RU2626590C2

RU2626590C2 - Genetic design for expression of genes in cells of insects polypedilum vanderplanki

Info

Publication number: RU2626590C2
Application number: RU2015154352A
Authority: RU
Inventors: Такахиро Кикавада; Олег Александрович Гусев; Ришар Корнетт; Елена Ильясовна Шагимарданова; Окада Джун; Согаме Йоичиро; Александр Александрович Несмелов
Priority date: 2015-12-18
Filing date: 2015-12-18
Publication date: 2017-07-28
Also published as: RU2015154352A

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: present invention includes, in addition to the standard elements for the production and functioning of the presented genetic construct, the P121 promoter with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.

EFFECT: solution can be implemented in the industrial production of biotechnological products, scientific, medical and industrial activities through the use of known standard technical devices and equipment and can be used to produce deactivated inactivated biological components.

2 cl, 13 dwg, 1 tbl, 3 ex

Description

Предлагаемое изобретение относится к области биохимии и генной инженерии, а именно к области создания новой технологии хранения биоматериалов, и представляет собой основополагающий элемент этой технологии.The present invention relates to the field of biochemistry and genetic engineering, and in particular to the field of creating a new technology for storing biomaterials, and is a fundamental element of this technology.

Более детально, предлагаемое изобретение относится к области создания генетической конструкция для экспрессии генов в клетках насекомого Polypedilum vanderplanki, которая в составе разрабатываемой биотехнологии будет использована для консервации биоматериалов с целью их (биоматериалов) длительного хранения и транспортировки, например для консервации инактивируемых обезвоживанием ферментов.In more detail, the present invention relates to the field of creating a genetic construct for the expression of genes in insect cells Polypedilum vanderplanki, which, as part of the biotechnology being developed, will be used for preserving biomaterials for their long-term storage and transportation, for example, for preserving dehydration-deactivated enzymes.

В настоящее время существует насущная проблема в области хранения биоматериалов - существующие технологии, например криохранение, использование консервантов на стадии предоставления настоящего технического решения, исчерпали возможности улучшения и не удовлетворяют потребностям общества по ряду причин, например по сложности, дороговизне и низкой эффективности хранения биоматериалов, применяемых для широкого круга решения проблем здравоохранения и биотехнологий. Разработанное техническое решение в целом нацелено на создание нового метода хранения биоматериала посредством сохранения рекомбинантных белков в составе культуры клеток насекомого Polypedilum vanderplanki, способных к выживанию без воды (ангидробиозу). Разрабатываемая на указанном явлении ангидробиоза биотехнология предполагает резкое удешевление хранения биоматериала (например, белков) и независимость от глубокой заморозки. Основой предлагаемого подхода является (I) генетическая конструкция (экспрессионный вектор), содержащая в своем составе сильный промотор и (II) культуру клеток насекомого Polypedilum vanderplanki.Currently, there is an urgent problem in the field of biomaterial storage - existing technologies, such as cryopreservation, the use of preservatives at the stage of presenting the present technical solution, have exhausted the possibility of improvement and do not meet the needs of society for several reasons, for example, the complexity, high cost and low efficiency of storage of biomaterials for a wide range of solutions to health and biotechnology issues. The developed technical solution is generally aimed at creating a new method for storing biomaterial by preserving recombinant proteins in the culture of Polypedilum vanderplanki insect cells that can survive without water (anhydrobiosis). Biotechnology developed on the basis of the indicated anhydrobiosis phenomenon implies a sharp reduction in the cost of storing biomaterial (for example, proteins) and independence from deep freezing. The basis of the proposed approach is (I) a genetic construct (expression vector) containing in its composition a strong promoter and (II) a culture of Polypedilum vanderplanki insect cells.

Из исследованного уровня техники, а именно из научной литературы, известно, что наиболее крупным и сложно устроенным живым организмом, способным восстанавливать жизнедеятельность после полного высыхания (обезвоживания на воздухе до влажности менее 2%), является насекомое Polypedilum vanderplanki [1]. Выделенные из Polypedilum vanderplanki культуры клеток также способны переносить обезвоживание [2]. Данная способность Polypedilum vanderplanki и выделенных из него культур клеток обусловлена свойственным этому насекомому сложным сочетанием молекулярных факторов, защищающих структуру и активность клеточных компонентов при обезвоживании. В обезвоженном состоянии Polypedilum vanderplanki характеризуется высокой устойчивостью к неблагоприятным воздействиям. В частности, обезвоженные личинки насекомого сохраняют жизнеспособность при действии температуры плюс 102°C в течение 2 мин, получении дозы γ-радиации 3000 Гр [грэй] - более чем на два порядка выше летальных для млекопитающих доз гамма-излучения [1]. Кроме того, в обезвоженном состоянии личинки Polypedilum vanderplanki могут длительно (10 лет и более), храниться с сохранением жизнеспособности [3]. Культуры клеток Polypedilum vanderplanki являются единственными известными культурами клеток насекомых, которые обладают природной способностью сохранять жизнеспособность при обезвоживании. Способность сохранять жизнеспособность при обезвоживании сочетается в них (культурах клеток Polypedilum vanderplanki) с эволюционно развитой системой экспрессии (реализации генетической информации последовательности ДНК в функциональный продукт - нуклеиновые кислоты или белки). Развитая система экспрессии клеток Polypedilum vanderplanki способна обеспечить полное созревание белков эукариот. В клетках Polypedilum vanderplanki могут быть получены и законсервированы путем обезвоживания биотехнологические продукты, в том числе инактивируемые обезвоживанием (сушкой) ферменты. По свойствам и особенностям клетки Polypedilum vanderplanki являются наиболее пригодной средой для получения инактивируемых обезвоживанием биотехнологических продуктов (например, ферментов). С учетом вышесказанного разработка и использование генетических конструкций для экспрессии чужеродных генов и получения биотехнологических продуктов в клетках Polypedilum vanderplanki является основой для создания нового способа их (биотехнологических продуктов) консервации, хранения и транспортировки. Основное требование к генетическим конструкциям, предназначенным для использования в клетках Polypedilum vanderplanki - обеспечение экспрессии чужеродных генов. Экспрессия генов обеспечивается особыми участками ДНК - промоторами, которые не являются универсальными, т.к. функционируют в определенных клетках или нескольких типах клеток [4].From the studied prior art, namely from the scientific literature, it is known that the largest and most complex living organism, capable of restoring life after complete drying (dehydration in air to a moisture content of less than 2%), is the insect Polypedilum vanderplanki [1]. Cell cultures isolated from Polypedilum vanderplanki are also able to tolerate dehydration [2]. This ability of Polypedilum vanderplanki and cell cultures isolated from it is due to the complex combination of molecular factors characteristic of this insect that protects the structure and activity of cellular components during dehydration. In the dehydrated state, Polypedilum vanderplanki is highly resistant to adverse effects. In particular, dehydrated insect larvae remain viable under the influence of temperature plus 102 ° C for 2 min, receiving a dose of γ radiation of 3000 Gy [gray] - more than two orders of magnitude higher than lethal doses of gamma radiation for mammals [1]. In addition, in the dehydrated state, Polypedilum vanderplanki larvae can be stored for a long time (10 years or more) with preservation of viability [3]. Polypedilum vanderplanki cell cultures are the only known insect cell cultures that have a natural ability to remain viable during dehydration. The ability to maintain viability during dehydration is combined in them (cell cultures of Polypedilum vanderplanki) with an evolutionarily developed system of expression (the implementation of genetic information of a DNA sequence into a functional product - nucleic acids or proteins). The developed cell expression system Polypedilum vanderplanki is able to ensure complete maturation of eukaryotic proteins. In Polypedilum vanderplanki cells, biotechnological products, including enzymes inactivated by dehydration (drying), can be obtained and preserved by dehydration. By properties and features, Polypedilum vanderplanki cells are the most suitable medium for the production of biotechnological products (for example, enzymes) inactivated by dehydration. Based on the foregoing, the development and use of genetic constructs for the expression of foreign genes and the production of biotechnological products in Polypedilum vanderplanki cells is the basis for creating a new method for their (biotechnological products) preservation, storage and transportation. The main requirement for genetic constructs intended for use in Polypedilum vanderplanki cells is the provision of the expression of foreign genes. Gene expression is provided by special sections of DNA - promoters that are not universal, because function in certain cells or several types of cells [4].

