RU2730657C1 - Anti-tumour agent based on recombinant vaccinia virus strain and method for production thereof - Google Patents
Anti-tumour agent based on recombinant vaccinia virus strain and method for production thereof Download PDFInfo
- Publication number
- RU2730657C1 RU2730657C1 RU2019127226A RU2019127226A RU2730657C1 RU 2730657 C1 RU2730657 C1 RU 2730657C1 RU 2019127226 A RU2019127226 A RU 2019127226A RU 2019127226 A RU2019127226 A RU 2019127226A RU 2730657 C1 RU2730657 C1 RU 2730657C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- vaccinia virus
- cells
- vaccinated
- strain
- lact
- Prior art date
Links
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims abstract description 39
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims abstract description 37
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 27
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 11
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 10
- 208000025036 lymphosarcoma Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 7
- 229940034982 antineoplastic agent Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 76
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 48
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 31
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 21
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 claims description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 17
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 16
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 16
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 14
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 9
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 9
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 9
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 claims description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 6
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000000527 sonication Methods 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 2
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 claims 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 48
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 24
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract description 21
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 19
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 5
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 21
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 16
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 13
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 11
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 10
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 description 9
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 8
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 6
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 6
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 4
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 4
- 241001147789 Paeniclostridium ghonii Species 0.000 description 4
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 244000309459 oncolytic virus Species 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 3
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 3
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 3
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 210000002683 foot Anatomy 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 3
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 3
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 3
- 238000011749 CBA mouse Methods 0.000 description 2
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 230000004900 autophagic degradation Effects 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 2
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 102000046157 human CSF2 Human genes 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000243290 Aequorea Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101000793859 Homo sapiens Kappa-casein Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010051676 Metastases to peritoneum Diseases 0.000 description 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000242739 Renilla Species 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 241001113283 Respirovirus Species 0.000 description 1
- 208000034712 Rickettsia Infections Diseases 0.000 description 1
- 108010093857 Viral Hemagglutinins Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002001 anti-metastasis Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000006721 cell death pathway Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000002281 colonystimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003145 cytotoxic factor Substances 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 210000000548 hind-foot Anatomy 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000032832 immune response to tumor cell Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000002414 leg Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 208000010918 peritoneal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
- 238000000316 virotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Группа изобретений относится к области медицины и касается противоопухолевого средства, содержащего рекомбинантный штамм вируса осповакцины W-GMCSF-Lact и способа его получения Средство может быть использовано для лечения злокачественных новообразований (солидных опухолей) млекопитающих.The group of inventions relates to the field of medicine and relates to an antitumor agent containing a recombinant vaccinia virus strain W-GMCSF-Lact and a method for its production. The agent can be used to treat malignant neoplasms (solid tumors) of mammals.
В связи с большой и всевозрастающей проблемой борьбы с онкологическими заболеваниями, колоссальным многообразием типов опухолей, нестабильностью, либо отсутствием иммунного ответа на опухолевые клетки и появлением иммунодефицитных состояний при онкологических заболеваниях особенно актуальными становятся работы по разработке и получению новых противоопухолевых средств с многофункциональным механизмом действия. Очень важно, чтобы эти препараты обладали высокоизбирательными онкотоксическими свойствами, что способствовало бы распознаванию и уничтожению только опухолевых и метастатических клеток, а также высвобождению опухоль-ассоциированных антигенов и презентации их иммунной системе хозяина. На роль таких агентов практически идеально подходят непатогенные или аттенуированные природные и рекомбинантные вирусы - онколитические вирусы, имеющие механизмы распознавания раковых клеток, обладающие избирательным цитолитическим потенциалом и, возможно, экспрессирующие гены иммунологически активных и других белков, специфически усиливающих их противоопухолевую активность. Помимо непосредственного лизиса раковых клеток онколитические вирусы способны вызывать иммунный ответ организма посредством стимулирования адаптивного и врожденного иммунитета (1-3).In connection with the large and growing problem of fighting cancer, the colossal variety of types of tumors, instability or lack of an immune response to tumor cells and the emergence of immunodeficiency states in cancer, work on the development and production of new antineoplastic agents with a multifunctional mechanism of action becomes especially urgent. It is very important that these drugs have highly selective oncotoxic properties, which would facilitate the recognition and destruction of only tumor and metastatic cells, as well as the release of tumor-associated antigens and their presentation to the host's immune system. Non-pathogenic or attenuated natural and recombinant viruses - oncolytic viruses that have mechanisms for recognizing cancer cells, have selective cytolytic potential and, possibly, express genes of immunologically active and other proteins that specifically enhance their antitumor activity - are almost ideally suited for the role of such agents. In addition to direct lysis of cancer cells, oncolytic viruses are able to induce the body's immune response by stimulating adaptive and innate immunity (1-3).
Известны средства на основе бактериальных онколитических штаммов Clostridium ghonii, обладающие способностью подавлять рост солидных злокачественных опухолей (4). В качестве онколитических штаммов используют штаммы Clostridium ghonii MW-DCG_HNCv18, Clostridium ghonii MW-DCG_CCv17 и Clostridium ghonii MW-DCG_LCv26, депонированные в Национальном Институте Измерений (National Measurement Institute, 1/153 Bertie Street, Port Melbourne, Victoria, Australia 3207) под соответствующими регистрационными номерами V12/001485, V12/001487 и V12/001486.There are known agents based on bacterial oncolytic strains of Clostridium ghonii with the ability to suppress the growth of solid malignant tumors (4). As oncolytic strains, the strains Clostridium ghonii MW-DCG_HNCv18, Clostridium ghonii MW-DCG_CCv17 and Clostridium ghonii MW-DCG_LCv26 deposited at the National Measurement Institute, 1/153 Bertie Street, Victoria, Port Australia, Melbourne correspond. registration numbers V12 / 001485, V12 / 001487 and V12 / 001486.
Известно средство на основе онколитического штамма ЖЭВ-15L вируса Коксаки В6, селективно инфицирующего и лизирующего опухолевые клетки человека и имеющего фрагмент геномной последовательности, являющийся его маркерными признаком (5). Данный штамм депонирован в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под регистрационным номером V-576.There is a known agent based on the oncolytic strain ZhEV-15 L of the Coxsackie B6 virus, which selectively infects and lyses human tumor cells and has a fragment of the genomic sequence, which is its marker feature (5). This strain was deposited in the FBSI SSC VB "Vector" under registration number V-576.
Известна композиция для лечения онкологических заболеваний, содержащая рекомбинантный штамм вируса Сендай, принадлежащий к роду Respirovirus, семейство Paramyxoviridae, полученный на основе вирусного материала, депонированного в американской коллекции клеточных культур АТСС под номером РТА-13024 и фармацевтически приемлемый носитель (6). Фармацевтически приемлемыми носителями являются: свежая аллантоисная жидкость эмбрионов кур, лиофилизированная аллантоисная жидкость, физиологический раствор или водные буферы, такие как PBS и т.п. Кроме того, композиция настоящего изобретения может содержать другие добавки, такие как адъюванты, стабилизаторы, антиоксиданты и т.п.A known composition for the treatment of oncological diseases, containing a recombinant strain of the Sendai virus belonging to the genus Respirovirus, the Paramyxoviridae family, obtained on the basis of viral material deposited in the American collection of cell cultures ATCC under the number PTA-13024 and a pharmaceutically acceptable carrier (6). Pharmaceutically acceptable carriers include fresh chicken embryonic allantoic fluid, lyophilized allantoic fluid, saline or aqueous buffers such as PBS and the like. In addition, the composition of the present invention may contain other additives such as adjuvants, stabilizers, antioxidants and the like.
Недостатками известной композиции являются многокомпонентность, трудоемкость ее приготовления, а также использование нестандартизованных компонентов.The disadvantages of the known composition are the multicomponent nature, laboriousness of its preparation, as well as the use of non-standardized components.
В настоящее время описан широкий круг вирусов, используемых для виротерапии злокачественных новообразований. На данный момент в США, Канаде, Китае и странах Европы (Германия, Венгрия) в клинических испытаниях протестирован ряд штаммов вируса осповакцины (ВОВ) на наличие у них противоопухолевого потенциала (7). По количеству клинических исследований среди рекомбинантых вирусов осповакцины лидируют препараты GL-ONC1 и Pexa-Vec/TG6006.Currently, a wide range of viruses have been described that are used for virotherapy of malignant neoplasms. Currently in the USA, Canada, China and European countries (Germany, Hungary) a number of vaccinia virus (VACV) strains have been tested in clinical trials for their antitumor potential (7). GL-ONC1 and Pexa-Vec / TG6006 are the leaders in the number of clinical trials among recombinant vaccinia viruses.
Известно противоопухолевое средство GL-ONC1 на основе рекомбинантного штамма вируса осповакцины, включающее аттенуированный вариант Л-ИВП, содержащий три инсерционные кассеты, кодирующие слитый белок люциферазы (Renilla) и зеленого флуоресцентного белка (Aequorea), β-галактозидазу и β-глюкуронидазу, и фармацевтически пригодный носитель (8). Трансгены встроены по локусам F14.5L, J2R (кодируют тимидинкиназу вируса) и A56R (кодирует гемагглютинин вируса), что и определяет аттенуацию рекомбинантного вируса. Противоопухолевое средство GL-ONC1 специфически инфицирует опухолевые клетки и уничтожает их путем онколизиса, что далее запускает противоопухолевый иммунный ответ.Known antitumor agent GL-ONC1 based on a recombinant vaccinia virus strain, including an attenuated version of L-IVP, containing three insertion cassettes encoding a fusion protein of luciferase (Renilla) and green fluorescent protein (Aequorea), β-galactosidase and β-glucuronidase, and pharmaceutical suitable carrier (8). The transgenes are inserted at loci F14.5L, J2R (encodes viral thymidine kinase) and A56R (encodes viral hemagglutinin), which determines the attenuation of the recombinant virus. The antitumor agent GL-ONC1 specifically infects tumor cells and destroys them by oncolysis, which further triggers an antitumor immune response.
