RU2659204C1 - Bio transplant for the joints dysplasia treatment and method of its preparation - Google Patents
Bio transplant for the joints dysplasia treatment and method of its preparation Download PDFInfo
- Publication number
- RU2659204C1 RU2659204C1 RU2017103716A RU2017103716A RU2659204C1 RU 2659204 C1 RU2659204 C1 RU 2659204C1 RU 2017103716 A RU2017103716 A RU 2017103716A RU 2017103716 A RU2017103716 A RU 2017103716A RU 2659204 C1 RU2659204 C1 RU 2659204C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- treatment
- dysplasia
- joints
- cultured
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 title claims abstract description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 2
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 13
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 5
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims abstract description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 4
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 claims description 3
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 abstract description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 abstract description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 abstract description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 abstract description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 abstract description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 4
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 3
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 210000002346 musculoskeletal system Anatomy 0.000 description 3
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010073767 Developmental hip dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 208000007446 Hip Dislocation Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 208000030175 lameness Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000037023 motor activity Effects 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- -1 streptomicin Chemical compound 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61D—VETERINARY INSTRUMENTS, IMPLEMENTS, TOOLS, OR METHODS
- A61D7/00—Devices or methods for introducing solid, liquid, or gaseous remedies or other materials into or onto the bodies of animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61D—VETERINARY INSTRUMENTS, IMPLEMENTS, TOOLS, OR METHODS
- A61D99/00—Subject matter not provided for in other groups of this subclass
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии и касается получения культуры генетически немодифицированных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и способа лечения дисплазии суставов.The invention relates to biotechnology and veterinary medicine and for obtaining a culture of genetically unmodified multipotent mesenchymal stromal cells and a method for the treatment of joint dysplasia.
В настоящее время в ветеринарной ортопедической практике возрастает число животных с заболеваниями опорно-двигательного аппарата. Так по статистике Ортопедического фонда животных (Orthopedic Foundation for Animals), для 50 наиболее подверженных дисплазиям пород, из 430000 обследованных собак дисплазия тазобедренного сустава присутствует в 21%, а дисплазии локтя в 16% из 180000 обследованных животных. Дегенеративные формы артритов составляют приблизительно одну треть причин, вызывающих хромоту у животных, наиболее часто встречающимися являются остеоартрозы. Вместе с тем, этиология возникновения остеоартроза до сих пор до конца не выяснена. Считают, что они могут быть вызваны травмами, возрастными изменениями, генетическими и другими факторами риска. Потеря способности передвигаться из-за болезни опорно-двигательного аппарата является ключевой причиной эвтаназии у большинства животных. Существующие методы лечения, как консервативные, так и хирургические, не позволяют ветеринарному врачу добиться полного выздоровления или ремиссии на длительный срок [Csaki С, Matis U, et al., 2007; Arends В, Vankelecom H., et al., 2009].Currently, the number of animals with diseases of the musculoskeletal system is increasing in veterinary orthopedic practice. Thus, according to statistics from the Orthopedic Foundation for Animals, for the 50 most prone to dysplasia breeds, out of the 430,000 examined dogs, hip dysplasia is present in 21%, and elbow dysplasia in 16% of the 180,000 examined animals. Degenerative forms of arthritis account for approximately one third of the causes of lameness in animals, the most common are osteoarthritis. However, the etiology of the occurrence of osteoarthritis is still not fully understood. It is believed that they can be caused by injuries, age-related changes, genetic and other risk factors. Loss of mobility due to illness of the musculoskeletal system is a key cause of euthanasia in most animals. Existing treatment methods, both conservative and surgical, do not allow the veterinarian to achieve full recovery or long-term remission [Csaki C, Matis U, et al., 2007; Arends B, Vankelecom H., et al., 2009].
