RU2710065C1 - Синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления ДНК вируса АЧС методом петлевой изотермической амплификации - Google Patents
Синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления ДНК вируса АЧС методом петлевой изотермической амплификации Download PDFInfo
- Publication number
- RU2710065C1 RU2710065C1 RU2018144588A RU2018144588A RU2710065C1 RU 2710065 C1 RU2710065 C1 RU 2710065C1 RU 2018144588 A RU2018144588 A RU 2018144588A RU 2018144588 A RU2018144588 A RU 2018144588A RU 2710065 C1 RU2710065 C1 RU 2710065C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- reaction
- sample
- virus
- dna
- isothermal amplification
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 title claims abstract description 8
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 title abstract description 18
- 241000701386 African swine fever virus Species 0.000 claims abstract description 14
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 26
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 23
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 11
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- XZTWHWHGBBCSMX-UHFFFAOYSA-J dimagnesium;phosphonato phosphate Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XZTWHWHGBBCSMX-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 2
- 238000004879 turbidimetry Methods 0.000 claims description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 claims 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 208000007407 African swine fever Diseases 0.000 description 32
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 10
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 208000001726 Classical Swine Fever Diseases 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 102000007537 Type II DNA Topoisomerases Human genes 0.000 description 2
- 108010046308 Type II DNA Topoisomerases Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 101100081998 African swine fever virus (strain Badajoz 1971 Vero-adapted) BA71V-005 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000977261 Asfarviridae Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 102100038395 Granzyme K Human genes 0.000 description 1
- 101001033007 Homo sapiens Granzyme K Proteins 0.000 description 1
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 description 1
- 241000238887 Ornithodoros Species 0.000 description 1
- 241000702665 Porcine rotavirus Species 0.000 description 1
- 206010067470 Rotavirus infection Diseases 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 239000010794 food waste Substances 0.000 description 1
- 238000011331 genomic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 101150039251 p22 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 208000012153 swine disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к молекулярной диагностике. Разработаны олигонуклеотидные праймеры для выявления ДНК вируса африканской чумы свиней: F3 р22 GTTTTACGGATACTGCTGC, В3 р22 CCTTACCATATTTAAGAACCGG, FIP р22 TGGGGGCTATGGGATTCACT-AAGAATTTGGAAAAACACGGC, BIP р22 TGTGTGAAAAATATTGTTCATGGGG-ACATAACATGTTCCCTCCTT, LoopB р22 CCGATGACTGTACAGGTTGGG. Предложен также способ выявления ДНК вируса африканской чумы свиней из биологического материала с помощью модифицированной ПЦР, а именно петлевой изотермической амплификации (LAMP). Предлагаемое изобретение позволяет быстро и с высокой степенью достоверности выявлять присутствие ДНК вируса АЧС при помощи петлевой изотермической амплификации при исследовании образцов широкого спектра патологического и биологического материала в полевых условиях и лабораториях. 2 н.п. ф-лы, 4 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности, к выявлению ДНК вируса африканской чумы свиней в полевых условиях, научно-исследовательских учреждениях и лабораториях, с помощью модификации полимеразной цепной реакции (ПЦР), а именно в петлевой изотермической амплификации.
Африканская чума свиней (АЧС) - вирусная болезнь домашних и диких свиней, характеризующаяся геморрагическим синдромом, контагиозностью и высокой летальностью, протекающая в сверхострой, острой, подострой, хронической и инаппарантной формах.
Вирус обладает высокой степенью патогенности (смертность среди животных достигает 100%). Разработанные методы лечения и специфической профилактики болезни малоэффективны и приводит к появлению хронической формы болезни, а затем к новым вспышкам инфекции в острой форме. Распространение АЧС наносит огромные экономические потери, складывающиеся из затрат на проведение ветеринарно-санитарных и карантинных мероприятий, убоя всего естественно восприимчивого поголовья на территории очага инфекции, а также затрат, связанных с ограничениями в международной торговле, накладываемыми на неблагополучную страну [1, 11].
