) Фармакологическое действие на вирус оценивали в тесте ингибирования образования инфекционных фокусов вируса, как описано в примере 3. Обозначения: «+» - ингибирование не более 50 раз; «++» - сильное ингибирование в 100 раз и более.(1) The pharmacological effect on the virus was evaluated in the test of inhibition of the formation of infectious foci of the virus, as described in example 3. Symbols: "+" - inhibition of not more than 50 times; "++" - strong inhibition by 100 times or more.
(2) Фармакологическое действие аэрозольного состава на микробы оценивали по ингибированию роста микроба в жидкой среде, как описано в примере 11. Обозначения: «+» - полное ингибирование роста микроба в присутствии исследуемого аэрозольного конденсата; «+/-» - частичное ингибирование роста микроба до уровня оптической плотности около 0,3 и менее; «-» - отсутствие ингибирующего эффекта на рост микроба, который достигал уровня оптической плотности 1,0 и более.(2) The pharmacological effect of the aerosol composition on microbes was evaluated by the inhibition of microbial growth in a liquid medium, as described in example 11. Legend: "+" - complete inhibition of microbial growth in the presence of the test aerosol condensate; "+/-" - partial inhibition of microbial growth to an optical density level of about 0.3 or less; "-" - the absence of an inhibitory effect on the growth of the microbe, which reached the level of optical density of 1.0 or more.
(3) Защитное действие на клетки-мишени оценивали по снижению цитотоксического (деструктивного) действия парамиксовируса Сендай на монослой клеток почки обезьяны (линия VERO), используя тест клеточного окрашивания трипановым голубым. Обозначения: «++» - выраженное защитное действие, более 50% клеток сохраняют жизнеспособность; «+» - умеренное снижение количества мертвых клеток в монослое до уровня 15-50%; «+/-» - слабое снижение количества мертвых клеток в монослое на уровне 15% и менее; «-» - отсутствие защитного эффекта и практически 100% гибель клеток.(3) The protective effect on target cells was assessed by reducing the cytotoxic (destructive) effect of Sendai paramyxovirus on a monolayer of monkey kidney cells (VERO line) using a trypan blue cell staining test. Designations: "++" - a pronounced protective effect, more than 50% of the cells remain viable; "+" - a moderate decrease in the number of dead cells in the monolayer to the level of 15-50%; "+/-" - a slight decrease in the number of dead cells in the monolayer at a level of 15% or less; "-" - no protective effect and almost 100% cell death.
Результаты, представленные в таблице 8, показывают сохранение полного комплекса фармакологических свойств комбинированного аэрозольного состава после его распыления и отсутствие инактивации активных веществ фармацевтической композиции аэрозоля.The results presented in table 8 show the preservation of the full range of pharmacological properties of the combined aerosol composition after its spraying and the absence of inactivation of the active substances of the pharmaceutical aerosol composition.
Пример 10.Example 10
Стабилизация инфекционности вируса в комбинированном аэрозольном составе.Stabilization of the infectivity of the virus in a combined aerosol composition.
Готовили комбинированный аэрозольный состав, содержащий активный парамиксовирус болезни Ньюкасла (штамм LaSota), приготовленный на растворе ФБ/3, содержащем 5% глицерина. Состав инкубировали 48 часов при температуре 30 град С и помещали в аэрозольное устройство Респимат. Далее генерировали аэрозоль, получали аэрозольный конденсат, который тестировали на наличие инфекционного вируса. Инфекционность вируса определяли методом титрования инфекционных фокусов в культуре клеток почки собаки (клеточная линия МДСК) (таблица 9).Prepared combined aerosol composition containing active paramyxovirus Newcastle disease (strain LaSota), prepared on a solution of FB/3 containing 5% glycerol. The composition was incubated for 48 hours at a temperature of 30 degrees C and placed in the Respimat aerosol device. Next, an aerosol was generated, an aerosol condensate was obtained, which was tested for the presence of an infectious virus. The infectivity of the virus was determined by the method of titration of infectious foci in the culture of dog kidney cells (cell line MDSC) (table 9).
(*) Аэрозольный состав готовили на буферном растворе ФБ/3, в который вносили вирус болезни Ньюкасла (ВБН) до титра около 3-6 ×106 инфекционных вирионов в мл аэрозольного состава, глицерин до конечной концентрации 5% и активное вещество ингибитора протеаз апротинин (до концентрации 50 мкгр/мл), леупептин (до концентрации 15 мкгр/мл) либо оба ингибитора в комбинации. Полученные состав помещали в капсулу Респимат, делали 30 выпусков, собирали конденсат и инфекционность вируса определяли методом инфекционных фокусов в культуре клеток МДСК. Фокусы определяли методом иммунного окрашивания специфическими анти-НДВ антителами, как описано выше в примере 2.(*) The aerosol composition was prepared in the FB/3 buffer solution, in which the Newcastle disease virus (NDV) was added to a titer of about 3-6 × 10 6 infectious virions per ml of the aerosol composition, glycerol to a final concentration of 5%, and the active substance of the protease inhibitor aprotinin (up to a concentration of 50 µg/ml), leupeptin (up to a concentration of 15 µg/ml), or both inhibitors in combination. The resulting composition was placed in a Respimat capsule, 30 releases were made, the condensate was collected, and the infectivity of the virus was determined by the method of infectious foci in the MDSC cell culture. Foci were determined by immunostaining with specific anti-NDV antibodies as described in Example 2 above.
(**) Для определения инфекционного титра вируса готовили 10-кратные разведения аэрозольного конденсата, которые вносили в культуру клеток и через 20 часов считали количество вирусных фокусов в клеточном монослое. Количество вируса рассчитывали по числу фокусов на мл объема аэрозольного состава.(**) To determine the infectious titer of the virus, 10-fold dilutions of the aerosol condensate were prepared, which were added to the cell culture and after 20 hours the number of viral foci in the cell monolayer was counted. The amount of virus was calculated from the number of foci per ml of the volume of the aerosol formulation.
Результаты проведенного тестирования указывают на то, что включение в аэрозольный состав ингибиторов протеаз широкого антипротеазного спектра действия (апротинина и леупептина) тормозило инактивацию инфекционных вирусных частиц в аэрозольном составе.The results of the testing indicate that the inclusion of protease inhibitors with a wide antiprotease spectrum of action (aprotinin and leupeptin) into the aerosol composition inhibited the inactivation of infectious viral particles in the aerosol composition.
Пример 11.Example 11
Фармакологическое действие комбинированного аэрозольного состава по предотвращению формирования вирусных мутантов.Pharmacological action of the combined aerosol composition to prevent the formation of viral mutants.
(*) Готовили комбинированный аэрозольный состав на основе раствора ФБ/3, содержащего апротинин, осельтамивир и ацетилсалициловую кислоту согласно следующего соотношения активных веществ: концентрация осельтамивира карбоксилата (ОСТМ) и апротинина (АПР) в аэрозольном составе составляло 2 мкМ и 40 мкгр/мл, соответственно. Использованная низкая концентрация апротинина вызывала частичное торможение размножение вируса гриппа в культуре клеток легкого человека (Calu-3). Действие комбинированного аэрозольного состава проверяли в клеточной культуре инфицированной вирусом гриппа A/PR/8/34 (H1N1) со множественностью около 0,001 ФОБ на клетку. В культуру клеток вносили 2 мл питательной среды с добавлением 70 мкл конденсированного аэрозольного состава, содержащего указанные активные вещества, и инкубировали при 37 град. С. Через 48 часов среду отбирали, смешивали 1 к 10 с новой порцией среды с аэрозольным составом и инкубировали на клеточной культуре 48 часов (пассаж №2). Таким образом, повторяли 6 последовательных пассажей в клеточной культуре Calu-3. После пассажа №3 и №6 клетки окрашивали на наличие вируса с помощью антител, конъюгированных с пероксидазой, красителем ТМБ. Результаты оценивали следующим образом: (-) - отсутствие инфицированных вирусом клеток (полное ингибирование вируса). (+/-) вирусом заражено не более 10% клеток во всем монослое (частичное ингибирование вируса). (+) - все 100% клеток заражены вирусом (появление резистентных штаммов вируса, отсутствие терапевтического эффекта).(*) A combined aerosol composition was prepared based on the FB/3 solution containing aprotinin, oseltamivir and acetylsalicylic acid according to the following ratio of active substances: the concentration of oseltamivir carboxylate (OSTM) and aprotinin (APR) in the aerosol composition was 2 μM and 40 μg/ml, respectively. The low concentration of aprotinin used caused partial inhibition of influenza virus replication in human lung cell culture (Calu-3). The effect of the combined aerosol formulation was tested in a cell culture infected with influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus at a multiplicity of about 0.001 FOB per cell. 2 ml of nutrient medium was added to the cell culture with the addition of 70 μl of a condensed aerosol composition containing the indicated active substances, and incubated at 37°C. C. After 48 hours, the medium was taken, mixed 1 to 10 with a new portion of the medium with an aerosol composition, and incubated on a cell culture for 48 hours (passage No. 2). Thus, 6 consecutive passages were repeated in the Calu-3 cell culture. After passage No. 3 and No. 6, the cells were stained for the presence of the virus using antibodies conjugated with peroxidase, TMB dye. The results were evaluated as follows: (-) - absence of virus-infected cells (complete inhibition of the virus). (+/-) no more than 10% of cells in the entire monolayer are infected with the virus (partial inhibition of the virus). (+) - all 100% of the cells are infected with the virus (the appearance of resistant strains of the virus, the absence of a therapeutic effect).
