RU2776455C2 - Method for in vitro determination of biocompatibility of scaffolds for neurotransplantation - Google Patents
Method for in vitro determination of biocompatibility of scaffolds for neurotransplantation Download PDFInfo
- Publication number
- RU2776455C2 RU2776455C2 RU2020143932A RU2020143932A RU2776455C2 RU 2776455 C2 RU2776455 C2 RU 2776455C2 RU 2020143932 A RU2020143932 A RU 2020143932A RU 2020143932 A RU2020143932 A RU 2020143932A RU 2776455 C2 RU2776455 C2 RU 2776455C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- scaffold
- cells
- calcium
- culture
- scaffolds
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 68
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 42
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims abstract description 42
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 42
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims abstract description 30
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 21
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 claims abstract description 18
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 claims abstract description 18
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims abstract description 13
- 230000003562 morphometric effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims abstract description 10
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 claims abstract description 5
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 5
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims abstract description 5
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims abstract description 4
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 4
- BRJCLSQFZSHLRL-UHFFFAOYSA-N oregon green 488 Chemical compound OC(=O)C1=CC(C(=O)O)=CC=C1C1=C2C=C(F)C(=O)C=C2OC2=CC(O)=C(F)C=C21 BRJCLSQFZSHLRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 238000004621 scanning probe microscopy Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 abstract description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 102000003705 Syndecan-1 Human genes 0.000 description 4
- 108090000058 Syndecan-1 Proteins 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 4
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 4
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 3
- 102100039037 Vascular endothelial growth factor A Human genes 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 2
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 2
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 2
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000009529 traumatic brain injury Effects 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 101600082430 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A (isoform VEGF165) Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102300041083 Vascular endothelial growth factor A isoform VEGF165 Human genes 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 125000004386 diacrylate group Chemical group 0.000 description 1
- GYZLOYUZLJXAJU-UHFFFAOYSA-N diglycidyl ether Chemical compound C1OC1COCC1CO1 GYZLOYUZLJXAJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 210000001951 dura mater Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N flavin mononucleotide Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- VOZRXNHHFUQHIL-UHFFFAOYSA-N glycidyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCC1CO1 VOZRXNHHFUQHIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000004295 hippocampal neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000001053 micromoulding Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000002074 nanoribbon Substances 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007971 neurological deficit Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920000767 polyaniline Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000005062 synaptic transmission Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000563 toxic property Toxicity 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Предлагаемое изобретение относится к области медицины (нейрохирургия, регенеративная медицина) и нейробиологии, касается способа in vitro определения биосовместимости скаффолдов для нейротрансплантации, который может быть использован для первичной оценки биосовместимости и безопасности применения скаффолдов для нейротрансплантации.The present invention relates to the field of medicine (neurosurgery, regenerative medicine) and neurobiology, concerns an in vitro method for determining the biocompatibility of scaffolds for neurotransplantation, which can be used for the initial assessment of biocompatibility and safety of the use of scaffolds for neurotransplantation.
На сегодняшний день остро стоит проблема восстановления ткани головного мозга после повреждений различного генеза. Потеря структурных и функциональных элементов центральной нервной системы влечет за собой рост острого неврологического дефицита, нарушение когнитивных функций (Mishchenko et al. Features of Primary Hippocampal Cultures Formation on Scaffolds Based on Hyaluronic Acid Glycidyl Methacrylate. 2018. CTM, Killen et al. Metabolism and inflammation: implications for traumatic brain injury therapeutics. 2019. Expert Review of Neurotherapeutics). Отсутствие эффективного лечения может привести к значительным ухудшениям состояния здоровья пациентов вплоть до глубокой инвалидизации. Перспективным подходом для преодоления данной проблемы является использование биоинженерных конструктов (скаффолдов), применение которых позволит поддерживать необходимую анатомическую структуру в зоне поражения с целью обеспечения свободного транспорта биологических жидкостей и постепенного его замещения естественной нервной тканью.Today, there is an acute problem of restoring brain tissue after injuries of various origins. The loss of structural and functional elements of the central nervous system entails an increase in acute neurological deficit, cognitive impairment (Mishchenko et al. Features of Primary Hippocampal Cultures Formation on Scaffolds Based on Hyaluronic Acid Glycidyl Methacrylate. 2018. CTM, Killen et al. Metabolism and inflammation : implications for traumatic brain injury therapeutics, 2019. Expert Review of Neurotherapeutics). The lack of effective treatment can lead to significant deterioration in the health of patients up to a deep disability. A promising approach to overcome this problem is the use of bioengineered constructs (scaffolds), the use of which will allow maintaining the necessary anatomical structure in the affected area in order to ensure free transport of biological fluids and its gradual replacement with natural nervous tissue.
Скаффолды представляют собой трехмерные биоактивные матриксы, способствующие морфологическому и функциональному восстановлению тканей головного мозга после различного рода повреждений или хирургических вмешательств.Scaffolds are three-dimensional bioactive matrices that contribute to the morphological and functional recovery of brain tissues after various types of injuries or surgical interventions.
