RU2682041C1 - Method of identification of osmotolerant yeast zygosaccharomyces rouxii based on real-time - Google Patents
Method of identification of osmotolerant yeast zygosaccharomyces rouxii based on real-time Download PDFInfo
- Publication number
- RU2682041C1 RU2682041C1 RU2018108821A RU2018108821A RU2682041C1 RU 2682041 C1 RU2682041 C1 RU 2682041C1 RU 2018108821 A RU2018108821 A RU 2018108821A RU 2018108821 A RU2018108821 A RU 2018108821A RU 2682041 C1 RU2682041 C1 RU 2682041C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- yeast
- zygosaccharomyces rouxii
- real
- identification
- osmotolerant
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к микробиологии и касается способов измерения, использующих микроорганизмы, а именно, нуклеиновые кислоты. Данное изобретение может быть использовано в пищевой промышленности, в особенности кондитерской, при идентификации дрожжей Zygosaccharomyces rouxii как во входящем сырье пищевого предприятия, так и на разных этапах производства, включая конечную продукцию.The present invention relates to microbiology and relates to measurement methods using microorganisms, namely, nucleic acids. This invention can be used in the food industry, in particular the confectionery, in the identification of Zygosaccharomyces rouxii yeast both in the incoming raw materials of the food enterprise and at different stages of production, including the final product.
Zygosaccharomyces rouxii являются осмотолерантными дрожжами. Осмотолерантные дрожжи - организмы, которые способны расти и размножаться в среде с низкой активность воды (Aw) й высоким соотношением углерод-азот (Tilbury R.H. Xerotolerant yeasts at high sugar concentrations. Microbial Growth and Survival in Extremes of Environment ed. Gould, G. W. and Corry J.E.L.. 1980, pp. 103-128). Осмотолерантные дрожжи являются основными организмами, вызывающими порчу таких продуктов как мед, различные виды сиропов, конфеты, джемы, желе (Walker H.W. and Ayres J.C. Yeasts as spoilage organisms. The yeasts, vol. 3. Academic Press, London, ed. Rose A.H. and Harrison J.S. 1970, pp. 463-527), концентрированные фруктовые соки (Combina M. et al. Yeast identification in grape juice concentrates from Argentina. Lett Appl Microbiol. 2007, 46(2): 192-197), сухофрукты (Martorell P. et al. Molecular monitoring of spoilage yeasts during the production of candied fruit nougats to determine food contamination sources. Int J Food Microbiol. 2005, 101(3): 293-302) и т.д. Дрожжи Zygosaccharomyces rouxii являются самыми осмотолератными дрожжами и наиболее часто обнаруживается в пищевых продуктах с высоким содержанием Сахаров (Leandro, MJ. et al. The osmotolerant fructophilic yeast Zygosaccharomyces rouxii employs two plasma-membrane fructose uptake systems belonging to a new family of yeast sugar transporters. Microbiology. 157(2): 601-608) и, соответственно, являются самыми опасными представителями группы осмотолерантных дрожжей, в особенности для кондитерской промышленности. Размножение этого микроорганизма приводит к порче произведенной продукции и ее не соответствию требованиям СанПина.Zygosaccharomyces rouxii are osmotolerant yeast. Osmotolerant yeast - organisms that can grow and multiply in a medium with a low water activity (Aw) and a high carbon-nitrogen ratio (Tilbury RH Xerotolerant yeasts at high sugar concentrations. Microbial Growth and Survival in Extremes of Environment ed. Gould, GW and Corry JEL. 1980, pp. 103-128). Osmotolerant yeast are the main organisms causing spoilage of products such as honey, various types of syrups, sweets, jams, jellies (Walker HW and Ayres JC Yeasts as spoilage organisms. The yeasts, vol. 3. Academic Press, London, ed. Rose AH and Harrison JS 1970, pp. 463-527), concentrated fruit juices (Combina M. et al. Yeast identification in grape juice concentrates from Argentina. Lett Appl Microbiol. 2007, 46 (2): 192-197), dried fruits (Martorell P . et al. Molecular monitoring of spoilage yeasts during the production of candied fruit nougats to determine food contamination sources. Int J Food Microbiol. 2005, 101 (3): 293-302), etc. Zygosaccharomyces rouxii yeast is the most osmotolerate yeast and is most commonly found in foods high in sugars (Leandro, MJ. Et al. The osmotolerant fructophilic yeast Zygosaccharomyces rouxii employs two plasma-membrane fructose uptake systems fed to new family Microbiology. 157 (2): 601-608) and, accordingly, are the most dangerous representatives of the osmotolerant yeast group, especially for the confectionery industry. Propagation of this microorganism leads to spoilage of manufactured products and their failure to meet SanPin requirements.