В последнее время во всем мире все большее внимание уделяется использованию стволовых клеток в терапии различных заболеваний. Изначально мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки (ММСК) привлекли к себе внимание в научном мире из-за их способности к дифференцировке в остеобласты, хондробласты и адипоциты и возможной трансдифференцировки в нейроны, глиальные и эндотелиальные клетки. Эта широкая пластичность под влиянием клеточного микроокружения, межклеточных структур и ряда химических факторов позволяет использовать ММСК в качестве ключевого механизма процессов репарации [Горностаева С.Н., 2006; Bronckaers A., Hilkens P., et. al. 2014].Recently, worldwide attention has been paid to the use of stem cells in the treatment of various diseases. Initially, multipotent mesenchymal stem cells (MMSCs) attracted attention in the scientific world because of their ability to differentiate into osteoblasts, chondroblasts and adipocytes and the possible transdifferentiation into neurons, glial and endothelial cells. This wide plasticity under the influence of the cellular microenvironment, intercellular structures and a number of chemical factors allows the use of MMSCs as a key mechanism of repair processes [Gornostaeva SN, 2006; Bronckaers A., Hilkens P., et. al. 2014].
ММСК, являясь клетками тканей взрослого организма, обладают ограниченным потенциалом дифференцировки. Тем не менее, с точки зрения этики, являются более приемлемым для клинического использования материалом. Популяции ММСК базируются в костном мозге, в жировом депо, а также могут присутствовать и во многих других тканях как резидентные клеточные компоненты. Их способность к дальнейшей дифференцировке определяется как клеточным, так и гуморальным микроокружением. Эти клетки формируют своеобразный «резерв», способный в случае необходимости мобилизоваться и перемещаться к зонам повреждения для участия в восстановлении пораженных участков ткани.MMSCs, being cells of tissues of an adult organism, have a limited potential for differentiation. However, from an ethical point of view, they are more acceptable for clinical use. MMSC populations are based in the bone marrow, in the fat depot, and can also be present in many other tissues as resident cellular components. Their ability to further differentiate is determined by both cellular and humoral microenvironment. These cells form a kind of “reserve”, which, if necessary, is able to mobilize and move to damage zones to participate in the restoration of affected tissue sites.
Еще одной очень важной особенностью ММСК является их низкая иммуногенность и, более того, способность подавлять посттрансплантационный иммунный ответ организма, что крайне важно при осуществлении различного рода аллогенных трансплантаций [Рябцева Е.С., Кривенко С.И., и др., 2006; Herrmann R.P., Sturm M.J., 2014].Another very important feature of MMSCs is their low immunogenicity and, moreover, the ability to suppress the body’s post-transplant immune response, which is extremely important when performing various kinds of allogeneic transplantations [Ryabtseva ES, Krivenko SI, et al., 2006; Herrmann R. P., Sturm M.J., 2014].
Одним из приоритетных направлений является лечение заболеваний и травм опорно-двигательного аппарата, дефектов суставного хряща, остеоартрита, которые являются растущей проблемой для человека и домашних животных и которые требуют разработки новой и усовершенствованной терапевтической стратегии.One of the priority areas is the treatment of diseases and injuries of the musculoskeletal system, defects in articular cartilage, osteoarthritis, which are a growing problem for humans and domestic animals and which require the development of a new and improved therapeutic strategy.
Благодаря ряду уникальных свойств, в частности, способности дифференцироваться в различные типы клеток соединительной ткани, ММСК привлекают пристальное внимание исследователей. Эти свойства определяют перспективность применения ММСК в биотехнологии и регенеративной медицине.Due to a number of unique properties, in particular, the ability to differentiate into various types of connective tissue cells, MMSCs attract the attention of researchers. These properties determine the prospects of using MMSCs in biotechnology and regenerative medicine.