Из исследованного заявителем уровня техники выявлено техническое решение под названием «Полученные из насекомых промоторы для экспрессии чужеродных белков в клетках насекомых» [5], сущность которого заключается в выделении полинуклеотидных последовательностей (в том числе регуляторных), расположенных в ДНК перед генами, кодирующими белки-гексамерины (запасающие белки насекомых), в том числе полинуклеотидных последовательностей, принадлежащих личинкам насекомых, в том числе личинкам бабочки Trichoplusia ni. По [5], указанные полинуклеотидные последовательности могут быть использованы в сочетании с другими регуляторными последовательностями, включая регуляторную последовательность промотора белка полиэдрина (структурного белка бакуловирусов насекомых) или промотора белка OOP («OmpA-OmpF porine»). По [5], указанные нуклеотидные последовательности могут быть использованы для получения векторов экспрессии (генетических конструкций), в том числе векторов в виде плазмиды или векторов на основе вирусов (в том числе баукловирусов). По [5], указанные векторы экспрессии могут быть дополнены последовательностью, кодирующей белок. Указанные в [5] векторы предлагается использовать для трансфекции или трансформации клеток, в том числе клеток насекомых (в том числе клеточных культур Sf9 или Sf21), а также для трансфекции, инфекции или трансформации личинок насекомых. Решение [5] содержит также описание способа получения рекомбинантных белков в клетках насекомых или личинках насекомых с использованием указанных в [5] векторов, в том числе с использованием личинок насекомых в качестве биофабрик для получения рекомбинантных белков.From the prior art examined by the applicant, a technical solution was identified under the name “Promoter derived from insects for the expression of foreign proteins in insect cells” [5], the essence of which is to isolate polynucleotide sequences (including regulatory) located in DNA in front of genes encoding protein hexamerins (insect storage proteins), including polynucleotide sequences belonging to insect larvae, including the larvae of the butterfly Trichoplusia ni. According to [5], these polynucleotide sequences can be used in combination with other regulatory sequences, including the regulatory sequence of the polyhedrin protein promoter (a structural protein of insect baculoviruses) or the OOP protein promoter ("OmpA-OmpF porine"). According to [5], these nucleotide sequences can be used to obtain expression vectors (genetic constructs), including vectors in the form of plasmids or vectors based on viruses (including baucloviruses). According to [5], these expression vectors can be supplemented by a protein coding sequence. The vectors indicated in [5] are proposed to be used for transfection or transformation of cells, including insect cells (including Sf9 or Sf21 cell cultures), as well as for transfection, infection, or transformation of insect larvae. Solution [5] also contains a description of the method for producing recombinant proteins in insect cells or insect larvae using the vectors specified in [5], including using insect larvae as biofactories for producing recombinant proteins.

Недостатком [5] является низкая активность описанных в [5] промоторов в клетках Polypedilum vanderplanki. Промоторы генов, кодирующих белки – гексамерины, не способны обеспечить достаточную, например для практического применения, экспрессию чужеродных генов в клетках Polypedilum vanderplanki вследствие того, что совокупный вклад кодирующих белки-гексамерины генов в общую экспрессию генов Polypedilum vanderplanki составляет весьма малую величину - не более 0,05% [1]. Следствием указанного недостатка является невозможность использования [5] для экспрессии чужеродных генов в клетках Polypedilum vanderplanki, что существенно ограничивает область применения известного способа [5].The disadvantage of [5] is the low activity of the promoters described in [5] in Polypedilum vanderplanki cells. The promoters of the genes encoding the hexamerins proteins are not capable of providing, for example, for practical use, the expression of foreign genes in Polypedilum vanderplanki cells due to the fact that the combined contribution of the genes encoding the hexamerin proteins is very small - no more than 0 , 05% [1]. A consequence of this drawback is the inability to use [5] for the expression of foreign genes in Polypedilum vanderplanki cells, which significantly limits the scope of the known method [5].

Из исследованного заявителем уровня техники выявлено также техническое решение под названием «Вектор для переноса и вакцина против туберкулеза» [6]. Сущность данного технического решения заключается в векторе, в который встроен сдвоенный промотор, содержащий промотор полиэдрина - структурного белка бакуловирусов насекомых, и промотор CMV (цитомегаловируса). Решение [6] аналогично заявленному техническому решению в части использования промотора бакуловирусов насекомых.From the prior art investigated by the applicant, a technical solution was also identified under the name “Transfer Vector and Tuberculosis Vaccine” [6]. The essence of this technical solution lies in the vector, in which the double promoter is inserted, containing the polyhedrin promoter, a structural protein of insect baculoviruses, and the CMV (cytomegalovirus) promoter. Solution [6] is similar to the claimed technical solution regarding the use of the promoter of insect baculoviruses.

Кроме описания указанного промотора, решение [6] содержит описание иных элементов вектора. Так, вектор по [6] содержит «слитую» (совмещающую различные фрагменты) ДНК, содержащую (А) фрагмент ДНК кодирующий белок-антиген Mycobacterium tuberculosis и (В) фрагмент ДНК гена, кодирующего аминокислотную последовательность, указанную в [6]. По [6], указанный вектор может содержать указанную «слитую» ДНК, полученную из геномной ДНК штамма М. tuberculosis H37Rv. По [6], указанный вектор может содержать также вышеуказанный фрагмент ДНК (А), полученный посредством ПЦР с геномной ДНК, выделенной из штамма M. tuberculosis H37Rv и вышеуказанный фрагмент ДНК (В), представляющий собой фрагмент, полученный посредством ПЦР с pBACsurf-1 в качестве матрицы (оба фрагмента должны быть расщеплены после ПЦР). В решении [6] описана также вакцина против туберкулеза, содержащая рекомбинантный вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV), содержащего указанные «слитую» ДНК и сдвоенный промотор. По [6], рекомбинантый вирус также может содержать «слитую» ДНК, полученную вышеуказанными способами с использованием геномной ДНК штамма М. tuberculosis H37Rv.In addition to the description of the indicated promoter, the solution [6] contains a description of other elements of the vector. Thus, the vector according to [6] contains “fused” (combining various fragments) DNA containing (A) a DNA fragment encoding a protein antigen of Mycobacterium tuberculosis and (B) a DNA fragment of a gene encoding the amino acid sequence specified in [6]. According to [6], the specified vector may contain the specified "fused" DNA obtained from the genomic DNA of a strain of M. tuberculosis H37Rv. According to [6], the indicated vector may also contain the above DNA fragment (A) obtained by PCR with genomic DNA isolated from M. tuberculosis H37Rv strain and the above DNA fragment (B), which is a fragment obtained by PCR with pBACsurf-1 as a matrix (both fragments must be cleaved after PCR). The solution [6] also described a vaccine against tuberculosis containing the recombinant nuclear polyhedrosis virus Autographa californica (AcNPV) containing the indicated “fused” DNA and a double promoter. According to [6], a recombinant virus may also contain “fused” DNA obtained by the above methods using the genomic DNA of M. tuberculosis H37Rv strain.

По [6], вышеуказанный бакуловирусный промотор может быть выбран из промотора полиэдрина, промотора p10, промотора IE1, промотора IE2, промотора р35, промотора р39 и промотора gр64. Недостатком [6] является отсутствие достоверного сходства (подобия) указанных в [6] промоторов к последовательности ДНК Polypedilum vanderplanki. Следствием приведенного недостатка является низкая, например недостаточная для практического применения, активность указанных в [6] промоторов в клетках Polypedilum vanderplanki. Таким образом, указанные в [6] промоторы не могут быть применены в клетках Polypedilum vanderplanki, что ограничивает область применения [6].According to [6], the aforementioned baculovirus promoter can be selected from the polyhedrin promoter, p10 promoter, IE1 promoter, IE2 promoter, p35 promoter, p39 promoter and gp64 promoter. The disadvantage of [6] is the lack of significant similarity (similarity) of the promoters indicated in [6] to the DNA sequence of Polypedilum vanderplanki. A consequence of this drawback is the low, for example, insufficient for practical use, activity of the promoters indicated in [6] in Polypedilum vanderplanki cells. Thus, the promoters indicated in [6] cannot be used in Polypedilum vanderplanki cells, which limits the scope [6].

