RU2607588C2

RU2607588C2 - Method of producing agent, binding with pre-vasopressin or its fragments

Info

Publication number: RU2607588C2
Application number: RU2014102721A
Authority: RU
Inventors: Йоахим ШТРУК
Original assignee: Б.Р.А.Х.М.С. Гмбх
Priority date: 2011-06-30
Filing date: 2012-06-26
Publication date: 2017-01-10
Also published as: JP2014520768A; BR112013032482A2; JP6088501B2; EP2726882A1; US20180252732A1; ZA201308165B; RU2014102721A; EP2541252A1; US10954298B2; US20140335628A1; WO2013000568A1; CN103635806B; CN103635806A

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: group of inventions relates to medicine and method of producing binding agent or mixture of binding agents, capable to bind with epitope, contained in amino acid sequence, corresponding to C-end part of pre-vasopressin, consisting of amino acids 146-163, but not containing amino acid 164, where said method includes steps of producing binding agent with help of forming agent; determination binding ability of binding agent with amino acid sequence with length of at least 12 amino acids, contained in amino acid sequence, corresponding to C-end part, but not containing amino acid 164 of pre-vasopressin; selection of binding agent from multitude of binding agents. Group of inventions also relates to forming agent for producing binding agent or mixture of binding agents; application of binding agent for qualitative or quantitative detection of pre-vasopressin or its fragments in biological sample.

EFFECT: group of inventions provides qualitative or quantitative detection of pre-vasopressin or its fragments in biological sample.

20 cl, 1 ex, 5 dwg, 2 tbl

Description

Настоящее изобретение относится к способу получения и/или подтверждения получения агента, связывающегося с препро-вазопрессином или с его фрагментами, включая копептин; к связывающему агенту и к набору, содержащему указанный связывающий агент и используемому для качественного или количественного детектирования препро-вазопрессина или его фрагментов, включая копептин, присутствующих в биологическом образце, и к пептиду, используемому для получения агента, связывающегося с препро-вазопрессином или его фрагментами, включая копептин. The present invention relates to a method for producing and / or confirming receipt of an agent that binds to prepro-vasopressin or its fragments, including copeptin; to a binding agent and to a kit containing said binding agent and used for the qualitative or quantitative detection of prepro-vasopressin or its fragments, including copeptin present in a biological sample, and to a peptide used to obtain an agent that binds to prepro-vasopressin or its fragments including copeptin.

Предшествующий уровень техники State of the art

Препро-вазопрессин может быть процессирован в про-вазопрессин посредством отщепления сигнального пептида, а про-вазопрессин может быть затем процессирован в вазопрессин, нейрофизин-2 и копептин, где указанный копептин представляет собой С-концевую часть пептида-предшественника. Вазопрессин, также известный как антидиуретический гормон (ADH), представляет собой ключевой регулятор водно-солевого баланса. Определение уровня вазопрессина в биологических образцах с применением стандартных клинических методов почти невозможно из-за серьезных технических проблем, связанных с быстрым клиренсом вазопрессина из кровотока, его взаимодействием с тромбоцитами в сыворотке и небольшим размером, см. раздел «Библиография» [0039], [1-3]. Большой удачей оказалось установление того факта, что копептин, стехиометрически образующийся вместе с вазопрессином, может служить в качестве суррогатного маркера для вазопрессина. Главной причиной такого успеха можно считать очень высокую ex vivo стабильность копептина, позволяющую использовать его в стандартных методах [4-6]. Prepro-vasopressin can be processed into pro-vasopressin by cleavage of the signal peptide, and pro-vasopressin can then be processed into vasopressin, neurophysin-2 and copeptin, where said copeptin is the C-terminal portion of the precursor peptide. Vasopressin, also known as antidiuretic hormone (ADH), is a key regulator of water-salt balance. Determining the level of vasopressin in biological samples using standard clinical methods is almost impossible due to serious technical problems associated with the rapid clearance of vasopressin from the bloodstream, its interaction with platelets in the serum and its small size, see the Bibliography section [0039], [1 -3]. It was a great success to establish the fact that copeptin, stoichiometrically formed together with vasopressin, can serve as a surrogate marker for vasopressin. The main reason for this success can be considered the very high ex vivo stability of copeptin, which allows its use in standard methods [4-6].

Клинические исследования выявили множество показаний, при которых измерение уровня копептина позволяет получить очень ценную диагностическую информацию, включая сердечно-сосудистые заболевания, болезни легких, инфекционные заболевания, болезни почек, патологические нарушения водно-солевого баланса и другие [5]. Известными методами детектирования копептина являются иммуноанализы [4, 6]. Clinical studies have revealed many indications in which measuring the level of copeptin provides very valuable diagnostic information, including cardiovascular diseases, lung diseases, infectious diseases, kidney diseases, pathological disorders of the water-salt balance and others [5]. Known methods for detecting copeptin are immunoassays [4, 6].

Препро-вазопрессин и его фрагменты могут быть также экспрессированы эктопически при раковых заболеваниях некоторых типов, и антитела против копептина могут быть использованы для детектирования его экспрессии в образцах ткани (EP 1539818 A2).Prepro-vasopressin and its fragments can also be ectopically expressed in certain types of cancer, and anti-copeptin antibodies can be used to detect its expression in tissue samples (EP 1539818 A2).

Хотя в литературе были описаны иммуногены для получения антител против копептина, однако, очень мало известно, если вообще известно, о фактических эпитопах этих антител. Описанные антитела против человеческого копептина представлены в таблице 1. Ранее, никогда не возникал вопрос, существуют ли эпитоп-специфические антитела против копептина, и если эти антитела существуют, то как, при их использовании в методах детектирования, эти антитела будут влиять на точность и надежность детектирования препро-вазопрессина или его фрагментов, включая копептин, в биологических образцах. Было высказано предположение, что копептин является в высокой степени стабильным per se. Антитело, используемое для детектирования зрелого копептина, эпитоп которого, скорее всего, является неспецифическим и был определен как эпитоп, картированный «поблизости от С-конца копептина», поставляется фирмой Santa Cruz Biotechnology, Inc., Heidelberg, Germany, и это антитело было рекомендовано для использования в ELISA и в других целях. Although immunogens have been described in the literature for the production of antibodies against copeptin, very little, if any, is known about the actual epitopes of these antibodies. The described antibodies against human copeptin are presented in Table 1. Previously, the question never arose whether epitope-specific antibodies against copeptin exist, and if these antibodies exist, how, when used in detection methods, these antibodies will affect accuracy and reliability detection of prepro-vasopressin or its fragments, including copeptin, in biological samples. It has been suggested that copeptin is highly stable per se. The antibody used to detect mature copeptin, the epitope of which is most likely non-specific and was defined as an epitope mapped "near the C-terminus of copeptin", is available from Santa Cruz Biotechnology, Inc., Heidelberg, Germany, and this antibody has been recommended for use in ELISA and other purposes.

Таблица 1Table 1 АнтителоAntibody Источ-никSource ИммуногенImmunogen ЭпитопEpitope СсылкаLink Анти-PATV17 антитело Anti-PATV17 antibody ОвцаSheep CATQLDGPAGALLLRLV,
представляющий положения 132-147 препро-вазопрессина + N-концевой цистеиновый остаток CATQLDGPAGALLLRLV,
representing provisions 132-147 of prepro-vasopressin + N-terminal cysteine residue Не описанNot described [6][6] Анти-PLAY17 антителоAnti-PLAY17 antibody ОвцаSheep CLACAPEPFEPAQPDAY,
представляющий положения 149-164 препро-вазопрессина + N-концевой цистеиновый остатокCLACAPEPFEPAQPDAY,
representing the provisions of 149-164 prepro-vasopressin + N-terminal cysteine residue Не описанNot described [6][6] 294/1A7294 / 1A7 МышьMouse ATQLDGPAGALLLRLVQLAGA-PEPFEPAQPDAY, представляющий положения 132-164 препро-вазопрессина + N-концевой цистеиновый остатокATQLDGPAGALLLRLVQLAGA-PEPFEPAQPDAY representing positions 132-164 of prepro-vasopressin + N-terminal cysteine residue GPAGAL, представляющий положения 137-144 препро-вазопрессинаGPAGAL representing provisions 137-144 of prepro-vasopressin WO 2010049179 A1WO 2010049179 A1 H-065-32H-065-32 КроликRabbit ASDRSNATQLDCPAGALLLRL-VQLAGAPEPFEPAQPDAY, представляющий положения 126-164 препро-вазопрессинаASDRSNATQLDCPAGALLLRL-VQLAGAPEPFEPAQPDAY representing provisions 126-164 of prepro-vasopressin Не описанNot described Phoenix Pharma-ceuticals, Burlingame, USAPhoenix Pharma-ceuticals, Burlingame, USA MAB6077 (клон 579021)MAB6077 (clone 579021) МышьMouse ASDRSNATQLDGPAG, представляющий положения 126-140 препро-вазопрессинаASDRSNATQLDGPAG representing position 126-140 of prepro-vasopressin Не описанNot described R+D Systems, Minneapolis, USAR + D Systems, Minneapolis, USA MAC-1MAC-1 МышьMouse QLAGAPEPFEPAQPDAY, представляющий положения 148-164 препро-вазопрессинаQLAGAPEPFEPAQPDAY representing provisions 148-164 of prepro-vasopressin Не описанNot described EP 1539818 A2EP 1 539 818 A2 sc-7811sc-7811 Обо-лочкаShell Не описанNot described «картирование эпитопа возле С-конца человеческого копептина»“Epitope mapping near the C-terminus of human copeptin” Santa Cruz Bio-techno-logy, Inc., Heidelberg, GermanySanta Cruz Bio-techno-logy, Inc., Heidelberg, Germany

Описание изобретенияDescription of the invention

Настоящее изобретение относится к способу по п.1 формулы изобретения; к пептиду по п.10 формулы изобретения и к его применению по п.11 формулы изобретения; к связывающему агенту по п.12 формулы изобретения; к применению указанного связывающего агента по п.14 формулы изобретения; и к набору по п. 18 формулы изобретения. Предпочтительные варианты изобретения описаны в соответствующих зависимых пунктах формулы изобретения.The present invention relates to a method according to claim 1; to the peptide according to claim 10 of the claims and to its use according to claim 11 of the claims; to a binding agent according to claim 12; to the use of said binding agent according to claim 14; and to the kit according to claim 18 of the claims. Preferred embodiments of the invention are described in the respective dependent claims.

Более конкретно, в первом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу получения и/или подтверждения получения агента, связывающегося с препро-вазопрессином (SEQ ID NO. 1) или с его фрагментами, длиной по меньшей мере 6 аминокислот, включая копептин (SEQ ID NO. 2), где указанный способ включает по меньшей мере одну из нижеследующих стадий: More specifically, in a first aspect, the present invention relates to a method for producing and / or confirming the preparation of a prepro-vasopressin binding agent (SEQ ID NO. 1) or fragments thereof of at least 6 amino acids in length, including copeptin (SEQ ID NO. 2), wherein said method comprises at least one of the following steps:

a) получения связывающего агента с использованием формирующего агента, содержащего аминокислотную последовательность длиной по меньшей мере в 6 аминокислот, содержащуюся в аминокислотной последовательности, соответствующей C-концевой части, но не содержащего аминокислоту 164 препро-вазопрессина (SEQ ID NO. 1); a) obtaining a binding agent using a forming agent containing an amino acid sequence of at least 6 amino acids contained in the amino acid sequence corresponding to the C-terminal portion but not containing amino acid 164 prepro-vasopressin (SEQ ID NO. 1);

b) определения способности связывающего агента связываться с аминокислотной последовательностью длиной по меньшей мере в 4 аминокислоты, содержащейся в аминокислотной последовательности, соответствующей C-концевой части, но не содержащей аминокислоту 164 препро-вазопрессина (SEQ ID NO. 1); b) determining the ability of the binding agent to bind to an amino acid sequence of at least 4 amino acids contained in the amino acid sequence corresponding to the C-terminal portion but not containing amino acid 164 prepro-vasopressin (SEQ ID NO. 1);

c) отбора и, необязательно, выделения связывающего агента из множества связывающих агентов, способных связываться с аминокислотной последовательностью, содержащейся в аминокислотной последовательности, соответствующей C-концевой части, но не содержащей аминокислоту 164 препро-вазопрессина (SEQ ID NO. 1); c) selecting and optionally isolating a binding agent from a plurality of binding agents capable of binding to the amino acid sequence contained in the amino acid sequence corresponding to the C-terminal portion but not containing amino acid 164 prepro-vasopressin (SEQ ID NO. 1);

d) осуществления анализов на связывание со связывающим агентом в целях определения ex vivo стабильности препро-вазопрессина или его фрагментов длиной по меньшей мере в 6 аминокислот, включая копептин, в биологическом образце; d) performing binding assays on a binding agent to determine ex vivo stability of prepro-vasopressin or fragments thereof of at least 6 amino acids in length, including copeptin, in a biological sample;

e) осуществления анализов на связывание со связывающим агентом и с другим связывающим агентом в целях сравнения для определения концентрации препро-вазопрессина или его фрагментов длиной по меньшей мере в 6 аминокислот, включая копептин, в биологическом образце; e) performing binding assays with a binding agent and with another binding agent for comparison purposes to determine the concentration of prepro-vasopressin or fragments thereof of at least 6 amino acids in length, including copeptin, in a biological sample;

где C-концевая часть состоит из аминокислот 138-164 препро-вазопрессина (SEQ ID NO. 1), where the C-terminal part consists of amino acids 138-164 prepro-vasopressin (SEQ ID NO. 1),

с получением связывающего агента или смеси связывающих агентов, способных связываться с эпитопом, содержащимся в аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам 138-163, но не содержащей аминокислоту 164 препро-вазопрессина (SEQ ID NO. 1). to obtain a binding agent or a mixture of binding agents capable of binding to an epitope contained in the amino acid sequence corresponding to amino acids 138-163, but not containing prepro-vasopressin amino acid 164 (SEQ ID NO. 1).

