RU2753996C1 - Bacterium corynebacterium glutamicum with increased ability to produce l-valine and method for producing l-valine using this bacterium - Google Patents
Bacterium corynebacterium glutamicum with increased ability to produce l-valine and method for producing l-valine using this bacterium Download PDFInfo
- Publication number
- RU2753996C1 RU2753996C1 RU2020132710A RU2020132710A RU2753996C1 RU 2753996 C1 RU2753996 C1 RU 2753996C1 RU 2020132710 A RU2020132710 A RU 2020132710A RU 2020132710 A RU2020132710 A RU 2020132710A RU 2753996 C1 RU2753996 C1 RU 2753996C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- valine
- corynebacterium glutamicum
- bacterium
- strain
- mutation
- Prior art date
Links
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 title claims description 58
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 title claims description 47
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 11
- 229960004295 valine Drugs 0.000 claims description 38
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 25
- 101150033780 ilvB gene Proteins 0.000 claims description 23
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 12
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical class O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 7
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 6
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 6
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 6
- 150000005693 branched-chain amino acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 30
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 102100030840 AT-rich interactive domain-containing protein 4B Human genes 0.000 description 13
- 101000792935 Homo sapiens AT-rich interactive domain-containing protein 4B Proteins 0.000 description 13
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 101150095957 ilvA gene Proteins 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-M 2-oxobutanoate Chemical compound CCC(=O)C([O-])=O TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100242924 Bacillus subtilis (strain 168) pbpF gene Proteins 0.000 description 2
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 2
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 2
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 101100242909 Streptococcus pneumoniae (strain ATCC BAA-255 / R6) pbpA gene Proteins 0.000 description 2
- 101100125907 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) ilvC1 gene Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000001486 biosynthesis of amino acids Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 101150090497 ilvC gene Proteins 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- -1 monosubstituted potassium phosphate Chemical class 0.000 description 2
- 101150058012 mrcA gene Proteins 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 101150105325 ponA gene Proteins 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 2
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WTLNOANVTIKPEE-UHFFFAOYSA-N 2-acetyloxypropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)OC(C)=O WTLNOANVTIKPEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2-oxobutanoic acid Chemical compound CC(C)C(=O)C(O)=O QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000276408 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Species 0.000 description 1
- 108010088278 Branched-chain-amino-acid transaminase Proteins 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 1
- 108700016168 Dihydroxy-acid dehydratases Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010000200 Ketol-acid reductoisomerase Proteins 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010006873 Threonine Dehydratase Proteins 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 101150043028 ilvD gene Proteins 0.000 description 1
- 101150105723 ilvD1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150099953 ilvE gene Proteins 0.000 description 1
- 101150077793 ilvH gene Proteins 0.000 description 1
- 101150060643 ilvN gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 159000000014 iron salts Chemical class 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000009374 poultry farming Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- KPZYAGQLBFUTMA-UHFFFAOYSA-K tripotassium;phosphate;trihydrate Chemical class O.O.O.[K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O KPZYAGQLBFUTMA-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000007738 vacuum evaporation Methods 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности, получению L-аминокислот с разветвленной боковой цепью (ВСАА от англ. branched-chain amino acids), преимущественно, L-валина, с помощью модифицированной бактерии Corynebacterium glutamicum, содержащей мутацию в регуляторной области оперона генов биосинтеза аминокислот ilvBNC.The invention relates to biotechnology, in particular, the production of L-amino acids with a branched side chain (BCAA from the English branched-chain amino acids), mainly L-valine, using a modified bacterium Corynebacterium glutamicum containing a mutation in the regulatory region of the operon of amino acid biosynthesis genes ilvBNC.
ВСАА (L-валин, L-лейцин, L-изолейцин, далее - валин, лейцин, изолейцин) относят к группе незаменимых аминокислот, которые не синтезируются в организме человека и животных, а поступают в организм с пищей. Получение ВСАА, широко используемых в качестве кормовых добавок в животноводстве и птицеводстве, обычно осуществляют путем ферментации Сахаров при помощи кишечной палочки Escherichia coli (US 5658766А) или коринеформных бактерий, таких как Corynebacterium или Brevibacterium (US 5521074А, US 7632663 В1, US 9290770 B2, US 10457919 B2). Пути биосинтеза изолейцина, валина и лейцина тесно связаны. Четыре фермента -ацетолактатсинтаза, изомероредуктаза, дегидратаза дигидроксикислот и трансаминаза В (кодируемые генами ilvBN, ilvC, ilvD и ilvE, соответственно) катализируют стадии превращения двух молекул пирувата в валин и, параллельно, этапы превращения 2-кетобутирата и пирувата в изолейцин.BCAAs (L-valine, L-leucine, L-isoleucine, hereinafter - valine, leucine, isoleucine) belong to the group of essential amino acids that are not synthesized in humans and animals, but enter the body with food. The production of BCAAs, widely used as feed additives in animal husbandry and poultry farming, is usually carried out by fermentation of sugars using Escherichia coli (US 5658766A) or coryneform bacteria such as Corynebacterium or Brevibacterium (US 5521074A, US 7632663 B1, US 9290770 B2, US 10457919 B2). The biosynthetic pathways for isoleucine, valine, and leucine are closely related. Four enzymes - acetolactate synthase, isomero reductase, dihydroxy acid dehydratase and transaminase B (encoded by genes ilvBN, ilvC, ilvD and ilvE, respectively) catalyze the steps of converting two molecules of pyruvate to valine and, in parallel, the steps of converting 2-ketobutyrate and pyruvate to isolate and pyruvate.
2-кетобутират образуется из треонина в реакции, катализируемой треониндегидратазой (кодируемой геном ilvA), специфичной для пути изолейцина. Лейцин-специфический путь начинается с 2-кетоизовалерата, который также является прямым предшественником валина. Участие одних и тех же ферментов в синтезе различных ВСАА затрудняет создание штаммов, продуцирующих одну из этих аминокислот без дополнительного образования в качестве побочного продукта других ВСАА.2-ketobutyrate is formed from threonine in a reaction catalyzed by threonine dehydratase (encoded by the ilvA gene) specific for the isoleucine pathway. The leucine-specific pathway begins with 2-ketoisovalerate, which is also a direct precursor of valine. The participation of the same enzymes in the synthesis of various BCAAs makes it difficult to create strains that produce one of these amino acids without additional formation of other BCAAs as a by-product.