Из исследованного заявителем уровня техники выявлено также техническое решение под названием «Векторы экспрессии насекомых» [7], сущность которого заключается в челночном векторе для трансформации клеток насекомых (челночный вектор - вектор, функциональный в клетках не менее чем двух различных организмов). Вектор по способу [7] предназначен для экспрессии исключительно в клетках насекомых. По совокупности совпадающих признаков способ [7] наиболее близок к заявленному техническому решению и выбран заявителем в качестве прототипа. Вектор по [7] состоит из 1) прокариотической (бактериальной) точки начала репликации; 2) промотора насекомых, гомологичного (сходного) промотору «immediate early baculovirus promoter» (незамедлительный ранний промотор бакуловируса) и способного функционировать в качестве указанного промотора; 3) прокариотного (бактериального) промотора; 4) селективного генетического маркера, способного обеспечить устойчивость к антибиотику блеомицинового (флеомицинового) типа. По [7] вектор может быть представлен в следующих вариантах: 1) вектор, содержащий последовательность прокариотного промотора в виде скрытого (криптического) промотора в промоторе насекомых; 2) вектор, обеспечивающий устойчивость к антибиотику блеомицинового (флеомицинового) ряда, а именно к антибиотику зеоцин; 3) вектор, содержащий участок вставки гетерологичной (чужеродной) ДНК, в том числе под контролем второго промотора насекомых, в том числе со встроенной гетерологичной ДНК. В техническом решении [7] описаны варианты нуклеотидных последовательностей промотора насекомых, в том числе элемента IE2B, пары элементов GATA-IE2B, и других. По [7], указанный вектор может быть дополнен элементами, определяемыми как транспозон (участок ДНК, способный к передвижению и размножению в пределах генома), в том числе вектор может быть дополнен транспозонами, содержащими селективный генетический маркер, участок вставки гетерологичной ДНК и индуцируемый ген транспозазы (фермента, который связывает одноцепочечную ДНК и встраивает ее в геномную ДНК). Решение [7] описывает также трансформированные указанным вектором клетки насекомых (в том числе трансформированные стабильно), метод трансформации клеток насекомых, варианты метода увеличения числа копий гетерологичной ДНК в клетках. По [7], трансформированные указанным вектором клетки используются для производства, в том числе 1) гетерологичных белков из группы металлотрансферинов и их биологически активных производных; 2) гормонов насекомых, а именно белков ионного транспорта.From the prior art investigated by the applicant, a technical solution called “Insect Expression Vectors” [7] was also identified, the essence of which is a shuttle vector for transforming insect cells (a shuttle vector is a vector functional in the cells of at least two different organisms). The vector according to the method [7] is intended for expression exclusively in insect cells. By the combination of matching features, the method [7] is closest to the claimed technical solution and is selected by the applicant as a prototype. The vector according to [7] consists of 1) a prokaryotic (bacterial) point of origin of replication; 2) an insect promoter homologous (similar) to the “immediate early baculovirus promoter” promoter (immediate early baculovirus promoter) and capable of functioning as said promoter; 3) prokaryotic (bacterial) promoter; 4) a selective genetic marker that can provide antibiotic resistance to the bleomycin (phleomycin) type. According to [7], a vector can be represented in the following variants: 1) a vector containing the sequence of a prokaryotic promoter in the form of a hidden (cryptic) promoter in an insect promoter; 2) a vector that provides resistance to the antibiotic bleomycin (phleomycin) series, namely, the antibiotic zeocin; 3) a vector containing a heterologous (foreign) DNA insertion site, including under the control of a second insect promoter, including with built-in heterologous DNA. The technical solution [7] describes variants of the nucleotide sequences of the insect promoter, including the IE2B element, a pair of GATA-IE2B elements, and others. According to [7], this vector can be supplemented with elements defined as transposon (a DNA region capable of movement and reproduction within the genome), including the vector can be supplemented with transposons containing a selective genetic marker, a heterologous DNA insertion site, and an inducible gene transposases (an enzyme that binds single-stranded DNA and integrates it into genomic DNA). Solution [7] also describes insect cells transformed by the indicated vector (including stably transformed), a method for transforming insect cells, variants of a method for increasing the number of copies of heterologous DNA in cells. According to [7], cells transformed with this vector are used to produce, including 1) heterologous proteins from the group of metallotransferins and their biologically active derivatives; 2) insect hormones, namely, proteins of ion transport.

Недостатком прототипа [7] является отсутствие промотора с достоверным сходством (подобием) к последовательности ДНК Polypedilum vanderplanki. Последствием недостатка прототипа является подтвержденная экспериментально (см. Пример первый) низкая, недостаточная для практического применения, активность его (прототипа) промотора в клетках Polypedilum vanderplanki. Низкая активность промотора прототипа [7] делает его неприменимым для экспрессии генов в клетках Polypedilum vanderplanki, существенно ограничивает область его (прототипа) применения, например, для получения биотехнологических продуктов, например инактивируемых обезвоживанием ферментов.The disadvantage of the prototype [7] is the lack of a promoter with significant similarity (similarity) to the DNA sequence of Polypedilum vanderplanki. A consequence of the lack of a prototype is experimentally confirmed (see Example one) low, insufficient for practical use, activity of its (prototype) promoter in Polypedilum vanderplanki cells . The low activity of the prototype promoter [7] makes it inapplicable for gene expression in Polypedilum vanderplanki cells , significantly limits the scope of its (prototype) application, for example, for the production of biotechnological products, for example, enzymes deactivated by dehydration.

Целью заявленного технического решения является создание генетической конструкции, обеспечивающей экспрессию чужеродных генов в культуре клеток насекомого Polypedilum vanderplanki, расширение возможностей консервации инактивируемых обезвоживанием биотехнологических продуктов.The purpose of the claimed technical solution is to create a genetic construct that ensures the expression of foreign genes in the insect cell culture Polypedilum vanderplanki, expanding the possibilities of preservation of biotechnological products inactivated by dehydration.

Сущностью заявленного технического решения является генетическая конструкция, обеспечивающая экспрессию чужеродных генов в культуре клеток насекомого Polypedilum vanderplanki.The essence of the claimed technical solution is the genetic design that provides the expression of foreign genes in the insect cell culture Polypedilum vanderplanki.

Заявленные цели достигаются тем, что создают генетическую конструкцию, включающую выделенный из последовательности ДНК Polypedilum vanderplanki промотор Р121 с нуклеотидной последовательностью SEQ ID: 1. Промотор Р121 может быть заменен на промотор Р-II с нуклеотидной последовательностью SEQ ID: 2.The stated goals are achieved by creating a genetic construct comprising the P121 promoter isolated from the Polypedilum vanderplanki DNA sequence with the nucleotide sequence of SEQ ID: 1. The P121 promoter can be replaced with the P-II promoter with the nucleotide sequence of SEQ ID: 2.

Заявленное техническое решение иллюстрируется следующими материалами, оформленными в соответствии со стандартами ВОИС.The claimed technical solution is illustrated by the following materials, designed in accordance with WIPO standards.

Фиг. 1 - Нуклеотидная последовательность промотора Р121.FIG. 1 - The nucleotide sequence of the promoter P121.

Фиг. 2 - Нуклеотидные последовательности праймеров для получения промотора Р121.FIG. 2 - Nucleotide sequences of primers to obtain the P121 promoter.

Фиг. 3 - Нуклеотидные последовательности праймеров для получения фрагмента ДНК с геном GFP.FIG. 3 - Nucleotide sequences of primers to obtain a DNA fragment with the GFP gene.

Фиг. 4 - Нуклеотидные последовательности праймеров для замены гена устойчивости к антибиотику зеоцин на ген устойчивости к антибиотику канамицин в конструкции plZ/V5-His.FIG. 4 - Nucleotide sequences of primers for replacing the zeocin antibiotic resistance gene with the kanamycin antibiotic resistance gene in the plZ / V5-His construct.

Фиг. 5 - Физическая карта генетической конструкции pP121topo2K-GFP, где: 1 - промотор Р121; 2…4 - сайты распознавания ферментов рестрикции Bgl II, Pst I и BamH I соответственно; 5 - ген GFP; 6 - сайт распознавания фермента рестрикции Xba I; 7 - точка начала репликации PUC; 8 - бактериальный промотор Т7; 9 - сайт распознавания фермента рестрикции Pst I; 10 - ген устойчивости к антибиотику канамицину; 11…13 - сайты распознавания ферментов рестрикции Sma I, Sa II, EcoR I соответственно.FIG. 5 - Physical map of the genetic structure of pP121topo2K-GFP, where: 1 - promoter P121; 2 ... 4 - recognition sites of restriction enzymes Bgl II, Pst I and BamH I, respectively; 5 - GFP gene; 6 - site recognition of the restriction enzyme Xba I; 7 - point of origin of PUC replication; 8 - bacterial promoter T7; 9 - recognition site of the restriction enzyme Pst I; 10 - antibiotic resistance gene kanamycin; 11 ... 13 - recognition sites of restriction enzymes Sma I, Sa II, EcoR I, respectively.

Фиг. 6 - Нуклеотидные последовательности праймеров, используемых для ПЦР клонов E. coli.FIG. 6 - Nucleotide sequences of primers used for PCR of E. coli clones.

Фиг. 7 - Фотография флюоресценции культуры клеток Pv11, экспрессирующих ген GFP после трансфекции конструкцией pP121topo2K-GFP.FIG. 7 - Fluorescence photograph of a Pv11 cell culture expressing the GFP gene after transfection with the pP121topo2K-GFP construct.

Фиг. 8 - Нуклеотидные последовательности праймеров для получения промотора Р-II.FIG. 8 - Nucleotide sequences of primers to obtain the promoter P-II.

Фиг. 9 - Сравнение нуклеотидных последовательностей промотора Р-II и промотора Р121; отличающиеся нуклеотиды выделены серым цветом, отсутствующие в одной из последовательностей нуклеотиды обозначены дефисами.FIG. 9 - Comparison of the nucleotide sequences of the promoter P-II and the promoter P121; differing nucleotides are grayed out; nucleotides that are absent in one of the sequences are indicated by hyphens.

Фиг. 10 - Фотография флюоресценции культуры клеток Pv11, экспрессирующих ген GFP после трансфекции конструкцией рР121-II (выделены стрелками).FIG. 10 - Fluorescence photograph of a culture of Pv11 cells expressing the GFP gene after transfection with the pP121-II construct (highlighted by arrows).

Фиг. 11 - Нуклеотидные последовательности праймеров для получения фрагментов ДНК с промотором Р121 (праймеры I, II), геном RFP (праймеры III, IV), участка генетической конструкции pcDNA5-FRT (праймеры V, VI).FIG. 11 - Nucleotide sequences of primers for obtaining DNA fragments with the P121 promoter (primers I, II), the RFP gene (primers III, IV), the pcDNA5-FRT genetic construct site (primers V, VI).