В основу главного аспекта настоящего изобретения был положен тот неожиданно обнаруженный факт, что фрагменты препро-вазопрессина, а особенно копептина, в биологических образцах не обладают такой уж высокой стабильностью per se, как это предполагалось ранее, и что стабильность аналита и точность и надежность детектирования непосредственно зависят от эпитопа, против которого направлены антитела, используемые в анализе по детектированию фрагментов, таких как копептин. В частности, было обнаружено, что исключение аминокислоты в положении 164 в С-концевой части препро-вазопрессина, как части эпитопа для агента, связывающегося с препро-вазопрессином или с его фрагментами, такими как копептин, играет очень важную роль с точки зрения точности детектирования и стабильности аналита. В соответствии с этим, указанный способ включает стадии подтверждения присутствия тех связывающих агентов, которые не требуют присутствия аминокислоты 164 в эпитопе аминокислотной последовательности, соответствующей С-концевой части препро-вазопрессина (SEQ ID NO. 1), то есть, аминокислотной последовательности, начинающейся с аминокислоты в положении 138 и далее. Как было обнаружено и подтверждено авторами настоящего изобретения, связывающие агенты, не требующие присутствия аминокислоты 164 в эпитопе для связывания, позволяют получить более точные и надежные результаты анализа, а поэтому они являются более подходящими для использования в анализах по детектированию препро-вазопрессина или его фрагментов, чем связывающие агенты, которым для связывания требуется присутствие указанной аминокислоты 164.The main aspect of the present invention was based on the unexpectedly discovered fact that fragments of prepro-vasopressin, and especially copeptin, in biological samples do not have as high stability per se as previously assumed, and that the stability of the analyte and the accuracy and reliability of detection directly depend on the epitope against which antibodies are used, used in the analysis for the detection of fragments, such as copeptin. In particular, it was found that the exclusion of the amino acid at position 164 in the C-terminal portion of prepro-vasopressin, as part of the epitope for an agent that binds to prepro-vasopressin or its fragments, such as copeptin, plays a very important role in terms of detection accuracy and analyte stability. Accordingly, the method comprises the steps of confirming the presence of those binding agents that do not require the presence of amino acid 164 in the epitope of the amino acid sequence corresponding to the C-terminal portion of prepro-vasopressin (SEQ ID NO. 1), i.e., the amino acid sequence starting with amino acids at position 138 ff. As was discovered and confirmed by the authors of the present invention, binding agents that do not require the presence of amino acid 164 in the epitope for binding, allow to obtain more accurate and reliable analysis results, and therefore they are more suitable for use in the analysis of the detection of prepro-vasopressin or its fragments, than binding agents that require the presence of said amino acid 164 to bind.

Было также показано, что в С-концевой части препро-вазопрессина, как части эпитопа для агента, связывающегося с препро-вазопрессином или с его фрагментами, может отсутствовать не только аминокислота 164, и что улучшенные результаты могут быть также получены даже, если отсутствует более, чем одна аминокислота. Более конкретно, в аминокислотной последовательности, соответствующей С-концевой части препро-вазопрессина (SEQ ID NO. 1), могут отсутствовать аминокислоты 163 и 164, предпочтительно, 162-164, а наиболее предпочтительно, аминокислоты 161-164. То есть, связывающий агент, который может быть получен способом согласно изобретению, не требует присутствия этих аминокислот в эпитопе для связывания с препро-вазопрессином или его фрагментами, включая копептин (SEQ ID NO. 2).It has also been shown that in the C-terminal portion of prepro-vasopressin, as part of the epitope for an agent that binds to prepro-vasopressin or its fragments, not only amino acid 164 may be absent, and that improved results can also be obtained even if more than one amino acid. More specifically, amino acids 163 and 164, preferably 162-164, and most preferably amino acids 161-164, may be missing from the amino acid sequence corresponding to the C-terminal portion of prepro-vasopressin (SEQ ID NO. 1). That is, a binding agent that can be obtained by the method according to the invention does not require the presence of these amino acids in the epitope to bind to prepro-vasopressin or its fragments, including copeptin (SEQ ID NO. 2).

Используемые здесь термины «препро-вазопрессин» и «копептин» включают также аминокислотные последовательности, которые только на 75%, предпочтительно, по меньшей мере на 80%, а более предпочтительно, по меньшей мере на 90% гомологичны препро-вазопрессину и копептину соответственно. То же самое относится не только к копептину, но и к другим фрагментам препро-вазопрессина. Термин «фрагменты» препро-вазопрессина означает фрагменты длиной по меньшей мере в 6 аминокислот, предпочтительно, по меньшей мере в 8 аминокислот, более предпочтительно, по меньшей мере в 10 аминокислот, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере в 12 аминокислот. As used herein, the terms “prepro-vasopressin” and “copeptin” also include amino acid sequences that are only 75%, preferably at least 80%, and more preferably at least 90% homologous to prepro-vasopressin and copeptin, respectively. The same applies not only to copeptin, but also to other fragments of prepro-vasopressin. The term “fragments” of prepro-vasopressin means fragments of at least 6 amino acids, preferably at least 8 amino acids, more preferably at least 10 amino acids, and most preferably at least 12 amino acids.

Способ согласно изобретению включает несколько путей получения и/или подтверждения получения подходящих связывающих агентов, которым для связывания не требуется присутствия аминокислоты 164, как описано выше, и которые могут быть использованы отдельно или в комбинации друг с другом. Первый возможный путь описан в стадии (a) и относится к целевому и селективному продуцированию связывающего агента с использованием подходящего формирующего агента, селективно образующего нужный связывающий агент. Более конкретно, формирующий агент включает аминокислотную последовательность, содержащуюся в аминокислотной последовательности, соответствующей С-концевой части, но не содержащей аминокислоту 164 препро-вазопрессина (SEQ ID NO. 1). То есть, указанный формирующий агент содержит аминокислотную последовательность длиной по меньшей мере в 6 аминокислот, которая соответствует по меньшей мере части аминокислотной последовательности, простирающейся от аминокислоты 138 до аминокислоты 164 препро-вазопрессина, но не имеющей аминокислоты 164. С использованием формирующего агента, где отсутствует аминокислота 164, можно получить связывающий агент или смесь связывающих агентов, для связывания с которыми не требуется присутствия указанной аминокислоты 164. (Используемый ниже термин «связывающий агент», если это не оговорено особо, означает связывающий агент одного типа или смесь связывающих агентов различных типов). В принципе, стадия (a) позволяет осуществлять селективное и непосредственное продуцирование нужного связывающего агента и не требует проведения дополнительных стадий для удаления связывающих агентов, которым для связывания требуется присутствие указанной аминокислоты 164. Однако это не исключает возможности проведения после стадии (a) дополнительных стадий, таких как характеристика, очистка, отбор и выделение. The method according to the invention includes several ways to obtain and / or confirm the receipt of suitable binding agents that do not require the presence of amino acid 164 for binding, as described above, and which can be used separately or in combination with each other. The first possible route is described in step (a) and relates to the targeted and selective production of a binding agent using a suitable forming agent selectively forming the desired binding agent. More specifically, the forming agent includes an amino acid sequence contained in the amino acid sequence corresponding to the C-terminal portion, but not containing amino acid 164 prepro-vasopressin (SEQ ID NO. 1). That is, said forming agent contains an amino acid sequence of at least 6 amino acids in length that corresponds to at least a portion of the amino acid sequence extending from amino acid 138 to amino acid 164 prepro-vasopressin, but lacking amino acid 164. Using a forming agent, where there is no amino acid 164, you can obtain a binding agent or a mixture of binding agents for the binding of which does not require the presence of the specified amino acid 164. (Used below is the term n "binding agent", unless otherwise indicated, it means one type of binding agent or mixture of binding agents of different types). In principle, step (a) allows selective and direct production of the desired binding agent and does not require additional steps to remove binding agents that require the presence of said amino acid 164. However, this does not preclude the possibility of carrying out additional steps after step (a), such as characterization, purification, selection and isolation.

В контексте настоящего изобретения, аминокислотная последовательность, содержащаяся в аминокислотной последовательности, соответствующей С-концевой части, но не содержащей аминокислоту 164 препро-вазопрессина (SEQ ID NO. 1), и используемая для получения связывающего агента, в принципе, может быть получена путем синтеза, либо она может происходить от природной аминокислотной последовательности. Такая последовательность может быть линейной или иметь складчатую структуру. Указанная аминокислотная последовательность, в принципе, может иметь любую длину, а именно, в 6 или более аминокислот, подходящую для получения нужного связывающего агента или для достижения эффективного связывания с указанным связывающим агентом. В принципе, она может соответствовать любой аминокислотной последовательности в пределах от аминокислоты 138 до аминокислоты 163 препро-вазопрессина. Предпочтительно, аминокислотная последовательность содержится в последовательности из аминокислот 140-163, более предпочтительно, 142-163, еще более предпочтительно, 144-163, а наиболее предпочтительно, 146-163 препро-вазопрессина (SEQ ID NO. 1). Подходящая аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 8 аминокислот, предпочтительно, по меньшей мере 10 аминокислот, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере 12 аминокислот. В частности, указанная аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере 6, предпочтительно, по меньшей мере 8, более предпочтительно, по меньшей мере 10, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере 12 непрерывно следующих друг за другом аминокислот, содержащихся в аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам 146-163 препро-вазопрессина (SEQ ID NO. 1).In the context of the present invention, the amino acid sequence contained in the amino acid sequence corresponding to the C-terminal part, but not containing amino acid 164 prepro-vasopressin (SEQ ID NO. 1), and used to obtain a binding agent, in principle, can be obtained by synthesis , or it can come from a natural amino acid sequence. Such a sequence may be linear or have a folded structure. The specified amino acid sequence, in principle, can be of any length, namely, 6 or more amino acids, suitable for obtaining the desired binding agent or to achieve effective binding to the specified binding agent. In principle, it can correspond to any amino acid sequence ranging from amino acid 138 to amino acid 163 prepro-vasopressin. Preferably, the amino acid sequence is contained in a sequence of amino acids 140-163, more preferably 142-163, even more preferably 144-163, and most preferably 146-163 prepro-vasopressin (SEQ ID NO. 1). A suitable amino acid sequence has at least 8 amino acids, preferably at least 10 amino acids, and most preferably at least 12 amino acids. In particular, the specified amino acid sequence contains at least 6, preferably at least 8, more preferably at least 10, and most preferably at least 12 continuously following each other amino acids contained in the amino acid sequence corresponding to amino acids 146 -163 prepro-vasopressin (SEQ ID NO. 1).