Для успешного приживления и стимулирования регенеративных процессов нейротрансплантаты должны обладать рядом свойств, в частности, биосовместимостью, отсутствием цитотоксичности и иммунологического отторжения, наличием адгезивной поверхности, контролируемой скоростью биодеградации, оптимальным размером пор для пространственного распределения клеток и васкуляризации, а также для поддержания нормального метаболизма и выживаемости клеток (Smith et al. Development of Self-Assembled Nanoribbon Bound Peptide-Polyaniline Composite Scaffolds and Their Interactions with Neural Cortical Cells. 2018. Bio engineering, Dave, Gomes. Interactions at scaffold interfaces: Effect of surface chemistry, structural attributes and bioaffinity. 2019. Materials Science & Engineering).For successful engraftment and stimulation of regenerative processes, neurotransplants must have a number of properties, in particular, biocompatibility, the absence of cytotoxicity and immunological rejection, the presence of an adhesive surface, a controlled biodegradation rate, an optimal pore size for spatial distribution of cells and vascularization, as well as to maintain normal metabolism and survival. cells (Smith et al. Development of Self-Assembled Nanoribbon Bound Peptide-Polyaniline Composite Scaffolds and Their Interactions with Neural Cortical Cells. 2018. Bio engineering, Dave, Gomes. Interactions at scaffold interfaces: Effect of surface chemistry, structural attributes and bioaffinity. 2019. Materials Science & Engineering).
Ключевым критерием возможности применения скаффолдов считается биосовместимость, поэтому перед непосредственным их использованием при нейрохирургических операциях важно определить наличие/отсутствие цитотоксического воздействия конструктов на клетки головного мозга.The key criterion for the possibility of using scaffolds is considered to be biocompatibility, therefore, before their direct use in neurosurgical operations, it is important to determine the presence / absence of a cytotoxic effect of constructs on brain cells.
Так, например, известен носитель для трансплантируемых клеток для замещения дефекта, полученного при черепно-мозговой травме (скаффолд), для определения биосовместимости которого использовалась визуализация целостности ткани мозга с помощью МРТ и тестирование когнитивного поведения мышей (RU 2659842 С2, кл. А61В 17/00, A61K 31/722, A61K 31/728, опубл. 04.07.2018 г.).So, for example, a carrier is known for transplantable cells to replace a defect resulting from a traumatic brain injury (scaffold), to determine the biocompatibility of which visualization of the integrity of the brain tissue using MRI and testing the cognitive behavior of mice was used (RU 2659842 C2, class A61B 17/ 00, A61K 31/722, A61K 31/728, published 07/04/2018).
Известен способ получения искусственной твердой мозговой оболочки на основе коллагена, влияние которой на ткани головного мозга крыс оценивалось только с помощью иммуногистологического исследования (RU 2723738 С1, кл. A61F 2/02, А61Р 25/00, А61Р 41/00, опубл. 17.06.2020 г.).A known method of obtaining an artificial dura mater based on collagen, the effect of which on the brain tissue of rats was evaluated only using immunohistological studies (RU 2723738 C1, class A61F 2/02, A61P 25/00, A61P 41/00, publ. 17.06. 2020).
Минусом указанных способов является не всестороннее исследование, недостаточное для определения биосовместимости имплантов.The disadvantage of these methods is not a comprehensive study, insufficient to determine the biocompatibility of implants.
Известен способ определения цитотоксичности трансплантатов, основанный на количественном анализе клеточной составляющей скаффолда с использованием окрашивания образцов флуорохромом Hoechst, обладающим высокой специфичностью к двухцепочечной молекуле ДНК, и проведении флуоресцентной микроскопии (RU №2675376 С1, кл. G01N 33/52, опубл. 19.12.2018 г.). Данный метод подходит для клеточных культур, способных к делению, например, мезенхимальных стволовых клеток, фибробластов, в связи с чем не может быть применим для первичных нейрональных культур.There is a known method for determining the cytotoxicity of grafts, based on a quantitative analysis of the cellular component of the scaffold using staining of samples with Hoechst fluorochrome, which has a high specificity for a double-stranded DNA molecule, and conducting fluorescent microscopy (RU No. 2675376 C1, class G01N 33/52, publ. 12/19/2018 G.). This method is suitable for cell cultures capable of dividing, for example, mesenchymal stem cells, fibroblasts, and therefore cannot be applied to primary neuronal cultures.
Известен способ микроскопической оценки цитотоксичности компонентов материалов скаффолдов, в соответствии с которым проводят инкубацию эритроцитов с компонентами материалов конструктов при 37°С в течение 30 мин., после чего эритроциты смешивают с аутологичной плазмой крови, помещают каплю на предметное стекло и проводят микрофотосъемку с объективом 100×. Цитотоксичность трансплантатов оценивают по изменению морфологии эритроцитов и их агрегатов в аутологичной плазме крови (RU 2653476 С1, кл. G01N 33/48, опубл. 08.05.2018 г.).A known method of microscopic assessment of the cytotoxicity of the components of scaffold materials, according to which the erythrocytes are incubated with the components of the materials of the constructs at 37°C for 30 minutes, after which the erythrocytes are mixed with autologous blood plasma, a drop is placed on a glass slide and microphotography is carried out with a lens ×. Graft cytotoxicity is assessed by changes in the morphology of erythrocytes and their aggregates in autologous blood plasma (RU 2653476 C1, class G01N 33/48, publ. 05/08/2018).