Современные штаммы-продуценты, используемые для промышленного производства ВСАА, содержат комплекс изменений в геноме, обеспечивающих сверхпродукцию ВСАА при росте на средах с сахарами. Для получения штаммов-продуцентов используют различные селекционные и генетические подходы, включая мутагенез (US 5521074 А, ЕР 0477000 А2), амплификацию отдельных или нескольких генов (US 7632663 B1), усиление активности отдельных генов или их инактивацию (Wada М. et al.) (7).Modern producer strains used for the industrial production of BCAAs contain a complex of changes in the genome that provide overproduction of BCAAs when grown on media with sugars. Various breeding and genetic approaches are used to obtain producer strains, including mutagenesis (US 5521074 A, EP 0477000 A2), amplification of individual or several genes (US 7632663 B1), enhancement of the activity of individual genes or their inactivation (Wada M. et al.) (7).
Известно, что гены биосинтеза ВСАА (ilB, ilvN и ilvC) в клетках Corynebacterium составляют единый оперон, активность которого подавляется валином, лейцином или изолейцином. Экспрессия генов оперона ilvBNC контролируется с участием регуляторной области - 292 нуклеотида, расположенной перед первым геном оперона. Она кодирует лидерный пептид из 15 аминокислот и район, где возможно формирование вторичных структур - терминатора и антитерминатора. Замена 3 валиновых остатков на аланиновые в лидерном пептиде ведет к потери зависимой от концентрации валина экспрессии оперона (S. Morbach). Удаление, частичное удаление или мутации, приводящие к инактивации лидерного пептида, ведут к повышенной продукции валина (US 20160108444 A1). Внесение делеции 211 п.о. в аттенюаторный район промоторной области гена ilvB, находящийся в составе автономной векторной плазмиды pECKAilvBNC, также ведет к увеличению продукции валина (ЕР 1860193А1).It is known that genes for BCAA biosynthesis (ilB, ilvN, and ilvC) in Corynebacterium cells constitute a single operon, the activity of which is suppressed by valine, leucine, or isoleucine. The expression of genes of the ilvBNC operon is controlled with the participation of a regulatory region - 292 nucleotides located in front of the first gene of the operon. It encodes a leader peptide of 15 amino acids and a region where the formation of secondary structures - a terminator and an antiterminator - is possible. The replacement of 3 valine residues by alanine residues in the leader peptide leads to the loss of the valine concentration-dependent expression of the operon (S. Morbach). Removal, partial removal or mutations leading to inactivation of the leader peptide lead to increased production of valine (US 20160108444 A1). Introduction of a 211 bp deletion into the attenuator region of the ilvB gene promoter region, which is part of the autonomous vector plasmid pECKAilvBNC, also leads to an increase in valine production (EP 1860193A1).
Значительное число известных штаммов-продуцентов аминокислот на основе бактерий Corynebacterium glutamicum, не снижает потребности в разработке новых подходов к созданию таких продуцентов и усовершенствованию существующих способов синтеза ВСАА.A significant number of known amino acid-producing strains based on the bacteria Corynebacterium glutamicum does not reduce the need for the development of new approaches to the creation of such producers and the improvement of existing methods for the synthesis of BCAAs.
Задачами настоящего изобретения являются:The objectives of the present invention are:
- повышение продуктивности штаммов-продуцентов ВСАА, принадлежащих к Corynebacterium glutamicum,- increasing the productivity of BCAA-producing strains belonging to Corynebacterium glutamicum,
- разработка способа получения валина с использованием этих штаммов.- development of a method for producing valine using these strains.
Поставленные задачи решены путем:The tasks were solved by:
- получения бактерии Corynebacterium glutamicum с мутацией PilvB(G183A) в регуляторной области оперона ilvBNC - продуцента аминокислоты с разветвленной боковой цепью: L-валина или L-лейцина.- obtaining a bacterium Corynebacterium glutamicum with a P ilvB (G183A) mutation in the regulatory region of the ilvBNC operon - a producer of a branched chain amino acid: L-valine or L-leucine.
- разработки способа получения L-валина путем культивирования бактерии Corynebacterium glutamicum с мутацией PilvB(G183A) в регуляторной области оперона ilvBNC в подходящих условиях с последующим выделением целевой аминокислоты из культуральной жидкости.- development of a method for producing L-valine by cultivating the bacterium Corynebacterium glutamicum with the P ilvB (G183A) mutation in the regulatory region of the ilvBNC operon under suitable conditions, followed by isolation of the target amino acid from the culture liquid.
В основу заявляемого изобретения положен обнаруженный факт, что штаммы Corynebacterium glutamicum, имеющие специфическую мутацию в регуляторной области перед старт-кодоном структурного гена ilvB, обладают повышенной способностью продуцировать аминокислоты с разветвленной боковой цепью. Эта мутация является заменой гуанина на аденин в положении -183 п. о. (G183A) в нуклеотидной последовательности перед первым структурным геном ilvB оперона ilvBNC (в последовательности SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 это нуклеотид номер 110) и не затрагивает последовательности, кодирующей лидерный пептид.The claimed invention is based on the discovered fact that Corynebacterium glutamicum strains having a specific mutation in the regulatory region before the start codon of the ilvB structural gene have an increased ability to produce branched-chain amino acids. This mutation is a substitution of guanine for adenine at position -183 bp. (G183A) in the nucleotide sequence before the first structural gene ilvB of the ilvBNC operon (in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 this is nucleotide number 110) and does not affect the sequence coding for the leader peptide.
В соответствии с описанием изобретения в качестве продуцента ВСАА используют бактерию Corynebacterium glutamicum, содержащую мутацию PilvB (G183A), приводящую к замене нуклеотида гуанин на нуклеотид аденин в регуляторной области оперона ilvBNC в положении -183 п.о. перед старт-кодоном первого структурного гена ilvB оперона.In accordance with the description of the invention, the bacterium Corynebacterium glutamicum containing the P ilvB (G183A) mutation leading to the substitution of a guanine nucleotide for an adenine nucleotide in the regulatory region of the ilvBNC operon at position -183 bp is used as a BCAA producer. before the start codon of the first structural gene of the ilvB operon.
В качестве исходной бактерии Corynebacterium glutamicum используют, в частности, штаммы Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 или Corynebacterium glutamicum АТСС 13869 (депонированы в коллекции типовых культур USA).As the initial bacterium Corynebacterium glutamicum used, in particular, strains of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 or Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 (deposited in the collection of type cultures of the USA).