Пример 12.Example 12.
Фармакологическое действие аэрозольного состава ингибитора протеаз и ацетилсалициловой кислоты (АСК).Pharmacological action of the aerosol composition of the protease inhibitor and acetylsalicylic acid (ASA).
(*) Готовили комбинированный аэрозольный состав на основе раствора ФБ/3, содержащего апротинин, АСК с соотношением активных веществ, как указано в таблице. Далее полученные составы вносили в устройство мягкого облака, распыляли аэрозоль и готовили конденсат аэрозольного облака, как описано в примере 2. Фармакологическую активность состава исследовали по ингибированию размножения вируса гриппа А в куриных эмбрионах. 9-дневные куриные эмбрионы заражали вирусом гриппа человека A/Aichi/68 введением в аллантоисную полость эмбриона около 1000 вирионов и дополнительно вводили 100 мкл двух кратных разведений конденсированного аэрозольного состава, полученного по прописи в таблице 18. Брали по 5 эмбрионов на одно разведение состава. После 36 часов инкубации эмбрионов при 37 град С отбирали аллантоисную жидкость из куриных эмбрионов и определяли количество синтезированного инфекционного вируса методом инфекционных фокусов в культуре клеток МДСК по количеству вирусных частиц на мл аллантоисной жидкости. В качестве контроля брали эмбрионы, которые заражали вирусом гриппа без введения аэрозольного состава. Определяли концентрацию активных веществ в аэрозольном конденсате, при которой отмечалось 100-кратное снижение титра вируса по сравнению с контролем (эффективная концентрация препарата).(*) Prepared a combined aerosol composition based on a solution of FB/3 containing aprotinin, ASA with the ratio of active substances, as indicated in the table. Further, the resulting compositions were introduced into the soft cloud device, an aerosol was sprayed and an aerosol cloud condensate was prepared, as described in example 2. The pharmacological activity of the composition was studied by inhibiting the reproduction of the influenza A virus in chicken embryos. 9-day-old chicken embryos were infected with the human influenza virus A/Aichi/68 by introducing about 1000 virions into the allantoic cavity of the embryo and additionally injected 100 μl of two-fold dilutions of the condensed aerosol composition obtained according to the prescription in Table 18. 5 embryos were taken per dilution of the composition. After 36 hours of incubation of the embryos at 37°C, allantoic fluid was taken from chicken embryos and the amount of the synthesized infectious virus was determined by the infectious foci method in the MDSC cell culture by the number of viral particles per ml of allantoic fluid. As a control, embryos were taken, which were infected with the influenza virus without the introduction of an aerosol composition. The concentration of active substances in the aerosol condensate was determined, at which a 100-fold decrease in the virus titer was noted compared to the control (effective drug concentration).
Приведенный пример №12 демонстрируют сохранение противовирусного действия активных веществ в комбинированном аэрозольном составе и синергидное усиление их терапевтического эффекта, который выражается в снижении эффективной лечебной дозы каждого активного вещества и предотвращении возникновения вирусных мутантных вариантов при применении комбинированного аэрозольного состава. Для достижения лечебного противовирусного эффекта требуются концентрации препаратов, которые более чем в 10 раз ниже концентраций при их индивидуальном применении. При применении комбинированного аэрозольного состава достигается снижение лечебной концентрации препаратов и понижение уровня и опасности развития их побочной токсичности.The above example No. 12 demonstrates the preservation of the antiviral effect of the active substances in the combined aerosol composition and the synergistic enhancement of their therapeutic effect, which is expressed in reducing the effective therapeutic dose of each active substance and preventing the occurrence of viral mutant variants when using the combined aerosol composition. To achieve a therapeutic antiviral effect, concentrations of drugs are required that are more than 10 times lower than concentrations when they are used individually. When using a combined aerosol composition, a decrease in the therapeutic concentration of drugs and a decrease in the level and risk of developing their side toxicity are achieved.
Пример 13.Example 13.
Аэрозольный состав вируса с ингибитором протеазAerosol formulation of virus with protease inhibitor
Готовили аэрозольный состав, содержащий низко инфекционный вируса гриппа, содержащий нерасщепленный гемагглютинин НА0 (м.м. 75 кДа), ингибитор протеаз (апротинин) или протеазу (трипсин) в концентрации 0.7, 250 и 10 мкгр на мл, соответственно. Состав готовили на буфере ФБ/3, содержащем 0,3% глицерина и 0,001% ДМСО. Затем проводили распыление в аэрозольном устройстве Респимат, собирали конденсат аэрозольного облака и исследовали его фармакологическую активность в тесте ингибирования протеазы (трипсина) и в тесте инфицирования клеток млекопитающих вирусом. Результаты приведены на фиг. 19 и в таблице 12.An aerosol formulation was prepared containing a low infectious influenza virus containing uncleaved hemagglutinin HA0 (75 kDa mw), a protease inhibitor (aprotinin), or a protease (trypsin) at a concentration of 0.7, 250, and 10 µg per ml, respectively. The composition was prepared in FB/3 buffer containing 0.3% glycerol and 0.001% DMSO. Then spraying was carried out in the Respimat aerosol device, the condensate of the aerosol cloud was collected and its pharmacological activity was studied in the protease (trypsin) inhibition test and in the test of infection of mammalian cells with a virus. The results are shown in FIG. 19 and in table 12.
(*) Готовили комбинированный аэрозольный состав, содержащий вирус гриппа A/Aichi/2/68, выращенный в культуре клеток МДСК, апротинин и трипсин, как указано в таблице. Вирус гриппа подвергали очистке методом осаждения через 30% раствор глицерина, приготовленный на буфере ФБ, при центрифугировании в роторе SW55.1 ультрацентрифуги Spinko L-65 при 25000 об/мин в течение 2 часов при +4 град С. Полученные осадок очищенного вируса суспендировали в буфере ФБ/3 и использовали для приготовления аэрозольного состава. Далее полученные составы вносили в устройство мягкого облака, распыляли аэрозоль и готовили конденсат результирующего аэрозоля. Фармакологическую активность полученных аэрозольных составов исследовали тремя тестами: (1) по ингибированию протеазы; (2) по гидролизу хромогенного протеазного субстрата L-ZAPA (Z-Arg-pNA); (3) по инфекционности в культуре клеток легкого человека (линия клеток Calu-3), как описано в примере 2. Инфекционность вируса определяли методом инфекционных фокусов в культуре клеток Calu-3 с идентификацией вирусных фокусов методом иммунного окрашивания специфическими анти-Aichi антителами, как описано выше в примере 2. В таблице представлен инфекционный титр вируса в 1 мл аэрозольного конденсата.(*) Prepared a combined aerosol composition containing influenza virus A/Aichi/2/68 grown in cell culture MDSC, aprotinin and trypsin, as indicated in the table. The influenza virus was subjected to purification by precipitation through a 30% glycerol solution prepared in FB buffer by centrifugation in the SW55.1 rotor of a Spinko L-65 ultracentrifuge at 25,000 rpm for 2 hours at +4°C. FB/3 buffer and used to prepare an aerosol formulation. Next, the obtained compositions were introduced into the soft cloud device, the aerosol was sprayed, and the condensate of the resulting aerosol was prepared. The pharmacological activity of the resulting aerosol formulations was investigated by three tests: (1) protease inhibition; (2) hydrolysis of the chromogenic protease substrate L-ZAPA (Z-Arg-pNA); (3) by infectivity in human lung cell culture (Calu-3 cell line) as described in Example 2. Virus infectivity was determined by infection foci method in Calu-3 cell culture with identification of viral foci by immunostaining with specific anti-Aichi antibodies as described above in example 2. The table shows the infectious titer of the virus in 1 ml of aerosol condensate.