Используемый здесь термин «связывающий агент» означает любое вещество, способное связываться с эпитопом, содержащимся в аминокислотной последовательности, соответствующей С-концевой части препро-вазопрессина (SEQ ID NO. 1). Этот связывающий агент обычно имеет адекватную форму, а также соответствующие пространственные и поверхностные свойства, такие как поверхностный заряд, гидрофобность, гидрофильность, присутствие или отсутствие доноров и/или акцепторов Льюиса, подходящие для специфического связывания с молекулами-мишенями или с представляющими интерес молекулами, то есть, с препро-вазопрессином или с его фрагментами, включая копептин. Таким образом, связывание может, например, опосредоваться ионными взаимодействиями, ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями, пи-пи-взаимодействиями, сигма-пи-взаимодействиями, гидрофобными взаимодействиями или взаимодействиями посредством водородных связей, или комбинациями двух или более из вышеупомянутых взаимодействий между связывающим агентом и молекулами-мишенями или представляющими интерес молекулами. Такие связывающие агенты могут быть выбраны из группы, состоящей из антител и аптамеров, но не ограничивающейся ими. As used herein, the term “binding agent” means any substance capable of binding to an epitope contained in the amino acid sequence corresponding to the C-terminal portion of prepro-vasopressin (SEQ ID NO. 1). This binding agent usually has an adequate shape, as well as corresponding spatial and surface properties, such as surface charge, hydrophobicity, hydrophilicity, the presence or absence of Lewis donors and / or acceptors, suitable for specific binding to target molecules or molecules of interest, then there is, with prepro-vasopressin or with its fragments, including copeptin. Thus, the binding may, for example, be mediated by ionic interactions, van der Waals interactions, pi-pi interactions, sigma-pi interactions, hydrophobic interactions or interactions via hydrogen bonds, or combinations of two or more of the above interactions between a binding agent and target molecules or molecules of interest. Such binding agents may be selected from, but not limited to, the group of antibodies and aptamers.

Предпочтительно, указанным связывающим агентом является антитело, а более предпочтительно, моноклональное антитело, поликлональная антисыворотка, обогащенное или очищенное поликлональное антитело, рекомбинантное антитело или их функциональные производные. Используемый здесь термин «антитело», если это не оговорено особо, употребляется в своем широком смысле и означает молекулы антитела и ряд молекул, происходящих от антитела. Такие молекулы, происходящие от антитела, содержат по меньшей мере одну вариабельную область (вариабельную область тяжелой цепи или легкой цепи), а также отдельные легкие цепи антител, отдельные тяжелые цепи антител, химерные гибриды между цепями антител и других молекул и т.п. Функциональными иммуноглобулиновыми фрагментами согласно изобретению могут быть Fv; scFv; Fv, связанный дисульфидным мостиком; Fab и F(ab’)₂. Термин «антитело» также включает поликлональные антитела, моноклональные антитела, а предпочтительно, антитела IgG1, химерные моноклональные антитела, гуманизованные антитела, генетически сконструированные моноклональные антитела. Функциональные производные представляют собой химически и/или биологически модифицированные варианты антител/антисыворотки, имеющие аналогичные функциональные свойства/связывающую способность. Аналогичным образом, формирующий агент может представлять собой любое вещество, подходящее для получения связывающего агента согласно изобретению. Предпочтительным формирующим агентом является иммуноген, а наиболее предпочтительно, природный или синтетический пептид, включающий аминокислотную последовательность длиной по меньшей мере в 6 аминокислот, содержащуюся в аминокислотной последовательности, соответствующей С-концевой части препро-вазопрессина (SEQ ID NO. 1).Preferably, said binding agent is an antibody, and more preferably a monoclonal antibody, a polyclonal antiserum, an enriched or purified polyclonal antibody, a recombinant antibody, or functional derivatives thereof. The term “antibody”, as used herein, unless otherwise indicated, is used in its broadest sense and refers to an antibody molecule and a series of molecules derived from an antibody. Such molecules derived from antibodies contain at least one variable region (variable region of the heavy chain or light chain), as well as individual light antibody chains, individual antibody heavy chains, chimeric hybrids between chains of antibodies and other molecules, and the like. Functional immunoglobulin fragments according to the invention may be Fv; scFv; Fv linked by a disulfide bridge; Fab and F (ab ') ₂ . The term “antibody” also includes polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and preferably IgG1 antibodies, chimeric monoclonal antibodies, humanized antibodies, genetically engineered monoclonal antibodies. Functional derivatives are chemically and / or biologically modified variants of antibodies / antisera having similar functional properties / binding ability. Similarly, the forming agent may be any substance suitable for preparing the binding agent of the invention. A preferred forming agent is an immunogen, and most preferably, a natural or synthetic peptide comprising an amino acid sequence of at least 6 amino acids contained in the amino acid sequence corresponding to the C-terminal portion of prepro-vasopressin (SEQ ID NO. 1).

Используемый здесь термин «формирующий агент» означает вещество, родственное сайту связывания и используемое для получения связывающего агента, например, аминокислотной последовательности. Формирующий агент может состоять из аминокислотной последовательности, описанной выше, либо он может содержать аминокислотную последовательность как функциональную часть соединения. Так, например, формирующий агент может также содержать связывающую часть, такую как другая аминокислотная последовательность. Предпочтительно, формирующий агент выбран из группы, включающий пептиды, состоящие из аминокислот 146-163 (SEQ ID NO. 7), 146-162 (SEQ ID NO. 8), 146-161 (SEQ ID NO. 9), 146-160 (SEQ ID NO. 10), 146-159 (SEQ ID NO. 11), 146-158 (SEQ ID NO. 12) и 146-157 (SEQ ID NO. 13) препро-вазопрессина (SEQ ID NO. 1). Эти пептиды и их применение в способе согласно изобретению также являются частью настоящего изобретения. Способы получения связывающих агентов, а в частности, антител с использованием пептидов, по существу, известны специалистам, а поэтому нет необходимости описывать их в настоящей заявке. As used herein, the term “forming agent” means a substance related to the binding site and used to produce a binding agent, for example, an amino acid sequence. The forming agent may consist of the amino acid sequence described above, or it may contain the amino acid sequence as a functional part of the compound. So, for example, the forming agent may also contain a binding part, such as another amino acid sequence. Preferably, the forming agent is selected from the group comprising peptides consisting of amino acids 146-163 (SEQ ID NO. 7), 146-162 (SEQ ID NO. 8), 146-161 (SEQ ID NO. 9), 146-160 (SEQ ID NO. 10), 146-159 (SEQ ID NO. 11), 146-158 (SEQ ID NO. 12) and 146-157 (SEQ ID NO. 13) prepro-vasopressin (SEQ ID NO. 1) . These peptides and their use in the method according to the invention are also part of the present invention. Methods for producing binding agents, and in particular antibodies using peptides, are essentially known to those skilled in the art, and therefore there is no need to describe them in this application.

В стадии (b) согласно изобретению определяют способность связывающего агента связываться с аминокислотной последовательностью, содержащейся в аминокислотной последовательности, соответствующей С-концевой части, но не содержащей аминокислоту 164 препро-вазопрессина (SEQ ID NO. 1). В этом случае, а также в стадии (c), аминокислотные последовательности и С-концевая часть определены как это указано выше в стадии (a), за исключением того, что длина аминокислотной последовательности по меньшей мере в 4 аминокислоты рассматривается как достаточная для определения связывания. Предпочтительно, указанная аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере 6, предпочтительно, по меньшей мере 8, более предпочтительно, по меньшей мере 10, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере 12 непрерывно следующих друг за другом аминокислот, содержащихся в аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам 146-163 препро-вазопрессина (SEQ ID NO. 1), а предпочтительно, она представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислот 146-163 (SEQ ID NO. 7), 146-162 (SEQ ID NO. 8), 146-161 (SEQ ID NO. 9), 146-160 (SEQ ID NO. 10), 146-159 (SEQ ID NO. 11), 146-158 (SEQ ID NO. 12) и 146-157 (SEQ ID NO. 13) препро-вазопрессина (SEQ ID NO. 1). In step (b) of the invention, the ability of the binding agent to bind to the amino acid sequence contained in the amino acid sequence corresponding to the C-terminal portion but not containing prepro-vasopressin amino acid 164 (SEQ ID NO. 1) is determined. In this case, as well as in step (c), the amino acid sequences and the C-terminal portion are determined as described above in step (a), except that the length of the amino acid sequence of at least 4 amino acids is considered sufficient to determine binding . Preferably, the specified amino acid sequence contains at least 6, preferably at least 8, more preferably at least 10, and most preferably at least 12 continuously following each other amino acids contained in the amino acid sequence corresponding to amino acids 146- 163 prepro-vasopressin (SEQ ID NO. 1), and preferably, it is an amino acid sequence selected from the group consisting of amino acids 146-163 (SEQ ID NO. 7), 146-162 (SEQ ID NO. 8), 146-161 (SEQ ID NO. 9), 14 6-160 (SEQ ID NO. 10), 146-159 (SEQ ID NO. 11), 146-158 (SEQ ID NO. 12) and 146-157 (SEQ ID NO. 13) prepro-vasopressin (SEQ ID NO. . one).

Стадия (b) может быть проведена, например, как дополнение к стадии (a) в целях подтверждения пригодности данного связывающего агента, полученного в стадии продуцирования. Однако, более предпочтительно, стадия (b) может быть проведена для того, чтобы определить, является ли связывающий агент, если он не был получен с использованием селективного формирующего агента, как описано в стадии (a), и, если не ясно, необходима ли аминокислота 164, присутствующая в эпитопе, для связывания, фактически способным связываться с аминокислотной последовательностью длиной по меньшей мере в 4 аминокислоты, содержащейся в аминокислотной последовательности, соответствующей С-концевой части, но не содержащей аминокислоту 164 препро-вазопрессина (SEQ ID NO. 1). Это также относится к смесям связывающих агентов, где может оказаться необходимым определить, содержат ли эти смеси связывающие агенты, которым, для их эффективного связывания, требуется присутствие аминокислоты 164 в эпитопе. Если это подтвердится, то такие нежелательные связывающие агенты могут быть, затем удалены в последующей стадии. Stage (b) can be carried out, for example, as an addition to stage (a) in order to confirm the suitability of this binding agent obtained in the production stage. However, more preferably, step (b) can be carried out in order to determine whether the binding agent is, if it was not obtained using a selective forming agent, as described in step (a), and if it is not clear whether amino acid 164 present in the epitope for binding, actually capable of binding to an amino acid sequence of at least 4 amino acids contained in the amino acid sequence corresponding to the C-terminal portion, but not containing amino acid 164 prepro azopressina (SEQ ID NO. 1). This also applies to mixtures of binding agents, where it may be necessary to determine whether these mixtures contain binding agents, which, for their effective binding, require the presence of amino acid 164 in the epitope. If this is confirmed, then such undesirable binding agents can then be removed in a subsequent step.