Наиболее близким к заявляемому средству - прототипом, является противоопухолевое средство Pexa-Vec, содержащее рекомбинантный штамм JX-594 вируса осповакцины и фармацевтически приемлимый наполнитель (9). Штамм JX-594 вируса осповакцины получен на основе американского вакцинного штамма Wyeth путем встройки в район делеции гена вирусной тимидинкиназы (фактор вирулентности) двух трансгенов: гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) человека и β-галактозидазы E. coli. Средство Pexa-Vec находится на 3 стадии клинических исследований в отношении гепатоцеллюлярной карциномы человека.The closest to the claimed agent, the prototype, is the Pexa-Vec antitumor agent containing the recombinant vaccinia virus JX-594 strain and a pharmaceutically acceptable excipient (9). Vaccine virus strain JX-594 was obtained on the basis of the American vaccine strain Wyeth by inserting two transgenes into the region of the viral thymidine kinase (virulence factor) gene deletion: human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and E. coli-galactosidase. Pexa-Vec is in
Способ получения противоопухолевого средства Pexa-Vec состоит из трех основных этапов, включающих получение вируссодержащего материала для противоопухолевого средства, его очистку и разбавление очищенного вируссодержащего концентрата фармацевтически приемлемым растворителем до концентрации вируса 1×109 БОЕ. Более конкретно, известный способ включает следующие стадии:The method for preparing the Pexa-Vec antitumor agent consists of three main stages, including obtaining a vaccinated material for the antitumor agent, purifying it and diluting the purified vaccinated concentrate with a pharmaceutically acceptable solvent to a virus concentration of 1 × 10 9 pfu. More specifically, the known method includes the following steps:
1. Получение вируссодержащего материала для лекарственного средства, включающее наработку вируса в клетках HeLa (культура клеток-продуцентов), лизирование клеток-продуцентов гипотоническим лизис-буфером (получение грубого лизата, содержащего вирус и клеточный дебрис).1. Obtaining vaccinated material for a drug, including the production of virus in HeLa cells (culture of producer cells), lysis of producer cells with a hypotonic lysis buffer (obtaining a crude lysate containing virus and cell debris).
2. Очистка вируссодержащего материала для лекарственного средства, включающая обработку лизата клеток-продуцентов ферментами: нуклеазой (бензоназой) для удаления ДНК клеток-продуцентов (HeLa) и протеазой (TrypLE™ Select) для удаления белков клеток-продуцентов (HeLa), тангенциальную фильтрацию вируссодержащего материала.2. Purification of vaccinated material for a drug, including the treatment of lysate of producer cells with enzymes: nuclease (benzonase) to remove DNA from producer cells (HeLa) and protease (TrypLE ™ Select) to remove proteins from producer cells (HeLa), tangential filtration of vaccinated material.
3. Разбавление очищенного вируссодержащего концентрата подходящим растворителем до концентрации вируса 1×109 БОЕ JX-594 (одна доза).3. Dilution of the purified vaccinated concentrate with a suitable solvent to a virus concentration of 1 × 10 9 pfu of JX-594 (one dose).
Известный способ позволяет получать целевой продукт с содержанием ДНК клеток-продуцентов - 3 мкг/дозу, содержанием белков клеток-продуцентов - 4 мг белка/дозу (10).The known method makes it possible to obtain the target product with the DNA content of the producer cells - 3 μg / dose, the protein content of the producer cells - 4 mg protein / dose (10).
Недостатками противоопухолевого средства Pexa-Vec (прототип) являются:The disadvantages of the Pexa-Vec anticancer agent (prototype) are:
- недостаточная онколитическая активность Pexa-Vec, связанная с использованием менее вирулентного векторного штамма вируса осповакцины (Wyeth против Л-ИВП) и за счет отсутствия встройки гена онкотоксического белка лактаптина;- insufficient oncolytic activity of Pexa-Vec, associated with the use of a less virulent vector strain of vaccinia virus (Wyeth against L-IVP) and due to the lack of insertion of the gene of the oncotoxic protein lactaptin;
- низкий уровень экспрессии ГМ-КСФ Pexa-Vec (40 пкг/мл);- low level of expression of GM-CSF Pexa-Vec (40 pg / ml);
- недостаточный уровень аттенуации Pexa-Vec, связанный с сохранением дополнительного гена вирулентности - вирусного ростового фактора;- insufficient level of Pexa-Vec attenuation, associated with the preservation of an additional virulence gene - the viral growth factor;
- неудовлетворительная онкоселективность Pexa-Vec за счет удаления лишь одного гена - гена тимидинкиназы;- unsatisfactory onkoselectivity of Pexa-Vec due to the removal of only one gene - the thymidine kinase gene;
- присутствуе в геноме Pexa-Vec протяженной встройки (3000 п.н.) несмыслового репортерного гена β-галактозидазы E. coli.- the presence in the Pexa-Vec genome of an extended insertion (3000 bp) of a non-sense reporter gene β-galactosidase of E. coli.
Недостатками известного способа получения противоопухолевого средства Pexa-Vec являются:The disadvantages of the known method of obtaining the antitumor agent Pexa-Vec are:
- использование культуры клеток-продуцентов, не обеспечивающей получение максимальной удельной концентрации вируса (количество вирусных частиц на одну клетку культуры-продуцента);- the use of a culture of producer cells that does not provide the maximum specific concentration of the virus (the number of viral particles per cell of the producer culture);
- недостаточная (не максимальная) степень очистки лекарственного средства, что может объясняться отсутствием стадии удаления клеточного дебриса (осветление при низкоскоростном центрифугировании) после обработки лизата клеток-продуцентов ферментами (бензоназа + трипсин), а также недостаточностью использования только тангенциальной фильтрации для удаления примесей.- insufficient (not maximum) degree of drug purification, which can be explained by the absence of a stage for removing cell debris (clarification with low-speed centrifugation) after treatment of the lysate of producer cells with enzymes (benzonase + trypsin), as well as insufficient use of only tangential filtration to remove impurities.
Задачей группы изобретений является создание высокоэффективного противоопухолевого средства, обладающего более высокой онколитической активностью и повышенными уровнями аттенуации, онкоселективности и экспрессии ГМ-КСФ.The task of a group of inventions is to create a highly effective antitumor agent with a higher oncolytic activity and increased levels of attenuation, oncoselectivity and expression of GM-CSF.
Технический результат: повышение противоопухолевой эффективности средства и расширение диапазона его функциональной активности.EFFECT: increasing the antitumor effectiveness of the agent and expanding the range of its functional activity.
Поставленная задача достигается предлагаемым противоопухолевым средством, которое содержит рекомбинантный вирус осповакцины (штамм VV-GMCSF-Lact ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» - V-688), полученный в культуре клеток почки африканской зеленой мартышки 4647 и продуцирующий секретйруемый гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) человека и несекретируемый онкотоксический белок лактаптин, и фармацевтически приемлемый растворитель, при следующем содержании компонентов (на 1 мл):The task is achieved by the proposed antitumor agent, which contains a recombinant vaccinia virus (strain VV-GMCSF-Lact FBSI GNTs VB "Vector" - V-688), obtained in a culture of kidney cells of the African green monkey 4647 and producing secreted granulocyte-macrophage factor colony stimulating -CSF) human and non-secreted oncotoxic protein lactaptin, and a pharmaceutically acceptable solvent, with the following content of components (per 1 ml):
Предлагаемое средство представляет собой замороженный раствор - плотную затвердевшую белого цвета массу. После размораживания - бесцветная жидкость, прозрачная или слабо опалесцирующая, без посторонних включений, рН 6,2-6,8. Заявляемое средство является стерильным, нетоксичным, не содержит микоплаз и посторонних вирусных агентов. Средство не содержит консервантов и антибиотиков. Содержание эндотоксинов в лекарственном средстве не превышает 0,5 ЕЭ/мл, содержание бычьего сывороточного альбумина - не более 50 нг/мл, содержание клеточной ДНК - не более 10 нг/мл и содержание белка - не более 100 мкг/мл.The proposed tool is a frozen solution - a dense solidified white mass. After thawing - a colorless liquid, transparent or slightly opalescent, without impurities, pH 6.2-6.8. The inventive agent is sterile, non-toxic, does not contain mycoplasms and foreign viral agents. The product does not contain preservatives or antibiotics. The content of endotoxins in the medicinal product does not exceed 0.5 EU / ml, the content of bovine serum albumin is not more than 50 ng / ml, the content of cellular DNA is not more than 10 ng / ml, and the protein content is not more than 100 μg / ml.
Специфическая активность предлагаемого средства измеряется как доза заражения, вызывающая 50%-ный литический эффект клеток рака молочной железы человека MDA-MB-231, и составляет не более 0,1 БОЕ/клетку.The specific activity of the proposed agent is measured as the dose of infection causing a 50% lytic effect of MDA-MB-231 human breast cancer cells, and is not more than 0.1 pfu / cell.
В качестве фармацевтически приемлемого растворителя может быть использован физиологический раствор или физиологически приемлемый буферный раствор.As the pharmaceutically acceptable solvent, physiological saline or physiologically acceptable buffered saline can be used.
Характеристика активного компонента. Двойной рекомбинантный штамм VV-GMCSF-Lact сконструирован на основе умеренно патогенного российского штамма Л-ИВП вируса осповакцины, содержит делеции фрагментов генов вирусной тимидинкиназы и ростового фактора, в районы которых встроены ген гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) человека, структура которого соответствует кДНК матричной РНК ГМ-КСФ человека (GenBank Асе. M11220.1), в центральной части гена вирусной тимидинкиназы между позициями 81277 и 81308 п.н. (GenBank Асе. KP233807.1); ген ГМ-КСФ человека экспрессируется под контролем природного промотора Р7.5k вируса осповакцины и продуцирует секретируемую форму биологически активного ГМ-КСФ человека в клетках млекопитающих; ген лактаптина, кодирующий фрагмент каппа-казеина человека 23-134 а.о., в левом концевом районе вирусного генома между позициями 7770 и 8071 п.н. (GenBank Асе. KP233807.1); ген лактаптина экспрессируется под контролем синтетического промотора вируса осповакцины P7.5synth и продуцирует онкотоксический рекомбинантный белок лактаптин, который специфически индуцирует апоптотическую гибель раковых клеток человека in vitro и in vivo (11). Встройка в качестве трансгена гена лактаптина в район делеции гена вирусного ростового фактора способствует дополнительной аттенуации (ослаблению) вируса в отношении нормальных клеток и усилению его литической (цитотоксической) активности в отношении раковых клеток. Штамм VV-GMCSF-Lact депонирован в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под номером V-688(12).Characteristics of the active component. The double recombinant strain VV-GMCSF-Lact is designed on the basis of the moderately pathogenic Russian L-IVP strain of the vaccinia virus, contains deletions of fragments of the viral thymidine kinase and growth factor genes, in whose regions the gene of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) (GM-structure corresponds to the cDNA of messenger RNA of human GM-CSF (GenBank Ace. M11220.1), in the central part of the viral thymidine kinase gene between positions 81277 and 81308 bp. (GenBank Ace. KP233807.1); the human GM-CSF gene is expressed under the control of the natural vaccinia virus P7.5k promoter and produces a secreted form of biologically active human GM-CSF in mammalian cells; the lactaptin gene encoding a fragment of human kappa-casein 23-134 amino acid residues in the left terminal region of the viral genome between positions 7770 and 8071 bp. (GenBank Ace. KP233807.1); The lactaptin gene is expressed under the control of the synthetic vaccinia virus P7.5synth promoter and produces the oncotoxic recombinant protein lactaptin, which specifically induces apoptotic death of human cancer cells in vitro and in vivo (11). The insertion of the lactaptin gene as a transgene into the deletion region of the viral growth factor gene contributes to additional attenuation (weakening) of the virus in relation to normal cells and enhances its lytic (cytotoxic) activity in relation to cancer cells. The VV-GMCSF-Lact strain was deposited in the State collection of viral pathogens and rickettsioses of the FBSI SSC VB "Vector" under the number V-688 (12).
