RU2741239C1

RU2741239C1 - Diagnostic technique for cattle leukemia

Info

Publication number: RU2741239C1
Application number: RU2020127621A
Authority: RU
Inventors: Анатолий Михайлович Коваленко; Ирина Михайловна Донник; Назар Валентинович Явников; Максим Валерьевич Петропавловский; Анна Сергеевна Кривоногова; Альбина Геннадьевна Исаева; Виктория Юрьевна Оскольская; Светлана Николаевна Беляева
Priority date: 2020-08-18
Filing date: 2020-08-18
Publication date: 2021-01-22

Abstract

FIELD: veterinary science.SUBSTANCE: invention relates to veterinary science and concerns a method for diagnosis of cattle leukemia. Substance of the method consists in that the immunodiffusion reaction is carried out for this purpose, concentration of immunoglobulins containing specific antibodies is performed by means of centrifugation of blood serum at 2 thousand rpm for 5 minutes. Immunodiffusion reaction is carried out at 37°C in a thermostat, holding agar with analyzed material for 48 hours.EFFECT: use of the method enables detecting animals infected with leucosis at earlier stages in the initial period of producing anti-leukemia antibodies.1 cl, 1 tbl, 7 ex

Description

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к способам диагностики лейкоза крупного рогатого скота.The invention relates to the field of veterinary medicine, in particular to methods for the diagnosis of leukemia in cattle.

Лейкоз крупного рогатого скота - хроническое инфекционное заболевание, распространенное по всему миру. Лейкозом болеет крупный рогатый скот всех возрастов. Болезнь протекает вначале бессимптомно, затем проявляется персистентным лимфоцитозом и/или образованием опухолевидных разрастаний в кроветворных и других органах и тканях.Bovine leukemia is a chronic infectious disease spread throughout the world. Leukemia affects cattle of all ages. The disease is initially asymptomatic, then manifests itself as persistent lymphocytosis and / or the formation of tumor-like growths in hematopoietic and other organs and tissues.

Среди болезней животных лейкоз крупного рогатого скота прочно занимает первое место среди инфекционных болезней, поэтому проблема своевременной эффективной диагностики лейкоза крупного рогатого скота стоит остро. В связи с этим совершенствование способов прижизненной диагностики лейкоза крупного рогатого скота актуально.Among animal diseases, bovine leukemia firmly ranks first among infectious diseases, therefore the problem of timely and effective diagnosis of bovine leukemia is acute. In this regard, improving the methods of intravital diagnostics of cattle leukemia is important.

Известен способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота путем проведения поэтапной иммобилизации на твердом носителе антигена вируса лейкоза. В результате его специфического иммунологического связывания с адсорбированными моноклональными антителами мыши против гликопротеидного антигена вируса лейкоза, внесение и инкубацию контрольных и анализируемых образцов сыворотки крови или молока крупного рогатого скота, внесение и инкубацию антител к иммуноглобулинам крупного рогатого скота, меченных пероксидазой, внесение субстрата ферментативной реакции и учет результатов реакции по величине оптической плотности анализируемых образцов. [RU 2377962 C1, A61D 99/00 (2006.01), 10.01.2010 г.]. Данный метод непрямого иммуноферментного анализа обладает высокой чувствительностью и специфичностью, однако его методика выполнения в три этапа требует специализированного оборудования и высококвалифицированного персонала.A known method for the diagnosis of leukemia in cattle by stage-by-stage immobilization on a solid carrier of the antigen of the leukemia virus. As a result of its specific immunological binding with adsorbed mouse monoclonal antibodies against the glycoprotein antigen of the leukemia virus, the introduction and incubation of control and analyzed samples of blood serum or cattle milk, the introduction and incubation of antibodies to cattle immunoglobulins labeled with peroxidase and an enzyme reaction taking into account the reaction results by the optical density of the analyzed samples. [RU 2377962 C1, A61D 99/00 (2006.01), 10.01.2010]. This method of indirect enzyme-linked immunosorbent assay has high sensitivity and specificity, however, its three-stage technique requires specialized equipment and highly qualified personnel.