Dalemans W., Lombardo Е. и Dekker R. представили способ «Mesenchymal stromal cells fortreating rheumatoid arthritis» (WO 2016001845 (A1) - England2016, A61K 35/28; A61P 9/02) для лечения ревматоидного артрита, включающий использование мезенхимальных стромальных клеток. Было обнаружено, что введение мезенхимальных стромальных клеток (МСК), в частности полученных из жировой ткани человека (hASCs), могут быть полезными при лечении ревматоидного артрита. Изобретение относится к композиции, содержащей мезенхимальные стромальные клетки (МСК), которая примененяется в лечении ревматоидного артрита. Изобретение также учитывает применение мезенхимальных стромальных клеток (МСК) в производстве лекарственного средства для лечения ревматоидного артрита.Dalemans W., Lombardo E. and Dekker R. presented a method of “Mesenchymal stromal cells fortreating rheumatoid arthritis” (WO 2016001845 (A1) - England2016, A61K 35/28; A61P 9/02) for the treatment of rheumatoid arthritis, including the use of mesenchymal stromal cells . It has been found that the administration of mesenchymal stromal cells (MSCs), in particular those derived from human adipose tissue (hASCs), may be useful in the treatment of rheumatoid arthritis. The invention relates to a composition containing mesenchymal stromal cells (MSCs), which is used in the treatment of rheumatoid arthritis. The invention also allows for the use of mesenchymal stromal cells (MSCs) in the manufacture of a medicament for the treatment of rheumatoid arthritis.
Недостатком этого способа является использование фетальной бычьей сыворотки или сывороточного альбумина человека, что приводит к невысокой пролиферативной активности ММСК жировой ткани в культуре. Использование дополнительных питательных и ростовых компонентов может стать решением этого вопроса. В частности замена такого стандартного компонента ростовой среды как эмбриональная телячья сыворотка на пуллированную плазму, обогащенную тромбоцитами, полученную от доноров того же вида. Использование в заявляемом способе пуллированной, обогащенной тромбоцитами плазмы крови позволяет получить культуру клеток ММСК жировой ткани аутологичных пациенту в условиях in vitro, которая будет отличаться высокой пролиферативной активностью, низким апоптотическим индексом, более высоким процентом жизнеспособных клеток и безопасностью в связи с отсутствием ксеногенных компонентов питательной среды.The disadvantage of this method is the use of fetal bovine serum or human serum albumin, which leads to a low proliferative activity of MMSC adipose tissue in culture. The use of additional nutritional and growth components may be the solution to this issue. In particular, the replacement of such a standard component of the growth medium as embryonic calf serum with pulled plasma enriched in platelets obtained from donors of the same species. The use of the claimed method in a pulled, platelet-rich blood plasma allows to obtain a culture of MMSC cells of adipose tissue autologous to the patient in vitro, which will be characterized by high proliferative activity, low apoptotic index, higher percentage of viable cells and safety due to the absence of xenogenic components of the nutrient medium .
Наиболее близким по технической сущности заявляемому (или выбранному в качестве прототипа) является способ «Биотрансплантат и способ лечения остеопороза» (патент РФ № RU 2265442 С1, 2004 г., A61K 35/28 (2000.01); A61K 35/48 (2000.01); А61Р 19/10 (2000.01)). Биотрансплантат для лечения остеопороза содержит мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (МСК), полученные из фетального, донорского или аутологичного материала, при этом ткань дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, содержащей трансферин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин до накопления в культуре клеток зрелой стромы. Способ лечения остеопороза заключается во внутривенном капельном введении МСК от 50 до 500 млн. в 50-100 мл физиологического раствора.Closest to the technical nature of the claimed (or selected as a prototype) is the method of “Biograft and method of treating osteoporosis” (RF patent No. RU 2265442 C1, 2004, A61K 35/28 (2000.01); A61K 35/48 (2000.01); A61P 19/10 (2000.01)). The biograft for the treatment of osteoporosis contains multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) obtained from fetal, donor or autologous material, the tissue is disaggregated, the resulting cell suspension is resuspended and cultured on growth medium containing transferrin, insulin, fibroblast growth factor and heparin cell culture of mature stroma. A method of treating osteoporosis consists in intravenous drip administration of MSCs from 50 to 500 million in 50-100 ml of physiological saline.
В связи с тем, что фетальные донорские клетки являются плюрипотентными, они обладают высокой пролиферативной активностью, что наряду с высокой вариабельностью генома зачастую может привести к развитию злокачественных новообразований, в случае применения этих клеток парентеральным путем. При внутривенном капельном введении аутологичного материала, регенераторная эффективность этих клеток крайне мала за счет системного действия, относительно малого количества и неспособности преодолеть васкулярно-эндотелиальный барьер.Due to the fact that fetal donor cells are pluripotent, they have high proliferative activity, which, along with high variability of the genome, can often lead to the development of malignant neoplasms, if these cells are used parenterally. With intravenous drip of autologous material, the regenerative efficiency of these cells is extremely low due to the systemic effect, relatively small number and inability to overcome the vascular-endothelial barrier.
