RU2780780C2

RU2780780C2 - Prediction of efficiency of using radiation therapy

Info

Publication number: RU2780780C2
Application number: RU2020143489A
Authority: RU
Inventors: Владимир Константинович Боженко; Татьяна Михайловна Кулинич; Екатерина Левановна Джикия; Ольга Сергеевна Регентова; Олег Ильич Щербенко
Filing date: 2020-12-28
Publication date: 2022-09-30

Abstract

FIELD: medicine; laboratory and molecular diagnostics; oncology; radiation therapy.

SUBSTANCE: invention relates to medicine, namely to laboratory and molecular diagnostics, oncology, and radiation therapy; it can be used for the prediction of efficiency of radiation therapy in children with diffuse brain stem tumor. Peripheral blood plasma is taken from a patient before radiation therapy, at different stages of the radiation therapy course, and after radiation therapy. At each stage of blood taking, using digital drop PCR (ddPCR), a concentration of a mutant form of BRAF(V600E) is determined. If the concentration of the mutant form of BRAF(V600E) is increased in the beginning of the radiation therapy course and is decreased to its end, then the efficiency of radiation therapy is predicted.

EFFECT: method provides a possibility of prediction of efficiency of radiation therapy in children with diffuse brain stem tumor due to determination of dynamics of levels of concentration of a mutant form of BRAF(V600E) during treatment.

3 cl, 1 dwg

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной и молекулярной диагностике, онкологии и лучевой терапии, и предназначено для прогнозирования эффективности лучевой терапии у детей с диффузно растущими глиомами ствола мозга. Способ прогнозирования эффективности лучевой терапии у пациентов с детскими диффузными срединными глиомами (ДГСМ), включает исследование периферической крови, в качестве «жидкостной биопсии», где по циркулирующей в плазме крови опухолевой ДНК (цоДНК) оценивается концентрация мутантной формы BRAF(V600E) и ее изменение в процессе лечения. Повышение концентрации в жидкостной биопсии мутантной формы BRAF(V600E) в процессе лечения коррелирует с лучшим прогнозом.The invention relates to medicine, namely to laboratory and molecular diagnostics, oncology and radiation therapy, and is intended to predict the effectiveness of radiation therapy in children with diffusely growing brainstem gliomas. A method for predicting the effectiveness of radiation therapy in patients with childhood diffuse median gliomas (DHCM), includes the study of peripheral blood, as a "liquid biopsy", where the concentration of the mutant form of BRAF (V600E) and its change is estimated from the circulating tumor DNA (cDNA) in the blood plasma in the course of treatment. Increasing the concentration of the BRAF(V600E) mutant in a liquid biopsy during treatment correlates with a better prognosis.