Известен способ оценки биосовместимости скаффолдов, включающий имплантацию скаффолда подкожно крысам, в котором после 7 суток имплантации под наркозом выполняется забор крови в объеме 3-5 мл и определение концентрации фактора роста эндотелия сосудов-A (VEGF) и синдекана-1, рассчитываются их соотношение, для нормировки величины соотношения концентраций VEGF и синдекана-1 ее умножают на поправочный коэффициент К, определяемый как соотношение медианного значения концентраций синдекана-1 и VEGF у интактных животных, если нормированная величина соотношения концентраций VEGF и синдекана-1 не превышает 2, считается, что скаффолд является не биосовместимым (RU №2714461 С1, кл. G09B 23/28, опубл. 17.02.2020 г.).A known method for assessing the biocompatibility of scaffolds, including implantation of the scaffold subcutaneously in rats, in which after 7 days of implantation under anesthesia, blood is taken in a volume of 3-5 ml and the concentration of vascular endothelial growth factor-A (VEGF) and syndecan-1 is determined, their ratio is calculated, to normalize the ratio of VEGF and syndecan-1 concentrations, it is multiplied by the correction factor K, defined as the ratio of the median value of syndecan-1 and VEGF concentrations in intact animals, if the normalized value of the ratio of VEGF and syndecan-1 concentrations does not exceed 2, it is considered that the scaffold is not biocompatible (RU No. 2714461 C1, class G09B 23/28, published on February 17, 2020).
Несмотря на то, что данные методы позволяют снизить время определения биосовместимости скаффолдов, они не предоставляют информации по токсичному воздействию исследуемых конструктов на первичные нейрональные культуры in vitro.Despite the fact that these methods can reduce the time for determining the biocompatibility of scaffolds, they do not provide information on the toxic effects of the test constructs on primary neuronal cultures in vitro.
В задачу изобретения положена разработка способа in vitro определения биосовместимости скаффолдов для нейротрансплантации.The objective of the invention is to develop an in vitro method for determining the biocompatibility of scaffolds for neurotransplantation.
Техническим результатом от использования заявленного изобретения является повышение эффективности и точности оценки рисков развития патологических реакций, которые могут привести к отторжению трансплантата, определение целесообразности применения создаваемых конструктов в нейротрансплантации.The technical result of using the claimed invention is to increase the efficiency and accuracy of assessing the risks of developing pathological reactions that can lead to graft rejection, determining the appropriateness of using the created constructs in neurotransplantation.
Поставленная задача достигается тем, что способ in vitro определения биосовместимости скаффолдов для нейротрансплантации включает сокультивирование первичных нейрональных культур со скаффолдами на поверхности конструктов, определение показателей жизнеспособности, морфометрических параметров и показателей функциональной активности клеток в культуре, оценку уровня цитотоксичности материала скаффолда, его адгезивных свойств и оптимальности архитектоники скаффолда для нейротрансплантации на основании регистрируемых параметров, при этом оценку жизнеспособности проводят с использованием флуоресцентных красителей пропидий йодида и бис-бензимида, а также качественно с использованием шкалы цитотоксичности согласно ГОСТ Р ИСО 10993-5:2009 (ISO 10993-5:2009), по результатам которой скаффолд считают биосовместимым, если количество живых клеток составляет 90% и более от всех клеток культуры, оценку морфометрических параметров клеточной культуры, культивируемой на поверхности конструкта, осуществляют с использованием сканирующей микроскопии и программы ImageJ, по результатам которой при снижении показателей в группе со скаффолдом относительно контрольной в 1,5 раза и более, считают, что материал конструкта и его структура оказывает деструктивное воздействие на культуру клеток, анализ спонтанной кальциевой активности проводят с использованием специфического кальциевого красителя Oregon Green 488 ВАРТА-1 AM и конфокального лазерного сканирующего микроскопа, по результатам которого скаффолд считают биосовместимым при количестве клеток, проявляющих кальциевую активность, 80% и более, длительности кальциевых событий 8-10 секунд, частоты кальциевых осцилляций 1,5-2 (количество кальциевых событий/мин.); первичные нейрональные культуры получают из эмбриональной ткани головного мозга мыши; экспериментальные методы, позволяющие оценить безопасность использования конструктов, проводят на 14 день культивирования клеточных культур.The task is achieved by the fact that the in vitro method for determining the biocompatibility of scaffolds for neurotransplantation includes co-cultivation of primary neuronal cultures with scaffolds on the surface of the constructs, determining viability indicators, morphometric parameters and indicators of the functional activity of cells in culture, assessing the level of cytotoxicity of the scaffold material, its adhesive properties and optimality scaffold architectonics for neurotransplantation based on recorded parameters, while viability is assessed using propidium iodide and bis-benzimide fluorescent dyes, as well as qualitatively using a cytotoxicity scale according to GOST R ISO 10993-5:2009 (ISO 10993-5:2009), according to the results of which the scaffold is considered biocompatible, if the number of living cells is 90% or more of all cells of the culture, the assessment of the morphometric parameters of the cell culture cultivated on the surface of the construct is carried out t using scanning microscopy and the ImageJ program, according to the results of which, with a decrease in indicators in the group with a scaffold relative to the control by 1.5 times or more, it is believed that the material of the construct and its structure has a destructive effect on the cell culture, the analysis of spontaneous calcium activity is carried out with using a specific calcium dye Oregon Green 488 VARTA-1 AM and a confocal laser scanning microscope, according to the results of which the scaffold is considered biocompatible when the number of cells exhibiting calcium activity is 80% or more, the duration of calcium events is 8-10 seconds, the frequency of calcium oscillations is 1.5 -2 (number of calcium events/min.); primary neuronal cultures are obtained from mouse fetal brain tissue; experimental methods to assess the safety of the use of constructs, carried out on the 14th day of cultivation of cell cultures.