Термин «бактерия, способная продуцировать аминокислоты с разветвленной боковой цепью» означает бактерию, способную накапливать валин или лейцин в больших количествах, чем родительские штаммы Corynebacterium glutamicum АТСС 13032, Corynebacterium glutamicum АТСС 13869.The term "bacterium capable of producing branched-chain amino acids" means a bacterium capable of accumulating valine or leucine in greater amounts than the parental strains of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 13869.
Термин «бактерия с мутацией в регуляторной области оперона ilvBNC» означает, что бактерия модифицирована таким образом, что нуклеотидная последовательность регуляторной области оперона ilvBNC из Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 или из Corynebacterium glutamicum АТСС 13869 (SEQ ID NO: 1) содержит замену нуклеотида гуанин на нуклеотид аденин (мутация G183A) в положении -183 перед старт-кодоном первого структурного гена ilvB оперона с образованием последовательности SEQ ID NO: 2.The term "bacterium with a mutation in the regulatory region of the ilvBNC operon" means that the bacterium has been modified so that the nucleotide sequence of the regulatory region of the ilvBNC operon from Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 or from Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 (SEQ ID NO: 1) contains a nucleotide substitution for nucleotide adenine (mutation G183A) at position -183 before the start codon of the first structural gene of the ilvB operon to form SEQ ID NO: 2.
Направленное введение мутации PilvB (G183A) в хромосому родительского штамма Corynebacterium glutamicum осуществляют с помощью известных методов генной инженерии, в частности, метода замещения, основанного на гомологичной рекомбинации (Schafer A. et al, 1994) (12). The targeted introduction of the P ilvB (G183A) mutation into the chromosome of the parental strain of Corynebacterium glutamicum is carried out using known genetic engineering methods, in particular, the substitution method based on homologous recombination (Schafer A. et al, 1994) (12).
ДНК-фрагмент регуляторной области оперона ilvBNC, содержащий мутацию PilvB(G183A), получают с помощью метода ПЦР (Sambrook et al.) (13). Затем исходную последовательность в хромосоме родительского штамма замещают на мутантную последовательность с помощью гомологичной рекомбинации, которую проводят, в частности, с использованием плазмиды, не способной к автономному поддержанию в клетке хозяина.A DNA fragment of the ilvBNC operon regulatory region containing the P ilvB (G183A) mutation was obtained using the PCR method (Sambrook et al.) (13). Then the original sequence in the chromosome of the parent strain is replaced with the mutant sequence by homologous recombination, which is carried out, in particular, using a plasmid that is not capable of autonomous maintenance in the host cell.
Способ получения валина в общем видеMethod for producing valine in general
Способ получения аминокислоты валина включает культивирование валин-продуцирующей бактерии Corynebacterium glutamicum с мутацией PilvB(G183A) в регуляторной области оперона ilvBNC в подходящих условиях с последующим выделением синтезированного валина из культуральной жидкости традиционными способами с кристаллизацией из раствора соляной кислоты (14).The method for producing the amino acid valine involves the cultivation of the valine-producing bacterium Corynebacterium glutamicum with the P ilvB (G183A) mutation in the regulatory region of the ilvBNC operon under suitable conditions, followed by the isolation of the synthesized valine from the culture liquid by traditional methods with crystallization from hydrochloric acid solution (14).
В качестве питательной среды для культивирования используют минеральную среду, включающую фосфаты натрия или калия, соли магния, а при необходимости соли марганца и железа, и содержащую в качестве источника углерода глюкозу или глюкозные сиропы, в качестве источника азота - аммонийные соли или мочевину, а также необходимые для роста аминокислоты и витамины. В качестве компонентов, ускоряющих рост бактерий, дополнительно добавляют кукурузный экстракт или гидролизаты глютена или сои. Культивирование бактерий проводят при 24-42°С, преимущественно при 30-32°С и рН среды в интервале 6,0-8,5, преимущественно в интервале 6,8-7,2.As a nutrient medium for cultivation, a mineral medium is used, including sodium or potassium phosphates, magnesium salts, and, if necessary, manganese and iron salts, and containing glucose or glucose syrups as a carbon source, ammonium salts or urea as a nitrogen source, and amino acids and vitamins necessary for growth. As components that accelerate the growth of bacteria, additionally add corn extract or hydrolysates of gluten or soy. Cultivation of bacteria is carried out at 24-42 ° C, mainly at 30-32 ° C and the pH of the medium in the range of 6.0-8.5, mainly in the range of 6.8-7.2.
Культивирование бактерий осуществляют в пробирках, колбах или специальных реакторах при аэробных условиях.Cultivation of bacteria is carried out in test tubes, flasks or special reactors under aerobic conditions.
Заявляемый способ позволяет обеспечить уровень продукции валина до 15-25 г/л, что в превосходит исходный уровень родительского штамма на 50-400% (в зависимости от штамма).The inventive method makes it possible to ensure the level of valine production up to 15-25 g / l, which exceeds the initial level of the parent strain by 50-400% (depending on the strain).
Примеры осуществления изобретенияExamples of implementation of the invention
Пример 1. Конструирование штамма Corynebacterium glutamicum VC3 ВКПМ В-13676 с мутацией в регуляторной области оперона ilvBNC.Example 1. Construction of the Corynebacterium glutamicum VC3 strain VKPM B-13676 with a mutation in the regulatory region of the ilvBNC operon.