Наиболее частым патологическим процессом в области ствола мозга у детей являются опухоли (ОСГМ). Удельный вес этой патологии среди всех новообразований ЦНС в детском и подростковом возрасте составляет от 10 до 15%, но, в то же время, она является причиной смерти около 40% всех детей, заболевших опухолями головного мозга [Ostrom Q.T. et al., 2014]. Пик заболевания приходится на 7-8 лет, частота заболеваний примерно одинакова для лиц обоего пола [Щербенко О.И. и соваторы, 2014]. В 80% случаев ОСГМ локализуются в области моста и растут инфильтративно [Кит О.И. и соваторы, 2017]. Значительно реже, в 15-20% случаев, ОСГМ растут преимущественно экзофитно, обозначаясь как задние экзофитные цервико-медуллярные глиомы и очаговые тектальные глиомы. Инфильтративно растущие ОСГМ являются наиболее тяжелой формой патологии. Радикальное хирургическое лечение этих опухолей сопровождается риском тяжелой инвалидизации и даже смерти больного, так как они расположены близко к ядрам черепно-мозговых нервов и проводящим путям, находящимся в области ствола. Возможность получение биопсийного материала также крайне ограничена, а ребиопсия во время прогрессирования практически не возможна [Pfaff Е. et al., 2019; Щербенко О.И. и соваторы, 2019; Panditharatna Е., et al., 2018]. В связи с этим крайне актуальным/важным является поиск не инвазивных методов, позволяющих получить клинически важную информацию о генетическом статусе опухоли, таких метод «жидкостной биопсии».The most common pathological process in the region of the brain stem in children is tumors (MTBs). The proportion of this pathology among all neoplasms of the central nervous system in childhood and adolescence is from 10 to 15%, but at the same time, it is the cause of death of about 40% of all children with brain tumors [Ostrom Q.T. et al., 2014]. The peak of the disease falls on 7-8 years, the frequency of diseases is approximately the same for both sexes [Shcherbenko O.I. and co-authors, 2014]. In 80% of cases, OSGM are localized in the region of the bridge and grow infiltratively [Kit O.I. and co-authors, 2017]. Much less often, in 15-20% of cases, CBMs grow predominantly exophytically, designated as posterior exophytic cervico-medullary gliomas and focal tectal gliomas. Infiltratively growing OSBMs are the most severe form of pathology. Radical surgical treatment of these tumors is accompanied by the risk of severe disability and even death of the patient, since they are located close to the nuclei of the cranial nerves and pathways located in the trunk region. The possibility of obtaining biopsy material is also extremely limited, and rebiopsy during progression is practically impossible [Pfaff E. et al., 2019; Shcherbenko O.I. and co-authors, 2019; Panditharatna E., et al., 2018]. In this regard, it is extremely relevant/important to search for non-invasive methods that allow obtaining clinically important information about the genetic status of the tumor, such as the “liquid biopsy” method.

Основным методом лечения ОСГМ в настоящее время являются лучевая и химиолучевая терапия, но у большинства больных достигаемый эффект имеет временный характер: через различные интервалы времени опухоль возобновляет рост и двухлетний срок переживают только 10-15% больных [Guillamo J.S. et al., 2001; Veldhuijzen van Zanten D.S.E.M. et al., 2017]. В ситуации, когда после короткого периода относительного благополучия, достигнутого в результате лучевой терапии, наступает ухудшение состояния ребенка, перед врачом встает сложная проблема оказания реальной помощи больному. Поиск наиболее рациональных и эффективных вариантов оказания помощи таким детям определяет актуальность исследования. Достигнутые в последние годы успехи в использовании молекулярно-генетических характеристик опухоли для диагностики и прогнозирования течения эмбриональных опухолей мозга [Kumar R. et al., 2018] дают надежду для достижения прогресса и при глиальных опухолях. Становится реальной перспектива использования информации о молекулярных особенностях глиом для прогнозирования течения, индивидуализации тактики и создания таргетных препаратов.Radiation and chemoradiation therapy are currently the main methods of treatment for OSGM, but in most patients the achieved effect is temporary: at various time intervals, the tumor resumes growth and only 10-15% of patients survive a two-year period [Guillamo J.S. et al., 2001; Veldhuijzen van Zanten D.S.E.M. et al., 2017]. In a situation where, after a short period of relative well-being achieved as a result of radiation therapy, the child's condition worsens, the doctor faces the difficult problem of providing real assistance to the patient. The search for the most rational and effective options for helping such children determines the relevance of the study. The recent advances in using tumor molecular genetic characteristics for diagnosing and predicting the course of embryonic brain tumors [Kumar R. et al., 2018] give hope for progress in glial tumors as well. The prospect of using information about the molecular features of gliomas to predict the course, individualize tactics, and create targeted drugs is becoming real.