Известен способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота, который включает серологическое исследование крови серонегативных животных на лейкоз с применение РИД в течение 5 дней после учета и оценки реакции на ППД-туберкулин для млекопитающих. При этом ППД-туберкулин для млекопитающих разводят 10% раствором левамизола из расчета 20 мл на 1 млн. ME. [RU 2620558 C1, G01N 33/49 (2006.01), G01N 33/53 (2006.01), G01N 33/531 (2006.01), 26.05.2017 г.]. Данный способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота представляет значимость при проведении диагностических аллергических исследований на туберкулез, тем не менее, он не может применяться регулярно в течение года.A known method for the diagnosis of leukemia in cattle, which includes a serological study of the blood of seronegative animals for leukemia with the use of RID within 5 days after recording and assessing the response to PPD-tuberculin for mammals. At the same time, PPD-tuberculin for mammals is diluted with 10% levamisole solution at the rate of 20 ml per 1 million IU. [RU 2620558 C1, G01N 33/49 (2006.01), G01N 33/53 (2006.01), G01N 33/531 (2006.01), May 26, 2017]. This method for the diagnosis of leukemia in cattle is important in the conduct of diagnostic allergic studies for tuberculosis, however, it cannot be used regularly throughout the year.

Известен способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота провокацией иммунного ответа, включающий серологическое исследование сыворотки крови в РИД с повторным серологическим исследованием крови серо-негативных животных после трехкратного введения инактивированной вакцины против лейкоза крупного рогатого скота с интервалом в 14 дней [RU 2264628 С2, G01N 33/53 (2000.01), 20.11.2005]. Но при сложности осуществления известный способ недостаточно эффективен, что обусловлено строго индивидуальным действием вакцины на фоне вторичных иммунодефицитов.A known method for diagnosing bovine leukemia by provoking an immune response, including a serological study of blood serum in RID with a repeated serological study of the blood of sero-negative animals after three times administration of an inactivated vaccine against leukemia in cattle with an interval of 14 days [RU 2264628 C2, G01N 33 / 53 (2000.01), 20.11.2005]. But with the complexity of implementation, the known method is not effective enough, which is due to the strictly individual action of the vaccine against the background of secondary immunodeficiencies.

Диагностику лейкоза осуществляют с использованием серологических, молекулярно-генетических (полимеразной цепной реакции - ПЦР), гематологических, клинических, патоморфологических методов и метода биопробы. В настоящее время в государственных программах по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота основу диагностики составляют серологические методы исследования - реакция иммунодиффузии (РИД) и иммуноферментный анализ (ИФА) (Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота, утвержденные Руководителем Департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации М.В. Кравчук 23 августа 2000 г. N 13-7-2/2130).Diagnosis of leukemia is carried out using serological, molecular genetic (polymerase chain reaction - PCR), hematological, clinical, pathomorphological methods and a bioassay method. Currently, in state programs to combat leukemia in cattle, the basis of diagnostics is made up of serological research methods - immunodiffusion reaction (RID) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Methodological guidelines for the diagnosis of bovine leukemia, approved by the Head of the Veterinary Department of the Ministry of Agriculture of the Russian Federation M.V. Kravchuk August 23, 2000 N 13-7-2 / 2130).