На данный момент идентификацию дрожжей рода Zygosaccharomyces rouxii в большинстве случаев проводят по морфологическим признакам, что является сложной задачей, которую способен решить только высококвалифицированный микробиолог.Currently, the identification of the yeast of the genus Zygosaccharomyces rouxii in most cases is carried out according to morphological characteristics, which is a complex task that only a highly qualified microbiologist can solve.
Также, вывить данный организм можно с помощью секвенирования консервативных участков генома. Зачастую необходимо быстро выявить присутствие Zygosaccharomyces rouxii ввиду их быстрого роста в продуктах с высоким содержанием Сахаров, чтобы выявить продукцию, а также входящее сырье, содержащие данный вид дрожжей для дальнейшей ее отбраковки.Also, this organism can be eliminated by sequencing conservative parts of the genome. Often, it is necessary to quickly identify the presence of Zygosaccharomyces rouxii due to their rapid growth in products with a high sugar content in order to identify products, as well as incoming raw materials containing this type of yeast for further rejection.
Известен способ определения наличия определенных микроорганизмов в биологическом образце (патент RU 2435865, МПК C12Q 1/68, G01N 33/569, G01N 33/543, опубл. 10.12.2011), взятый за прототип, включающий иммобилизацию биологического организма и его ДНК с последующей идентификацией на основе ПНР с генотипирующими праймерами. Недостатком данного способа является низкая видоспецифичность ввиду того, что одни лишь праймеры не обеспечивают высокой специфичности анализа, что может привести к ложноположительным результатам.A known method for determining the presence of certain microorganisms in a biological sample (patent RU 2435865, IPC C12Q 1/68, G01N 33/569, G01N 33/543, publ. 10.12.2011), taken as a prototype, including the immobilization of a biological organism and its DNA, followed by identification based on the NDP with genotyping primers. The disadvantage of this method is the low species specificity due to the fact that primers alone do not provide high specificity of the analysis, which can lead to false positive results.
Задачей настоящего изобретения является разработка высокоспецифичного и оперативного способа идентификации присутствия дрожжей Zygosaccharomyces rouxii.An object of the present invention is to provide a highly specific and operative method for identifying the presence of Zygosaccharomyces rouxii yeast.
Технический результат заключается в разработке высокочувствительного способа и сокращении времени анализа присутствия дрожжей Zygosaccharomyces rouxii с 5 суток до 1 суток (в 5 раз).The technical result consists in developing a highly sensitive method and reducing the analysis time of the presence of Zygosaccharomyces rouxii yeast from 5 days to 1 day (5 times).