Стадия (b) может быть проведена с применением любого подходящего метода определения, известного специалисту. Предпочтительным способом определения способности связывающего агента связываться с аминокислотной последовательностью длиной по меньшей мере в 4 аминокислоты, соответствующей аминокислотной последовательности С-концевой части препро-вазопрессина, является картирование эпитопов. Способ картирования эпитопов известен специалистам. Картирование эпитопов представляет собой способ идентификации сайтов связывания или «эпитопов» связывающих агентов на их антигенах-мишенях. Существует два типа общих структур, которые используются связывающими агентами для связывания с антигенами, а именно, линейная и конформационная структура. Линейные эпитопы образованы непрерывной последовательностью аминокислот белка, а конформационные эпитопы состоят из аминокислот, которые имеют дискретную последовательность белка, но все вместе они образуют трехмерную укладку белка. Существует несколько методов картирования эпитопов для связывания на антигенах-мишенях. Метод, называемый «золотым стандартом», представляет собой комбинированный метод рентгеновской кристаллографии, который позволяет непосредственно визуализировать взаимодействие между антигеном и связывающим агентом. Однако, осуществление этого способа связано с определенными техническими трудностями, поскольку он требует больших количеств очищенного белка и больших затрат времени и средств. Альтернативой способу картирования эпитопов является пептидное сканирование. Этот метод заключается в использовании библиотеки коротких пептидных последовательностей, происходящих от перекрывающихся сегментов белка-мишени, и в проведении тестов на их способность связываться с представляющим интерес антителом. Этот метод является более быстрым и относительно не дорогостоящим, однако, он применяется, главным образом, для картирования линейных, а не конформационных эпитопов. Для того чтобы определить, может ли связывающий агент связываться с соответствующей аминокислотной последовательностью, указанная аминокислотная последовательность может быть прямо или опосредованно присоединена к твердой фазе. Аминокислотная последовательность для непрямого связывания может содержать эту аминокислотную последовательность как функциональную часть соединения. Так, например, указанная аминокислотная последовательность может дополнительно содержать связывающую часть, такую как биотин. Биотинилированные аминокислотные последовательности могут быть иммобилизованы посредством стрептавидина, авидина, нейтравидина или каптавидина, которые непосредственно связаны с твердой фазой. Поскольку биотин связывается со стрептавидином, авидином, нейтравидином или каптавидином с очень высокой аффинностью и специфичностью, то впоследствии, аминокислотную последовательность, тестируемую на связывание с соответствующим связывающим агентом, опосредованно присоединяют к твердой фазе с использованием комплекса «биотин/стрептавидин». Другим методом картирования эпитопов является сайт-направленный мутагенез. При применении такого метода, системные мутации аминокислот вводят в последовательность белка, а затем определяют уровень специфического связывания связывающего агента в целях идентификации аминокислот, составляющих эпитоп. Этот способ целесообразно использовать для картирования линейных и конформационных эпитопов, однако, он является довольно трудоемким и требует много времени, а поэтому, анализ обычно ограничивается только небольшим числом аминокислотных остатков. Все эти методы могут быть применены в стадии (b) согласно изобретению. Однако в этом способе предпочтительно оценивать уровень связывания связывающего агента с вариантами связывающей области. Такие варианты могут быть усеченными, мутированными, удлиненными или как-либо иначе модифицированными вариантами связывающей области, которые обычно получают методами химического синтеза или методами молекулярной биологии в виде рекомбинантных пептидов/белков. Следует отметить, что на интерпретацию экспериментальных данных картирования эпитопов могут существенно влиять условия проведения эксперимента, такие как, например, количество мишеней для связывания, концентрации используемого связывающего агента, применяемый метод детектирования, созданные условия инкубирования и т.п. Тем не менее, этот метод известен специалистам, а поэтому он также может быть принят во внимание. Stage (b) can be carried out using any suitable determination method known to the person skilled in the art. A preferred method for determining the ability of a binding agent to bind to an amino acid sequence of at least 4 amino acids in length corresponding to the amino acid sequence of the C-terminal portion of prepro-vasopressin is epitope mapping. A method for mapping epitopes is known in the art. Epitope mapping is a method of identifying binding sites or “epitopes” of binding agents on their target antigens. There are two types of general structures that are used by binding agents to bind to antigens, namely, a linear and conformational structure. Linear epitopes are formed by a continuous sequence of protein amino acids, and conformational epitopes are composed of amino acids that have a discrete protein sequence, but together they form a three-dimensional protein folding. There are several methods for mapping epitopes for binding to target antigens. The method, called the "gold standard", is a combined method of x-ray crystallography, which allows you to directly visualize the interaction between the antigen and the binding agent. However, the implementation of this method is associated with certain technical difficulties, since it requires large quantities of purified protein and a large investment of time and money. An alternative to the epitope mapping method is peptide scanning. This method consists of using a library of short peptide sequences originating from overlapping segments of the target protein and testing their ability to bind to the antibody of interest. This method is faster and relatively inexpensive, however, it is mainly used for mapping linear, rather than conformational, epitopes. In order to determine whether a binding agent can bind to the corresponding amino acid sequence, the specified amino acid sequence can be directly or indirectly attached to the solid phase. The amino acid sequence for indirect binding may contain this amino acid sequence as a functional part of the compound. So, for example, the specified amino acid sequence may additionally contain a binding part, such as biotin. Biotinylated amino acid sequences can be immobilized by streptavidin, avidin, neutravidin or captavidin, which are directly linked to the solid phase. Since biotin binds to streptavidin, avidin, neutravidin or captavidin with very high affinity and specificity, subsequently, the amino acid sequence tested for binding to the corresponding binding agent is indirectly coupled to the solid phase using the biotin / streptavidin complex. Another method for epitope mapping is site-directed mutagenesis. Using this method, systemic amino acid mutations are introduced into the protein sequence, and then the level of specific binding of the binding agent is determined in order to identify the amino acids that make up the epitope. This method is advisable to use for mapping linear and conformational epitopes, however, it is quite time-consuming and time-consuming, and therefore, the analysis is usually limited to only a small number of amino acid residues. All of these methods can be applied in stage (b) according to the invention. However, in this method, it is preferable to evaluate the level of binding of the binding agent to variants of the binding region. Such variants may be truncated, mutated, elongated or otherwise modified variants of the binding region, which are usually obtained by chemical synthesis methods or molecular biology methods in the form of recombinant peptides / proteins. It should be noted that the interpretation of experimental data on epitope mapping can be significantly affected by the experimental conditions, such as, for example, the number of targets for binding, the concentration of the binding agent used, the detection method used, the incubation conditions created, etc. However, this method is known to those skilled in the art, and therefore it can also be taken into account.

Если, например, окажется, что в описанной выше стадии определения (b) была получена смесь связывающих агентов или если указанный способ приводит к получению смеси связывающих агентов, а указанная смесь содержит нежелательные связывающие агенты, которым, для их эффективного связывания требуется аминокислота 164, присутствующая в эпитопе, то такие нежелательные связывающие агенты либо должны быть удалены, либо по меньшей мере должно быть уменьшено их количество. Для этих целей, в этот способ согласно изобретению была включена стадия (c), где нужный связывающий агент, которому не требуется для связывания аминокислоты 164, присутствующей в эпитопе препро-вазопрессина, и который дает улучшенные результаты анализа, был выбран так, чтобы он мог быть отделен от нежелательного связывающего агента. Такая стадия отбора может быть осуществлена любым способом, подходящим для селективного отбора нужного связывающего агента в целях увеличения его количества по сравнению с количеством нежелательного связывающего агента. Предпочтительным способом достижения этой цели является аффинное разделение. В этом способе используются различные связывающие свойства разделенных молекул. Наиболее распространенным способом является аффинная хроматография, в которой лиганд, специфичный к сайту связывания молекулы-мишени, присоединяют к инертной хроматографической матрице. При этих условиях связывания, такой специфический лиганд, присутствующий на хроматографической матрице, будет связываться с молекулами только специфически. Все другие компоненты образца будут проходить через хроматографическую среду в несвязанном виде. После стадии промывки, связанные молекулы могут быть затем подвернуты высвобождению и элюированию путем изменения условий в сторону диссоциации или путем добавления избытка вещества, которое будет вытеснять молекулу-мишень из аффинного лиганда (конкурентное элюирование). Таким образом, связывающий агент может присутствовать в выделенной или очищенной форме. Однако настоящее изобретение не ограничивается вышеуказанными стадиями отбора, очистки и выделения, и это означает, что могут быть применены и любые другие подходящие методы. If, for example, it turns out that, in the above determination step (b), a mixture of binding agents was obtained, or if the specified method yields a mixture of binding agents, and the specified mixture contains undesirable binding agents, which require effective amino acid 164, present in the epitope, then such undesirable binding agents must either be removed, or at least their quantity must be reduced. For these purposes, step (c) was included in this method according to the invention, where the desired binding agent, which is not required to bind amino acid 164 present in the prepro-vasopressin epitope, and which gives improved analysis results, was selected so that it could be separated from the unwanted binding agent. Such a selection step may be carried out by any method suitable for selectively selecting the desired binding agent in order to increase its amount compared to the amount of undesired binding agent. The preferred way to achieve this goal is affinity separation. This method uses various binding properties of the separated molecules. The most common method is affinity chromatography, in which a ligand specific to the binding site of the target molecule is attached to an inert chromatographic matrix. Under these binding conditions, such a specific ligand present on a chromatographic matrix will only bind specifically to molecules. All other components of the sample will pass through the chromatographic medium in an unbound form. After the washing step, the bound molecules can then be subjected to release and elution by changing the conditions towards dissociation or by adding an excess of substance that will displace the target molecule from the affinity ligand (competitive elution). Thus, the binding agent may be present in isolated or purified form. However, the present invention is not limited to the above stages of selection, purification and isolation, and this means that any other suitable methods can be applied.

Для того, чтобы определить, требует ли связывающий агент присутствия аминокислоты 164 препро-вазопрессина в эпитопе для связывания, могут быть также проведены анализы на связывание в соответствии со стадиями (d) и (e) согласно изобретению. Обе эти стадии позволяют проводить опосредованную характеризацию специфичности связывающего агента к эпитопу и таким образом, подтвердить пригодность данного связывающего агента. In order to determine whether the binding agent requires the presence of amino acid 164 prepro-vasopressin in the epitope for binding, binding assays can also be carried out in accordance with steps (d) and (e) according to the invention. Both of these stages allow an indirect characterization of the specificity of the binding agent to the epitope and, thus, confirm the suitability of this binding agent.

Используемый здесь термин «анализ» может означать анализ любого типа, применяемый в области диагностики. Такой анализ может быть проведен на основе связывания детектируемого аналита с одним или более зондами для захвата с определенной аффинностью. Что касается взаимодействия между молекулами для захвата и молекулами-мишенями или представляющими интерес молекулами, то их константа аффинности, предпочтительно, превышает 10⁸ M^-1. «Молекулами для захвата» являются молекулы, которые могут быть использованы для связывания с молекулами-мишенями или с представляющими интерес молекулами. Таким образом, молекулы для захвата должны иметь адекватную форму с точки зрения пространственных и поверхностных свойств, таких как поверхностный заряд, гидрофобность, гидрофильность, присутствие или отсутствие доноров и/или акцепторов Льюиса, подходящих для специфического связывания с молекулами-мишенями или с представляющими интерес молекулами. Как упоминалось выше, такое связывание может быть опосредовано, например, ионными взаимодействиями, ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями, пи-пи-взаимодействиями, сигма-пи-взаимодействиями, гидрофобными взаимодействиями или взаимодействиями посредством водородных связей, или комбинациями двух или более из вышеупомянутых взаимодействий между молекулами для захвата и молекулами-мишенями или представляющими интерес молекулами. As used herein, the term “analysis” may mean any type of analysis used in the diagnostic field. Such an analysis can be carried out based on the binding of the detected analyte to one or more probes for capture with a certain affinity. As for the interaction between capture molecules and target molecules or molecules of interest, their affinity constant is preferably greater than 10 ⁸ M ^-1 . “Capture molecules” are molecules that can be used to bind to target molecules or molecules of interest. Thus, capture molecules must have an adequate shape in terms of spatial and surface properties, such as surface charge, hydrophobicity, hydrophilicity, the presence or absence of Lewis donors and / or acceptors suitable for specific binding to target molecules or molecules of interest . As mentioned above, such a binding can be mediated, for example, by ionic interactions, van der Waals interactions, pi-pi interactions, sigma-pi interactions, hydrophobic interactions or interactions via hydrogen bonds, or combinations of two or more of the above interactions between capture molecules and target molecules or molecules of interest.

Указанные анализы могут быть осуществлены в различных форматах, таких как, например, радиоиммуноанализ (РИА), хемилюминесцентные и флуоресцентные иммуноанализы, твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), анализы с использованием массивов сфер на основе Luminex, анализы с использованием микромассивов белков и анализы в формате экспресс-тестов, такие как, например, иммунохроматографические тест-полоски.These analyzes can be carried out in various formats, such as, for example, radioimmunoassay (RIA), chemiluminescent and fluorescence immunoassays, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), analyzes using arrays of spheres based on Luminex, analyzes using protein microarrays and analyzes in express format -tests, such as, for example, immunochromatographic test strips.

Такие анализы могут быть гомогенными или гетерогенными, конкурентными и неконкурентными. В особенно предпочтительном варианте изобретения, указанный анализ проводят в форме «сэндвич-анализа», представляющего собой неконкурентный иммуноанализ, в котором детектируемую и/или количественно оцениваемую молекулу присоединяют к первому антителу и ко второму антителу. Первое антитело может быть связано с твердой фазой, например, со сферой, с поверхностью лунки или другого контейнера, а также с чипом или с полоской, а вторым антителом является антитело, которое было помечено, например, красителем, радиоизотопом или реакционноспособной или каталитически активной молекулой. Затем, количество меченого антитела, связанного с аналитом, определяют с применением соответствующего метода. Общая схема и процедуры «сэндвич-анализов» подробно описаны в литературе и известны специалистам (см. руководство The Immunoassay Handbook, Ed. David Wild, Elsevier LTD, Oxford; 3rd ed. (May 2005), ISBN-T3: 978-0080445267; Hultschig C et al., Curr Opin Chem Biol. 2006 Feb; 10(1):4-10. PMID: 16376134, которое вводится в настоящее описание посредством ссылки).Such assays may be homogeneous or heterogeneous, competitive and non-competitive. In a particularly preferred embodiment of the invention, said assay is carried out in the form of a “sandwich assay”, which is a non-competitive immunoassay in which a detectable and / or quantifiable molecule is coupled to a first antibody and a second antibody. The first antibody can be associated with a solid phase, for example, with a sphere, with the surface of a hole or other container, as well as with a chip or strip, and the second antibody is an antibody that has been labeled, for example, with a dye, radioisotope or a reactive or catalytically active molecule . Then, the amount of labeled antibody bound to the analyte is determined using the appropriate method. The general scheme and procedures for “sandwich analyzes” are described in detail in the literature and are known to those skilled in the art (see The Immunoassay Handbook, Ed. David Wild, Elsevier LTD, Oxford; 3rd ed. (May 2005), ISBN-T3: 978-0080445267; Hultschig C et al., Curr Opin Chem Biol. 2006 Feb; 10 (1): 4-10. PMID: 16376134, which is incorporated herein by reference).

В особенно предпочтительном варианте изобретения, в указанном анализе используют две молекулы для захвата, предпочтительно, антитела, которые присутствуют в виде дисперсий в жидкой реакционной смеси, где первый компонент для мечения присоединен к первой молекуле для захвата и является частью системы мечения, проводимого на основе гашения флуоресценции или хемилюминесценции или амплификации, а второй компонент для мечения, входящий в указанную систему мечения, присоединен ко второй молекуле для захвата, так, чтобы после связывания обеих молекул для захвата с аналитом генерировался измеримый сигнал, позволяющий детектировать образовавшиеся ««сэндвич»-комплексы в растворе, содержащем указанный образец. In a particularly preferred embodiment of the invention, said assay uses two capture molecules, preferably antibodies that are present as dispersions in the liquid reaction mixture, where the first tagging component is attached to the first capture molecule and is part of the quench-based tagging system fluorescence or chemiluminescence or amplification, and the second component for labeling, included in the specified labeling system, is attached to the second molecule for capture, so that after binding both x molecules to capture with the analyte generated a measurable signal that allows you to detect the resulting "sandwich" complexes in a solution containing the specified sample.

Еще более предпочтительно, чтобы указанная система мечения содержала редкоземельные криптаты или редкоземельные хелаты в комбинации с флуоресцентным красителем или с хемилюминесцентным красителем, а в частности, с красителем цианинового типа.Even more preferably, said labeling system contains rare earth cryptates or rare earth chelates in combination with a fluorescent dye or a chemiluminescent dye, and in particular a cyanine-type dye.

В стадии (d), анализ на связывание осуществляют с использованием связывающего агента для определения ex vivo стабильности препро-вазопрессина или его фрагментов, включая копептин, в биологическом образце. Как было показано в настоящем изобретении, стабильность аналита была выше в том случае, когда использовался связывающий агент, которому для связывания не требуется присутствия аминокислоты 164 препро-вазопрессина или его фрагмента, по сравнению со связывающим агентом, для связывания которого требовалось присутствие указанной аминокислоты 164. Следовательно, по стабильности аналита можно сделать выводы относительно типа связывающего агента. Такими аналитами, имеющими наивысшую стабильность, являются аналиты, для связывания которых не требуется присутствия аминокислоты 164, а поэтому, такие связывающие агенты являются предпочтительными с точки зрения настоящего изобретения. Связывающие агенты, для связывания которых, как уже известно, не требуется присутствия аминокислоты 164, могут быть использованы в целях сравнения, то есть, стабильность аналита, связанного с этими сравниваемыми связывающими агентами, может быть использована в качестве стандарта, с которым можно сравнивать стабильность аналита, оцениваемую для новых связывающих агентов. In step (d), a binding assay is performed using a binding agent to determine ex vivo stability of prepro-vasopressin or fragments thereof, including copeptin, in a biological sample. As shown in the present invention, analyte stability was higher when a binding agent was used that does not require the presence of amino acid 164 prepro-vasopressin or a fragment thereof to bind, compared with a binding agent that requires the presence of said amino acid 164 to bind. Therefore, on the stability of the analyte, conclusions can be drawn regarding the type of binding agent. Such analytes having the highest stability are analytes for the binding of which the presence of amino acid 164 is not required, and therefore, such binding agents are preferred from the point of view of the present invention. Binding agents, for the binding of which, as is already known, the presence of amino acid 164 is not required, can be used for comparison purposes, that is, the stability of the analyte associated with these comparable binding agents can be used as a standard with which the stability of the analyte can be compared. evaluated for new binding agents.

В стадии (e), которая может быть проведена в качестве альтернативы стадии (d) или дополнения к стадии (d), также используется другой связывающий агент для сравнения, а анализы на связывание осуществляют с использованием этого связывающего агента для сравнения и нового связывающего агента для определения концентрации препро-вазопрессина или его фрагментов, включая копептин, в биологическом образце. Связывающим агентом, подходящим для сравнения, является связывающий агент, которому, как уже известно, для связывания с указанным эпитопом не требуется присутствия указанной аминокислоты 164 препро-вазопрессина. Как и ожидалось, новый связывающий агент, которому для связывания с указанным эпитопом также не требовалось присутствия указанной аминокислоты 164 препро-вазопрессина, давал в результате аналогичные или более высокие концентрации препро-вазопрессина или его фрагментов, включая копептин, в биологическом образце, при сравнении со связывающим агентом, используемым для сравнения, тогда как связывающие агенты, требующие присутствия указанной аминокислоты 164, как и ожидалось, давали более низкие концентрации. In step (e), which can be performed as an alternative to step (d) or in addition to step (d), another binding agent is also used for comparison, and binding assays are carried out using this binding agent for comparison and a new binding agent for determining the concentration of prepro-vasopressin or its fragments, including copeptin, in a biological sample. A binding agent suitable for comparison is a binding agent which, as is already known, does not require the presence of said amino acid 164 prepro-vasopressin to bind to said epitope. As expected, the new binding agent, which also did not require the presence of the indicated amino acid 164 prepro-vasopressin to bind to the indicated epitope, resulted in similar or higher concentrations of prepro-vasopressin or its fragments, including copeptin, in a biological sample, when compared with the binding agent used for comparison, while binding agents requiring the presence of the specified amino acid 164, as expected, gave lower concentrations.

Как уже упоминалось выше, способ согласно изобретению может включать только одну из стадий (a)-(e). Так например, он может состоять только из стадии (a), стадии (b), стадии (c), стадии (d) или стадии (e). Однако, такой способ также включает комбинации из двух или более стадий (a)-(e), которые могут быть проведены в любом подходящем порядке. Так, например, после стадии получения, которая, предположительно, может давать смесь, содержащую желательные и нежелательные связывающие агенты, может быть проведена стадия анализа, такая как стадия (b), (d) или (e), а после нее может быть проведена, но необязательно, стадия отбора нужных связывающих агентов, которая может быть осуществлена в соответствии со стадией (с), а затем, если это необходимо, может быть проведена стадия выделения, с получением большого количества нужного связывающего агента (который, как упоминалось выше, может представлять собой смесь нужных связывающих агентов).As mentioned above, the method according to the invention may include only one of the stages (a) to (e). For example, it may consist only of stage (a), stage (b), stage (c), stage (d) or stage (e). However, such a method also includes combinations of two or more stages (a) to (e), which may be carried out in any suitable order. So, for example, after a preparation step, which, presumably, can produce a mixture containing the desired and undesired binding agents, an analysis step such as step (b), (d) or (e) can be carried out, and after it can be carried out but optionally, a step of selecting the desired binding agents, which can be carried out in accordance with step (c), and then, if necessary, an isolation step can be carried out to obtain a large amount of the desired binding agent (which, as mentioned above, can presented It is a mixture of the desired binding agents).

С применением способа согласно изобретению, включающего по меньшей мере одну из стадий (a)-(e), можно получить такие связывающие агенты, которые будут эффективно связываться с эпитопом, содержащимся в аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам 138-163, но не содержащей аминокислоту 164 препро-вазопрессина (SEQ ID NO. 1), где указанными связывающими агентами, как было неожиданно обнаружено авторами изобретения, являются связывающие агенты, которым, для их эффективного связывания, не требуется присутствия аминокислоты 164 в эпитопе аминокислотной последовательности, соответствующей С-концевой части препро-вазопрессина. Таким образом, более точные результаты анализа могут быть получены с помощью связывающего агента, продуцированного способом согласно изобретению, или набора, содержащего указанный связывающий агент, и использованы для качественного или количественного детектирования препро-вазопрессина или его фрагментов, включая копептин, в биологическом образце.Using the method according to the invention, comprising at least one of the stages (a) to (e), it is possible to obtain such binding agents that will effectively bind to the epitope contained in the amino acid sequence corresponding to amino acids 138-163, but not containing amino acid 164 prepro-vasopressin (SEQ ID NO. 1), wherein said binding agents, as was unexpectedly discovered by the inventors, are binding agents which, for their effective binding, do not require the presence of amino acid 164 in the epithet ne amino acid sequence corresponding to the C-terminal part of prepro-vasopressin. Thus, more accurate analysis results can be obtained using a binding agent produced by the method according to the invention, or a kit containing the specified binding agent, and used for the qualitative or quantitative detection of prepro-vasopressin or its fragments, including copeptin, in a biological sample.

Биологический образец, может представлять собой физиологическую жидкость любого типа, предпочтительно, выбранную из группы, включающей кровь, сыворотку, плазму, мочу, цереброспинальную жидкость и слюну. Предпочтительным образцом является проба крови, а наиболее предпочтительно, проба сыворотки или проба плазмы. Если это необходимо, то образец, перед его применением в соответствии с настоящим изобретением, может быть подвергнут гомогенизации или экстракции растворителем с получением жидкого образца. Таким образом, жидким образцом может быть раствор или суспензия. Жидкие образцы, перед их применением в соответствии с настоящим изобретением, могут быть подвергнуты одной или более стадиям предварительной обработки. Такой предварительной обработкой являются, но не ограничиваются ими, разведение, фильтрация, центрифугирование, концентрирование, седиментация, осаждение и диализ. Предварительная обработка может также включать добавление к раствору химических или биохимических веществ, таких как кислоты, основания, буферы, соли, растворители, реакционноспособные красители, детергенты, эмульгаторы, хелатообразующие агенты. The biological sample may be any type of physiological fluid, preferably selected from the group consisting of blood, serum, plasma, urine, cerebrospinal fluid, and saliva. A preferred sample is a blood sample, and most preferably a serum sample or a plasma sample. If necessary, the sample, before its use in accordance with the present invention, can be subjected to homogenization or solvent extraction to obtain a liquid sample. Thus, the liquid sample may be a solution or suspension. Liquid samples, before their use in accordance with the present invention, can be subjected to one or more stages of pre-treatment. Such pre-treatments include, but are not limited to, dilution, filtration, centrifugation, concentration, sedimentation, precipitation, and dialysis. Pretreatment may also include the addition of chemical or biochemical substances to the solution, such as acids, bases, buffers, salts, solvents, reactive dyes, detergents, emulsifiers, chelating agents.

В контексте настоящего описания, «плазма» представляет собой фактически бесклеточный супернатант крови, содержащий антикоагулянт, полученный после центрифугирования. Репрезентативными антикоагулянтами являются соединения, связывающиеся с ионами кальция, такие как EDTA или цитрат, и ингибиторы тромбина, такие как гепаринаты или гирудин. Бесклеточная плазма может быть получена путем центрифугирования крови, обработанной антикоагулянтами (например, крови, обработанной цитратом, EDTA или гепарином), в течение по меньшей мере 15 минут при 2000-3000×g. Поэтому, предпочтительно, чтобы пробы плазмы согласно изобретению были подвергнуты центрифугированию при более, чем 1500×g в течение 30 минут, предпочтительно, по меньшей мере при 2000×g в течение по меньшей мере 30 минут, более предпочтительно, по меньшей мере при 3000×g в течение по меньшей мере 20 минут, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере при 3000×g в течение по меньшей мере 30 минут. In the context of the present description, "plasma" is actually a cell-free blood supernatant containing an anticoagulant obtained after centrifugation. Representative anticoagulants are compounds that bind to calcium ions, such as EDTA or citrate, and thrombin inhibitors, such as heparins or hirudin. Cell-free plasma can be obtained by centrifuging blood treated with anticoagulants (for example, blood treated with citrate, EDTA or heparin) for at least 15 minutes at 2000-3000 × g. Therefore, it is preferable that the plasma samples according to the invention are centrifuged at more than 1500 × g for 30 minutes, preferably at least 2000 × g for at least 30 minutes, more preferably at least 3000 × g for at least 20 minutes, and most preferably at least 3000 × g for at least 30 minutes.

В контексте настоящего описания, «сыворотка» представляет собой неразведенную внеклеточную часть крови после ее адекватного свертывания. Свертывание крови обычно происходит за 30 минут. Сыворотка может быть получена путем центрифугирования пробы свернутой крови в течение по меньшей мере 10 минут при скорости минимум 1500×g. Поэтому, предпочтительно, чтобы проба сыворотки согласно изобретению была подвергнута центрифугированию при скорости по меньшей мере 1500×g в течение по меньшей мере 10 минут, предпочтительно, по меньшей мере в течение 15 минут, а более предпочтительно, по меньшей мере в течение 20 минут. Наиболее предпочтительно, чтобы проба сыворотки была подвергнута центрифугированию при скорости по меньшей мере 3000×g в течение по меньшей мере 20 минут. In the context of the present description, "serum" is the undiluted extracellular part of the blood after its adequate coagulation. Blood coagulation usually occurs in 30 minutes. Serum can be obtained by centrifuging a clotted blood sample for at least 10 minutes at a speed of at least 1,500 x g. Therefore, it is preferable that the serum sample according to the invention be centrifuged at a speed of at least 1500 × g for at least 10 minutes, preferably at least 15 minutes, and more preferably at least 20 minutes. Most preferably, the serum sample is centrifuged at a speed of at least 3000 × g for at least 20 minutes.

Надежность результатов при определении препро-вазопрессина или его фрагментов может быть даже увеличена с использованием, помимо связывающего агента согласно изобретению, по меньшей мере одного другого связывающего агента. Такой другой связывающий агент, в отличие от связывающего агента согласно изобретению, соответственно связывается с другим эпитопом препро-вазопрессина или его фрагментов. Предпочтительным эпитопом, используемым другим связывающим агентом для связывания, предпочтительно, является эпитоп, который полностью или частично содержится в аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам 126-164 препро-вазопрессина (SEQ. ID NO. 1). Особенно предпочтительно, чтобы такой эпитоп полностью или частично содержался в аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам 126-146 препро-вазопрессина, а наиболее предпочтительно, аминокислотам 126-137 препро-вазопрессина. В этом контексте описания, термин «частично содержится» означает, что только часть эпитопа находится в аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам 126-164 препро-вазопрессина, а другая часть расположена выше по направлению к N-концу аминокислотной последовательности. То есть, часть этого эпитопа перекрывается с указанной аминокислотной последовательностью препро-вазопрессина, а остальная часть эпитопа находится выше. Такое перекрывание, предпочтительно, составляет по меньшей мере 6 аминокислот. Термин «дополнительный связывающий агент» означает любое вещество, способное связываться с эпитопом, полностью или частично содержащимся в аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам 126-164 препро-вазопрессина (SEQ ID NO. 1). Предпочтительным дополнительным связывающим агентом является антитело, а более предпочтительно, моноклональное антитело, поликлональная антисыворотка, обогащенное или очищенное поликлональное антитело, рекомбинантное антитело или их функциональные производные. The reliability of the results in determining prepro-vasopressin or its fragments can even be increased by using, in addition to the binding agent according to the invention, at least one other binding agent. Such another binding agent, unlike the binding agent according to the invention, respectively binds to another epitope of prepro-vasopressin or its fragments. A preferred epitope used by another binding agent for binding is preferably an epitope that is fully or partially contained in the amino acid sequence corresponding to amino acids 126-164 of prepro-vasopressin (SEQ. ID NO. 1). It is particularly preferred that such an epitope is fully or partially contained in the amino acid sequence corresponding to amino acids 126-146 of prepro-vasopressin, and most preferably, amino acids 126-137 of prepro-vasopressin. In this context of the description, the term "partially contained" means that only part of the epitope is in the amino acid sequence corresponding to amino acids 126-164 of prepro-vasopressin, and the other part is located higher towards the N-end of the amino acid sequence. That is, part of this epitope overlaps with the indicated amino acid sequence of prepro-vasopressin, and the rest of the epitope is higher. Such overlap is preferably at least 6 amino acids. The term “additional binding agent” means any substance capable of binding to an epitope fully or partially contained in the amino acid sequence corresponding to amino acids 126-164 of prepro-vasopressin (SEQ ID NO. 1). A preferred additional binding agent is an antibody, and more preferably, a monoclonal antibody, a polyclonal antiserum, an enriched or purified polyclonal antibody, a recombinant antibody, or functional derivatives thereof.

Ниже представлено более подробное описание настоящего изобретения со ссылками на прилагаемый графический материал и примеры. Графический материал и примеры относятся к предпочтительным вариантам изобретения, которое не ограничивается этими вариантами и включает все другие варианты его осуществления, входящие в объем формулы изобретения. Below is a more detailed description of the present invention with reference to the accompanying graphic material and examples. Graphic material and examples relate to preferred variants of the invention, which is not limited to these variants and includes all other variants of its implementation, included in the scope of the claims.

Описание графического материалаDescription of graphic material

Фиг. 1. Картирование эпитопа для овечьей анти-PLAY17 антисыворотки (фиг. 1 (A)), аффинно очищенного овечьего поликлонального анти-PLAY17 антитела (фиг. 1 (B)), mAb 429/F4 (фиг. 1 (С) и mAb 423/F10 (фиг. 1 (D)). Результаты представлены как данные по связыванию с соответствующим указанным пептидом минус неспецифическое связывание (то есть, связывание, достигаемое в отсутствии тестируемого антитела), по отношению к связыванию с пептидом P146-164 минус неспецифическое связывание. Результаты даны для различных разведений/количеств тестируемых антисывороток/антител. FIG. 1. Epitope mapping for sheep anti-PLAY17 antiserum (FIG. 1 (A)), affinity purified sheep polyclonal anti-PLAY17 antibody (FIG. 1 (B)), mAb 429 / F4 (FIG. 1 (C) and mAb 423 / F10 (Fig. 1 (D)): The results are presented as binding data for the corresponding peptide minus non-specific binding (i.e., binding achieved in the absence of the test antibody) with respect to binding to the P146-164 peptide minus non-specific binding. Results are given for various dilutions / amounts of antisera / antibodies tested.

Фиг. 2 Кривые «доза-ответ» для анализов с использованием поликлональных (pc) анти-PLAY17 антител/моноклональных (mc) анти-PATV17 антител (фиг. 2 (A)), mAb 429/F4/mc анти-PATV17 антител (Фиг. 2 (B)), mAb 423/F10/mc анти-PATV17 антител (фиг. 2 (С).FIG. 2 Dose-response curves for assays using polyclonal (pc) anti-PLAY17 antibodies / monoclonal (mc) anti-PATV17 antibodies (FIG. 2 (A)), mAb 429 / F4 / mc anti-PATV17 antibodies (FIG. 2 (B)), mAb 423 / F10 / mc anti-PATV17 antibodies (Fig. 2 (C).

Фиг. 3. Корреляция проб сыворотки, проанализированных с использованием pc анти-PLAY17 антител/mc анти-PATV17 антител и mAb 429/F4/mc анти-PATV17 антител (фиг. 3 (A)), pc анти-PLAY17 антител/mc анти-PATV17 антител и mAb 423/F10/mc анти-PATV17 антител (фиг. 3 (B)), mAb 423/F10/mc анти-PATV17 антител и mAb 429/F4/mc анти-PATV17 антител (Fig. 3 (С)).FIG. 3. Correlation of serum samples analyzed using pc anti-PLAY17 antibodies / mc anti-PATV17 antibodies and mAb 429 / F4 / mc anti-PATV17 antibodies (Fig. 3 (A)), pc anti-PLAY17 antibodies / mc anti-PATV17 antibodies and mAb 423 / F10 / mc anti-PATV17 antibodies (Fig. 3 (B)), mAb 423 / F10 / mc anti-PATV17 antibodies and mAb 429 / F4 / mc anti-PATV17 antibodies (Fig. 3 (C)) .

Фиг. 4. Корреляция проб EDTA-плазмы, оцененных с использованием pc анти-PLAY17 антител/mc анти-PATV17 антител и mAb 429/F4/mc анти-PATV17 антител (фиг. 4 (A)), pc анти-PLAY17 антитело/mc анти-PATV17 антител и mAb 423/F10/mc анти-PATV17 антител (фиг. 4 (B)), mAb 423/F10/mc анти-PATV17 антител и mAb 429/F4/mc анти-PATV17 антител (Fig. 4 (С).FIG. 4. Correlation of EDTA plasma samples evaluated using pc anti-PLAY17 antibodies / mc anti-PATV17 antibodies and mAb 429 / F4 / mc anti-PATV17 antibodies (Fig. 4 (A)), pc anti-PLAY17 antibody / mc anti -PATV17 antibodies and mAb 423 / F10 / mc anti-PATV17 antibodies (Fig. 4 (B)), mAb 423 / F10 / mc anti-PATV17 antibodies and mAb 429 / F4 / mc anti-PATV17 antibodies (Fig. 4 (C )

Фиг. 5. Стабильность аналита. Указаны средние величины (ср.кв.откл.) для пяти проб сыворотки после их хранения при 22°C в течение определенных периодов времени по отношению к величинам, полученным для проб, не находившихся на хранении (t=0), где указанные пробы были оценены с помощью описанных здесь анализов. FIG. 5. The stability of the analyte. The average values (cf. off) are indicated for five serum samples after storage at 22 ° C for certain periods of time in relation to the values obtained for samples not stored (t = 0), where these samples were evaluated using the analyzes described here.

ПримерыExamples

Пептиды Peptides

Нижеследующие пептиды, родственные копептину, химически синтезировали, очищали и контроль их качества осуществляли в соответствии со стандартными процедурами: The following peptides related to copeptin were chemically synthesized, purified, and their quality control was carried out in accordance with standard procedures:

ПептидPeptide ПоследовательностьSequence SEQ ID NO:SEQ ID NO: Положение аминокислот препро-вазопрессинаThe amino acid position of prepro-vasopressin PAY16PAY16 CAGAPEPFEPAQPDAYCAGAPEPFEPAQPDAY 4four 150-164(+N-концевой цистеин)150-164 (+ N-terminal cysteine) PAY14PAY14 CAPEPFEPAQPDAYCAPEPFEPAQPDAY 33 152-164(+N-концевой цистеин)152-164 (+ N-terminal cysteine) Р146-164P146-164 LVQLAGAPEPFEPAQPDAYLVQLAGAPEPFEPAQPDAY 66 146-164146-164 Р146-163P146-163 LVQLAGAPEPFEPAQPDALVQLAGAPEPFEPAQPDA 77 146-163146-163 Р146-162P146-162 LVQLAGAPEPFEPAQPDLVQLAGAPEPFEPAQPD 88 146-162146-162 Р146-161P146-161 LVQLAGAPEPFEPAQPLVQLAGAPEPFEPAQP 99 146-161146-161

Р146-159P146-159 LVQLAGAPEPFEPALVQLAGAPEPFEPA 11eleven 146-159146-159 Р146-158P146-158 LVQLAGAPEPFEPLVQLAGAPEPFEP 1212 146-158146-158 Р146-157P146-157 LVQLAGAPEPFELVQLAGAPEPFE 1313 146-157146-157

АнтителаAntibodies

Моноклональные антитела против пептидов PAY16 и PAY14 получали стандартными методами (Harlow E, Lane D. Antibodies - A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Lane RD. A short-duration polyethylene glycol fusion technique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas. J. Immunol Methods 1985; 81: 223-8).Monoclonal antibodies against the PAY16 and PAY14 peptides were obtained by standard methods (Harlow E, Lane D. Antibodies - A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Lane RD. A short-duration polyethylene glycol fusion technique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas. J. Immunol Methods 1985; 81: 223-8).

Вкратце, пептиды конъюгировали с BSA с использованием сульфо-MBS (сложного эфира м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида). Мышей Balb/c иммунизировали этими конъюгатами, а затем подвергали бустер-иммунизации, и клетки селезенки подвергали слиянию с миеломными клетками SP2/0 с получением гибридомных клеточных линий. Клеточные линии скринировали на их способность секретировать антитела, связывающиеся с иммуногенными пептидами, которые были нанесены на твердую полистироловую фазу. Briefly, peptides were conjugated to BSA using sulfo-MBS (m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester). Balb / c mice were immunized with these conjugates and then booster immunized, and spleen cells were fused with SP2 / 0 myeloma cells to produce hybridoma cell lines. Cell lines were screened for their ability to secrete antibodies that bind to immunogenic peptides that were coated on the solid polystyrene phase.

С применением такого метода получали клеточные линии, секретирующие моноклональные антитела 429/F4 (против PAY16) и 423/F10 (против PAY14). В последующих экспериментах, моноклональные антитела выделяли из супернатанта культуры с помощью аффинной хроматографии на G-белке. Using this method, cell lines secreting monoclonal antibodies 429 / F4 (against PAY16) and 423 / F10 (against PAY14) were obtained. In subsequent experiments, monoclonal antibodies were isolated from the culture supernatant using G protein affinity chromatography.

Овечью антисыворотку и соответствующие аффинно очищенные поликлональные овечьи антитела против пептида PLAY17 («pc анти-PLAY антитела»), используемые в анализах, проводимых в хемилюминесцентной/сенсибилизированной пробирке для детектирования копептина (CT-proAVP) как описано в [4, 7], закупали у BRAHMS GmbH, Hennigsdorf, Germany. Sheep antiserum and the corresponding affinity purified polyclonal sheep antibodies against the PLAY17 peptide (“pc anti-PLAY antibodies”) used in assays performed in a chemiluminescent / sensitized tube for the detection of copopeptin (CT-proAVP) as described in [4, 7], were purchased at BRAHMS GmbH, Hennigsdorf, Germany.