На фиг. 1 представлены репрезентативные микрофотографии первичных нейрональных культур на 14 день культивирования in vitro, где: А интактная культура, Б - культура на скаффолде, В - культура рядом со скаффолдом. Масштабная линейка - 50, 100 мкм.In FIG. Figure 1 shows representative micrographs of primary neuronal cultures on the 14th day of in vitro cultivation, where: A intact culture, B - culture on the scaffold, C - culture next to the scaffold. Scale bar - 50, 100 µm.
На фиг. 2 представлены параметры спонтанной кальциевой активности клеток первичных нейрональных культур на 14 день сокультивирования со скаффолдом. * - различия достоверны относительно группы «Интактная», р<0,05, критерий Манна-Уитни.In FIG. Figure 2 shows the parameters of spontaneous calcium activity of cells of primary neuronal cultures on the 14th day of cocultivation with a scaffold. * - differences are significant relative to the "Intact" group, p<0.05, Mann-Whitney test.
На фиг. 3 представлены репрезентативные микрофотографии первичных нейрональных культур на 14 день культивирования in vitro, где: А интактная культура, Б - культура на скаффолде, В - культура рядом со скаффолдом. Масштабная линейка - 50, 100 мкм.In FIG. Figure 3 shows representative micrographs of primary neuronal cultures on the 14th day of in vitro cultivation, where: A is an intact culture, B is a culture on a scaffold, and C is a culture next to the scaffold. Scale bar - 50, 100 µm.
Предлагаемый способ in vitro определения биосовместимости скаффолдов для нейротрансплантации осуществляют следующим образом.The proposed in vitro method for determining the biocompatibility of scaffolds for neurotransplantation is carried out as follows.
Способ оценки биосовместимости скаффолдов основан на сокультивировании первичных нейрональных культур, полученных из эмбриональной ткани головного мозга мыши, и последующим анализом следующих показателей:The method for assessing the biocompatibility of scaffolds is based on the co-cultivation of primary neuronal cultures obtained from mouse embryonic brain tissue and subsequent analysis of the following parameters:
- количество жизнеспособных клеток первичных нейрональных культур при их сокультивировании со скаффолдом;- the number of viable cells of primary neuronal cultures when they are co-cultivated with a scaffold;
- морфометрические параметры клеток первичной нейрональной культуры при сокультивировании со скаффолдом (диаметр Ферета, площадь поверхности клеток, площадь поверхности конгломератов);- morphometric parameters of cells of the primary neuronal culture during cocultivation with scaffold (Feret diameter, cell surface area, conglomerate surface area);
- параметры спонтанной кальциевой активности клеток первичной нейрональной культуры при сокультивировании со скаффолдом (количество клеток, проявляющих кальциевую активность, частота и длительность кальциевых осцилляций).- parameters of spontaneous calcium activity of cells of the primary neuronal culture during cocultivation with a scaffold (number of cells exhibiting calcium activity, frequency and duration of calcium oscillations).
Показания биосовметимости скаффолдов с клетками нервной системы выражаются:Indications of biocompatibility of scaffolds with cells of the nervous system are expressed as:
- количество жизнеспособных клеток первичных нейрональных культур при их сокультивировании со скаффолдом достигает 90% и более;- the number of viable cells of primary neuronal cultures when they are co-cultivated with a scaffold reaches 90% or more;
- морфометрические параметры клеток первичной нейрональной культуры при сокультивировании со скаффолдом: диаметр Ферета 10-14 мкм; площадь поверхности клеток 60-120 мкм2; площадь поверхности конгломератов 8000 мкм2 и более;- morphometric parameters of the cells of the primary neuronal culture when cocultivated with a scaffold: Feret diameter 10-14 µm; cell surface area 60-120 µm 2 ; surface area of conglomerates 8000 µm 2 and more;
- параметры спонтанной кальциевой активности клеток первичной нейрональной культуры при сокультивировании со скаффолдом: количество клеток, проявляющих кальциевую активность 80% и более; частота кальциевых событий 1,5-2 количество кальциевых событий/мин.; длительность кальциевых осцилляций 8-10 секунд.- parameters of spontaneous calcium activity of cells of the primary neuronal culture when co-cultivated with a scaffold: the number of cells exhibiting calcium activity of 80% or more; frequency of calcium events 1.5-2 number of calcium events/min.; the duration of calcium oscillations is 8-10 seconds.
Скаффолды считаются биосовместимыми при одновременном выполнении данных условий.Scaffolds are considered biocompatible when these conditions are met simultaneously.
Для экспериментального обоснования данного способа были изучены образцы скаффолдов, полученных методом микромолдинга, разработанных для не йротранс плантации.To experimentally substantiate this method, samples of scaffolds obtained by the micromolding method, designed for neurotransplantation, were studied.