Технический результат достигается тем, что в способе идентификации дрожжей Zygosaccharomyces rouxii в продуктах с высоким содержанием Сахаров на основе ПЦР в реальном времени, включающем предварительное обогащение дрожжей, осаждение их центрифугированием, выделение ДНК с проведением ПЦР в реальном времени, согласно изобретению, для амплификации используются праймеры ZygRux-f GACGTGAACTCTTAACGGAG и ZygRux-r GAGAGCAGAACCCTCCC, а также Taqman зонд ZygRux-p FAM CGGAGGAGATTAAAAACAGCCGCGCA BHQ1, где логарифмическое повышение уровня флюоресценции свидетельствует о наличии штамма дрожжей Zygosaccharomyces rouxii.The technical result is achieved by the fact that in the method for identifying yeast Zygosaccharomyces rouxii in high-sugar products based on real-time PCR, including preliminary enrichment of the yeast, precipitation by centrifugation, DNA isolation with real-time PCR, according to the invention, primers are used for amplification ZygRux-f GACGTGAACTCTTAACGGAG and ZygRux-r GAGAGCAGAACCCTCCC, as well as the Taqman probe ZygRux-p FAM CGGAGGAGATTAAAAACAGCCGCGCA BHQ1, where a logarithmic increase in the level of fluorescence of Zygos arrhythmia .
Предварительно проведен анализ нуклеотидной последовательности участка ДНК, включающего гены 18S рРНК, 5.8Si рРНК и 28S рРНК и межгенные участки ITS1 и ITS2 для дрожжей Zygosaccharomyces rouxii. Установлены консервативные участки для данного таксона, которые позволяют разработать метод экспресс-идентификации дрожжей на основе ПНР в реальном времени с использованием Taqman зонда, представляющего собой олигонуклеотид, к которому присоединены молекула флуорофора и молекула гасителя флуоресценции. При проведении ПЦР гибридизованный с ДНК зонд расщепляется ДНК-полимеразой (вследствие ее экзонуклеазной активности) и высвобождается флуоресцентная метка. Таким образом, наблюдается повышение уровня флуоресценции.A preliminary analysis of the nucleotide sequence of the DNA site, including the genes 18S rRNA, 5.8Si rRNA and 28S rRNA and intergenic regions ITS1 and ITS2 for yeast Zygosaccharomyces rouxii. Conservative sites for this taxon have been established that allow developing a method for express identification of yeast based on PNR in real time using a Taqman probe, which is an oligonucleotide to which a fluorophore molecule and a fluorescence quencher molecule are attached. During PCR, a probe hybridized with DNA is cleaved by DNA polymerase (due to its exonuclease activity) and a fluorescent label is released. Thus, an increase in the level of fluorescence is observed.
На чертеже приведены кривые флуоресценции ДНК из 8 проб 60%-ого сахарного сиропа, используемого для выращивания колоний шмелей и подкормки медоносных пчел, полученные в ходе проведения ПЦР в реальном времени.The drawing shows the fluorescence curves of DNA from 8 samples of 60% sugar syrup used for growing bumblebee colonies and feeding honey bees obtained in real-time PCR.
Способ идентификации дрожжей Zygosaccharomyces rouxii с помощью проведения ПЦР в реальном времени с использованием Taqman зонда в представленном способе реализуется следующим образом:The method of identification of Zygosaccharomyces rouxii yeast by real-time PCR using a Taqman probe in the presented method is implemented as follows:
1. Производится сбор биологического материала (сироп, джемы, входящее сырье предприятия и др.). Для анализа используется 1-5 мл биологического материала.1. Biological material is collected (syrup, jams, incoming raw materials of the enterprise, etc.). For the analysis, 1-5 ml of biological material is used.
2. Проводится предварительное 18-часовое обогащение образца в среде для культивирования дрожжей и плесени (например, бульон Сабуро). Объемное соотношение пищевой субстрат: среда обогащения составляет не менее 1:10.2. A preliminary 18-hour enrichment of the sample is carried out in a medium for culturing yeast and mold (for example, Saburo broth). The volume ratio of the food substrate: the enrichment medium is at least 1:10.
3. Проводится осаждение клеток дрожжей с помощью центрифугирования (например, 10000 g, 5 мин), супернатант удаляется.3. The yeast cells are precipitated by centrifugation (for example, 10,000 g, 5 min), the supernatant is removed.