Проведенные в последние годы молекулярно-генетические исследования опухолей мозга позволили выявить ряд полезных для диагностики и планирования лечения маркеров при различных морфологических вариантах. Роль одного из важных молекулярных маркеров в нейроонкологии отводится гену BRAF. Протоонкоген BRAF - часть семейства сериновых/треониновых протеинкиназ, которые участвуют в MAPK/ERK сигнальном пути, регулируют клеточную дифференцировку, пролиферацию и миграцию [Roberts P.J. et al., 2007] и играют важнейшую роль в патогенезе различных видов рака. В нейроонкологии, наиболее диагностически ценными являются следующие мутации в гене BRAF: соматическая точечная мутация BRAF-V600E и соматическая fusion-мутация - генов KIAA1549-BRAF. Мутации BRAF-V600E чаще всего встречаются в плеоморфной ксантоастроцитоме, ганглиоглиоме, эпителиоидных глиобластомах и глиомах, диагностированных в более молодом возрасте. Мутация V600E присутствует у 15% диффузно инфильтративных педиатрических астроцитом II-IV степени злокачественности [Santiago-Dieppa D.R., et al, 2018]. Частота обнаружения мутации возрастает до 25% в педиатрических и взрослых ганглиоглиомах и достигает рекордного максимума - около 80% в плеоморфных ксантоастроцитомах [Veldhuijzen van Zanten S.E. et al., 2016]. Мутации BRAF-V600E, распространена в подмножестве глиом и может представлять собой потенциальный прогностический маркер. По данным мета- исследования [Нuу Gia Vuong et al., 2018], основанного на анализе 11 статей и 1308 пациентов с глиомой, было показано, что мутация V600E в гене BRAF связана с улучшением общей выживаемости (OS) у пациентов (HR=0,60; 95% CI=0,44-0,80). Результаты для выживаемости без прогрессирования (PFS), однако, не были статистически значимыми (HR=1.39; 95% CI=0.82-2.34). При разделение пациентов по группам, основанным на возрасте, наличие мутации V600E в гене BRAF ассоциировалось с улучшение выживаемости у детей и в группе молодых взрослых (до 35 лет), но не имело прогностического значения у пожилых пациентов. Кроме того, мутация V600E BRAF была связана только с благоприятным прогнозом при глиомах более низкой степени злокачественности. Проведенный мета-анализ свидетельствует о том, что мутация V600E в гене BRAF оказывает благоприятное прогностическое влияние на глиомы и ее прогностическая ценность может зависеть от возраста пациента и степени злокачественности опухоли.Molecular genetic studies of brain tumors conducted in recent years have made it possible to identify a number of markers useful for diagnosis and treatment planning in various morphological variants. The role of one of the important molecular markers in neurooncology is assigned to the BRAF gene. The BRAF proto-oncogene is part of a family of serine/threonine protein kinases that are involved in the MAPK/ERK signaling pathway and regulate cell differentiation, proliferation, and migration [Roberts P.J. et al., 2007] and play an important role in the pathogenesis of various types of cancer. In neurooncology, the following mutations in the BRAF gene are the most diagnostically valuable: the somatic point mutation BRAF-V600E and the somatic fusion mutation of the KIAA1549-BRAF genes. BRAF-V600E mutations are most common in pleomorphic xanthoastrocytoma, ganglioglioma, epithelioid glioblastomas, and gliomas diagnosed at younger ages. The V600E mutation is present in 15% of diffusely infiltrative grade II-IV pediatric astrocytomas [Santiago-Dieppa D.R., et al, 2018]. The frequency of mutation detection increases to 25% in pediatric and adult gangliogliomas and reaches a record high of about 80% in pleomorphic xanthoastrocytomas [Veldhuijzen van Zanten S.E. et al., 2016]. BRAF-V600E mutations are common in a subset of gliomas and may represent a potential prognostic marker. According to a meta-study [Huy Gia Vuong et al., 2018], based on an analysis of 11 articles and 1308 patients with glioma, it was shown that the V600E mutation in the BRAF gene is associated with improved overall survival (OS) in patients (HR=0 .60, 95% CI=0.44-0.80). Results for progression-free survival (PFS), however, were not statistically significant (HR=1.39; 95% CI=0.82-2.34). When patients were divided into groups based on age, the presence of the V600E mutation in the BRAF gene was associated with improved survival in children and in the group of young adults (under 35 years), but had no prognostic value in elderly patients. In addition, the V600E BRAF mutation was only associated with a favorable prognosis in lower-grade gliomas. The meta-analysis performed indicates that the V600E mutation in the BRAF gene has a favorable prognostic effect on gliomas and its prognostic value may depend on the patient's age and tumor grade.