Клетки первичных нейрональных культур были получены по стандартному протоколу (Vedunova et al. Seizure-like activity in hyaluronidase-treated dissociated hippocampal cultures. 2013. Front Cell Neurosci.) из ткани головного мозга эмбрионов мыши (линия SHK) 18-го дня гестации. Хирургически извлеченные отделы головного мозга эмбрионов подвергались механической обработке, а затем 20-минутной инкубации с 0,25% раствором трипсина (Life Technologies, США) в условиях CO2-инкубатора. Полученная клеточная суспензия трехкратно промывалась натрий-фосфатным буфером, затем средой для культивирования (состав: 92,75% нейробазальная среда (Neurobasal™ "Invitrogen"), 5% сыворотка эмбриональная телячья ("ПанЭко"), 2% биоактивная добавка В27 ("Invitrogen"), 0,25% L-глутамин ("Invitrogen") и далее подвергалась центрифугированию (3 мин., 1000 об./мин.). После удаления надосадочной жидкости клеточная суспензия помещалась на поверхность скаффолда (плотность 27000 кл/см2), выдерживалась в СО2-инкубаторе в течение 15 минут, после чего производился долив культуральной среды до объема 2 мл.Cells of primary neuronal cultures were obtained according to the standard protocol (Vedunova et al. Seizure-like activity in hyaluronidase-treated dissociated hippocampal cultures. 2013. Front Cell Neurosci.) from the brain tissue of mouse embryos (SHK line) on the 18th day of gestation. The surgically extracted parts of the brain of the embryos were subjected to mechanical treatment, and then a 20-minute incubation with a 0.25% trypsin solution (Life Technologies, USA) in a CO 2 incubator. The resulting cell suspension was washed three times with sodium phosphate buffer, then with a culture medium (composition: 92.75% neurobasal medium (Neurobasal™ "Invitrogen"), 5% fetal calf serum ("PanEco"), 2% bioactive additive B27 ("Invitrogen "), 0.25% L-glutamine (Invitrogen"), and then subjected to centrifugation (3 min., 1000 rpm). After removal of the supernatant, the cell suspension was placed on the surface of the scaffold (density 27000 cells/cm 2 ) , kept in a CO 2 incubator for 15 minutes, after which the culture medium was topped up to a volume of 2 ml.
Жизнеспособность первичных нейрональных культур поддерживалась в течение 21 дня в условиях СО2-инкубатора (температура 35,5°С, газовая смесь содержит 5% СО2). Замена питательной среды (состав: 94,5% Neurobasal™, 4% В27, 1% L-глутамин, 0,5% сыворотка эмбриональная телячья) проводится 1 раз в 2 суток. Морфологическое состояние первичных нейрональных культур и оценка адгезивных свойств материала скаффолда анализировали в дни замены культуральной среды с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа.The viability of primary neuronal cultures was maintained for 21 days in a CO 2 incubator (temperature 35.5°C, gas mixture contains 5% CO 2 ). Replacement of the nutrient medium (composition: 94.5% Neurobasal ™, 4% B27, 1% L-glutamine, 0.5% fetal calf serum) is carried out 1 time in 2 days. The morphological state of the primary neuronal cultures and the assessment of the adhesive properties of the scaffold material were analyzed on the days of culture medium replacement using an inverted fluorescent microscope.
Количественный анализ жизнеспособности первичных нейрональных культур сокультивируемых со скаффолдами производился на 14 день культивирования путем окрашивания флуоресцентными красителями пропидий иодидом (Sigma-Aldrich, США) и бис-бензимидом (Sigma-Aldrich, США), обеспечивающими визуализацию ядер погибших клеток и общего количества клеток в культуре соответственно. С использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа в 10 полях зрения производился подсчет пропидий иодид положительно окрашенных и бис-бензимид положительно окрашенных клеток с последующим анализом их процентного соотношения. В случае наличия автофлуоресценции скаффолда оценка жизнеспособности проводится относительно клеток, находящихся в непосредственной близости к скаффолду.Quantitative analysis of the viability of primary neuronal cultures co-cultivated with scaffolds was carried out on the 14th day of cultivation by staining with fluorescent dyes propidium iodide (Sigma-Aldrich, USA) and bis-benzimide (Sigma-Aldrich, USA), providing visualization of the nuclei of dead cells and the total number of cells in culture respectively. Using an inverted fluorescent microscope in 10 fields of view, positively stained propidium iodide and positively stained bis-benzimid cells were counted, followed by analysis of their percentage. If the scaffold autofluorescence is present, the viability is assessed relative to the cells located in close proximity to the scaffold.
Качественный анализ цитотоксичности скаффолдов для клеток нервной системы производился с использованием шкалы цитотоксичности согласно ГОСТ Р ИСО 10993-5:2009 (ISO 10993-5:2009) (табл. 1). Согласно данной шкале скаффолды не проявляют токсического действия при наличии 90-100% жизнеспособных клеток в культуре.Qualitative analysis of the cytotoxicity of scaffolds for cells of the nervous system was carried out using the cytotoxicity scale according to GOST R ISO 10993-5:2009 (ISO 10993-5:2009) (Table 1). According to this scale, scaffolds do not show toxic effects in the presence of 90-100% of viable cells in culture.
На 14 день сокультивирования первичных нейрональных культур со скаффолдами осуществлялась оценка морфометрических параметров клеток с помощью метода сканирующей электронной микроскопии и последующей обработкой данных в программе Image J. Проводилось измерение следующих параметров: диаметр Ферета (мкм) (максимальное расстояние между краями клеток), площадь поверхности отдельных клеток и их конгломератов (мкм2). Сравнение данных параметров клеточной культуры, культивируемой со скаффолдом, с клеточной культурой, выращенной при отсутствии скаффолда по стандартному протоколу (далее - интактная культура) (Vedunova et al. Seizure-like activity in hyaluronidase-treated dissociated hippocampal cultures. 2013. Front Cell Neurosci.) с использованием адгезивного агента (полиэтиленимина), позволяет определить наличие деструктивного влияния материала конструкта на морфологические параметры клеток.On the 14th day of co-cultivation of primary neuronal cultures with scaffolds, the morphometric parameters of the cells were assessed using the method of scanning electron microscopy and subsequent data processing in the Image J program. The following parameters were measured: Feret diameter (µm) (maximum distance between cell edges), cells and their conglomerates (µm 2 ). Comparison of these parameters of a cell culture cultivated with a scaffold with a cell culture grown in the absence of a scaffold according to a standard protocol (hereinafter referred to as intact culture) (Vedunova et al. Seizure-like activity in hyaluronidase-treated dissociated hippocampal cultures. 2013. Front Cell Neurosci. ) using an adhesive agent (polyethyleneimine), allows you to determine the presence of a destructive effect of the construct material on the morphological parameters of cells.