Штамм Corynebacterium glutamicum VC3 ВКПМ В-13676 сконструирован на основе штамма Corynebacterium glutamicum VC2 ВКПМ В-13675, являющегося производным штамма Corynebacterium glutamicum АТСС 13032, у которого гены ponA и ilvA делегированы, путем замены нативной последовательности регуляторной области оперона ilvBNC (SEQ ID NO: 1) мутантной копией (SEQ ID NO: 2). Для этого с помощью ПЦР получена мутантная копия регуляторной области оперона ilvBNC с заменой нуклеотида гуанин на аденин в позиции -183 перед старт-кодоном структурного гена ilvB, которая затем вставлена в плазмиду pIKA-sac13, полученную путем клонирования на векторе pUC19 ("Thermoscientific") гена sacB из Bacillus subtilis 168 (NC_000964, Accession Number X02730) и гена KmR (Tarutina) (15). С учетом того, что плазмида pIKA-sac13 не способна автономно поддерживаться в клетках Corynebacterium glutamicum после введения плазмиды с помощью электропорации в клетки Corynebacterium glutamicum VC2 В-13675, отобраны клоны, в хромосоме которых в результате двух циклов гомологичной рекомбинации произошло замещение нативной последовательности регуляторной области оперона ilvBNC на мутантную копию. Наличие замены в регуляторной области подтверждено с помощью анализа методом ПЦР и секвенирования. Полученный штамм Corynebacterium glutamicum VC3 с заменой нуклеотида гуанин на аденин в позиции -183 перед старт-кодоном структурного гена ilvB депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика как Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13676.The Corynebacterium glutamicum VC3 strain VKPM B-13676 is designed on the basis of the Corynebacterium glutamicum VC2 VKPM B-13675 strain, which is a derivative of the Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 strain, in which the ponA and ilvA genes are ) a mutant copy (SEQ ID NO: 2). For this, using PCR, a mutant copy of the regulatory region of the ilvBNC operon was obtained with the substitution of the nucleotide guanine for adenine at position -183 in front of the start codon of the ilvB structural gene, which was then inserted into the pIKA-sac13 plasmid obtained by cloning on the pUC19 vector ("Thermoscientific") the sacB gene from Bacillus subtilis 168 (NC_000964, Accession Number X02730) and the Km R gene (Tarutina) (15). Taking into account the fact that the pIKA-sac13 plasmid is not able to autonomously maintain in Corynebacterium glutamicum cells after the introduction of the plasmid by electroporation into Corynebacterium glutamicum VC2 B-13675 cells, clones were selected, in the chromosome of which, as a result of two cycles of homologous recombination, the regulatory region of the native sequence was replaced of the ilvBNC operon to the mutant copy. The presence of a substitution in the regulatory region was confirmed by PCR analysis and sequencing. The resulting strain of Corynebacterium glutamicum VC3 with the replacement of the guanine nucleotide for adenine at position -183 before the start codon of the ilvB structural gene was deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms of the National Research Center "Kurchatov Institute" - GosNIIgenetics as Corynebacterium glutamicum VKPM.
Пример 2. Конструирование штамма Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13677 (VB3) с мутацией в регуляторной области оперона ilvBNC.Example 2. Construction of the Corynebacterium glutamicum strain VKPM B-13677 (VB3) with a mutation in the regulatory region of the ilvBNC operon.
Штамм Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13677 (VB3) сконструирован на основе штамма Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13674 (VB2), имеющего делеции в генах ponA и ilvA в хромосоме штамма Corynebacterium glutamicum АТСС 13869, путем замены нативной последовательности регуляторной области гена ilvB (SEQ ID NO: 1) на их мутантную копию (SEQ ID NO: 2). Конструирование мутантной копии регуляторной области оперона ilvBNC и замена нативной последовательности на мутантную копию проведены как описано в Примере 1. Наличие замены в регуляторной области подтверждено с помощью анализа методом ПЦР и секвенирования. Полученный штамм Corynebacterium glutamicum VB3 с мутацией в регуляторной области оперона ilvBNC депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика как Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13677.The Corynebacterium glutamicum strain VKPM B-13677 (VB3) was designed on the basis of the Corynebacterium glutamicum strain VKPM B-13674 (VB2), which has deletions in the ponA and ilvA genes in the chromosome of the Corynebacterium glutamicum strain by replacing the HTSC 138 NO: 1) to their mutant copy (SEQ ID NO: 2). Construction of a mutant copy of the ilvBNC operon regulatory region and replacement of the native sequence with a mutant copy was carried out as described in Example 1. The presence of a change in the regulatory region was confirmed by PCR analysis and sequencing. The obtained strain of Corynebacterium glutamicum VB3 with a mutation in the regulatory region of the ilvBNC operon was deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms of the National Research Center "Kurchatov Institute" - GosNIIgenetika as Corynebacterium glutamicum VKPM B-13677.
Пример 3. Оценка влияния мутации PilvB (G183A) в регуляторной области оперона ilvBNC у штамма Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13676 или штамма Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13677 на активность ацетолактатсинтазы -ключевого фермента биосинтеза аминокислот с разветвленной боковой цепьюExample 3. Evaluation of the effect of the P ilvB (G183A) mutation in the regulatory region of the ilvBNC operon in the Corynebacterium glutamicum strain VKPM B-13676 or the Corynebacterium glutamicum strain VKPM B-13677 on the activity of acetolactate synthase, a key enzyme of side chain branch biosynthesis of amino acids
Штамм Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13676 или штамм Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13677 выращивают в колбах на питательной среде, содержащей (г/л): фосфат калия однозамещенный - 2,5, фосфат калия двузамещенный трехводный - 19,7, сульфат магния семиводный - 1,0, глюкоза - 20,0, биотин - 0,0001, тиамин - 0,0002, кукурузный экстракт - 5,0, сульфат аммония - 15,0, изолейцин - 0,25, вода до 1 л, рН 7,0-7,2 в течение 7 ч с перемешиванием (300 об/мин) при 30°С, используя в качестве посевного материала ночные культуры штаммов, выращенные при тех же условиях. Затем клетки собирают с помощью центрифугирования, осадок промывают фосфатным буфером (0,2 М, рН7,4), клетки суспендируют в том же буфере с добавлением MgCl2 (5 мМ) и β-меркаптоэтанола (1 мкл/мл) и разрушают ультразвуком в течение 15 минут. По окончании обработки ультразвуком образцы центрифугируют при 12000 об/мин в течение 10 минут при 4°С. В качестве контроля используют родительские штаммы Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13675 и Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13674, выращенные при тех же условиях, что и мутантные штаммы.The Corynebacterium glutamicum strain VKPM B-13676 or the Corynebacterium glutamicum strain VKPM B-13677 are grown in flasks on a nutrient medium containing (g / l): monosubstituted potassium phosphate - 2.5, disubstituted trihydrate potassium phosphate - 19.7, magnesium sulfate 1.0, glucose - 20.0, biotin - 0.0001, thiamine - 0.0002, corn extract - 5.0, ammonium sulfate - 15.0, isoleucine - 0.25, water up to 1 liter, pH 7, 0-7.2 for 7 hours with stirring (300 rpm) at 30 ° C, using as inoculum overnight cultures of strains grown under the same conditions. Then the cells are collected by centrifugation, the pellet is washed with phosphate buffer (0.2 M, pH7.4), the cells are suspended in the same buffer with the addition of MgCl 2 (5 mM) and β-mercaptoethanol (1 μl / ml) and disrupted by ultrasound in within 15 minutes. At the end of sonication, the samples are centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. The parental strains of Corynebacterium glutamicum VKPM B-13675 and Corynebacterium glutamicum VKPM B-13674, grown under the same conditions as the mutant strains, are used as control.
Активность ацетолактатсинтазы в полученных бесклеточных экстрактах штаммов определяют при 30°С согласно методике, описанной Guo et al. 2015 (16) с некоторыми модификациями.The acetolactate synthase activity in the obtained cell-free extracts of the strains was determined at 30 ° C according to the method described by Guo et al. 2015 (16) with some modifications.
Удельную активность ацетолактатсинтазы рассчитывают как нмоль α-ацетолактата, образующегося в минуту в расчете на 1 мг общего белка. Количество общего белка в экстрактах определяют по методу Лоури (17).The specific activity of acetolactate synthase is calculated as nmol of α-acetolactate formed per minute per 1 mg of total protein. The amount of total protein in the extracts is determined by the Lowry method (17).
Из результатов, представленных в таблице 1, следует, что введение мутации PilvB(G183A), локализованной в регуляторной области оперона ilvBNC, в геном штамма Corynebacterium glutamicum VB2 ВКПМ В-13674 или Corynebacterium glutamicum VC2 ВКПМ В-13675 приводит к увеличению активности ацетолактатсинтазы - ключевого фермента биосинтеза аминокислот с разветвленной боковой цепью в 6,5 раз по сравнению с родительскими штаммами.From the results presented in Table 1, it follows that the introduction of the PilvB (G183A) mutation, localized in the regulatory region of the ilvBNC operon, into the genome of the Corynebacterium glutamicum VB2 strain VKPM B-13674 or Corynebacterium glutamicum VC2 VKPM B-13675ate leads to an increase in the activity of the key acetolactase enzyme biosynthesis of amino acids with a branched side chain in 6.5 times compared to parental strains.
Пример 4. Оценка влияния мутации PilvB(G183A) в регуляторной области оперона ilvBNC на продуктивность по валину или лейцину у штамма Corynebacterium glutamicum VB3 ВКПМ В-13677Example 4. Evaluation of the effect of the P ilvB (G183A) mutation in the regulatory region of the ilvBNC operon on the productivity of valine or leucine in the Corynebacterium glutamicum VB3 VKPM B-13677 strain
Оценку проводят в пробирочных тестах. Для этого 0,3 мл культуры штамма Corynebacterium glutamicum VB3 ВКПМ В-13677, предварительно выращенной в течение 22 ч с перемешиванием (300 об/мин) при 30°С, вносят в пробирки с 3 мл среды следующего состава (мас. %): глюкоза - 10,0 хлорид аммония - 2,5, фосфат калия однозамещенный - 0,1, сульфат магния семиводный - 0,1, мел - 2,5, биотин - 0,00001, тиамин - 0,00002 с добавлением кислотного гидролизата пшеничного глютена 50,0 мл/л, вода - остальное. Гидролизат пшеничного глютена получают путем гидролиза пшеничного глютена серной кислотой согласно известным способам гидролиза различного сырья с целью получения источника ростовых факторов при микробиологическом производстве аминокислот (18). Перед внесением в среду гидролизат нейтрализуют концентрированным аммиаком. В качестве контрольного штамма используют родительский штамм Corynebacterium glutamicum VB2 ВКПМ В-13674.Evaluation is carried out in test tube tests. For this, 0.3 ml of the culture of the Corynebacterium glutamicum VB3 VKPM B-13677 strain, previously grown for 22 h with stirring (300 rpm) at 30 ° C, is introduced into test tubes with 3 ml of the medium of the following composition (wt%): glucose - 10.0 ammonium chloride - 2.5, monosubstituted potassium phosphate - 0.1, magnesium sulfate heptahydrate - 0.1, chalk - 2.5, biotin - 0.00001, thiamine - 0.00002 with the addition of wheat acid hydrolyzate gluten 50.0 ml / l, water - the rest. Wheat gluten hydrolyzate is obtained by hydrolysis of wheat gluten with sulfuric acid according to known methods of hydrolysis of various raw materials in order to obtain a source of growth factors during the microbiological production of amino acids (18). Before adding to the medium, the hydrolyzate is neutralized with concentrated ammonia. The parental strain of Corynebacterium glutamicum VB2 VKPM B-13674 is used as a control strain.
Пробирки с культурами инкубируют в течение 36 ч с перемешиванием (300 об/мин) при 30°С и затем в культуральной жидкости определяют содержание валина или лейцина методом тонкослойной хроматографии.The tubes with cultures are incubated for 36 hours with stirring (300 rpm) at 30 ° C, and then the content of valine or leucine in the culture liquid is determined by thin layer chromatography.
Из результатов, представленных в таблице 2, следует, что штамм Corynebacterium glutamicum VB3 ВКПМ В-13677 с мутацией PilvB(G183A) в регуляторной области оперона ilvBNC продуцирует на 50% больше валина и в 2 раза больше лейцина по сравнению с родительским штаммом Corynebacterium glutamicum VB2 ВКПМ В-13674.From the results presented in Table 2, it follows that the Corynebacterium glutamicum VB3 strain VKPM B-13677 with the P ilvB (G183A) mutation in the regulatory region of the ilvBNC operon produces 50% more valine and 2 times more leucine than the parental strain of Corynebacumterium glutamterium VB2 VKPM B-13674.
Пример 5. Оценка влияния мутации PilvB(G183A) в регуляторной области оперона ilvBNC на продуктивность по валину у штамма Corynebacterium glutamicum VC3 ВКПМ В-13676Example 5. Evaluation of the effect of the P ilvB (G183A) mutation in the regulatory region of the ilvBNC operon on valine productivity in the Corynebacterium glutamicum VC3 strain VKPM B-13676
Оценку продуктивности проводят в пробирочных тестах также как описано в примере 4. В качестве штамма сравнения используют родительский штамм Corynebacterium glutamicum VC2 ВКПМ В-13675.Evaluation of productivity is carried out in test tube tests as described in example 4. As a comparison strain, the parental strain of Corynebacterium glutamicum VC2 VKPM B-13675 is used.