В связи с этим нам представилось целесообразным при помощи метода «жидкостной биопсии» по циркулирующей в плазме крови опухолевой ДНК (цоДНК) изучить выявление и динамику концентрации в процессе лучевой терапии мутантной формы BRAF(V600E) при ДГСМ и других локализациях глиом мозга у детей.In this regard, it seemed reasonable to us, using the “liquid biopsy” method of tumor DNA (cDNA) circulating in the blood plasma, to study the detection and concentration dynamics of the BRAF(V600E) mutant form during radiation therapy in DHSM and other localizations of brain gliomas in children.

Метод разработан в ФГБУ «Российский научный центр Рентгенорадиологии» Минздрава России и основана на оценке изменения уровня концентрации мутантной формы BRAF(V600E) в процессе лучевой терапии методом цифровой капельной ПЦР (ddPCR) в материале жидкостной биопсии.The method was developed at the Federal State Budgetary Institution “Russian Scientific Center for Radiological Radiology” of the Ministry of Health of Russia and is based on the assessment of changes in the concentration of the BRAF(V600E) mutant form during radiation therapy using digital droplet PCR (ddPCR) in liquid biopsy material.

Задачей изобретения является создание метода, позволяющего прогнозировать эффективность лучевой терапии у пациентов детского возраста с диффузными опухолями ствола головного мозга.The objective of the invention is to create a method to predict the effectiveness of radiation therapy in pediatric patients with diffuse tumors of the brain stem.

Для решения поставленной задачи в способе прогнозирования эффективности лучевой терапии у пациентов детского возраста с диффузными опухолями ствола головного мозга проводится забор периферической венозной крови в объеме не менее 2,5 мл четыре раза за период лечения. Образцы получают до начала курса лучевой терапии (ЛТ); на 3-5-й день; 14-18 день после начала ЛТ и после окончания ЛТ. Подготовка плазмы и выделение циркулирующей ДНК проводятся в максимально короткие сроки после получения образцов крови, не более 30 минут после забора крови. Скрининг мутации BRAF (V600E) проводится методом цифровой капельной ПЦР (Digital Droplet PCR, ddPCR). Анализ и обработка результатов осуществляется с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel 2013 (Microsoft Corporation, США) и Statistica 10.0 (StatSoft Inc., США). Оценивается динамика изменения концентрации мутантной формы BRAF(V600E) в процессе лучевой терапии, увеличение концентрации BRAF(V600E) в процессе лучевой терапии коррелирует с положительным прогнозом лечения.To solve the problem in the method for predicting the effectiveness of radiation therapy in pediatric patients with diffuse tumors of the brain stem, peripheral venous blood is taken in a volume of at least 2.5 ml four times during the treatment period. Samples are obtained before the start of a course of radiation therapy (RT); on the 3-5th day; 14-18 days after the start of RT and after the end of RT. Plasma preparation and isolation of circulating DNA are carried out as soon as possible after receiving blood samples, no more than 30 minutes after blood sampling. Screening for BRAF mutation (V600E) is carried out by digital droplet PCR (Digital Droplet PCR, ddPCR). Analysis and processing of the results is carried out using the Microsoft Excel 2013 (Microsoft Corporation, USA) and Statistica 10.0 (StatSoft Inc., USA) software package. The dynamics of changes in the concentration of the mutant form of BRAF(V600E) during radiation therapy is assessed; an increase in the concentration of BRAF(V600E) during radiation therapy correlates with a positive treatment prognosis.

Способ осуществляют следующим образом.The method is carried out as follows.

Были исследованы 146 образцов плазмы периферической крови, полученные от 60 пациентов, из них у 31 был установлен диагноз ДГСМ и у 29 другие глиальные опухоли головного мозга. Образцы получали до начала курса ЛТ; на 3-5-й; 14-18 день после начала ЛТ и после окончания ЛТ. По результатам проведенной лучевой терапии, пациенты были разделены на две группы: 1-я - наступление рецидива опухоли менее, чем через 6 месяцев после окончания курса ЛТ; 2 - стабилизация процесса, отсутствие рецидива, в течение 6 и более месяцев после окончания курса ЛТ.We studied 146 peripheral blood plasma samples obtained from 60 patients, of which 31 were diagnosed with DHCM and 29 with other glial brain tumors. Samples were obtained prior to the start of the RT course; on the 3-5th; 14-18 days after the start of RT and after the end of RT. According to the results of the radiation therapy, the patients were divided into two groups: 1st - the onset of tumor recurrence less than 6 months after the end of the RT course; 2 - stabilization of the process, no recurrence, within 6 months or more after the end of the course of RT.