Полученные результаты показывают совместимость компонентов аэрозольного состава, сохранение фармакологических свойств активных веществ состава и отсутствие взаимного ингибирования активных веществ, стабилизация инфекционности вируса в аэрозольном составе ингибитором протеаз. Аэрозольные составы данного типа могут использоваться для приготовления вирусных вакцин и для местного применения при онколитической виротерапии живыми вирусами различных типов опухолей.The results obtained show the compatibility of the components of the aerosol composition, the preservation of the pharmacological properties of the active substances of the composition and the absence of mutual inhibition of the active substances, the stabilization of the infectivity of the virus in the aerosol composition by the protease inhibitor. Aerosol compositions of this type can be used for the preparation of viral vaccines and for topical application in oncolytic virotherapy with live viruses of various types of tumors.
Пример 14.Example 14
Комбинированный аэрозольный состав на основе ингибитора протеаз и протеазы иной специфичности.Combined aerosol composition based on a protease inhibitor and a protease of a different specificity.
Готовили аэрозольный состав, содержащий ингибитор клеточных протеаз смерти (каспаз) и протеолитический фермент трипсин (сериновая протеаза) на основе буфера ФБ/3 с 0,1% глицерина. Концентрации активных веществ составляли 10 и 20 мкгр на мл состава для ингибитора каспаз и трипсина, соответственно. Для генерации аэрозоля использовали устройство респимат, производили распыление и собирали конденсат исследуемого состава. Фармакологическую активность конденсата исследовали в тесте ингибирования каспазы 3 человека и трипсина по расщеплению соответствующих субстратов N-a-бензоил-DL-аргинин-4-нитроанилида (БАПНА) для трипсина и Ac-DEVD-pNA для каспазы 3. Реакцию расщепления субстратов соответствующими протеазами оценивали по изменению цвета раствора, которое сопровождается окрашиванием раствора измеряемое по интенсивности поглощения при длине волны 405 нм. Результат показан на Фиг. 10.An aerosol composition was prepared containing an inhibitor of cell death proteases (caspase) and the proteolytic enzyme trypsin (serine protease) based on FB/3 buffer with 0.1% glycerol. The active substance concentrations were 10 and 20 µg per ml of the caspase inhibitor and trypsin formulation, respectively. To generate an aerosol, a Respimat device was used, spraying was performed, and the condensate of the studied composition was collected. The pharmacological activity of the condensate was studied in the
Пример 15.Example 15
Комбинированный аэрозольный состав, содержащий ингибитор протеаз, супероксиддисмутазу, сорастворительCombined aerosol composition containing protease inhibitor, superoxide dismutase, co-solvent
Готовили аэрозольный состав, содержащий апротинин (ингибитор протеаз) и супероксиддисмутазу (СОД - фермент утилизации активных форм кислорода и оксидных радикалов) на основе буфера ФБ/3 с 0,03% глицерина. Концентрации активных веществ составляли 250 и 700 мкгр на мл состава для ингибитора протеаз и СОД, соответственно. Для генерации аэрозоля использовали устройство мягкого облака Респимат, производили распыление и собирали конденсат исследуемого состава. Фармакологическую активность конденсата исследовали в тесте подавления цитопатогенного действия (ЦПД) вируса гриппа на клетки легкого человека (линия Calu-3) и в тесте ингибирования гидролитической активности трипсина по расщеплению хромогенного субстрата N-а-бензоил-DL-аргинин-4-нитроанилида (БАПНА). Реакцию расщепления субстрата трипсином оценивали по изменению цвета раствора, которое сопровождается окрашиванием раствора измеряемое по интенсивности поглощения при длине волны 405 нм.An aerosol composition was prepared containing aprotinin (a protease inhibitor) and superoxide dismutase (SOD - an enzyme for the utilization of reactive oxygen species and oxide radicals) based on FB/3 buffer with 0.03% glycerol. The active substance concentrations were 250 and 700 µg per ml of the protease inhibitor and SOD formulation, respectively. To generate the aerosol, a Respimat soft cloud device was used, spraying was performed, and the condensate of the studied composition was collected. The pharmacological activity of the condensate was studied in the test for suppressing the cytopathogenic effect (CPE) of the influenza virus on human lung cells (Calu-3 line) and in the test for inhibiting the hydrolytic activity of trypsin by cleavage of the chromogenic substrate N-a-benzoyl-DL-arginine-4-nitroanilide (BAPN ). The reaction of cleavage of the substrate with trypsin was assessed by the color change of the solution, which is accompanied by the coloring of the solution, measured by the absorption intensity at a wavelength of 405 nm.
ЦПД исследовали колориметрическим тетразолиевым методом (МТТ тест) с использованием красителя 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромида, который переходит в пурпурный формазан под действием НАДФ-Н-зависимых клеточных оксидоредуктазных ферментов жизнеспособных клеток. Количество формазана, которое определяют фотометрически при 590 нм, отражает количество живых клеток.CPE was studied by the colorimetric tetrazolium method (MTT test) using the dye 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide, which turns into purple formazan under the action of NADP-H-dependent cellular oxidoreductase enzymes viable cells. The amount of formazan, which is determined photometrically at 590 nm, reflects the number of living cells.
Для определения активности ингибитора протеаз использовали тест ингибирования трипсина. Конденсат после аэрозольного распыления комбинированного состава конденсат смешивали с трипсином в присутствии субстрата БАПНА, инкубировали 20 мин при 30 град С и определяли интенсивность окрашивания (ОП-оптическую плотность) раствора при 405 нм. Результаты показаны в таблице 13.The trypsin inhibition test was used to determine the activity of the protease inhibitor. The condensate after aerosol spraying of the combined composition, the condensate was mixed with trypsin in the presence of the BAPNA substrate, incubated for 20 min at 30°C, and the staining intensity (OD optical density) of the solution was determined at 405 nm. The results are shown in Table 13.
1) Цитопатогенное (ЦПД; цитодеструктивное) действие исследовали методом МТТ, так называемый, МТТ тест. Клетки инфицировали вирусом гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2), вносили среду с аэрозольным конденсатом и инкубировали 48 часов при 36 град. С.Затем клетки инкубировали с тетразолиевым красителем и определяли уровень образования формазана по стандартной МТТ методике по оптической плотности при 590 нм. Обозначения: «+» - значение оптической плотности в контрольной пробе, которое принимали за 100%; «+/-» - частичное ЦПД на уровне 5-40%; «-» - минимальный уровень ЦПД на уровне 5% и ниже.1) Cytopathogenic (CPP; cytodestructive) action was investigated by the MTT method, the so-called MTT test. Cells were infected with influenza virus A/Aichi/2/68 (H3N2), medium with aerosol condensate was added and incubated for 48 hours at 36°C. C. The cells were then incubated with tetrazolium dye and the level of formazan formation was determined by the standard MTT method by optical density at 590 nm. Designations: "+" - the value of optical density in the control sample, which was taken as 100%; "+/-" - partial CPP at the level of 5-40%; "-" - the minimum level of CPP at the level of 5% and below.
2) Аэрозольные конденсаты смешивали с равным объемом стандартного трипсина и определяли гидролитическую активность смеси по расщеплению хромогенного субстрата L-ZAPA (Z-Arg-pNA), как описано в примере 2. Результаты оценивали по следующей шкале: «+» - контрольная гидролитическая активность в пробе трипсина без конденсата, которую принимали за 100%; «+/-» - средняя активность не более 30%; «-»- слабая активность не более 5%. Полученные результаты представлены в табл. 13.2) Aerosol condensates were mixed with an equal volume of standard trypsin and the hydrolytic activity of the mixture was determined by the breakdown of the chromogenic substrate L-ZAPA (Z-Arg-pNA), as described in example 2. The results were evaluated on the following scale: "+" - control hydrolytic activity in trypsin sample without condensate, which was taken as 100%; "+/-" - average activity is not more than 30%; "-" - weak activity no more than 5%. The results obtained are presented in table. 13.
Полученные результаты показывают сохранение фармакологической активности как ингибитора протеазы, так и супероксиддисмутазы после аэрозольного распыления комбинированного аэрозольного состава.The results obtained show the preservation of the pharmacological activity of both the protease inhibitor and superoxide dismutase after aerosol spraying of the combined aerosol composition.
Пример 16.Example 16
Комбинированный аэрозольный состав ингибитора протеаз и антивирусных антител.Combined aerosol composition of a protease inhibitor and antiviral antibodies.