Из результатов, представленных в таблице 3, следует, что штамм Corynebacterium glutamicum VC3 ВКПМ В-13676 с мутацией PilvB(G183A) в регуляторной области оперона ilvBNC, продуцирует в 4 раза больше валина, чем родительский штамм Corynebacterium glutamicum VC2 В-13675.From the results presented in Table 3, it follows that the Corynebacterium glutamicum VC3 strain VKPM B-13676 with the P ilvB (G183A) mutation in the regulatory region of the ilvBNC operon produces 4 times more valine than the parental Corynebacterium glutamicum VC2 B-136 strain.
Из результатов, представленных в таблицах 1, 2 и 3, следует, что потенциал штаммов Corynebacterium glutamicum АТСС13032 и АТСС13869 по удельной активности ацетолактатсинтазы и по уровню продукции валина существенно различается. Штамм VB2, производный от Corynebacterium glutamicum АТСС13869, продуцирует в 5 раз больше валина по сравнению со штаммом VC2, производным от Corynebacterium glutamicum АТСС13032.From the results presented in Tables 1, 2, and 3, it follows that the potential of the Corynebacterium glutamicum strains ATCC13032 and ATCC13869 for the specific activity of acetolactate synthase and for the level of valine production differs significantly. The VB2 strain, derived from Corynebacterium glutamicum ATCC13869, produces 5 times more valine than the VC2 strain derived from Corynebacterium glutamicum ATCC13032.
Штаммы, содержащие мутацию PilvB(G183A) в регуляторной области оперона ilvBNC - Corynebacterium glutamicum VC3, Corynebacterium glutamicum VB3, обеспечивают увеличение продукции валина от 50 до 400% по сравнению с контрольными штаммами. При этом эффект, который оказывает мутация PilvB(G183A) в регуляторной области ilvBNC, зависит от родительского штамма.Strains containing the P ilvB (G183A) mutation in the regulatory region of the ilvBNC operon - Corynebacterium glutamicum VC3, Corynebacterium glutamicum VB3, provide an increase in valine production from 50 to 400% compared to control strains. The effect of the P ilvB (G183A) mutation in the ilvBNC regulatory region depends on the parental strain.
Пример 6. Получение валина с использованием штамма Corynebacterium glutamicum VB3 ВКПМ В-13677 или штамма Corynebacterium glutamicum VC3 ВКПМ В-13676Example 6. Getting valine using the Corynebacterium glutamicum VB3 strain VKPM B-13677 or the Corynebacterium glutamicum VC3 VC3 VKPM B-13676 strain
Для выделения валина из культуральной жидкости штамм Corynebacterium glutamicum VB3 ВКПМ В-13677 или штамм Corynebacterium glutamicum VC3 ВКПМ В-13676 выращивают в колбах в условиях и на среде как описано в примере 4. После выращивания твердые остатки, такие как клетки, удаляют из культуральной жидкости методом центрифугирования и фильтрацией через мембрану с последующим вакуум-выпариванием образовавшегося пермеата. Из водного раствора валин выделяют кристаллизацией с последующей перекристаллизацией из раствора соляной кислоты (14). Выход валина из КЖ составляет 50,7%, содержание валина в полученном продукте -99,6%.To isolate valine from the culture liquid, the Corynebacterium glutamicum VB3 strain VKPM B-13677 or the Corynebacterium glutamicum VC3 VKPM B-13676 strain are grown in flasks under the conditions and on the medium as described in example 4. After cultivation, solid residues such as cells are removed from the culture liquid by centrifugation and filtration through a membrane, followed by vacuum evaporation of the formed permeate. Valine is isolated from an aqueous solution by crystallization, followed by recrystallization from a hydrochloric acid solution (14). The output of valine from the CL is 50.7%, the content of valine in the resulting product is 99.6%.
Таким образом, наличие мутации PilvB(G183A), локализованной в регуляторной области оперона ilvBNC, в штамме бактерий Corynebacterium glutamicum - продуценте аминокислоты с разветвленной боковой цепью позволяет значительно повысить выход целевой аминокислоты по сравнению с родительским штаммом, что представляет интерес для получения и усовершенствования продуцентов аминокислот из группы ВСАА.Thus, the presence of the P ilvB (G183A) mutation, localized in the regulatory region of the ilvBNC operon, in the Corynebacterium glutamicum bacterial strain, a producer of a branched chain amino acid, makes it possible to significantly increase the yield of the target amino acid in comparison with the parent strain, which is of interest for obtaining and improving producers amino acids from the BCAA group.
Разработанный на основе заявляемой бактерии способ получения валина расширяет арсенал известных способов получения этой наиболее востребованной из группы ВСАА аминокислоты и позволяет повысить уровень продукции валина на 50-400% по сравнению с родительским штаммом.The method for producing valine developed on the basis of the claimed bacterium expands the arsenal of known methods for producing this amino acid, which is the most demanded from the BCAA group, and makes it possible to increase the level of valine production by 50-400% compared to the parent strain.
Список источников информацииList of information sources
1. US 5521074 А1.US 5521074 A
2. US 7632663 В12.US 7632663 B1
3. US 9290770 В23. US 9290770 B2
4. US 10457919 В24.US 10457919 B2
5. US 5658766А5. US 5658766A
6. ЕР 0477000 А26. EP 0477000 A2
7. Wada М., Hijikata N.. Aoki R., Takesue N., and Yokota A. Enhanced valine production in Corynebacterium glutamicum with defective H+-ATPase and C-terminal truncated acetohydroxyacid synthase. Biosci. Biotechnol. Biochem. (2008). V. 72 (11). P. 2959-2965.7. Wada M., Hijikata N .. Aoki R., Takesue N., and Yokota A. Enhanced valine production in Corynebacterium glutamicum with defective H + -ATPase and C-terminal truncated acetohydroxyacid synthase. Biosci. Biotechnol. Biochem. (2008). V. 72 (11). P. 2959-2965.