На 14 день сокультивирования первичных нейрональных культур со скаффолдами анализировалась функциональная активность клеток с использованием методики кальциевого имиджинга. Детекция цитоплазматического Са2+, как одного из ключевых регуляторов метаболических каскадов в клетке, позволяет провести тонкий анализ активности как нейронов, так и глии (Мищенко и др. Применение методики прижизненного детектирования экспрессии мРНК в сочетании с кальциевым имиджингом для исследования нейросетевой активности in vitro. 2018. Биологические мембраны, Захаров и др. Флуоресцентный сканирующий мониторинг кальциевой активности нейронов гиппокампа при последовательном воздействии модуляторов синаптической передачи. 2011. Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского). Кальциевые события детектировали с помощью специфического кальциевого красителя Oregon Green 488 ВАРТА-1 AM (OGB1) (Invitrogen, США) и конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Осуществлялась регистрация временных серий изображений поля флуоресценции OGB1. Изменение интенсивности флуоресценции (усл. ед.) показывает зависимость внутриклеточной концентрации ионов кальция от времени и характеризует функциональную активность клеток в культуре. Выделение и анализ кальциевых осцилляций проводились с помощью программы Astroscanner (свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ №2014662670). Учитывались параметры: общая длительность кальциевых осцилляций (с), частота возникновения кальциевых осцилляций (количество кальциевых событий/мин.), количество клеток в культуре, проявляющих кальциевую активность (%).On the 14th day of cocultivation of primary neuronal cultures with scaffolds, the functional activity of cells was analyzed using the calcium imaging technique. Detection of cytoplasmic Ca2+ , as one of the key regulators of metabolic cascades in the cell, makes it possible to conduct a fine analysis of the activity of both neurons and glia (Mishchenko et al. Application of the method of in vivo detection of mRNA expression in combination with calcium imaging to study neural network activity in vitro. 2018. Biological membranes, Zakharov et al. Fluorescence scanning monitoring of calcium activity of hippocampal neurons under sequential exposure to synaptic transmission modulators, 2011. Lobachevsky University Bulletin of Nizhny Novgorod). Calcium events were detected using a specific calcium dye Oregon Green 488 BARTA-1 AM (OGB1) (Invitrogen, USA) and a confocal laser scanning microscope. Registration of time series of images of the OGB1 fluorescence field was carried out. The change in fluorescence intensity (arb. units) shows the dependence of the intracellular concentration of calcium ions on time and characterizes the functional activity of cells in culture. Isolation and analysis of calcium oscillations were carried out using the Astroscanner program (certificate of state registration of the computer program No. 2014662670). The following parameters were taken into account: the total duration of calcium oscillations (s), the frequency of occurrence of calcium oscillations (the number of calcium events/min.), the number of cells in culture that exhibit calcium activity (%).
Пример 1.Example 1
На этапе 0-14 дней сокультивирования первичных нейрональных культур со скаффолдами, представляющими собой нетканые пленки (состав: коллаген 1 типа нативный нереконструированный из шкуры крупного рогатого скота, сшитый с помощью диглицидилового эфира бутанодиола) отмечается активное прикрепление клеток к материалу и их дальнейшее развитие на поверхности конструкта в виде клеточных конгломератов (кол-во конгломератов/200 мкм2 7,47±1,03, площадь поверхности конгломератов 8073,01±5003,29 мкм2), образующих между собой связи.At the stage of 0-14 days of co-cultivation of primary neuronal cultures with scaffolds, which are non-woven films (composition: type 1 collagen, native, not reconstructed from the skin of cattle, cross-linked with butanodiol diglycidyl ether), active attachment of cells to the material and their further development on the surface is noted construct in the form of cellular conglomerates (number of conglomerates/200 µm 2 7.47±1.03, surface area of conglomerates 8073.01±5003.29 µm 2 ), forming bonds between themselves.
Анализ морфометрических показателей не выявил достоверных различий с контрольной культурой, культивируемой без присутствия скаффолда (табл. 2), что говорит об отсутствии влияния материала на морфометрические характеристики клеток.An analysis of morphometric parameters did not reveal significant differences from the control culture cultivated without the presence of a scaffold (Table 2), which indicates that the material does not affect the morphometric characteristics of cells.
Установлено, что скаффолды обладают автофлуоресценцией, в связи с чем оценка жизнеспособности проводилась относительно клеток, находящихся в непосредственной близости к скаффолду.It was found that scaffolds exhibit autofluorescence, and therefore the viability was assessed relative to cells located in close proximity to the scaffold.
Количественный анализ жизнеспособности клеток первичных нейрональных культур не выявил достоверных различий от группы культур, культивируемых без скаффолда (табл. 3), что свидетельствует об отсутствии токсических свойств.Quantitative analysis of cell viability of primary neuronal cultures did not reveal significant differences from the group of cultures cultivated without scaffold (Table 3), which indicates the absence of toxic properties.