Заявляемый способ локального лечения дисплазии суставов является методом внутрисуставного введения клеточного материала в очаг деструкции ткани, что предполагает непосредственное взаимодействие клеточного трансплантата с окружающей тканью с экскрецией в межклеточное пространство всех противовоспалительных и ростовых факторов, а также прямой контакт с клеточным и внеклеточным тканевым микроокружением реципиента.The inventive method for the local treatment of joint dysplasia is the method of intraarticular injection of cellular material into the tissue destruction site, which involves direct interaction of the cell transplant with the surrounding tissue with excretion of all anti-inflammatory and growth factors into the intercellular space, as well as direct contact with the recipient's cellular and extracellular tissue microenvironment.
Задачей заявляемого изобретения является разработка высокоэффективного способа клеточной терапии дисплазий суставов для применения в ветеринарной медицине.The task of the invention is to develop a highly effective method of cell therapy for joint dysplasia for use in veterinary medicine.
Поставленная задача решается тем, что в изобретении «Биотрансплантат для лечения дисплазии суставов и способ его получения», при котором в биотрансплантанте содержатся мезенхимальные стволовые клетки (МСК) из аутологичного материала и согласно изобретению содержится от 5 млн. мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, предназначенных для введения во внутрисуставную сумку, причем биотрансплантан используется для лечения дисплазии суставов у собак. Используемые в изобретении «Биотрансплантат для лечения дисплазии суставов и способ его получения» мезенхимальные стволовые клетки (МСК), получают из аутологичного материала, который измельчают, ферментативно дезагрегируют и полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, причем согласно изобретению мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, получают из жирового биоптата аутологичного материала и культивируют в среде с добавлением пуллированной, обогащенной тромбоцитами плазмы крови.The problem is solved in that the invention "Biotransplant for the treatment of joint dysplasia and a method for its preparation", in which the biotransplant contains mesenchymal stem cells (MSCs) from autologous material and according to the invention contains from 5 million multipotent mesenchymal stromal cells for administration in the intraarticular bag, with a biotransplant used to treat joint dysplasia in dogs. Mesenchymal stem cells (MSCs) used in the invention, “Biograft for the treatment of joint dysplasia and a method for producing it,” are obtained from autologous material that is ground, enzymatically disaggregated and the resulting cell suspension is resuspended and cultured on growth medium, according to the invention, multipotent mesenchymal stromal cells, obtained from a fat biopsy of autologous material and cultured in a medium supplemented with a pulled, platelet-rich blood plasma.
Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.
Биоптат жировой ткани объемом 4-6 см3 промывается раствором D-PBS, в пропорции 1:2, для удаления примеси клеточных компонентов крови, далее биоптат гомогенезируется. Полученная гомогенная смесь из жировой ткани инкубируется в присутствии смеси ферментов в шейкере инкубаторе при 37°С и 200 об/мин в течение часа. После окончания инкубации непереваренный остаток жировой ткани тщательно пипетируется, отбирается водная фаза содержащая суспензию клеток от жировой фазы, и промывается средой, содержащей сыворотку в соотношении 1:1, центрифугированием в 50 мл пробирках при 800 g и +4°С в течение 10 мин. После первой промывки супернатант сливается, клеточный осадок ресуспендируется в 40 мл раствора Хэнкса и центрифугируется при 400 g и +4°С в течение 5 мин. После центрифугирования надосадок сливается и добавляется 1 мл полной питательной среды (DMEM : F12 (1:1), 5% пуллированной обогащенной тромбоцитами плазмы, penicillin, streptomicin, L-glutamine) и ресуспендируется. Количество ядросодержащих клеток (ЯСК) и их жизнеспособность определяется путем подсчета в камере Горяева с использованием Trypan blue 0,4%. Полученная суспензия клеток ММСК жировой ткани для дальнейшего культивирования засевается в культуральные флаконы площадью 25 см2, с плотностью посева 10-50×103 ЯСК/см2 в соответствующем объеме полной (ростовой) питательной среды при 37°С и 5% CO2. Через 24-48 часов неприкрепившиеся клетки удаляют и заменяют ростовую среду. В дальнейшем замену среды производят через каждые 2 дня.A biopsy sample of adipose tissue with a volume of 4-6 cm 3 is washed with a D-PBS solution, in a ratio of 1: 2, to remove impurities of the cellular components of the blood, and then the sample is homogenized. The resulting homogeneous mixture of adipose tissue is incubated in the presence of an enzyme mixture in a shaker incubator at 37 ° C and 200 rpm for an hour. After the incubation, the undigested residue of adipose tissue is thoroughly pipetted, the aqueous phase containing the suspension of cells from the fat phase is selected, and washed with medium containing serum in the ratio 1: 1 by centrifugation in 50 ml tubes at 800 g and + 4 ° С for 10 min. After the first wash, the supernatant is drained, the cell pellet is resuspended in 40 ml of Hanks solution and centrifuged at 400 g and + 4 ° C for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant is drained and 1 ml of complete nutrient medium (DMEM: F12 (1: 1), 5% pulled platelet-rich plasma, penicillin, streptomicin, L-glutamine) is added and resuspended. The number of nucleated cells (YSC) and their viability is determined by counting in a Goryaev chamber using Trypan blue 0.4%. The resulting suspension MMSC adipose tissue cells for further culturing sown in culture flasks of 25 cm 2, with a seeding density of NC 10-50 × 103 / cm2 in an appropriate volume of the total (growth) of the nutrient medium at 37 ° C and 5% CO2. After 24-48 hours, non-adherent cells are removed and the growth medium is replaced. Subsequently, the medium is replaced every 2 days.
Условия культивирования позволяют при многократном пассировании максимально наращивать гомогенную клеточную культуру недифференцированных ММСК.Cultivation conditions allow for repeated passage to maximize the homogeneous cell culture of undifferentiated MMSCs.
Условия культивирования позволяют сохранить мультипотентность культуры клеток.The cultivation conditions allow to maintain the multipotency of the cell culture.
Условия культивирования позволяют получить большое количество ММСК, необходимое для инъекции и формирования клеточного банка пациента, что обеспечивает воспроизводимость результатов лечения.Cultivation conditions allow to obtain a large number of MMSCs necessary for injection and formation of a patient’s cell bank, which ensures reproducibility of treatment results.
Способ лечения базируется на экспериментально доказанном факте противовоспалительных и регенеративных свойствах мультипотентных мезенхимальных стромальных клетках.The method of treatment is based on the experimentally proven fact of the anti-inflammatory and regenerative properties of multipotent mesenchymal stromal cells.
Динамика роста клеточной культуры ММСК из жировой ткани животного показана в таблице, где:The growth dynamics of the cell culture MMSC from the adipose tissue of the animal is shown in the table, where:
Т - общее количество клеток в культуре;T is the total number of cells in the culture;
L - количество живых клеток в культуре;L is the number of living cells in the culture;
D - количество мертвых клеток в культуре;D is the number of dead cells in the culture;
V - жизнеспособность.V is viability.
На Фиг. 1. показаны культуры ММСК 1 и 2-го пассажей:In FIG. 1. shows the culture of MMSK 1st and 2nd passages:
а) Пассаж 1, конфлуентная культура ММСК; отсутствуют морфологические признаки старения, отмечен упорядоченный рост культуры; фазовый контраст, увеличение ×100.a) Passage 1, the confluent culture of MMSK; there are no morphological signs of aging, an ordered growth of culture is noted; phase contrast, magnification × 100.
b) Пассаж 2, субконфлуентная культура ММСК; отсутствуют морфологические признаки старения, отмечен упорядоченный рост культуры; фазовый контраст, увеличение ×100.b) Passage 2, subconfluent culture of MMSC; there are no morphological signs of aging, an ordered growth of culture is noted; phase contrast, magnification × 100.