8. US 20160108444 A18.US 20160108444 A1
9. Morbach S., Junger C., Sahmand H., Eggeling L. Attenuation Control of ilvBNC in Corynebacterium glutamicum: Evidence of Leader Peptide Formation without the Presence of a Ribosome Binding Site. Journal of Bioscience and Bioengineering. 2000. V.90. - №5. - P. 501-5079. Morbach S., Junger C., Sahmand H., Eggeling L. Attenuation Control of ilvBNC in Corynebacterium glutamicum: Evidence of Leader Peptide Formation without the Presence of a Ribosome Binding Site. Journal of Bioscience and Bioengineering. 2000. V.90. - No. 5. - P. 501-507
10. ЕР 1860193 A110. EP 1860193 A1
11. Liebl W., Ehrmann M., Ludwig W., Schleifer K.H. Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297T, "Brevibacterium flavum" DSM 20411, "Brevibacterium lactofermentum" DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns Int. J. Syst. Bacteriol. - Vol. 41(2). - P. 255-260.11. Liebl W., Ehrmann M., Ludwig W., Schleifer K.H. Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297T, "Brevibacterium flavum" DSM 20411, "Brevibacterium lactofermentum" DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns Int. J. Syst. Bacteriol. - Vol. 41 (2). - P. 255-260.
12. Schäfer A., Tauch A., Jäger W., Kalinowski J., Thierbach G., and Pühler. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the E. coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum. Gene. -(1994). V. 145. P. 69-73.12. Schäfer A., Tauch A., Jäger W., Kalinowski J., Thierbach G., and Pühler. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the E. coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum. Gene. - (1994). V. 145. P. 69-73.
13. Sambrook I., Russell D. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 200113. Sambrook I., Russell D. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 2001
14. A.E. Агаджанян, Г.Ж. Оганесян и Е.А. Агаджанян Выделение и очистка валина из культуральной жидкости Химический журнал Армении, 2002, №4, 55, стр. 121-12914. A.E. Aghajanyan, G. Zh. Oganesyan and E.A. Aghajanyan Isolation and purification of valine from the culture liquid Chemical Journal of Armenia, 2002, No. 4, 55, pp. 121-129
15. Taratina M.G., Raevskaya N.M., Shustikova Т.Е., et al. Assessment of effectiveness of Corynebacterium glutamicum promoters and their application to enhancement of gene activity in lysine-producing bacteria. Biotekhnologiya (Biotechnology), 2015, 6, 16-24. doi: 10.21519/0234-2758-2015-6-16-2415. Taratina M. G., Raevskaya N. M., Shustikova T. E., et al. Assessment of the effectiveness of Corynebacterium glutamicum promoters and their application to enhancement of gene activity in lysine-producing bacteria. Biotekhnologiya (Biotechnology), 2015, 6, 16-24. doi: 10.21519 / 0234-2758-2015-6-16-24
16. Guo Y., Han M., Xu J., Zhang W. Analysis of acetohydroxyacid synthase variants from branched-chain amino acids-producing strains and their effects on the synthesis of branched-chain amino acids in Corynebacterium glutamicum. Protein Expression and Purification. -(2015). - V. 109. P. 106-11216. Guo Y., Han M., Xu J., Zhang W. Analysis of acetohydroxyacid synthase variants from branched-chain amino acids-producing strains and their effects on the synthesis of branched-chain amino acids in Corynebacterium glutamicum. Protein Expression and Purification. - (2015). - V. 109. P. 106-112
17. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951 193(1) 265-275.17. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951 193 (1) 265-275.
18. Биотехнология и биоинженерия, Рига, 1978 18. Biotechnology and Bioengineering, Riga, 1978
--->--->
Перечень последовательностейSequence listing
<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный<110> Federal State Budgetary Institution "State
научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных Research Institute of Genetics and Selection of Industrial
микроорганизмов Национального исследовательского центра «Курчатовский microorganisms of the National Research Center "Kurchatovsky
институт»» (НИЦ «Курчатовский институт»- ГосНИИгенетика) Institute "" (NRC "Kurchatov Institute" - GosNIIgenetics)
<120> Бактерия Corynebacterium glutamicum с повышенной способностью продуцировать <120> Corynebacterium glutamicum with an increased capacity to produce
L-валин и способ получения L-валина с использованием этой бактерии L-valine and a method for producing L-valine using this bacterium
<160> 2<160> 2
<210> 1<210> 1
<211> 292<211> 292
<212> DNA<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032
<220><220>
<221> CDS<221> CDS
<222> (1)…(-292)<222> (1) ... (-292)
<223> ilvBNC regulator region <223> ilvBNC regulator region
<400> 1<400> 1
catgaccatt attcgacttg tagtagtaac cgcgcggcgc ctgccgtaac ggccttccaa 60catgaccatt attcgacttg tagtagtaac cgcgcggcgc ctgccgtaac ggccttccaa 60
gtcgtctcgt caagcgccct cgacaacact caccacagtg ttggaacgag ggctttcttg 120gtcgtctcgt caagcgccct cgacaacact caccacagtg ttggaacgag ggctttcttg 120
ttggttatga cccaagtagc caactttgca acagacatct gtcgcactgc gtgcacacgc 180ttggttatga cccaagtagc caactttgca acagacatct gtcgcactgc gtgcacacgc 180
atccgcgtcg gaacaatttt aaatgagggc tttgtcttta ggctgagttg aaatcggctt 240atccgcgtcg gaacaatttt aaatgagggc tttgtcttta ggctgagttg aaatcggctt 240
ggcttggacg ggtcctgtga aaatccttat ttagtaaagg agccagaaag tc 292ggcttggacg ggtcctgtga aaatccttat ttagtaaagg agccagaaag tc 292
<210> 2<210> 2
<211> 292<211> 292
<212> DNA<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032
<220><220>
<221> CDS<221> CDS
<222> (1)…(-292)<222> (1) ... (-292)
<223> ilvBNC regulator region с заменой гуанина на аденин в позиции -183 п.н.<223> ilvBNC regulator region with replacement of guanine for adenine at position -183 bp
перед старт кодоном структурного гена ilvB before the start of the ilvB structural gene codon
<400> 2<400> 2
catgaccatt attcgacttg tagtagtaac cgcgcggcgc ctgccgtaac ggccttccaa 60catgaccatt attcgacttg tagtagtaac cgcgcggcgc ctgccgtaac ggccttccaa 60
gtcgtctcgt caagcgccct cgacaacact caccacagtg ttggaacgaa ggctttcttg 120gtcgtctcgt caagcgccct cgacaacact caccacagtg ttggaacgaa ggctttcttg 120
ttggttatga cccaagtagc caactttgca acagacatct gtcgcactgc gtgcacacgc 180ttggttatga cccaagtagc caactttgca acagacatct gtcgcactgc gtgcacacgc 180