Фиг. 12 - физическая карта генетической конструкции pcDNA-P121-RFP, где: 1 - промотор Р121; 7 - точка начала репликации PUC, 14 - ген RFP; 15 - ген устойчивости к антибиотику гигромицину; 16 - ген устойчивости к антибиотику ампициллину; 17 - бактериальный промотор blaFIG. 12 is a physical map of the genetic construction of pcDNA-P121-RFP, where: 1 is the P121 promoter; 7 - the beginning point of PUC replication, 14 - RFP gene; 15 - gene for antibiotic resistance to hygromycin; 16 - antibiotic resistance gene ampicillin; 17 - bacterial promoter bla

Фиг. 13 - фотография флюоресценции культуры клеток Pv11, экспрессирующих ген RFP после трансфекции конструкцией pcDNA-P121-RFPFIG. 13 is a fluorescence photograph of a culture of Pv11 cells expressing the RFP gene after transfection with the pcDNA-P121-RFP construct

Нуклеотдиные последовательности промоторов Р121 и PII на электронном носителе (SEQ ID: 1 и SEQ ID: 2 соответственно).The nucleotide sequences of the P121 and PII promoters on electronic media (SEQ ID: 1 and SEQ ID: 2, respectively).

Осуществление заявленного технического решения демонстрируется следующими примерами:The implementation of the claimed technical solution is demonstrated by the following examples:

ПРИМЕР ПЕРВЫЙ, демонстрирующий процесс получения генетической конструкции, включающей промотор Р121EXAMPLE FIRST, demonstrating the process of obtaining a genetic construct comprising the P121 promoter

Промотор Р121 выбран на основе экспериментальных данных об экспрессии генов в Polypedilum vanderplanki [1], как обеспечивающий наиболее высокий уровень конститутивной (постоянной) экспрессии генов: находящийся под управлением Р121 ген Pv.00443 является наиболее высокоэкспрессируемым геном в личинках Polypedilum vanderplanki [1]. Из современного уровня техники не выявлено промоторов и иных известных нуклеотидных последовательностей с достоверным сходством к промотору Р121.The P121 promoter was selected on the basis of experimental data on gene expression in Polypedilum vanderplanki [1], as it provides the highest level of constitutive (constant) gene expression: the Pv.00443 gene controlled by P121 is the most highly expressed gene in Polypedilum vanderplanki larvae [1]. Promoters and other known nucleotide sequences with significant similarity to the P121 promoter have not been identified from the state of the art.

Получают экземпляры насекомого Polypedilum vanderplanki, например, путем культивирования в лабораторных условиях. Из Polypedilum vanderplanki (например, из личинок) выделяют общую ДНК, например, с использованием специализированного коммерческого набора Nucleospin tissue kit (производства фирмы Macherey Nagel, Германия). Нуклеотидная последовательность промотора Р121 приведена на Фиг. 1. Специфический фрагмент ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность промотора Р121, получают в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием общей ДНК Polypedilum vanderplanki в качестве матрицы. Для ПЦР (здесь и далее в тексте) используют высокоточную полимеразу, например полимеразу Q5 производства фирмы New England Biolabs, США, и праймеры с последовательностью по Фиг. 2 (I, II). На Фиг. 2 приведены нуклеотидные последовательности используемых для получения промотора Р121 праймеров. Polypedilum vanderplanki insect instances are obtained , for example, by cultivation under laboratory conditions. Total DNA is isolated from Polypedilum vanderplanki (e.g., from larvae), for example, using the specialized commercial Nucleospin tissue kit (manufactured by Macherey Nagel, Germany). The nucleotide sequence of the P121 promoter is shown in FIG. 1. A specific DNA fragment containing the nucleotide sequence of the P121 promoter is obtained in a polymerase chain reaction (PCR) using common Polypedilum vanderplanki DNA as a template. For PCR (hereinafter in the text), high-precision polymerase, for example, Q5 polymerase manufactured by New England Biolabs, USA, and primers with the sequence of FIG. 2 (I, II). In FIG. 2 shows the nucleotide sequences used to obtain the P121 primer promoter.

Для проверки (доказательства) наличия экспрессии чужеродного гена в клетках Polypedilum vanderplanki в качестве модели используют ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок (известный ген GFP). Получают фрагмент ДНК с геном GFP, например, путем ПЦР, используя в качестве матрицы ДНК, содержащую ген GFP (например, плазмиду plZT/V5-His производства фирмы Thermo Fisher Scientific, США) и праймеры, например, по Фиг. 3 (I, II). На Фиг. 3 приведены нуклеотидные последовательности используемых для получения фрагмента ДНК с геном GFP праймеров.To verify (evidence) the presence of foreign gene expression in Polypedilum vanderplanki cells, a gene encoding a green fluorescent protein (known GFP gene) is used as a model. A DNA fragment with the GFP gene is obtained, for example, by PCR using a DNA containing the GFP gene (for example, plasmid plZT / V5-His manufactured by Thermo Fisher Scientific, USA) and primers, for example, as shown in FIG. 3 (I, II). In FIG. Figure 3 shows the nucleotide sequences used to obtain the DNA fragment with the GFP primer gene.

Получают несущий элемент заявляемой генетической конструкции, а именно модифицированную генетическую конструкцию plZ/V5-His (производства фирмы Thermo Fisher Scientific, США). Модификацию генетической конструкции plZ/V5-His выполняют путем замены гена устойчивости к антибиотику зеоцин на ген устойчивости к антибиотику канамицин. Замену гена устойчивости проводят известным путем ПЦР генетических конструкций plZ/V5-His и pTagRFP-N (производства фирмы «Евроген», Россия) с использованием праймеров по Фиг. 4 (I, II) и соединения полученных фрагментов ДНК методом Гибсона [8], например с использованием коммерческого набора Gibson Assembly (производства фирмы New England Biolabs, США) в стандартных условиях, в соответствии с рекомендациями производителя. На Фиг. 4 приведены нуклеотидные последовательности праймеров, используемых для замены гена устойчивости к антибиотику зеоцин на ген устойчивости к антибиотику канамицин в конструкции plZ/V5-His. Таким образом, заменой гена устойчивости получают промежуточную генетическую конструкцию, являющуюся несущим элементом заявляемой генетической конструкции.A support element of the claimed genetic construct is obtained, namely a modified plZ / V5-His genetic construct (manufactured by Thermo Fisher Scientific, USA). Modification of the plZ / V5-His genetic construct is performed by replacing the zeocin antibiotic resistance gene with the kanamycin antibiotic resistance gene. The resistance gene is replaced by the known PCR method of the plZ / V5-His and pTagRFP-N genetic constructs (manufactured by Eurogen, Russia) using the primers of FIG. 4 (I, II) and compounds of the obtained DNA fragments by the Gibson method [8], for example, using the Gibson Assembly commercial kit (manufactured by New England Biolabs, USA) under standard conditions, in accordance with the manufacturer's recommendations. In FIG. Figure 4 shows the nucleotide sequences of the primers used to replace the zeocin antibiotic resistance gene with the kanamycin antibiotic resistance gene in the plZ / V5-His construct. Thus, by replacing the resistance gene, an intermediate genetic construct is obtained, which is the supporting element of the claimed genetic construct.

Полученную промежуточную генетическую конструкцию обрабатывают ферментами рестрикции EcoRI и XbaI в стандартных условиях в соответствии с рекомендациями производителя (фирмы New England Biolabs, США). Непосредственно после обработки ферментами рестрикции в конструкцию встраивают ранее полученные фрагменты ДНК, содержащие промотор Р121 и ген GFP. The resulting intermediate genetic construct is treated with restriction enzymes EcoRI and XbaI under standard conditions in accordance with the manufacturer's recommendations (New England Biolabs, USA). Immediately after treatment with restriction enzymes, the previously obtained DNA fragments containing the P121 promoter and the GFP gene are inserted into the construct.

Встраивание выполняют методом Гибсона [8], например, с использованием коммерческого набора Gibson Assembly (производства фирмы New England Biolabs, США) в стандартных условиях в соответствии с рекомендациями производителя. По завершении описанных действий получают генетическую конструкцию pP121topo2K-GFP, Фиг. 5. На Фиг. 5 приведена физическая карта генетической конструкции pP121topo2K-GFP, где: 1 - промотор Р121; 2…4 - сайты распознавания ферментов рестрикции Bgl II, Pst I и BamH I соответственно; 5 - ген GFP; 6 - сайт распознавания фермента рестрикции Xba I; 7 - точка начала репликации PUC; 8 - бактериальный промотор Т7; 9 - сайт распознавания фермента рестрикции Pst I; 10 - ген устойчивости к антибиотику канамицину; 11…13 - сайты распознавания ферментов рестрикции Sma I, Sa II, EcoR I соответственно.Embedding is performed by the Gibson method [8], for example, using a commercial Gibson Assembly kit (manufactured by New England Biolabs, USA) under standard conditions in accordance with the manufacturer's recommendations. Upon completion of the described steps, the pP121topo2K-GFP genetic construct is obtained, FIG. 5. In FIG. 5 shows a physical map of the genetic construct pP121topo2K-GFP, where: 1 - the promoter P121; 2 ... 4 - recognition sites of restriction enzymes Bgl II, Pst I and BamH I, respectively; 5 - GFP gene; 6 - site recognition of the restriction enzyme Xba I; 7 - point of origin of PUC replication; 8 - bacterial promoter T7; 9 - recognition site of the restriction enzyme Pst I; 10 - antibiotic resistance gene kanamycin; 11 ... 13 - recognition sites of restriction enzymes Sma I, Sa II, EcoR I, respectively.

На Фиг. 5 основным элементом конструкции pP121topo2K-GFP является промотор Р121, обеспечивающий экспрессию встроенных в конструкцию генов (в приведенном ПРИМЕРЕ ПЕРВОМ - гена GFP). Конструкция pP121topo2K-GFP содержит также дополнительные элементы, которые известны из существующего уровня техники и не являются обязательными: 10 - ген, обеспечивающий устойчивость клеток к антибиотику канамицину для селекции несущих генетическую конструкцию клеток стандартным способом [9] (см. далее в тексте ПРИМЕРА ПЕРВОГО); 7 - точка начала репликации (копирования) в клетках E. coli (PUC-точку); 8 - промотор Т7. Элементы 7 и 8 обеспечивают копирование конструкции pP121topo2K-GFP в клетках E. coli и облегчают ее получение [9] (см. далее в тексте ПРИМЕРА ПЕРВОГО); 2…4, 6, 9, 11…13 - сайты распознавания ферментов рестрикции для манипуляций с генетической конструкцией [10].In FIG. 5, the main element of the pP121topo2K-GFP construct is the P121 promoter, which provides expression of the genes integrated into the construct (in the EXAMPLE ONE, the GFP gene). The construction of pP121topo2K-GFP also contains additional elements that are known from the prior art and are not required: 10 — a gene that provides resistance of cells to the antibiotic kanamycin for selection of cells carrying the genetic construction of cells in a standard way [9] (see further in the EXAMPLE FIRST) ; 7 - the start point of replication (copying) in E. coli cells (PUC-point); 8 - T7 promoter. Elements 7 and 8 provide copying of the pP121topo2K-GFP construct in E. coli cells and facilitate its preparation [9] (see further in the text of EXAMPLE FIRST); 2 ... 4, 6, 9, 11 ... 13 - recognition sites of restriction enzymes for manipulations with the genetic construct [10].

Полученную генетическую конструкцию pP121topo2K-GFP вводят в клетки E. coli (выполняют трансфекцию), например, с использованием известного способа теплового шока, например при температуре плюс 42°С, в течение 45 сек. После завершения трансфекции клетки E. coli рассевают на чашке Петри, например, с известной питательной средой LB, с добавлением агара и антибиотика, например канамицина (50 мкг/мл). Посев культивируют, например, в течение 24 ч при температуре плюс 37°С. После культивации отбирают и сохраняют несколько клонов E. coli. Убеждаются в наличии конструкции pP121topo2K-GFP в клонах E. coli. Для этого проводят ПЦР отобранных клонов E. coli, используя праймеры в соответствии с Фиг. 6. На Фиг. 6: Нуклеотидные последовательности праймеров, используемых для ПЦР клонов E. coli. Наличие конструкции pP121topo2K-GFP в клоне E. coli определяют по наличию продуктов ПЦР, визуально подтвержденному при электрофорезе в агарозном геле с окрашиванием ДНК специфическим красителем, например красителем этидиум бромид.The resulting genetic construct pP121topo2K-GFP is introduced into E. coli cells (transfected), for example, using the known method of heat shock, for example at a temperature of + 42 ° C, for 45 sec. After transfection is complete, E. coli cells are seeded on a Petri dish, for example, with a known LB growth medium, with agar and an antibiotic, for example kanamycin (50 μg / ml). Sowing is cultivated, for example, for 24 hours at a temperature of plus 37 ° C. After cultivation, several E. coli clones are selected and stored . Confirm the presence of pP121topo2K-GFP constructs in E. coli clones . For this, PCR of selected E. coli clones is carried out using the primers in accordance with FIG. 6. In FIG. 6: Nucleotide sequences of primers used for PCR of E. coli clones. The presence of the pP121topo2K-GFP construct in the E. coli clone is determined by the presence of PCR products visually confirmed by agarose gel electrophoresis with DNA staining with a specific dye, for example, ethidium bromide dye.

Один из содержащих конструкцию pP121topo2K-GFP клонов E. coli (любой) вносят в 50 мл известной жидкой питательной среды LB и культивируют 24 часа на качалке, например, при плюс 37,0°С. Из полученной жидкой культуры E. coli выделяют генетическую конструкцию pP121topo2K-GFP с помощью коммерческого набора Nucleospin plasmid Kit (производства фирмы Macherey Nagel, Германия). Выделенную генетическую конструкцию используют для трансфекции (введения ДНК в клетки) ранее выделенной из насекомого Polypedilum vanderplanki [2] культуры клеток Pv11. Жизнеспособность культуры клеток Pv11 должна составлять не менее 90% при определении окраской трипановым синим - это условие обеспечивают использованием культуры клеток Pv11 в логарифмической фазе роста. Трансфекцию осуществляют, например, с использованием прибора NEPA21 (фирмы NepaGene, Япония) стандартным методом электропорации [11], основанном на подаче импульсов электрического тока на суспензию клеток с внесенной генетической конструкцией. Оптимальная плотность суспензии клеток Pv11 при трансфекции составляет 10 млн клеток/мл, концентрация генетической конструкции в суспензии клеток 1 мкг/мл. Параметры импульсов электрического тока устанавливают, например, в соответствии с Таблицей; работу с прибором осуществляют в соответствии с рекомендациями производителя.One of the constructs pP121topo2K-GFP of E. coli clones (any) is introduced into 50 ml of the known LB liquid culture medium and cultured for 24 hours on a rocking chair, for example, at plus 37.0 ° C. The pP121topo2K-GFP genetic construct was isolated from the obtained E. coli liquid culture using a commercial Nucleospin plasmid Kit (manufactured by Macherey Nagel, Germany). An isolated genetic construct is used for transfection (introducing DNA into cells) of a Pv11 cell culture previously isolated from the insect Polypedilum vanderplanki [2]. The viability of the Pv11 cell culture should be at least 90% when determined by trypan blue staining - this condition is ensured by using the Pv11 cell culture in the logarithmic growth phase. Transfection is carried out, for example, using the NEPA21 device (NepaGene, Japan) using the standard electroporation method [11], based on the supply of electric current pulses to a cell suspension with a genetic design. The optimal density of the Pv11 cell suspension during transfection is 10 million cells / ml; the concentration of the genetic construct in the cell suspension is 1 μg / ml. The parameters of the pulses of electric current are set, for example, in accordance with the Table; work with the device is carried out in accordance with the manufacturer's recommendations.

Таблица. Параметры импульсов электрического тока для трансфекции культуры клеток Pv11 конструкцией pP121topo2K-GFPTable. Parameters of electric current pulses for transfection of Pv11 cell culture with pP121topo2K-GFP construct

В контрольном варианте трансфекцию культуры клеток Pv11 осуществляют описанным выше путем с использованием вместо заявляемой конструкции pP121topo2K-GFP ее прототипа [7] - стандартной конструкции plZT/V5-His (производства фирмы Thermo Fisher Scientific, США). Конструкция plZT/V5-His (прототип) содержит ген GFP под управлением промотора le2 бакуловируса OpMNPV.In the control variant, the transfection of the Pv11 cell culture is carried out as described above using instead of the claimed construct pP121topo2K-GFP its prototype [7] - the standard construction plZT / V5-His (manufactured by Thermo Fisher Scientific, USA). The plZT / V5-His construct (prototype) contains the GFP gene under the control of the le2 promoter of the baculovirus OpMNPV.

После трансфекции клетки Pv11 культивируют в стандартных условиях: питательная среда IPL, температура от +24 до +25°С, при плотности клеточной суспензии от 2×10⁴ до 1×10⁶ клеток/мл [2]. Наличие экспрессии гена GFP в клетках Pv11 проверяют через 24 часа после трансфекции, например, осуществляя микроскопию клеток Pv11 методами фазового контраста и флюоресценции при длине волны λ_{возбуждения} = 489 нм, длине волны λ_{эмиссии} = 525 нм. Наличие флюоресценции клеток Pv11 свидетельствует о наличии в них белка GFP, Фиг. 7, где приведена фотография флюоресценции культуры клеток Pv11, экспрессирующих ген GFP после трансфекции конструкцией pP121topo2K-GFP. Наличие флюоресценции подтверждает факт состоявшейся экспрессии кодирующего белок GFP гена.After transfection, Pv11 cells are cultured under standard conditions: IPL growth medium, temperature from +24 to + 25 ° C, at a cell suspension density of 2 × 10 ⁴ to 1 × 10 ⁶ cells / ml [2]. The presence of GFP gene expression in Pv11 cells is checked 24 hours after transfection, for example, by microscopy of Pv11 cells by phase contrast and fluorescence methods at a wavelength λ _excitation = 489 nm, wavelength λ _emission = 525 nm. The presence of fluorescence of Pv11 cells indicates the presence of GFP protein in them, FIG. 7, which shows a fluorescence photograph of a culture of Pv11 cells expressing the GFP gene after transfection with the pP121topo2K-GFP construct. The presence of fluorescence confirms the fact that expression of the GFP protein coding gene has taken place.

Состоявшаяся и установленная экспрессия гена GFP подтверждает достижение цели заявляемого изобретения - сконструированная в соответствии с описанием предлагаемого изобретения, содержащая промотор Р121, генетическая конструкция pP121topo2K-GFP обеспечивает экспрессию чужеродного гена GFP в выделенной из насекомого Polypedilum vanderplanki культуре клеток Pv11.The completed and established expression of the GFP gene confirms the achievement of the goal of the claimed invention — constructed in accordance with the description of the invention, containing the P121 promoter, the pP121topo2K-GFP genetic construct allows expression of the foreign GFP gene in the Pv11 cell culture isolated from the insect Polypedilum vanderplanki .

В контрольном варианте, в клетках Pv11 после трансфекции конструкцией plZT/V5-His, флюоресценция белка GFP не наблюдается, что свидетельствует об отсутствии экспрессии гена GFP.In the control variant, in Pv11 cells after transfection with the plZT / V5-His construct, fluorescence of the GFP protein was not observed, indicating the absence of GFP gene expression.

Сравнение результатов осуществления заявляемого способа и контрольного варианта показывает и доказывает, что успешно обеспечиваемая заявленным техническим решением экспрессия чужеродного гена GFP в выделенной из насекомого Polypedilum vanderplanki культуре клеток Pv11 не осуществима по прототипу [6] (генетической конструкцией plZT7V5-His с промотором le2).Comparison of the results of the implementation of the proposed method and the control variant shows and proves that the expression of the foreign GFP gene in the Pv11 cell culture isolated from the insect Polypedilum vanderplanki is not feasible according to the prototype [6] (plZT7V5-His genetic construct with the le2 promoter), which is successfully provided by the claimed technical solution.

ПРИМЕР ВТОРОЙ, показывающий конструирование генетической конструкции, включающей аналог промотора Р121 со сходством нуклеотидной последовательности не менее 86% (промотор PII с нуклеотидной последовательностью SEQ ID: 2)EXAMPLE TWO, showing the construction of a genetic construct comprising an analogue of the P121 promoter with a similar nucleotide sequence of at least 86% (PII promoter with the nucleotide sequence of SEQ ID: 2)

Описанным в ПРИМЕРЕ ПЕРВОМ путем получают генетическую конструкцию рР121-II, при этом праймеры для получения промотора Р121 (Фиг. 2, I, II) заменяют на иные праймеры, например на праймеры, нуклеотидная последовательность которых приведена на Фиг. 8 (I-IV). На Фиг. 8 - нуклеотидные последовательности праймеров для получения промотора Р-II, отличающегося от приведенного в ПРИМЕРЕ ПЕРВОМ промотора. Заменой праймеров и осуществлением описанных в ПРИМЕРЕ ПЕРВОМ действий получают генетическую конструкцию рР121-II.The first construct described in EXAMPLE 1 is the pP121-II genetic construct, and the primers for the P121 promoter (FIG. 2, I, II) are replaced with other primers, for example, primers whose nucleotide sequence is shown in FIG. 8 (I-IV). In FIG. 8 - nucleotide sequence of the primers to obtain the promoter P-II, different from that shown in EXAMPLE FIRST promoter. By replacing the primers and carrying out the steps described in EXAMPLE FIRST, the pP121-II genetic construct is obtained.

Конструкция рР121-II идентична описанной в ПРИМЕРЕ ПЕРВОМ конструкции pP121topo2K-GFP, где промотор Р121 заменен на промотор Р-II. Промотор Р-II является аналогом промотора Р121, в котором фрагмент из последних 398 нуклеотидов заменен на сходный по своей последовательности фрагмент ДНК Polypedilum vanderplanki (сходство оценивали с помощью стандартной программы BLAST [12]). Сравнение нуклеотидных последовательностей промотора Р-II и промотора Р121 приведено на Фиг. 9, на которой отличающиеся между последовательностями нуклеотиды выделены серым цветом, отсутствующие в одной из последовательностей нуклеотиды обозначены дефисами. Гомология (сходство) нуклеотидных последовательностей промотора Р-II и промотора Р121 составляет 86% при анализе с помощью стандартной программы Needle [13]. То есть промотор Р-II является аналогом промотора Р121 (описан в ПРИМЕРЕ ПЕРВОМ) с не менее чем 86%-ным подобием (сходством) нуклеотидной последовательности.The construction of pP121-II is identical to that described in EXAMPLE FIRST construct pP121topo2K-GFP, where the P121 promoter is replaced by the P-II promoter. The P-II promoter is an analogue of the P121 promoter, in which a fragment of the last 398 nucleotides is replaced by a Polypedilum vanderplanki DNA fragment similar in sequence (similarity was evaluated using the standard BLAST program [12]). A comparison of the nucleotide sequences of the promoter P-II and the promoter P121 is shown in FIG. 9, in which nucleotides that differ between the sequences are grayed out, nucleotides that are absent in one of the sequences are indicated by hyphens. The homology (similarity) of the nucleotide sequences of the P-II promoter and the P121 promoter is 86% when analyzed using the standard Needle program [13]. That is, the P-II promoter is an analogue of the P121 promoter (described in EXAMPLE FIRST) with at least 86% similarity (similarity) to the nucleotide sequence.

Действия с генетической конструкцией рР121-II полностью идентичны описанным в ПРИМЕРЕ ПЕРВОМ, показывающем экспрессию чужеродного гена в выделенной из насекомого Polypedilum vanderplanki культуре клеток Pv11.The actions with the pP121-II genetic construct are completely identical to those described in EXAMPLE ONE showing the expression of a foreign gene in the Pv11 cell culture isolated from the insect Polypedilum vanderplanki .

На завершающем этапе, аналогично ПРИМЕРУ ПЕРВОМУ, путем использования фазово-контрастной и флюоресцентной микроскопии клеток Pv11 устанавливают (выявляют) наличие флюоресценции клеток Pv11, Фиг. 10, где приведена фотография флюоресценции культуры клеток Pv11, экспрессирующих ген GFP после трансфекции конструкцией рР121-II. Установленная флюоресценция свидетельствует о наличии зеленого флуоресцентного белка (GFP) в клетках Pv11, и соответственно - об успешной экспрессии гена GFP с использованием иной, отличной от приведенной в ПРИМЕРЕ ПЕРВОМ, генетической конструкции.At the final stage, similarly to EXAMPLE ONE, by using phase contrast and fluorescence microscopy of Pv11 cells, the presence of fluorescence of Pv11 cells is established (detected), FIG. 10, which shows a fluorescence photograph of a culture of Pv11 cells expressing the GFP gene after transfection with the pP121-II construct. The established fluorescence indicates the presence of green fluorescent protein (GFP) in Pv11 cells, and, accordingly, the successful expression of the GFP gene using a different genetic construct than that shown in EXAMPLE FIRST.

Таким образом, генетическая конструкция, содержащая аналог промотора Р121 с более чем 86%-ным подобием (сходством) нуклеотидной последовательности (в приведенном ПРИМЕРЕ ВТОРОМ - генетическая конструкция рР121-II с промотором Р-II) тоже обеспечивает экспрессию чужеродного гена GFP в выделенной из насекомого Polypedilum vanderplanki культуре клеток Pv11.Thus, a genetic construct containing an analogue of the P121 promoter with more than 86% similarity (similarity) to the nucleotide sequence (in the EXAMPLE TWO — the pP121-II genetic construct with the P-II promoter) also provides expression of a foreign GFP gene in an insect isolated Polypedilum vanderplanki Pv11 cell culture.