Готовили аэрозольные составы, содержащие активные вещества апротинина, леупептина и антитела кролика против белка НА вируса гриппа человека штамм A/Aich/2/68 (H3N2) в концентрации 40, 15 и 10 мкгр на мл, соответственно, в отдельности или вместе. В качестве базового раствора использовали буфер ФБ/3 (рН 7,2), содержащий 0,07% глицерина. После распыления приготовленного состава в устройстве Респимат или Бореаль (модель 4000) получали конденсат аэрозольного состава. Далее брали вирус гриппа в дозе 100 ФОБ, смешивали с равным объемом аэрозольного конденсата, вносили в культуру клеток почки собаки (линия МДСК) и инкубировали при 36 град С в CO2 атмосфере. Через 10-15 часов клетки фиксировали и инфицированные клетки окрашивали мышиными антителами к вирусному белку NP с помощью метода "True Blue", как описано в примере 2. Результат показан на фиг. 11.Aerosol formulations were prepared containing the active substances of aprotinin, leupeptin and rabbit antibodies against the HA protein of the human influenza virus strain A/Aich/2/68 (H3N2) at a concentration of 40, 15 and 10 μg per ml, respectively, separately or together. Buffer FB/3 (pH 7.2) containing 0.07% glycerol was used as the base solution. After spraying the prepared composition in the Respimat or Boreal device (model 4000), a condensate of the aerosol composition was obtained. Next, an influenza virus was taken at a dose of 100 FOB, mixed with an equal volume of aerosol condensate, introduced into a dog kidney cell culture (MDSC line) and incubated at 36°C in a CO2 atmosphere. After 10-15 hours, cells were fixed and infected cells were stained with mouse anti-viral NP antibodies using the "True Blue" method as described in Example 2. The result is shown in FIG. eleven.
Пример 17.Example 17.
Комбинированный аэрозольный состав интерферона и ингибитора протеаз.Combined aerosol composition of interferon and protease inhibitor.
Готовили аэрозольные составы, содержащие активные вещества апротинина и интерферона альфа-2в человека в концентрации 40 и 15 мкгр на мл, соответственно, в отдельности или вместе. В качестве базового раствора использовали буфер ФБ/3 (рН 7,2), содержащий 0,1% глицерина. После распыления приготовленного состава в устройстве Респимат получали конденсат аэрозольного состава. Далее среду для клеток смешивали аэрозольным конденсатом в соотношении 3 к 1 и вносили в культуру клеток легкого человека (линия Calu-3) и инкубировали при 36 град С в CO2 атмосфере в течение 2 часов. Затем в культуру вносили вирус гриппа человека A/PR/8/34 (H1N1) в дозе 100 ФОБ на клеточный монослой в чашке диаметром 3 см и инкубировали при 36 град С в CO2 атмосфере в течение 10 часов. Затем клетки фиксировали и инфицированные клетки окрашивали антителами кролика, полученными к вирусу, и окрашивали вторичными антителами с пероксидазой с помощью метода "True Blue", как описано в примере 2. Результат показан на фиг. 12.Aerosol formulations were prepared containing the active substances of aprotinin and human interferon alfa-2b at a concentration of 40 and 15 μg per ml, respectively, alone or together. Buffer FB/3 (pH 7.2) containing 0.1% glycerol was used as the base solution. After spraying the prepared composition in the Respimat device, a condensate of the aerosol composition was obtained. Next, the cell medium was mixed with aerosol condensate in a ratio of 3 to 1 and introduced into a human lung cell culture (Calu-3 line) and incubated at 36°C in a CO2 atmosphere for 2 hours. Then, human influenza virus A/PR/8/34 (H1N1) was added to the culture at a dose of 100 FOB per cell monolayer in a 3 cm dish and incubated at 36°C in a CO2 atmosphere for 10 hours. The cells were then fixed and the infected cells were stained with rabbit antibodies prepared against the virus and stained with secondary antibodies with peroxidase using the "True Blue" method as described in Example 2. The result is shown in FIG. 12.
Пример 18.Example 18.
Профиль дисперсности аэрозольного облака при распылении комбинированного аэрозольного состава ингибитора протеаз и рибавирина, содержащего глицерин.Dispersion profile of an aerosol cloud when spraying a combined aerosol composition of a protease inhibitor and ribavirin containing glycerin.
Исследовали пригодность аэрозольного состава для генерирования мелкодисперсного аэрозоля за счет выталкивающей силы в устройстве мягкого облака. Аэрозольный состав готовится согласно прописи состава №3, указанного в таблице 2 с добавлением глицерина в конечной концентрации 0,5%. Определение дисперсности проводили микроскопически после выпуска аэрозоля на стекло. Делают выпуск аэрозольного состава на чистую обезжиренную матрицу, расположенную перпендикулярно направлению распыления на расстоянии 5 см от выходного отверстия устройства. Определение величины влажных частиц осуществляют с помощью микроскопа при 450-кратном увеличении сразу после напыления аэрозоля на стекло. Диаметр частиц определяют на матрице, имеющей размеченную сетку. Подсчет проводят на 10 полях зрения (Фиг. 13). Измерение проводят 3 раза из одного баллона на разных сроках выпуска аэрозоля и далее рассчитывают распределение частиц по фракциям с определенным диапазоном по диаметру частиц в процентах от общего количества частиц на стекле в поле зрения. Аэрозольное облако, генерированное из аэрозольного состава ингибитора протеаз, имело преимущественный диапазон дисперсности от 0,1 до 300 мкм, пригодный для медицинского применения. Результат показан на Фиг. 13.The suitability of an aerosol composition for generating a fine aerosol due to the buoyancy force in a soft cloud device was investigated. The aerosol composition is prepared according to the formulation of composition No. 3 indicated in table 2 with the addition of glycerol at a final concentration of 0.5%. Determination of dispersion was carried out microscopically after the release of the aerosol on the glass. The aerosol composition is released onto a clean, fat-free matrix located perpendicular to the spray direction at a distance of 5 cm from the outlet of the device. Determination of the size of wet particles is carried out using a microscope at 450-fold increase immediately after spraying the aerosol onto the glass. The particle diameter is determined on a matrix having a marked grid. Counting is carried out on 10 fields of view (Fig. 13). The measurement is carried out 3 times from one container at different times of aerosol release, and then the distribution of particles by fractions with a certain range of particle diameter as a percentage of the total number of particles on the glass in the field of view is calculated. The aerosol cloud generated from the aerosol composition of the protease inhibitor had an advantageous dispersion range from 0.1 to 300 μm, suitable for medical use. The result is shown in Fig. 13.
Краткое описание фигур (рисунков).Brief description of the figures (drawings).
Фиг. 1. Содержание рибавирина в конденсате генерированного аэрозоля.Fig. 1. The content of ribavirin in the condensate of the generated aerosol.
Аэрозольный составы, приготовленные согласно прописи в таблице 1, распыляли и получали растворы соответствующих аэрозольных конденсатов. Далее готовили разведения конденсата и определяли концентрации рибавирина по интенсивности характерного для рибавирина поглощения ультрафиолетового спектра излучения при длине волны 206 нм (ОП/206). Стрелкам показано положение на кривой значений для аэрозольных составов, указанных в таблице 2 составом с концентрацией рибавирина: 20, 150 и 250 мкгр на мл. Калибровочная кривая построена на основании значений растворов с известной концентрацией рибавирина.Aerosol compositions prepared according to the recipe in table 1 were sprayed and solutions of the corresponding aerosol condensates were obtained. Next, dilutions of the condensate were prepared and the concentrations of ribavirin were determined by the intensity of the absorption of the ultraviolet radiation spectrum characteristic of ribavirin at a wavelength of 206 nm (OD/206). The arrows show the position on the curve of the values for the aerosol formulations indicated in Table 2 with formulations at ribavirin concentrations of 20, 150, and 250 μg per ml. The calibration curve is based on the values of solutions with a known concentration of ribavirin.
Фиг. 2. Содержание апротинина в конденсате генерированного аэрозоля.Fig. 2. The content of aprotinin in the condensate of the generated aerosol.
Полученные образцы аэрозольного конденсата, как указано в таблице 2, анализировали в полиакриламидном геле (ПАГе). Из собранных порций аэрозольного состава отбирают аликвоты (~15 мкл), которые смешивают с 5 мкл диссоциирующего раствора, содержащего 5% додецилсульфата натрия (ДСН) и 200 мкМ дитиотреитола (ДТТ), нагревают в течение 10 мин при 700 С и наносят на гель. Фокусирующий и разделительный гели готовили в буферной системе по методу Laemmli (1970). Электрофорез проводят при 70V на пластину ПАГ шириной 8 см в течение 2 часов. После окончания электрофореза полипептиды в геле окрашивают Кумаси Голубым R-350 (0,1%), который растворяли в смеси вода: этанол: уксусная кислота в соотношении по объему 5:5:1 при комнатной температуре. Не связавшуюся краску отмывают из геля в смеси вода: этанол: уксусная кислота с соотношением 88:5:7, соответственно. Для сравнения в качестве стандартного образца апротинина используют коммерческий препарат очищенного апротинина, выделенного из легких крупного рогатого скота (фирма Sigma, США). Стрелками показано положение апротинина в геле, что соответствует полипептиду с молекулярной массой (м.м.) 6,5 кДа.The resulting samples of aerosol condensate, as indicated in table 2, were analyzed in a polyacrylamide gel (PAGE). Aliquots (~15 µl) are taken from the collected portions of the aerosol composition, which are mixed with 5 µl of a dissociating solution containing 5% sodium dodecyl sulfate (SDS) and 200 µM dithiothreitol (DTT), heated for 10 min at 700 C and applied to the gel. Focusing and separating gels were prepared in a buffer system according to the method of Laemmli (1970). Electrophoresis is carried out at 70V on a
Эти данные показывают, что апротинин не изменял свои структурные свойства при распылении аэрозоля из аэрозольного состава. В образцах аэрозольного конденсата не обнаружено белковых агрегатов в высокомолекулярной зоне (ВМЗ) с м.м. массой 120-275 кДа, что указывало на отсутствие агрегатов и денатурации апротинина в процессе смешивания и распыления аэрозольных составов. Дорожки №2, №2, №3 - образцы согласно таблице 2. Дорожка №4 - маркерные белки определенной молекулярной массы.These data show that aprotinin did not change its structural properties when aerosolized from the aerosol formulation. In the samples of aerosol condensate, no protein aggregates were found in the high molecular weight zone (VMZ) with m.m. with a mass of 120-275 kDa, which indicated the absence of aggregates and denaturation of aprotinin in the process of mixing and spraying aerosol compositions. Tracks No. 2, No. 2, No. 3 - samples according to table 2. Track No. 4 - marker proteins of a certain molecular weight.