atccgcgtcg gaacaatttt aaatgagggc tttgtcttta ggctgagttg aaatcggctt 240atccgcgtcg gaacaatttt aaatgagggc tttgtcttta ggctgagttg aaatcggctt 240
ggcttggacg ggtcctgtga aaatccttat ttagtaaagg agccagaaag tc 292ggcttggacg ggtcctgtga aaatccttat ttagtaaagg agccagaaag tc 292
<---<---
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020132710A RU2753996C1 (en) | 2020-10-05 | 2020-10-05 | Bacterium corynebacterium glutamicum with increased ability to produce l-valine and method for producing l-valine using this bacterium |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020132710A RU2753996C1 (en) | 2020-10-05 | 2020-10-05 | Bacterium corynebacterium glutamicum with increased ability to produce l-valine and method for producing l-valine using this bacterium |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2753996C1 true RU2753996C1 (en) | 2021-08-25 |
Family
ID=77460490
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020132710A RU2753996C1 (en) | 2020-10-05 | 2020-10-05 | Bacterium corynebacterium glutamicum with increased ability to produce l-valine and method for producing l-valine using this bacterium |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2753996C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1860193A1 (en) * | 2006-05-22 | 2007-11-28 | Evonik Degussa GmbH | Promoter-activity modulation for branched-chain amino acid production |
| US20160108444A1 (en) * | 2013-03-11 | 2016-04-21 | Cj Cheiljedang Corporation | Strain having enhanced L-valine productivity and L-valine production method using the same |
| RU2675506C2 (en) * | 2013-06-03 | 2018-12-20 | Эвоник Дегусса Гмбх | Method of producing l-leucine, l-valine, l-isoleucine, alpha-ketoisovalerate, alpha-keto-beta-methylvalerate or alpha-ketoisocaproate using recombinant corynebacterium containing ilvbn operon that can be induced by propionate |
-
2020
- 2020-10-05 RU RU2020132710A patent/RU2753996C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1860193A1 (en) * | 2006-05-22 | 2007-11-28 | Evonik Degussa GmbH | Promoter-activity modulation for branched-chain amino acid production |
| US20160108444A1 (en) * | 2013-03-11 | 2016-04-21 | Cj Cheiljedang Corporation | Strain having enhanced L-valine productivity and L-valine production method using the same |
| RU2675506C2 (en) * | 2013-06-03 | 2018-12-20 | Эвоник Дегусса Гмбх | Method of producing l-leucine, l-valine, l-isoleucine, alpha-ketoisovalerate, alpha-keto-beta-methylvalerate or alpha-ketoisocaproate using recombinant corynebacterium containing ilvbn operon that can be induced by propionate |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| CHEN C. ET AL. Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum ATCC13869 for L-valine production. Metab Eng., 2015 May;29:66-75. doi: 10.1016/j.ymben.2015.03.004. * |
| CHEN C. ET AL. Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum ATCC13869 for L-valine production. Metab Eng., 2015 May;29:66-75. doi: 10.1016/j.ymben.2015.03.004. WADA М. ET AL. Enhanced Valine Production in Corynebacterium glutamicum with Defective H+-ATPase and C-Terminal Truncated Acetohydroxyacid Synthase. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2008, 72:11, 2959-2965, doi: 10.1271/bbb.80434. * |
| WADA М. ET AL. Enhanced Valine Production in Corynebacterium glutamicum with Defective H+-ATPase and C-Terminal Truncated Acetohydroxyacid Synthase. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2008, 72:11, 2959-2965, doi: 10.1271/bbb.80434. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20110039313A1 (en) | Method for the fermentative production of cadaverine | |
| US7754446B2 (en) | Alleles of the rel gene from coryneform bacteria | |
| US8637295B1 (en) | Process for the production of L-lysine | |
| JP6341907B2 (en) | Feedback resistant alpha-isopropylmalate synthase | |
| JP5227789B2 (en) | Method for fermentative production of L-amino acids | |
| RU2676137C2 (en) | Microorganism for producing o-acetyl-homoserine and method for producing o-acetyl-homoserine using same | |
| US8119374B2 (en) | Nucleotide sequences of coryneform bacteria coded for proteins participating in L-serine metabolism and method for microbial production of L-serine | |
| RU2699516C2 (en) | Novel lysine decarboxylase and method of producing cadaverine using thereof | |
| JPWO2006035831A1 (en) | Process for producing L-arginine, L-ornithine or L-citrulline | |
| US8080395B2 (en) | Alleles of the PRPD1 gene from coryneform bacteria | |
| US8592177B2 (en) | Process for the fermentative preparation of organic chemical compounds using Coryneform bacteria in which the sugR gene is present in attenuated form | |
| US8592187B2 (en) | Alleles of the oxyR gene from coryneform bacteria | |
| RU2288265C2 (en) | Method for preparing l-threonine | |
| RU2753996C1 (en) | Bacterium corynebacterium glutamicum with increased ability to produce l-valine and method for producing l-valine using this bacterium | |
| US20030087400A1 (en) | Process for the fermentative production of L-lysine using coryneform bacteria | |
| US7083952B2 (en) | Nucleotide sequences coding for proteins involved in the biosynthesis of L-serine, an improved method for the microbial production of L-serine and a genetically modified microorganism suitable therefor | |
| US7732176B2 (en) | Nucleotide sequences that encode deregulated phosphoglycerate dehydrogenases of coryneform bacteria and method for producing L-serine | |
| RU2339699C2 (en) | RECOMBINANT PLASMID pT7ΔpckA::loxpcat, PROVIDING SYNTHESIS OF L-THREONINE IN CELLS OF Escherichia coli, AND RECOMBINANT STRAIN Escherichia coli FTR2717 (KCCM-10475)-PRODUCER OF L-THREONINE | |
| US6995000B2 (en) | Nucleotide sequences coding for the sigM gene | |
| RU2639247C1 (en) | L-lysin-producing coryneformic bacterium with inactive ltbr genome and method for obtaining of l-lysin using this bacterium | |
| RU2612159C1 (en) | L-lysine-producing coryneform bacterium with mutant gene fusa and method for obtaining l-lysine with application thereof | |
| Jakobsen | Study and engineering of methanolassimilation and L-lysineproduction in the thermotolerantbacterium Bacillus methanolicus |