Возбудитель африканской чумы свиней - крупный ДНК-содержащий вирус семейства Asfarviridae. Диаметр вириона около 200 нм. Суперкапсидная оболочка приобретается вирусом в ходе почкования из клетки зрелого вируса и является модифицированной клеточной мембраной.
Особенности морфологии вируса африканской чумы свиней обуславливают его высокую устойчивость и длительную сохранность в окружающей среде. Вирус АЧС может переноситься и распространяться с контаминированными пищевыми отходами, зараженными дикими кабанами, а также клещами рода Ornithodoros [8, 10].
Заболевание является эндемичным для многих стран Южной Африки. В 2007 г. вирус АЧС был занесен в Кавказский регион, изначально в Грузию, затем в Армению, Азербайджан и во многие регионы Российской Федерации (РФ). С начала 2014 г. вспышки африканской чумы свиней постоянно регистрируются в странах восточной Европы (Польша, Литва, Латвия, Эстония) [5].
Несмотря на многолетней опыт и имеющиеся подробные рекомендации по лабораторной диагностике, идентификация вируса АЧС традиционными методами (по его биологическим свойствам) требует значительных затрат и времени. В связи с этим разработка специфичных и чувствительных экспресс-методов для обнаружения генома вируса африканской чумы свиней в полевых условиях является актуальной задачей.
Для лабораторной диагностики для выявления генома возбудителя АЧС Всемирной организацией здравоохранения животных (МЭБ) рекомендуются:
- классическая ПЦР с детекцией продуктов амплификации в агарозном геле;
- ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ).
По сравнению с вышеперечисленными методами, использование модифицированной ПЦР - петлевой изотермической амплификации или LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) позволяет существенно сократить время и ресурсы, и проводить исследования в полевых условиях.
Для стран, эндемичных по африканской чуме свиней, важна скорость постановки диагноза, а применение метода петлевой изотермической амплификации позволит оперативно, непосредственно на месте, проводить диагностические исследования этим методом, поскольку для постановки реакции используются портативные приборы, работающие на аккумуляторах.
Метод LAMP, предложенный японским ученым Цугунори Нотоми (Tsugunori Notomi) в 2000 году [9], основывался на использовании праймеров к шести различным участкам целевой области генома.
Впоследствии, метод был усовершенствован путем добавления еще одной пары праймеров - петлевых праймеров [4]. При их использовании наработка продукта идет с петель в обе стороны, а не в одну, как в оригинальном методе.
Известен способ, разработанный Wang J. с соавторами, по выявлению ДНК вируса АЧС метом изотермической рекомбиназной полимеразной амлификациии (РПА). Праймеры в данном наборе подобраны на ген B646L, кодирующий основной капсидный белок р72. Но в данном варианте, разработанная РПА предназначена только для анализа свежеотобранного материала - крови, выделений из носа после простой процедуры лизиса (без экстракции) и линейной амплификации. Недостатком данного метода является также то, что возможна лишь частичная его оптимизация [3].
Известен набор, разработанный сотрудниками TwistDx Ltd, Кембридж, Великобритания для диагностики АЧС методом РПА, праймеры в которой так же подобраны на области гена B646L [2].
Наиболее близким аналогом предлагаемого метода по сути и назначению является метод петлевой изотермической амплификации, разработанный Heather Е. James и др. [6]. В данной работе праймеры подобраны к последовательности гена, кодирующего белок вируса АЧС - топоизомераза II. Отличие данного метода от разработанного нами заключается в использованном участке генома вируса АЧС. Выбранный нами участок, ген KP177R, кодирующий белок р22, в отличии от гена, кодирующего топоизомеразу II, имеет копию на другом конце генома вируса АЧС, что может привести к повышению специфичности реакции и ее чувствительности.
Задачей настоящего изобретения являлась разработка высокочувствительного, экономичного и экспрессного способа выявлять присутствие ДНК вируса АЧС при помощи петлевой изотермической амплификации с целью устранения вышеуказанных недостатков.
