RU2681475C1 - Вариант репрессора глюконата, микроорганизм-продуцент L-лизина, содержащий его, и способ получения L-лизина с его использованием - Google Patents
Вариант репрессора глюконата, микроорганизм-продуцент L-лизина, содержащий его, и способ получения L-лизина с его использованием Download PDFInfo
- Publication number
- RU2681475C1 RU2681475C1 RU2017138267A RU2017138267A RU2681475C1 RU 2681475 C1 RU2681475 C1 RU 2681475C1 RU 2017138267 A RU2017138267 A RU 2017138267A RU 2017138267 A RU2017138267 A RU 2017138267A RU 2681475 C1 RU2681475 C1 RU 2681475C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lysine
- microorganism
- variant
- gntr1
- strain
- Prior art date
Links
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 title claims abstract description 128
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M D-gluconate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M 0.000 title claims abstract description 37
- 229940050410 gluconate Drugs 0.000 title claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 20
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 67
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 claims abstract description 59
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 42
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 29
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 10
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 21
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 25
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 25
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 19
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 8
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 5
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 5
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- -1 γ-methyl-L-lysine Chemical compound 0.000 description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000008545 L-lysines Chemical class 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZIWNLPKLQFDFEU-FJXQXJEOSA-N calcium;3-[[(2r)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound [Ca].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O ZIWNLPKLQFDFEU-FJXQXJEOSA-N 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 3
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 3
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000004108 pentose phosphate pathway Effects 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012365 batch cultivation Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- MYVIATVLJGTBFV-UHFFFAOYSA-M thiamine(1+) chloride Chemical class [Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N MYVIATVLJGTBFV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- NZWPVDFOIUKVSJ-YFKPBYRVSA-N (2s)-2,6-diamino-n-hydroxyhexanamide Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NO NZWPVDFOIUKVSJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 2,6-diaminopimelic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MJPCOTCPKZTNHX-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-1,1-dinitroguanidine Chemical compound CN=C(N)N([N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O MJPCOTCPKZTNHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NDXGCVGKTPQXFA-UHFFFAOYSA-N 3-chloroazepan-2-one Chemical compound ClC1CCCCNC1=O NDXGCVGKTPQXFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000044 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase Proteins 0.000 description 1
- 108020001657 6-phosphogluconate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000004567 6-phosphogluconate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 108700016171 Aspartate ammonia-lyases Proteins 0.000 description 1
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 description 1
- 108020004652 Aspartate-Semialdehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N Chick antidermatitis factor Natural products OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241001655326 Corynebacteriales Species 0.000 description 1
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 1
- 101100465553 Dictyostelium discoideum psmB6 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010014468 Dihydrodipicolinate Reductase Proteins 0.000 description 1
- 108010013195 E coli gluconate permease Proteins 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108010021382 Gluconokinase Proteins 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 102220466851 HLA class II histocompatibility antigen, DR beta 4 chain_V59A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108010064711 Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- GHSJKUNUIHUPDF-BYPYZUCNSA-N L-thialysine Chemical compound NCCSC[C@H](N)C(O)=O GHSJKUNUIHUPDF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 101100063932 Micromonospora echinospora gacH gene Proteins 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108091000041 Phosphoenolpyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100024009 Probable gluconokinase Human genes 0.000 description 1
- 241000588768 Providencia Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 101100169519 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) dapAL gene Proteins 0.000 description 1
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010043652 Transketolase Proteins 0.000 description 1
- 102000014701 Transketolase Human genes 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150073654 dapB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 108010056578 diaminopimelate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 230000004190 glucose uptake Effects 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 101150016365 gntK gene Proteins 0.000 description 1
- 101150092851 gntP gene Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 101150033534 lysA gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 108010071189 phosphoenolpyruvate-glucose phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 1
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 102200026301 rs28942092 Human genes 0.000 description 1
- 102220209296 rs760271693 Human genes 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
- C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
- C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
- C07C229/26—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having more than one amino group bound to the carbon skeleton, e.g. lysine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/15—Corynebacterium
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен полипептид, обладающий активностью репрессора глюконата, и полинуклеотид, кодирующий его. Предложен вектор экспрессии, содержащий указанный полинуклеотид. Предложен микроорганизм рода Corynebacterium, являющийся продуцентом L-лизина, содержащий полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид. Предложен способ получения L-лизина с использованием указанного микроорганизма. Группа изобретений позволяет увеличить скорость продукции L-лизина по сравнению с немодифицированным родительским микроорганизмом. 5 н. и 2 з.п. ф-лы, 7 табл., 7 пр.
Description
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к новому варианту репрессора глюконата, содержащему его микроорганизму и способу получения L-лизина с его использованием.
Предшествующий уровень техники
Для массового производства полезных продуктов, таких как аминокислоты, регуляция потребления глюкозы и пентозофосфатного пути у штамма Corynebacterium является очень важной (Handbook of Corynebacterium glutamicum. 2005. 215-240).
Репрессор глюконата (GntR) представляет собой важный регуляторный белок, который регулирует поток углерода через потребление глюкозы и пентозофосфатный путь. Известно, что у штамма Corynebacterium glutamicum обнаружены два репрессора глюконата (GntR1 и GntR2).
GntR1 и GntR2 сильно ингибируют экспрессию генов, кодирующих глюконатпермеазу (gntP), глюконаткиназу (gntK) и 6-фосфоглюконат-дегидрогеназу (gnd), которые связаны с метаболизмом глюконата и оказывают действие, слабо ингибируя экспрессию оперона tkt-tal-zwf-opcA-devB, который представляет собой основной ген пути фосфорилирования пентоз. Между тем, экспрессия генов, кодирующих специфичный к глюкозе фермент-транспортер II (ptsG) и специфичный к сахарозе фермент-транспортер II (ptsS) фосфотрансферазной системы (PTS), которая представляет собой основной метаболический путь потребления сахаров (sugar-infusion) штамма Corynebacterium, активируется для вовлечения в значительной степени в потребление сахаров (Julia Frunzke, Verena Engels, Sonja Hasenbein, Cornelia Gatgens and Michael Bott, Molecular Microbiology (2008) 67(2), 305-322).