Данные жизнеспособности подтверждаются качественным анализом (просмотр микрофотографий, полученных методом световой микроскопии - не менее 10 полей зрения) (рис. 1). Согласно шкале ГОСТ Р ИСО 10993-5:2009 цитотоксичность материала скаффолдов составляет 0 баллов (не цитотоксичный).Viability data are confirmed by qualitative analysis (viewing microphotographs obtained by light microscopy - at least 10 fields of view) (Fig. 1). According to the GOST R ISO 10993-5:2009 scale, the cytotoxicity of the scaffold material is 0 points (not cytotoxic).
Анализ функциональной кальциевой активности первичных нейрональных культур, сокультивируемых со скаффолдом, не выявил значимых различий в проценте активных клеток и частоты кальциевых осцилляций по сравнению со значениями, зарегистрированными в группе культур, культивируемых без скаффолда (рис. 2). Тем не менее отмечается модуляция метаболической активности клеток, характеризующаяся снижением длительности кальциевых осцилляций. Изменения могут быть связаны с ослаблением потока кальция из эндоплазматического ретикулума или сниженной концентрацией кальция в эндоплазматическом ретикулуме, но не свидетельствуют о цитотоксическом эффекте.An analysis of the functional calcium activity of primary neuronal cultures co-cultivated with a scaffold did not reveal significant differences in the percentage of active cells and the frequency of calcium oscillations compared with the values recorded in the group of cultures cultivated without a scaffold (Fig. 2). Nevertheless, there is a modulation of the metabolic activity of cells, characterized by a decrease in the duration of calcium oscillations. Changes may be associated with a decrease in the flow of calcium from the endoplasmic reticulum or a reduced concentration of calcium in the endoplasmic reticulum, but do not indicate a cytotoxic effect.
На основе полученных результатов можно сделать заключение, что материал тестируемого скаффолда имеет хорошие адгезивные свойства и высокую биосовместимость с клетками нервной системы, характеризующуюся отсутствием токсических эффектов и наличием функционально активных клеточных конгломератов на поверхности конструкта. Разработанный образец скаффолда может быть рекомендован к проведению исследований in vivo для установления степени биосовместимости на организменном уровне.Based on the results obtained, it can be concluded that the material of the tested scaffold has good adhesive properties and high biocompatibility with the cells of the nervous system, characterized by the absence of toxic effects and the presence of functionally active cell conglomerates on the surface of the construct. The developed scaffold sample can be recommended for in vivo studies to determine the degree of biocompatibility at the organism level.
Пример 2.Example 2
На этапе 0-14 дней сокультивирования первичных нейрональных культур со скаффолдами, представляющими собой сшитый гидрогелевый объем в виде цилиндра диаметром 5 мм и высотой 1 мм (состав: метакрилированная гиалуроновая кислота, синтез 14.1н (степень замещения 39%) - 20%; полиэтиленгликоль диакрилат, Mn=575 - 2.5%; рибофлавин мононуклеотид - 0.0025%; триэтаноламин - 0.5%, физраствор 76.9975%), отмечается активное прикрепление клеток к материалу и их дальнейшее развитие на поверхности конструкта в виде клеточных конгломератов (кол-во конгломератов/200 мкм2 9,71±0,8, площадь поверхности конгломератов 4162,81±1491,30 мкм2), образующих между собой связи.At the stage of 0-14 days of co-cultivation of primary neuronal cultures with scaffolds, which are a cross-linked hydrogel volume in the form of a cylinder with a diameter of 5 mm and a height of 1 mm (composition: methacrylated hyaluronic acid, synthesis 14.1n (39% substitution degree) - 20%; polyethylene glycol diacrylate , Mn=575 - 2.5%; riboflavin mononucleotide - 0.0025%; triethanolamine - 0.5%, saline solution 76.9975%), there is an active attachment of cells to the material and their further development on the surface of the construct in the form of cell conglomerates (number of conglomerates / 200 μm 2 9.71±0.8, surface area of conglomerates 4162.81±1491.30 µm 2 ) forming bonds between themselves.
Анализ морфометрических показателей выявил снижение диаметра Ферета и площади поверхности клеток относительно интактной группы (табл. 4), что может быть связано с не оптимальной архитектоникой конструкта.An analysis of morphometric parameters revealed a decrease in the Feret diameter and cell surface area relative to the intact group (Table 4), which may be due to the construct's non-optimal architectonics.
Установлено, что скаффолды обладают автофлуоресценцией, в связи с чем оценка жизнеспособности проводилась относительно клеток, находящихся в непосредственной близости к скаффолду.It was found that scaffolds exhibit autofluorescence, and therefore the viability was assessed relative to cells located in close proximity to the scaffold.
Количественный анализ жизнеспособности клеток первичных нейрональных культур выявил достоверные различия в проценте живых клеток по сравнению с показателями группы культур, культивируемых без скаффолда (табл. 5), что говорит о наличии цитотоксического эффекта.Quantitative analysis of the cell viability of primary neuronal cultures revealed significant differences in the percentage of living cells compared to the parameters of the group of cultures cultivated without scaffold (Table 5), which indicates the presence of a cytotoxic effect.
Данные жизнеспособности подтверждаются качественным анализом (просмотр микрофотографий, полученных методом световой микроскопии не менее 10 полей зрения) (рис. 3). Согласно шкале ГОСТ Р ИСО 10993-5:2009 цитотоксичность материала скаффолдов составляет 1 балл (легкая цитотоксичность).Viability data are confirmed by qualitative analysis (viewing microphotographs obtained by light microscopy of at least 10 fields of view) (Fig. 3). According to the GOST R ISO 10993-5:2009 scale, the cytotoxicity of the scaffold material is 1 point (mild cytotoxicity).