Как правило, онколитические вирусы способны активировать в инфицированных клетках не один путь клеточной гибели, однако известно, что основным путем гибели, индуцируемым аденовирусами, является аутофагия, тогда как для вируса осповакцины превалирует программируемый некроз (13). Мишенью рекомбинантного вируса осповакцины VV-GMCSF-Lact являются EGFR-положительные клетки. Повышенная экспрессия гена EGFR (рецептор эпидермального фактора роста) характерна для многих раковых клеток человека. Комбинация делеций VGF и tk генов (двойные рекомбинанты) обеспечивает вирусу дополнительную таргетность в отношении раковых клеток и резко снижает его вирулентность в отношении здоровых клеток. Основным механизмом гибели EGFR-положительных клеток рака молочной железы под действием предлагаемого противоопухолевого средства на основе рекомбинантного штамма VV-GMCSF-Lact вируса осповакцины является RIPK-1-независимый EGFR-зависимый некроз. Кроме того, опухолевые клетки, инфицированные вирусом VV-GMCSF-Lact, активно захватываются перитонеальными макрофагами.As a rule, oncolytic viruses are able to activate more than one cell death pathway in infected cells; however, it is known that the main pathway of death induced by adenoviruses is autophagy, while for vaccinia virus programmed necrosis prevails (13). The target of the recombinant vaccinia virus VV-GMCSF-Lact is EGFR-positive cells. Increased expression of the EGFR (epidermal growth factor receptor) gene is characteristic of many human cancer cells. The combination of deletions of VGF and tk genes (double recombinants) provides the virus with additional targeting against cancer cells and dramatically reduces its virulence against healthy cells. The main mechanism of death of EGFR-positive breast cancer cells under the influence of the proposed antitumor agent based on the recombinant VV-GMCSF-Lact strain of vaccinia virus is RIPK-1-independent EGFR-dependent necrosis. In addition, tumor cells infected with the VV-GMCSF-Lact virus are actively captured by peritoneal macrophages.
Предлагаемое противоопухолевое средство предназначено для парентерального (внутриопухолевого) введения в солидную злокачественную опухоль в эффективной дозе (1-2)×107 БОЕ/мл ×107 БОЕ/мл один раз в неделю курсом из 4-х инъекций. Солидная злокачественная опухоль может быть глиобластомой, лимфосаркомой, карциномой молочной железы.The proposed antitumor agent is intended for parenteral (intratumoral) administration into a solid malignant tumor at an effective dose (1-2) × 10 7 PFU / ml × 10 7 PFU / ml once a week in a course of 4 injections. A solid malignant tumor can be glioblastoma, lymphosarcoma, breast carcinoma.
Поставленная задача достигается также предлагаемым способом получения заявляемого средства, включающим следующие основные этапы:The task is also achieved by the proposed method of obtaining the claimed agent, which includes the following main stages:
Этап 1. Получение вируссодержащего материала для противоопухолевого средства, включающее накопление культуры клеток-продуцентов 4647, заражение культуры клеток-продуцентов 4647 вирусом осповакцины, культивирование зараженной культуры-продуцента, сбор вируссодержащего материала для лекарственного средства.Stage 1. Obtaining a vaccinated material for an antitumor agent, including accumulating a culture of producing cells 4647, infecting a culture of producing cells 4647 with a vaccinia virus, cultivating an infected producer culture, collecting vaccinating material for a drug.
Этап 2. Очистка вируссодержащего материала для средства, включающая следующие стадии: осаждение вируссодержащего материала ультрацентрифугированием, гомогенизацию вируссодержащего материала ультразвуком, обработку гомогената ферментами (бензоназой и трипсином), осветление вируссодержащего материала при низкоскоростном центрифугировании (удаление клеточного дебриса), доочистку осветленного концентрированного вируссодержащего материала двукратным ультрацентрифугированием в слое 36%-ной сахарозы (удаление балластных высокомолекулярных клеточных компонентов).
Этап 3. Получение противоопухолевого средства путем разбавления очищенного вируссодержащего концентрата 0,9% раствором натрия хлорида до концентрации вируса не менее 1,0×107 БОЕ/мл и не более 2,0×107 БОЕ/мл.
Предлагаемый способ заключается в следующем.The proposed method is as follows.
Этап 1. Получение вируссодержащего материала проводят стандартным способом. Сначала проводят накопление культуры-продуцента путем серийных пассажей культуры клеток линии 4647 (клетки почки африканской зеленой мартышки, аттестованные для производства вакцин в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»), восстановленной из посевного банка. После накопления необходимого количества клеток, полученную культуру-продуцент используют для получения вируссодержащего материала для противоопухолевого средства. Наработку вируса проводят в роллерных бутылях с монослоем клеток-продуцентов 4647. Из роллерных бутылей с монослоем клеток-продуцентов удаляют ростовую среду и в каждую бутыль добавляют по 10 мл суспензии вируса (штамм VV-GMCSF-Lact ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» - V-688) с титром не менее 107 БОЕ/мл для заражения клеток и инкубируют в роллерной установке при температуре (37±1)°С в течение 1 часа для адсорбции вируса на клетках. Затем в каждую роллерную бутыль вносят дополнительно поддерживающую среду (среда ДМЕМ, канамицин 0,06 мг/мл). Зараженные емкости инкубируют в роллерной установке при температуре 36,5-37,5°С в течение 2-х суток до образования 100%-ного ЦПД (цитопатическое действие).Stage 1. Obtaining vaccinated material is carried out in a standard way. First, the accumulation of the producer culture is carried out by serial passages of the cell culture of the 4647 line (African green monkey kidney cells, certified for the production of vaccines at the FBSI SSC VB "Vector"), recovered from the seed bank. After accumulation of the required number of cells, the resulting culture-producer is used to obtain vaccinated material for an antitumor agent. Virus production is carried out in roller bottles with a monolayer of producer cells 4647. Growth medium is removed from roller bottles with a monolayer of producer cells and 10 ml of a virus suspension is added to each bottle (strain VV-GMCSF-Lact FBUN SSC VB "Vector" - V- 688) with a titer of at least 10 7 pfu / ml to infect cells and incubate in a roller installation at a temperature of (37 ± 1) ° С for 1 hour to adsorb the virus on the cells. Then, an additional supporting medium (DMEM medium, kanamycin 0.06 mg / ml) is added to each roller bottle. Infected containers are incubated in a roller installation at a temperature of 36.5-37.5 ° C for 2 days until a 100% CPP is formed (cytopathic effect).
Этап 2 Очистка вируссодержащего материала для противоопухолевого средства, получение вирусного концентрата
Полученный на этапе 1 вируссодержащий материал переносят в стерильные центрифужные стаканы и концентрируют ультрацентрифугированием при 4-8°С и 15300 об/мин в течение 1 часа. Супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в 1 мМ Трис-HCl, рН 9.0.Obtained in stage 1 vaccinated material is transferred into sterile centrifuge beakers and concentrated by ultracentrifugation at 4-8 ° C and 15300 rpm for 1 hour. The supernatant is removed and the pellet is resuspended in 1 mM Tris-HCl, pH 9.0.
Полученную суспензию вируссодержащего материала обрабатывают ультразвуком (гомогенизируют) на ультразвуковом дезинтеграторе. Обработку ультразвуком проводят три раза по 20 секунд, с охлаждением после каждой обработки в течение 10 секунд во льду.The resulting suspension of vaccinated material is sonicated (homogenized) on an ultrasonic disintegrator. The sonication is carried out three times for 20 seconds, with cooling after each treatment for 10 seconds on ice.
К полученному гомогенату вируссодержащего материала добавляют фермент бензоназу до конечной концентрации 40-42 единицы активности/мл и MgCl2 и инкубируют 30-40 минут при комнатной температуре. К гомогенату с бензоназой добавляют раствор трипсина до конечной концентрации 0,10-0,12 мг/мл и инкубируют еще 30-40 минут при температуре 37°С. Обработка ферментами позволяет разрушить нуклеиновые кислоты и белки клеток-продуцентов.To the obtained homogenate of vaccinated material, benzonase enzyme is added to a final concentration of 40-42 activity units / ml and MgCl 2 and incubated for 30-40 minutes at room temperature. A trypsin solution is added to the homogenate with benzonase to a final concentration of 0.10-0.12 mg / ml and incubated for another 30-40 minutes at 37 ° C. Enzyme treatment allows the destruction of nucleic acids and proteins of producer cells.
Обработанный ферментами гомогенат вируссодержащего материала осветляют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10-15 минут при температуре 4-8°С (удаление клеточного дебриса).The homogenate of vaccinated material treated with enzymes is clarified by centrifugation at 3000 rpm for 10-15 minutes at a temperature of 4-8 ° C (removal of cell debris).