Раскрытие изобретения
Техническая задача
Задача настоящего изобретения заключалась в том, чтобы выявить ген, оказывающий эффективное действие на продуктивность по L-лизину, и разработать новый вариант репрессора 1 глюконата (GntR1), и было подтверждено, что у микроорганизма-продуцента L-лизина, содержащего этот вариант, скорость потребления сахаров и продуктивность по L-лизину увеличивалась по сравнению с микроорганизмом, содержащим репрессор 1 глюконата дикого типа, и тем самым авторы настоящего изобретения осуществили настоящее изобретение.
Техническое решение
В качестве объекта настоящего изобретения предложен новый вариант белка-репрессора глюконата.
В качестве другого объекта настоящего изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий этот вариант, и вектор экспрессии, содержащий этот полинуклеотид.
В качестве еще одного объекта настоящего изобретения предложен микроорганизм-продуцент L-лизина, который экспрессирует вариант белка-репрессора глюконата.
В качестве еще одного объекта настоящего изобретения предложен способ получения L-лизина, включающий: (а) культивирование микроорганизма-продуцента L-лизина в среде, и (б) выделение L-лизина из культивированного микроорганизма или из среды со стадии (а).
Полезные эффекты изобретения
Микроорганизм-продуцент L-лизина, содержащий вариант репрессора глюконата по настоящему изобретению, демонстрирует повышенную скорость потребления сахаров по сравнению с микроорганизмом, не содержащим этот вариант, и может обеспечить эффективное продуцирование L-лизина. Более конкретно, L-лизин представляет собой незаменимую аминокислоту корма животных, и необходимо ее производство в промышленных масштабах, и когда L-лизин продуцируется с высокой эффективностью в соответствии с настоящим изобретением, это также может снизить затраты при производстве корма.
Наилучшее воплощение изобретения
В одном воплощении настоящего изобретения предложен новый вариант белка-репрессора глюконата.
Как его используют здесь, термин "белок-репрессор глюконата" относится к регуляторному белку, вовлеченному в метаболизм глюконата или в потребление сахаров. Белок-репрессор глюконата конкретно не ограничен, но может представлять собой белок микроорганизма, принадлежащего роду Corynebacterium, в частности, белок-репрессор глюконата, имеющий происхождение из Corynebacterium glutamicum. Более конкретно, белок-репрессор глюконата может представлять собой белок GntR1, имеющий происхождение из Corynebacterium glutamicum, но не ограничен этим. Белок-репрессор глюконата может представлять собой, без ограничения, GntR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. Например, белок-репрессор глюконата может представлять собой аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 и имеющую гомологию по меньшей мере 80%, в частности по меньшей мере 90%, более конкретно по меньшей мере 95% и еще более конкретно по меньшей мере 99%. Дополнительно белок-репрессор глюконата, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, может кодироваться геном gntR1, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3, но не ограничен этим. Например, это может быть нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 3 или может быть нуклеотидная последовательность, имеющая гомологию по меньшей мере 80%, в частности по меньшей мере 90%, более конкретно по меньшей мере 95% или еще более конкретно по меньшей мере 99%.
Как его используют здесь, термин "гомология" относится к проценту идентичности между двумя полинуклеотидными или полипептидными группировками. Гомология между последовательностями из одной группировки и другой группировки может быть определена известными методиками. Например, гомологию можно определить путем выравнивания последовательностей и непосредственно выравнивания последовательностей двух полинуклеотидных молекул или двух полипептидных молекул с использованием компьютерной программы, доступной в настоящее время. Компьютерная программа может представлять собой BLAST (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM (DNASTAR Inc.) и так далее. Кроме того, гомология между полинуклеотидами может быть определена путем гибридизации полинуклеотидов в условиях образования стабильных двойных связей между гомологичными участками, затем разрезая их специфичными к одноцепочечной нуклеиновой кислоте нуклеазами для определения размера отделенного фрагмента.
Вариант белка-репрессора глюконата может представлять собой полипептид, в котором аргинин (R), представляющий собой 102ую аминокислоту в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, заменен на аминокислоту, отличную от аргинина. В частности, вариант белка-репрессора глюконата может представлять собой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, где аминокислота в положении 102 заменена на цистеин (С).
Такой вариант белка-репрессора глюконата включает не только полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, но также вариант, имеющий гомологию 80% или более, в частности 90% или более, более конкретно 95% или более, еще более конкретно 99% или более, и по существу, это очевидно, что аминокислотная последовательность, обладающая биологической активностью, идентичной или соответствующей таковой белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, даже в случаях, когда некоторые из последовательностей имеют делецию, модификацию, замену или вставку в аминокислотные последовательности, включена в объем настоящего изобретения.
В другом воплощении настоящего изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий вариант белка-репрессора глюконата, и вектор экспрессии, содержащий этот полинуклеотид.
Белок-репрессор глюконата и его вариант являются такими как описано выше.
В частности, полинуклеотид, кодирующий вариант белка-репрессора глюконата, может представлять собой полинуклеотид, кодирующий белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, или может представлять собой полинуклеотид, имеющий гомологию по меньшей мере 80%, в частности по меньшей мере 90%, более конкретно 95%, еще более конкретно по меньшей мере 99%. Полинуклеотид, кодирующий вариант белка-репрессора глюконата, может иметь, например, нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, но не ограничен этим.
Как его используют здесь, термин "полинуклеотид" относится к полимеру нуклеотидов, в которых нуклеотидные мономеры связаны в длинную цепь ковалентными связями. В целом это относится к цепям ДНК или РНК длиннее определенной длины. Полинуклеотид может иметь разнообразные нуклеотидные последовательности, которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность, вследствие вырожденности генетического кода. Дополнительно, для оптимизации экспрессии в зависимости от типа клеток-хозяев можно использовать кодон-оптимизированные последовательности.
Как его используют здесь, термин "вектор" относится к любой молекуле нуклеиновой кислоты для клонирования и/или переноса полинуклеотида в клетку-хозяина. Вектор может представлять собой репликон, который может осуществлять репликацию фрагмента, соединенного с другим фрагментом ДНК. Термин "единица репликации" относится к любой генетической единице (например, плазмиде, фагу, космиде, хромосоме и вирусу). В настоящем изобретении вектор конкретно не ограничен, при условии, что он способен реплицироваться в хозяине, и можно использовать любой вектор, известный в данной области техники. Вектор, используемый для конструирования рекомбинантного вектора, может представлять собой плазмиду, космиду, вирус и бактериофаг в природной или рекомбинантной форме. Например, pWE15, М13, λEMBL3, λEMBL4, λFIXII, λDASHII, λZAPII, λgt10, λgt11, Charon4A, Charon21A и так далее можно использовать в качестве фагового вектора или космидного вектора, а в качестве плазмидного вектора можно использовать вектор pDZ, систему pBR, систему pUC, систему pBluescriptll, систему pGEM, систему pTZ, систему pCL, систему рЕТ и так далее. Доступные векторы конкретно не ограничены, и можно использовать известные векторы экспрессии. В частности, можно использовать pDZ (Регистрационный No. патента Кореи 10-0924065; включен в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте), но не ограничиваясь этим.
Как его используют здесь, термин "трансформация" означает процесс, осуществляемый путем введения полинуклеотида, кодирующего вариант белка-репрессора глюконата, в клетку-хозяина таким образом, что полинуклеотид может экспрессироваться в клетке-хозяине, и полинуклеотид, которым трансформируют, при условии, что он может экспрессироваться в клетке-хозяине, включает без ограничения, полинуклеотиды, которые встраиваются в хромосому или локализуются за пределами хромосомы.
Полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, которая представляет собой конструкцию, содержащую все элементы, необходимые для собственной экспрессии. Обычно экспрессионная кассета может включать промотор, функционально связанный с геном, сигнал терминации транскрипции, сайт связывания с рибосомой и сигнал терминации трансляции. Экспрессионная кассета может находиться в форме вектора экспрессии, способного к саморепликации. Более того, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина сам по себе или в форме экспрессионной кассеты и функционально связан с последовательностью, необходимой для экспрессии в клетке-хозяине, но не ограничен этим.
В другом воплощении настоящего изобретения предложен микроорганизм-продуцент L-лизина, который экспрессирует вариант белка-репрессора глюконата.
Белок-репрессор глюконата и его вариант описаны выше.
Как его используют здесь, термин "L-лизин" означает незаменимую аминокислоту, которая не синтезируется в организме как основная α-аминокислота, и относится к типу L-аминокислоты, имеющей химическую формулу NH2(CH2)4CH(NH2)COOH. Биосинтез L-лизина начинается с щавелевоуксусной кислоты и происходит через лизиновый путь биосинтеза, и NADPH-зависимая редуктаза катализирует промежуточный процесс в биосинтезе лизина. В процессе биосинтеза одной молекулы L-лизина ферменты переработки сахаров непосредственно потребляют три молекулы NADPH, и одна молекула NADPH используется опосредованно.
Микроорганизм может содержать варианты белка-репрессора глюконата вследствие мутации, или он может быть трансформирован вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий вариант белка-репрессора глюконата.
Микроорганизм включает белок, обладающий мутантной активностью белка-репрессора глюконата, либо прокариотический микроорганизм, либо эукариотический микроорганизм, если микроорганизм трансформирован таким образом, что экспрессируется белок гликозилтрансфераза. Например, могут выть включены штаммы микроорганизмов, такие как штаммы рода Escherichia, рода Erwinia, рода Serratia, рода Providencia, рода Enterobacteria, рода Salmonella, рода Streptomyces, рода Pseudomonas, рода Brevibacterium или рода Corynebacterium и так далее. В частности, они могут представлять собой микроорганизмы, принадлежащие роду Corynebacterium, и более конкретно, Corynebacterium glutamicum, но не ограничены этим.
Когда мутантный белок белка-репрессора глюконата по настоящему изобретению содержится в микроорганизме-продуценте L-лизина, способность продуцировать L-лизин может быть увеличена путем эффективного потребления сахарида по сравнению с микроорганизмом, содержащим белок-репрессор глюконата дикого типа.
Микроорганизм-продуцент L-лизина может включать любой тип микроорганизма, если он обладает способностью продуцировать L-лизин, и включает все формы природных штаммов и рекомбинантных штаммов.
Микроорганизм рода Corynebacterium, способный продуцировать L-лизин, может представлять собой мутантный штамм, устойчивый к аналогу L-лизина. Аналоги L-лизина ингибируют рост микроорганизмов-коринебактерий, но такое ингибирование полностью или частично устраняется, когда в среде одновременно присутствует L-лизин. Примеры аналогов L-лизина включают окса-L-лизин, L-лизин-гидроксамат, S-(2-аминоэтил)-L-цистеин (АЕС), γ-метил-L-лизин, α-хлоркапролактам и так далее, но не ограничены ими. Вариант, обладающий устойчивостью к таким аналогам L-лизина, может быть получен путем обработки микроорганизма рода Corynebacterium традиционным методом искусственного мутагенеза, но не ограничиваясь этим. Неограничивающие примеры этого включают Corynebacterium glutamicum КССМ11016Р (Регистрационный No. патента Кореи 10-0159812), Corynebacterium glutamicum KFCC 11001 и Corynebacterium glutamicum KCCM11347P (Регистрационный No. патента Кореи 10-0073610), но не ограничены ими.
Дополнительно, микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий способностью продуцировать L-лизин, может быть модифицирован таким образом, что активность белка, связанного с биосинтезом L-лизина, усилена по сравнению с немодифицированными штаммами. То есть экспрессия одного или более чем одного типа генов, связанных с биосинтезом L-лизина, усилена. Такое усиление экспрессии может включать, без ограничения, амплификацию гена, замену или изменение последовательностей, таких как промоторы или инициирующие кодоны, введение модификаций для улучшения экспрессии и так далее. Неограничивающие примеры этого включают Corynebacterium glutamicum CJ3P (Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40), но не ограничены этим.
Дополнительно примеры гена, связанного с биосинтезом L-лизина, включают гены, вовлеченные в путь биосинтеза L-лизина, и в частности, ген синтазы дигидродипиколиновой кислоты (dapA), ген аспартокиназы (lysC), ген редуктазы дигидродипиколиновой кислоты (dapB), ген диаминопимелат-декарбоксилазы (lysA), ген диаминопимелат-дегидрогеназы (ddh), ген фосфоенолпируват-карбоксилазы (ррс), ген аспартат-полуальдегид-дегидрогеназы (asd), ген аспартазы (aspA) и пируваткарбоксилазы (рус), но не ограничены ими. Кроме того, может быть рассмотрена транскетолаза (tkt), присутствующая в пентозофосфатном пути, и так далее, но ген не ограничен ими.
Между тем, микроорганизм может представлять собой микроорганизм рода Corynebacterium, который может обладать способностью продуцировать L-лизин вследствие введения модификаций, известных в данной области техники, ассоциированных с продуцированием L-лизина, но не ограничен этим.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения L-лизина, включающий: (а) культивирование микроорганизма-продуцента L-лизина в среде, и (б) выделение L-лизина из культивированного микроорганизма или из культуральной среды со стадии (а).
L-лизин и продуцирующий его микроорганизм являются такими, как описано выше.
Как его используют здесь, термин "культура" относится к культивированию микроорганизма в умеренно искусственно контролируемых условиях окружающей среды. Процесс культивирования по настоящему изобретению можно проводить в соответствии с подходящей культуральной средой и условиями культивирования, известными в данной области техники. Условия, такие как определенная температура культивирования, время инкубации и рН среды, можно выполнить в соответствии с общими знаниями специалиста в данной области техники или в соответствии с известными традиционными способами. В частности, эти известные способы культивирования описаны в следующих источниках [Chmiel; Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung indie Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) и Storhas; Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)]. Кроме того, способ культивирования включает периодическое культивирование, непрерывное культивирование и периодическое культивирование с подпиткой. В частности, периодический процесс или периодический процесс с подпиткой или повторяющийся периодический процесс с подпиткой могут быть проведены в форме непрерывного культивирования, но процесс культивирования не ограничивается этим.
Среда, применяемая для культивирования, должна соответствовать требованиям конкретных штаммов должным образом. Источники углерода, которые можно использовать в среде, включают сахариды и углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал, целлюлоза и так далее; масла и жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло, кокосовое масло и так далее; жирную кислоту, такую как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, линолевая кислота и так далее; глицерин; спирт, такой как этанол, и органическую кислоту, такую как уксусная кислота, но не ограничены ими. Эти вещества можно использовать по отдельности или в виде смеси, без ограничения. Источники азота, которые можно использовать, включают пептон, дрожжевой экстракт, мясной бульон, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, соевую муку и мочевину, или неорганические соединения, такие как сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония, нитрат аммония и так далее, но не ограничены ими, и источники азота также могут быть использованы по отдельности или в виде смеси. Доступные источники фосфата включают дигидрофосфат калия, гидроортофосфат калия или соответствующие натрий-содержащие соли и так далее, но не ограничены ими. Дополнительно среда для культивирования может содержать соли металлов, такие как сульфат магния или сульфат железа, но соли не ограничены ими. Наконец, в дополнение к веществам, описанным выше, могут быть использованы вещества, необходимые для роста, такие как аминокислоты и витамины. Дополнительно можно использовать предшественники, подходящие для культуральной среды. Исходные вещества, описанные выше, можно добавлять в инкубатор порциями или непрерывно в процессе инкубации, но не ограничиваясь этим.
Дополнительно, химические соединения, такие как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота и серная кислота, могут быть подходящим образом добавлены в инкубатор во время культивирования для подведения рН культуральной среды. Во время инкубации образование пузырьков можно подавлять путем использования пеногасителей, таких как полигликолевый эфир жирной кислоты. Кроме того, для поддержания аэробных условий в инкубаторе или в инкубационной смеси в инкубатор может быть добавлен кислород или кислородсодержащий газ, или для поддержания анаэробных условий может быть введен азот, водород или углекислый газ, или газ можно не вводить. Температура инкубации обычно составляет от 20°С до 40°С, в частности от 30°С до 35°С, но не ограничена этим. Период инкубации можно продолжать вплоть до достижения желаемого количества полезного вещества, и в частности может составлять от 10 часов до 100 часов. L-лизин можно выделять из культуральной среды, или он может находиться внутри микроорганизмов.
Дополнительно, способы получения L-лизина по настоящему изобретению или способы выделения L-лизина из культуральной среды широко известны в данной области техники. Для способов выделения L-лизина можно использовать фильтрование, анионообменную хроматографию, кристаллизацию и ВЭЖХ (высокоэффективную жидкостную хроматографию) и так далее, но способы не ограничены этими примерами.
Наилучшее воплощение изобретения
Здесь и далее настоящее изобретение будет описано более подробно с помощью следующих примеров. Однако эти примеры предназначены исключительно для иллюстративных целей и не предназначены никаким образом ограничивать объем настоящего изобретения.
Пример 1: Получение библиотеки рекомбинантной геномной ДНК Corynebacterium glutamicum
В данном примере для обнаружения способности продуцировать L-лизин и генов и вариантов, которые оказывают полезное действие на продуктивность, после введения искусственных мутаций в штаммы Corynebacterium glutamicum АТСС13032 с помощью N-метил-N-нитро-N-нитрогуанидина (NTG) геномную ДНК экстрагировали с использованием методов экстракции, общеизвестных в данной области техники. Полученную ДНК подвергали действию фермента рестрикции Sau3Al для получения частичных фрагментов, имеющих размер от 1 т.п.н. до 3 т.п.н. После соединения этих фрагментов с трансформирующим челночным вектором pECCG122 в Е. coli и Corynebacterium по концам, полученным после расщепления ферментом рестрикции BamHI, ими трансформировали Е. coli DH5α и наносили на твердую среду LB, содержащую канамицин (25 мг/л). После отбора колоний, трансформированных вследствие вставки в вектор фрагментов путем ПЦР (с использованием праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 5 и 6), всех их смешивали вместе для выделения плазмид путем общеизвестного метода выделения.
Пример 2: Введение искусственного варианта библиотеки и усиление способности продуцировать L-лизин
С использованием штамма КССМ11016Р в качестве родительского штамма (микроорганизм был раскрыт как KFCC10881 и повторно депонирован в международном органе депонирования в соответствии с Будапештским договором и получил номер доступа КССМ11016Р, Регистрационный номер патента Кореи 10-0159812) была проведена трансформация полученным вектором и нанесение на комплексную среду для чашки.
Комплексная среда для чашки
Глюкоза 20 г, (NH4)2SO4 50 г, пептон 10 г, дрожжевой экстракт 5 г, мочевина 1,5 г, KH2PO4 5 г, K2HPO4 10 г, MgSO4 7H2O 0,5 г, биотин 100 мкг, соль тиаминхлорид 1000 мкг, кальций-пантотеновая кислота 2000 мкг, никотинамид 2000 мкг, агар 20 г и канамицин 25 мг (1 л дистиллированной воды).
Примерно 10000 колоний высевали на каждые 300 мкл селективной среды и культивировали в течение примерно 16 часов при 1000 об/мин при 32°С в 96-луночном планшете с глубокими лунками. Для анализа уровня продукции L-лизина, продуцируемого во время культивирования, применяли нингидриновый метод (J. Biol. Chem. 1948. 176:367-388). После завершения культивирования проводили реакцию между 10 мкл культурального супернатанта и 190 мкл раствора для нингидриновой реакции (63% глицерин, 27% раствор нингидрина) при 65°С в течение 30 минут, измеряли поглощение при длине волны 570 нм с помощью спектрофотометра и сравнивали с поглощением в контрольной группе (KCCM11016P/pECCG122); было отобрано 248 типов варианта штамма, демонстрирующих похожее или повышенное поглощение. Во время культивирования в этих условиях, поскольку штамм из контрольной группы имел остаточный сахар от 1 г/л до 2 г/л, скорость потребления сахара в контрольной группе была высокой, и можно было отобрать штаммы с повышенной способностью продуцировать лизин.
Селективная среда (рН 8,0)
Глюкоза 10 г, сульфат аммония 5,5 г, MgSO4⋅7H2O 1,2 г, KH2PO4 0,8 г, K2HPO4 16,4 г, биотин 100 мкг, тиамин HCl 1000 мкг, кальций-пантотеновая кислота 2000 мкг и никотинамид 2000 мкг (1 л стандарта - дистиллированной воды).
Дополнительно, на основе 248 выбранных типов штаммов способ выполняли в повторах. В результате были выбраны варианты штаммов 29 типов из вышеупомянутых, которые имели способность продуцировать L-лизин, увеличенную более чем на 10% по сравнению со штаммом KCCM11016P/pECCG122.
Пример 3: Способность выбранных искусственных вариантов штаммов продуцировать L-лизин и анализ скорости потребления сахара
29 выбранных типов штаммов из Примера 2 культивировали в соответствии с описанным ниже способом и анализировали на способность продуцировать L-лизин и скорость потребления сахара.
Каждый штамм высевали в колбу на 250 мл с угловыми перегородками и культивировали при покачивании при 30°С в течение 20 часов при 200 об/мин. После этого 1 мл культурального раствора штамма высевали в колбу на 250 мл с угловыми перегородками, содержащую 24 мл продукционной среды. Концентрацию L-лизина анализировали посредством ВЭЖХ, и для измерения скорости потребления сахара штаммов и их продуктивности измеряли остаточную концентрацию сахара в культуральной среде с течением времени.
Среда для выращивания штамма (рН 7,0)
Глюкоза 20 г, пептон 10 г, дрожжевой экстракт 5 г, мочевина 1,5 г, KH2PO4 4 г, K2HPO4 8 г, MgSO4⋅7H2O 0,5 г, биотин 100 мкг, тиамин HCl 1000 мкг, кальций-пантотеновая кислота 2000 мкг, никотинамид 2000 мкг (1 л стандарта-дистиллированной воды).
Продукционная среда (рН 7,0)
Глюкоза 100 г, (NH4)2SO4 40 г, соевый белок 2,5 г, твердая фракция кукурузного экстракта 5 г, мочевина 3 г, KH2PO4 1 г, MgSO4⋅7H2O 0,5 г, биотин 100 мкг, соль тиамин-хлорид 1000 мкг, кальций-пантотеновая кислота 2000 мкг, никотинамид 3000 мкг и СаСО3 30 г (1 л стандарта - дистиллированной воды).
Среди вариантов штаммов 29 типов концентрация L-лизина по сравнению с контрольной группой была выше эквивалентного уровня, и были выбраны три типа штаммов с повышенной скоростью потребления сахара и продуктивностью для повторного выполнения культивирования и анализа, и проанализированные результаты представлены в Таблице 1.
Было подтверждено, что три штамма продуцировали L-лизин на уровне выше эквивалентного уровня контрольной группы, и скорость потребления в единицу времени была увеличена путем улучшения продуктивности ферментирования. Среди отобранных вариантов штаммов был выбран в итоге штамм КССМ11016Р/1160 с наиболее значимо повышенной продуктивностью, и были выделены плазмиды для поиска мутаций нуклеотидной последовательности на базовом генетическом уровне, которые вызывали увеличение скорости потребления сахара и продуктивности. Впоследствии нуклеотидные последовательности анализировали с использованием SEQ ID NO: 5 и 6. Плазмиды, происходящие из КССМ11016Р/1160, содержали участок примерно от 450 п. н. вверх по ходу транскрипции от ORF (открытой рамки считывания) инициирующего кодона гена NCgl2440 до зоны примерно 350 п. н. вниз по ходу транскрипции от терминирующего кодона. Далее, путем анализа нуклеотидной последовательности гена, основанном на информации из базы данных GenBank Национального Института Здравоохранения (NIH), было подтверждено, что ген представляет собой gntR1, который является одним из репрессоров глюконата, и вариант gntR1, который был введен в штамм КССМ11016Р/1160, содержал замену С на Т в 304ом положении нуклеотидной последовательности, и было подтверждено, что 102ая аминокислота была изменена с аргинина на цистеин.
Таким образом, было подтверждено, что аргинин, который представляет собой 102ую аминокислоту gntR1, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, был заменен на цистеин.
Пример 4: Получение вектора для введения варианта gntR1 в хромосому штамма-продуцента L-лизина
Для подтверждения эффекта применения варианта gntR1, который был подтвержден в Примере 3, был получен вектор, который может вводить его в хромосому.
На основании описанных нуклеотидных последовательностей был синтезирован праймер (SEQ ID NO: 7), в котором участок для фермента рестрикции EcoRI был вставлен на 5'-конце и участок для фермента рестрикции SalI был вставлен на 3'-конце. С помощью таких пар праймеров была проведена ПЦР с использованием плазмиды КССМ11016Р/1160 в качестве матрицы для амплификации фрагментов гена gntR1. Условия ПЦР состояли в 30-кратном повторении цикла денатурации при 94°С в течение 5 минут, денатурации при 94°С в течение 30 секунд, отжига при 56°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 40 секунд, и реакцию полимеризации проводили при 72°С в течение 7 минут.
После обработки фрагментов гена, которые были амплифицированы путем ПЦР, ферментами рестрикции EcoRI и SalI, каждый фрагмент ДНК выделяли, и после его соединения с вектором pDZ (Регистрационный номер патента Кореи 10-0924065), имеющим концы, полученные с помощью ферментов рестрикции EcoRI и SalI, ими трансформировали Е. coli DH5α и переносили на твердую среду LB, содержащую канамицин (25 мг/л). После отбора колонии, которая была трансформирована вектором, в котором ген-мишень был вставлен с помощью ПЦР, была получена плазмида с использованием общеизвестного метода выделения плазмид, и в соответствии с вариантом, который был вставлен в gntR1 плазмиды, он получил название pDZ-gntR1 (R102C).
Пример 5: Получение штамма, в котором вариант gntR1 введен в КССМ11016Р, штамм-продуцент L-лизина, и сравнение продуктивности
Новым вариантом вектора для введения, полученном в Примере 4, трансформировали Corynebacterium glutamicum КССМ11016Р, который представляет собой штамм-продуцент L-лизина, в соответствии с двухстадийной гомологичной рекомбинацией хромосом. После этого штамм, в хромосому которого был введен вариант gntR1, отбирали с помощью анализа секвенирования хромосом, и штамм, в который был введен вариант gntR1, получил название KCCM11016P::gntR1(R102C).
Измеряли концентрацию L-лизина и остаточную концентрацию сахара на основании культивирования такими же способами, как в Примере 3. Дополнительно для подтверждения эффектов при культивировании на нерафинированном сахаре, для анализа с использованием тех же самых способов использовали продукционную среду на основе нерафинированного сахара вместо продукционной среды на основе глюкозы [Таблица 2].
Исходная продукционная среда на основе сахара (рН 7,0)
Нерафинированный сахар 100 г, (NH4)2SO4 40 г, соевый белок 2,5 г, твердая фракция кукурузного экстракта 5 г, фермент 3 г, КН2РО4 1 г, MgSO4⋅7 H2O 0,5 г, биотин 100 мкг, кислая соль тиамин-хлорид 1000 мкг, кальций-пантотеновая кислота 2000 мкг, никотинамид 3000 мкг, СаСО3 30 г (дистиллированная вода до уровня 1 л).
В результате было подтверждено, что скорость потребления сахара повышалась без влияния на способность продуцировать L-лизин больше у KCCM11016P::gntR1(R102C), чем у КССМ11016, который представляет собой группу сравнения в среде с глюкозой и исходной среде с сахаром. Кроме того, в результате подтверждения интервалов времени, в течение которых вся глюкоза и исходный сахар были потреблены, было показано, что в группах сравнения они были полностью потреблены через 72 часа и 68 часов, и было продуцировано 43,5 г/л и 47,0 г/л L-лизина, соответственно, а варианты штаммов с введением gntR1 продуцировали 43,9 г/л и 47,4 г/л через 60 часов и 58 часов. То есть было подтверждено, что в случае штаммов, которым был введен вариант gntR1, способность продуцировать L-лизин в зависимости от времени была увеличена на 21% и 18% в среде с глюкозой и нерафинированным сахаром, соответственно [Таблица 3].
Как видно из вышеприведенных результатов, введение варианта gntR1 дает способность продуцировать L-лизин на таком же уровне и является эффективным в отношении скоростей потребления глюкозы и нерафинированного сахара. То есть, можно полагать, что введение варианта gntR1 по настоящему изобретению, дает превосходную эффективность в отношении способности продуцировать L-лизин. Как таковой KCCM11016P::gntR1(R102C), названный авторами настоящего изобретения Corynebacterium glutamicum "CA01-2293", который обладает повышенной скоростью потребления глюкозы и продуктивностью, 5 декабря 2014 депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов (КССМ), международном органе депонирования, с номером доступа КССМ11628Р.
Пример 6: Получение штаммов, у которых вариант gntR1 введен в штамм-продуцент L-лизина, и сравнение продуктивности
Для определения эффектов других штаммов, принадлежащих Corynebacterium glutamicum, штамм, у которого вариант gntR1 введен в Corynebacterium glutamicum КССМ11347Р (микроорганизм раскрыт как KFCC10750 и повторно депонирован в международном органе депонирования согласно Будапештскому договору, и обозначен как КССМ11347Р. Регистрационный номер патента Кореи 10-0073610) был получен и назван как KCCM11347P::gntR1(R102C). Используя тот же способ, как в Примере 5, полученные штаммы культивировали и сравнивали их способность продуцировать лизин и остаточный сахар [Таблица 4].
В результате, так же как в Примере 5, было подтверждено, что во всех случаях скорость потребления глюкозы была увеличена в среде с глюкозой и нерафинированным сахаром по сравнению с группой сравнения. Кроме того, в результате определения интервалов времени, в течение которых глюкоза и нерафинированный сахар были полностью потреблены, было показано, что в группе сравнения весь сахар был потреблен за 72 часа и 69 часов, и было продуцировано 38,6 г/л и 41,3 г/л L-лизина, а штамм с вариантом gntR1 продуцировал L-лизин через 61 час и 58 часов в концентрации 38,7 г/л и 41,4 г/л. То есть было подтверждено, что в случае штаммов, которым был введен вариант gntR1, продуктивность по L-лизину в зависимости от времени была увеличена на 18% и 19% в среде с глюкозой и нерафинированным сахаром, соответственно [Таблица 5].
Пример 7: Получение штамма, в котором вариант gntR1 введен в L-лизин-продуцирующий штамм CJ3P, и сравнение продуктивности
Для подтверждения эффектов других штаммов, принадлежащих Corynebacterium glutamicum, был получен штамм, в котором вариант gntR1 введен в Corynebacterium glutamicum CJ3P (Binder et al. Genome Biology 2012, 13: R40), и он получил название CJ3P::GntR1(R102C). Штамм CJ3P представляет собой штамм Corynebacterium glutamicum, обладающий способностью продуцировать L-лизин, в котором 3 типа изменений (pyc(Pro458Ser), hom(Val59Ala), lysC(Thr311Ile)) были введены в штаммы дикого типа на основе раскрытого способа. С использованием такого же способа, как в Примере 5, был получен штамм, и были измерены его способность продуцировать лизин и концентрация остаточного сахара в культуральной среде с течением времени [Таблица 6].
В результате, также как в Примерах 5 и 6, было подтверждено, что скорость потребления сахара была увеличена у варианта штамма со вставкой gntR1 по сравнению с контрольной группой. Кроме того, в результате подтверждения интервалов времени, в течение которых глюкоза и нерафинированный сахар были полностью потреблены, было показано, что глюкоза и нерафинированный сахар были полностью потреблены через 48 часов и 42 часа в контрольной группе, и L-лизин был продуцирован в концентрации 8,2 г/л и 8,8 г/л, соответственно, а штамм со вставкой gntR1(R102C) продуцировал лизин через 42 часа и 38 часов в концентрации 8,4 г/л и 9,0 г/л, соответственно. То есть, было подтверждено, что в случае штамма с введенным изменением gntR1 скорость продукции L-лизина в зависимости от времени увеличивалась на 17% и 13%, соответственно [Таблица 7].
Соответственно, вышеизложенные результаты подтверждают, что когда изменение gntR1 введено в лизин-продуцирующий штамм рода Corynebacterium, вследствие увеличения скорости потребления сахара скорость продуцирования лизина эффективно увеличивается.
На основании вышеизложенного специалист в данной области техники, к которой принадлежит данное изобретение, понимает, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без изменения технической идеи или существенных признаков настоящего изобретения. В этом отношении примеры воплощений, раскрытых здесь, служат исключительно для иллюстративных целей и не предназначены ограничивать объем настоящего изобретения. Наоборот, настоящее изобретение предназначено охватывать не только воплощения, представленные в примерах, но также различные альтернативные, модифицированные, эквивалентные и другие воплощения могут быть включены, сохраняющие идею и входящие в объем настоящего изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.
Claims (9)
1. Полипептид, обладающий активностью репрессора глюконата, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.
2. Полинуклеотид, кодирующий полипептид по п. 1.
3. Полинуклеотид по п. 2, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2.
4. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п. 2.
5. Микроорганизм рода Corynebacterium, являющийся продуцентом L-лизина, имеющий полинуклеотид, кодирующий полипептид по п. 1.
6. Микроорганизм рода Corynebacterium по п. 5, представляющий собой Corynebacterium glutamicum.
7. Способ получения L-лизина, включающий:
(а) культивирование микроорганизма рода Corynebacterium по п. 5 или 6 в среде; и
(б) выделение L-лизина из культивированного микроорганизма или из среды со стадии (а).
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150055495A KR101640711B1 (ko) | 2015-04-20 | 2015-04-20 | 글루코네이트 리프레서 변이체, 이를 포함하는 l-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ－라이신 생산방법 |
| KR10-2015-0055495 | 2015-04-20 | ||
| PCT/KR2016/002480 WO2016171392A1 (ko) | 2015-04-20 | 2016-03-11 | 글루코네이트 리프레서 변이체, 이를 포함하는 l-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ－라이신 생산방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2681475C1 true RU2681475C1 (ru) | 2019-03-06 |
Family
ID=56616452
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017138267A RU2681475C1 (ru) | 2015-04-20 | 2016-03-11 | Вариант репрессора глюконата, микроорганизм-продуцент L-лизина, содержащий его, и способ получения L-лизина с его использованием |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10253339B2 (ru) |
| EP (1) | EP3287469B1 (ru) |
| JP (1) | JP6465997B2 (ru) |
| KR (1) | KR101640711B1 (ru) |
| CN (1) | CN107849094B (ru) |
| BR (1) | BR112017022528A2 (ru) |
| DK (1) | DK3287469T3 (ru) |
| ES (1) | ES2745561T3 (ru) |
| HU (1) | HUE045394T2 (ru) |
| MY (1) | MY176584A (ru) |
| PL (1) | PL3287469T3 (ru) |
| RU (1) | RU2681475C1 (ru) |
| WO (1) | WO2016171392A1 (ru) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114540261B (zh) * | 2020-11-24 | 2024-02-02 | 北京化工大学 | 一种产氨基己二酸的基因工程菌 |
| US12258600B2 (en) * | 2021-09-20 | 2025-03-25 | Evonik Operations Gmbh | Method for the fermentative production of L-lysine using C. glutamicum strains expressing modified gluconate repressor proteins GntR1 and GntR2 |
| KR102703209B1 (ko) * | 2021-10-14 | 2024-09-05 | 대상 주식회사 | L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법 |
| CN115490761B (zh) * | 2021-11-01 | 2023-06-09 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 基于赖氨酸外排蛋白构建的重组微生物及生产赖氨酸的方法 |
| KR20230161244A (ko) * | 2022-05-18 | 2023-11-27 | 씨제이제일제당 (주) | 신규한 글루타메이트 글루코네이트 리프레서 변이체 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산 방법 |
| KR20230161245A (ko) * | 2022-05-18 | 2023-11-27 | 씨제이제일제당 (주) | 글루코네이트 리프레서 단백질 활성이 약화된 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산 방법 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2099424C1 (ru) * | 1991-03-06 | 1997-12-20 | Адзиномото Ко., Инк. | Способ получения l-лизина посредством культивирования штамма бактерий |
| KR20050026388A (ko) * | 2002-05-16 | 2005-03-15 | 바스프 악티엔게젤샤프트 | 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 리신 합성을 위한리프레서 ｇｌｘＲ의 용도 |
| KR20120007965A (ko) * | 2010-07-15 | 2012-01-25 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ－라이신 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 ｌ－라이신 생산방법 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR0159812B1 (ko) | 1995-12-20 | 1998-11-16 | 손경식 | 코리네박테리움 글루타미컴 씨에이치 77 및 이 균주를 이용한 l-라이신의 제조 방법 |
| JP4623825B2 (ja) * | 1999-12-16 | 2011-02-02 | 協和発酵バイオ株式会社 | 新規ポリヌクレオチド |
| DE10154245A1 (de) | 2001-11-05 | 2003-06-05 | Basf Ag | Gene die für regulatorische Proteine codieren |
| EP3170889A1 (en) | 2006-09-15 | 2017-05-24 | CJ Cheiljedang Corporation | A corynebacteria having enhanced l-lysine productivity and a method of producing l-lysine using the same |
-
2015
- 2015-04-20 KR KR1020150055495A patent/KR101640711B1/ko active Active
-
2016