4. Производится выделение ДНК из осажденных клеток, выделение ДНК можно осуществлять как с помощью коммерческих наборов, так и методами органической экстракции.4. DNA is extracted from the precipitated cells; DNA can be isolated using either commercial kits or organic extraction methods.
5. Проводят ПЦР. Используют следующие температурные циклы: 94°С 4 мин, 35 циклов (94°С 30 сек, 58°С 30 сек, 72°С 30 сек.)5. Perform PCR. The following temperature cycles are used: 94 ° C for 4 min, 35 cycles (94 ° C for 30 sec, 58 ° C for 30 sec, 72 ° C for 30 sec.)
Используются следующие праймеры и зонд:The following primers and probe are used:
Прямой GACGTGAACTCTTAACGGAGDirect GACGTGAACTCTTAACGGAG
Зонд FAM CGGAGGAGATTAAAAACAGCCGCGCA BHQ1FAM Probe CGGAGGAGATTAAAAACAGCCGCGCA BHQ1
Обратный GAGAGCAGAACCCTCCCReverse GAGAGCAGAACCCTCCC
Данные праймеры амплифицируют продукт ПЦР, который содержит нуклеотидные полиморфизмы, характерные только для Zygosaccharomyces rouxii, с которыми взаимодействует Taqman зонд.These primers amplify a PCR product that contains nucleotide polymorphisms specific to Zygosaccharomyces rouxii with which the Taqman probe interacts.
6. В случае, если наблюдается логарифмическое повышение уровня флуоресценции в канале FAM амплификатора, это означает, что продукт обсеменен дрожжами Zygosaccharomyces rouxii.6. If there is a logarithmic increase in the level of fluorescence in the FAM channel of the amplifier, this means that the product is seeded with Zygosaccharomyces rouxii yeast.
Предлагаемый способ является высокочувствительным, хорошо воспроизводимым и экономичным. Анализ можно проводить в лабораториях, имеющих амплификатор в реальном времени, центрифугу, сопутствующие реактивы и расходные материалы.The proposed method is highly sensitive, well reproducible and economical. The analysis can be carried out in laboratories that have a real-time amplifier, a centrifuge, related reagents and consumables.
Способ поясняется примером:The method is illustrated by an example:
После предварительного обогащения и выделения ДНК из 8 проб 60% сахарного сиропа был проведен ПЦР в реальном времени (чертеж) В двух пробах (№2 и №5) наблюдался логарифмическое повышения уровня флуоресценции в канале FAM амплификатора, при этом в других пробах (№1, 3, 4, 6-8) не наблюдалось повышение флуоресценции. Следовательно, пробы сиропа №2 и №5 обсеменены дрожжами Zygosaccharomyces rouxii.After preliminary enrichment and DNA isolation from 8 samples of 60% sugar syrup, real-time PCR was performed (drawing). Two samples (No. 2 and No. 5) showed a logarithmic increase in the level of fluorescence in the FAM channel of the amplifier, while in other samples (No. 1 , 3, 4, 6-8) no increase in fluorescence was observed. Therefore, samples of syrup No. 2 and No. 5 are seeded with Zygosaccharomyces rouxii yeast.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018108821A RU2682041C1 (en) | 2018-03-12 | 2018-03-12 | Method of identification of osmotolerant yeast zygosaccharomyces rouxii based on real-time |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018108821A RU2682041C1 (en) | 2018-03-12 | 2018-03-12 | Method of identification of osmotolerant yeast zygosaccharomyces rouxii based on real-time |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2682041C1 true RU2682041C1 (en) | 2019-03-14 |
Family
ID=65805825
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018108821A RU2682041C1 (en) | 2018-03-12 | 2018-03-12 | Method of identification of osmotolerant yeast zygosaccharomyces rouxii based on real-time |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2682041C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2449019C2 (en) * | 2006-06-22 | 2012-04-27 | Нанектис Биотекноложьес | Method of detecting microorganisms in sample |
| US9487836B2 (en) * | 2008-08-22 | 2016-11-08 | Medical Service Consultation International, Llc | Methods and compositions for identifying yeast |