Осветленный концентрированный вируссодержащий материал подвергают доочистке от балластных высокомолекулярных клеточных компонентов в режиме двукратного ультрацентрифугирования в слое 36%-ной сахарозы. Ультрацентрифугирование проводят при 12000 об/мин в течение 60-80 минут при температуре 4-8°СThe clarified concentrated vaccinated material is subjected to additional purification from ballast high molecular weight cellular components in the mode of double ultracentrifugation in a layer of 36% sucrose. Ultracentrifugation is carried out at 12000 rpm for 60-80 minutes at a temperature of 4-8 ° C
После первого ультрацентрифугирования в слое 36%-ной сахарозы осадки вируссодержащего материала восстанавливают в 0,001 М Трис-HCl, рН 9,0 (в 
После второго ультрацентрифугирования в слое 36%-ной сахарозы осадки вируссодержащего материала ресуспендируют в 0,9%-ном растворе натрия хлорида (физиологический раствор) и обрабатывают ультразвуком как указано выше. В результате получают очищенный концентрат противоопухолевого средства на основе рекомбинантного вируса осповакцины с титром вируса 5,8×108 - 1,6×109 БОЕ/мл.After the second ultracentrifugation in a layer of 36% sucrose, the precipitates of vaccinated material are resuspended in 0.9% sodium chloride solution (saline) and treated with ultrasound as described above. As a result, a purified concentrate of an antitumor agent based on a recombinant vaccinia virus with a virus titer of 5.8 × 10 8 - 1.6 × 10 9 PFU / ml is obtained.
Этап 3 Получение противоопухолевого средства.
Очищенный вируссодержащий материал разбавляют 0,9%-ным раствором натрия хлорида до расчетной концентрации вируса не менее 1,0×107 БОЕ/мл и не более 2,0×107 БОЕ/мл, расфасовывают и хранят при температуре минус 40-42°С.Purified vaccinated material is diluted with 0.9% sodium chloride solution to a calculated virus concentration of at least 1.0 × 10 7 pfu / ml and not more than 2.0 × 10 7 pfu / ml, packaged and stored at minus 40-42 ° C.
Определяющими отличиями заявляемого средства от прототипа являются:The defining differences between the proposed agent and the prototype are:
- средство содержит литически активный (вирулентный) штамм VV-GMCSF-Lact с двойной делецией генов тимидинкиназы и ростового фактора, что обеспечивает высокую аттенуацию вируса и безопасность его использования для иммунодефицитных раковых больных. Для усиления противоопухолевой активности штамм содержит в качестве трансгенов ген ГМ-КСФ и ген цитотоксического белка лактаптина, обеспечивающие специфическую гибель раковых клеток.- the product contains a lytically active (virulent) VV-GMCSF-Lact strain with a double deletion of the thymidine kinase and growth factor genes, which ensures high attenuation of the virus and the safety of its use for immunodeficient cancer patients. To enhance the antitumor activity, the strain contains, as transgenes, the GM-CSF gene and the cytotoxic protein gene lactaptin, which provide specific death of cancer cells.
- штамм W-GMCSF-Lact вируса осповакцины используют в средстве с экспериментально подобранным, оптимальным титром вируса, составляющим (1-2)×107 БОЕ/мл, что позволяет осуществлять избирательное инфицирование и активный лизис широкого спектра опухолевых клеток человека малым количеством вирусных частиц.- the strain W-GMCSF-Lact of the vaccinia virus is used in a drug with an experimentally selected, optimal virus titer of (1-2) × 10 7 PFU / ml, which allows for selective infection and active lysis of a wide range of human tumor cells with a small amount of viral particles ...
Определяющими отличиями заявляемого способа от прототипа являются:The defining differences between the proposed method and the prototype are:
- в качестве культуры-продуцента для наработки вируса используют клетки почки африканской зеленой мартышки линии 4647, что позволяет получить максимальный выход вирусных частиц (1-2)×107 БОЕ/мл) по сравнению с клетками почки африканской зеленой мартышки линии Vero (6,4×106 БОЕ/мл), поскольку клетки 4647 крупнее клеток Vero, имеют больший объем цитоплазмы, что позволяет увеличить концентрацию вирусных частиц в одной клетке.- the cells of the kidney of the African green monkey line 4647 are used as a producer culture for the production of the virus, which makes it possible to obtain the maximum yield of viral particles (1-2) × 10 7 PFU / ml) compared to the kidney cells of the African green monkey line Vero (6, 4 × 10 6 pfu / ml), since 4647 cells are larger than Vero cells, they have a larger volume of cytoplasm, which allows an increase in the concentration of viral particles in one cell.
- обработанный ферментами гомогенат вируссодержащего материала осветляют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10-15 минут, что позволяет эффективно удалить клеточный дебрис и обеспечить максимальную степень очистки противоопухолевого средства;- the homogenate of vaccinated material treated with enzymes is clarified by centrifugation at 3000 rpm for 10-15 minutes, which allows to effectively remove cell debris and ensure the maximum degree of purification of the antitumor agent;
- осветленный концентрированный вируссодержащий материал подвергают доочистке от балластных высокомолекулярных клеточных компонентов путем двукратного ультрацентрифугирования при 12000 об/мин в слое 36%-ной сахарозы в течение 60-80 минут, что позволяет получать средство с минимальным количеством балластных высокомолекулярных клеточных компонентов, которые могут являться причиной побочных токсических эффектов.- the clarified concentrated vaccinated material is subjected to additional purification from ballast high-molecular cellular components by two-time ultracentrifugation at 12000 rpm in a layer of 36% sucrose for 60-80 minutes, which makes it possible to obtain a product with a minimum amount of ballast high-molecular cell components that can cause side toxic effects.
Предлагаемое средство обладает повышенной противоопухолевой эффективностью за счет более высокой онколитической активности, а также высоких уровней аттенуации, онкоселективности и экспрессии ГМ-КСФ. Заявляемое средство имеет более широкий диапазон функциональной активности (по сравнению с прототипом), поскольку проявляет онколитическую активность в отношении таких солидных злокачественных опухолей, как глиобластома, лимфосаркома и карцинома молочной железы.The proposed agent has increased antitumor efficacy due to higher oncolytic activity, as well as high levels of attenuation, oncoselectivity and expression of GM-CSF. The inventive agent has a wider range of functional activity (in comparison with the prototype), since it exhibits oncolytic activity against such solid malignant tumors as glioblastoma, lymphosarcoma and breast carcinoma.
Изобретение иллюстрируется следующими фигурами графических изображений:The invention is illustrated by the following figures:
Фиг. 1. Противоопухолевая активность VV-GMCSF-Lact в отношении глиобластомы человека U87-MG in vivo. Динамика роста опухоли U87-MG на мышах SCID при лечении заявляемым средством.FIG. 1. Antitumor activity of VV-GMCSF-Lact against human glioblastoma U87-MG in vivo. Growth dynamics of the U87-MG tumor in SCID mice treated with the claimed agent.
Фиг. 2. Противоопухолевая активность VV-GMCSF-Lact в отношении лекарственно-устойчивой лимфосаркомы мыши RLS in vivo. Динамика изменения размера лапы мышей CBA с внутримышечно трансплантированными опухолевыми клетками RLS при лечении заявляемым средством.FIG. 2. Antitumor activity of VV-GMCSF-Lact against drug-resistant lymphosarcoma in RLS mice in vivo. Dynamics of changes in the paw size of CBA mice with intramuscularly transplanted RLS tumor cells during treatment with the claimed agent.
фиг. 3. Противоопухолевая активность VV-GMCSF-Lact в отношений развившейся опухоли аденокарциномы молочной железы человека MDA-MB-231. Динамика роста опухоли на мышах SCID при лечении заявляемым средством.fig. 3. Antitumor activity of VV-GMCSF-Lact in relation to the developed human breast adenocarcinoma tumor MDA-MB-231. Tumor growth dynamics in SCID mice treated with the claimed agent.
Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его осуществления.For a better understanding of the essence of the invention, examples of its implementation follow.
Пример 1. Получение заявляемого противоопухолевого средства на основе рекомбинантного штамма VV-GMCSF-Lact вируса осповакцины.Example 1. Obtaining the claimed antineoplastic agent based on the recombinant strain VV-GMCSF-Lact of the vaccinia virus.
Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pVGF-FR2-PE/L-Pat, трансфекцию клеток CV-1 рекомбинантной плазмидой pVGF-FR2-PE/L-Pat и получение рекомбинантного штамма VV-GMCSF-Lact вируса осповакцины проводят согласно известной методике (12). Очищенный рекомбинантный штамм вируса осповакцины VV-GMCSF-Lact с титром 109 БОЕ/мл хранится в расфасованном виде при -80°С (производственный штамм).Construction of recombinant plasmid DNA pVGF-FR2-PE / L-Pat, transfection of CV-1 cells with the recombinant plasmid pVGF-FR2-PE / L-Pat, and production of the recombinant vaccinia virus VV-GMCSF-Lact strain are carried out according to a known method (12). The purified recombinant vaccinia virus strain VV-GMCSF-Lact with a titer of 10 9 PFU / ml is stored in packaged form at -80 ° C (industrial strain).
Этап 1. Получение вируссодержащего материала для противоопухолевого средстваStage 1. Obtaining vaccinated material for an antitumor agent
Накопление культуры-продуцента проводят путем серийных пассажей культуры клеток линии 4647, аттестованной для производства вакцин в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», восстановленной из посевного банка. Используют для субкультивирования культуру клеток, сформировавшую плотный монослой, без признаков дегенерации и загрязнения микробной флорой. Техника проведения пассажа заключается в следующем: из культуральных матрасов вместимостью 50 мл удаляют ростовую среду, вносят в каждый матрас по 10 мл подогретого в термостате до температуры (32±0,5)°С фосфатно-солевого буферного раствора (PBS). Монослой клеток обмывают легким покачиванием, затем удаляют PBS пипеткой. Процедуру отмывки монослоя PBS повторяют дважды, затем в матрасы добавляют по 1 мл подогретого в термостате до температуры (32±0,5)°С диспергирующего раствора (100 мл раствора PBS/EDTA + 50 мг трипсина (Trypsin, for cell culture, Gerbu)), инкубируют матрасы при (37±0,5)°С до отслоения клеток, затем добавляют 9 мл ростовой среды. Флакон с клетками встряхивают 2-3 раза, не допуская образования обильной пены, осторожно пипетируют содержимое для получения однородной суспензии.The accumulation of the producer culture is carried out by serial passages of the cell culture of the 4647 line, certified for the production of vaccines at the FBSI SSC VB "Vector", restored from the seed bank. A cell culture that has formed a dense monolayer without signs of degeneration and contamination by microbial flora is used for subculturing. The technique of the passage is as follows: the growth medium is removed from the culture mattresses with a capacity of 50 ml, 10 ml of phosphate-buffered saline (PBS) heated in a thermostat to a temperature of (32 ± 0.5) ° C is added to each mattress. The cell monolayer is washed with gentle shaking, then removed with a PBS pipette. The procedure for washing the PBS monolayer is repeated twice, then 1 ml of a dispersing solution heated in a thermostat to a temperature of 32 ± 0.5 ° C (100 ml of PBS / EDTA solution + 50 mg of trypsin (Trypsin, for cell culture, Gerbu) is added to the mattresses) ), incubate the mattresses at (37 ± 0.5) ° C until the cells are detached, then 9 ml of the growth medium is added. The vial with cells is shaken 2-3 times, avoiding the formation of abundant foam, carefully pipet the contents to obtain a homogeneous suspension.