Данная задача была решена благодаря созданию олигонуклеотидных праймеров, а также подбору условий для проведения петлевой изотермической амплификации, обеспечивающей получение результата в короткие сроки (в течение 40 минут) и при незначительных материальных затратах, снижая до минимума манипуляции при исследовании образцов крови и тканевых экссудатов в полевых условиях и лабораториях.
Сущность изобретения заключается в новом подходе обнаружения ДНК вируса АЧС с помощью проведения модифицированной ПЦР - петлевой изотермической амплификации (метод LAMP), и с использованием разработанных олигонуклеотидных праймеров (F3 р22, В3 р22, FIP р22, BIP р22, LoopB р22), фланкирующих специфический фрагмент генома вируса АЧС. Представленный метод включает последовательности олигонуклеотидных праймеров, имеющих следующую нуклеотидный состав:
F3 р22 GTTTTACGGATACTGCTGC
В3 р22 CCTTACCATATTTAAGAACCGG
FIP р22 TGGGGGCTATGGGATTCACT-AAGAATTTGGAAAAACACGGC
BIP р22 TGTGTGAAAAATATTGTTCATGGGG-ACATAACATGTTCCCTCCTT
LoopB р22 CCGATGACTGTACAGGTTGGG
При помощи указанных олигонуклеотидов (F3 р22, В3 р22, FIP р22, BIP р22, LoopB р22) проводят петлевую изотермическую амплификацию, позволяющую обнаружить геном вируса АЧС. При наличии в исследуемых образцах ДНК вируса АЧС в ходе петлевой изотермической амплификации синтезируются зигзагообразные продукты, содержащие фрагменты генома данного вируса.
Изобретение может быть использовано в ветеринарии, клинической и лабораторной диагностике для выявления ДНК вируса АЧС в образцах крови, пробах органов от инфицированных животных и вируссодержащем материале.
Техническим результатом изобретения является: расширенный спектр биологического материала (внутренние органы, сыворотка крови, цельная кровь, культура клеток), пригодного для проведения исследований без необходимости использования широкого спектра амплификаторов; сокращение времени для проведения массовых исследований проб на наличие генома вируса африканской чумы свиней.
В основе предложенного способа лежит образование специфического продукта, представляющего собой смесь петлеобразных петлевых нуклеотидных структур, варьирующих по длине и структуре петель. Синтез целевого продукта начинается со специфичного связывания сконструированных праймеров с участком гена, кодирующего белок р22 в геноме вируса АЧС.
Для разработки праймеров из базы данных GenBank были получены полногеномные нуклеотидные последовательности гена р22 отечественных изолятов, а также изолятов Benin97/1, OURT 88/3, L60, NHV, Ken06, BA71V, Е75 вирусов АЧС. Последовательности выравнены с помощью программы «BioEdit 7.0».
Праймеры для LAMP рассчитывались в программе PrimerExplorer V. 4. согласно руководству с учетом использования восьми участков гена. Рассчитаны 20 комплектов праймеров (FIP, BIP, F3, В3) и проведен их анализ с учетом таких параметров, как 5'- и 3-'концевая стабильность праймеров, размер фрагмента, GC-состав праймеров и положение праймеров относительно друг друга.
В результате проведенного анализа был отобран 1 комплект праймеров. В завершении процесса подбора праймеров в программе PrimerExplorer V.4. на основе полученных результатов рассчитан и петлевой праймер (Bloop).
Основная характеристика рассчитанных олигонуклеотидов представлена в таблице 1.
По сравнению с ПЦР, где используется только одна пара праймеров, предложенный метод LAMP более специфичен, потому что используемые пары праймеров, гомологичны не двум, а шести участкам целевой молекулы ДНК. Кроме того, регистрировать накопление продукта можно даже визуально по помутнению пробы, которое вызвано появлением осадка пирофосфата магния, выпадающего в ходе реакции.