Подготовки качественной плазмы проводилась сразу после получения образца крови, время от забора до подготовки составляло не более 30 минут. Подготовку плазмы и последующее выделение циркулирующей ДНК проводили согласно протоколу фирмы производителя, использовали наборы фирмы Sileks на основе частиц SileksMagNA-Direct (избирательное связывание нуклеиновых кислот).Preparation of high-quality plasma was carried out immediately after receiving a blood sample, the time from sampling to preparation was no more than 30 minutes. Plasma preparation and subsequent isolation of circulating DNA were performed according to the manufacturer's protocol; Sileks kits based on SileksMagNA-Direct particles (selective binding of nucleic acids) were used.

Высокочувствительный скрининг мутации BRAF (V600E) проводили методом Digital Droplet PCR (ddPCR) с использованием наборов BRAF V600E Screening Kit (Bio-Rad, USA) и системы QX100™ Droplet Digital™ PCR System (Bio-Rad, США). Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel 2013 (Microsoft Corporation, США) и Statistica 10.0 (StatSoft Inc., США).Highly sensitive screening for BRAF mutation (V600E) was performed by Digital Droplet PCR (ddPCR) using BRAF V600E Screening Kit (Bio-Rad, USA) and QX100™ Droplet Digital™ PCR System (Bio-Rad, USA). Statistical processing of the results was carried out using the Microsoft Excel 2013 (Microsoft Corporation, USA) and Statistica 10.0 (StatSoft Inc., USA) software package.

При сравнении результатов исследования мутационного статуса по плазме крови 11 больных различными локализациями глиом методом ddPCR и их же гистологических препаратов, полученных в результате операции, методом NGS установлено полное совпадение как положительных, так и отрицательных данных. Это дало основание для использования метода ddPCR при оценке мутационного статуса опухоли по циркулирующей в плазме крови опухолевой ДНК.When comparing the results of the study of the mutational status in the blood plasma of 11 patients with different localizations of gliomas using the ddPCR method and their own histological preparations obtained as a result of the operation, using the NGS method, a complete coincidence of both positive and negative data was established. This gave grounds for using the ddPCR method in assessing the mutational status of a tumor based on tumor DNA circulating in blood plasma.

В целях выявления возможности прогнозирования течения заболевания, по молекулярно-генетическим признакам нами было проведено исследование динамики содержания опухолевой ДНК в плазме крови больных ДГСМ в процессе лучевой терапии и после ее окончания. Для этого был проведен дискриминантный анализ, в котором в качестве переменных использованы данные о концентрации циркулирующих в плазме крови, как мутантных, так и молекул дикого типа опухолевой ДНК (цоДНК), а также ряд клинических данных. Было установлено, что соотношение концентрация ДНК гена BRAF с мутацией V600E у больных с более благоприятным течением опухоли увеличивается в начале курса радиотерапии и снижается к концу ее. У больных с ранним рецидивом опухоли к концу курса лечения концентрация этого мутантного гена, напротив, не изменяется или возрастает (рис. 1)In order to identify the possibility of predicting the course of the disease, according to molecular genetic features, we conducted a study of the dynamics of the content of tumor DNA in the blood plasma of patients with DHCM during and after radiation therapy. To do this, a discriminant analysis was performed, in which data on the concentration of circulating in blood plasma, both mutant and wild-type tumor DNA molecules (cDNA), as well as a number of clinical data, were used as variables. It was found that the ratio of the concentration of the BRAF gene DNA with the V600E mutation in patients with a more favorable course of the tumor increases at the beginning of the course of radiotherapy and decreases towards the end of it. In patients with early tumor recurrence, by the end of the course of treatment, the concentration of this mutant gene, on the contrary, does not change or increases (Fig. 1)

Рис. 1. Динамика содержания мутантных форм ДНК гена BRAF в процессе лучевой терапии в зависимости от наличия или отсутствия прогрессирования опухоли.Rice. Fig. 1. Dynamics of the content of mutant DNA forms of the BRAF gene during radiation therapy depending on the presence or absence of tumor progression.

