RU2747087C1 - Method for production of biocomposite spheroids for bone restoration - Google Patents
Method for production of biocomposite spheroids for bone restoration Download PDFInfo
- Publication number
- RU2747087C1 RU2747087C1 RU2020128818A RU2020128818A RU2747087C1 RU 2747087 C1 RU2747087 C1 RU 2747087C1 RU 2020128818 A RU2020128818 A RU 2020128818A RU 2020128818 A RU2020128818 A RU 2020128818A RU 2747087 C1 RU2747087 C1 RU 2747087C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- spheroids
- agarose
- cells
- subject
- well
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/39—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Botany (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnology area
Изобретение относится к области медицины, а именно к тканевой инженерии, регенеративной медицине, пластической хирургии, стоматологии, травматологии и ортопедии.The invention relates to medicine, namely to tissue engineering, regenerative medicine, plastic surgery, dentistry, traumatology and orthopedics.
Уровень техникиState of the art
Найти эффективные пути восстановления структуры и анатомической целостности органов и тканей после повреждения (нарушения) или болезней, изменяющих их нормальную структуру - это серьезная проблема здравоохранения, требующая поиска и разработки более эффективных решений. Новая область медицины - регенеративная медицина - ставит одну из задач выявления регенерационной способности там, где она оставалась нераскрытой. Одно из важнейших положений учения о регенерации гласит, что если органотипическая регенерация не наблюдается в естественных условиях, то она может быть индуцирована и усилена искусственным путем.Finding effective ways to restore the structure and anatomical integrity of organs and tissues after damage (disruption) or diseases that change their normal structure is a serious public health problem that requires the search and development of more effective solutions. A new area of medicine - regenerative medicine - poses one of the tasks of revealing the regenerative capacity where it remained undisclosed. One of the most important provisions of the theory of regeneration says that if organotypic regeneration is not observed in natural conditions, then it can be induced and enhanced artificially.
Регенеративная медицина - восстановление нормальной структуры и функций поврежденных или стареющих органов, тканей и клеток человека, за счет появления и внедрения новых технологий: генной и клеточной терапии, стволовых клеток, тканевой инженерии, биомеханических протезов и т.д.Regenerative medicine - restoration of the normal structure and functions of damaged or aging organs, tissues and cells of a person, due to the emergence and implementation of new technologies: gene and cell therapy, stem cells, tissue engineering, biomechanical prostheses, etc.
Областью исследований травматологии и ортопедии является экспериментальная и клиническая разработка новых методов лечения заболеваний и повреждений опорно-двигательной системы и внедрение их в клиническую практику. Трансплантация костной ткани или костнопластических материалов имеет высокую востребованность в современной медицине, стоит на втором месте по частоте пересадок донорских тканей реципиенту после переливания крови. Трансплантационная регенерация кости по костному аутологичному, аллогенному трансплантату или каркасу (костнопластическому материалу) является длительным, ограничивающим подвижность и мучительным для пациента методом лечения, растягивается на многие месяцы и годы, требующим стабилизации костных отломков, иногда иммобилизации конечности, далеко не всегда удается добиться полной реабилитации - костного сращения и избежать повторных хирургических операций и инвалидизации пациента.The area of research in traumatology and orthopedics is the experimental and clinical development of new methods of treating diseases and injuries of the musculoskeletal system and their introduction into clinical practice. Transplantation of bone tissue or osteoplastic materials is in high demand in modern medicine, and is in second place in terms of the frequency of donor tissue transplants to a recipient after blood transfusion. Transplant bone regeneration using an autologous bone graft, allogeneic graft or frame (osteoplastic material) is a long-term, limiting mobility and painful treatment method for the patient, stretches for many months and years, requiring the stabilization of bone fragments, sometimes immobilization of the limb, it is far from always possible to achieve complete rehabilitation - bone fusion and avoid repeated surgeries and patient disability.
Одним из направлений стимуляции репаративного остеогенеза является клеточная терапия. Однако, эффективность клеточных трансплантаций часто недостаточно высока. Это связано с рядом ограничений, требующих преодоления, проведения трансляционных исследований.One of the directions of stimulation of reparative osteogenesis is cell therapy. However, the efficiency of cell transplantation is often not high enough. This is due to a number of limitations that need to be overcome and to carry out translational research.
Можно выделить следующие ограничения клеточной терапии в травматологии и ортопедии.The following limitations of cell therapy in traumatology and orthopedics can be distinguished.
1. Быстрая гибель клеток при трансплантации в виде суспензии.1. Rapid cell death in suspension transplantation.
2. Недостаточно длительное удержание на месте.2. Insufficient long-term retention in place.
3. Потеря жизнеспособности из-за ограниченной передачи сигналов от клетки к клетке и клеточного матрикса.3. Loss of viability due to limited cell-to-cell signaling and cellular matrix.
4. Неконтролируемая микросреда реципиентной области.4. Uncontrolled microenvironment of the recipient area.
5. Недостижение порога количества клеток, необходимого для остеогенеза.5. Failure to reach the threshold of the number of cells required for osteogenesis.
6. Необходимость длительного взаимодействия с организованным субстратом.6. The need for long-term interaction with an organized substrate.
Установлено, что максимум трехмиллиметровые кусочки тканей могут существовать в благоприятной среде без собственной сосудистой сети и нормального кровообращения. Одним из решений проблем клеточной терапии стали разработки клеточных или тканевых сфероидов, как строительных блоков для регенеративной медицины и тканевой инженерии в том числе опорно-двигательного аппарата. Тканевые сфероиды - это плотно упакованные клетки в агрегаты округлой формы, наиболее часто производят диаметром 25-500 микрометров.It has been established that a maximum of three-millimeter pieces of tissue can exist in a favorable environment without their own vasculature and normal blood circulation. One of the solutions to the problems of cell therapy was the development of cellular or tissue spheroids as building blocks for regenerative medicine and tissue engineering, including the musculoskeletal system. Tissue spheroids are densely packed cells in rounded aggregates, most often produced with a diameter of 25-500 micrometers.
Основные преимущества применения клеточных сфероидов в тканевой инженерии костей:The main advantages of using cellular spheroids in bone tissue engineering are:
1. Увеличение жизнеспособности клеток.1. Increased cell viability.
2. Микросреда, приближенная к in vivo.2. Microenvironment close to in vivo.
3. Высокая клеточная емкость для реконструкции.3. High cell capacity for reconstruction.
4. Большая биосовместимость.4. Great biocompatibility.
5. Способность к механотрансдукции.5. Ability to mechanotransduct.
6. Способность к биоинтеграции и клеточной дифференцировке.6. Ability for biointegration and cell differentiation.
Немецкая компания «Со.don" успешно использует тканевые сфероиды ("хондросферы") в клинике с 2008 года для лечения повреждений и хряща. Проведено более 15 тысяч трансплантаций хондросфер 75% из которых завершились успехом. Причем повторная биопсия через 2 года убедительно и объективно продемонстрировала полную регенерацию дефектов хряща хондросферами с образованием аутентичного гиалинового хряща. После завершения успешного клинических испытаний компания получила разрешение в 2018 году использовать данную технологию во всех странах Европейского союза.The German company "Co.don" has been successfully using tissue spheroids ("chondrospheres") in the clinic since 2008 for the treatment of injuries and cartilage. More than 15 thousand chondrosphere transplants have been carried out, 75% of which have been successful. Moreover, repeated biopsy after 2 years has convincingly and objectively demonstrated complete regeneration of cartilage defects by chondrospheres with the formation of authentic hyaline cartilage After the completion of successful clinical trials, the company received permission in 2018 to use this technology in all countries of the European Union.
Известен другой тип тканевых сфероидов - «остеосферы», сформированные из костных клеток для лечения болезней и повреждений кости. Компания "Osteosphere" расположенная в Техасе, США пытается коммерциализировать данную технологию.Known another type of tissue spheroids - "osteospheres", formed from bone cells for the treatment of diseases and bone damage. Osteosphere, based in Texas, USA, is trying to commercialize the technology.
Свойства сфероидов и их регенеративный потенциал зависят от способов их производства. Самый давно известный, широко распространенный, относительно дешевый и простой метод - метод «висячей капли» (hanging drop method), существует много модификаций этого метода. В одной, из которых, клеточную суспензию помещают на крышку чашки Петри в виде капли на несмачиваемой необработанной поверхности полимера, к которой клетки не могут адгезироваться, поэтому клетки спонтанно образуют между собой клеточные агрегаты на дне капли культуральной среды - сфероиды [Susan Breslin, Lorraine O'Driscoll. (2013). Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249]. Любое случайное резкое перемещение, встряхивание смешивает капли, производственный процесс нарушается. Достаточно сложно проводить смену культуральной питательной среды.The properties of spheroids and their regenerative potential depend on the methods of their production. The most well-known, widespread, relatively cheap and simple method is the hanging drop method; there are many modifications of this method. In one of which, the cell suspension is placed on the lid of a Petri dish in the form of a drop on the non-wetted untreated polymer surface, to which the cells cannot adhere, therefore the cells spontaneously form cell aggregates among themselves at the bottom of the culture medium drop - spheroids [Susan Breslin, Lorraine O 'Driscoll. (2013). Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249]. Any accidental sudden movement, shaking mixes the drops, the production process is disrupted. It is quite difficult to change the culture medium.
Один из известных способов производства сфероидов (компания Synthecon, США) основан на принципе клинотации, определяемая как аннулирование силы тяжести при медленном вращении вокруг одной или двух осей. Когда культуральный сосуд с питательной средой и клеточной культурой вращается, клетки или агрегаты клеток ускоряются до предельной (седиментационной) скорости, при которой сила гравитации уравновешены гидродинамическими силами сдвига, центробежной силой и силой Кориолиса. В этих условиях клетки взаимодействуют между собой и образуют клеточные агрегаты. Основной недостаток - плохо контролируемые размеры клеточных агрегатов - большой разброс размеров, соответственно многие агрегаты клеток осаждаются на стенки флаконов в роллерных системах The Rotary Cell Culture System (RCCS) этого производителя.One of the known methods for the production of spheroids (Synthecon, USA) is based on the principle of clinotation, defined as the cancellation of the force of gravity when slowly rotating around one or two axes. When the culture vessel with the nutrient medium and the cell culture rotates, the cells or cell aggregates are accelerated to the limiting (sedimentation) speed at which the force of gravity is balanced by hydrodynamic shear forces, centrifugal force and Coriolis force. Under these conditions, cells interact with each other and form cell aggregates. The main disadvantage is the poorly controlled size of cell aggregates - a large variation in size, therefore, many cell aggregates are deposited on the walls of the vials in The Rotary Cell Culture System (RCCS) roller systems from this manufacturer.
Известна технология 3D клеточных культур, которая максимизирует межклеточные взаимодействия. Клеточные агрегаты образуются в агарозных лунках, имеющих определенные размеры (Microtissues, США). Компания производит силиконовые прецизионные микроформы для литья агарозы 3D Petri Dishes ™, агарозные отпечатки, с которых помещаются в стандартные многолуночные планшеты, заполняемые культуральной питательной средой. В новом 3D Petri Dishes ™ в противоположности обычной чашке Петри, живые клетки не прилипают ко дну чашки, но они самостоятельно прилипают друг к другу и самостоятельно собираются в трехмерные микроткани. Форма лунки затрудняет циркуляцию питательной среды, диффузию кислорода и извлечение клеточных агрегатов. Агарозная лунка в микроформованном агарозном геле имеет 800 мкм - диаметр, глубину - 2000 мкм.Known technology 3D cell culture, which maximizes intercellular interactions. Cell aggregates are formed in agarose wells with a certain size (Microtissues, USA). The company manufactures 3D Petri Dishes ™ silicone precision agarose molds, agarose prints that are placed in standard multi-well plates filled with culture medium. In the new 3D Petri Dishes ™, in contrast to a conventional Petri dish, living cells do not adhere to the bottom of the dish, but they adhere to each other on their own and self-assemble into three-dimensional micro-tissues. The shape of the well hinders the circulation of the nutrient medium, diffusion of oxygen and the extraction of cell aggregates. An agarose well in a microformed agarose gel has a diameter of 800 µm and a depth of 2000 µm.
Одной из особенностей сфероидов, производимых по этому способу, является образование гипоксического ядра в центре клеточного агрегата, в этой центральной области сфероида формируется область апоптоза и гибели клеток.One of the features of spheroids produced by this method is the formation of a hypoxic nucleus in the center of the cell aggregate; in this central region of the spheroid, a region of apoptosis and cell death is formed.
В качестве прототипа настоящего изобретения может быть выбран способ получения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, культивированных в виде сфероидов для стимуляции регенерации костной ткани, описанный в документе RU2675930. Однако данный способ характеризуется рядом ограничений, в частности получаемые сфероиды имеют мелкий размер 50-200 мкм.As a prototype of the present invention, a method for obtaining multipotent mesenchymal stromal cells cultured in the form of spheroids to stimulate bone tissue regeneration, described in document RU2675930, can be selected. However, this method is characterized by a number of limitations, in particular, the resulting spheroids have a small size of 50-200 microns.
Таким образом, несмотря на имеющиеся способы производства клеточных сфероидов, все они характеризуются рядом недостатков и ограничений, поэтому сохраняется необходимость в разработке и создании новых способов и подходов к решению указанных проблем.Thus, despite the existing methods for the production of cell spheroids, they are all characterized by a number of disadvantages and limitations, therefore, there remains a need to develop and create new methods and approaches to solving these problems.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Задача настоящего изобретения состоит в разработке нового способа получение клеточных сфероидов для восстановления костной ткани.The object of the present invention is to develop a new method for producing cell spheroids for bone tissue repair.
Техническим результатом данного изобретения является разработка нового эффективного способа получения сфероидов, в частности на основе клеток надкостницы, для эффективного восстановления костей, обладающих выраженным регенеративным потенциалом.The technical result of this invention is the development of a new effective method for producing spheroids, in particular on the basis of periosteal cells, for effective restoration of bones with a pronounced regenerative potential.
Указанный технический результат достигается посредством осуществления способа получения сфероидов для восстановления костной ткани субъекта, включающий:The specified technical result is achieved by implementing a method for producing spheroids for restoring bone tissue of a subject, including:
- получение адгезивных клеточных культур аутологичных клеток субъекта, представляющих собой 2D культуру клеток.- obtaining adhesive cell cultures of autologous cells of the subject, which is a 2D cell culture.
- 3D культивирование указанных аутологичных клеток субъекта в агарозных лунках, в качестве агарозной лунки используется усеченная пирамидообразная агарозная лунка в виде четырехугольной правильной пирамиды, подача питательной среды осуществляется с помощью электронно-сетчатого распылителя в виде тонкодисперсного аэрозоля с размером капель 1-3 мкм, факел распыления аэрозоля направлен под углом 20-85° к основанию лунки, а наклон агарозных лунок к горизонту составляет 3-5°, причем питательная среда содержит пеногаситель.- 3D culturing of the specified autologous cells of the subject in agarose wells, a truncated pyramid-shaped agarose well in the form of a quadrangular regular pyramid is used as an agarose well, the nutrient medium is supplied using an electron-mesh nebulizer in the form of a fine-dispersed aerosol with a droplet size of 1-3 μm, a spray torch aerosol is directed at an angle of 20-85 ° to the base of the well, and the slope of the agarose wells to the horizon is 3-5 °, and the nutrient medium contains an antifoam agent.
В частных вариантах воплощения изобретения сфероиды представляют собой сфероиды на основе клеток надхрящницы собственного реберного хряща субъекта, сфероиды на основе аутологичных клеток надкостницы субъекта, сфероиды на основе аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и измельченной частично деминерализованной аллогенной кости в виде биокомпозитного ядра сфероида, сфероиды на основе аутологичных клеток надкостницы субъекта и измельченной частично деминерализованной аллогенной кости в виде биокомпозитного ядра сфероида. В более предпочтительных вариантах воплощения изобретения адгезивная клеточная культура аутологичных клеток субъекта представляет собой 2D культуру клеток внутреннего слоя надкостницы субъекта и обладающих остеогенными потенциями. В частных вариантах воплощения изобретения сфероид включает деминерализованный костный матрикс в виде ядра сфероида.In particular embodiments of the invention, the spheroids are spheroids based on perichondrium cells of the subject's own costal cartilage, spheroids based on autologous cells of the subject's periosteum, spheroids based on autologous multipotent mesenchymal bone marrow stromal cells and crushed partially demineralized allogenic bone in the form of a biocomposite spheroid core based on autologous cells of the subject's periosteum and crushed partially demineralized allogeneic bone in the form of a biocomposite spheroid core. In more preferred embodiments of the invention, the adhesive cell culture of the autologous cells of the subject is a 2D culture of cells of the inner layer of the periosteum of the subject and having osteogenic potencies. In particular embodiments of the invention, the spheroid comprises a demineralized bone matrix in the form of a spheroid core.
В частных вариантах воплощения изобретения питательная среда для культивирования в качестве пеногасителя включает симетикон в количестве 5 мг на 1 литр питательной среды на этапе 3D культивирования.In particular embodiments of the invention, the culture medium for cultivation as an antifoam agent comprises simethicone in an amount of 5 mg per 1 liter of the culture medium at the stage of 3D cultivation.
В частных вариантах воплощения изобретения питательная среда для культивирования включает тромболизат человека 5-10% и дексаметазон в концентрации 5 мкг на литр среды, без ксеногенной фетальной бычьей сыворотки.In particular embodiments of the invention, the culture medium comprises human thrombolysate 5-10% and dexamethasone at a concentration of 5 μg per liter of medium, without xenogenic fetal bovine serum.
В частных вариантах воплощения изобретения усеченная пирамидообразная агарозная лунка в виде четырехугольной правильной пирамиды характеризуется тем, что высота пирамиды 1200 мкм, в основании квадрат с размером стороны 600 мкм.In particular embodiments of the invention, a truncated pyramid-shaped agarose well in the form of a quadrangular regular pyramid is characterized in that the height of the pyramid is 1200 µm, at the base is a square with a side size of 600 µm.
В частных вариантах воплощения изобретения агарозная лунка находиться в стерильной воздушной среде CO2-инкубатора с повышенным до 5% содержанием углекислого газа и при 100% влажности, при термостатировании газовой фазы 36,6°С.In particular embodiments of the invention, the agarose well is located in a sterile air environment of a CO 2 incubator with an increased carbon dioxide content of up to 5% and at 100% humidity, while the gas phase is thermostated at 36.6 ° C.
В частных вариантах воплощения изобретения размер сфероида составляет 400-800 мкм.In particular embodiments of the invention, the spheroid size is 400-800 microns.
В частных вариантах воплощения изобретения размер сфероида составляет 600 мкм.In particular embodiments of the invention, the spheroid size is 600 μm.
В частных вариантах воплощения изобретения размер биомпозитного ядра сфероида составляет 300-500 мкм.In particular embodiments of the invention, the size of the spheroid biomposite core is 300-500 μm.
В частных вариантах воплощения изобретения размер биомпозитного ядра сфероида составляет 300 мкм.In particular embodiments of the invention, the size of the spheroid biomposite core is 300 μm.
В частных вариантах воплощения изобретения в лунку помещают перед началом 3D культивирования 10000-20000 клеток.In particular embodiments of the invention, 10,000 to 20,000 cells are placed in the well prior to 3D culturing.
В частных вариантах воплощения изобретения субъект представляет собой человека.In particular embodiments of the invention, the subject is a human.
В частных вариантах воплощения изобретения 3D культивирование осуществляется в течение 7-21 дней.In particular embodiments of the invention, 3D cultivation is carried out for 7-21 days.
Краткое описание чертежей.Brief description of the drawings.
Фигура 1. Схема строения агарозной лунки:Figure 1. Scheme of the structure of the agarose well:
А) схема строения агарозной лунки 3D Petri Dishes ™ (Microtissues, США) (затруднена диффузия кислорода);A) a diagram of the structure of a 3D Petri Dishes ™ agarose well (Microtissues, USA) (diffusion of oxygen is difficult);
Б) схема строения агарозной лунки по изобретению (более активный рост сфероидов).B) a diagram of the structure of the agarose well according to the invention (more active growth of spheroids).
На фиг.1 цифрами обозначены следующие позиции:In Fig. 1, the following positions are indicated by numbers:
10 - уровень питательной среды.10 - the level of the nutrient medium.
Фигура 2. Схема расположения панели с агарозными лунками в культуральном флаконе с подачей высокодисперстного аэрозоля из питательной среды. На фиг.2 цифрами обозначены следующие позиции:Figure 2. Layout of a panel with agarose wells in a culture flask with a fine aerosol supplied from a nutrient medium. In figure 2, the following positions are indicated by numbers:
1. Мэш-небулайзер с автоматической подачей питательной среды в резервуар не-булайзера;1. Mesh nebulizer with automatic feeding of the culture medium into the non-bulizer reservoir;
2. Патрубок соединяющий Мэш-небулайзер с культуральным флаконом;2. A branch pipe connecting the Mash-nebulizer with the culture flask;
3. Культуральный флакон (матрас для клеточных культур) с поддающейся повторной герметизации боковой крышкой с вентилируемой крышкой со встроенным фильтром (Techno Plastic Products AG);3. Culture vial (cell culture mattress) with a resealable side cap with a vented cap with built-in filter (Techno Plastic Products AG);
4. Чашка с агарозой и лунками;4. A plate with agarose and wells;
5. Агарозная лунка;5. Agarose well;
6. Вентиллируемая крышка со встроенным фильтром культурального флакона;6. Vented cap with built-in filter of the culture flask;
7. Боковая крышка культурального флакона, открывающаяся.7. Openable side cover of the culture flask.
Определение и терминыDefinition and terms
Различные термины, относящиеся к объектам настоящего изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения. Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое значение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.Various terms related to the objects of the present invention are used above and also in the description and in the claims. Unless otherwise specified, all technical and scientific terms used in this application have the same meaning as understood by those skilled in the art. References to techniques used in describing the present invention refer to well known techniques, including modifying these techniques and replacing them with equivalent techniques known to those skilled in the art.
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».In the description of this invention, the terms "includes" and "including" are interpreted as meaning "includes, among other things". These terms are not intended to be construed as “consists only of”.
В описании данного изобретения термин «ткань» относится к системе клеток и неклеточных структур, обладающих общностью строения, в ряде случаев общностью происхождения, и специализированные на выполнении определенных функций.In the description of this invention, the term "tissue" refers to a system of cells and non-cellular structures that have a common structure, in some cases a common origin, and specialized in performing certain functions.
Используемый в данном документе термин «дефект» относится к хрящевой или костной ткани, если она отсутствует, уменьшено ее количество или она иначе повреждена. Дефект скелетных соединительных тканей может быть результатом заболевания, лечения заболевания или травмы.As used herein, the term "defect" refers to cartilage or bone tissue if it is absent, reduced in quantity, or otherwise damaged. A skeletal connective tissue defect can result from disease, treatment for a disease, or injury.
Термин «адгезивная культура» в настоящем документе означает монослойную культуру клеток, способных посредством своих рецепторов прикрепляться к культуральному пластику или стеклу, при наличии определенных условий эти клетки будут прикрепляться к субстрату и в норме будут делиться и распространяться таким способом.The term "adhesive culture" in this document means a monolayer culture of cells capable of attaching through their receptors to culture plastic or glass, under certain conditions, these cells will attach to the substrate and normally divide and spread in this way.
Используемый в данной заявке термин «сфероиды» относится к плотно упакованным клеточным агрегатам шарообразной формы, сформированных путем трехмерного культивирования. Их важным свойством является способность к взаимной адгезии и последующему тканевому слиянию, а также к адгезии к элементам внеклеточного матрикса. Сфероиды, согласно изобретению, характеризуются размером 400-800 мкм, в предпочтительных вариантах 600 мкм. Сфероиды согласно настоящему изобретению могут быть получены на основе клеток надхрящницы собственного реберного хряща субъекта, сфероиды на основе аутологичных клеток надкостницы субъекта, сфероиды на основе аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и измельченной частично деминерализованной аллогенной кости в виде ядра сфероида, сфероиды на основе аутологичных клеток надкостницы субъекта и измельченной частично деминерализованной аллогенной кости в виде ядра сфероида.Used in this application, the term "spheroids" refers to tightly packed ball-shaped cell aggregates formed by three-dimensional cultivation. Their important property is the ability for mutual adhesion and subsequent tissue fusion, as well as for adhesion to the elements of the extracellular matrix. Spheroids, according to the invention, are characterized by a size of 400-800 microns, in preferred embodiments 600 microns. Spheroids according to the present invention can be obtained on the basis of perichondrium cells of the subject's own costal cartilage, spheroids based on autologous cells of the subject's periosteum, spheroids based on autologous multipotent mesenchymal bone marrow stromal cells and crushed partially demineralized allogeneic bone in the form of a spheroid nucleus, spheroids based on autologous the periosteum of the subject; and crushed partially demineralized allogeneic bone in the form of a spheroid core.
Клетки камбиального слоя надкостницы содержат скелетогенные клетки - остеобласты, преостеобласты и стволовые скелетогенные клетки.The cells of the cambial layer of the periosteum contain skeletal cells - osteoblasts, preosteoblasts, and skeletal stem cells.
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) костного мозга - гетерогенная популяция клеток стромы костного мозга, способная к дифференцировке в клетки, имеющие мезенхимальное происхождение: адипоциты, остеоциты, хондроциты, а также в особых условиях in vitro в клетки эктодермального и энтодермального фенотипа.Bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells (MMSCs) are a heterogeneous population of bone marrow stroma cells capable of differentiation into cells of mesenchymal origin: adipocytes, osteocytes, chondrocytes, as well as under special conditions in vitro into cells of the ectodermal and endodermal phenotype.
Используемый в данной заявке термин «трансплантат» относится к сфероидам, а термин «трансплантация» - это процесс пересадки указанного трансплантата на основе сфероидов в организм субъекта, как правило, для устранения дефекта скелетных соединительных тканей.As used in this application, the term "graft" refers to spheroids, and the term "transplant" is the process of transplanting said spheroid-based graft into a subject, typically to repair a skeletal connective tissue defect.
«Композиты» - это материалы-конструкции, они конструируются из двух, трех или более материалов, обладающих различными свойствами и достаточно надежно соединенных друг с другом, чтобы обеспечить работу полученной системы как единого целого. Биокомпозиты - это конструкции, созданные природой."Composites" are materials of construction, they are constructed from two, three or more materials with different properties and reliably enough connected to each other to ensure the operation of the resulting system as a whole. Biocomposites are structures created by nature.
«Кость» - орган опорно-двигательного аппарата, построенный преимущественно из костной ткани. Кость с позиции материаловедения - это биокомпозит или полимерный композит. Исследованиями их свойств интенсивно занимаются специалисты в области композитов. Известно, что костная ткань содержит три основных компонента - минеральное вещество гидроксилапатит (~70%), органическое вещество на основе белка коллагена (~20%) и воду (~10%)."Bone" is an organ of the musculoskeletal system, built primarily of bone tissue. From the point of view of materials science, bone is a biocomposite or a polymer composite. Experts in the field of composites are intensively studying their properties. It is known that bone tissue contains three main components - the mineral substance hydroxylapatite (~ 70%), organic matter based on collagen protein (~ 20%) and water (~ 10%).
Частицы деминерализованной кости по изобретению (деминерализованный костный матрикс в виде ядра сфероида), в частности, представляют собой костнопластический материал Перфоост.Particles of demineralized bone according to the invention (demineralized bone matrix in the form of a spheroid core), in particular, are bone-grafting material Perfoost.
Подробное раскрытие изобретенияDetailed disclosure of the invention
Клетки внутреннего слоя надкостницы являются камбием, содержащим остеоген-ные клетки, принимающим активное участие в костной регенерации.The cells of the inner layer of the periosteum are cambium containing osteogenic cells, which takes an active part in bone regeneration.
Условия реализации костеобразовательных потенций надкостницы:Conditions for the implementation of bone-forming potencies of the periosteum:
1. Надкостница и суставные хрящи оставляются на своих прежних местах.1. The periosteum and articular cartilage are left in their original places.
2. На разрез надкостницы накладываются хирургические швы, для восстановления ее целостности и препятствия врастанию внутрь параоссальных тканей.2. Surgical sutures are applied to the periosteum incision to restore its integrity and prevent the ingrowth of paraosseous tissues inside.
3. При регенерации первоначально формируется «грубая модель будущей кости», которая состоит в значительной мере из хряща. Хрящевая матрица замещается полноценной новообразованной костью-регенератом.3. During regeneration, a "rough model of the future bone" is initially formed, which consists largely of cartilage. The cartilaginous matrix is replaced by a full-fledged newly formed regenerated bone.
Агарозные лунки создаются в агарозе (силиконовая форма с выпячиваниями в форме лунок заливается агарозой - получается отливка) и они (слой агарозы с множественными лунками в ней) в чашке переносятся в культуральный флакон (фиг.2). Дно чашки расположено под углом к дну культурального флакона. И уже в этом флаконе переносятся в СО2-инкубатор. Поднятый ободок в чашке по высоте соответствует уровню залитой агарозы. Он не мешает сливу питательной среды с поверхности агарозы. В культуральном флаконе делается специальное дополнительное отверстие для соединения небулайзера с емкостью флакона через патрубок, который герметично соединен с флаконом и небулайзером. Факел аэрозоля падает на поверхность агарозы и создает ток питательной среды по поверхности. Применяемая в данном изобретении технология получения аэрозоля - Меш-технология распыления (Vibrating Mesh Technology, технология основана на «просеивании» (проталкивании) питательной среды через сетку-мембрану с множеством микроскопических отверстий) позволяет выращивать сфероиды, сохраняя все свойства питательной среды, и получать очень мелкие капли 1-3 мкм (высокодисперсные аэрозоли) питательной среды. Толщина слоя текущей питательной среды около 2-3 мкм.Agarose wells are created in agarose (a silicone mold with protrusions in the shape of wells is filled with agarose - a casting is obtained) and they (a layer of agarose with multiple wells in it) in a dish are transferred into a culture flask (Fig. 2). The bottom of the dish is at an angle to the bottom of the culture flask. And already in this bottle they are transferred to a CO 2 incubator. The raised rim in the dish corresponds in height to the level of the embedded agarose. It does not interfere with the drainage of the nutrient medium from the agarose surface. A special additional hole is made in the culture flask to connect the nebulizer with the capacity of the flask through a branch pipe, which is hermetically connected to the flask and the nebulizer. An aerosol torch falls on the agarose surface and creates a flow of nutrient medium over the surface. The aerosol production technology used in this invention - Vibrating Mesh Technology (Vibrating Mesh Technology, the technology is based on "sifting" (pushing) the nutrient medium through a mesh-membrane with many microscopic holes) allows you to grow spheroids, preserving all the properties of the nutrient medium, and get very small drops of 1-3 microns (highly dispersed aerosols) of the nutrient medium. The thickness of the layer of the current nutrient medium is about 2-3 microns.
В эксперименте удается в указанных выше агарозных лунках формировать жизнеспособные сфероиды с выраженным регенераторным потенциалом заданных размеров.In the experiment, it is possible to form viable spheroids with a pronounced regenerative potential of a given size in the above agarose wells.
Такой способ выращивания позволяет более эффективно обеспечить подачу растворенных питательных веществ и кислорода к сфероидам, а также повысить эффективность воздействия газотрансмиттеров (при их добавлении в газовую фазу культуральной среды) на 3D клеточные культуры, в том числе на клеточные агрегаты и сфероиды.This method of cultivation makes it possible to more efficiently provide the supply of dissolved nutrients and oxygen to the spheroids, as well as to increase the efficiency of the effect of gas transmitters (when added to the gas phase of the culture medium) on 3D cell cultures, including cell aggregates and spheroids.
Пример реализации способа по изобретению.An example of the implementation of the method according to the invention.
Этапы выполнения способа.Stages of the method.
1. Под общим наркозом у кролика в ходе небольшой хирургической операции в асептических условиях производиться забор надкостницы с передней поверхности большеберцовой кости размером 4 на 1 см. Рана ушивается.1. Under general anesthesia in a rabbit during a small surgical operation under aseptic conditions, the periosteum is taken from the anterior surface of the tibia measuring 4 by 1 cm. The wound is sutured.
2. Надкостница передается в клеточную лабораторию. С помощью скальпеля производиться выскабливание внутреннего росткового слоя надкостницы, с последующим помещением кусочков тканей в раствор коллагеназы для получения диспергированных клеток.2. The periosteum is transferred to the cell laboratory. With the help of a scalpel, scraping of the inner growth layer of the periosteum is performed, followed by placing pieces of tissue in a collagenase solution to obtain dispersed cells.
3. Клетки надкостницы переносятся в культуральные флаконы (обработанная поверхность дна флакона для адгезивных культур) с питательной средой и культивируются в системе 2D, как адгезивные клеточные культуры. В питательной среде отсутствует ксеногенная фетальная бычья сыворотка, вместо которой используется человеческий тромболизат. Лизаты тромбоцитов способствуют расширению мезенхимальных стволовых клеток и являются безопасным заменителем сыворотки животных в клеточной терапии (Doucet С, Ernou I, Zhang Y, Llense JR, Begot L, Holy X, et al. Platelet lysates promote mesenchymal stem cell expansion: a safety substitute for animal serum in cell-based therapy applications. J Cell Physiol. 2005; 205(2):228-36), более того, соединительнотканного происхождения клетки размножающиеся в тромболизатах, растут быстрее по сравнению с клетками, размноженными в среде, обогащенной фетальной бычьей сывороткой. Питательная среда - среда ДМЕМ с L-глутамином (ПанЭко, РФ), 10% тромболизатом (PLTGold® Human Platelet Lysate Merck), пенициллин-стрептомициновая смесь (пенициллин-стрептомицин, 100-кратный раствор, рабочая концентрация 10 мл/л (ПанЭко, РФ) с добавлением дексаметазона (0,1 мкМ дексаметазона (Sigma, США). Может быть использована среда бессывороточная, среда StemPro MSC SFM CTS (Thermo FS).3. Periosteal cells are transferred into culture flasks (treated bottom surface of an adhesive culture flask) with a growth medium and cultured in a 2D system as an adhesive cell culture. The nutrient medium lacks xenogenic fetal bovine serum, instead of which human thrombolysate is used. Platelet lysates promote the expansion of mesenchymal stem cells and are a safe substitute for animal serum in cell therapy (Doucet C, Ernou I, Zhang Y, Llense JR, Begot L, Holy X, et al. Platelet lysates promote mesenchymal stem cell expansion: a safety substitute for animal serum in cell-based therapy applications. J Cell Physiol. 2005; 205 (2): 228-36), moreover, of connective tissue origin, cells multiplying in thrombolysates grow faster than cells multiplied in a medium enriched with fetal bovine serum ... Nutrient medium - DMEM medium with L-glutamine (PanEco, RF), 10% thrombolysate (PLTGold® Human Platelet Lysate Merck), penicillin-streptomycin mixture (penicillin-streptomycin, 100-fold solution, working
4. Суспензия клеточной культуры клеток надкостницы переносят в виде суспензии в агарозные лунки (форма лунки в виде усеченной пирамиды) в количестве 20000 клеток на 1 лунку, куда предварительно погружают частицу частично деминерализованной аллогенной кости, для последующего 3D культивирования и образования клеточных агрегатов, окружающих ядро из заготовленной костной ткани.4. Suspension of cell culture of periosteal cells is transferred as a suspension into agarose wells (shaped like a truncated pyramid) in the amount of 20,000 cells per well, where a particle of partially demineralized allogeneic bone is preliminarily immersed, for subsequent 3D culturing and the formation of cell aggregates surrounding the nucleus from harvested bone tissue.
5. Агарозные лунки переносят в CO2-инкубатор с повышенным до 5% содержанием углекислого газа и при 100% влажности, при термостатировании газовой фазы 36,6°С внутри инкубатора.5. Agarose wells are transferred to a CO 2 -incubator with an increased carbon dioxide content of up to 5% and at 100% humidity, while the gas phase is thermostated at 36.6 ° C inside the incubator.
6. Внутри CO2-инкубатора находиться электронно-сетчатый распылитель питательной культуральной среды в виде тонкодисперсного аэрозоля с размером капель 1-3 мкм, факел распыления аэрозоля питательной среды направлен под углом 20-85 градусов к основанию лунки. Питательная среда - среда ДМЕМ с L-глутамином (ПанЭко, РФ), 10% тромболизатом (PLTGold® Human Platelet Lysate Merck), пенициллин-стрептомициновая смесь (Пенициллин-стрептомицин, 100-кратный раствор, рабочая концентрация 10 мл/л (ПанЭко, РФ) с добавлением дексаметазона (0,1 мкМ дексаметазона (Sigma, США), с добавлением симетикона в количестве 5 мг на 1 литр питательной среды. Может быть использована среда бессывороточная StemPro MSC SFM CTS (Thermo FS) с добавлением дексаметазона (0,1 мкМ дексаметазона (Sigma, США), с добавлением пеногасителя симетикона в количестве 5 мг на 1 литр питательной среды.6. Inside the CO 2 incubator there is an electron-mesh nebulizer of the culture medium in the form of a fine aerosol with a droplet size of 1-3 microns, the aerosol spray of the culture medium is directed at an angle of 20-85 degrees to the base of the well. Nutrient medium - DMEM medium with L-glutamine (PanEco, RF), 10% thrombolysate (PLTGold® Human Platelet Lysate Merck), penicillin-streptomycin mixture (Penicillin-streptomycin, 100-fold solution, working
7. Рост клеточных сфероидов из клеток надкостницы в 3D культуре может продолжаться до 14 суток.7. Growth of cell spheroids from periosteal cells in 3D culture can last up to 14 days.
8. Сфероиды извлекаются из агарозных лунок, отмываются от культуральной питательной среды в теплом растворе F12 и виде суспензии набираются в шприц для трансплантации субъекту, в частности в организм модельного животного как трансплантаты - источники костной регенерации, а также как субстрат для трансплантационной регенерации кости.8. Spheroids are removed from the agarose wells, washed from the culture medium in warm F12 solution and drawn into a syringe for transplantation to a subject, in particular into a model animal's body, as grafts - sources of bone regeneration, and also as a substrate for transplant bone regeneration.
В известных агарозных лунках большая глубина, и цилиндрическая форма, поэтому извлечение сфероидов затруднено, часто необходимо центрифугировать агарозные формы с лунками, чтобы извлечь оттуда сфероиды. Диффузия питательных веществ и кислорода затруднено, так как стоит над сфероидом неподвижный более высокий столб питательной среды с узким входным отверстием (фиг.1, а).The known agarose wells have great depth and cylindrical shape, so the extraction of spheroids is difficult, it is often necessary to centrifuge the agarose molds with wells in order to extract the spheroids from there. Diffusion of nutrients and oxygen is difficult, since there is a stationary, higher column of the nutrient medium with a narrow inlet above the spheroid (Fig. 1, a).
В способе по изобретению над отверстием в лунку постоянный микроток питательной среды, более активная подача питательных веществ и более высокая смешиваемость питательной среды с агарозной лунке, эта питательная среда мелко распылена и активно орошает лунки, количество растворенного кислорода в ней выше, отверстие более широкое и расширяемое кверху, поэтому извлечение сфероидов сложностей не вызывает, при росте сфероида, он поднимается к выходному отверстию (фиг.1, б). Ток питательной среды над лункой в 2-4 мкм толщиной способствует низкоамплитудным движениям и неполному вращению сфероидов, что оказывает благоприятное влияние на их рост и препятствует миграции клеток наружу из лунки. В таком способе больше скорость наращивания биомассы сфероидов и выше клеточность самого сфероида (клетки более активно пролиферируют и плотность клеток в клеточном агрегате выше). Форма лунки в виде усеченной пирамиды легче изготавливать, меньше бракованных заливок.In the method according to the invention, a constant microcurrent of the nutrient medium above the hole in the well, a more active supply of nutrients and a higher miscibility of the nutrient medium with the agarose well, this nutrient medium is finely atomized and actively irrigates the wells, the amount of dissolved oxygen in it is higher, the opening is wider and expandable upward, therefore, the extraction of spheroids does not cause difficulties, with the growth of the spheroid, it rises to the outlet (Fig. 1, b). The current of the nutrient medium above the hole, 2-4 microns thick, promotes low-amplitude movements and incomplete rotation of the spheroids, which has a beneficial effect on their growth and prevents the migration of cells out of the hole. In this method, the rate of growth of the spheroid biomass is higher and the cellularity of the spheroid itself is higher (cells proliferate more actively and the density of cells in the cell aggregate is higher). The shape of the hole in the form of a truncated pyramid is easier to manufacture, there are fewer defective fillings.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.Although the invention has been described with reference to the disclosed embodiments, it should be apparent to those skilled in the art that the specific experiments described in detail are provided for the purpose of illustrating the present invention only and should not be construed as in any way limiting the scope of the invention. It should be understood that various modifications are possible without departing from the spirit of the present invention.
Claims (12)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020128818A RU2747087C1 (en) | 2020-08-31 | 2020-08-31 | Method for production of biocomposite spheroids for bone restoration |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020128818A RU2747087C1 (en) | 2020-08-31 | 2020-08-31 | Method for production of biocomposite spheroids for bone restoration |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2747087C1 true RU2747087C1 (en) | 2021-04-26 |
Family
ID=75584955
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020128818A RU2747087C1 (en) | 2020-08-31 | 2020-08-31 | Method for production of biocomposite spheroids for bone restoration |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2747087C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2818176C1 (en) * | 2023-07-21 | 2024-04-25 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии имени Н.Н. Приорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТО им. Н.Н. Приорова" Минздрава России) | Method for producing tissue-engineered periosteum from cell spheroids for repairing bone defects in patients |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU94575U1 (en) * | 2009-07-07 | 2010-05-27 | Федеральное государственное учреждение "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" РФ | MATRIX FOR CULTIVATION OF CELLS AND CELL GROWTH |
| RU2530622C2 (en) * | 2012-03-01 | 2014-10-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Biotransplant for recovery of bone tissue volume in case of degenerative diseases and traumatic injuries of bones and method of obtaining thereof |
| RU2539831C1 (en) * | 2014-02-14 | 2015-01-27 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of preparing cellular cultures in form of spheroids for formation of biologically engineered construction of front layers of artificial cornea |
| RU2636464C2 (en) * | 2015-11-23 | 2017-11-23 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова" (МГУ) | Method for obtaining and application of tissue engineering structures based on progenital cells for heart diseases treatment |
| RU2661105C2 (en) * | 2016-01-21 | 2018-07-11 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-технический центр "БиоКлиникум" | Method for producing spheroids of heparg cells in a medium without dimethyl sulphoxide |
| RU2675930C1 (en) * | 2017-07-21 | 2018-12-25 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" (ФГБНУ "НИИОПП") | Cell culture and biotransplant for bone tissue regeneration on its basis |
| RU2704094C1 (en) * | 2019-05-16 | 2019-10-23 | федеральное государственное автономное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of transplantation of retinal pigment epithelium in the form of multicellular 3d spheroids in experiment |