В реакции используется Bst-полимераза, которая, в отличие от Taq-полимеразы, обладает способностью разделять цепи ДНК без нагрева пробы до 95°С. За счет указанного свойства Bst-полимеразы и двух из сконструированных праймеров происходит разделение цепей ДНК при одной температуре, вследствие чего отсутствует необходимость в термоциклировании и использовании для этого сложного оборудования. В процессе петлевой изотермической амплификации происходит образование специфичных петлевых структур с выпадением осадка пирофосфата магния, являющегося побочным продуктом реакции. Результат может быть учтен визуально по выпадающему осадку пирофосфата магния и/или изменению окраски реакционной смеси, а также при добавлении интеркалирующего красителя - с помощью прибора с флуоресцентной детекцией [9].
Дополнительным преимуществом метода LAMP является незначительное влияние на ход реакции наличия биологических примесей, как правило, ингибирующих ПЦР. Исследуемый образец можно вносить в реакционную смесь без предварительной очистки вирусной ДНК [7].
Метод LAMP прост в исполнении, дешев (в отличие от других методов изотермической амплификации) и, в случае турбидиметрического или колориметрического учета результатов реакции, не требует использования дорогостоящего оборудования с гибридизационно-флуоресцентной детекцией.
Для проведения петлевой изотермической амплификации в отдельной пробирке готовят реакционную смесь на необходимое количество образцов (N), в число которых входит отрицательный контроль выделения (ОКВ), отрицательный контроль реакции (ОК) и положительный контроль реакции (ПК). Объем смеси для одной пробы составляет 20 мкл, содержащих:
| - смесь праймеров | 6,5 мкл; |
| - 10х Thermopol буфер | 2,5 мкл; |
| - 100 мМ р-р сульфата магния | 1,5 мкл; |
| - 10 мМ р-р дезоксинуклеозидтрифосфатов | 3,5 мкл; |
| - деионизированная вода | 4 мкл; |
| - флуоресцентный краситель SYBR Green | 1 мкл; |
| - Bst ДНК-полимераза | 1 мкл. |
При приготовлении смеси необходимо избегать попадания прямого солнечного света, т.к. это приводит к разрушению флуоресцентных красителей. Реакционную смесь перемешивают, покачивая пробирки и центрифугируют, после чего распределяют по 20 мкл в соответствующее число пробирок (количество проб с учетом контрольных образцов + 1 шт.). В последнюю очередь вносят 5 мкл ДНК. Общий объем реакции составляет 25 мкл.
Пробирки помещают в термостат или амплификатор (например, «Rotorgene 6000» (Corbett Research, Австралия)) с программой протекания реакции, приведенной в таблице 2. Время реакции составляет 40 минут.
В случае использования прибора с флуоресцентной детекцией и добавлении интеркалирующего красителя, флуоресценцию измеряют при 63°С на канале Green. Длительность одного цикла составляет 30 секунд, поскольку сигнал регистрируется на шаге амплификации каждые 30 секунд. Результаты интерпретируют, анализируя кривые накопления флуоресцентного сигнала для каждой пробы с помощью программного обеспечения прибора. Пробы считаются положительными, если в пробе есть значение Ct. Пробы считаются отрицательными, если значения Ct не определяются. Все значения Ct (пороговой линии) учитываются только для сигналов, поднявшихся выше фонового уровня шума и имеющих вид экспоненциальных кривых.
Результаты не подлежат учету, если:
- отсутствует положительный сигнал в пробе с положительным контролем реакции. Это может свидетельствовать о неправильно выбранной программе амплификации и о других ошибках, допущенных на этапе постановки реакции. В таком случае необходимо провести реакцию еще раз.
- появляется любое значение Ct в таблице результатов для отрицательного контроля выделения и для отрицательного контроля реакции на канале Green. Это свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. Поэтому результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.
Кроме того, результаты реакции могут быть учтены по изменению окраски реакционной смеси и турбидиметрически.
В случае визуального учета реакции с помощью турбидиметрии, результат считается положительным, если выпадает белый осадок пирофосфата магния. Если проба остается прозрачной, результат считается отрицательным.
При колориметрическом учете результатов реакции, цвет реакционной смеси положительной пробы меняется на зеленый; результат считается отрицательным, если цвет реакционной смеси остается без изменений (желтый).