Далее полученную клеточную суспензию разводят ростовой средой (культуральная среда ДМЕМ, 10% сыворотки эмбриональной телячьей, 0,06 мг/мл канамицина) до концентрации 0,10 млн. жизнеспособных клеток в 1 мл ростовой среды. В культуральный матрас вместимостью 650 мл заливают 40 мл разведенной клеточной суспензии, матрас помещают в термостат при температуре (37±0,5)°С и выдерживают в течение 4-5 суток до формирования монослоя.Next, the resulting cell suspension is diluted with growth medium (culture medium DMEM, 10% fetal calf serum, 0.06 mg / ml kanamycin) to a concentration of 0.10 million viable cells in 1 ml of growth medium. In a culture mattress with a capacity of 650 ml, 40 ml of a diluted cell suspension is poured, the mattress is placed in a thermostat at a temperature of (37 ± 0.5) ° C and incubated for 4-5 days until a monolayer is formed.
После образования монослоя процедуру снятия клеток с матраса вместимостью 650 мл повторяют также, как описано выше для матрасов вместимостью 50 мл, но с той лишь разницей, что в матрас вместимостью 650 мл с клеточным монослоем вносится по 50 мл промывочного раствора PBS, 3 мл раствора трипсина, 27 мл ростовой среды для подсчета клеток и 190 мл ростовой среды.After the formation of a monolayer, the procedure for removing cells from a mattress with a capacity of 650 ml is repeated as described above for mattresses with a capacity of 50 ml, but with the only difference that 50 ml of washing solution of PBS, 3 ml of trypsin solution are introduced into a mattress with a capacity of 650 ml with a cell monolayer , 27 ml of growth medium for cell counting and 190 ml of growth medium.
После накопления необходимого количества клеток, полученную культуру-продуцент используют для получения вируссодержащего материала для лекарственного средства. Наработку вируса проводят в 8 роллерных бутылях с монослоем клеток-продуцентов линии 4647 (роллерная установка INCUDRIVE D-I (Schuett, Германия) или подобная). Площадь поверхности каждой роллерной бутыли составляет 850 см2.After accumulation of the required number of cells, the resulting culture-producer is used to obtain vaccinated material for the drug. The production of the virus is carried out in 8 roller bottles with a monolayer of cell-producers of the 4647 line (roller installation INCUDRIVE DI (Schuett, Germany) or similar). The surface area of each roller bottle is 850 cm 2 .
Из роллерных бутылей с монослоем клеток-продуцентов удаляют ростовую среду и в каждую бутыль добавляют по 10 мл суспензии вируса (штамм VV-GMCSF-Lact ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» - V-688) с титром не менее 107 БОЕ/мл для заражения клеток (множественность инфекции 1 БОЕ/клетку). Емкости с зараженными клетками помещают в роллерную установку при температуре (37±0,5)°С на 1 час для адсорбции вируса на клетках. Затем в каждую роллерную бутыль вносят дополнительно по 90 мл поддерживающей среды (среда ДМЕМ, канамицин 0,06 мг/мл).Growth medium is removed from roller bottles with a monolayer of producer cells, and 10 ml of virus suspension (VV-GMCSF-Lact strain VV-GMCSF-Lact FBUN SSC VB "Vector" - V-688) with a titer of at least 10 7 pfu / ml is added to each bottle for infection cells (multiplicity of infection 1 pfu / cell). Containers with infected cells are placed in a roller installation at a temperature of (37 ± 0.5) ° C for 1 hour to adsorb the virus on the cells. Then, an additional 90 ml of support medium (DMEM medium, kanamycin 0.06 mg / ml) is added to each roller bottle.
Зараженные емкости инкубируют в роллерной установке при температуре (37±0,5)°С 2 суток до образования 100%-ного ЦПД (цитопатическое действие). По истечении 2х суток роллерные бутыли с инфицированной вирусом культурой клеток-продуцентов механически встряхивают для сбрасывания неотслоившихся клеток в культуральную среду. Полученный вируссодержащий материал подвергают дальнейшей процедуре по приготовлению препарата.Infected containers are incubated in a roller installation at a temperature of (37 ± 0.5) ° C for 2 days until a 100% CPP is formed (cytopathic effect). After 2 days, roller bottles with a virus-infected culture of producing cells are mechanically shaken to discard non-exfoliated cells into the culture medium. The resulting vaccinated material is subjected to a further preparation procedure.
Этап 2. Очистка вируссодержащего материала для противоопухолевого средства.
Все стадии очистки проводят при температуре 6°С. Полученный на этапе 1 вируссодержащий материал переносят в стерильные центрифужные стаканы вместимостью 250 мл (по 200 мл в стакан) и концентрируют ультрацентрифугированием при 15300 об/мин в течение 1 часа (Центрифуга Avanti J-E, ротор JA-14). Супернатант удаляют, а осадки восстанавливают в буферном растворе 0,001 М Трис-HCl из расчета 10% осадка к 90% буферного раствора (15 мл буфера на осадок с одной роллерной бутыли).All stages of cleaning are carried out at a temperature of 6 ° C. The vaccinated material obtained in stage 1 is transferred into sterile centrifuge beakers with a capacity of 250 ml (200 ml per beaker) and concentrated by ultracentrifugation at 15300 rpm for 1 hour (Avanti J-E centrifuge, JA-14 rotor). The supernatant is removed, and the sediments are reduced in a buffer solution of 0.001 M Tris-HCl at the rate of 10% sediment to 90% buffer solution (15 ml of buffer per sediment from one roller bottle).
Полученную суспензию вируссодержащего материала обрабатывают ультразвуком (гомогенизируют) на ультразвуковом дезинтеграторе (УЗД2-0,1/22, Россия). Частота колебаний наконечника - 22 кГц, амплитуда - 14÷16 мкм, мощность дезинтеграции - 300 Вт. Обработку ультразвуком проводят три раза по 20 секунд, с охлаждением после каждой обработки в течение 10 секунд во льду.The resulting suspension of vaccinated material is sonicated (homogenized) on an ultrasonic disintegrator (UZD2-0.1 / 22, Russia). The oscillation frequency of the tip is 22 kHz, the amplitude is 14-16 μm, the disintegration power is 300 W. The sonication is carried out three times for 20 seconds, with cooling after each treatment for 10 seconds on ice.
К полученному гомогенату вируссодержащего материала добавляют фермент бензоназу (Benzonase, ≥250 units/mkl; Sigma-Aldrich #E1014-25KU) до конечной концентрации 40 единиц активности/мл и 60 мкл раствора 1 М MgCl2 из расчета на 30 мл гомогената и инкубируют 30 минут, периодически встряхивая. К гомогенату с бензоназой добавляют раствор трипсина (360 мг/мл) до конечной концентрации 0,12 мг/мл и инкубируют еще 30 минут при температуре 37°С.To the resulting homogenate of vaccinated material, add the benzonase enzyme (Benzonase, ≥250 units / mkl; Sigma-Aldrich # E1014-25KU) to a final concentration of 40 activity units / ml and 60 μl of a 1 M MgCl 2 solution per 30 ml of homogenate and incubate 30 minutes, shaking occasionally. Trypsin solution (360 mg / ml) is added to the homogenate with benzonase to a final concentration of 0.12 mg / ml and incubated for another 30 minutes at 37 ° C.
Обработанный ферментами гомогенат вируссодержащего материала переносят в стерильные центрифужные стаканы и осветляют центрифугированием (центрифуга Avanti J-E, ротор JS-13.1) при 3000 об/мин в течение 10 минут (удаление клеточного дебриса).The enzyme-treated homogenate of vaccinated material is transferred into sterile centrifuge beakers and clarified by centrifugation (Avanti J-E centrifuge, JS-13.1 rotor) at 3000 rpm for 10 minutes (removal of cell debris).
Осветленный концентрированный вируссодержащий материал подвергают доочистке от балластных высокомолекулярных клеточных компонентов в режиме двукратного ультрацентрифугирования в слое 36%-ной сахарозы. Для этого в центрифужные пробирки вместимостью 50 мл для ротора JS-13.1 центрифуги Avanti J-E (Beckman Coulter, США) вносят по 5 мл 36%-ного раствора сахарозы. Затем осветленный концентрированный вируссодержащий материал в объеме 30 мл аккуратно наслаивают по стенке центрифужных пробирок с помощью стеклянной пипетки на слой 36%-ной сахарозы. Режим центрифугирования - 80 мин при 12000 об/мин.The clarified concentrated vaccinated material is subjected to additional purification from ballast high molecular weight cellular components in the mode of double ultracentrifugation in a layer of 36% sucrose. For this, 5 ml of a 36% sucrose solution are added to centrifuge tubes with a capacity of 50 ml for the JS-13.1 rotor of the Avanti J-E centrifuge (Beckman Coulter, USA). Then the clarified concentrated vaccinated material in a volume of 30 ml is carefully layered along the wall of centrifuge tubes using a glass pipette onto a layer of 36% sucrose. Centrifugation mode - 80 min at 12000 rpm.
Осадки после первого ультрацентрифугирования в слое 36%-ной сахарозы восстанавливают в 15 мл 0,001 М Трис-HCl, рН 9,0, обрабатывают ультразвуком три раза по 20 секунд, с охлаждением после каждой обработки в течение 10 секунд во льду. Частота колебаний наконечника - 22 кГц, амплитуда - 14÷16 мкм, мощность дезинтеграции - 300 Вт. Полученные суспензии объединяют попарно и в объеме 30 мл аккуратно наслаивают по стенке центрифужных пробирок с помощью стеклянной пипетки на 5 мл слой 36%-ной сахарозы. Ультрацентрифугирование проводят на центрифуге Avanti J-E (Beckman Coulter, США), используя ротор JS-13.1, режим центрифугирования - 80 мин при 12000 об/мин.The precipitates after the first ultracentrifugation in a layer of 36% sucrose are reduced in 15 ml of 0.001 M Tris-HCl, pH 9.0, sonicated three times for 20 seconds, with cooling after each treatment for 10 seconds on ice. The oscillation frequency of the tip is 22 kHz, the amplitude is 14-16 μm, the disintegration power is 300 W. The resulting suspensions are combined in pairs and in a volume of 30 ml is carefully layered on the wall of centrifuge tubes using a glass pipette on a 5 ml layer of 36% sucrose. Ultracentrifugation is carried out in an Avanti J-E centrifuge (Beckman Coulter, USA), using a JS-13.1 rotor, centrifugation mode is 80 min at 12000 rpm.