ПРИМЕР ТРЕТИЙ, демонстрирующий процесс получения генетической конструкции с промотором Р121 на основе генетической конструкции pcDNA5-FRTEXAMPLE THREE demonstrating the process of obtaining a genetic construct with the P121 promoter based on the pcDNA5-FRT genetic construct

Получают генетическую конструкцию pcDNA-P121-RFP. Для этого методом ПЦР, в соответствии с описанием в примере первом, получают фрагменты ДНК, содержащие ген красного флуоресцентного белка (ген RFP), промотор Р121 и участок генетической конструкции pcDNA5-FRT. При проведении ПЦР используют праймеры, нуклеотидная последовательность которых приведена на Фиг. 11. На Фиг. 11 - нуклеотидные последовательности праймеров для получения фрагментов ДНК с промотором Р121 (праймеры I, II), геном RFP (праймеры III, IV), участка генетической конструкции pcDNA5-FRT (праймеры V, VI). При получении участка генетической конструкции pcDNA5-FRT в качестве матрицы для ПЦР используют соответствующую генетическую конструкцию производства фирмы Thermo Fisher Scientific, США. При получении фрагмента ДНК с геном RFP в качестве матрицы для ПЦР используют генетическую конструкцию, содержащую данный ген, например генетическую конструкцию pTagRFP-N производства фирмы Евроген, Россия.The pcDNA-P121-RFP genetic construct is obtained. For this, PCR method, in accordance with the description in Example One, produces DNA fragments containing the red fluorescent protein gene (RFP gene), the P121 promoter, and the pcDNA5-FRT genetic construct. When performing PCR, primers are used whose nucleotide sequence is shown in FIG. 11. In FIG. 11 — nucleotide sequences of primers for obtaining DNA fragments with the P121 promoter (primers I, II), the RFP gene (primers III, IV), the pcDNA5-FRT genetic construct site (primers V, VI). Upon receipt of the plot of the genetic construct of pcDNA5-FRT as a template for PCR using the appropriate genetic design manufactured by Thermo Fisher Scientific, USA. Upon receipt of a DNA fragment with the RFP gene, a genetic construct containing this gene, for example, the pTagRFP-N genetic construct manufactured by Eurogen, Russia, is used as a template for PCR.

Полученные в ПЦР фрагмент ДНК с промотором Р121 и фрагмент генетической конструкции pcDNA5-FRT объединяют с использованием метода Гибсона [8], получая промежуточную генетическую конструкцию pcDNA-P121. Промежуточную генетическую конструкцию pcDNA-P121 обрабатывают ферментами рестрикции HindIII и XhoI и встраивают в нее фрагмент ДНК с геном RFP методом Гибсона [8], в соответствии с описанием в ПРИМЕРЕ ПЕРВОМ. Тем самым получают генетическую конструкцию pcDNA-P121-RFP, Фиг. 12. На Фиг. 12 приведена физическая карта генетической конструкции pcDNA-P121-RFP, где: 1 - промотор Р121; 7 - точка начала репликации PUC, 14 - ген RFP; 15 - ген устойчивости к антибиотику гигромицину; 16 - ген устойчивости к антибиотику ампициллину; 17 - бактериальный промотор bla.The DNA fragment obtained by PCR with the P121 promoter and the pcDNA5-FRT genetic construct fragment were combined using the Gibson method [8] to obtain the intermediate pcDNA-P121 genetic construct. The intermediate genetic construct pcDNA-P121 is treated with the restriction enzymes HindIII and XhoI and a DNA fragment with the RFP gene is inserted into it using the Gibson method [8], as described in EXAMPLE ONE. In this way, the pcDNA-P121-RFP genetic construct is obtained, FIG. 12. In FIG. 12 is a physical map of the genetic construct of pcDNA-P121-RFP, where: 1 - promoter P121; 7 - the beginning point of PUC replication, 14 - RFP gene; 15 - gene for antibiotic resistance to hygromycin; 16 - antibiotic resistance gene ampicillin; 17 - bacterial promoter bla.

Конструкция pcDNA-P121-RFP содержит промотор Р121 аналогично конструкции pP121topo2K-RFP, описанной в ПРИМЕРЕ ПЕРВОМ. При этом остальные конструктивные элементы генетической конструкции pcDNA-P121-RFP, необходимые для ее получения и функционирования, отличаются от таковых в конструкции pP121topo2K-RFP.The pcDNA-P121-RFP construct contains the P121 promoter similarly to the pP121topo2K-RFP construct described in EXAMPLE ONE. At the same time, the remaining structural elements of the pcDNA-P121-RFP genetic construct, necessary for its production and functioning, differ from those in the pP121topo2K-RFP construct.

Действия с генетической конструкцией pcDNA-P121-RFP полностью идентичны описанным в ПРИМЕРЕ ПЕРВОМ, показывающим экспрессию чужеродного гена в выделенной из насекомого Polypedilum vanderplanki культуре клеток Pv11. На завершающем этапе, аналогично ПРИМЕРУ ПЕРВОМУ, путем использования фазово-контрастной и флюоресцентной микроскопии клеток Pv11 устанавливают (выявляют) наличие флюоресценции клеток Pv11, Фиг. 13, где приведена фотография флюоресценции культуры клеток Pv11, экспрессирующих ген RFP после трансфекции конструкцией pcDNA-P121-RFP. Установленная флюоресценция свидетельствует о наличии красного флуоресцентного белка (RFP) и соответственно об успешной экспрессии чужеродного гена RFP в клетках Polypedilum vanderplanki (культуре клеток Pv11) с использованием иной, отличной от приведенной в ПРИМЕРЕ ПЕРВОМ, генетической конструкции pcDNA-P121-RFP.The actions with the pcDNA-P121-RFP genetic construct are completely identical to those described in EXAMPLE FIRST showing the expression of a foreign gene in a Pv11 cell culture isolated from the insect Polypedilum vanderplanki . At the final stage, similarly to EXAMPLE ONE, by using phase contrast and fluorescence microscopy of Pv11 cells, the presence of fluorescence of Pv11 cells is established (detected), FIG. 13, which shows a fluorescence photograph of a culture of Pv11 cells expressing the RFP gene after transfection with the pcDNA-P121-RFP construct. The established fluorescence indicates the presence of a red fluorescent protein (RFP) and, accordingly, the successful expression of a foreign RFP gene in Polypedilum vanderplanki cells (Pv11 cell culture) using a different genetic construct, pcDNA-P121-RFP, different from EXAMPLE ONE.

Сущностным признаком генетических конструкций pcDNA-P121-RFP и pP121topo2K-RFP является наличие промотора Р121. Помимо промотора Р121, генетические конструкции pcDNA-P121-RFP и pP121topo2K-RFP содержат также иные конструктивные элементы, необходимые для их получения и функционирования, такие как ген резистентности к антибиотику, бактериальный промотор и точка начала репликации (копирования). При этом все конструктивные элементы у генетических конструкций pcDNA-P121-RFP и pP121topo2K-RFP отличаются, за исключением промотора Р121 и точки начала репликации (копирования) генетической конструкции (точка PUC, Фиг. 5, поз. 7 и Фиг. 12, поз. 7). Из уровня техники известно, что точка PUC в генетических конструкциях может быть заменена на иные варианты данного конструктивного элемента. Так, рекомендации базы данных генетических конструкций Addgene (расположенные в сети интернет по адресу URL: http://blog.addgene.org/plasmid-101-origin-of-replication [14]) включают список из 10 вариантов точек начала репликации, успешно обеспечивающих копирование и получение генетических конструкций известным способом с использованием бактерий [9]. Таким образом, общий элемент генетических конструкций pcDNA-P121-RFP и pP121topo2K-RFP точка PUC не является существенным и может быть заменен на иные варианты точки начала репликации, известные из уровня техники.The essential feature of the pcDNA-P121-RFP and pP121topo2K-RFP genetic constructs is the presence of the P121 promoter. In addition to the P121 promoter, the pcDNA-P121-RFP and pP121topo2K-RFP genetic constructs also contain other structural elements necessary for their production and functioning, such as the antibiotic resistance gene, the bacterial promoter, and the origin of replication (copying). Moreover, all structural elements of the genetic constructs pcDNA-P121-RFP and pP121topo2K-RFP are different, with the exception of the P121 promoter and the start point of replication (copying) of the genetic construct (PUC point, Fig. 5, pos. 7 and Fig. 12, pos. 7). It is known from the prior art that the PUC point in genetic constructs can be replaced by other variants of this structural element. So, the recommendations of the Addgene genetic constructs database (located on the Internet at the URL: http://blog.addgene.org/plasmid-101-origin-of-replication [14]) include a list of 10 options for replication start points, successfully providing copying and obtaining genetic constructs in a known manner using bacteria [9]. Thus, the common element of the genetic constructs pcDNA-P121-RFP and pP121topo2K-RFP, the PUC point is not significant and can be replaced by other variants of the origin of replication known in the art.

Таким образом, для достижения заявленной цели (экспрессии чужеродных генов в клетках насекомого Polypedilum vanderplanki), генетические конструкции должны содержать промотор Р121 (SEQ ID:1) или его аналог со сходством нуклеотидной последовательности более 86%, а именно промотор PII (SEQ ID: 2). Остальные конструктивные элементы генетических конструкций для экспрессии генов в клетках Polypedilum vanderplanki могут быть использованы в различных вариантах, обеспечивающих получение и функционирование генетических конструкций, в соответствии с известным уровнем техники.Thus, to achieve the stated goal (expression of foreign genes in Polypedilum vanderplanki insect cells ), genetic constructs must contain the P121 promoter (SEQ ID: 1) or its analogue with a nucleotide sequence similarity of more than 86%, namely the PII promoter (SEQ ID: 2 ) The remaining structural elements of the genetic constructs for gene expression in Polypedilum vanderplanki cells can be used in various ways, ensuring the production and functioning of genetic constructs, in accordance with the prior art.

Осуществление предлагаемого изобретения не ограничивается приведенными ПРИМЕРАМИ.The implementation of the invention is not limited to the given EXAMPLES.