Результат считается достоверным только в случае прохождения положительного контроля реакции (ПК) и отсутствия амплификации специфичного продукта для отрицательного контроля реакции (ОК) и отрицательного контроля выделения ДНК (ОКВ).
Использование сконструированных синтетических олигонуклеотидных праймеров позволяет проводить амплификацию фрагмента генома только вируса африканской чумы свиней.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Определение специфичности петлевой изотермической амплификации для выявления генома вируса АЧС.
Для оценки специфичности метода использовали 6 проб, содержащих ДНК вируса АЧС и 5 проб содержащих ДНК гетерологичных вирусов, вызывающих болезни свиней с аналогичными клиническими признаками (вирусы: классической чумы свиней (КЧС), болезни Ауески (БА), репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС), ротавирусной инфекции свиней (РВИС), трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС)), а также 1 пробу содержащую ДНК Е. coli. Результаты интерпретировали по наличию или отсутствию Ct в соответствующей графе. Результаты представлены в таблице 3.
Петлевую изотермическую амплификацию и регистрацию результатов проводили по программе, описанной выше.
Пробирки поместили в амплификатор «Rotorgene 6000» (Corbett Research, Австралия)) с программой протекания реакции, приведенной в таблице 2. Время реакции составило 40 минут. Флуоресценцию измеряли при 63°С на канале Green. Длительность одного цикла составляет 30 секунд, поскольку сигнал регистрируется на шаге амплификации каждые 30 секунд. Результаты интерпретировали, анализируя кривые накопления флуоресцентного сигнала для каждой пробы с помощью программного обеспечения прибора.
Результаты интерпретировали на основании наличия или отсутствия значения Ct. Значение Ct варьировало от 24,09 до 38,97 у проб содержащих ДНК вируса АЧС. С помощью метода петлевой изотермической амплификации выявлены все положительные образцы, в то время как образцы, содержащие ДНК других возбудителей, были отрицательные.
Пример 2. Определение чувствительности петлевой изотермической амплификации для выявления генома вируса АЧС.
Для определения аналитической чувствительности метода были приготовлены 5 десятикратных разведений ДНК изолята вируса АЧС. Результаты представлены в таблице 4.
Чувствительность предложенного метода составляет 1 lg ГАдЕ, что составляет 10-15 ГАдЕ50.
Таким образом, изобретение может быть использовано в ветеринарной практике для выявления генетического материала вируса африканской чумы свиней в биологических образцах при проведении скрининговых исследований, для решения научно-исследовательских задач по мониторингу распространения АЧС. Использование специфических праймеров и метод петлевой изотермической амплификации позволяет выявить генетический материал вируса АЧС при проведении массовых исследований проб.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения:
1. Африканская чума свиней: монография. - Макаров В.В. - М.: РУДН, 2011. - 268 с
2. Презентация Тревора Дрю на международном ветеринарном конгрессе 2015 г.
3. A recombinase polymerase amplification-based assay for rapid detection of African swine fever virus., Wang J, Wang J Geng Y, Yuan W., Can J Vet Res. 2017 Oct; 81(4): 308-312
4. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. - Nagamine K., Hase Т., Notomi T. (2002).. Molecular and cellular probes 16, 223-229.
5. African swine fever: an epidemiological update - 
J.M., Mur L., 
B. // Transboundary and emerging diseases. - 2012. - T. 59. - №. s1. - C. 27-35
6. Detection of African swine fever virus by loop-mediated isothermal amplification. - Heather E. James, K. Ebert, R. McGonigle, Scott M. Reid, Neil Boonham, Jennifer A. Tomlinson, Geoffrey H. Hutchings, Mick Denyer, Chris A.L. Oura, Juliet P. Dukes, Donald P. King
7. Detection of Middle East respiratory syndrome coronavirus using reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). - Shirato K., Yano Т., Senba S., Akachi S., Kobayashi Т., Nishinaka Т., Matsuyama S. (2014). Virology journal 11, 139
8. Genomic analysis of highly virulent isolate of African swine fever virus. - Chapman DAG, Darby AC, Da Silva M, Upton C, Radford AD, Dixon LK. Emerg Infect Dis. 2011.
9. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. - Notomi Т., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa Т., Watanabe K., Amino N., Hase T. (2000). Nucleic acids research 28, E63.
10. Pathogenesis of African swine fever in domestic pigs and European wild boar - Blome S., Gabriel C, Beer M. // Virus research. - 2013. - T. 173. - №. 1. - C. 122-130.
11. Purification and properties of African swine fever virus - Carrascosa A.L. et al. // Journal of virology. - 1985. - T. 54. - №. 2. - C. 337-344.
- - отсутствие сигнала, проба отрицательна
«-» - отсутствие сигнала, проба отрицательна
«К» - отрицательный контроль реакции
Claims (3)
1. Набор синтетических олигонуклеотидных праймеров, состоящий из праймеров комплементарных умеренно консервативной области гена, кодирующего белок р22, имеющих следующий нуклеотидный состав:
2. Способ выявления ДНК вируса африканской чумы свиней из биологического материала с использованием олигонуклеотидных праймеров по п. 1 с помощью петлевой изотермической амплификации, состоящей из 2 этапов: инкубация пробирок при 63°С в течение 40 минут и учет результатов реакции с помощью программного обеспечения прибора, при этом образец считается положительным на наличие ДНК вируса АЧС, если присутствует значение Ct, образец считается отрицательным на наличие ДНК вируса, если значение Ct отсутствует, однако в случае, если отсутствует положительный сигнал в пробе с положительным контролем реакции и появляется любое значение Ct для отрицательного контроля выделения и для отрицательного контроля реакции, необходимо повторить реакцию с целью подтвердить или опровергнуть наличие ДНК искомого вируса в исследуемой пробе; кроме того, в случае визуального учета реакции при турбидиметрии и колориметрии результат считается положительным на наличие ДНК вируса АЧС, если выпадает белый осадок пирофосфата магния или если цвет реакционной смеси меняется на зеленый; образец считается отрицательным на наличие ДНК вируса, если проба остается прозрачной или цвет реакционной смеси остается без изменений (желтым).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018144588A RU2710065C1 (ru) | 2018-12-14 | 2018-12-14 | Синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления ДНК вируса АЧС методом петлевой изотермической амплификации |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018144588A RU2710065C1 (ru) | 2018-12-14 | 2018-12-14 | Синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления ДНК вируса АЧС методом петлевой изотермической амплификации |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2710065C1 true RU2710065C1 (ru) | 2019-12-24 |
Family
ID=69022743
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018144588A RU2710065C1 (ru) | 2018-12-14 | 2018-12-14 | Синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления ДНК вируса АЧС методом петлевой изотермической амплификации |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2710065C1 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113215311A (zh) * | 2021-04-23 | 2021-08-06 | 华南农业大学 | 一种离心式微流控芯片鉴别非洲猪瘟病毒基因缺失株和非洲猪瘟流行株的引物组合及试剂盒 |
| NL2031407B1 (en) * | 2022-03-25 | 2022-12-30 | Maoming Branch Guangdong Laboratory For Lingnan Modern Agriculture | Primer Set, Probe, Kit and Application for Detecting African Swine Fever Virus |
| RU2799410C1 (ru) * | 2022-10-06 | 2023-07-05 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина" (ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина) | Синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ высокочувствительного экспресс-выявления днк вируса африканской чумы свиней методом петлевой изотермической амплификации в присутствии днк внутреннего контрольного образца |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2360971C1 (ru) * | 2007-11-23 | 2009-07-10 | ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии | Способ и тест-система для обнаружения днк вируса африканской чумы свиней с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции |
| RU2639572C1 (ru) * | 2016-10-21 | 2017-12-21 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Способ подготовки биоматериала для контроля качества дезинфекции свинарников от вируса африканской чумы свиней |
| WO2018069450A1 (en) * | 2016-10-14 | 2018-04-19 | Aarhus Universitet | Methylation biomarkers for lung cancer |
-
2018