На основе полученных результатов можно сделать заключение, что материал тестируемого скаффолда имеет хорошие адгезивные свойства для клеток нервной системы, однако имеет не оптимальную архитектонику для полноценного их развития, а также обладает легким цитотоксическим действием. Разработанный образец скаффолда может быть рекомендован к проведению исследований in vivo для установления степени биосовместимости на организменном уровне только после существенной доработки.Based on the results obtained, it can be concluded that the material of the tested scaffold has good adhesive properties for the cells of the nervous system, however, it has a non-optimal architectonics for their full development, and also has a slight cytotoxic effect. The developed sample of the scaffold can be recommended for in vivo studies to determine the degree of biocompatibility at the organism level only after significant refinement.
Таким образом, предлагается эффективный способ первичной оценки биосовместимости скаффолдов, предназначенных для нейротрансплантации.Thus, an effective method for the initial assessment of the biocompatibility of scaffolds intended for neurotransplantation is proposed.
Claims (2)
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2020143932A RU2020143932A (en) | 2022-06-30 |
| RU2776455C2 true RU2776455C2 (en) | 2022-07-21 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2832295C1 (en) * | 2024-01-17 | 2024-12-23 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" | Method for non-invasive monitoring of polymer scaffold biodegradation |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2653476C1 (en) * | 2017-05-10 | 2018-05-08 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Приволжский исследовательский медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for microscopic assessment of cytotoxicity of components of scaffold materials |
| RU2675376C1 (en) * | 2017-07-17 | 2018-12-19 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Приволжский исследовательский медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО "ПИМУ" Минздрава России) | Method of quantitative analysis of cellular components of scaffold |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2653476C1 (en) * | 2017-05-10 | 2018-05-08 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Приволжский исследовательский медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for microscopic assessment of cytotoxicity of components of scaffold materials |
| RU2675376C1 (en) * | 2017-07-17 | 2018-12-19 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Приволжский исследовательский медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО "ПИМУ" Минздрава России) | Method of quantitative analysis of cellular components of scaffold |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| T.A. MISHCHENKO et al. Features of primary hippocampal cultures formation on scaffolds based on hyaluronic acid glycidyl methacrylate, pp.103-110, DOI: 10.17691/stm2018.10.1.13. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2832295C1 (en) * | 2024-01-17 | 2024-12-23 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" | Method for non-invasive monitoring of polymer scaffold biodegradation |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Swanson et al. | Macropore design of tissue engineering scaffolds regulates mesenchymal stem cell differentiation fate | |
| Maraldi et al. | Human amniotic fluid-derived and dental pulp-derived stem cells seeded into collagen scaffold repair critical-size bone defects promoting vascularization | |
| Guo et al. | Preparation of the acellular scaffold of the spinal cord and the study of biocompatibility | |
| Muangsanit et al. | Rapidly formed stable and aligned dense collagen gels seeded with Schwann cells support peripheral nerve regeneration | |
| RU2530169C2 (en) | Membrane as substrate for growing cells of retinal pigment epithelium (versions), application thereof and method of inoculating such cells | |
| Chen et al. | NSC-derived extracellular matrix-modified GelMA hydrogel fibrous scaffolds for spinal cord injury repair | |
| Hu et al. | Electrospun gelatin/PCL and collagen/PCL scaffolds for modulating responses of bone marrow endothelial progenitor cells | |
| WO2018090542A1 (en) | Construction of microrna gene-mediated novel tissue engineered nerve and applications thereof in repairing nerve defect | |
| JP7273418B2 (en) | Biomaterial for scaffold-free structure containing adipose-derived stem cells and method for producing the same | |
| CA2716752A1 (en) | Method for producing artificial skin | |
| CN113677700A (en) | Cell structure and method for producing cell structure | |
| JP7050296B2 (en) | Gelatin derivatives, crosslinked gelatin hydrogels and their porous bodies, and methods for producing them. | |
| Li et al. | Preparation and characterization of a novel acellular swim bladder as dura mater substitute | |
| Andrews et al. | Strategies to mitigate variability in engineering human nasal cartilage | |
| JP7548583B2 (en) | Biomaterials containing adipose-derived stem cells and gelatin and methods for producing same | |
| DE102006012162A1 (en) | Bone repair material using a cartilage cell with the potential for hypertrophy and a scaffold | |
| Li et al. | In vitro biomimetic platforms featuring a perfusion system and 3D spheroid culture promote the construction of tissue-engineered corneal endothelial layers | |
| Bodhak et al. | Combinatorial cassettes to systematically evaluate tissue-engineered constructs in recipient mice | |
| Jolly et al. | Skeletal microenvironment system utilising bovine bone scaffold co-cultured with human osteoblasts and osteoclast-like cells | |
| RU2776455C2 (en) | Method for in vitro determination of biocompatibility of scaffolds for neurotransplantation | |
| JP2024170544A (en) | Osteoblasts differentiated from mesenchymal stem cells and compositions for treating bone disease comprising same | |
| Makarov et al. | Collagen fiber autofluorescence level in evaluating the biological properties of tissue grafts | |
| Xia et al. | Preparation of laser microporous porcine acellular dermal matrix and observation of wound transplantation | |
| Chen et al. | Three-dimensional poly lactic-co-glycolic acid scaffold containing autologous platelet-rich plasma supports keloid fibroblast growth and contributes to keloid formation in a nude mouse model | |
| Kazimierczak et al. | Effectiveness of the production of tissue-engineered living bone graft: a comparative study using perfusion and rotating bioreactor systems |