По достижении культурой 75-85% конфлюэнтности, монослой трипсинизируют и пересевают в новые культуральные флаконы. После получения нужной концентрации клеток, необходимых для инъекции, с высоким пролиферативным потенциалом и жизнеспособностью не менее 95% клетки в количестве 5 млн. ресуспендируют в 1 мл физиологического раствора. К концу культивирования клетки имеют фибробластоподобный фенотип, морфологические признаки старения культуры отсутствуют (фиг. 1.). Трансплантацию осуществляют в условиях хирургического отделения ветеринарной клиники. Суспензия мезенхимальных стволовых клеток под контролем ультразвукого аппарата (УЗИ) вводится во внутрисуставную сумку.After the culture reaches 75-85% confluency, the monolayer is trypsinized and reseeded into new culture bottles. After obtaining the desired concentration of cells necessary for injection, with a high proliferative potential and viability of at least 95%, cells in the amount of 5 million are resuspended in 1 ml of physiological saline. Towards the end of cultivation, the cells have a fibroblast-like phenotype, and there are no morphological signs of aging of the culture (Fig. 1.). Transplantation is carried out in the surgical department of a veterinary clinic. A suspension of mesenchymal stem cells under the control of an ultrasound apparatus (ultrasound) is inserted into the intraarticular bag.
Таким образом, в заявляемом способе лечения дисплазии суставов с использованием биотрансплантата, биотрансплантат содержит мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), полученные из жирового биоптата аутологичного происхождения, при этом ткань гомогенезируют, ферментируют колагеназой, полученную клеточную суспензию отмывают и культивируют в питательной среде, содержащей глютамин, гентамицин и 5% пулированной плазмы, обогащенной тромбоцитами, полученную от доноров того же вида. Способ лечения дисплазии суставов заключается во внутрисуставном введении 5 млн. ММСК в 1 мл физиологического раствора. Изобретение обеспечивает восстановление хрящевой ткани сустава, приводит к снижению воспалительных процессов, позволяющих улучшить двигательную активность пациента.Thus, in the claimed method for the treatment of joint dysplasia using a biotransplant, the biotransplant contains multipotent mesenchymal stromal cells (MMSCs) obtained from an autologous fat biopsy specimen, the tissue is homogenized, fermented with collagenase, the resulting cell suspension is washed and cultured in a nutrient medium, , gentamicin and 5% of platelet-rich plasma obtained from donors of the same species. A method of treating joint dysplasia is the intra-articular administration of 5 million MMSCs in 1 ml of physiological saline. The invention provides restoration of the cartilage tissue of the joint, leads to a decrease in inflammatory processes that improve the patient's motor activity.
ЛитератураLiterature
1. Csaki С., Matis U., Mobasheri A., Ye Н., Shakibaei М. Chondrogenesis, osteogenesis and adipogenesis of canine mesenchymal stem cells: a biochemical, morphological and ultrastructural study. Histochem Cell Biol. 2007; 128(6): 507-20.1. Csaki S., Matis U., Mobasheri A., Ye N., Shakibaei M. Chondrogenesis, osteogenesis and adipogenesis of canine mesenchymal stem cells: a biochemical, morphological and ultrastructural study. Histochem Cell Biol. 2007; 128 (6): 507-20.
2. Arends В., Vankelecom H., Vander Borght S., Roskams Т., Penning L.C., Rothuizen J., Spee B. The dog liver contains a "side population" of cells with hepatic progenitorlike characteristics. Stem Cells Dev. 2009; 18(2): 343-50.2. Arends B., Vankelecom H., Vander Borght S., Roskams T., Penning L.C., Rothuizen J., Spee B. The dog liver contains a "side population" of cells with hepatic progenitorlike characteristics. Stem Cells Dev. 2009; 18 (2): 343-50.