После второго ультрацентрифугирования в слое 36%-ной сахарозы осадки ресуспендируют в 8 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида (физиологический раствор) и обрабатывают ультразвуком три раза по 20 секунд, с охлаждением после каждой обработки в течение 10 секунд во льду. Частота колебаний наконечника - 22 кГц, амплитуда - 14÷16 мкм, мощность дезинтеграции - 300 Вт.After the second ultracentrifugation in a layer of 36% sucrose, the precipitates are resuspended in 8 ml of 0.9% sodium chloride solution (saline) and sonicated three times for 20 seconds, with cooling after each treatment for 10 seconds on ice. The oscillation frequency of the tip is 22 kHz, the amplitude is 14-16 μm, the disintegration power is 300 W.
Очищенный концентрированный вируссодержащий материал для препарата хранят в низкотемпературном морозильнике при температуре минус (40±2)°С.The purified concentrated vaccinated material for the preparation is stored in a low-temperature freezer at a temperature of minus (40 ± 2) ° C.
Этап 3 Получение противоопухолевого средства.
Очищенный концентрированный вируссодержащий материл, полученный на этапе 2, разбавляют 0,9%-ным раствором натрия хлорида до концентрации вируса 1,0×107 БОЕ/мл. После тщательного перемешивания контролируют величину рН, которая должна быть 6,5±0,3 (при необходимости рН корректируют разбавленной 1:1 соляной кислотой). В результате получают противоопухолевое средство, содержащее, в 1 мл:The purified concentrated vaccinated material obtained in
штамм W-GMCSF-Lact вируса осповакцины - 1×107 БОЕstrain W-GMCSF-Lact of vaccinia virus - 1 × 10 7 pfu
физиологический раствор - до 1 мл.saline solution - up to 1 ml.
Противоопухолевое лекарственное средство контролируют по следующим показателям: прозрачность, цветность, рН, механические включения, стерильность, аномальная токсичность, микоплазмы, посторонние агенты, бактериальные эндотоксины, бычий сывороточный альбумин, клеточная ДНК, белок, специфическая активность.The antitumor drug is controlled according to the following parameters: transparency, color, pH, mechanical inclusions, sterility, abnormal toxicity, mycoplasmas, foreign agents, bacterial endotoxins, bovine serum albumin, cellular DNA, protein, specific activity.
Пример 2.Example 2.
Предлагаемое противоопухолевое средство получают аналогично примеру 1, за исключением того, что к полученному гомогенату вируссодержащего материала добавляют фермент бензоназу (42 единицы активности/мл) и MgCl2 и инкубируют 40 минут, далее к гомогенату с бензоназой добавляют раствор трипсина до конечной концентрации 0,10-мг/мл и инкубируют смесь еще 40 минут при температуре 37°С, из обработанного ферментами гомогената вируссодержащего материала удаляют клеточный дебрис центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 минут, ультрацентрифугирование в слое 36%-ной сахарозы проводят в течение 60 минут, а очищенный вируссодержащий материл разбавляют фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) до концентрации вируса 2,0×107 БОЕ/мл и получают противоопухолевое лекарственное средство, содержащее, в 1 мм:The proposed antitumor agent is obtained analogously to example 1, except that the enzyme benzonase (42 units of activity / ml) and MgCl 2 are added to the resulting homogenate of vaccinated material and incubated for 40 minutes, then a trypsin solution is added to the homogenate with benzonase to a final concentration of 0.10 -mg / ml and the mixture is incubated for another 40 minutes at a temperature of 37 ° C, cell debris is removed from the homogenate of vaccinated material treated with enzymes by centrifugation at 3000 rpm for 15 minutes, ultracentrifugation in a layer of 36% sucrose is carried out for 60 minutes, and the purified vaccinated material is diluted with phosphate buffered saline (PBS) to a virus concentration of 2.0 × 10 7 pfu / ml and an antitumor drug is obtained containing, in 1 mm:
штамм W-GMCSF-Lact вируса осповакцины - 2×107 БОЕstrain W-GMCSF-Lact of vaccinia virus - 2 × 10 7 pfu
фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) - до 1 мл.phosphate-buffered saline (PBS) - up to 1 ml.
Пример 3. Оценка противоопухолевой эффективности заявляемого средства на основе рекомбинантного штамма VV-GMCSF-Lact вируса осповакцины в отношении глиобластомы человека U87-MG in vivoExample 3. Evaluation of the antitumor efficacy of the proposed agent based on the recombinant strain VV-GMCSF-Lact of vaccinia virus against human glioblastoma U87-MG in vivo
Исследования проводили с использованием мышей линии SCID, возраст 10-12 недель, разведения SPF-вивария Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск, Россия).The studies were carried out using SCID mice, 10-12 weeks old, diluted with an SPF vivarium of the Institute of Cytology and Genetics SB RAS (Novosibirsk, Russia).
Клетки глиобластомы человека U-87-MG культивировали в среде αМЕМ (GIBCO, США) с добавлением 100 ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина сульфата, 0,25 мкг/мл амфотерицина в присутствии 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. Клетки культивировали при 37°С в атмосфере 5% СО2. Клетки U87-MG трансплантировали мышам SCID подкожно в область спины в количестве 2×106 клеток на мышь в 0,1 мл физиологического раствора.Human glioblastoma cells U-87-MG were cultured in αMEM medium (GIBCO, USA) supplemented with 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin sulfate, 0.25 μg / ml amphotericin in the presence of 10% fetal bovine serum. The cells were cultured at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 . U87-MG cells were transplanted subcutaneously into the back of SCID mice at 2 x 10 6 cells per mouse in 0.1 ml of saline.
Мыши линии SCID с трансплантированными опухолевыми клетками глиобластомы человека U87-MG по достижению опухолевыми узлами среднего размера 100 мм3 были рандомно разделены на экспериментальную и контрольную группы по 10 животных в каждой. Мышам экспериментальной группы внутриопухолево вводили лекарственное средство в дозе 1×107 БОЕ/ мышь, 4 инъекции, 1 раз в неделю, а контрольным животным вводили физиологический раствор по аналогичной схеме. Эффективность противоопухолевого действия лекарственного средства оценивали по индексу торможения роста опухоли (ТРО) после курса 4-х внутриопухолевых инъекций.SCID mice with transplanted human glioblastoma U87-MG tumor cells upon reaching tumor nodes with an average size of 100 mm 3 were randomly divided into experimental and control groups of 10 animals each. The mice of the experimental group were injected intratumorally with the drug at a dose of 1 × 10 7 pfu / mouse, 4 injections, once a week, and the control animals were injected with physiological saline according to a similar scheme. The effectiveness of the antitumor action of the drug was assessed by the index of tumor growth inhibition (TPO) after a course of 4 intratumoral injections.
На Фиг. 1 представлены кривые роста опухолей U87-MG на мышах линии SCID в экспериментальной и контрольной группах. Стрелками отмечены дни, в которые проводили инъекции. (*) - р<0.05. Из данных Фиг. 1 видно, что лекарственное средство на основе рекомбинантного штамма VV-GMCSF-Lact вируса осповакцины обладает высокой противоопухолевой эффективностью в отношении EGFR-положительной глиобластомы человека U87-MG. Индекс ТРО составил 87%.FIG. 1 shows the growth curves of U87-MG tumors in SCID mice in the experimental and control groups. The arrows mark the days on which the injections were performed. (*) - p <0.05. From the data of FIG. 1 shows that a drug based on the recombinant vaccinia virus strain VV-GMCSF-Lact has high antitumor efficacy against EGFR-positive human glioblastoma U87-MG. The TPO index was 87%.
Пример 4. Оценка противоопухолевой эффективности заявляемого средства на основе рекомбинантного штамма VV-GMCSF-Lact вируса осповакцины в отношении лекарственно-устойчивой лимфосаркомы мыши RLS in vivoExample 4. Evaluation of the antitumor efficacy of the claimed agent based on the recombinant VV-GMCSF-Lact vaccinia virus against drug-resistant lymphosarcoma in RLS mice in vivo
Исследования проводили с использованием мышей линии СВА, 10-12 недель, разведения вивария ИХБФМ СО РАН (г.Новосибирск, Россия).The studies were carried out using mice of the CBA line, 10-12 weeks old, breeding the vivarium of the ICBFM SB RAS (Novosibirsk, Russia).
Клетки лимфосаркомы мыши линии RLS культивировали в среде IMDM (SIGMA, Великобритания) с добавлением 100 ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина сульфата, 0,25 мкг/мл амфотерицина в присутствии 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. Клетки культивировали при 37°С в атмосфере 5% СО2.RLS mouse lymphosarcoma cells were cultured in IMDM medium (SIGMA, UK) supplemented with 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin sulfate, 0.25 μg / ml amphotericin in the presence of 10% fetal bovine serum. The cells were cultured at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 .
Клетки RLS трансплантировали мышам линии СВА внутримышечно в заднюю лапу в количестве 1500 клеток на мышь в 0,1 мл физиологического раствора. Лимфосаркома мыши RLS является моделью лекарственно-устойчивой опухоли и характеризуется устойчивостью к циклофосфану (14). Индукция опухолевого роста RLS происходит при внутрибрюшинной или внутримышечной (в бедро) трансплантации опухоли. Внутримышечное введение опухолевых клеток приводит к развитию опухоли между мышечными волокнами, что позволяет моделировать внутриопухолевое введение препарата при введении лекарственного средства в бедро экспериментальным животным.RLS cells were transplanted into CBA mice intramuscularly into the hind paw in an amount of 1500 cells per mouse in 0.1 ml of saline. RLS mouse lymphosarcoma is a drug-resistant tumor model and is characterized by resistance to cyclophosphamide (14). RLS tumor growth is induced by intraperitoneal or intramuscular (in the thigh) tumor transplantation. Intramuscular injection of tumor cells leads to the development of a tumor between muscle fibers, which makes it possible to simulate intratumoral administration of the drug when the drug is injected into the thigh of experimental animals.