Приведенные примеры осуществления предлагаемого изобретения показывают его осуществимость с использованием стандартного оборудования и материалов, полезность для применения в биотехнологиях, например для получения используемых в аналитической деятельности и диагностике инактивируемых обезвоживанием ферментов.The examples of the implementation of the invention show its feasibility using standard equipment and materials, usefulness for use in biotechnology, for example, to obtain used in analytical activities and the diagnosis of inactivated dehydration enzymes.

В заявленном техническом решении заявителем реализована поставленная цель: создана генетическая конструкция, обеспечивающая экспрессию чужеродных генов в культуре клеток насекомого Polypedilum vanderplanki; доказательством служат Фиг. 7, Фиг. 10, на которых продемонстрирована флюоресценция культуры клеток Pv11, обусловленная экспрессией чужеродного белка GFP за счет применения заявляемой конструкции. Экспрессия чужеродных генов путем применения заявляемой конструкции позволяет получать в клетках Polypedilum vanderplanki биотехнологические продукты, например белки, в том числе инактивируемые обезвоживанием ферменты. Клетки Polypedilum vanderplanki способны сохранять жизнеспособность и, соответственно, активность внутриклеточных компонентов при обезвоживании [1]. В связи с вышесказанным использование заявляемой генетической конструкции для получения биотехнологических продуктов в клетках Polypedilum vanderplanki является основой для нового способа консервации, хранения и транспортировки биотехнологических продуктов. Указанный способ основан на обезвоживании клеток Polypedilum vanderplanki, содержащих полученный биотехнологический продукт. Тем самым применение заявляемой генетической конструкции обеспечивает существенное расширение возможностей консервации инактивируемых обезвоживанием биотехнологических продуктов.In the claimed technical solution, the applicant realized the goal: he created a genetic construct that ensures the expression of foreign genes in the insect cell culture Polypedilum vanderplanki; the evidence is FIG. 7, FIG. 10, which demonstrated the fluorescence of a Pv11 cell culture due to the expression of a foreign GFP protein through the use of the claimed construct. The expression of foreign genes through the use of the claimed design allows you to get in the cells of Polypedilum vanderplanki biotechnological products, such as proteins, including dehydration-inactivated enzymes. Polypedilum vanderplanki cells are able to maintain viability and, accordingly, the activity of intracellular components during dehydration [1]. In connection with the foregoing, the use of the inventive genetic construct for the production of biotechnological products in Polypedilum vanderplanki cells is the basis for a new method of preservation, storage and transportation of biotechnological products. The specified method is based on dehydration of Polypedilum vanderplanki cells containing the obtained biotechnological product. Thus, the use of the claimed genetic design provides a significant expansion of the conservation capabilities of inactivated dehydration biotechnological products.

Заявленное техническое решение удовлетворяет критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как при определении уровня техники не обнаружены средства, которым присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле предлагаемого изобретения, включая характеристику назначения.The claimed technical solution meets the criterion of "novelty" presented to the invention, since when determining the prior art no means were found that are inherent in signs identical (that is, matching the functions performed by them and the form of execution of these signs) to all the signs listed in the formula of the invention , including a description of the destination.

Заявленное техническое решение удовлетворяет критерию «изобретательский уровень», т.к. не является очевидным для специалиста в данной области техники и из исследованного уровня техники, заявителем не выявлены технические решения, совпадающие по технической сущности предлагаемым решением, и не установлена известность влияния отличительных признаков на полученный технический результат.The claimed technical solution meets the criterion of "inventive step", because it is not obvious to a person skilled in the art and from the investigated prior art, the applicant has not identified technical solutions that match the technical nature of the proposed solution, and the popularity of the distinctive features on the obtained technical result has not been established.

Заявляемое техническое решение можно реализовать в промышленном производстве биотехнологических продуктов, используемых в биотехнологиях, научной, медицинской и производственной деятельности посредством использования известных стандартных технических устройств и оборудования. Это соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям.The claimed technical solution can be implemented in the industrial production of biotechnological products used in biotechnology, scientific, medical and industrial activities through the use of well-known standard technical devices and equipment. This meets the criterion of "industrial applicability" presented to the invention.

Источники информацииInformation sources

1. Gusev О. et al. Comparative genome sequencing reveals genomic signature of extreme desiccation tolerance in the anhydrobiotic midge // Nat. Commun. Nature Publishing Group, 2014. Vol. 5. P. 4784.1. Gusev, O. et al. Comparative genome sequencing reveals genomic signature of extreme desiccation tolerance in the anhydrobiotic midge // Nat. Commun. Nature Publishing Group, 2014. Vol. 5. P. 4784.

2. Nakahara Y. et al. Cells from an anhydrobiotic chironomid survive almost complete desiccation // Cryobiology. Elsevier Inc., 2010. Vol. 60, №2. P. 138-146.2. Nakahara Y. et al. Cells from an anhydrobiotic chironomid survive almost complete desiccation // Cryobiology. Elsevier Inc., 2010. Vol. 60, No. 2. P. 138-146.

3. Cornette R., Kikawada T. The induction of anhydrobiosis in the sleeping chironomid: current status of our knowledge // IUBMB Life. 2011. Vol. 63, №6. P. 419-429.3. Cornette R., Kikawada T. The induction of anhydrobiosis in the sleeping chironomid: current status of our knowledge // IUBMB Life. 2011. Vol. 63, No. 6. P. 419-429.

4. Nakabachi A. Horizontal gene transfers in insects // Curr. Opin. Insect Sci., 2015. Vol. 7. P. 24-29.4. Nakabachi A. Horizontal gene transfers in insects // Curr. Opin. Insect Sci., 2015. Vol. 7. P. 24-29.

5. Патент WO/2010/025764 A1. МПК 2006.01 C12N 15/85, C12N 15/866, A01K 67/033. Приоритет от 02.09.2008. Опубл. 11.03.2010. Описание изобретения.5. Patent WO / 2010/025764 A1. IPC 2006.01 C12N 15/85, C12N 15/866, A01K 67/033. Priority from 02.09.2008. Publ. 03/11/2010. Description of the invention.

6. Патент RU 2453603 С2, МПК 2006.01 C12N 15/63, A61K 39/04. Приоритет от 08.02.2007. Опубл. 20.06.2012. Описание изобретения.6. Patent RU 2453603 C2, IPC 2006.01 C12N 15/63, A61K 39/04. Priority from 08.02.2007. Publ. 06/20/2012. Description of the invention.

7. Патент WO/1998/044141. МПК 2006.01 C07K 14/575, C07K 14/79, C12N 15/69, C12N 15/85, C12N 9/64. Приоритет от 26.03.1998. Опубл. 08.10.1998. Описание изобретения.7. Patent WO / 1998/044141. IPC 2006.01 C07K 14/575, C07K 14/79, C12N 15/69, C12N 15/85, C12N 9/64. Priority from 03/26/1998. Publ. 10/08/1998. Description of the invention.

8. Altschul S.F. et al. Basic local alignment search tool. // J. Mol. Biol. 1990. Vol. 215, №3. P. 403-410.8. Altschul S.F. et al. Basic local alignment search tool. // J. Mol. Biol. 1990. Vol. 215, No. 3. P. 403-410.

9. Gibson D.G. et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. // Nat. Methods. 2009. Vol. 6, №5. P. 343-345.9. Gibson D.G. et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. // Nat. Methods 2009. Vol. 6, No. 5. P. 343-345.

10. Sambrook J., W Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual // Cold Spring Harb. NY. 2001. P. 999.10. Sambrook J., W Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual // Cold Spring Harb. NY. 2001.P. 999.

11. Cohen S.N. et al. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1973. Vol. 70, №11. P. 3240-3244.11. Cohen S.N. et al. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1973. Vol. 70, No. 11. P. 3240-3244.

12. Neumann E. et al. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. // EMBO J. 1982. Vol. 1, №7. P. 841-845.12. Neumann E. et al. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. // EMBO J. 1982. Vol. 1, No. 7. P. 841-845.

13. Rice P., Longden I., Bleasby A. EMBOSS: the European Molecular Biology Open Software Suite. // Trends Genet. 2000. Vol. 16, №6. P. 276-277.13. Rice P., Longden I., Bleasby A. EMBOSS: the European Molecular Biology Open Software Suite. // Trends Genet. 2000. Vol. 16, No. 6. P. 276-277.

14. Morgan K., Plasmids 101: Origin of Replication [Электронный ресурс] // Addgene. - 2016. URL: http://blog.addgene.org/plasmid-101-origin-of-replication (дата обращения: 10.10.2016).14. Morgan K., Plasmids 101: Origin of Replication [Electronic resource] // Addgene. - 2016. URL: http://blog.addgene.org/plasmid-101-origin-of-replication (accessed: 10/10/2016).

Claims

1. A genetic construct for gene expression in Polypedilum vanderplanki insect cells, comprising the P121 promoter isolated from the Polypedilum vanderplanki DNA sequence with the nucleotide sequence of SEQ ID: 1.

2. The genetic construct according to claim 1, characterized in that the P121 promoter is replaced by a P-II promoter with the nucleotide sequence of SEQ ID: 2.