-
2018
- 2018-03-12 RU RU2018108821A patent/RU2682041C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2449019C2 (en) * | 2006-06-22 | 2012-04-27 | Нанектис Биотекноложьес | Method of detecting microorganisms in sample |
| US9487836B2 (en) * | 2008-08-22 | 2016-11-08 | Medical Service Consultation International, Llc | Methods and compositions for identifying yeast |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zott et al. | Characterization of the yeast ecosystem in grape must and wine using real-time PCR | |
| US20060257871A1 (en) | One step real-time rt pcr kits for the universal detection of organisms in industrial products | |
| CN113897456B (en) | Real-time fluorescence PCR detection primer probe combination and detection kit for four fir anthracnose pathogens and application of kit | |
| RU2682041C1 (en) | Method of identification of osmotolerant yeast zygosaccharomyces rouxii based on real-time | |
| Al-Sheikh | LAMP-PCR detection of ochratoxigenic Aspergillus species collected from peanut kernel | |
| JP5048622B2 (en) | PCR primers for detection of lactic acid bacteria | |
| Renouf et al. | Genetic and phenotypic evidence for two groups of Oenococcus oeni strains and their prevalence during winemaking | |
| Sanz et al. | Development of a PCR-culture technique for rapid detection of yeast species in vacuum packed ham | |
| RU2676099C1 (en) | Method for identification of yeast genus pichia based on real time pcr using a taqman probe | |
| KR101752274B1 (en) | Primer set for high sensitive real-time multiplex loop-mediated isothermal amplification reaction for determining type of shiga toxin genes stx1 and stx2 of Enterohemorrhagic Escherichia coli, and method for determining type of shiga toxin genes of Enterohemorrhagic Escherichia coli using the same | |
| Syromyatnikov et al. | Taqman RT-PCR Analysis for the Identification of the Osmotolerant Yeast Zygosaccharomyces rouxii | |
| JP2006061152A (en) | Primer for detection of yeast and mold, method for detection of yeast and mold, and kit for detection of yeast and mold | |
| KR101149437B1 (en) | Genetic markers for Xanthomonas oryzae pv.oryzae, primers for the markers, and method for detecting and discriminating Xanthomonas oryzae pv.oryzae | |
| CN112410456A (en) | A kind of kit and detection method for rapid on-site detection of K. mikielia | |
| CN111394482A (en) | Rapid detection method for enterobacter sakazakii in dairy product | |
| US20120009575A1 (en) | Inducible nucleic acid targets for detection of pathogens, methods and compositions thereof | |
| RU2631933C1 (en) | Method for differentiation of commercially important mites of amblyseius genus based on restrictive analysis | |
| Ivanova | Advanced receptions in the methodology of extraction total and viral nucleic acids from Basidiomycetes | |
| Dabban et al. | Isolation Techniques Used for Molecular Characterization of Beneficial Microorganisms: Cultural, Biochemical and Molecular Characterization | |
| Wei et al. | Analysis of the diversity of yeast communities in Xinjiang honey | |
| RU2822738C1 (en) | Method for identifying important for agriculture fungi of the genus trichoderma-trichoderma harzianum, trichoderma viride and trichoderma atroviride based on pcr-rflp | |
| Grajdieru et al. | MOLECULAR DETECTION OF ACETIC ACID BACTERIA AT DIFFERENT STAGES OF WINE PRODUCTION | |
| RU2653435C1 (en) | Method of differentiation of key breeds of honey bees in russia based on mutagenic pcr-rflp | |
| RU2751248C2 (en) | Primers for detecting the species monilinia laxa, monilinia fruticola, monilinia fructigena | |
| Díaz et al. | Molecular techniques for the detection and identification of yeasts in wine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20200116 Effective date: 20200116 |