Метод реакции иммунодиффузии основан на обнаружении в сыворотке крови животных специфических преципитирующих антител к антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота, которые появляются в крови через 14-60 дней после заражения животных и сохраняются пожизненно. Это связано с тем, что онкогенный процесс у разных животных имеет различный временной характер. Поскольку лейкоз крупного рогатого скота является медленной инфекцией, то существует необходимость в выявлении противовирусных антител в ранней период онкогенеза. Данная реакция позволяет выявлять эти антитела в период от 14 до 60 дней в период инокуляции возбудителя. Но, при незначительных концентрациях антител в исследуемых сыворотках и не соответствующих температурных режимах, при которых наступает связывание (in vivo) антигена с антителом, происходит в незначительных концентрациях (in vitro) при проведении реакции иммунодиффузии, которые не позволяют их выявить и видеть их в виде линий преципитаций.The method of the immunodiffusion reaction is based on the detection in the blood serum of animals of specific precipitating antibodies to the antigens of the bovine leukemia virus, which appear in the blood 14-60 days after infection of the animals and persist for life. This is due to the fact that the oncogenic process in different animals has a different temporal character. Since bovine leukemia is a slow infection, there is a need to identify antiviral antibodies in the early period of oncogenesis. This reaction allows the detection of these antibodies in the period from 14 to 60 days during the period of inoculation of the pathogen. But, at insignificant concentrations of antibodies in the studied sera and inappropriate temperature conditions at which the binding (in vivo) of the antigen with the antibody occurs, occurs in insignificant concentrations (in vitro) during the immunodiffusion reaction, which do not allow them to be detected and seen in the form lines of precipitation.

Задачей изобретения является раннее выявление инфицированных лейкозом животных, находящихся в начальный период выработки противолейкозных антител, сокращая при этом время их нахождения в стаде и способствуя ускорению проведения оздоровительных мероприятий, не требуя значительных материальных и временных затрат.The objective of the invention is the early detection of animals infected with leukemia, which are in the initial period of the production of anti-leukemic antibodies, while reducing the time of their stay in the herd and contributing to the acceleration of health-improving measures, without requiring significant material and time costs.

Это достигается тем, что при предлагаемом способе диагностики лейкоза крупного рогатого скота при проведении пробоподготовки постановки реакции иммунодиффузии для выявления лейкозных животных на первом этапе исследования, проводят концентрирование иммунноглобулинов, в которых содержатся специфические антитела. Данное концентрирование специфических антител заключается в том, что дополнительно проводят центрифугирование сыворотки крови в пробирках Эппендорфа при 2 тыс. об/мин. в течение 5 минут. А саму реакцию проводят при 37°C в термостате, выдерживая агар с исследуемым материалом 48 часов. При этом увеличивается концентрация специфических преципитирующих антител к антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота и повышается температура проведения реакции до 37°C.This is achieved by the fact that the proposed method for the diagnosis of leukemia in cattle during the preparation of the immunodiffusion reaction for the detection of leukemic animals at the first stage of the study, concentrate the immunoglobulins, which contain specific antibodies. This concentration of specific antibodies consists in the fact that blood serum is additionally centrifuged in Eppendorf tubes at 2 thousand rpm. within 5 minutes. And the reaction itself is carried out at 37 ° C in a thermostat, keeping the agar with the test material for 48 hours. At the same time, the concentration of specific precipitating antibodies to the antigens of the bovine leukemia virus increases and the reaction temperature rises to 37 ° C.

Данные выводы были сделаны на основе проведенного опыта. В опыте участвовало 330 голов крупного рогатого скота из неблагополучного хозяйства по лейкозу, ранее не имеющих положительной реакции в реакции иммунодиффузии. Испытуемые сыворотки от этих животных готовили по образцам №№1-7 и проводили в условиях, указанных в соответствующих образцах.These conclusions were made on the basis of the experience. The experiment involved 330 head of cattle from a dysfunctional farm for leukemia, previously not having a positive reaction in the immunodiffusion reaction. The tested sera from these animals were prepared according to samples No. 1-7 and carried out under the conditions indicated in the corresponding samples.