Мыши с трансплантированными внутримышечно в ногу клетками резистентной к циклофосфамиду лимфосаркомы RLS были рандомно разделены на экспериментальную и контрольную группы по 10 животных в каждой. Через 7 дней после трансплантации опухолевых клеток мышам экспериментальной группы внутриопухолево (в мышцу бедра) вводили предлагаемое средство в дозе 1×107 БОЕ/мышь, курсом 3 инъекции, 1 раз в неделю, а контрольным животным аналогично вводили физиологический раствор. Курс введения лекарственного средства был ограничен 3-мя инъекциями, поскольку при продлении эксперимента еще на одну неделю размер опухолей животных контрольной группы не позволял животным подходить к кормушке. Продолжение эксперимента в данном случае противоречит нормам гуманного отношения к животным.Mice transplanted into the leg intramuscularly with cells of cyclophosphamide-resistant lymphosarcoma RLS were randomly divided into experimental and control groups, 10 animals each. 7 days after transplantation of tumor cells, the mice of the experimental group were intratumorally (in the thigh muscle) injected with the proposed agent at a dose of 1 × 10 7 pfu / mouse, in a course of 3 injections, once a week, and the control animals were similarly injected with saline. The course of drug administration was limited to 3 injections, since when the experiment was extended for another week, the size of the tumors of the animals in the control group did not allow the animals to approach the feeding trough. The continuation of the experiment in this case contradicts the norms of a humane attitude towards animals.
Эффективность противоопухолевого действия лекарственного средства оценивали по индексу торможения роста опухоли (ТРО). Для вычисления индекса ТРО измеряли объем лапы с опухолью у животных экспериментальной и контрольной групп.The effectiveness of the antitumor effect of the drug was assessed by the tumor growth inhibition index (TPO). To calculate the TPO index, the volume of a paw with a tumor was measured in animals of the experimental and control groups.
На Фиг. 2 представлены кривые изменения объема лапы с опухолью у животных экспериментальной и контрольной групп. Стрелками отмечены дни, в которые проводили инъекции. (*) - р<0.05. Из данных Фиг. 2 видно, что лекарственное средство на основе рекомбинантного штамма VV-GMCSF-Lact вируса осповакцины обладает высокой противоопухолевой эффективностью в отношении лекарственно-устойчивой опухоли RLS (лимфосаркомы) мыши. Индекс ТРО составил 84%.FIG. 2 shows curves of changes in the volume of a paw with a tumor in animals of the experimental and control groups. The arrows mark the days on which the injections were performed. (*) - p <0.05. From the data of FIG. 2 shows that the drug based on the recombinant VV-GMCSF-Lact vaccinia virus has high antitumor efficacy against the drug-resistant RLS tumor (lymphosarcoma) of the mouse. The TPO index was 84%.
Пример 5. Оценка противоопухолевой эффективности заявляемого средства на основе рекомбинантного штамма VV-GMCSF-Lact вируса осповакцины в отношении развившейся опухоли аденокарциномы молочной железы человека MDA-MB-231 in vivoExample 5. Evaluation of the antitumor efficacy of the proposed agent based on the recombinant strain VV-GMCSF-Lact of vaccinia virus against the developed tumor of adenocarcinoma of the human breast MDA-MB-231 in vivo
Исследования проводили с использованием мышей линии SCID, возраст 10-12 недель, разведения SPF-вивария Института цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск, Россия).The studies were carried out using SCID mice, 10-12 weeks old, diluted with an SPF vivarium of the Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences (Novosibirsk, Russia).
Клетки аденокарциномы молочной железы человека MDA-MB-231 культивировали в среде L-15 Лейбовица (SIGMA, Великобритания) с добавлением 100 ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина сульфата, 0,25 мкг/мл амфотерицина в присутствии 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (GIBCO, США). Клетки MDA-MB-231 трансплантировали мышам SCID подкожно в область спины в 0,1 мл физиологического раствора с добавлением матригеля (Matrigel™, BD Bioscience, США) в объемном соотношении суспензия клеток : матригель 1:1.Human breast adenocarcinoma cells MDA-MB-231 were cultured in Leibovitz L-15 medium (SIGMA, UK) supplemented with 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin sulfate, 0.25 μg / ml amphotericin in the presence of 10% fetal serum cattle (GIBCO, USA). MDA-MB-231 cells were transplanted subcutaneously in the back region of SCID mice in 0.1 ml of saline supplemented with Matrigel (Matrigel ™, BD Bioscience, USA) in a volume ratio of cell suspension: Matrigel 1: 1.
Поскольку задачей исследования было изучение действия лекарственного средства на развившуюся опухоль (≥500 мм3), мышей линии SCID предварительно делили на экспериментальную и контрольную группы; животным экспериментальной группы подкожно трансплантировали в 3 раза больше опухолевых клеток (4,5×106 клеток), чем животным контрольной группы (1,5×106). Такая постановка эксперимента необходима, поскольку при трансплантации одинакового количества опухолевых клеток и при отсутствии лечения животные контрольной группы не доживают до окончания эксперимента.Since the aim of the study was to study the effect of a drug on a developed tumor (≥500 mm 3 ), SCID mice were preliminarily divided into experimental and control groups; The animals of the experimental group were subcutaneously transplanted 3 times more tumor cells (4.5 × 10 6 cells) than the animals of the control group (1.5 × 10 6 ). Such an experimental setup is necessary, since after transplantation of the same number of tumor cells and in the absence of treatment, the animals of the control group do not survive until the end of the experiment.
При исследовании противоопухолевой эффективности заявляемого средства в отношении развившейся опухоли целесообразно увеличить суммарную дозу препарата. Курс терапии состоял из 6-ти ежедневных инъекций вируса в дозе 1×107 БОЕ/мышь. Лечение начинали по достижении объема опухоли в экспериментальной группе >500 мм3.When studying the antitumor efficacy of the proposed agent against a developed tumor, it is advisable to increase the total dose of the drug. The course of therapy consisted of 6 daily injections of the virus at a dose of 1 × 10 7 pfu / mouse. Treatment was started when the tumor volume in the experimental group was> 500 mm 3 .
Эффективность противоопухолевой терапии лекарственным средством оценивали по индексу торможения роста опухоли (ТРО) после окончания курса лечения.The effectiveness of anticancer drug therapy was assessed by the tumor growth inhibition index (TPO) after the end of the course of treatment.
На Фиг. 3 (А) представлены кривые роста опухолей у животных экспериментальной и контрольной групп. Скобкой со стрелками обозначен период введения препарата. Из данных Фиг. 3 (А) видно, что предлагаемое противоопухолевое средство обеспечивает эффективное и достоверное уменьшение размера развившейся опухоли MDA-MB-231 по сравнению с исходными размерами опухоли (на 42%).FIG. 3 (A) shows curves of tumor growth in animals of the experimental and control groups. The brackets with arrows indicate the period of drug administration. From the data of FIG. 3 (A) shows that the proposed antitumor agent provides an effective and reliable reduction in the size of the developed tumor MDA-MB-231 in comparison with the initial tumor size (by 42%).
Поскольку разница в исходных размерах опухолей в контрольной и экспериментальной группах не позволяет напрямую корректно рассчитать индекс ТРО, полученные данные трансформировали в значения изменения роста опухоли по отношению к исходному размеру опухоли в (%).Since the difference in the initial sizes of tumors in the control and experimental groups does not allow to directly correctly calculate the TPO index, the obtained data were transformed into the values of the change in tumor growth relative to the initial tumor size in (%).
На Фиг. 3 (Б) представлены кривые роста опухолей у животных экспериментальной и контрольной групп. Скобкой со стрелками обозначен период введения препарата. Данные представлены в процентах по отношению к размеру опухолей на момент начала лечения. Из данных Фиг. 3 (Б) видно, что противоопухолевое средство на основе рекомбинантного штамма VV-GMCSF-Lact вируса осповакцины обладает высокой противоопухолевой эффективностью в отношении развившейся опухоли аденокарциномы молочной железы человека MDA-MB-231.FIG. 3 (B) shows curves of tumor growth in animals of the experimental and control groups. The brackets with arrows indicate the period of drug administration. Data are presented as a percentage in relation to the size of tumors at the time of initiation of treatment. From the data of FIG. 3 (B) shows that an antitumor agent based on the recombinant strain VV-GMCSF-Lact of vaccinia virus has high antitumor efficacy against the developed tumor of adenocarcinoma of the human breast MDA-MB-231.
Для развившейся опухоли индекс ТРО рассчитывали по формуле:For a developed tumor, the TPO index was calculated using the formula:
ТРО=((%Vконтроль - %Vопыт)/%Vконтроль) × 100%, гдеTPO = ((% V control -% V experiment ) /% V control ) × 100%, where
%Vконтроль - процент изменения размера опухоли в финальной точке эксперимента относительно начальной точки эксперимента (животные контрольной группы);% V control - the percentage of change in tumor size at the final point of the experiment relative to the initial point of the experiment (animals of the control group);
%Vопыт - процент изменения размера опухоли в финальной точке эксперимента относительно начальной точки эксперимента (животные экспериментальной группы);% V experiment - percentage of change in tumor size at the final point of the experiment relative to the initial point of the experiment (animals of the experimental group);
Согласно полученным данным индекс ТРО для развившейся опухоли составил 77,6%.According to the data obtained, the TPO index for the developed tumor was 77.6%.
Данные экспериментов, описанные в примерах 3-5, свидетельствуют о том» что заявляемое противоопухолевое средство на основе рекомбинантного штамма VV-GMCSF-Lact вируса осповакцины обладает высокой противоопухолевой эффективностью в отношении солидных опухолей человека и животных.The experimental data described in examples 3-5 indicate that the claimed antitumor agent based on the recombinant vaccinia virus VV-GMCSF-Lact strain has high antitumor efficacy against solid tumors in humans and animals.
Предлагаемое средство на основе рекомбинантного штамма VV-GMCSF-Lact может быть использовано в качестве нового вирусного препарата с противоопухолевой и антиметастатической активностью и низкой токсичностью для терапии солидных опухолей человека и животных.The proposed agent based on the recombinant VV-GMCSF-Lact strain can be used as a new viral drug with antitumor and antimetastatic activity and low toxicity for the treatment of solid tumors in humans and animals.