Полученные данные свидетельствуют, что с помощью метода «жидкостной биопсии» можно определить наличие в плазме крови цоДНК специфичных для глиальных опухолей молекулярно-генетических маркеров и проследить их динамику в процессе лучевой терапии с возможным использованием полученных данных в прогнозировании течения заболевания. Различия в динамике содержания маркеров в процессе лучевой терапии у больных глиомами и ДГСМ могут быть также объяснены большей гетерогенностью структуры ДГСМ. Среди которых присутствуют опухоли лучше поддающиеся ионизирующей радиации, в результате чего на первом этапе концентрация мутировавшей ДНК в плазме крови повышается, а по мере девитализации основной популяции клеток опухоли к концу курса лечения она снижается.The data obtained indicate that using the method of "liquid biopsy" it is possible to determine the presence in the blood plasma of ctDNA specific for glial tumors of molecular genetic markers and trace their dynamics during radiation therapy with the possible use of the obtained data in predicting the course of the disease. Differences in the dynamics of the content of markers during radiation therapy in patients with gliomas and DHCM can also be explained by the greater heterogeneity of the DHCM structure. Among which there are tumors that are better amenable to ionizing radiation, as a result of which, at the first stage, the concentration of mutated DNA in the blood plasma increases, and as the main population of tumor cells devitalizes by the end of the course of treatment, it decreases.

1. Относительная концентрация мутаций BRAF (V600E), в плазме крови больных диффузно растущими опухолями ствола мозга выше, чем при глиомах других локализаций.1. The relative concentration of BRAF (V600E) mutations in the blood plasma of patients with diffusely growing tumors of the brain stem is higher than in gliomas of other localizations.

2. Повышение концентрации в плазме крови мутантной формы BRAF(V600E) коррелирует с лучшим прогнозом.2. An increase in the plasma concentration of the mutant form of BRAF(V600E) correlates with a better prognosis.

3. Динамический контроль концентрации опухолевой ДНК содержащей мутацию BRAFV600E в плазме крови у детей с опухолями головного мозга в процессе лучевой терапии может быть использован для прогноза эффективности ЛТ. На основании анализа динамики уровней концентрации мутантной цоДНК в процессе лечения, возможно предсказание рецидива опухоли после лучевой терапии с достоверностью 96%.3. Dynamic control of the concentration of tumor DNA containing the BRAFV600E mutation in the blood plasma of children with brain tumors during radiation therapy can be used to predict the effectiveness of RT. Based on the analysis of the dynamics of mutant ctDNA concentration levels during treatment, it is possible to predict tumor recurrence after radiation therapy with a 96% certainty.

Claims

1. A method for predicting the effectiveness of radiation therapy in children with a diffuse tumor of the brain stem, including

(a) collection of peripheral blood plasma from the patient before radiation therapy, at different stages of the course of radiation therapy and after radiation therapy;

(b) determination by digital droplet PCR (ddPCR) of the concentration of the mutant form of BRAF(V600E) at each stage of blood sampling;

(c) processing of measurement results,

if the concentration of the mutant form of BRAF(V600E) increases at the beginning of the course of radiotherapy and decreases towards the end of it, then the effectiveness of radiotherapy is predicted.

2. A method for predicting the effectiveness of radiation therapy according to claim 1, characterized in that radiation therapy is used for diffusely growing medium-sized gliomas (DGSM).

3. A method for predicting the effectiveness of radiation therapy according to claim 1, characterized in that peripheral blood plasma samples were obtained before the start of a course of radiation therapy; on the 3-5th; 14-18 days after the start of radiation therapy and after the end of radiation therapy.