RU2668158C1 - Способ очистки имиглюцеразы - Google Patents
Способ очистки имиглюцеразы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2668158C1 RU2668158C1 RU2017122712A RU2017122712A RU2668158C1 RU 2668158 C1 RU2668158 C1 RU 2668158C1 RU 2017122712 A RU2017122712 A RU 2017122712A RU 2017122712 A RU2017122712 A RU 2017122712A RU 2668158 C1 RU2668158 C1 RU 2668158C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- imiglucerase
- sepharose
- protein
- deglycosylation
- purification
- Prior art date
Links
- 102100033342 Lysosomal acid glucosylceramidase Human genes 0.000 title claims abstract description 66
- 108010039650 imiglucerase Proteins 0.000 title claims abstract description 52
- 229960002127 imiglucerase Drugs 0.000 title claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 55
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 30
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims abstract description 24
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 22
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 claims abstract description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 19
- 108010055851 Acetylglucosaminidase Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102100030122 Protein O-GlcNAcase Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000012619 Butyl Sepharose® Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000013522 chelant Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims description 8
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 abstract description 7
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract description 7
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 abstract description 6
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 abstract description 4
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 abstract description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 57
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 38
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 31
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 28
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 20
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 17
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 description 13
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 13
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 13
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 13
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 10
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 9
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 9
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 6
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 208000015872 Gaucher disease Diseases 0.000 description 5
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 5
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone Chemical compound C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 4
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 4
- 101000997662 Homo sapiens Lysosomal acid glucosylceramidase Proteins 0.000 description 4
- 108010031099 Mannose Receptor Proteins 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YUDPTGPSBJVHCN-YMILTQATSA-N 4-methylumbelliferyl beta-D-glucoside Chemical compound C1=CC=2C(C)=CC(=O)OC=2C=C1O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O YUDPTGPSBJVHCN-YMILTQATSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 3
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 3
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- IFBHRQDFSNCLOZ-RMPHRYRLSA-N 4-nitrophenyl beta-D-glucoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 IFBHRQDFSNCLOZ-RMPHRYRLSA-N 0.000 description 2
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 2
- 229920000057 Mannan Polymers 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 2
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N anthranilic acid Chemical compound NC1=CC=CC=C1C(O)=O RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- YBSQGNFRWZKFMJ-UHFFFAOYSA-N Cerebroside B Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)NC(C(O)C=CCCC=C(C)CCCCCCCCC)COC1OC(CO)C(O)C(O)C1O YBSQGNFRWZKFMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 208000033868 Lysosomal disease Diseases 0.000 description 1
- 208000015439 Lysosomal storage disease Diseases 0.000 description 1
- DINOPBPYOCMGGD-VEDJBHDQSA-N Man(a1-2)Man(a1-2)Man(a1-3)[Man(a1-2)Man(a1-3)[Man(a1-2)Man(a1-6)]Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC(=O)C)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]3[C@H]([C@@H](O[C@@H]4[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O[C@@H]4[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]4[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O[C@@H]4[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)O3)O)O2)O)[C@@H](CO)O1 DINOPBPYOCMGGD-VEDJBHDQSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 206010033661 Pancytopenia Diseases 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 108010060162 alglucerase Proteins 0.000 description 1
- 229960003122 alglucerase Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229940049197 cerezyme Drugs 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 208000024389 cytopenia Diseases 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000016097 disease of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000011013 endotoxin removal Methods 0.000 description 1
- 238000002641 enzyme replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000013020 final formulation Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical group 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 1
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 239000012088 reference solution Substances 0.000 description 1
- 102220007922 rs387907003 Human genes 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
- IPCXNCATNBAPKW-UHFFFAOYSA-N zinc;hydrate Chemical compound O.[Zn] IPCXNCATNBAPKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к медицине и биотехнологии и может быть использована в фармацевтической промышленности. Предложены способ дегликозилирования имиглюцеразы и очистки имиглюцеразы, включающий этап дегликозилирования имиглюцеразы. Способ дегликозилирования включает выделение полученной в клетках СНО имиглюцеразы и ее последующую обработку нейраминидазой, β-1,4-галактозидазой и β-N-ацетилглюкозаминидазой в одну стадию. Соотношение ферментов нейраминидазы: β-1,4-галактозидазы: β-N-ацетилглюкозаминидазы в смеси составляет: 6 Е:1 Е:14 Е в расчете на 1 г белка. Способ очистки имиглюцеразы включает гидрофобную хроматографию на Butyl-сефарозе, катионный обмен на SP-сефарозе, металло-хелатную хроматографию на IMAC-сефарозе, гидрофобную хроматографию на Phenyl-сефарозе, совмещенную с дегликозилированием целевого белка, фильтрацию через Q-сефарозу и катионный обмен на СМ-сефарозе. Изобретения позволяют получать продукт фармакопейного качества с содержанием не менее 99% имиглюцеразы (по обрашенно-фазовой ВЭЖХ), не более 4% родственных примесей (по эксклюзионной ВЭЖХ), с удельной активностью не менее 35 МЕ/мг и содержанием остаточных белков клетки-продуцента не более 50 нг/мг. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 10 пр.