Фиг. 3. Подавление трипсина ингибитором протеаз после генерирования аэрозоля. Готовили стандартный раствор трипсина, который смешивали с аэрозольным конденсатом и инкубировали в течении часа при комнатной температуре. Исследовали конденсаты, полученные из свеже приготовленных аэрозольных составов и из составов, хранившихся 5 лет при температуре +10 град. С. После инкубации смеси конденсата с трипсином определяли остаточную активность трипсина методом торможения гидролитического асщепления хромогенного субстрата L-ZAPA (Z-Arg-pNA), ведущего к образованию нитроанилида (NA), дающего желтое окрашивание, которое регистрируется при длине волны 405 нм (ОП/405). Для тестирования в исследуемую смесь вносят субстрат L-ZAPA (25 мкл раствора с концентрацией 1 мг/мл), инкубируют 15 мин при 20 град. С, гидролитическую реакцию останавливают добавлением 25 мкл 1М раствора соляной кислоты и измеряют величину ОП/405, которая показывает уровень остаточного активного (не ингибированного) трипсина (Фиг. 3).Fig. 3. Inhibition of trypsin by a protease inhibitor after aerosol generation. A standard trypsin solution was prepared, which was mixed with an aerosol condensate and incubated for an hour at room temperature. We studied condensates obtained from freshly prepared aerosol compositions and from compositions stored for 5 years at a temperature of +10°C. C. After incubation of the mixture of condensate with trypsin, the residual activity of trypsin was determined by inhibition of hydrolytic degradation of the chromogenic substrate L-ZAPA (Z-Arg-pNA), leading to the formation of nitroanilide (NA), giving a yellow color, which is recorded at a wavelength of 405 nm (OD /405). For testing, the L-ZAPA substrate (25 µl of a solution with a concentration of 1 mg/ml) is added to the test mixture, incubated for 15 minutes at 20 deg. C, the hydrolytic reaction is stopped by adding 25 μl of 1M hydrochloric acid and the OD/405 value is measured, which indicates the level of residual active (not inhibited) trypsin (FIG. 3).
Аэозольные составы ингибиторов протеаз готовили на буфере ФБ/3, содержащем 1% глицерина и следующие ингибиторы протеаз: апротинин (20 мкгр/мл), камостад (0,5 мкгр/мл), леупептин (2 мкгр/мл), смесь трех перечисленных ингибиторов с теми же концентрациями, соответственно пробы 2-5 по оси абсцисс. Поси ординат откладывали активность трипсина, которую выражали в оптических единицах поглощения при ОП/405, при этом величину ОП/405 контрольной пробы с трипсином без аэрозольного конденсата (столбик №1) принимали за 100%. Как показано на фиг. 3, исследуемые пробы аэрозольного конденсата и их разведения в 10 раз полностью ингибировали активность трипсина. Таким образом, это тестирование показывает, что ингибитор протеаз остается стабильным в аэрозольном составе и устойчиво сохраняет антипротеазную активность на исходном уровне в процессе хранения. Сохранение антипротеазной активности состав наблюдалось, по крайней мере, в течение 5 лет.Aerosol formulations of protease inhibitors were prepared in FB/3 buffer containing 1% glycerol and the following protease inhibitors: aprotinin (20 μg/ml), camostad (0.5 μg/ml), leupeptin (2 μg/ml), a mixture of the three listed inhibitors with the same concentrations, respectively, samples 2-5 along the abscissa. The y-axis plotted trypsin activity, which was expressed in optical absorption units at OD/405, while the OD/405 value of the control sample with trypsin without aerosol condensate (column No. 1) was taken as 100%. As shown in FIG. 3, the studied samples of aerosol condensate and their dilution completely inhibited trypsin activity by 10 times. Thus, this testing indicates that the protease inhibitor remains stable in the aerosol formulation and sustainably retains its original anti-protease activity during storage. The persistence of the antiprotease activity of the formulation was observed for at least 5 years.
Фиг. 4. Ингибирование размножения вируса гриппа комбинированным аэрозольным составом после генерирования аэрозоля.Fig. 4. Inhibition of influenza virus replication by combined aerosol formulation after aerosol generation.
Для тестирования фармакологической активности аэрозоля ингибиторов протеаз и их комбинаций с веществами иного механизма действия использовали метод подавления вирусных инфекционных фокусов в культуре клеток млекопитающих, формирующихся под действием патогенных для человека вирусов гриппа. Вирус гриппа формировал цитолитические инфекционные фокусы в культуре клеток кишечника человека (линия СаСо-2), формирование которых подавлялось исследуемыми аэрозольными составами после их аэрозольного распыления. Данные такого тестирования приведены на фиг. 4.To test the pharmacological activity of an aerosol of protease inhibitors and their combinations with substances of a different mechanism of action, we used the method of suppressing viral infectious foci in a culture of mammalian cells formed under the influence of influenza viruses pathogenic for humans. Influenza virus formed cytolytic infectious foci in human intestinal cell culture (line CaCo-2), the formation of which was suppressed by the studied aerosol compositions after their aerosol spraying. Data from this test is shown in Fig. four.
Аэрозольные составы ингибиторов протеаз (апротинин и леупептин) в комбинации с антивирусными веществами, а именно: фавипиравиром, рибавирином, ацетил салициловый кислотой, осельтамивиром готовили на фосфатном буферном растворе ФБ/3. Далее производили распыление в устройстве эжекторного типа «Бореаль», собирали и осаждали аэрозольный конденсат, который добавляли в клеточную питательную среду и вносили равную дозу вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2). Через 15-17 часов после инкубации при 37 град. С клеточную культуру фиксировали 4%-ым раствором параформальдегида и вирусные фокусы окрашивали с помощью специфических противовирусных антител (субтип анти-Н3) и пероксидазных конъюгатов, используя в качестве хромогенного субстрата препарат "True Blue". Результаты, представленные на фиг. 4, показывают количество инфицированных вирусом клеток и отражают снижение их количества, которое формировалось под действием аэрозольных составов.Aerosol compositions of protease inhibitors (aprotinin and leupeptin) in combination with antiviral substances, namely: favipiravir, ribavirin, acetyl salicylic acid, oseltamivir were prepared in FB/3 phosphate buffer solution. Next, spraying was carried out in a Boreal ejector device, the aerosol condensate was collected and precipitated, which was added to the cell nutrient medium and an equal dose of human influenza virus A/Aichi/2/68 (H3N2) was introduced. 15-17 hours after incubation at 37 degrees. The cell culture was fixed with 4% paraformaldehyde solution, and viral foci were stained with specific antiviral antibodies (anti-H3 subtype) and peroxidase conjugates using True Blue as a chromogenic substrate. The results shown in FIG. 4 show the number of cells infected with the virus and reflect the decrease in their number, which was formed under the action of aerosol formulations.
Окрашенные с помощью антивирусных антител клеточные культуры фотографировали в световом микроскопе под увеличением х80. Лунка 1 - показывают клеточные пробы, инкубированные без конденсата (состав №7), 2 - лунка с 30 мкл конденсата, полученного распылением из устройства (состав №2), 3 - лунка с 30 мкл конденсата аэрозольного состава, хранившегося 5 лет (состав №2), соответственно.Cell cultures stained with antiviral antibodies were photographed under a light microscope at x80 magnification. Well 1 - shows cell samples incubated without condensate (composition No. 7), 2 - well with 30 μl of condensate obtained by spraying from the device (composition No. 2), 3 - well with 30 μl of aerosol composition condensate stored for 5 years (composition No. 2), respectively.