- 2018-12-14 RU RU2018144588A patent/RU2710065C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2360971C1 (ru) * | 2007-11-23 | 2009-07-10 | ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии | Способ и тест-система для обнаружения днк вируса африканской чумы свиней с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции |
| WO2018069450A1 (en) * | 2016-10-14 | 2018-04-19 | Aarhus Universitet | Methylation biomarkers for lung cancer |
| RU2639572C1 (ru) * | 2016-10-21 | 2017-12-21 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Способ подготовки биоматериала для контроля качества дезинфекции свинарников от вируса африканской чумы свиней |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113215311A (zh) * | 2021-04-23 | 2021-08-06 | 华南农业大学 | 一种离心式微流控芯片鉴别非洲猪瘟病毒基因缺失株和非洲猪瘟流行株的引物组合及试剂盒 |
| NL2031407B1 (en) * | 2022-03-25 | 2022-12-30 | Maoming Branch Guangdong Laboratory For Lingnan Modern Agriculture | Primer Set, Probe, Kit and Application for Detecting African Swine Fever Virus |
| RU2799410C1 (ru) * | 2022-10-06 | 2023-07-05 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина" (ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина) | Синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ высокочувствительного экспресс-выявления днк вируса африканской чумы свиней методом петлевой изотермической амплификации в присутствии днк внутреннего контрольного образца |
| RU2806908C1 (ru) * | 2022-12-23 | 2023-11-08 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" | Способ обнаружения ДНК вируса африканской чумы свиней с помощью специфических олигонуклеотидов путем изотермической петлевой амплификации и колориметрической детекции результатов амплификации |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Soliman et al. | Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS) | |
| RU2680094C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных | |
| CN110699489B (zh) | 非洲猪瘟病毒cd2v基因的实时荧光pcr检测引物探针组、试剂盒及方法 | |
| CN110699490B (zh) | 非洲猪瘟病毒cd2v基因的raa恒温荧光检测引物探针组、试剂盒及方法 | |
| RU2727054C1 (ru) | Способ выявления кДНК коронавируса SARS-CoV-2 с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции | |
| RU2710065C1 (ru) | Синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления ДНК вируса АЧС методом петлевой изотермической амплификации | |
| RU2694558C1 (ru) | Способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота | |
| CN116814857A (zh) | 猫细小病毒及其试剂盒和荧光重组酶聚合酶扩增的方法 | |
| RU2714045C1 (ru) | Олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченый зонд, способ и тест-система для выявления генома вируса заразного узелкового дерматита (нодулярного дерматита) КРС в реакции полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2726242C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2694501C1 (ru) | Тест-система для обнаружения генома возбудителя ротовируса типа А у сельскохозяйственных животных с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени | |
| RU2689718C1 (ru) | Способ выявления генома возбудителя ротовирусной инфекции у сельскохозяйственных животных | |
| RU2698662C1 (ru) | Тест-система для выявления РНК возбудителя вируса артериита у лошадей | |
| RU2694499C1 (ru) | Тест-система для обнаружения генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени | |
| RU2700481C1 (ru) | Способ выявления РНК возбудителя вируса артериита у лошадей | |
| Singh et al. | Development and Standardization of Visual Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Specific Diagnosis of Johne's Disease | |
| CN113234862A (zh) | 非洲猪瘟病毒lamp检测引物组及试剂盒 | |
| RU2731716C1 (ru) | Набор для дифференциации пестивирусов крупного рогатого скота и способ дифференциации пестивирусов крупного рогатого скота | |
| RU2740097C1 (ru) | Способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции нового типа (nCov19) у приматов | |
| RU2824666C1 (ru) | Олигонуклеотидные праймеры для выявления РНК вируса энзоотического лейкоза крупного рогатого скота полимеразно-цепной реакцией | |
| RU2700450C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) | |
| RU2719719C1 (ru) | Способ выявления ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2741887C1 (ru) | Тест-система для выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции нового типа (nCov19) у приматов | |
| RU2828887C1 (ru) | Набор высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров и зондов для детекции и дифференциации вирусов ачс, кчс и вд | |
| RU2814556C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени |