RU2694966C1 - Method for diagnosis of cattle leukemia virus - Google Patents
Method for diagnosis of cattle leukemia virus Download PDFInfo
- Publication number
- RU2694966C1 RU2694966C1 RU2018132934A RU2018132934A RU2694966C1 RU 2694966 C1 RU2694966 C1 RU 2694966C1 RU 2018132934 A RU2018132934 A RU 2018132934A RU 2018132934 A RU2018132934 A RU 2018132934A RU 2694966 C1 RU2694966 C1 RU 2694966C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- blv
- primers
- fam
- complementary
- leukemia virus
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 title claims abstract description 29
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 26
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 title abstract description 23
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title description 10
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims abstract description 31
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 10
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 5
- 101000779253 Bos taurus AP-3 complex subunit delta-1 Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 241000714266 Bovine leukemia virus Species 0.000 claims description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 6
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 5
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims description 3
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 claims description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 abstract description 4
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 abstract description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 abstract description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 6
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 244000309464 bull Species 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 4
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 4
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 3
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- 241001663879 Deltaretrovirus Species 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 2
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 2
- 101150088264 pol gene Proteins 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101710081103 Cuticular glutathione peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 208000032420 Latent Infection Diseases 0.000 description 1
- 206010025280 Lymphocytosis Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000011225 antiretroviral therapy Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 231100000749 chronicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 1
- 108010027225 gag-pol Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 208000019420 lymphoid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012932 thermodynamic analysis Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
- G01N33/49—Blood
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Ecology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеThe technical field to which the invention relates.
Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии, молекулярно-генетической диагностики и ветеринарной медицины и может найти применение как в ранней диагностике инфекционных заболеваний животных, так и в научных исследованиях для обнаружения и типирования вируса лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.The invention relates to the field of biotechnology, molecular biology, molecular genetic diagnosis and veterinary medicine and can be used both in the early diagnosis of infectious diseases of animals, and in scientific research for the detection and typing of the bovine leukemia virus in real time .
Уровень техникиThe level of technology
Лейкоз крупного рогатого скота – острое инфекционное заболевание, склонное к хронизации. В качестве основного этиологического агента лейкоза крупного рогатого скота выступает РНК-содержащий вирус рода дельтаретровирусы (лат. Deltaretrovirus) из семейства ретровирусы (лат. Retroviridae), морфологически сходный с возбудителями лейкоза у животных других видов. Cattle leukemia is an acute infectious disease prone to chronicity. The main etiological agent of bovine leukemia is the RNA-containing virus of the genus Deltaretrovirus (Latin Deltaretrovirus) from the retrovirus family (Latin Retroviridae), morphologically similar to the causative agents of leukemia in animals of other species.
Естественным хозяином вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) является крупный рогатый скот, что приводит к значительным экономическим потерям в областях промышленного разведения КРС в России и во всем мире. Существование диких резервуаров возбудителя на сегодняшний день не подтверждено, но предполагается, что вирус может сохраняться в организме многих видов животных: кроликов, крыс, кур, свиней, коз и овец (Riebe R. et al, 2004 [4]).Cattle is the natural host of the bovine leukemia virus (VLKRS), which leads to significant economic losses in the areas of industrial breeding of cattle in Russia and around the world. The existence of wild reservoirs to date has not been confirmed, but it is assumed that the virus can persist in the body of many animal species: rabbits, rats, chickens, pigs, goats and sheep (Riebe R. et al, 2004 [4]).
К основным клиническим проявлениям ВЛКРС относят развитие лимфоидных новообразований в результате пролиферации поликлональных Т-лимфоцитов, с поражением других иммунокомпетентных клеток, органов иммунной системы (селезенка, лимфатические узлы и др.) В тоже время, отсутствие клинической симптоматики примерно у одной трети от общего количества инфицированных животных провоцирует развитие стойкого лимфоцитоза (Mirsky M.L. et al, 1996 [3]). На фоне общего истощения иммунной системы наблюдается снижение устойчивости к инфекционной, инвазионной и соматической патологии. Так как клетки вируса и антитела к нему циркулируют в организме в «неактивном» состоянии в течение всей жизни, ВЛКРС относят к латентным или персистирующим инфекциям.The main clinical manifestations of VLKRS include the development of lymphoid neoplasms as a result of proliferation of polyclonal T-lymphocytes, with damage to other immunocompetent cells, organs of the immune system (spleen, lymph nodes, etc.) At the same time, the absence of clinical symptoms in about one third of the total infected animals provokes the development of resistant lymphocytosis (Mirsky ML et al, 1996 [3]). Against the background of a general depletion of the immune system, a decrease in resistance to infectious, invasive and somatic pathology is observed. Since the cells of the virus and its antibodies circulate in the body in an “inactive” state throughout life, VLKRS are referred to as latent or persistent infections.
Подобно прочим инфекционным ретровирусам, вирус лейкоза КРС, имеет три основных структурных гена, кодирующих вирусные протеины в следующем порядке 5’gag – pol – env. Like other infectious retroviruses, the bovine leukemia virus, has three main structural genes encoding viral proteins in the following order 5’gag - pol - env.
Ген gag (специфичный для ретровирусов) кодирует белки, формирующие «сердцевину» вируса, которые необходимы для его внутриклеточной сборки и высвобождения из клетки. Ген pol кодирует ферментную систему (обратную транскриптазу, интегразу, рибонуклеазу) (Kobayashi S. Et al, 2010 [1]). The gag gene (specific to retroviruses) encodes proteins that form the "core" of the virus, which are necessary for its intracellular assembly and release from the cell. The pol gene encodes an enzyme system (reverse transcriptase, integrase, ribonuclease) (Kobayashi S. Et al, 2010 [1]).
Ген гликопротеина (env) ВЛКРС, состоящий из gp51 гликопротеина внешней мембраны и трансмембранного gp30 гликопротеина, участвует в инфицировании клеток тканей, вызывая сильный иммунный ответ у инфицированных животных (Mamoun R. Et al, 1990 [2]).The glycoprotein gene (env) VLKRS, consisting of gp51 glycoprotein of the outer membrane and transmembrane gp30 glycoprotein, is involved in the infection of tissue cells, causing a strong immune response in infected animals (Mamoun R. Et al, 1990 [2]).
Важно отметить, подходы к классификации ВЛКРС за последние десятилетия значительно изменились. Однако наиболее современной является оценка генотипического разнообразия ВЛКРС на основе филогенетического анализа локуса env-гена данного вирусного патогена. Это связано в том числе и с получением новых знаний о связи данного гликопротеина с проявляем атипичных форм лейкоза. Сегодня на основе структуры гена env выделяют более 8 генотипов данного возбудителя. Было установлено, что для каждого из них характерна определенная географическая зона распространения, однако зарегистрированы единичные завозные случаи инфекции, вызванные другими генотипами (Rola-Luszczak M. Et al, 2013 [5]).It is important to note that the approaches to the classification of VLKRS have changed significantly over the past decades. However, the most up-to-date is the assessment of the genotypic diversity of VLKRS based on phylogenetic analysis of the env gene locus of a given viral pathogen. This is also connected with the acquisition of new knowledge about the connection of this glycoprotein with the manifestation of atypical forms of leukemia. Today, based on the structure of the env gene, more than 8 genotypes of this pathogen are isolated. It was found that each of them is characterized by a specific geographic distribution zone, however, single imported cases of infection caused by other genotypes were recorded (Rola-Luszczak M. Et al, 2013 [5]).
Диагностика лейкоза может осуществляться с использованием серологических, молекулярно-генетических (полимеразной цепной реакции - ПЦР), гематологических, клинических, патоморфологических методов и метода биопробы. В настоящее время в государственных программах по борьбе с лейкозом КРС основу диагностики составляют серологические методы исследования - реакция иммунодиффузии (РИД) и иммуноферментный анализ (ИФА); гематологические, клинические и патоморфологические методы служат для уточнения диагноза. Однако в силу особенностей инфекционного процесса плановые методы неприменимы для ранней диагностики, поскольку ориентированы на выявление иммунного ответа организма (не ранее 5-6-месячного возраста телят). В связи с этим, наиболее современный метод - молекулярно-генетическая диагностика, в частности ПЦР-анализ, за счет обнаружения РНК самого вируса или ДНК образованного им провируса, применим даже для новорожденных телят и, кроме того, обладает значительно большей чувствительностью и специфичностью по сравнению с серологическими методами. Это объясняет ежегодно растущий интерес, как со стороны самих хозяйств, так и надзорных органов именно к этому методу.Diagnosis of leukemia can be carried out using serological, molecular genetic (polymerase chain reaction - PCR), hematological, clinical, pathological methods and the method of biological tests. Currently, in state programs for the control of bovine leukemia, serological methods are the basis for diagnosis - immunodiffusion reaction (RID) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); hematological, clinical and pathological methods are used to clarify the diagnosis. However, due to the nature of the infectious process, planned methods are not applicable for early diagnosis, since they are focused on identifying the body’s immune response (not earlier than 5-6 months old calves). In this regard, the most modern method - molecular genetic diagnostics, in particular PCR analysis, due to the detection of RNA of the virus itself or the DNA of the provirus formed by it, is applicable even to newborn calves and, moreover, has a much greater sensitivity and specificity compared to with serological methods. This explains the growing interest each year, both from the farms themselves and from the supervisory authorities to this method.
Известен способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом ПЦР, заключающийся в использовании прямого и обратного олигонуклеотидных праймеров для выявления фрагмента гена pol провируса лейкоза крупного рогатого скота с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле. A known method for the diagnosis of bovine leukemia by PCR, which consists in the use of direct and reverse oligonucleotide primers to identify a fragment of the pol gene of the provirus of bovine leukemia with electrophoretic detection of amplification products in an agarose gel.
В качестве праймеров используют однонуклеотиды следующей последовательности:As primers, single nucleotides of the following sequence are used:
PF2 : 5’-TGAACGGACAAATGGACTGCTC-3’;P F2 : 5'-TGAACGGACAAATGGACTGCTC-3 ';
PR2 : 5’-CCGACAGAGAGCGAGGAGAG-3’.P R2 : 5'-CCGACAGAGAGCGAGGAGAG-3 '.
При постановке ПЦР этим способом размер продукта амплификации составляет 438 пар нуклеотидов (п.н.). Однако, данный способ требует проведения дополнительной стадии электрофоретической детекции, что повышает длительность анализа и вероятность возникновения контаминации (патент RU №2445370 С1, опубл. 20.03.12 г. Бюл. №8).When PCR is made in this way, the size of the amplification product is 438 base pairs (bp). However, this method requires an additional stage electrophoretic detection, which increases the duration of the analysis and the likelihood of contamination (patent RU No. 2445370 C1, publ. 20.03.12, Bull. No. 8).
Известен также способ выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени, заключающийся в использовании прямого и обратного олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидного зонда с флуоресцентной меткой для выявления фрагмента гена pol провируса лейкоза крупного рогатого скота. В качестве праймеров используют:There is also known a method for detecting bovine leukemia provirus DNA by real-time PCR, which consists of using direct and reverse oligonucleotide primers and a fluorescently labeled oligonucleotide probe to detect a fragment of the bovine leukemia poli virus gene. As primers use:
Pol (nested, sense) 5’-CTACCTTGCAGATCTCATC-3’;Pol (nested, sense) 5’-CTACCTTGCAGATCTCATC-3 ’;
Pol (nested, antisense) 5’- GCTTGTCGAAGCTCTGCAATGC-3.Pol (nested, antisense) 5’-GCTTGTCGAAGCTCTGCAATGC-3.
В реакционную смесь добавляют синтезированный зонд с флуоресцентной меткой – pol (molecular beacon) 5’ (FAM) – CGAGCCACCCACTACCCGCCGCCGCTCG-dabcyl-3’. Размер продукта на выходе составляет 202 п.н. (Гулюкин М.И. и др. Применение ПЦР для выявления вируса лейкоза крупного рогатого скота. Харьков, «Ветеринарная медицина», вып.92. с.145-150). To the reaction mixture is added a synthesized probe with a fluorescent tag - pol (molecular beacon) 5 ’(FAM) - CGAGCCACCCACTACCCGCCGCCGCTCG-dabcyl-3’. The size of the product at the exit is 202 p. (Gulyukin MI and others. The use of PCR for the detection of the leukemia virus in cattle. Kharkov, "Veterinary medicine", vol.92. P.145-150).
В этом способе из-за низкой консервативности снижается специфичность и эффективность обнаружения ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (Mechanisms of leukemogenesis induced by bovine leukemia virus; prospects for novel antiretroviral therapies in human. N.Gillet, A.Florins, M. Boxus, C. Burteau, A. Nigro, F. Vandermeers, H. Balon, Amel-BayaBouzar, J. Defoichel, A. Burny, M. Reichert, R. Kettmann and Luc Willems. Retrovirology 2007, 4:18).In this method, due to the low conservatism, the specificity and efficiency of detection of cattle leukemia provirus DNA decreases (Mechanisms of leukemogenesis induced by bovine leukemia virus; prospects for novel antiretroviral therapies in human. N.Gillet, A.Flins, M. Boxus, C Burteau, A. Nigro, F. Vandermeers, H. Balon, Amel-Baya Bouzar, J. Defoichel, A. Burny, M. Reichert, R. Kettmann and Luc Willems. Retrovirology 2007, 4:18).
Существует способ обнаружения провируса лейкоза крупного рогатого скота, основанный на выявлении фрагмента LTR (Long Terminal Repeat) - последовательности провируса лейкоза (патент RU № 2558252 С2, опубл. 27.07.15 г. бюл. №21). Детекцию продуктов амплификации проводят путем электрофореза реакционной смеси в агарозном геле, окрашенном бромидом этидия. В качестве праймеров используются олигонуклеотиды:There is a method for detecting bovine leukemia provirus based on identifying a fragment of LTR (Long Terminal Repeat) - leukemia provirus sequence (patent RU No. 2558252 C2, publ. 27.07.15, bulletin No. 21). The detection of amplification products is carried out by electrophoresis of the reaction mixture in agarose gel stained with ethidium bromide. Oligonucleotides are used as primers:
BL1.F 5´-GAGTTAGCGGCACCAGAAGC-3´;BL1.F 5´-GAGTTAGCGGCACCAGAAGC-3´;
BL1.R 5´-ATAGAGCTCGCGGTGGTCTC-3´.BL1.R 5´-ATAGAGCTCGCGGTGGTCTC-3´.
Продукт синтеза составляет 175 п.н. Данный способ требует проведения дополнительной стадии электрофоретической детекции, что повышает длительность анализа и вероятность возникновения контаминации.Product synthesis is 175 p. This method requires an additional stage electrophoretic detection, which increases the duration of the analysis and the likelihood of contamination.
Известен способ экспресс-диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, включающий использование прямого и обратного олигонуклеотидного праймера с добавлением в реакционную смесь олигонуклеотидного зонда с флуоресцентной меткой для выявления фрагмента гена р24 провируса лейкоза крупного рогатого скота следующей структуры:A known method for the rapid diagnosis of bovine leukemia using real-time polymerase chain reaction involves the use of a direct and reverse oligonucleotide primer with the addition of an oligonucleotide probe with a fluorescent label to the reaction mixture to detect a fragment of the cattle leukosis provirus of the following structure:
PF - 5'-GGCACCGGGTTCGCAAGTAT-3';P F - 5'-GGCACCGGGTTCGCAAGTAT-3 ';
PR - 5'-CGGTTAGGCTGGTCATGTGGCC-3';P R - 5'-CGGTTAGGCTGGTCATGTGGCC-3 ';
зонд RT р24 - AAACACTACGACTTGCAATCTTACAGGCCGAC, меченный с 5'-конца флуоресцентным красителем ROX и с 3'-конца гасителем RTQ2. Результаты интерпретируются на основании наличия пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что определяет наличие для данной пробы ампликона, размером 140 п.н. (патент RU 2644233 С2, опубл. 08.02.2018, бюл.№4). probe R T р24 - AAACACTACGACTTGCAATCTTACAGGCCGAC, labeled from the 5'-end with the ROX fluorescent dye and from the 3'-end of the RTQ2 quencher. The results are interpreted based on the presence of the intersection of the fluorescence curve with the threshold line set at the appropriate level, which determines the presence of an amplicon for this sample, 140 bp in size. (patent RU 2644233 C2, publ. 08/02/2018, bull. No. 4).
Все вышеперечисленные способы ориентированы на выявление ДНК образованного в клетке провируса, а не РНК самого вируса, что не позволяет выявить вирусоносительство на самой ранней стадии заболевания. Известные способы не фланкируют область env -гена, ассоциированного с проявлением атипичных форм лейкоза. Кроме того, эти методы не позволяют определить генотип выявленного ВЛКРС.All of the above methods are focused on identifying the DNA of the provirus formed in the cell, and not the RNA of the virus itself, which makes it impossible to identify the virus carrier at the very early stage of the disease. Known methods do not flank the env-gene region associated with the manifestation of atypical forms of leukemia. In addition, these methods do not allow to determine the genotype of the identified VLKRS.
Раскрытие изобретенияDISCLOSURE OF INVENTION
Технической задачей, на достижение которой направлено изобретение, является разработка быстрого, высокоспецифичного (отсутствие ложноположительных результатов), чувствительного способа диагностики РНК ВЛКРС на ранней стадии заболевания методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ).The technical task, to which the invention is directed, is the development of a fast, highly specific (no false positive results) sensitive method for diagnosing VLCRC RNA at an early stage of the disease by PCR with real-time detection (PCR-RV).
Технический результат заявляемого изобретения заключается в формировании реакционных смесей для проведения ПЦР-РВ в два независимых этапа (обнаружение ВЛКРС и генетическое типирование вируса), включающих для первого этапа пару специфических олигонуклеотидных праймеров, комплиментарных областям, фланкирующим консервативный участок гена env (гена белка оболочки gp51), и TaqMan ДНК-зонд, полностью комплиментарный консервативному участку; для второго – пару специфичных праймеров и два флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зонда, специфичных к аллелям РНК разных генотипов вируса лейкоза. Это обеспечивает максимальную информативность, чувствительность и специфичность метода, минимизацию контаминации в лаборатории, а также возможность достоверно дискриминировать изоляты российских штаммов от других.The technical result of the claimed invention consists in the formation of reaction mixtures for carrying out PCR-RV in two independent stages (detection of VLKRS and genetic typing of the virus), including for the first stage a pair of specific oligonucleotide primers complementary to the regions flanking the conserved region of the env gene (gp51 shell protein) , and a TaqMan DNA probe, fully complimentary to the conservative region; for the second, a pair of specific primers and two fluorescently labeled oligonucleotide probes specific for RNA alleles of different genotypes of leukemia virus. This ensures maximum information content, sensitivity and specificity of the method, minimization of contamination in the laboratory, as well as the ability to reliably discriminate the isolates of Russian strains from others.
Техническая задача решается, а технический результат достигается за счет последовательного использования в реакционной смеси двух систем праймер-зонд, имеющих следующие характеристики:The technical problem is solved, and the technical result is achieved due to the successive use of two primer-probe systems in the reaction mixture, which have the following characteristics:
1. Прямой и обратный праймеры, а также олигонуклеотидный зонд для этапа обнаружения РНК ВЛКРС имеют следующий нуклеотидный состав (5ґ-3ґ-):1. The forward and reverse primers, as well as the oligonucleotide probe for the VLCRS RNA detection stage, have the following nucleotide composition (5ґ-3ґ-):
BLVcons-F – CAGGGCCATGGYCACRTATG;BLVcons-F - CAGGGCCATGGYCACRTATG;
BLVcons-R – GCYTGGGAGGCRTTGTCC;BLVcons-R - GCYTGGGAGGCRTTGTCC;
BLVcons-probe - FAM-CGAGCCCCGATGCCCTTATGTG-BHQ1.BLVcons-probe - FAM-CGAGCCCCGATGCCCTTATGTG-BHQ1.
Температура отжига прямого и обратного праймера составляет 58,5 и 59,2°С, зонда – 62,4°С, GC-состав – 60%, 66,7% и 63,6% соответственно, праймеры фланкируют консервативный фрагмент гена gp51 ВЛКРС, самокомплиментарные участки внутри каждого праймера и между прямым и обратным отсутствуют, размер ампликонов 93 п.н.The annealing temperature of the forward and reverse primers is 58.5 and 59.2 ° C, the probe is 62.4 ° C, the GC composition is 60%, 66.7% and 63.6%, respectively, the primers flank the conservative gp51 gene fragment of the VLKRS , there are no self-complementary regions inside each primer and between direct and reverse, the size of the amplicons is 93 bp.
2. Последовательности праймеров и зондов для генетического типирования ВЛКРС (SNP-типирование) следующие (5ґ-3ґ-): 2. Sequences of primers and probes for genetic typing VLKRS (SNP-typing) the following (5ґ-3ґ-):
BLV-F = GGCACCACCCTTCCCAGA;BLV-F = GGCACCACCCTTCCCAGA;
BLV-R = AGARAGATTAACCAGGGAGATAGG;BLV-R = AGARAGATTAACCAGGGAGATAGG;
BLV-FAM-T = FAM-TTCAATGTTTCTCAAGGC-BHQ1;BLV-FAM-T = FAM-TTCAATGTTTCTCAAGGC-BHQ1;
BLV-VIC-C = VIC-TCAACGTTTCTCAAGGC-BHQ1.BLV-VIC-C = VIC-TCAACGTTTCTCAAGGC-BHQ1.
Прямой и обратный праймеры комплиментарны области вирусного гена gp51, не содержат самокомплиментарных участков внутри каждого из них, температура отжига составляет 60,1 и 55,6°С, GC-состав праймеров – 66,7 и 43,8%, зонда BLV-FAM-T – 38,9%, BLV-VIC-C – 47,1%, размер ПЦР-продукта – 86 п.н. TagMan-зонды специфичны соответственно к аллелям С и Т, что позволяет с высокой степенью вероятности дифференцировать штаммы III и IV генотипов (аллель С), выделяемые на территории Российской Федерации и стран Восточной Европы, от других (аллель Т).The forward and reverse primers are complementary to the region of the gp51 viral gene, do not contain self-complementary regions within each of them, the annealing temperature is 60.1 and 55.6 ° C, the GC-composition of the primers is 66.7 and 43.8%, the BLV-FAM probe -T - 38.9%, BLV-VIC-C - 47.1%, the size of the PCR product is 86 bp. TagMan probes are specific, respectively, to alleles C and T, which allows a high degree of probability to differentiate strains of the III and IV genotypes (allele C), isolated on the territory of the Russian Federation and countries of Eastern Europe, from others (allele T).
Характеристика разработанных праймеров приведена в таблице 1.Characteristics of the developed primers are shown in table 1.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Разработка способа диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота осуществлялась следующим образом.Development of a method for the diagnosis of bovine leukemia virus was carried out as follows.
На основании филогенетического и сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей гена gp51 155 штаммов ВЛКРС из международной базы данных DDBJ/EMBL/GenBank, доступных на момент проведения исследования, были выделены 3 группы преобладающих генотипов вируса в зависимости от их географического положения. Например, генотипы I и II характерны для стран Тихоокеанского региона и условно были обозначены как генотип «США – Япония». Штаммы близких генотипов III и IV выделяют преимущественно в странах Восточной Европы, поэтому эти генотипы были условно обозначены как генотип «Россия – Европа». Генотип V – наиболее обособленный в генетическом отношении от других – обозначен как генотип «Азия».Based on the phylogenetic and comparative analysis of the nucleotide sequences of the gp51155 gene of the VLCRS strains from the international database DDBJ / EMBL / GenBank, available at the time of the study, 3 groups of the prevailing genotypes of the virus were identified depending on their geographical location. For example, genotypes I and II are characteristic for the countries of the Pacific region and were conventionally designated as the genotype "USA - Japan". The strains of similar genotypes III and IV are isolated mainly in the countries of Eastern Europe; therefore, these genotypes were provisionally designated as the “Russia-Europe” genotype. Genotype V - the most genetically isolated from others - is designated as the genotype "Asia".
При сравнительном анализе нуклеотидных последовательностей локуса env всех исследуемых штаммов была обнаружена общая консервативная область размером 26 п.н. с координатами 4944 – 4969, которая была использована в качестве мишени при конструировании ПЦР тест-системы для обнаружения ВЛКРС.A comparative analysis of the nucleotide sequences of the env locus of all strains under study revealed a total conservative region of 26 bp in size. with coordinates 4944 - 4969, which was used as a target in the design of PCR test systems for the detection of VLKRS.
В качестве стратегии для генотипирования изолятов ВЛКРС различного происхождения использовался комплекс специфичных SNP в вариабельной области гена gp51. Мишенью была выбрана наиболее перспективная позиция 5427 (С/Т), которая позволяет с высокой степенью вероятности дифференцировать штаммы III и IV генотипов (аллель С), выделяемые на территории Российской Федерации и стран Восточной Европы, от других (аллель Т). A complex of specific SNPs in the variable region of the gp51 gene was used as a strategy for genotyping isolates of VLCRs of various origins. The target selected the most promising position 5427 (C / T), which allows a high degree of probability to differentiate strains of the III and IV genotypes (allele C), isolated in the territory of the Russian Federation and Eastern Europe, from others (allele T).
Выбор пар праймеров и зондов, а также проверка их качества и термодинамический анализ осуществляли с помощью компьютерной программы Vector NTI 11 (Invitrogen, США). Праймеры проверяли на отсутствие гомологии с последовательностями других вирусов и генома человека программой BLAST с помощью web-ресурса Национального центра биотехнологической информации (NCBI) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Оценка специфичности сконструированных праймеров подтвердила гомологичность выбранных пар BLVcons-F - BLVcons-R и BLV-F - BLV-R с нуклеотидной последовательностью гена gp51 и отсутствие значимой гомологии с нуклеотидными последовательностями других видов вирусов. The selection of pairs of primers and probes, as well as their quality check and thermodynamic analysis were carried out using the computer program Vector NTI 11 (Invitrogen, USA). Primers were tested for the absence of homology with sequences of other viruses and the human genome by the BLAST program using the web-resource of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). An assessment of the specificity of the designed primers confirmed the homology of the selected BLVcons-F - BLVcons-R and BLV-F - BLV-R pairs with the nucleotide sequence of the gp51 gene and the absence of significant homology with the nucleotide sequences of other types of viruses.
Дизайн каждой отобранной пары праймеров и зондов (для обнаружения и генетического типирования ВЛКРС) осуществлен в полном соответствии с требованиями, предъявляемыми к олигонуклеотидам: прямой и обратный праймеры, составляющие пару, комплиментарны к выбранному фрагменту РНК вируса лейкоза крупного рогатого скота; имеют оптимальный размер, структуру и GC-состав; у них отсутствует взаимо- и самокомплиментарность; температуры отжига и плавления близкие. Длина специфического фрагмента составляет соответственно 93 и 86 п.н.The design of each selected pair of primers and probes (for detection and genetic typing of VLKRS) was carried out in full compliance with the requirements for oligonucleotides: the forward and reverse primers that make up the pair are complementary to the selected fragment of bovine leukemia virus RNA; have an optimal size, structure and GC-composition; they lack interoperability and self-complementarity; Annealing and melting temperatures are close. The length of a specific fragment is respectively 93 and 86 bp.
Праймеры и зонды были синтезированы на автоматических ДНК-синтезаторах в коммерческом сервисном центре и очищены с помощью полиакриламидного геля (ПААГ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (чистота продукта 98 %).Primers and probes were synthesized on automatic DNA synthesizers at a commercial service center and purified using polyacrylamide gel (PAAG) and high performance liquid chromatography (HPLC) (product purity 98%).
Состав реакционных смесей представлен в таблицах 2 и 3. Они подбирались таким образом, чтобы концентрация ионов MgCl2 обеспечивала оптимальную скорость и точность работы фермента Taq-полимеразы, а концентрация дНТФ, праймеров, зондов и объем пробы способствовали повышению специфичности реакции.The composition of the reaction mixtures is presented in Tables 2 and 3. They were selected so that the concentration of MgCl 2 ions ensured the optimum speed and accuracy of the Taq polymerase enzyme, and the concentration of dNTPs, primers, probes and sample volume increased the specificity of the reaction.
Амплификацию проводили в объеме реакционной смеси 25 мкл. В качестве положительного контроля прохождения полимеразной цепной реакции с использованием разработанных праймеров использовали синтетические ДНК-матрицы, которые были синтезированы стандартным способом на автоматических ДНК-синтезаторах.Amplification was carried out in a 25 μl volume of the reaction mixture. As a positive control of the passage of the polymerase chain reaction using the developed primers, synthetic DNA templates were used, which were synthesized using a standard method on automatic DNA synthesizers.
Температурно-временной режим реакции отражен в таблице 4.The temperature-time reaction is reflected in table 4.
ПЦР проводили на термоциклерах Rotor-Gene Q (Qiagen, Германия) и CFX96 (Bio-Rad, США).PCR was performed on Rotor-Gene Q thermocyclers (Qiagen, Germany) and CFX96 (Bio-Rad, USA).
Учет результатов ПЦР для этапа обнаружения ВЛКРС проводили на основании регистрации флуоресцентных сигналов по каналу FAM/Green и по наличию (или отсутствию) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией.Recording of the PCR results for the VLCRS detection stage was carried out on the basis of recording fluorescent signals on the FAM / Green channel and on the presence (or absence) of the intersection of the fluorescence curve with the threshold line set at the appropriate level.
Учет результатов ПЦР для SNP-типирования проводили на основании регистрации флуоресцентных сигналов по каналам FAM/Green и JOE/Yellow и по наличию (или отсутствию) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов).Recording of PCR results for SNP typing was carried out on the basis of recording fluorescent signals on the FAM / Green and JOE / Yellow channels and on the presence (or absence) of the fluorescence curve intersecting the threshold line set at an appropriate level (which corresponds to the presence or absence of the threshold value of the “Ct "In the corresponding column in the results table).
Анализировали кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам:Analyzed the curves of the accumulation of the fluorescent signal in two channels:
1. По каналу для флуорофора FAM/Green регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента РНК, содержащего в позиции 5427 нуклеотид Т;1. The signal for the FAM / Green fluorophore is recorded, indicating the accumulation of the amplification product of an RNA fragment containing nucleotide T at position 5427;
2. По каналу для флуорофора JOE/Yellow регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации РНК, содержащего в позиции 5427 нуклеотид С.2. The channel for the JOE / Yellow fluorophore registers a signal indicating the accumulation of an RNA amplification product containing 5427 nucleotide C in position.
Пример 1. Проверка эффективности этапа обнаружения ВЛКРС.Example 1. Check the effectiveness of the detection phase VLKRS.
Материалом для исследования служили 22 пробы периферической крови крупного рогатого скота из неблагополучного по лейкозу хозяйства, у которых носительство ВЛКРС было подтверждено в реакции иммунодиффузии (Правила по профилактике и борьбе с лейкозом крупного рогатого скота, утвержденные приказом Минсельхозпрода РФ от 11 мая 1999 г. № 359).The study was carried out on 22 samples of peripheral blood of cattle from a leukemia-negative household, in which the VLKRS carrier was confirmed by immunodiffusion (Rules for the prevention and control of cattle leukemia, approved by order of the Ministry of Agriculture and Food of the Russian Federation of 11 May 1999 No. 359 ).
Принцип интерпретации результатов следующий. РНК ВЛКРС обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для флуорофора FAM/Green определено значение порогового цикла Ct, не превышающее граничное значение (пороговое значение Ct для положительных проб по каналу FAM/Green брали не более 45). При этом кривая флуоресценции каждой исследуемой пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.The principle of interpretation of the results is as follows. RNA VLKRS detected if for the sample in the table of results for the fluorophore FAM / Green determined the value of the threshold cycle Ct, not exceeding the limit value (the threshold value of Ct for positive samples on the channel FAM / Green took no more than 45). In this case, the fluorescence curve of each test sample should cross the threshold line in the area of the characteristic exponential rise of fluorescence.
РНК ВЛКРС не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для флуорофора FAM/Green не определено значение порогового цикла Ct.RNA of VLCCR was not detected if the value of the Ct threshold cycle was not determined for the FAM / Green fluorophore for this sample in the results table for the FAM / Green fluorophore.
Испытания показали, что из 22 проб в 20 случаях получен положительный ответ в ПЦР. Отрицательные контроли амплификации и экстракции РНК показали отсутствие вирусной РНК в пробе, что позволяет считать результаты ПЦР-исследований достоверными.Tests have shown that of the 22 samples in 20 cases, a positive response was obtained in PCR. Negative controls of RNA amplification and extraction showed the absence of viral RNA in the sample, which makes it possible to consider the results of PCR studies to be reliable.
Пример 2. Проверка эффективности этапа генетического типирования ВЛКРС.Example 2. Testing the effectiveness of the stage of genetic typing VLKRS.
В качестве материала для испытаний служили 22 пробы периферической крови крупного рогатого скота из неблагополучного по лейкозу хозяйства, положительно реагирующих в реакции иммунодиффузии (Правила по профилактике и борьбе с лейкозом крупного рогатого скота, утвержденные приказом Минсельхозпрода РФ от 11 мая 1999 г. № 359).As a material for testing, 22 samples of peripheral blood of cattle from a leukemia-unfavorable farm responded positively in the immunodiffusion reaction (Rules for the prevention and control of cattle leukemia, approved by order of the Ministry of Agriculture and Food of the Russian Federation of May 11, 1999 No. 359).
Принцип интерпретации результатов следующий: в позиции 5427 вируса лейкоза находится нуклеотид Т, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для флуорофора FAM/Green определено значение порогового цикла Ct, не превышающее граничное значение (пороговое значение Ct для положительных проб по каналу FAM/Green брали не более 40). При этом кривая флуоресценции каждой исследуемой пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.The principle of interpretation of the results is as follows: nucleotide T is in position 5427 of the leukemia virus if the value of the threshold cycle Ct is determined for a given sample in the results table for the FAM / Green fluorophore and does not exceed the limit value (the Ct value for positive samples for the FAM / Green channel took no more than 40). In this case, the fluorescence curve of each test sample should cross the threshold line in the area of the characteristic exponential rise of fluorescence.
В позиции 5427 вируса лейкоза не находится нуклеотид Т, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для флуорофора FAM/Green не определено значение порогового цикла Ct.The nucleotide T is not located at position 5427 of the leukemia virus, if the value of the threshold cycle Ct is not determined in the results table for the FAM / Green fluorophore for this sample.
В результате 22 пробы, а также отрицательные контроли выделения и амплификации показали отсутствие нуклеотида Т. Положительный контроль (синтетическая ДНК-матрица Т) имела определенное значение порогового цикла.As a result, 22 samples, as well as negative controls for isolation and amplification, showed the absence of the T nucleotide. The positive control (synthetic DNA template T) had a certain threshold cycle value.
Аналогично по каналу для флуорофора JOE/Yellow регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации РНК, содержащего в позиции 5427 нуклеотид С. Пороговое значение Ct для положительных проб по данному каналу - не более 30.Similarly, the channel for the JOE / Yellow fluorophore registers a signal indicating the accumulation of an RNA amplification product containing 5427 nucleotide C in the position. The Ct threshold value for positive samples for this channel is not more than 30.
Анализ проб показал в 21 случае из 22 наличие нуклеотида С (принадлежность к генотипу «Россия-Европа»), отрицательный результат в отрицательных контролях выделения и амплификации, а также в положительном контроле нуклеотида Т. В связи с этим, результаты испытаний считали достоверными.Analysis of the samples showed in 21 cases out of 22 the presence of nucleotide C (belonging to the Russia-Europe genotype), a negative result in the negative controls for isolation and amplification, as well as in the positive control of the nucleotide T. In this regard, the test results were considered reliable.
Техническим результатом заявленного изобретения является достоверный, высокочувствительный и высокоспецифичный способ детекции и генотипирования фрагмента РНК вируса лейкоза крупного рогатого скота в биологическом материале на ранней стадии заболевания в короткие сроки. При этом компьютерный анализ показал отсутствие реакции на гомологичные и гетерологичные организмы.The technical result of the claimed invention is a reliable, highly sensitive and highly specific method for the detection and genotyping of an RNA fragment of bovine leukemia virus in biological material at an early stage of the disease in a short time. At the same time, computer analysis showed no response to homologous and heterologous organisms.
Предложенный способ апробирован с положительными результатами и регулярной воспроизводимостью этих результатов в 2018 году на 250 пробах РНК, выделенных из периферической крови крупного рогатого скота 5 хозяйств Ставропольского края. Работу проводили на базе ГБУ СК «Ставропольская краевая ветеринарная лаборатория» (г. Светлоград).The proposed method was tested with positive results and regular reproducibility of these results in 2018 on 250 RNA samples isolated from the peripheral blood of cattle in 5 farms of the Stavropol Territory. The work was carried out on the basis of GBU IC "Stavropol Regional Veterinary Laboratory" (Svetlograd).
Предлагаемый способ может быть использован как в диагностике инфекционных заболеваний животных, так и в научных исследованиях для обнаружения и типирования РНК ВЛКРС методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.The proposed method can be used both in the diagnosis of infectious diseases of animals, and in scientific research for the detection and typing of RNA VLKR by the method of polymerase chain reaction in real time.
Источники информации:Information sources:
1. Kobayashi S., Tsutsui T., Yamamoto T., Hayama Y., Kameyama K., Konishi M., Murakami K. Risk factors associated with within-herd transmission of bovine leukemia virus on dairy farms in Japan // BMC veterinary research. – 2010. – V. 6, No. 1. – P. 1.1. Kobayashi S., Tsutsui T., Yamamoto T., Hayama Y., Kameyama K., Konishi M., Murakami K. Risk factors associated with bovine leukemia in Japan // BMC veterinary research. - 2010. - V. 6, No. 1. - P. 1.
2. Mamoun R., Morisson M., Rebeyrotte N., Busetta B., Couez D., Kettmann R., et al. Sequence variability of bovine leukemia virus env gene and its relevance to the structure and antigenicity of the glycoproteins // J. Virol. – 1990. – V. 64, No. 9 – P. 4180-4188.2. Mamoun R., Morisson M., Rebeyrotte N., Busetta B., Couez D., Kettmann R., et al. Sequence variability of bovine leukemia virus and its glycoproteins // J. Virol. - 1990. - V. 64, No. 9 - P. 4180-4188.
3. Mirsky M.L., Olmstead C.A., Da Y., Lewin H.A. The prevalence of proviral bovine leukemia virus in peripheral blood mononuclear cells at two subclinical stages of infection // J. Virol. – 1996. – V. 70 – P. 2178–2183.3. Mirsky M.L., Olmstead C.A., Da Y., Lewin H.A. The prevalence of proviral bovine leukemia virus in peripheral blood cells at two subclinical stages of infection // J. Virol. - 1996. - V. 70 - P. 2178–2183.
4. Riebe R., Blankenstein P., Starick E., Bondzio A. Establishment of a new bovine leucosis virus producing cell line // J. Virol. Meth. – 2004. – V. 121, No. 2 – P. 239-246.4. Riebe R., Blankenstein, P., Starick, E., Bondzio A., Establishment of a new bovine leucosis virus producing cell line // J. Virol. Meth. - 2004. - V. 121, No. 2 - P. 239-246.
5. Rola-Luszczak M., Pluta A., Olech M., Donnik I., Petropavlovskiy M., Gerilovych A. et al. The molecular characterization of bovine leukaemia virus isolates from Eastern Europe and Siberia and its impact on phylogeny // PLoS One. – 2013. – V. 8, No.3 – P. e58705.5. Rola-Luszczak, M., Pluta, A., Olech, M., Donnik, I., Petropavlovskiy, M., Gerilovych, A. et al. The molecular characterization of the bovine leukaemia virus is a phylogeny virus / PLoS One. - 2013. - V. 8, No.3 - P. e58705.
Цитируемые патенты: Cited patents:
1. RU №2445370 С1, опубл. 20.03.12 г. Бюл. №8.1. RU # 2445370 C1, publ. 03/20/12. Bull. №8.
2. RU № 2558252 С2, опубл. 27.07.15 г. Бюл. №21.2. RU No. 2558252 C2, publ. 07.27.15 Bul. №21.
3. RU №2644233 С2, опубл. 08.02.2018 г. Бюл. №4.3. RU # 2644233 C2, publ. 08.02.2018 Bull. №4.
Сущность изобретения поясняется таблицами и рисунками, в которых отображается следующая информация.The invention is illustrated by tables and figures that display the following information.
Таблица 1. Характеристика отобранных праймеров и зондов.Table 1. Characteristics of the selected primers and probes.
Таблица 2. Состав реакционной смеси для обнаружения РНК ВЛКРС.Table 2. The composition of the reaction mixture for the detection of RNA VLKRS.
Таблица 3. Состав реакционной смеси для SNP-типирования ВЛКРС.Table 3. The composition of the reaction mixture for SNP-typing VLKRS.
Таблица 4. Температурно-временной режим проведения амплификацииTable 4. Temperature-time mode of amplification
Сопоставительный анализ заявляемого изобретения показал, что совокупность существенных признаков заявленного способа, не известна из уровня техники и значит, соответствует условию патентоспособности «Новизна».Comparative analysis of the claimed invention showed that the set of essential features of the claimed method is not known from the prior art and therefore corresponds to the condition of patentability "Novelty."
В уровне техники не было выявлено признаков, совпадающих с отличительными признаками заявленного изобретения и влияющих на достижение заявленного технического результата, поэтому заявленное изобретение соответствует условию патентоспособности «Изобретательский уровень».In the prior art there were no signs that match the distinctive features of the claimed invention and affect the achievement of the claimed technical result, therefore, the claimed invention meets the condition of patentability "Inventive step".
Приведенные сведения подтверждают возможность применения заявляемого способа в области биотехнологии, молекулярной биологии, молекулярно-генетической диагностики и ветеринарной медицины для ранней диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота, и поэтому соответствует условию патентоспособности «Промышленная применимость».The information confirms the possibility of applying the proposed method in the field of biotechnology, molecular biology, molecular genetic diagnosis and veterinary medicine for early diagnosis of the leukemia virus in cattle, and therefore meets the condition of patentability "Industrial applicability".
Claims (11)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018132934A RU2694966C1 (en) | 2018-09-18 | 2018-09-18 | Method for diagnosis of cattle leukemia virus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018132934A RU2694966C1 (en) | 2018-09-18 | 2018-09-18 | Method for diagnosis of cattle leukemia virus |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2694966C1 true RU2694966C1 (en) | 2019-07-18 |
Family
ID=67309165
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018132934A RU2694966C1 (en) | 2018-09-18 | 2018-09-18 | Method for diagnosis of cattle leukemia virus |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2694966C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2803893C1 (en) * | 2022-12-27 | 2023-09-21 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный аграрный научный центр Республики Дагестан" | Accelerated method for post-mortem diagnosis of bovine leukemia using enzyme immunoassay |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012053666A1 (en) * | 2010-10-21 | 2012-04-26 | Riken | Kit for detecting bovine leukemia virus(blv), and use thereof |
| CN103045762A (en) * | 2012-12-31 | 2013-04-17 | 上海市动物疫病预防控制中心 | Kit for detecting proviral DNA (deoxyribonucleic acid) of bovine leukemia virus (BLV) and application of kit |
-
2018
- 2018-09-18 RU RU2018132934A patent/RU2694966C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012053666A1 (en) * | 2010-10-21 | 2012-04-26 | Riken | Kit for detecting bovine leukemia virus(blv), and use thereof |
| CN103045762A (en) * | 2012-12-31 | 2013-04-17 | 上海市动物疫病预防控制中心 | Kit for detecting proviral DNA (deoxyribonucleic acid) of bovine leukemia virus (BLV) and application of kit |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| GILLET NA et al. Bovine leukemia virus small noncoding RNAs are functional elements that regulate replication and contribute to oncogenesis in vivo. PLoS Pathog., 2016, 12(4):e1005588. * |
| JIMBA M et al. BLV-CoCoMo-qPCR: Quantitation of bovine leukemia virus proviral load using the CoCoMo algorithm. Retrovirology, 2010, Nov, 7:91. * |
| POLAT M et al. Detection and molecular characterization of bovine leukemia virus in Philippine cattle. Arch Virol, 2015, 160(1), p.285-96. * |
| POLAT M et al. Detection and molecular characterization of bovine leukemia virus in Philippine cattle. Arch Virol, 2015, 160(1), p.285-96. JIMBA M et al. BLV-CoCoMo-qPCR: Quantitation of bovine leukemia virus proviral load using the CoCoMo algorithm. Retrovirology, 2010, Nov, 7:91. GILLET NA et al. Bovine leukemia virus small noncoding RNAs are functional elements that regulate replication and contribute to oncogenesis in vivo. PLoS Pathog., 2016, 12(4):e1005588. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2803893C1 (en) * | 2022-12-27 | 2023-09-21 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный аграрный научный центр Республики Дагестан" | Accelerated method for post-mortem diagnosis of bovine leukemia using enzyme immunoassay |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Marfurt et al. | Identification and differentiation of Leishmania species in clinical samples by PCR amplification of the miniexon sequence and subsequent restriction fragment length polymorphism analysis | |
| CN101611155B (en) | Diagnostic sequences for shrimp pathogens | |
| CN107849618A (en) | Differentiate and detect the genetic marker of aquatile infectious disease Causative virus and using its Causative virus discriminating and detection method | |
| RU2445370C1 (en) | Diagnostic technique for cattle leukaemia by polymerase chain reaction | |
| Pestechian et al. | Genetic diversity of Echinococcus granulosus in center of Iran | |
| WO2022257663A1 (en) | Method and kit for detecting and screening n501y mutation in covid-19 | |
| WO2011146756A1 (en) | Methods and kits useful in the differentiation of burkholderia species | |
| CA2820421A1 (en) | Kit for detecting bovine leukemia virus(blv), and use thereof | |
| JP6511544B2 (en) | Biomarkers and diagnostic methods for detection of highly pathogenic viral hemorrhagic sepsis virus | |
| CN113508182A (en) | Assays for detecting Human Papilloma Virus (HPV) | |
| US20190055599A1 (en) | Oligonucleotides, Oligonucleotide Set, Kit For Diagnosis And Discrimination Of HTLV-1/2 Infection, Polynucleotyde Suitable For Use As A Reference Target For Primer And Probe Design For Detection And Differentiation of HTLV-1 and HTLV-2, Amplicon, And Method For Detecting At Least One HTLV Target | |
| Kuan et al. | Use of Reverse Transcription Loop‐Mediated Isothermal Amplification for the Detection of Z ucchini yellow mosaic virus | |
| JP2011078358A (en) | Method for detecting norovirus | |
| CN105296669A (en) | RT-LAMP detection primer set, kit and detection method for infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) | |
| CN107190103B (en) | Multiplex PCR primer set, kit and method for simultaneous detection of three fish viruses | |
| RU2694966C1 (en) | Method for diagnosis of cattle leukemia virus | |
| RU2550257C2 (en) | METHOD OF DIFFERENTIATING TYPICAL AND ATYPICAL STRAINS Yersinia pestis OF MEDIEVAL BIOVAR BY PCR METHOD WITH HYBRIDISATION-FLUORESCENT RECORDING RESULTS | |
| CN104975077B (en) | Pig source eperythrozoon fluorescent quantificationally PCR detecting kit and its application | |
| KR102091280B1 (en) | Primers for LAMP based detection of Chicken anemia virus and its use | |
| JP5315519B2 (en) | Koi herpesvirus (KHV) detection method | |
| US10017830B2 (en) | Oligonucleotide probes, kit containing the same and method for pathotyping of H5 avian influenza viruses | |
| Guo et al. | Detection and Differentiation of Avian Reoviruses Using SYBR-Green I–Based Two-Step Real-Time Reverse Transcription PCR with Melting Curve Analysis | |
| KR102276396B1 (en) | A composition and RT-qPCR based chip for detecting avian influenza viruses and method for detecting avian influenza viruses using the same | |
| CN109517929B (en) | Primer group and kit for porcine circovirus detection and type2 typing | |
| CN105400908A (en) | Primer and kit for detecting channel catfish viruses through pyrosequencing technology and detecting method |