Картирование эпитоповEpitope mapping

Эпитопы для антител картировали следующим образом: Epitopes for antibodies were mapped as follows:

a) Нанесение пептидовa) Application of peptides

Нанесение пептидов осуществляли в соответствии со стандартными процедурами (EP 1488209 A1, EP 1738178 A1): Полистироловые пробирки Startubes (Greiner) покрывали пептидами P146-164, P146-163, P146-162, P146-161, P146-159, P146-158 и Ρ146-157 (на пробирку, 1,5 мкг пептида в 300 мкл PBS, pH 7,8) в течение ночи при 22°C. Затем пробирки блокировали 10 ммоль/л Na-фосфата (pH 6,5), содержащего 3% Karion FP (Merck), 0,5% BSA без протеазы (Sigma), и лиофилизовали.Peptides were applied in accordance with standard procedures (EP 1488209 A1, EP 1738178 A1): Startubes polystyrene tubes (Greiner) were coated with peptides P146-164, P146-163, P146-162, P146-161, P146-159, P146-158 and Ρ146-157 (per tube, 1.5 μg peptide in 300 μl PBS, pH 7.8) overnight at 22 ° C. The tubes were then blocked with 10 mmol / L Na-phosphate (pH 6.5) containing 3% Karion FP (Merck), 0.5% BSA without protease (Sigma), and lyophilized.

b) Мечение ослиными антителами против овечьих IgG и козьими антителами против мышиных IgG b) Labeling with donkey anti-sheep IgG antibodies and goat anti-mouse IgG antibodies

Мечение проводили в соответствии со стандартными процедурами (EP 1488209 A1, EP 1738178 A1). Концентрацию ослиных антител против антител овцы (Scantibodies Laboratory Inc., USA) и козьих антител против антител мыши (BiosPacific, USA) доводили до 1 г/л, и антитела метили путем инкубирования с хемилюминесцентной меткой «MACN-акридиний-NHS-эфир» (1 г/л; InVent GmbH, Hennigsdorf, Germany) в молярном отношении 1:4 в течение 20 минут при комнатной температуре. Реакции прекращали путем добавления 1/10 объема 1 ммоль/л Триса в течение 10 минут при комнатной температуре. Меченые антитела отделяли от свободной метки с помощью эксклюзионной хроматографии на колонке NAP-5 (GE Healthcare, Freiburg, Germany) и на 5 мкм ВЭЖХ-колонке Thermo BioBasic 300 (Thermo Scientific).Labeling was carried out in accordance with standard procedures (EP 1 488 209 A1, EP 1 738 178 A1). The concentration of donkey antibodies against sheep antibodies (Scantibodies Laboratory Inc., USA) and goat antibodies against mouse antibodies (Bios Pacific, USA) was adjusted to 1 g / l, and the antibodies were labeled by incubation with the chemiluminescent label "MACN-acridinium-NHS-ether" ( 1 g / l; InVent GmbH, Hennigsdorf, Germany) in a 1: 4 molar ratio for 20 minutes at room temperature. The reactions were terminated by adding 1/10 volume of 1 mmol / L Tris for 10 minutes at room temperature. Labeled antibodies were separated from the free label by size exclusion chromatography on a NAP-5 column (GE Healthcare, Freiburg, Germany) and on a 5 μm Thermo BioBasic 300 HPLC column (Thermo Scientific).

c) Поликлональная (pc) анти-PLAY17 антисыворотка/аффинно очищенное антителоc) Polyclonal (pc) anti-PLAY17 antiserum / affinity purified antibody

Метку получали путем разведения меченного ослиного антитела против овечьих IgG в аналитическом буфере PBS с 0,5% альбумином бычьей сыворотки без протеазы (Sigma), содержащем 106 относительных световых единиц (RLU) MACN-меченного антитела на 200 мкл. Поликлональную (Pc) овечью анти-PLAY17 антисыворотку (B.R.A.H.M.S GmbH, Hennigsdorf, Germany) разводили PBS с 0,5% альбумином бычьей сыворотки (без протеазы) в отношениях 1:1000, 1:3000, 1:9000, 1:27000 и 1:81000. Аффинно очищенные поликлональные овечьи анти-PLAY17 антитела разводили PBS с 0,5% альбумином бычьей сыворотки без протеазы, до следующих концентраций: 972, 324, 108, 36 и 12 нг/200 мкл. В первой стадии инкубирования, 50 мкл разведений поликлональной овечьей анти-PLAY17 антисыворотки/очищенных антител и 200 мкл PBS с 0,5% альбумином бычьей сыворотки (без протеазы) пипетировали в пробирки, покрытые пептидами P146-164, P146-163, P146-162, P146-161, P146-159, P146-158 и P146-157. Для определения уровня неспецифического связывания (NSB), в пробирки, покрытые пептидами P146-164, P146-163, P146-162, P146-161, P146-159, P146-158 и P146-157, пипетировали только 250 мкл PBS с 0,5% альбумином бычьей сыворотки (без протеазы). Эти пробирки инкубировали в течение ночи при 22°C с перемешиванием. Затем пробирки 5 раз промывали 1 мл промывочного раствора B.R.A.H.M.S (B.R.A.H.M.S GmbH). Во второй стадии инкубирования добавляли 200 мкл меченного ослиного антитела против овечьих IgG, и пробирки инкубировали в течение 2 часов при 22°C с перемешиванием. Затем пробирки 5 раз промывали 1 мл промывочного раствора B.R.A.H.M.S, и связанную хемилюминесценцию измеряли в течение 1 секунды на пробирку с помощью люминометра LB 952T (Berthold).The label was obtained by diluting labeled donkey anti-sheep IgG antibody in PBS assay buffer with 0.5% bovine serum albumin without protease (Sigma) containing 106 relative light units (RLU) of MACN-labeled antibody per 200 μl. Polyclonal (Pc) sheep anti-PLAY17 antiserum (BRAHMS GmbH, Hennigsdorf, Germany) was diluted with PBS with 0.5% bovine serum albumin (without protease) in the ratios 1: 1000, 1: 3000, 1: 9000, 1: 27000 and 1 : 81000. Affinity purified polyclonal sheep anti-PLAY17 antibodies were diluted with PBS with 0.5% bovine serum albumin without protease to the following concentrations: 972, 324, 108, 36, and 12 ng / 200 μl. In the first stage of incubation, 50 μl of dilutions of polyclonal sheep anti-PLAY17 antiserum / purified antibodies and 200 μl of PBS with 0.5% bovine serum albumin (without protease) were pipetted into tubes coated with peptides P146-164, P146-163, P146-162 , P146-161, P146-159, P146-158 and P146-157. To determine the level of non-specific binding (NSB), only 250 μl of PBS with 0, was pipetted into tubes coated with peptides P146-164, P146-163, P146-162, P146-161, P146-159, P146-158 and P146-157 5% bovine serum albumin (no protease). These tubes were incubated overnight at 22 ° C with stirring. Then the tubes were washed 5 times with 1 ml of B.R.A.H.M.S washing solution (B.R.A.H.M.S GmbH). In a second incubation step, 200 μl of labeled donkey anti-sheep IgG antibody was added, and the tubes were incubated for 2 hours at 22 ° C. with stirring. Then the tubes were washed 5 times with 1 ml of B.R.A.H.M.S wash solution, and the associated chemiluminescence was measured for 1 second per tube using a LB 952T luminometer (Berthold).

d) mAb 429/F4 и mAb 423/F10d) mAb 429 / F4 and mAb 423 / F10

Метку получали путем разведения меченного козьего антитела против мышиных IgG в аналитическом буфере (PBS, 0,5% с альбумином бычьей сыворотки без протеазы), содержащем 106 относительных световых единиц (RLU) MACN-меченного антитела на 200 мкл. Моноклональные антитела 429/F4 и 423/F10 разводили PBS с 0,5% альбумином бычьей сыворотки (без протеазы) до следующих концентраций: 972, 324, 108, 36 и 12 нг/200 мкл. The label was obtained by diluting goat-labeled anti-mouse IgG antibody in assay buffer (PBS, 0.5% with bovine serum albumin without protease) containing 106 relative light units (RLUs) of MACN-labeled antibody per 200 μl. Monoclonal antibodies 429 / F4 and 423 / F10 were diluted with PBS with 0.5% bovine serum albumin (without protease) to the following concentrations: 972, 324, 108, 36, and 12 ng / 200 μl.

В первой стадии инкубирования, 50 мкл разведений mAb 429/F4/mAb 423/F10 и 200 мкл PBS с 0,5% альбумином бычьей сыворотки (без протеазы) пипетировали в пробирки, покрытые пептидами P146-164, P146-163, P146-162, P146-161, P146-159, P146-158 и P146-157. Для определения NSB, в пробирки, покрытые пептидами P146-164, P146-163, P146-162, P146-161, P146-159, P146-158 и P146-157, пипетировали только 250 мкл PBS с 0,5% альбумином бычьей сыворотки (без протеазы). Эти пробирки инкубировали в течение ночи при 22°C с перемешиванием. Затем пробирки 5 раз промывали 1 мл промывочного раствора B.R.A.H.M.S (B.R.A.H.M.S GmbH, Henninsdorf, Germany). Во второй стадии инкубирования добавляли 200 мкл меченного козьего антитела против антитела мыши, и пробирки инкубировали в течение 2 часов при 22°C с перемешиванием. Затем пробирки 5 раз промывали 1 мл промывочного раствора B.R.A.H.M.S, и связанную хемилюминесценцию измеряли в течение 1 секунды на пробирку с помощью люминометра LB 952T (Berthold).In the first stage of incubation, 50 μl of dilutions of mAb 429 / F4 / mAb 423 / F10 and 200 μl of PBS with 0.5% bovine serum albumin (without protease) were pipetted into tubes coated with peptides P146-164, P146-163, P146-162 , P146-161, P146-159, P146-158 and P146-157. To determine NSB, only 250 μl of PBS with 0.5% bovine serum was pipetted into tubes coated with peptides P146-164, P146-163, P146-162, P146-161, P146-159, P146-158 and P146-157 (without protease). These tubes were incubated overnight at 22 ° C with stirring. The tubes were then washed 5 times with 1 ml of B.R.A.H.M.S wash solution (B.R.A.H.M.S GmbH, Henninsdorf, Germany). In a second incubation step, 200 μl of labeled goat anti-mouse antibody was added, and the tubes were incubated for 2 hours at 22 ° C. with stirring. Then the tubes were washed 5 times with 1 ml of B.R.A.H.M.S wash solution, and the associated chemiluminescence was measured for 1 second per tube using a LB 952T luminometer (Berthold).

На фиг. 1(A)-1(D) проиллюстрировано наблюдаемое связывание антисыворотки и антител с пептидами, представляющими собой С-концевую полноразмерную часть и усеченные варианты С-концевой части копептина. Овечья анти-PLAY17 антисыворотка, аффинно очищенное овечье поликлональное анти-PLAY17 антитело и mAb 429/F4 обнаруживали почти аналогичное связывание с пептидными последовательностями, соответствующими положениям аминокислот 146-164, 146-163, 146-162, 146-161 препро-вазопрессина. Что касается пептидных вариантов, то варианты с большим усечением по С-концу обнаруживали меньший уровень связывания. Снижение уровня связывания зависело от концентрации используемых антител. Что касается тестируемых антисывороток/антител, то можно сделать вывод, что эпитопы для этих антисывороток/антител не содержат аминокислоты в положениях 161-164 препро-вазопрессина. В отличие от этого, связывание mAb 423/F10 было эффективным лишь по отношению к пептиду, соответствующему положениям аминокислот 146-164 препро-вазопрессина, и существенно снижалось в случае связывания с пептидными вариантами, усеченным по С-концу. Следовательно, в эпитопе для mAb 423/F10 присутствовала аминокислота в положении 164 препро-вазопрессина.In FIG. 1 (A) -1 (D) illustrates the observed binding of antiserum and antibodies to peptides representing the C-terminal full-length part and truncated variants of the C-terminal part of copeptin. The sheep anti-PLAY17 antiserum, affinity purified sheep polyclonal anti-PLAY17 antibody and mAb 429 / F4 showed almost similar binding to peptide sequences corresponding to amino acid positions 146-164, 146-163, 146-162, 146-161 prepro-vasopressin. As for peptide variants, variants with greater truncation at the C-terminus showed a lower level of binding. The decrease in the level of binding depended on the concentration of antibodies used. As for the tested antisera / antibodies, it can be concluded that the epitopes for these antisera / antibodies do not contain amino acids at positions 161-164 of prepro-vasopressin. In contrast, binding of mAb 423 / F10 was only effective with respect to the peptide corresponding to amino acid positions 146-164 of prepro-vasopressin, and was significantly reduced when binding to peptide variants truncated at the C-terminus. Therefore, the amino acid at position 164 of prepro-vasopressin was present in the epitope for mAb 423 / F10.