1. Образец №1. После получения сыворотки крови, проводили центрифугирование в пробирках Эппендорфа 2,0 мл при 2 тыс. об/мин. в течение 5 минут. Надосадочную жидкость удаляли, а исследовали лишь осадок после внесения в лунки агаровых палеток, помещая на 48 часов в термостат при 37°C, затем читали реакцию.1. Sample No. 1. After obtaining blood serum, centrifugation was carried out in 2.0 ml Eppendorf tubes at 2 thousand rpm. within 5 minutes. The supernatant was removed, and only the sediment was investigated after placing in the wells of agar pallets, placed in a thermostat at 37 ° C for 48 hours, then the reaction was read.

2. Образец №2. После получения сыворотки крови, проводили центрифугирование в пробирках Эппендорфа 2,0 мл при 2 тыс. об/мин. в течение 5 минут. Надосадочную жидкость удаляли, а исследовали лишь осадок после внесения в лунки агаровых палеток, помещая на 48 часов в термостат при 40°C, затем читали реакцию.2. Sample No. 2. After obtaining blood serum, centrifugation was carried out in 2.0 ml Eppendorf tubes at 2 thousand rpm. within 5 minutes. The supernatant was removed, and only the sediment was examined after placing in the wells of agar pallets, placed in a thermostat at 40 ° C for 48 hours, then the reaction was read.

3. Образец №3. После получения сыворотки крови, проводили центрифугирование в пробирках Эппендорфа 2,0 мл при 1 тыс. об/мин. в течение 5 минут. Надосадочную жидкость удаляли, а исследовали лишь осадок после внесения в лунки агаровых палеток, помещая на 48 часов в термостат при 37°C, затем читали реакцию.3. Sample No. 3. After obtaining blood serum, centrifugation was carried out in 2.0 ml Eppendorf tubes at 1000 rpm. within 5 minutes. The supernatant was removed, and only the sediment was investigated after placing in the wells of agar pallets, placed in a thermostat at 37 ° C for 48 hours, then the reaction was read.

4. Образец №4. После получения сыворотки крови, проводили центрифугирование в пробирках Эппендорфа 2,0 мл при 1 тыс. об/мин. в течение 5 минут. Надосадочную жидкость удаляли, а исследовали лишь осадок после внесения в лунки агаровых палеток, помещая на 48 часов в термостат при 24°C, затем читали реакцию.4. Sample No. 4. After obtaining blood serum, centrifugation was carried out in 2.0 ml Eppendorf tubes at 1000 rpm. within 5 minutes. The supernatant was removed, and only the sediment was investigated after placing in the wells of agar pallets, placed in a thermostat at 24 ° C for 48 hours, then the reaction was read.

5. Образец №5. После получения сыворотки крови, проводили центрифугирование в пробирках Эппендорфа 2,0 мл при 2 тыс. об/мин. в течение 3 минут. Надосадочную жидкость удаляли, а исследовали лишь осадок после внесения в лунки агаровых палеток, помещая на 48 часов в термостат при 32°C, затем читали реакцию.5. Sample No. 5. After obtaining blood serum, centrifugation was carried out in 2.0 ml Eppendorf tubes at 2 thousand rpm. within 3 minutes. The supernatant was removed, and only the sediment was examined after placing in the wells of agar pallets, placed in a thermostat at 32 ° C for 48 hours, then the reaction was read.

6. Образец №6. После получения сыворотки крови, проводили центрифугирование в пробирках Эппендорфа 2,0 мл при 2 тыс. об/мин. в течение 2 минут. Надосадочную жидкость удаляли, а исследовали лишь осадок после внесения в лунки агаровых палеток, помещая на 48 часов в термостат при 40°C, затем читали реакцию.6. Sample No. 6. After obtaining blood serum, centrifugation was carried out in 2.0 ml Eppendorf tubes at 2 thousand rpm. within 2 minutes. The supernatant was removed, and only the sediment was examined after placing in the wells of agar pallets, placed in a thermostat at 40 ° C for 48 hours, then the reaction was read.