Фиг. 5. Ингибирование размножения коронавируса конденсатом аэрозольного состава после генерирования аэрозоля.Fig. 5. Inhibition of the reproduction of the coronavirus by the condensate of the aerosol composition after the generation of the aerosol.
Для тестирования фармакологической активности аэрозоля ингибиторов протеаз и их комбинаций с веществами иного механизма действия использовали метод подавления вирусных инфекционных фокусов в культуре клеток млекопитающих, формирующихся под действием патогенных коронавирусов крупного рогатого скота. Коронавирус штамм KV-92 формировал цитолитические инфекционные фокусы в культуре клеток почки быка (линия MDBK), формирование которых подавлялось исследуемыми аэрозольными составами после их аэрозольного распыления. Данные такого тестирования приведены на фиг. 5.To test the pharmacological activity of an aerosol of protease inhibitors and their combinations with substances of a different mechanism of action, we used the method of suppressing viral infectious foci in a culture of mammalian cells formed under the influence of pathogenic bovine coronaviruses. Coronavirus strain KV-92 formed cytolytic infectious foci in a culture of bovine kidney cells (MDBK line), the formation of which was suppressed by the studied aerosol compositions after their aerosol spraying. Data from this test is shown in Fig. 5.
Аэрозольные составы ингибиторов протеаз (апротинин и леупептин) в комбинации с антивирусными веществами, а именно: фавипиравиром, рибавирином готовили на фосфатном буферном растворе ФБ/3, содержащем 0,05% ДМСО. Далее производили распыление в устройстве мягкого облака Респимат, собирали и осаждали аэрозольный конденсат, который добавляли в клеточную питательную среду и вносили начальную дозу коронавируса (штамм KV-92), равную 0,001 ФОБ на клетку, и инкубировали при 36,5 град С в CO2-атмосферном инкубаторе. Через 48-72 часов после инкубации определяли антивирусную фармакологическую активность при 37 град. С клеточную культуру фиксировали 4%-ым раствором параформальдегида и вирусные фокусы окрашивали с помощью специфических противовирусных антител и пероксидазных конъюгатов, используя в качестве хромогенного субстрата препарат "True Blue". Результаты показаны на фиг. 5. Результаты показывают количество инфицированных вирусом клеток и отражало уровень вирусного поражения, снижение которых формировалось под действием аэрозольных составов.Aerosol compositions of protease inhibitors (aprotinin and leupeptin) in combination with antiviral agents, namely: favipiravir, ribavirin were prepared in a phosphate buffer solution FB/3 containing 0.05% DMSO. Next, spraying was carried out in the Respimat soft cloud device, the aerosol condensate was collected and precipitated, which was added to the cell nutrient medium and the initial dose of coronavirus (KV-92 strain) equal to 0.001 FOB per cell was introduced, and incubated at 36.5 deg C in CO2- atmospheric incubator. 48-72 hours after incubation, antiviral pharmacological activity was determined at 37 degrees. The cell culture was fixed with 4% paraformaldehyde solution, and viral foci were stained with specific antiviral antibodies and peroxidase conjugates using True Blue as a chromogenic substrate. The results are shown in FIG. 5. The results show the number of virus-infected cells and reflect the level of viral damage, the reduction of which was formed under the action of aerosol formulations.
Конденсаты исследуемых аэрозолей вносили в культуру клеток почки быка, инфицированных коронавирусом, и инкубировали в течение 50-70 часов при 36 град С.Клеточные культуры окрашивали антивирусными антителами, указывающими на наличие инфицированных клеток в клеточном монослое. Количество и размер окрашенных зон показывает интенсивность развития коронавируса в клеточной пробе. Пробы: (1) -контрольная инфицированная культура с конденсатом плацебо (состав №7); (2) клеточная культура с конденсатом аэрозольного состава №6; (3) - клеточная культура с конденсатом аэрозольного состава №1; (4) - культура клеток с конденсатом аэрозольного состава №5. Результат показывает существенное усиление фармакологического вирус ингибирующего действия комбинации ингибитора протеаз и антивирусного вещества.The condensates of the studied aerosols were introduced into the culture of bovine kidney cells infected with coronavirus and incubated for 50-70 hours at 36°C. Cell cultures were stained with antiviral antibodies indicating the presence of infected cells in the cell monolayer. The number and size of the colored zones shows the intensity of the development of the coronavirus in the cell sample. Samples: (1) - control infected culture with placebo condensate (composition No. 7); (2) cell culture with condensate aerosol composition No. 6; (3) - cell culture with condensate aerosol composition No. 1; (4) - cell culture with aerosol composition condensate No. 5. The result shows a significant enhancement of the pharmacological virus inhibitory action of the combination of the protease inhibitor and the antiviral substance.
Фиг. 6. Определение концентрации фавипиравира в конденсате аэрозольного состава.Fig. 6. Determination of the concentration of favipiravir in the condensate of the aerosol composition.
Калибровочная кривая построена по поглощению раствора фавипиравира с известной концентрацией по поглощению при длине волны 206 нм (спектр поглощения характерный для вещества фавипиравира). Стрелками показаны образцы аэрозольного конденсата полученное после генерирования аэрозоля составов №1, №2 и №3, представленных в таблице 3, соответственно. По оси абсцисс показаны величины поглощения при длине волны 325 нм, по оси ординат отложены Lg концентрации фавипиравира в растворе. Оптическую плотность (ОП) измеряли на спектрофотометре ULTRASPEC II model 4050 при максимальной длине поглощения 325 нм.The calibration curve was built on the absorption of a solution of favipiravir with a known concentration by absorption at a wavelength of 206 nm (absorption spectrum characteristic of the substance of favipiravir). The arrows show samples of aerosol condensate obtained after generating aerosol compositions No. 1, No. 2 and No. 3, presented in Table 3, respectively. The abscissa shows the absorption values at a wavelength of 325 nm, the ordinate shows Lg concentrations of favipiravir in solution. Optical density (OD) was measured on an ULTRASPEC II model 4050 spectrophotometer at a maximum absorption length of 325 nm.
Фиг. 7. Торможение размножения коронавируса комбинированным аэрозольным составом.Fig. 7. Inhibition of the reproduction of coronavirus with a combined aerosol composition.
Аэрозольные составы ингибитора протеаз (леупептин) в комбинации с антивирусным веществом (фавипиравир) готовили на фосфатном буферном растворе ФБ/3. Далее производили распыление в устройстве эжекторного типа «Бореаль, модель F4000», собирали и осаждали аэрозольный конденсат, который добавляли в клеточную питательную среду и вносили коронавирус KV92 в дозе около 30 ФОЕ на одну лунку, содержащую около 105 клеток MLDK. Через 65 часов после инкубации при 37 град, в культуральной жидкости клеток определяли количество накопившегося вируса методом гемагглютинации мышиных эритроцитов. Полученные результаты показывают, что в присутствии аэрозольного конденсата заметно (в 5 и более раз) снижается размножение и накопление вируса. Методом световой микроскопии клеточного монослоя регистрировали практическая 100% гибель в контрольных клетках без аэрозольного конденсата, частичную гибель в пробах с аэрозольным составом леупептина и фавипиравира. В клетках с комбинированным составом леупептина и фавипиравира отмечалось заметное снижение гибели клеток. Проведенные исследования показали, что комбинированный аэрозольный состав фавипиравира (антивирусного вещества) и леупептина (ингибитора протеаз) сохранял фармакологические свойства активных веществ после аэрозольной генерации состава по ингибированию размножения вируса (антивирусное действие) и снижению деструкции клеточного монослоя (антидеструктивное действие).Aerosol formulations of a protease inhibitor (leupeptin) in combination with an antiviral agent (favipiravir) were prepared in FB/3 phosphate buffer solution. Next, spraying was carried out in a Boreal ejector type device, model F4000, the aerosol condensate was collected and precipitated, which was added to the cell nutrient medium and the KV92 coronavirus was introduced at a dose of about 30 FFU per well containing about 10 5 MLDK cells. 65 hours after incubation at 37 degrees, the amount of accumulated virus was determined in the cell culture fluid by hemagglutination of mouse erythrocytes. The results obtained show that in the presence of aerosol condensate, the multiplication and accumulation of the virus is noticeably (by a factor of 5 or more) reduced. Practical 100% death in control cells without aerosol condensate, partial death in samples with aerosol composition of leupeptin and favipiravir was recorded by light microscopy of the cell monolayer. In cells with a combined composition of leupeptin and favipiravir, there was a marked decrease in cell death. The studies have shown that the combined aerosol composition of favipiravir (antiviral agent) and leupeptin (protease inhibitor) retained the pharmacological properties of the active substances after aerosol generation of the composition to inhibit virus reproduction (antiviral action) and reduce the destruction of the cell monolayer (antidestructive action).
Фиг. 8. Фармакологическое действие ингибиторов протеаз в комбинации с антивирусными веществами против коронавируса.Fig. 8. Pharmacological action of protease inhibitors in combination with antiviral agents against coronavirus.
Аэрозольные составы готовили на ФБ/3 с концентрациями активных веществ: апротинин (50 мкгр/мл), рибавирин (20 мкгр/мл), фавипиравир (65 мкгр/мл), леупептин (15 мкгр/мл). По оси абсцисс показаны номера проб аэрозольного состава, содержащего: (1) - контрольный аэрозольный состав без активных веществ; (2) - апротинин; (3) - рибавирин; (4) фавипиравир; (5) - апротинин+рибавирин; (6) - апротинин + фавипиравир; (7) - леупептин; (8) - леупептин + рибавирин; (9) - леупептин+фавипиравир. По оси ординат отложены двоичный логарифм разведения исследуемой культуральной, в котором наблюдалась вирус-индуцированная гемагглютинация эритроцитов.Aerosol formulations were prepared on FB/3 with concentrations of active substances: aprotinin (50 μg/ml), ribavirin (20 μg/ml), favipiravir (65 μg/ml), leupeptin (15 μg/ml). The abscissa axis shows the numbers of samples of the aerosol composition containing: (1) - control aerosol composition without active substances; (2) - aprotinin; (3) - ribavirin; (4) favipiravir; (5) - aprotinin + ribavirin; (6) - aprotinin + favipiravir; (7) - leupeptin; (8) - leupeptin + ribavirin; (9) - leupeptin + favipiravir. The y-axis shows the binary logarithm of the dilution of the studied culture, in which virus-induced hemagglutination of erythrocytes was observed.
Представленные данные показывают сохранение фармакологических свойств ингибиторов протеаз и их комбинаций с антивирусными веществами различного механизма действия после аэрозольного распыления. Приведенный пример дополнительно показывает усиление фармакологического противовирусного эффекта комбинированного аэрозольного состава, содержащего ингибиторы протеаз и антивирусное вещество, по сравнению с применением индивидуального фармакологического вещества.The presented data show the preservation of the pharmacological properties of protease inhibitors and their combinations with antiviral agents of various mechanisms of action after aerosol spraying. This example further shows the enhancement of the pharmacological antiviral effect of the combined aerosol composition containing protease inhibitors and antiviral agent, compared with the use of an individual pharmacological agent.
Фиг. 9. Белковый профиль используемого в аэрозольном составе слабо инфекционного вируса гриппа A/Aichi/2/68.Fig. 9. Protein profile of the weakly infectious influenza virus A/Aichi/2/68 used in the aerosol formulation.
Дорожка 1 - исходный вирус гриппа, выращенный в культуре клеток МДСК и содержащий нерасщепленный гемагглютинин НАО (м.м. 75 кДа). вирус гриппа; 2 - вирус гриппа после инкубации аэрозольного конденсата, содержащего вирус и апротинин, с клетками Calu-3, содержит нерасщепленный НА0; 3 - вирус гриппа в аэрозольном составе, содержащем трипсин, содержит расщепленный НА1 (м.м. 55 кДа); (4) - вирус гриппа в аэрозольном конденсате без апротинина после контакта с клетками Calu-3 содержит расщепленный НА1 (м.м. 55 кДа).Lane 1 - the original influenza virus grown in MDSC cell culture and containing uncleaved hemagglutinin HAO (mm 75 kDa). influenza virus; 2 - influenza virus after incubation of an aerosol condensate containing the virus and aprotinin with Calu-3 cells, contains uncleaved HA0; 3 - influenza virus in an aerosol composition containing trypsin contains cleaved HA1 (mm 55 kDa); (4) - influenza virus in aerosol condensate without aprotinin after contact with Calu-3 cells contains cleaved HA1 (MW 55 kDa).
Фиг. 10. Сохранение фармакологической активности ингибитора протеаз и протеазы после распыления смешанного аэрозольного состава с данными активными веществами.Fig. 10. Preservation of the pharmacological activity of the protease inhibitor and protease after spraying a mixed aerosol composition with these active substances.
Для определения сохранения активности ингибитора протеаз в аэрозольном конденсате смешивали конденсат и раствор активной каспазы 3, инкубировали 20 мин при 30 град С и определяли интенсивность поглощения при длине волны 405 нм. Для определения сохранения активности трипсина после его аэрозольного распыления комбинированного состава конденсат смешивали с субстратом БАПНА, инкубировали 20 мин при 30 град С и определяли интенсивность окрашивания раствора при 405 нм. Панель А: (1) - контрольный раствор исходной активной протеазы; (2) раствор трипсина с конденсатом исследуемого конденсата; (3) - раствор субстрата без протеазы (негативный контроль). (4) - конденсат, полученный из аэрозольного состава трипсина без ингибитора каспазы. Панель Б: (1) -контрольный раствор исходной активной каспазы 3 (положительный контроль); (2) раствор каспазы 3 с исследуемым конденсатом; (3) - раствор субстрата без конденсата и без протезы (негативный контроль). (4) - конденсат, полученный из аэрозольного состава ингибитора каспазы без трипсина.To determine the retention of protease inhibitor activity in the aerosol condensate, the condensate and
Полученные результаты показывают сохранение фармакологической активности как ингибитора протеазы, так и протеазы иной специфичности при распылении их комбинированного аэрозольного состава.The results obtained show the preservation of the pharmacological activity of both a protease inhibitor and a protease of a different specificity when spraying their combined aerosol composition.
Фиг. 11. Фармакологическое действие аэрозоля антител на клетки-мишени, инфицированные вирусом гриппа.Fig. 11. Pharmacological action of antibody aerosol on target cells infected with influenza virus.
В культуру прикрепленных клеток МДСК вносили вирус гриппа A/Aichi/2/68, инкубировали в присутствии исследуемых аэрозольных конденсатов и далее окрашивали для выявления клеток, инфицированных вирусом. Цифрами показаны пробы: (1) - контрольные клетки, инфицированные вирусом и инкубированные без аэрозольного конденсата; (2) - клетки с вирусом гриппа, инкубированные с аэрозольным конденсатом, содержащим ингибиторы протеаз апротинин, леупептин и противовирусные антитела.Influenza virus A/Aichi/2/68 was introduced into the culture of attached MDSC cells, incubated in the presence of the studied aerosol condensates, and then stained to detect virus-infected cells. The numbers show the samples: (1) control cells infected with the virus and incubated without aerosol condensate; (2) cells with influenza virus incubated with aerosol condensate containing protease inhibitors aprotinin, leupeptin and antiviral antibodies.
Как показано на фиг. 11, в пробе с ингибиторами протеаз и антителами практически полностью отсутствуют признаки инфекции вирусом. Этот пример демонстрирует сохранение фармакологических свойств антител против самого вируса и против его деструктивного действия на клеточный монослой после аэрозольного распыления антител из комбинированного аэрозольного состава с ингибиторами протеаз и глицерина.As shown in FIG. 11, in the sample with protease inhibitors and antibodies, there are almost no signs of virus infection. This example demonstrates the preservation of the pharmacological properties of antibodies against the virus itself and against its destructive effect on the cell monolayer after aerosol spraying of antibodies from a combined aerosol formulation with protease inhibitors and glycerol.
Фиг. 12. Фармакологическое действие аэрозольного состава с интерфероном на клетки-мишени, инфицированные вирусом гриппа.Fig. 12. Pharmacological action of the aerosol composition with interferon on target cells infected with the influenza virus.
В культуру прикрепленных клеток человека Calu-3 вносили конденсат аэрозольного состава с рекомбинантным интерфероном альфа-2в и ингибитором протеаз (апротинином), дополнительно для заражения клеток вносили вирус гриппа A/PR/8/34 и инкубировали 10 часов для развития инфекции. Затем клетки фиксировали и окрашивали для выявления клеток, инфицированных вирусом. Цифрами показаны пробы: (1) - контрольные клетки, инфицированные вирусом и инкубированные без аэрозольного конденсата; (2) - клетки с вирусом гриппа, инкубированные в присутствии конденсата с ингибитором протеаз апротинина; (3) - клетки, инкубированные с аэрозольным конденсатом, содержащим ингибитор протеаз и интерферон.An aerosol condensate with recombinant interferon alfa-2b and a protease inhibitor (aprotinin) was introduced into the culture of attached human cells Calu-3, the influenza virus A/PR/8/34 was additionally introduced to infect the cells, and incubated for 10 hours to develop infection. The cells were then fixed and stained to detect virus-infected cells. The numbers show the samples: (1) control cells infected with the virus and incubated without aerosol condensate; (2) cells with influenza virus incubated in the presence of a condensate with the protease inhibitor aprotinin; (3) - cells incubated with an aerosol condensate containing a protease inhibitor and interferon.
Как демонстрирует на фиг. 12, в пробе с интерфероном значительно снижены признаки инфекции вирусом и количество инфекционных фокусов. Этот пример демонстрирует сохранение фармакологических свойств интерферона по подавлению размножения вируса после его аэрозолирования из комбинированного аэрозольного состава с ингибиторами протеаз и глицерина.As shown in FIG. 12, in the test with interferon, the signs of infection with the virus and the number of infectious foci are significantly reduced. This example demonstrates the preservation of the pharmacological properties of interferon to suppress viral reproduction after its aerosolization from a combined aerosol composition with protease inhibitors and glycerol.
Фиг. 13. Профиль дисперсности аэрозоля.Fig. 13. Aerosol dispersion profile.
По оси ординат показано содержание (%) фракции в аэрозольном облаке. По оси ординат цифрами показаны диапазоны диаметра частиц в аэрозольном облаке: 1 - (0,1-10 мкм); 2 - (10-50 мкм); 3 - 50-100 мкм); 4 - (100-240 мкм); 5 - (>250 мкм).The ordinate shows the content (%) of the fraction in the aerosol cloud. On the y-axis, the numbers show the ranges of particle diameters in the aerosol cloud: 1 - (0.1-10 microns); 2 - (10-50 microns); 3 - 50-100 microns); 4 - (100-240 microns); 5 - (>250 µm).
Источники литературыLiterature sources
1. Терехова Е.П. 2014. Ингаляционные устройства, применяемые для лечения бронхиальной астмы. Практическая Пульмонология. №4, стр. 45-52.1. Terekhova E.P. 2014. Inhalation devices used to treat bronchial asthma. Practical Pulmonology. No. 4, pp. 45-52.
2. Терехова Е.П. 2013. Современные ингаляционные устройства, применямые для лечения бронхиальной астмы (лекции для врачей). Эффективная фармакотерапия 2013, т. 39 (№3), стр. 24-39.2. Terekhova E.P. 2013. Modern inhalation devices used for the treatment of bronchial asthma (lectures for physicians). Effective Pharmacotherapy 2013, vol. 39 (No. 3), pp. 24-39.
3. Ganderton D, Lewis D, Davies R, Meakin B, Brambilla G, Church T. 2002. Modulite: a means of designing the aerosols generated by pressurized metered dose inhalers. Respir Med. 96 Suppl D: S3-8.3. Ganderton D, Lewis D, Davies R, Meakin B, Brambilla G, Church T. 2002. Modulite: a means of designing the aerosols generated by pressurized metered dose inhalers. Respir Med. 96 Suppl D: S3-8.
4. Мещерякова H.H. 2006. Модулит - новая технология в дозированных аэрозольных ингаляторах. Ингаляционная терапия. Атмосфера. Пульмонология и аллергология. №2, 40-42.4. Meshcheryakova H.H. 2006. Modulite - a new technology in metered-dose aerosol inhalers. inhalation therapy. Atmosphere. Pulmonology and Allergology. No. 2, 40-42.
5. Black D.L., McQuay M.Q., M.P. Bonin. 1996. Laser-based techniques for particle-size measurement: A review of sizing methods and their industrial applications. Progress in Energy and Combustion Science. Vol. 22 (3), pages 267-306.5. Black D.L., McQuay M.Q., M.P. Bonin. 1996. Laser-based techniques for particle-size measurement: A review of sizing methods and their industrial applications. Progress in Energy and Combustion Science. Vol. 22(3), pages 267-306.
6. Патент ЕАПО №034991. «Фармацевтический аэрозольный состав ингибитора протеаз».6. Patent EAPO No. 034991. "Pharmaceutical aerosol formulation of a protease inhibitor".
7. Патент РФ №2657523. «Фармацевтический аэрозольный состав ингибиторов протеаз с озон-сберегающим пропеллентом и его получение».7. RF patent No. 2657523. "Pharmaceutical aerosol composition of protease inhibitors with ozone-sparing propellant and its preparation".
8. Патент РФ №2711080. «Комбинированный аэрозольный состав на основе ингибиторов протеаз и его получение».8. RF patent No. 2711080. "Combined aerosol composition based on protease inhibitors and its preparation".
9. Laemmli U. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature 227, 680-685 (1970). https://doi.org/10.1038/227680a09. Laemmli U. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature 227, 680-685 (1970). https://doi.org/10.1038/227680a0
Claims (4)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2781097C1 true RU2781097C1 (en) | 2022-10-05 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0563389A1 (en) * | 1991-08-21 | 1993-10-06 | ZHIRNOV, Oleg Petrovich | Pharmaceutical aerosol preparation and its use for treatment and prophylaxis of viral diseases |
| RU2657523C2 (en) * | 2011-11-03 | 2018-06-14 | Олег Петрович Жирнов | Pharmaceutical aerosol composition of protease inhibitors with ozone-preserving propellant and its preparation |
| RU2711080C2 (en) * | 2015-06-15 | 2020-01-15 | Олег Петрович Жирнов | Combined aerosol composition based on protease inhibitors and preparation thereof |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0563389A1 (en) * | 1991-08-21 | 1993-10-06 | ZHIRNOV, Oleg Petrovich | Pharmaceutical aerosol preparation and its use for treatment and prophylaxis of viral diseases |
| RU2657523C2 (en) * | 2011-11-03 | 2018-06-14 | Олег Петрович Жирнов | Pharmaceutical aerosol composition of protease inhibitors with ozone-preserving propellant and its preparation |
| RU2711080C2 (en) * | 2015-06-15 | 2020-01-15 | Олег Петрович Жирнов | Combined aerosol composition based on protease inhibitors and preparation thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| HUI-LING LIN et al. Hypertonic saline enhances the efcacy of aerosolized gentamicin against Pseudomonas aeruginosa //Scientific Reports, volume 10, 2020, рр.1-9. JOHN V. BENNETT et al. Aerosolized measles and measles-rubella vaccines induce better measles antibody booster responses than injected vaccines: randomized trials in Mexican schoolchildren //Bulletin of the World Health Organization 2002, 80 (10), рр.806-812. SUZY HUIJGHEBAERT et al. Does Trypsin Oral Spray (Viruprotect®/ColdZyme®) Protect against COVID-19 and Common Colds or Induce Mutation? Caveats in Medical Device Regulations in the European Union // Int. J. Environ. Res. Public Health, 2021, 18(10), 5066, Published: 11 May 2021. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chang et al. | Phage therapy for respiratory infections | |
| US10959969B1 (en) | Methods of treating SARS Cov-2 virus with protocatechuic acid | |
| ES2389864T3 (en) | Dry powder compositions and systems for poultry vaccination | |
| JP2008523153A (en) | Compositions and methods for reducing disease transmission | |
| JP2774379B2 (en) | Pharmaceutical aerosol compositions and their use in treating and preventing viral diseases | |
| EP2046316A1 (en) | Antiviral use of cationic surfactant | |
| ES2579181T3 (en) | Isolated nut extract, procedure for obtaining and using it | |
| JP2011157405A (en) | Formulation limiting spread of pulmonary infection | |
| JP2022525177A (en) | The process of making stable bacterial extracts and their use as pharmaceuticals | |
| CN115721726B (en) | Nasal product for preventing or relieving cold symptoms and preparation method thereof | |
| US20200054595A1 (en) | EGCG-Palmitate Compositions and Methods of Use Thereof | |
| ES2928399T3 (en) | Bactericidal pharmaceutical composition comprising ibuprofen | |
| CA2784973C (en) | New synergistic compositions for the treatment of topical viral infections | |
| WO2022036774A1 (en) | Application of tannic acid in preparation of anti-respiratory virus drug | |
| RU2781097C1 (en) | Pharmaceutical aerosol composition of polyvalent action | |
| RU2123328C1 (en) | Liposomal antiviral drug for oral using | |
| KR20080084992A (en) | Uses of Elderberry Extract | |
| EA047991B1 (en) | COMBINED PHARMACEUTICAL AEROSOL COMPOSITION OF WATER-BASED PROTEASE INHIBITORS AND ITS APPLICATION | |
| US20050220720A1 (en) | Formulations limiting spread of pulmonary infections | |
| US20230218557A1 (en) | A fatty acid based composition for treatment and/or prevention of enveloped-virus related infections | |
| RU2118163C1 (en) | Drug for treatment of patients with viral disease | |
| US20230226136A1 (en) | A synergistic formulation for management of respiratory pathogens including coronaviruses | |
| RU2750933C1 (en) | Method for testing the biological activity of aerosol preparations | |
| ES2280941T3 (en) | USE OF 2-MERCAPTOETHANOSULFONATE AS AN ANTI-VIRAL. | |
| JP2023143850A (en) | Composition for preventing coronavirus infection |