3. Горностаева C.H., Миогенная дифференцировка ультипотентных мезенхимальных стромальных клеток человека in vitro и in vivo. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва, 2006 г.3. Gornostaeva C.H., Myogenic differentiation of human ultipotent mesenchymal stromal cells in vitro and in vivo. Abstract of dissertation for the degree of candidate of biological sciences. Moscow, 2006
4. Bronckaers A., Hilkens P., Martens W., Gervois P., Ratajczak J., Struys Т., Lambrichts I. Mesenchymal stem/stromal cells as a pharmacological and therapeutic approach to accelerate angiogenesis. Pharmacol Ther. 2014; 143(2): 181-96.4. Bronckaers A., Hilkens P., Martens W., Gervois P., Ratajczak J., Struys T., Lambrichts I. Mesenchymal stem / stromal cells as a pharmacological and therapeutic approach to accelerate angiogenesis. Pharmacol Ther. 2014; 143 (2): 181-96.
5. Рябцева E.C., Кривенко С.И., Левин В.И., Луц Л.С., Белевцев М.В., Усс А.Л., Змачинский В.А. Мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани: характеристика и аспекты использования при трансплантации гемопоэтических клеток. Известия НАН Беларуси. 2006, 1: 81-87.5. Ryabtseva E.C., Krivenko S.I., Levin V.I., Lutz L.S., Belevtsev M.V., Uss A.L., Zmachinsky V.A. Mesenchymal stem cells of adipose tissue: characteristics and aspects of hematopoietic cell transplantation. Proceedings of the NAS of Belarus. 2006, 1: 81-87.
6. Herrmann R.P., Sturm M.J. Adult human mesenchymal stromal cells and the treatment of graft versus host disease. Stem Cells Cloning. 2014; 7:45-52.6. Herrmann R.P., Sturm M.J. Adult human mesenchymal stromal cells and the treatment of graft versus host disease. Stem Cells Cloning. 2014; 7: 45-52.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017103716A RU2659204C1 (en) | 2017-02-03 | 2017-02-03 | Bio transplant for the joints dysplasia treatment and method of its preparation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017103716A RU2659204C1 (en) | 2017-02-03 | 2017-02-03 | Bio transplant for the joints dysplasia treatment and method of its preparation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2659204C1 true RU2659204C1 (en) | 2018-06-28 |
Family
ID=62815327
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017103716A RU2659204C1 (en) | 2017-02-03 | 2017-02-03 | Bio transplant for the joints dysplasia treatment and method of its preparation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2659204C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2732150C1 (en) * | 2020-03-04 | 2020-09-11 | Общество с ограниченной ответственностью "Центр клеточных технологий" | Method for producing autologous thrombocyte lysate as a base for cellular biomedical preparations of veterinary medicine |
| CN114525245A (en) * | 2022-02-15 | 2022-05-24 | 江苏银丰生物工程有限公司 | CMM culture medium and application thereof |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998051317A1 (en) * | 1997-05-13 | 1998-11-19 | Osiris Therapeutics, Inc. | Osteoarthritis cartilage regeneration using human mesenchymal stem cells |
| RU2265442C1 (en) * | 2004-05-14 | 2005-12-10 | ЗАО "РеМеТэкс" | Biotransplant and method for treating the cases of osteoporosis |
| RU2298410C1 (en) * | 2005-09-12 | 2007-05-10 | ЗАО "РеМеТэкс" | Biotransplant and method for treatment of rheumatic and autoimmune diseases |
| RU2309756C1 (en) * | 2006-07-03 | 2007-11-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Транс-Технологии" | Method for treating false articulations due to transplantation of autologous mesenchymal stem cells and biotransplant for its application |
| WO2010111278A1 (en) * | 2009-03-23 | 2010-09-30 | The Texas A&M University System | Compositions of mesenchymal stem cells to regenerate bone |
| WO2016001845A1 (en) * | 2014-06-30 | 2016-01-07 | Tigenix S.A.U. | Mesenchymal stromal cells for treating rheumatoid arthritis |
-
2017
- 2017-02-03 RU RU2017103716A patent/RU2659204C1/en active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998051317A1 (en) * | 1997-05-13 | 1998-11-19 | Osiris Therapeutics, Inc. | Osteoarthritis cartilage regeneration using human mesenchymal stem cells |