Description
Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и может быть использовано в фармацевтической промышленности. Раскрыт способ контролируемого дегликозилирования и очистки рекомбинантного белка глюкоцереброзидазы, который применяется при длительной фермент-замещающей терапии у пациентов с диагнозом болезнь Гоше.
Болезнь Гоше - наследственное аутосомно-рецессивное метаболическое заболевание, возникающее вследствие дефицита лизосомального фермента бета-глюкоцереброзидазы (GBA). Это самое частое лизосомальное заболевание. Наибольшая распространенность отмечается среди евреев Ашкенази (1 на 855 человек), тогда как среди других популяций она составляет 1 на 100 тыс. В России распространенность составляет 1 на 50 тыс., то есть, приблизительно, около трех тысяч пациентов (1).
Функциональная недостаточность GBA приводит к накоплению субстрата этого фермента, глюкоцереброзида, в организме, преимущественно в печени, селезенке и костном мозге. Наиболее частыми осложнениями болезни Гоше являются костно-суставные поражения, которые являются наиболее частой причиной инвалидности и смертности при болезни Гоше. Существует три типа болезни Гоше. Наиболее распространенный - тип 1, характеризуется широким спектром проявлений, обусловленных цитопенией. Тип 2 и тип 3 - редкие варианты, проявляются в детском возрасте и сопровождаются неврологическими расстройствами. Наиболее эффективна при данном заболевании заместительная терапия глюкоцереброзидазой, которая, в сравнении с другими препаратами, приносит наиболее существенные результаты.
Первым препаратом для ферментативной заместительной терапии была альглюцераза (GBA, выделенная из плацентарного материала человека). Препарат выпускался под названием Глуцераза. Следующим шагом было создание рекомбинантного белка, мутантной формы бета-глюкоцереброзидазы человека с одной аминокислотной заменой Arg495His (имиглюцераза), экспрессированного в трансформированной линии СНО (клетки яичников китайского хомячка). Лекарственное средство на основе этого белка известно под названием Церезим.
Основной проблемой при получении имиглюцеразы является ее сложный профиль гликозилирования. В природной глюкоцереброзидазе имеется 4 сайта гликозилирования, при этом, боковые цепи не содержат концевых манноз. В связи с этим, природная глюкоцереброзидаза практически не способна к проникновению в макрофаги по механизму взаимодействия с их маннозными рецепторами. Рекомбинантная имиглюцераза имеет от одной до девяти структур Man3→Man9 и обладает большим сродством к маннозным рецепторам на поверхности макрофагов. Однако, указанные остатки маннозы «скрыты» другими сахарами и поэтому, чтобы получить активный белок, СНО-экспрессированную имиглюцеразу подвергают в ходе выделения и очистки дальнейшему процессингу с использованием ферментов, изменяющих ее паттерн гликозилирования.
Для решения этой задачи в статье Furbish с сотр. (BiochimicaetBiophysicaActa, 1981, 673, 425-434) применялась последовательная обработка белка нейраминидазой, галактозидазой и β-N-ацетилглюкозаминидазой, для удаления, соответственно, остатков сиаловой кислоты, галактозы и N-ацетилглюкозамина. Эти несколько этапов ферментативной обработки позволяют высвободить значительное число маннозных остатков таким образом, чтобы боковые цепи гликанов преимущественно оканчивались остатками маннозы. Результирующая углеводная структура имиглюцеразы отличается от таковой глюкоцереброзидазы, что обеспечивает существенно большее время полужизни in vivo и более высокое сродство к маннозным рецепторам на поверхности человеческих клеток.
Однако такая последовательная обработка ферментами, хотя и позволяет получить активный белок, не очень эффективна, поскольку существует риск неполного гидролиза соответствующих моносахаридных звеньев одним из ферментов, что блокирует функцию последующих ферментов. Таким образом, данный подход требует продолжительного времени, больших количеств ферментов и в итоге оказывается весьма дорогостоящим, что, в конечном счете, значительно увеличивает стоимость полученного белка. Поэтому задача разработки новых, более экономичных и эффективных, способов выделения и очистки биологически активной глюкоцереброзидазы сохраняется.
Известны различные способы очистки глюкоцереброзидазы с использованием комбинаций хроматографических методов, а также стадий осаждения и экстракции. Однако часть из них относится к очистке белка, выделенного из плаценты (например, J. Biol. Chem. 1973, 248, 5256-5261; P. N. A. S.1977, 74, 3560-3563; ANALYTICAL BIGCHEMISTRY 1986, 154,655-663;CAN. J. BIOCHEM.1982, 60,1025-1031 и т.п.), то есть такие способы не учитывают особенностей белка, полученного рекомбинантным способом, и, как правило, имеют довольно низкие выходы (около 30%). Более современные способы очистки разработаны для глюкоцереброзидазы, в которой в силу различных причин не требуется проводить контролируемое дегликозилирование, например, для белков, содержащих мутации (как в способе, описанном в WO 2011119115) или полученных в специально созданной линии клеток (например, Plant Biotechnology Journal 2007,5, 579-590).
Наиболее близким к заявленному можно считать способ выделения и очистки глюкоцереброзидазы, использованный в патенте US 5549892. Способ включает очистку полученного в клетках СНО белка и последовательную обработку его ферментами, в соответствии с методикой, описанной в статье Furbish (см. выше). Однако детали способа очистки в патенте не раскрыты.
Таким образом, хотя известны различные способы очистки глюкоцереброзидазы и способ ферментативного отщепления остатков сахаров, из уровня техники не известен удобный и эффективный метод, объединяющий эти этапы и позволяющий получить продукт, пригодный далее для создания лекарственного препарата.
Задача заявленного технического решения - получение имиглюцеразы фармакопейного качества путем оптимизации этапов ферментативной обработки белка и многостадийной схемы хроматографической очистки.
Поставленная задача решается за счет разработки способа очистки имиглюцеразы, который совмещает этап гидрофобной хромотографии с дегликозилированием целевого белка за счет ферментативной обработки нейраминидазой, β-1,4-галактозидазой и β-N-ацетилглюкозаминидазой, проходящей в одну стадию.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу дегликозилирования имиглюцеразы, полученной в клетках млекопитающих, отличающемуся тем, что обработка нейраминидазой, β-1,4-галактозидазой и β-N-ацетилглюкозаминидазой проводится в одну стадию.
В предпочтительном варианте соотношение ферментов нейраминидазы: β-1,4-галактозидазы: β-N-ацетилглюкозаминидазыв смеси составляет: 6Е : 1Е : 14Е в расчете на 1 г белка.
В предпочтительном варианте дегликозилирование проводится в течение 22-36 часов при комнатной температуре.
В предпочтительном варианте дегликозилирование проводится в ходе хроматографической очистки целевого белка.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу очистки имиглюцеразы, полученной в клетках млекопитающих, при котором в ходе хроматографической очистки проводится дегликозилирование имиглюцеразы.
В предпочтительном варианте способ очистки имиглюцеразы включает следующие стадии:
а) гидрофобную хроматографию на Butyl-сефарозе,
б) катионный обмен на SP-сефарозе,
в) металло-хелатную хроматографию на IMAC-сефарозе,
г) гидрофобную хроматографию на Phenyl-сефарозе, совмещенную с дегликозилированием целевого белка по любому из пп. 1-4,
д) фильтрацию через Q-сефарозу,
е) катионный обмен на СМ-сефарозе.
Используемый в настоящем документе термин «имиглюцераза» обозначает рекомбинантную форму бета-глюкоцереброзидазы.
Используемый в настоящем документе термин «белок фармакопейного качества» обозначает следующие критерии его чистоты: не менее 99% основного вещества (по обрашенно-фазовой ВЭЖХ), не более 4% родственных примесей (по эксклюзионной ВЭЖХ), удельная активность не менее 35 МЕ/мг, содержание остаточных белков клетки-продуцента не более 50 нг/мг имиглюцеразы.
Предлагаемый способ выделения и очистки имиглюцеразы, синтезируемой в клетках СНО, состоит из нескольких последовательных стадий.
После культивирования рекомбинантного клона-продуцента культуральную жидкость (КЖ), содержащую целевой белок, наносят на колонку с Butyl-сефарозой (гидрофобная хроматография). На данной стадии происходит первичный захват белка, а применение нескольких промывок, содержащих этиленгликоль, позволяет удалить основные родственные примеси имиглюцеразы. Из уровня техники (ANALYTICAL BIGCHEMISTRY 1986, 154, 655-663) известно применение аффинного сорбента для захвата белка из культуральной жидкости, однако невозможность отделения родственных примесей при его использовании, а также высокая стоимость изготовления такого сорбента, подтверждают очевидные преимущества применения гидрофобной хроматографии на первой стадии выделения.
На второй стадии очистки проводится катионообменная хроматография на SP-сефарозе, позволяющая удалить основную часть остаточных примесных белков клеток-продуцентов за счет солевой промывки и щадящей элюции целевого белка с сорбента путем увеличения pH. Хроматографическая чистота целевого белка после первых двух стадий очистки достигает 96-98% как на обращенно-фазовой, так и на эксклюзионной ВЭЖХ.
В целях дальнейшего увеличения чистоты целевого белка до 98-99%, для его использования в качестве фармацевтической субстанции, на третьем этапе очистки используется цинк-хелатная хроматография на IMAC-сефарозе со специфической элюцией имиглюцеразы комбинированным буферным раствором с высоким содержанием хлорида натрия и этиленгликоля. В результате получается высокоочищенный белок, пригодный для дальнейшей обработки дегликозилирующими ферментами с целью увеличения его функциональной активности.
Фракция целевого белка с третьей стадии очистки наносится на сорбент Phenyl-сефарозу. На данном этапе (гидрофобная хроматография) проводится контролируемое дегликозилирование целевого белка при помощи смеси трех ферментов (нейраминидаза, β-1,4-галактозидаза, β-N-ацетилглюкозаминидаза) для укорачивания полисахаридных цепей белка до концевых маннозных остатков. Подобраны минимальные концентрации гликозидаз в реакционной смеси (снижение более чем в 10 раз по сравнению с известными из уровня техники), обеспечивающие полноту прохождения реакции и приемлемую для коммерческого производства скорость процесса. Более того, подтверждена возможность многократного использования оптимизированной ферментной смеси без потери эффективности дегликозилирования. В связи с высокой стоимостью коммерчески доступных гликозидаз, проведенная оптимизация позволяет значительно снизить затраты на получение целевой субстанции.
При использовании в производстве коммерческих ферментов, произведенных в бактериальных клеточных линиях и не прошедших достаточной очистки, может быть введен дополнительный этап удаления эндотоксинов. В таком случае целевой белок после дегликозилирования промывается буферным раствором, содержащим изопропанол, перед элюцией с сорбента.
Полученный частично дегликозилированный белок далее подвергают фильтрации через анионообменный сорбент Q-сефарозу для удаления остаточных эндотоксинов и ДНК клеток-продуцентов.
Последнюю стадию хроматографической очистки проводят на СМ-сефарозе, осуществляя финальную доочистку от примесных белков клеток-продуцентов и перевод белка в буфер готовой формы. В результате получают субстанцию с хроматографической чистотой не менее 99% по обращенно-фазовой ВЭЖХи специфической активностью около 40 МЕ/мг, далее используемую для получения готовой формы лекарственного средства. Общий выход продукта после всех стадий выделения составляет приблизительно 40%.
Ключевые преимущества данного способа выделения и очистки имиглюцеразы состоят в усовершенствовании и оптимизации наиболее сложного и дорогостоящего этапа дегликозилирования белка за счет подтвержденной возможности использования смеси трех гликозидаз, что позволяет непосредственно в ходе хроматографической очистки модифицировать профиль гликозилирования белка для активации его функциональных свойств. Разработанная методика дает возможность получения активного целевого белка высочайшей степени чистоты пригодного для фармацевтического применения. Кроме того, возможность использовать оптимизированную ферментную смесь повторно позволяет существенно снизить затраты на производство конечного продукта.
После завершения хроматографической очистки проводили контроль углеводной структуры субстанции. Аспарагин-связанные олигосахариды извлекались путем инкубации имиглюцеразы с N-гликаназой с последующим флуоресцентным мечением и анализом полученной смеси на гидрофильной ВЭЖХ-колонке высокого разрешения (фиг. 1). Методом масс-спектрометрического анализа показано, что три основных пика олигосахаридов соответствуют Man3GlcNAc2, Man3(Fucα1→3)GlcNAc2 и GlcNAcMan3(Fucα1→3)GlcNAc2, то есть подавляющее число углеводных цепей полученного гликопротеина содержат один или два концевых маннозных остатка необходимых для его биологической активности.
Ферментативную активность имиглюцеразы измеряли при помощи хромогенного метода с использованием 4-нитрофенил-β-D-глюкопиранозида в качестве субстрата. Биологическую активность субстанции подтверждали по способности имиглюцеразы к интернализации в иммунные клетки крови мыши с сохранением ферментативной активности, детектируемой более чувствительным методом с флуорогенным субстратом (4-метилумбеллиферил-β-D-глюкопиранозид). Показано, что целевой белок обладает требуемой специфической активностью (около 40 МЕ/мг) и эффективно проникает в клетку, подтверждая тем самым свою полную функциональность.
Полученный белок характеризуется следующими параметрами: не менее 99% основного вещества (по обрашенно-фазовой ВЭЖХ), не более 4% родственных примесей (по эксклюзионной ВЭЖХ), удельная активность не менее 35 МЕ/мг, содержание остаточных белков клетки-продуцента не более 50 нг/мг имиглюцеразы. Изобретение иллюстрируется, но не ограничивается приведенными ниже примерами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Создание продуцента имиглюцеразы.
Ген, кодирующий имиглюцеразу, был сконструирован синтетическим способом, используя кодоны, оптимизированные для экспрессии в клетках грызунов (китайского хомячка). Аминокислотная последовательность белка была взята из базы данных UniProt (UniProtKB - Р04062 (GLCM_HUMAN). Для обеспечения секреции целевого белка в культуральную среду, ген имиглюцеразы содержал сигнальный пептид, обеспечивающий направление белковой молекулы по секреторному пути. Сигнальный пептид был взят из последовательности человеческого фактора свертываемости крови FVII. После прохождения через эндоплазматический ретикулум сигнальный пептид отщепляется от полипептида имиглюцеразы.
Ген имиглюцеразы был клонирован в плазмидные векторы для экспрессии в клетках млекопитающих под контролем сильного промотора и экспрессировался в клетках СНО (линия клеток яичников китайского хомячка). Два сконструированных вектора содержали идентичный ген, но отличались устойчивостью к селективному антибиотику. Вектор pMS590 нес ген устойчивости к пуромицину, а вектор pMS591 нес ген устойчивости к гигромицину, что обеспечивало устойчивость трансфецированной клеточной линии к селективным антибиотикам.
Экспрессия осуществлялась путем введения экспрессионных плазмид pMS590 pMS591, созданных на основе модифицированной плазмиды pUC18, в клеточную линию-хозяина посредством трансфекции клеток. Клеточная линия-хозяин представляла собой субклон линии клеток яичников китайского хомячка СНО-К1, приспособленный к выращиванию в виде суспензии в питательной среде, не содержащей сыворотки крови животных. В качестве способа трансфекции применяли электропорацию, в результате чего, введенная последовательность стабильно интегрировалась в геном хозяина.
Для идентификации и выделения клеток, продуцирующих имиглюцеразу, после трансфекции и добавления селективного антибиотика в культуральную среду, суспензия клеток разбавлялась и рассевалась таким образом, чтобы изолировать популяции, выросшие из единичных клеток, то есть клеточные клоны. После выделения клоны выращивались до состояния конфлюэнтности, и содержание целевого белка в супернатанте оценивалось методом иммуноферментного анализа, а также Вестерн-блоттинга. Клеточные клоны, секретирующие β-глюкоцереброзидазу на высоком уровне, размножали и хранили с помощью криоконсервации.
Пример 2. Культивирование клеток-продуцентов.
Для производства имиглюцеразы культивирование клеточного клона, стабильно продуцирующего целевой белок, проводили в течение не менее 20 суток в непрерывном (перфузионном) режиме в одноразовом биореакторе волнового типа со встроенной перфузионной мембраной. Для культивирования использовали базовую питательную среду SFM4CHO (HyClone), не содержащую сыворотки крови крупного рогатого скота и иных компонентов животного происхождения, дополненную нутриентной добавкой CHOFeedBioreactorSupplement (SAFC) в количестве 5 мл/л. Температура культивирования составляла 37°С в фазе экспоненциального роста и 32°С в продукционной фазе. Скорость протока питательной среды достигала одного объема биореактора в сутки. Культуральная жидкость, отделенная от клеток, раз в сутки передавалась на хроматографическую очистку. Процесс культивирования завершали после снижения жизнеспособности клеток ниже 80%.
Пример 3. Хроматография на сорбенте Butyl Sepharose.
К культуральной жидкости, содержащей рекомбинантную имиглюцеразу, добавляли хлорид натрия до концентрации 0,5 М. Сорбент уравновешивали буферным раствором состава 50 мM Tris-HCl, 0,5 М NaCl, 10% этиленгликоль (pH 7,2), затем наносили культуральную жидкость. По окончании нанесения сорбент последовательно промывали несколькими объемами буферных растворов следующего состава:
- 50 мМ Tris-HCl, 0,5 М хлорид натрия, 10% этиленгликоль (pH 7,2);
- 10 мМ Tris-HCl, 0,1 М хлорид натрия, 10% этиленгликоль (pH 7,2);
- 10 мМ ацетат натрия, 0,1 М хлорид натрия, 10% этиленгликоль (pH 5,0).
Целевой белок элюировали буферным раствором, содержащим 10 мМ ацетат натрия, 0,15 М хлорид натрия, 70% этиленгликоль (pH 5,0). Элюат собирали и передавали на следующую стадию очистки.
Пример 4. Хроматография на сорбенте SP Sepharose.
Элюат с Butyl-сефарозы разбавляли в два раза раствором 20 мМ ацетата натрия (pH 5,0) и наносили на сорбент, предварительно уравновешенный буферным раствором состава 20 мМ ацетат натрия, 25 мМ хлорид натрия, 10% этиленгликоль (pH 5,0).
По окончании нанесения сорбент последовательно промывали буферными растворами следующего состава:
- 20 мМ ацетат натрия, 25 мМ хлорид натрия, 10% этиленгликоль (pH 5,0);
- 20 мМ ацетат натрия, 100 мМ хлорид натрия, 10% этиленгликоль(pH 5,0).
Целевой белок элюировали буферным раствором, содержащим 20 мМ фосфат натрия, 100 мМ хлорид натрия, 20% этиленгликоль (pH 7,0). Элюат собирали и передавали на следующую стадию очистки.
Пример 5. Хроматография на сорбенте IMAC Sepharose.
Перед нанесением белка сорбент насыщали ионами Zn2+ путем последовательных промывок водой, раствором 0,2 М хлорида цинка, водой, а затем уравновешивали буферным раствором состава 20 мМ фосфат натрия, 0,1М хлорид натрия, 20% этиленгликоль (pH 7,0). Элюат с SP-сефарозы наносили на сорбент и по окончании нанесения проводили последовательные промывки буферными растворами следующего состава:
- 20 мМ фосфат натрия, 0,1 М хлорид натрия, 20% этиленгликоль (pH 7,0)
- 20 мМ фосфат натрия (pH 7,0);
- 20 мМ фосфат натрия, 1 М хлорид натрия (pH 7,0);
- 20 мМ фосфат натрия, 1 М хлорид натрия, 20% этиленгликоль (pH 7,0).
Целевой белок элюировали буферным раствором, содержащим 50 мМ фосфат натрия, 2,8 М хлорид натрия, 30% этиленгликоль (pH 7,0). Элюат собирали и передавали на следующую стадию очистки.
Пример 6. Хроматография на сорбенте Phenyl Sepharose и ферментативная обработка.
Элюат с IMAC-сефарозы разбавляли в 5 раз раствором 50 мМ фосфата натрия (pH 7,5) и наносили на сорбент, предварительно уравновешенный буферным раствором состава 50 мМ фосфат натрия, 0,5 М хлорид натрия, 5% этиленгликоль (pH 7,5). По окончании нанесения сорбент последовательно промывали буферными растворами следующего состава:
- 50 мМ фосфат натрия, 0,5 М хлорид натрия, 5% этиленгликоль (pH 7,5);
- 50 мМ цитрат натрия, 10% этиленгликоль (pH 5,7).
Последний буферный раствор также применялся для приготовления реакционной смеси ферментов для контролируемого дегликозилирования иммобилизованной на сорбенте имиглюцеразы. Объем реакционной смеси составлял 110% от колоночного объема; ферментный состав смеси рассчитывался из следующих соотношений: 6Е нейраминидазы (Worthington), 1E β-1,4-галактозидазы (Calbiochem) и 14Е β-N-ацетилглюкозаминидазы (Sigma) на 1 г имиглюцеразы.
Реакционную смесь для дегликозилирования пропускали через сорбент в режиме рециркуляции с линейной скоростью 90 см/ч в течение ~22-36 часов. После гидролиза олигосахаридных цепей реакционную смесь собирали и хранили при температуре 4°С (показана стабильность в течение минимум двух недель) для повторного использования. Сорбент промывали буферным раствором состава 50 мМ цитрат натрия, 10% изопропанол (pH 5,7). Целевой белок с оптимизированным профилем гликозилирования элюировали буферным раствором, содержащим 40 мМ фосфат натрия, 55% пропиленгликоль (pH 7,5). Элюат собирали и передавали на следующую стадию очистки.
Пример 7. Хроматография на сорбенте Q Sepharose.
Элюат с Phenyl-сефарозы разбавляли в 2 раз раствором 100 мМ фосфата натрия (pH 7,5) и наносили на сорбент, предварительно уравновешенный буферным раствором состава 50 мМ фосфат натрия, 10% этиленгликоль (pH 7,5). Данную стадию проводили в режиме фильтрации; после нанесения фракции целевого белка сорбент промывали буфером для уравновешивания. Фильтрат собирали и передавали на следующую стадию очистки.
Пример 8. Хроматография на сорбенте CM Sepharose.
К фильтрату с Q-сефарозы добавляли раствор 1 М лимонной кислоты до значения pH 5,0 и наносили на сорбент, предварительно уравновешенный раствором 25 мМ цитрата натрия (pH 5,0). По окончании нанесения сорбент последовательно промывали буферными растворами следующего состава:
- 25 мМ цитрат натрия (pH 5,0);
- 25 мМ цитрат натрия, 10% изопропанол (pH 5,0).
Затем, для удаления фракции белка с высоким содержанием остаточных белков СНО, проводили промывку линейным градиентом буфера состава 25 мМ цитрат натрия, 10% изопропанол, 200 мМ хлорид натрия (pH 5,0) с остановкой градиента при достижении проводимости 7-8 mS/cm. После этого сорбент последовательно промывали буферными растворами следующего состава:
- 25 мМ цитрат натрия, 10% изопропанол (pH 5,0)
- 25 мМ цитрат натрия, 0,01% полисорбат-80 (pH 5,0).
Целевой белок элюировали буферным раствором, содержащим 55 мМ цитрат натрия, 0.01% полисорбат-80 (pH 6,3). Для приготовления готовой субстанции в полученный раствор имиглюцеразы вносили в сухом виде недостающие компоненты финальной формуляции.
Пример 9. Определение углеводной структуры имиглюцеразы.
Аликвоту 0,5 мг субстанции имиглюцеразы переводили в 0,2 мл гликозидазного буфера (50 мМ Tris-HCl, pH 8,0) при помощи 250-кратного разбавления на микроконцентраторе Amicon-10К (Millipore). Затем к образцу добавляли около 20 единиц активности N-glycanase (Prozyme) и термостатировали при +37°С в течение 8 ч. Олигосахариды отделяли от белка ультрафильтрацией на Amicon-10К с дополнительными промывками деионизованной водой. Собранный проскок (99% материала) упаривали досуха на вакуумном концентраторе CentriVap (Labconco).
Реагент для флуоресцентного мечения олигосахаридов получали последовательным растворением 1 мкг 2-аминобензойной кислоты и 1,25 мкг цианоборогидрида натрия в 21 мкл смеси диметилсульфоксида с уксусной кислотой. Образцы смеси олигосахаридов растворяли в 3 мкл деионизованной воды и затем добавляли 10 мкл реагента для мечения. Реакционную смесь инкубировали в течение 3 ч при +45°С. Избыточный краситель удаляли методом твердофазной экстракции на колонках LudgerClean™ T1 Cartridge Kit (Ludger) согласно рекомендуемому протоколу. Пробы упаривали до объема около 50 мкл и использовали для анализа.
Хроматографический анализ (фиг. 1) осуществляли на приборе Alliance HPLC (Waters) с применением гидрофильной ВЭЖХ-колонки высокого разрешения TSKgel Amide-80 (Tosoh Bioscience) с предколонкой TSKguardgel Amide-80. Разделение проводили при температуре колонки 45°С в градиенте подвижной фазы (раствор формиата аммония с ацетонитрилом). Сигнал детектировали по флуоресценции при 425 нм при возбуждении светом 360 нм.
Пример 10. Определение биологической активности полученного белка и способности его интернализации в клетку.
Ферментативную активность имиглюцеразы измеряли хромогенным методом с 4-нитрофенил-β-D-глюкопиранозидом в качестве субстрата. В исследуемый образец в нескольких разведениях вносили четырехкратный объем 10 мМ раствора субстрата и инкубировали 15 мин при 37°С, после чего реакцию останавливали прибавлением восьми объемов 0,1 М раствора глицина. Измеряли оптическую плотность растворов на спектрофотометре в максимуме поглощения при длине волны 400 нм. Активность определяли, исходя из того, что одна единица активности соответствует гидролизу одного мкмоля субстрата/мин при температуре 37°С.
Биологическую функциональность имиглюцеразы определяли по способности исследуемых образцов белка интернализироваться в перитонеальные макрофаги (моноциты) мыши в присутствии или в отсутствие дрожжевого маннана с последующей детекцией ферментативной активности интернализированной имиглюцеразы в клеточном лизате.
Пул мышиных клеток, содержащих перитонеальные макрофаги, осаждали центрифугированием с последующим ресуспендированием клеточного осадка в питательной среде DMEM/F12 с 10% бычьей сывороткой, 2 мМ глутамином и пенициллин-стрептомицином. Полученные клетки высевали в 6 луночный планшет в количестве 7 млн/лунку. По окончании полуторачасовой инкубации прикрепившиеся клетки перитонеальных макрофагов двукратно промывали средой с последующим добавлением 2 мл свежей среды в каждую лунку. К клеткам добавляли аликвоты исследуемых образцов имиглюцеразы до концентрации 100 мкг/мл. В качестве контроля использовали клетки, к которым предварительно добавляли маннан (до концентрации 800 мкг/мл), блокирующий маннозные рецепторы. После 3-х часовой инкубации при 37°С макрофаги промывали фосфатно-солевым буфером; смывы после 4 и 5 промывок собирались для анализа. По окончании последней промывки клетки каждой лунки смывали 500 мкл лизирующего буфера. Полученные образцы клеточных лизатов и промывочных растворов были использованы для детектирования активной формы белка.
Определение ферментной активности имиглюцеразы в клеточном лизате проводили флюорогенным методом: под действием имиглюцеразы происходит расщепление синтетического субстрата (4-метилумбеллиферил-β-D-глюкопиранозид) с образованием флюоресцентного вещества 4-метилумбеллиферона.
К 20 мкл образцов имиглюцеразы, разведенных в фосфатном буфере, добавляли 80 мкл 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкопиранозида (Sigma) и инкубировали 30 мин при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 800 мкл 0,1 М раствора глицина, pH 10,5. Флюоресценцию испытуемых растворов и раствора сравнения, не содержащего белка, измеряли спектрофотометрически при длине волны возбуждения 365 нм и длине волны эмиссии 440 нм. Флюоресценция продукта реакции количественно оценивается с помощью калибровочной кривой, построенной для заданных концентраций 4-метилумбеллиферона (Sigma).
Claims (10)
1. Способ дегликозилирования имиглюцеразы, полученной в клетках млекопитающих, включающий выделение полученной в клетках СНО имиглюцеразы и ее последующую обработку нейраминидазой, β-1,4-галактозидазой и β-N-ацетилглюкозаминидазой, отличающийся тем, что обработка нейраминидазой, β-1,4-галактозидазой и β-N-ацетилглюкозаминидазой проводится в одну стадию, и соотношение ферментов нейраминидазы: β-1,4-галактозидазы: β-N-ацетилглюкозаминидазы в смеси составляет: 6 Е:1 Е:14 Е в расчете на 1 г белка.
2. Способ дегликозилирования имиглюцеразы по п. 1, отличающийся тем, что дегликозилирование проводится в течение 22-36 часов при комнатной температуре.
3. Способ дегликозилирования имиглюцеразы по любому из пп. 1, 2, отличающийся тем, что дегликозилирование проводится в ходе хроматографической очистки.
4. Способ очистки имиглюцеразы из культуральной жидкости, полученной при культивировании клеток млекопитающих, включающий следующие стадии:
а) гидрофобную хроматографию на Butyl-сефарозе,
б) катионный обмен на SP-сефарозе,
в) металло-хелатную хроматографию на IMAC-сефарозе,
г) гидрофобную хроматографию на Phenyl-сефарозе, совмещенную с дегликозилированием целевого белка по любому из пп. 1-3,
д) фильтрацию через Q-сефарозу,
е) катионный обмен на СМ-сефарозе.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017122712A RU2668158C1 (ru) | 2017-06-28 | 2017-06-28 | Способ очистки имиглюцеразы |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017122712A RU2668158C1 (ru) | 2017-06-28 | 2017-06-28 | Способ очистки имиглюцеразы |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2668158C1 true RU2668158C1 (ru) | 2018-09-26 |
Family
ID=63668991
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017122712A RU2668158C1 (ru) | 2017-06-28 | 2017-06-28 | Способ очистки имиглюцеразы |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2668158C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2794425C1 (ru) * | 2022-10-11 | 2023-04-18 | Общество с ограниченной ответственностью "БИОТЕХНО" | Способ перфузионной фильтрации для непрерывного культивирования культур клеток |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5549892A (en) * | 1988-12-23 | 1996-08-27 | Genzyme Corporation | Enhanced in vivo uptake of glucocerebrosidase |
| RU2535342C2 (ru) * | 2003-04-27 | 2014-12-10 | Проталикс Лтд. | Продуцирование высокоманнозных белков в растительных культурах |
-
2017
- 2017-06-28 RU RU2017122712A patent/RU2668158C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5549892A (en) * | 1988-12-23 | 1996-08-27 | Genzyme Corporation | Enhanced in vivo uptake of glucocerebrosidase |
| RU2535342C2 (ru) * | 2003-04-27 | 2014-12-10 | Проталикс Лтд. | Продуцирование высокоманнозных белков в растительных культурах |
Non-Patent Citations (5)
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2794425C1 (ru) * | 2022-10-11 | 2023-04-18 | Общество с ограниченной ответственностью "БИОТЕХНО" | Способ перфузионной фильтрации для непрерывного культивирования культур клеток |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2017232121B2 (en) | In vivo production of proteins | |
| ES2848861T3 (es) | Enzima mutante EndoS | |
| US4925796A (en) | Method for enhancing glycoprotein stability | |
| AU2018200374A1 (en) | Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease | |
| KR20140036226A (ko) | 모유 올리고사카라이드(hmo) 또는 그의 전구체의 다양화 | |
| KR20180025969A (ko) | N- 및 o-글리코실화 패턴이 변이된 당단백질을 생성하는 세포 및 그의 방법 및 용도 | |
| US20210106658A1 (en) | Compositions comprising heterogeneous populations of recombinant human clotting factor xa proteins | |
| Huang et al. | Site-selective sulfation of N-glycans by human GlcNAc-6-O-sulfotransferase 1 (CHST2) and chemoenzymatic synthesis of sulfated antibody glycoforms | |
| Faid et al. | Site-specific glycosylation analysis of the bovine lysosomal α-mannosidase | |
| Dojima et al. | Comparison of the N-linked glycosylation of human β1, 3-N-acetylglucosaminyltransferase 2 expressed in insect cells and silkworm larvae | |
| Freeman et al. | Lysosomal degradation of heparin and heparan sulphate | |
| RU2668158C1 (ru) | Способ очистки имиглюцеразы | |
| Zhang et al. | Chemoenzymatic glycan-selective remodeling of a therapeutic lysosomal enzyme with high-affinity M6P-glycan ligands. Enzyme substrate specificity is the name of the game | |
| US20210017500A1 (en) | Animal cell strain and method for use in producing glycoprotein, glycoprotein and use thereof | |
| WO2020022924A1 (ru) | Способ очистки имиглюцеразы | |
| KR102528707B1 (ko) | 고순도의 히알루로니다제 정제 방법 | |
| WO2016076440A1 (ja) | 糖ペプチド又は糖蛋白質の製造方法 | |
| EP4509601A1 (en) | Coagulation factor x activating enzyme and use thereof | |
| WO2003057710A2 (en) | Methods of producing high mannose glycoproteins in complex carbohydrate deficient cells | |
| JPWO2020090357A1 (ja) | Ｏ結合型糖ペプチドの製造方法 | |
| EP0565241B1 (en) | Oligosaccharides | |
| KR20150063057A (ko) | 히알루로난-리아제 효소, 이의 생산 방법, 이의 용도, 및 저분자량의 히알루로난의 제조 방법 | |
| Tong et al. | Identification and characterization of emGalaseE, a β-1, 4 galactosidase from Elizabethkingia meningoseptica, and its application on living cell surface | |
| US5047337A (en) | Ceramide-glycanase | |
| Hoffmann | Investigations into enzymatic transglycosylation reactions for the synthesis of glycoconjugates and glyco-functionalized polyphenols |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MZ4A | Patent is void |
Effective date: 20190122 |