- 2016-03-11 HU HUE16783326A patent/HUE045394T2/hu unknown
- 2016-03-11 BR BR112017022528-0A patent/BR112017022528A2/pt active Search and Examination
- 2016-03-11 US US15/568,385 patent/US10253339B2/en active Active
- 2016-03-11 RU RU2017138267A patent/RU2681475C1/ru active
- 2016-03-11 CN CN201680035755.2A patent/CN107849094B/zh active Active
- 2016-03-11 WO PCT/KR2016/002480 patent/WO2016171392A1/ko active Application Filing
- 2016-03-11 PL PL16783326T patent/PL3287469T3/pl unknown
- 2016-03-11 MY MYPI2017703961A patent/MY176584A/en unknown
- 2016-03-11 JP JP2017555259A patent/JP6465997B2/ja active Active
- 2016-03-11 EP EP16783326.8A patent/EP3287469B1/en active Active
- 2016-03-11 DK DK16783326T patent/DK3287469T3/da active
- 2016-03-11 ES ES16783326T patent/ES2745561T3/es active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2099424C1 (ru) * | 1991-03-06 | 1997-12-20 | Адзиномото Ко., Инк. | Способ получения l-лизина посредством культивирования штамма бактерий |
| KR20050026388A (ko) * | 2002-05-16 | 2005-03-15 | 바스프 악티엔게젤샤프트 | 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 리신 합성을 위한리프레서 ｇｌｘＲ의 용도 |
| KR20120007965A (ko) * | 2010-07-15 | 2012-01-25 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ－라이신 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 ｌ－라이신 생산방법 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| FRUNZKE J. et al., Co-ordinated regulation of gluconate catabolism and glucose uptake in Corynebacterium glutamicum by two functionally equivalent transcriptional regulators, GntR1 and GntR2, Molecular Microbiology Vol. 67, No. 2, pp. 305-322, 2008. * |
| UniProtKB - Q8NMP1 (Q8NMP1_CORGL), 01.10.2002; Найдено в Интернет по адресу: www.uniprot.org/uniprot/Q8NMP1. * |
| YUYA TANAKA et al., Genome-Wide Analysis of the Role of Global Transcriptional Regulator GntR1 in Corynebacterium glutamicum, Journal of Bacteriology Vol. 196, No. 18, pp. 3249 -3258, 2014. * |
| YUYA TANAKA et al., Genome-Wide Analysis of the Role of Global Transcriptional Regulator GntR1 in Corynebacterium glutamicum, Journal of Bacteriology Vol. 196, No. 18, pp. 3249 -3258, 2014. FRUNZKE J. et al., Co-ordinated regulation of gluconate catabolism and glucose uptake in Corynebacterium glutamicum by two functionally equivalent transcriptional regulators, GntR1 and GntR2, Molecular Microbiology Vol. 67, No. 2, pp. 305-322, 2008. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3287469B1 (en) | 2019-08-07 |
| PL3287469T3 (pl) | 2020-06-15 |
| WO2016171392A1 (ko) | 2016-10-27 |
| EP3287469A1 (en) | 2018-02-28 |
| US20180100173A1 (en) | 2018-04-12 |
| CN107849094B (zh) | 2020-01-14 |
| CN107849094A (zh) | 2018-03-27 |
| US10253339B2 (en) | 2019-04-09 |
| HUE045394T2 (hu) | 2019-12-30 |
| DK3287469T3 (da) | 2019-11-04 |
| ES2745561T3 (es) | 2020-03-02 |
| BR112017022528A2 (pt) | 2019-02-19 |
| JP2018512877A (ja) | 2018-05-24 |
| KR101640711B1 (ko) | 2016-07-19 |
| EP3287469A4 (en) | 2018-10-03 |
| JP6465997B2 (ja) | 2019-02-06 |
| MY176584A (en) | 2020-08-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2616870C1 (ru) | Способ получения L-лизина с использованием микроорганизмов, обладающих способностью продуцировать L-лизин | |
| RU2681475C1 (ru) | Вариант репрессора глюконата, микроорганизм-продуцент L-лизина, содержащий его, и способ получения L-лизина с его использованием | |
| RU2683208C1 (ru) | Мутант пируватдегидрогеназы, микроорганизм, содержащий мутант, и способ получения L-аминокислоты с использованием микроорганизма | |
| RU2665825C2 (ru) | Микроорганизмы, продуцирующие путресцин, и способ получения путресцина с использованием этих микроорганизмов | |
| KR20130082124A (ko) | 자일로즈 이용능이 부여된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산방법 | |
| RU2691303C1 (ru) | Микроорганизм, продуцирующий путресцин или орнитин, и способ получения путресцина или орнитина с использованием этого микроорганизма | |
| RU2683551C1 (ru) | Микроорганизм, обладающий продуктивностью по L-лизину, и способ получения L-лизина с использованием этого микроорганизма | |
| JP6750005B2 (ja) | Ｌ−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物及びそれを用いたｌ−リジン生産方法 | |
| RU2711981C2 (ru) | Микроорганизм рода Escherichia, обладающий продуктивностью по L-триптофану, и способ получения L-триптофана с его использованием | |
| RU2685482C1 (ru) | Микроорганизмы corynebacterium sp., обладающие способностью продуцировать l-лизин, и способ продуцирования l-лизина с использованием этих микроорганизмов | |
| RU2668830C2 (ru) | Микроорганизм рода Corynebacterium для продуцирования L-лизина и способ получения L-лизина с его помощью | |
| JP2019030316A (ja) | Ｌ−リシン生産能を有する微生物及びそれを用いたｌ−リシンの生産方法 | |
| EP3106516B1 (en) | Recombinant microorganism of genus escherichia with l-threonine productivity, and method for producing l-threonine using same | |
| US10053698B2 (en) | Recombinant microorganisms of Escherichia with L-threonine productivity and method of producing L-threonine using the same | |
| KR101564753B1 (ko) | 코리네형 세균 유래의 치환된 개시코돈을 포함하는 재조합 벡터, 형질전환된 숙주세포 및 이를 이용한 아미노산의 생산방법 | |
| RU2672323C2 (ru) | Микроорганизм для продуцирования диамина и способ получения диамина с его использованием | |
| RU2696504C2 (ru) | Микроорганизм для продуцирования диамина и способ получения диамина с его использованием | |
| RU2819442C1 (ru) | Микроорганизм, обладающий усиленной способностью продуцировать L-аминокислоту с разветвленной цепью, и способ получения L-аминокислоты с разветвленной цепью с его использованием | |
| RU2817768C2 (ru) | Микроорганизм, обладающий усиленной способностью продуцировать L-аминокислоту с разветвленной цепью, и способ получения L-аминокислоты с разветвленной цепью с его использованием | |
| BR112018003756B1 (pt) | Microorganismo corynebacterium glutamicum produtor de l-lisina e método de produção de l-lisina usando os mesmos |