| RU2265442C1 (en) * | 2004-05-14 | 2005-12-10 | ЗАО "РеМеТэкс" | Biotransplant and method for treating the cases of osteoporosis |
| RU2298410C1 (en) * | 2005-09-12 | 2007-05-10 | ЗАО "РеМеТэкс" | Biotransplant and method for treatment of rheumatic and autoimmune diseases |
| RU2309756C1 (en) * | 2006-07-03 | 2007-11-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Транс-Технологии" | Method for treating false articulations due to transplantation of autologous mesenchymal stem cells and biotransplant for its application |
| WO2010111278A1 (en) * | 2009-03-23 | 2010-09-30 | The Texas A&M University System | Compositions of mesenchymal stem cells to regenerate bone |
| WO2016001845A1 (en) * | 2014-06-30 | 2016-01-07 | Tigenix S.A.U. | Mesenchymal stromal cells for treating rheumatoid arthritis |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2732150C1 (en) * | 2020-03-04 | 2020-09-11 | Общество с ограниченной ответственностью "Центр клеточных технологий" | Method for producing autologous thrombocyte lysate as a base for cellular biomedical preparations of veterinary medicine |
| CN114525245A (en) * | 2022-02-15 | 2022-05-24 | 江苏银丰生物工程有限公司 | CMM culture medium and application thereof |
| CN114525245B (en) * | 2022-02-15 | 2023-12-12 | 江苏银丰生物工程有限公司 | CMM culture medium and application thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kolaparthy et al. | Adipose tissue-adequate, accessible regenerative material | |
| Brennan et al. | Pre-clinical studies of bone regeneration with human bone marrow stromal cells and biphasic calcium phosphate | |
| CN1860222A (en) | Stem cells for clinical and commercial uses | |
| WO2015004609A2 (en) | Adherent cells from placenta and use thereof in treatment of injured tendons | |
| JP6545690B2 (en) | Stem cells derived from trophoblast basal layer and cell therapeutic agent containing the same | |
| JP6193214B2 (en) | Method for producing dental pulp-derived pluripotent stem cells | |
| AU2013206755B2 (en) | Activating adipose-derived stem cells for transplantation | |
| CN103223194A (en) | Cartilage graft for cartilage injury repair and preparation method thereof | |
| Linon et al. | Engraftment of autologous bone marrow cells into the injured cranial cruciate ligament in dogs | |
| CN107376025B (en) | Preparation method and application of cell-scaffold composite material for cartilage injury repair | |
| RU2659204C1 (en) | Bio transplant for the joints dysplasia treatment and method of its preparation | |
| Maiti et al. | Isolation, Proliferation and Morphological Characteristics of Bone-Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells (BM-MSC) from Different Animal Species. | |
| CN112300986B (en) | Method for preparing adipose-derived mesenchymal stem cells by serum-free medium | |
| US9434923B2 (en) | Preparation of parental cell bank from foetal tissue | |
| Ninu et al. | Isolation, proliferation, characterization and in vivo osteogenic potential of bone-marrow derived mesenchymal stem cells (rBMSC) in rabbit model | |
| KR101649375B1 (en) | The method of manufacturing the transplantable spheroids of mixed cellular complexes for cell transplantation and the usage of the same | |
| WO2014203268A2 (en) | Method for isolation, purification and industrial scale expansion of equine adipose tissue derived mensenchymal stem cells | |
| CN114480261B (en) | Extraction and separation method of umbilical cord source bone stem cells | |
| Graide et al. | Enhancing autologous Equine Therapy: Innovative 3D Culture Method for Muscle-derived Progenitor Cells (mdP-Cells) | |
| Lee et al. | Autologous iPSC-and MSC-derived Chondrocyte Implants for Cartilage Repair in a Miniature Pig Model | |
| Voga et al. | ISOLATION OF LIVE CELLS FROM DIFFERENT MICE TISSUES UP TO NINE DAYS AFTER DEATH | |
| Pawitan | Advances in regenerative medicine: From stem cells to organoids | |
| AU2016244319A1 (en) | Cell free preparation and uses thereof | |
| WO2023063417A1 (en) | Method for suspension culture of adherent cells with stirring | |
| RU2404242C1 (en) | Method for faster formation of callus in mammals |