Источники информацииSources of information
1. Lichty BD, Breitbach CJ, Stojdl DF, Bell JC. Going viral with cancer immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 2014 Aug; 14(8):559-67. doi: 10.1038/nrc3770.1. Lichty BD, Breitbach CJ, Stojdl DF, Bell JC. Going viral with cancer immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 2014 Aug; 14 (8): 559-67. doi: 10.1038 / nrc3770.
2. Tsun A, Miao XN, Wang CM, Yu DC. Oncolytic Immunotherapy for Treatment of Cancer Adv Exp. Med. Biol. 2016; 909:241-83. doi: 10.1007/978-94-017-7555-7_5.2. Tsun A, Miao XN, Wang CM, Yu DC. Oncolytic Immunotherapy for Treatment of Cancer Adv Exp. Med. Biol. 2016; 909: 241-83. doi: 10.1007 / 978-94-017-7555-7_5.
3. Raja J, Ludwig JM, Gettinger SN, Schalper KA, Kim HS. Oncolytic virus immunotherapy: future prospects for oncology. J. Immunother. Cancer. 2018 Dec. 4;6(1):140. doi: 10.1186/s40425-018-0458-z.3. Raja J, Ludwig JM, Gettinger SN, Schalper KA, Kim HS. Oncolytic virus immunotherapy: future prospects for oncology. J. Immunother. Cancer. 2018 Dec. 4; 6 (1): 140. doi: 10.1186 / s40425-018-0458-z.
4. Патент RU 2667432 C1, опубл. 20.06.2016.4. Patent RU 2667432 C1, publ. 06/20/2016.
5. Патент RU 2496873 C1, опубл. 27.10.2013.5. Patent RU 2496873 C1, publ. 27.10.2013.
6. Патент RU 2519763 C9, опубл. 20.06.2014.6. Patent RU 2519763 C9, publ. 06/20/2014.
7. Jonathan G. Pol, Sarah 
8. Lauer UM, Schell M, Beil J, et. al, Phase I Study of Oncolytic Vaccinia Virus GL-ONC1 in Patients with Peritoneal Carcinomatosis. Clin. Cancer Res. 2018 Sep. 15; 24(18):4388-4398. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-18-0244.8. Lauer UM, Schell M, Beil J, et. al, Phase I Study of Oncolytic Vaccinia Virus GL-ONC1 in Patients with Peritoneal Carcinomatosis. Clin. Cancer Res. 2018 Sep. 15; 24 (18): 4388-4398. doi: 10.1158 / 1078-0432.CCR-18-0244.
9. Патент US 2017298324 A1, опубл. 19.10.2017.9. Patent US 2017298324 A1, publ. 19.10.2017.
10. Патент US 20140162342 A1, опубл. 12.06.2014.10. Patent US 20140162342 A1, publ. 12.06.2014.
11. Koval OA, Tkachenko AV, Fomin AS, Semenov DV, Nushtaeva AA, Kuligina EV, Zavjalov EL, Richter VA. Lactaptin induces p53-independent cell death associated with features of apoptosis and autophagy and delays growth of breast cancer cells in mouse xenografts. PLoS One. 2014. Apr. 7;9(4):e93921. doi: 10.1371/journal.pone.0093921.11. Koval OA, Tkachenko AV, Fomin AS, Semenov DV, Nushtaeva AA, Kuligina EV, Zavjalov EL, Richter VA. Lactaptin induces p53-independent cell death associated with features of apoptosis and autophagy and delays growth of breast cancer cells in mouse xenografts. PLoS One. 2014. Apr. 7; 9 (4): e93921. doi: 10.1371 / journal.pone.0093921.
12. Патент RU 2604187 C1, опубл. 10.12.2016.12. Patent RU 2604187 C1, publ. 10.12.2016.
13. Whilding L., Archibald K., Kulbe H. et al. Vaccinia virus induces programmed necrosis in ovarian cancer cells // Mol. Ther. - 2013. - V. 11. - N 45. - P. 2074-2086. doi: 10.1038/mt.2013.195.13. Whilding L., Archibald K., Kulbe H. et al. Vaccinia virus induces programmed necrosis in ovarian cancer cells // Mol. Ther. - 2013. - V. 11. - N 45. - P. 2074-2086. doi: 10.1038 / mt.2013.195.
14. Mironova NL, Petrushanko IY, Patutina OA et al. Ribonuclease binase inhibits primary tumor growth and metastases via apoptosis induction in tumor cells., Cell Cycle. 2013. Jul. 1;12(13):2120-31. doi: 10.4161/cc.25164.14. Mironova NL, Petrushanko IY, Patutina OA et al. Ribonuclease binase inhibits primary tumor growth and metastases via apoptosis induction in tumor cells., Cell Cycle. 2013. Jul. 1; 12 (13): 2120-31. doi: 10.4161 / cc.25164.
Claims (9)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019127226A RU2730657C1 (en) | 2019-08-27 | 2019-08-27 | Anti-tumour agent based on recombinant vaccinia virus strain and method for production thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019127226A RU2730657C1 (en) | 2019-08-27 | 2019-08-27 | Anti-tumour agent based on recombinant vaccinia virus strain and method for production thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2730657C1 true RU2730657C1 (en) | 2020-08-24 |
Family
ID=72238013
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019127226A RU2730657C1 (en) | 2019-08-27 | 2019-08-27 | Anti-tumour agent based on recombinant vaccinia virus strain and method for production thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2730657C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115261341A (en) * | 2022-09-05 | 2022-11-01 | 东曜药业有限公司 | Method for clarifying oncolytic vaccinia virus harvesting solution |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2604187C1 (en) * | 2015-10-20 | 2016-12-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | RECOMBINANT STRAIN VV-GMCSF-Lact OF VACCINIA VIRUS, HAVING ONCOLYTIC ACTIVITY AND PRODUCING GRANULOCYTIC-MACROPHAGAL COLONY-STIMULATING FACTOR AND ONCOTOXIC LACTAPTIN PROTEIN |
-
2019
- 2019-08-27 RU RU2019127226A patent/RU2730657C1/en active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2604187C1 (en) * | 2015-10-20 | 2016-12-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | RECOMBINANT STRAIN VV-GMCSF-Lact OF VACCINIA VIRUS, HAVING ONCOLYTIC ACTIVITY AND PRODUCING GRANULOCYTIC-MACROPHAGAL COLONY-STIMULATING FACTOR AND ONCOTOXIC LACTAPTIN PROTEIN |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ВАСИЛЬЕВА Н.С. и др.Лекарственное средство для лечения глиобластомы человека на основе рекомбинантного штамма вируса осповакцины, Всероссийская мультиконференция с международным участием Биотехнология - медицине будущего, 29 июня - 2 июля 2019, Новосибирск, Россия, с.31. * |
| ВАСИЛЬЕВА Н.С. и др.Лекарственное средство для лечения глиобластомы человека на основе рекомбинантного штамма вируса осповакцины, Всероссийская мультиконференция с международным участием Биотехнология - медицине будущего, 29 июня - 2 июля 2019, Новосибирск, Россия, с.31. КУЛИГИНА Е.В. и др. Противоопухолевый препарат лактаптин: способы повышения эффективности, Российский биотерапевтический журнал N 1, т.15, 2016, с.55-56. * |
| КУЛИГИНА Е.В. и др. Противоопухолевый препарат лактаптин: способы повышения эффективности, Российский биотерапевтический журнал N 1, т.15, 2016, с.55-56. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115261341A (en) * | 2022-09-05 | 2022-11-01 | 东曜药业有限公司 | Method for clarifying oncolytic vaccinia virus harvesting solution |
| CN115261341B (en) * | 2022-09-05 | 2024-03-22 | 东曜药业有限公司 | Method for clarifying oncolytic vaccinia virus harvest liquid |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2873880B2 (en) | Genus immunity inducer based on combination of poxvirus components and method for producing the same | |
| ES2647662T3 (en) | Infectious DNA vaccines against chikungunya virus | |
| US20100172877A1 (en) | Compositions and methods of use of an oncolytic vesicular stomatitis virus | |
| JP7046014B2 (en) | Recombinant non-pathogenic Marek's disease virus construct encoding antigens for infectious laryngeal tracheitis virus and infectious bursal disease virus | |
| US20240294883A1 (en) | Compositions for producing recombinant virus | |
| US20180371026A1 (en) | Feline calicivirus vaccine | |
| US20190000943A1 (en) | Aav6 vectors for immunotherapy | |
| JP7132339B2 (en) | Pseudorabies virus for treating tumors | |
| US10617729B2 (en) | Multitargeting onocolytic adenovirus, methods of use, and methods of making | |
| JP2021500876A (en) | Recombinant non-pathogenic Marek's disease virus construct encoding multiple heterologous antigens | |
| BR112020010316A2 (en) | modified brucella vaccine strain for the treatment of brucellosis | |
| RU2730657C1 (en) | Anti-tumour agent based on recombinant vaccinia virus strain and method for production thereof | |
| KR102365045B1 (en) | Suspension Cell Culture Adapted Vaccine Strain Derived from Foot-and-mouth disease virus of O/ME-SA/Ind-2001 Lineage and Method of Preparing the Same | |
| Fu et al. | Genetically coating oncolytic herpes simplex virus with CD47 allows efficient systemic delivery and prolongs virus persistence at tumor site | |
| CN109078179A (en) | Hendra and Nipah viral G glycoprotein immunogenic composition | |
| JP2019520338A (en) | Equine influenza virus attenuated live vaccine | |
| EP3624825A1 (en) | Recombinant oncolytic virus | |
| WO2020230785A1 (en) | Cell fusion-inducing vaccinia virus and use thereof | |
| ES2573704T3 (en) | Recombinant variolovaccine virus that has the hepatitis C virus gene | |
| RU2700083C2 (en) | Use of genetically modified pathogenic measles virus with improved apoptotic properties (mv-deltac virus) in cancer therapy | |
| Li et al. | Development and characterization of Rift Valley fever virus-like particles | |
| US20120171246A1 (en) | Immunization to reduce neurotoxicity during treatment with cytolytic viruses | |
| CN1242065C (en) | Pig breeding and respiratory syndrome recombined adenovirus and vaccine | |
| EP3823654B1 (en) | Methods for treatment of cancer using chikungunya-vsv chimeric virus | |
| KR102320271B1 (en) | Suspension Cell Culture Adapted Vaccine Strain Derived from Foot-and-mouth disease virus of A/ASIA/Sea-97 Lineage and the Viral Vaccine Composition Containing the Same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20201125 Effective date: 20201125 |
|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20220310 |