| RU2721532C1 (en) * | 2018-12-12 | 2020-05-19 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" (ФГБНУ "НИИОПП") | Cell culture and biotransplant for bone tissue regeneration based thereon |
-
2020
- 2020-08-31 RU RU2020128818A patent/RU2747087C1/en active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU94575U1 (en) * | 2009-07-07 | 2010-05-27 | Федеральное государственное учреждение "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" РФ | MATRIX FOR CULTIVATION OF CELLS AND CELL GROWTH |
| RU2530622C2 (en) * | 2012-03-01 | 2014-10-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Biotransplant for recovery of bone tissue volume in case of degenerative diseases and traumatic injuries of bones and method of obtaining thereof |
| RU2539831C1 (en) * | 2014-02-14 | 2015-01-27 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of preparing cellular cultures in form of spheroids for formation of biologically engineered construction of front layers of artificial cornea |
| RU2636464C2 (en) * | 2015-11-23 | 2017-11-23 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова" (МГУ) | Method for obtaining and application of tissue engineering structures based on progenital cells for heart diseases treatment |
| RU2661105C2 (en) * | 2016-01-21 | 2018-07-11 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-технический центр "БиоКлиникум" | Method for producing spheroids of heparg cells in a medium without dimethyl sulphoxide |
| RU2675930C1 (en) * | 2017-07-21 | 2018-12-25 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" (ФГБНУ "НИИОПП") | Cell culture and biotransplant for bone tissue regeneration on its basis |
| RU2721532C1 (en) * | 2018-12-12 | 2020-05-19 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" (ФГБНУ "НИИОПП") | Cell culture and biotransplant for bone tissue regeneration based thereon |
| RU2704094C1 (en) * | 2019-05-16 | 2019-10-23 | федеральное государственное автономное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of transplantation of retinal pigment epithelium in the form of multicellular 3d spheroids in experiment |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| CESARZ Z. Spheroid culture of mesenchymal stem cells, Stem Cells Int., 2016, no.5, p.1-11. * |
| ГРЯДУНОВА А.А. и др. Масштабируемая биофабрикация и морфологическая оценка тканевых сфероидов, Клиническая и экспериментальная морфология, 2019, том 8, no.2, стр.12-20. * |
| САБУРИНА И.Н., РЕПИН В.С. 3D-культивирование:от отдельных клеток к регерационной ткани, Гены и Клетки, 2010, том V, no.2, стр.75-86. * |
| САБУРИНА И.Н., РЕПИН В.С. 3D-культивирование:от отдельных клеток к регерационной ткани, Гены и Клетки, 2010, том V, no.2, стр.75-86. ГРЯДУНОВА А.А. и др. Масштабируемая биофабрикация и морфологическая оценка тканевых сфероидов, Клиническая и экспериментальная морфология, 2019, том 8, no.2, стр.12-20. CESARZ Z. Spheroid culture of mesenchymal stem cells, Stem Cells Int., 2016, no.5, p.1-11. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2819284C2 (en) * | 2022-06-29 | 2024-05-16 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии имени Н.Н. Приорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТО им. Н.Н. Приорова" Минздрава России) | Method of producing tissue-engineered periosteum from cell spheroids for repairing bone defects of subject |
| RU2818176C1 (en) * | 2023-07-21 | 2024-04-25 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии имени Н.Н. Приорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТО им. Н.Н. Приорова" Минздрава России) | Method for producing tissue-engineered periosteum from cell spheroids for repairing bone defects in patients |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Logeart‐Avramoglou et al. | Engineering bone: challenges and obstacles | |
| US6886568B2 (en) | Method for fabricating cell-containing implants | |
| Yin et al. | Agarose particle-templated porous bacterial cellulose and its application in cartilage growth in vitro | |
| Chen et al. | Stem cell-delivery therapeutics for periodontal tissue regeneration | |
| WO2006112684A1 (en) | Transplantation of differentiated immature adipocytes and biodegradable scaffold for tissue augmentation | |
| JP6434014B2 (en) | Method for producing spherical chondrocyte therapeutic agent | |
| WO2013176131A1 (en) | Template base for use in production of artificial tissue body for transplantation | |
| EP2644695B1 (en) | Cultured cartilage tissue material | |
| Ladeira et al. | Core–shell microcapsules: biofabrication and potential applications in tissue engineering and regenerative medicine | |
| JP5876934B2 (en) | Tissue regeneration construct and method for producing tissue regeneration construct | |
| Jin et al. | Establishment of three‐dimensional tissue‐engineered bone constructs under microgravity‐simulated conditions | |
| JP2009532054A (en) | 3D cell culture | |
| RU2747087C1 (en) | Method for production of biocomposite spheroids for bone restoration | |
| CN114848895A (en) | 3D printing titanium alloy porous support loaded double-factor shell-core microsphere slow release system | |
| Zhou et al. | Study on a 3D-Bioprinted tissue model of self-assembled nanopeptide hydrogels combined with adipose-derived mesenchymal stem cells | |
| JP2004129549A (en) | Selective growth method for mesenchymal stem cell from fat-derived cell group | |
| CN103874763A (en) | Preparation of parental cell bank from foetal tissue | |
| RU2731314C1 (en) | Method for production of spheroids for cartilage repair | |
| RU2586952C1 (en) | Method of treating hepatic failure | |
| RU2800991C9 (en) | Method of biofabrication of a transplant in the form of cell spheroids for regenerative technologies for restoring a subject's cartilage based on the subject's own costal cartilage perichondrium and multipotent mesenchymal stromal bone marrow cells of the same subject | |
| George et al. | Tissue engineering and regenerative medicines: an interdisciplinary understanding | |
| RU2744732C1 (en) | Biocomposite spheroid for bone repair and method of its preparation | |
| RU2800991C2 (en) | Method of biofabrication of a transplant in the form of cell spheroids for regenerative technologies for restoring a subject's cartilage based on the subject's own costal cartilage perichondrium and multipotent mesenchymal stromal bone marrow cells of the same subject | |
| RU2818176C1 (en) | Method for producing tissue-engineered periosteum from cell spheroids for repairing bone defects in patients | |
| RU2744756C1 (en) | Method of transplanting biocomposite spheroids to ensure the possibility of restoring the integrity of the bone in case of defects that exceed the critical size |