7. Образец №7. Стандартное проведение реакции иммунодиффузии. После получения сыворотки крови, центрифугирование не проводили. Исследуемый материал сразу помещали в лунки с агаром. После проводили учет реакции (проведено согласно Методическим указаниям по диагностике лейкоза крупного рогатого скота от 23 августа 2000 г. N 13-7-2/2130).7. Sample No. 7. Standard performance of the immunodiffusion reaction. After obtaining blood serum, centrifugation was not performed. The test material was immediately placed in agar wells. After that, the reaction was recorded (carried out according to the Guidelines for the diagnosis of cattle leukemia from August 23, 2000, N 13-7-2 / 2130).

Результаты проведения реакции иммунодиффузии с испытуемыми сыворотками животных, ранее нереагирующих серологически, приведены в таблице.The results of the immunodiffusion reaction with the tested sera of animals that previously did not react serologically are shown in the table.

В результате опыта сделали вывод, что предлагаемый способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота основан на установленной прямой связи концентрации антител в испытуемой сыворотке и абсолютного связывания антител с антигенами при более физиологически приближенного к in vivo (37°C) реакции антигена с антителом, что приводит к повышению чувствительности реакции иммуннодиффузии (образец №1) и позволяет выявлять на 35% больше инфицированных вирусом лейкоза животных по сравнению с постановкой стандартной реакции иммунодиффузии.As a result of the experiment, it was concluded that the proposed method for diagnosing bovine leukemia is based on the established direct relationship between the concentration of antibodies in the test serum and the absolute binding of antibodies to antigens with a more physiologically close to in vivo (37 ° C) reaction of an antigen with an antibody, which leads to increasing the sensitivity of the immunodiffusion reaction (sample No. 1) and makes it possible to detect 35% more animals infected with the leukemia virus compared with the standard immunodiffusion reaction.

Применение предлагаемого способа диагностики лейкоза крупного рогатого скота позволяет выявлять инфицированных лейкозом животных на более ранних стадиях, находящихся в начальный период выработки противолейкозных антител, что позволяет сократить время их нахождения в стаде и способствует ускорению проведения оздоровительных мероприятий, не требуя значительных материальных и временных затрат.The use of the proposed method for diagnosing leukemia in cattle makes it possible to identify animals infected with leukemia at earlier stages, which are in the initial period of the production of anti-leukemic antibodies, which makes it possible to reduce the time of their stay in the herd and helps to accelerate the implementation of health-improving measures, without requiring significant material and time costs.

Источники информацииInformation sources

1. RU 2377962 C1, A61D 99/00 (2006.01), 10.01.2010 г.1. RU 2377962 C1, A61D 99/00 (2006.01), 10.01.2010

2. RU 2620558 C1, G01N 33/49 (2006.01), G01N 33/53 (2006.01), G01N 33/531 (2006.01), 26.05.2017 г.2.RU 2620558 C1, G01N 33/49 (2006.01), G01N 33/53 (2006.01), G01N 33/531 (2006.01), May 26, 2017

3. RU 2264628 C2, G01N 33/53 (2000.01), 20.11.2005 г.3. RU 2264628 C2, G01N 33/53 (2000.01), 20.11.2005

4. Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота, утвержденные Руководителем Департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации М.В. Кравчук 23 августа 2000 г. N 13-7-2/2130.4. Guidelines for the diagnosis of bovine leukemia, approved by the Head of the Veterinary Department of the Ministry of Agriculture of the Russian Federation M.V. Kravchuk August 23, 2000 N 13-7-2 / 2130.

Claims

A method for diagnosing leukemia in cattle, including conducting sample preparation of a method for setting up an immunodiffusion reaction to identify animals infected with leukemia at the first stage of the study, while concentrating immunoglobulins containing specific antibodies by centrifuging blood serum in Eppendorf tubes at 2 thousand rpm within 5 minutes, and the reaction itself is carried out at 37 ° C in a thermostat, keeping the agar with the test material for 48 hours.