ИммуноанализыImmunoassays

Мечение моноклональных антител Labeling of Monoclonal Antibodies

Мечение проводили в соответствии со стандартными процедурами (EP 1488209 A1, EP 1738178 A1). Концентрацию очищенных антител 429/F4 и 423/F10 доводили до 1 г/л, и антитела метили путем инкубирования с хемилюминесцентной меткой «MACN-акридиний-NHS-эфир» (1 г/л; InVent GmbH, Hennigsdorf, Germany) в молярном отношении 1:5 в течение 20 минут при комнатной температуре. Реакции прекращали путем добавления 1/10 объема 1 ммоль/л Триса в течение 10 минут при комнатной температуре. Меченые антитела отделяли от свободной метки с помощью эксклюзионной хроматографии на колонке NAP-5 (GE Healthcare, Freiburg, Germany) и на 5 мкм ВЭЖХ-колонке Thermo BioBasic 300 (Thermo Scientific).Labeling was carried out in accordance with standard procedures (EP 1 488 209 A1, EP 1 738 178 A1). The concentration of purified antibodies 429 / F4 and 423 / F10 was adjusted to 1 g / l, and the antibodies were labeled by incubation with a chemiluminescent label "MACN-acridinium-NHS-ether" (1 g / l; InVent GmbH, Hennigsdorf, Germany) in molar ratio 1: 5 for 20 minutes at room temperature. The reactions were terminated by adding 1/10 volume of 1 mmol / L Tris for 10 minutes at room temperature. Labeled antibodies were separated from the free label by size exclusion chromatography on a NAP-5 column (GE Healthcare, Freiburg, Germany) and on a 5 μm Thermo BioBasic 300 HPLC column (Thermo Scientific).

Три ««сэндвич»-иммуноанализа были проведены или разработаны следующим образом: Three sandwich immunoassays were performed or developed as follows:

A. Pc анти-PLAY17/mc анти-PATV17 антителаA. Pc anti-PLAY17 / mc anti-PATV17 antibody

Стандарт CT-proAVP LIA (B.R.A.H.M.S GmbH, Hennigsdorf, Germany), описанный в [7].Standard CT-proAVP LIA (B.R.A.H.M.S GmbH, Hennigsdorf, Germany) described in [7].

B. mAb 429/F4/mc анти-PATV17 антителаB. mAb 429 / F4 / mc anti-PATV17 antibody

Метку получали путем разведения меченого антитела 429/F4 в аналитическом буфере (300 ммоль/л фосфата калия, 100 ммоль/л NaCl, 10 ммоль/л натрий-EDTA, 5 г/л альбумина бычьей сыворотки без протеазы, 1 г/л неспецифических овечьих IgG, 1 г/л неспецифических бычьих IgG, 1 г/л неспецифических мышиных IgG, 0,9 г/л азида натрия, pH 7,0), содержащем 106 относительных световых единиц (RLU) MACN-меченного антитела на 200 мкл. 50 мкл стандартов CT pro-AVP (B.R.A.H.M.S GmbH), Hennigsdorf, Germany)/образцов и 200 мкл метки пипетировали в пробирки, покрытые CT pro-AVP (B.R.A.H.M.S GmbH). Пробирки инкубировали в течение 2 часов при 22°C с перемешиванием. Затем пробирки 5 раз промывали 1 мл промывочного раствора (B.R.A.H.M.S, GmbH), и связанную хемилюминесценцию измеряли в течение 1 секунды на пробирку с помощью люминометра LB 952T (Berthold). The label was obtained by diluting the labeled 429 / F4 antibody in assay buffer (300 mmol / L potassium phosphate, 100 mmol / L NaCl, 10 mmol / L sodium EDTA, 5 g / L bovine serum albumin without protease, 1 g / L non-specific sheep IgG, 1 g / L non-specific bovine IgG, 1 g / L non-specific mouse IgG, 0.9 g / L sodium azide, pH 7.0) containing 106 relative light units (RLUs) of MACN-labeled antibody per 200 μl. 50 μl of CT pro-AVP standards (B.R.A.H.M.S GmbH), Hennigsdorf, Germany) / samples and 200 μl of label were pipetted into tubes coated with CT pro-AVP (B.R.A.H.M. GmbH). The tubes were incubated for 2 hours at 22 ° C with stirring. Then the tubes were washed 5 times with 1 ml of washing solution (B.R.A.H.M.S, GmbH), and the associated chemiluminescence was measured for 1 second per tube using an LB 952T luminometer (Berthold).

С. mAb 423/F10/mc анти-PATV17 антитело C. mAb 423 / F10 / mc anti-PATV17 antibody

Метку получали путем разведения меченых антител 423/F10 в аналитическом буфере (300 ммоль/л фосфата калия, 100 ммоль/л NaCl, 10 ммоль/л натрий-EDTA, 5 г/л альбумина бычьей сыворотки без протеазы, 1 г/л неспецифических овечьих IgG, 1 г/л неспецифических бычьих IgG, 1 г/л неспецифических мышиных IgG, 0,9 г/л азида натрия, pH 7,0), содержащем 106 относительных световых единиц (RLU) MACN-меченного антитела на 200 мкл. 50 мкл стандартов CT pro-AVP (B.R.A.H.M.S GmbH, Hennigsdorf, Germany)/образцов и 200 мкл метки пипетировали в пробирки, покрытые CT pro-AVP (B.R.A.H.M.S GmbH). Пробирки инкубировали в течение 2 часов при 22°C с перемешиванием. Затем пробирки 5 раз промывали 1 мл промывочного раствора (B.R.A.H.M.S, GmbH), и связанную хемилюминесценцию измеряли в течение 1 секунды на пробирку с помощью люминометра LB 952T (Berthold).The label was obtained by diluting labeled 423 / F10 antibodies in assay buffer (300 mmol / L potassium phosphate, 100 mmol / L NaCl, 10 mmol / L sodium EDTA, 5 g / L bovine serum albumin without protease, 1 g / L non-specific sheep IgG, 1 g / L non-specific bovine IgG, 1 g / L non-specific mouse IgG, 0.9 g / L sodium azide, pH 7.0) containing 106 relative light units (RLUs) of MACN-labeled antibody per 200 μl. 50 μl of CT pro-AVP standards (B.R.A.H.M.S GmbH, Hennigsdorf, Germany) / samples and 200 μl of label were pipetted into tubes coated with CT pro-AVP (B.R.A.H.M. GmbH). The tubes were incubated for 2 hours at 22 ° C with stirring. Then the tubes were washed 5 times with 1 ml of washing solution (B.R.A.H.M.S, GmbH), and the associated chemiluminescence was measured for 1 second per tube using an LB 952T luminometer (Berthold).

Типичные кривые «доза-ответ» для этих трех анализов представлены на фиг. 2. Typical dose-response curves for these three assays are shown in FIG. 2.

Сравнение методов Method Comparison

С помощью вышеописанных трех анализов были оценены различные клинические образцы, включая пробы, взятые у здоровых индивидуумов, у пациентов с болезнями сердца и у пациентов с ICU. Графические сравнения методов анализа представлены на фиг. 3 (для сыворотки) и фиг. 4 (для пробы EDTA-плазмы). Идеальные коэффициенты корреляции Спирмана были получены при сравнении анализа, проводимого с использованием pc анти-PLAY17/mc анти-PATV17 антител, с анализом, проводимым с использованием mAb 429/F4/mAb PATV17, тогда как явные различия наблюдались при сравнении анализа, проводимого с использованием mAb 423/F10/mc анти-PATV17 антител, с анализом, проводимым с использованием pc анти-PLAY17 антител/mc анти-PATV17 антител или с анализом, проводимым с использованием mAb 429/F4/mc анти-PATV17 антител. Различия были более явно выражены при использовании сыворотки, а не проб EDTA-плазмы. Наблюдаемые различия явно ассоциировались с эпитопами для антител. Эпитоп для mAb 423/F10 содержит аминокислоту в положении 164 препро-вазопрессина, а эпитопы поликлональных анти-PLAY17 антител и mAb 429/F4 не содержат аминокислоты в положениях 161-164 препро-вазопрессина. Очевидно, что в сыворотке и в плазме, помимо полноразмерного копептина, присутствуют также варианты, усеченные по С-концу. Поскольку пробы, используемые в сравнении методов, были подвергнуты замораживанию сразу после сбора и оттаиванию непосредственно перед их оценкой, то частичное усечение по С-концу, очевидно, не является последствием хранения этих проб ex vivo, а уже происходило in vivo.Using the above three analyzes, various clinical samples were evaluated, including samples taken from healthy individuals, patients with heart disease, and patients with ICU. Graphical comparisons of the analysis methods are presented in FIG. 3 (for serum) and FIG. 4 (for sample EDTA plasma). Spearman's ideal correlation coefficients were obtained by comparing the analysis using pc anti-PLAY17 / mc anti-PATV17 antibodies with the analysis using mAb 429 / F4 / mAb PATV17, while clear differences were observed when comparing the analysis using mAb 423 / F10 / mc anti-PATV17 antibodies, with analysis using pc anti-PLAY17 antibodies / mc anti-PATV17 antibodies or with analysis using mAb 429 / F4 / mc anti-PATV17 antibodies. Differences were more pronounced when using serum rather than EDTA plasma samples. The observed differences were clearly associated with antibody epitopes. The epitope for mAb 423 / F10 contains the amino acid at position 164 of prepro-vasopressin, and the epitopes of polyclonal anti-PLAY17 antibodies and mAb 429 / F4 do not contain the amino acid at positions 161-164 of prepro-vasopressin. Obviously, in serum and plasma, in addition to full-sized copeptin, there are also variants truncated at the C-terminus. Since the samples used in comparing the methods were frozen immediately after collection and thawed immediately before their evaluation, the partial truncation at the C-terminus is obviously not a consequence of the storage of these samples ex vivo, but already occurred in vivo.

Стабильность аналитаAnalyte stability

Субсерию проб сыворотки, используемых в сравнениях методов анализа, хранили в течение различных периодов времени при 22°C, а затем оценивали путем проведения трех анализов. При проведении анализа с использованием mAb 423/F10/mc анти-PATV17 антител, выход резко снижался уже после 1-го дня хранения при 22°C. Эпитоп для mAb 423/F10 содержал аминокислоту в положении 164 препро-вазопрессина. В отличие от этого, аналит был гораздо более стабильным при проведении анализа с использованием pc анти-PLAY17 антител/mc анти-PATV17 антител или mAb 429/F4/mc анти-PATV17 антител. Эпитопы для pc анти-PLAY17 антител и mAb 429/F4 не содержали аминокислоты в положениях 161-164 препро-вазопрессина.A subset of serum samples used in comparisons of assay methods was stored for various periods of time at 22 ° C and then evaluated by three assays. When conducting analysis using mAb 423 / F10 / mc anti-PATV17 antibodies, the yield sharply decreased after 1 day of storage at 22 ° C. The epitope for mAb 423 / F10 contained the amino acid at position 164 of prepro-vasopressin. In contrast, the analyte was much more stable when tested using pc anti-PLAY17 antibodies / mc anti-PATV17 antibodies or mAb 429 / F4 / mc anti-PATV17 antibodies. Epitopes for pc anti-PLAY17 antibodies and mAbs 429 / F4 did not contain amino acids at positions 161-164 of prepro-vasopressin.

Последовательности The sequence

SEQ ID NO. 2 (Копептин) SEQ ID NO. 2 (Copeptin)

ASDRSNATQLDGPACALLLRLVQLAGAPEPFEPAQPDAY ASDRSNATQLDGPACALLLRLVQLAGAPEPFEPAQPDAY

(представляющая собой последовательность с аминокислотами в положениях 126-164 препро-вазопрессина)(which is a sequence with amino acids at positions 126-164 of prepro-vasopressin)

SEQ ID NO. 3 (Пептид PAY14) SEQ ID NO. 3 (Peptide PAY14)

CAPEPFEPAQPDAY CAPEPFEPAQPDAY

(представляющая собой последовательность с аминокислотами в положениях 152-164 препро-вазопрессина + N-концевой цистеин)(which is a sequence with amino acids at positions 152-164 of prepro-vasopressin + N-terminal cysteine)

SEQ ID NO. 4 (Пептид PAY16) SEQ ID NO. 4 (PAY16 Peptide)

CAGAPEPFEPAQPDAY CAGAPEPFEPAQPDAY

(представляющая собой последовательность с аминокислотами в положениях 150-164 препро-вазопрессина + N-концевой цистеин)(which is a sequence with amino acids at positions 150-164 of prepro-vasopressin + N-terminal cysteine)

SEQ ID NO. 5 (Пептид PAY33) SEQ ID NO. 5 (PAY33 Peptide)

ATQLDGPAGALLLRLVQLAGAPEPFEPAQPDAY ATQLDGPAGALLLRLVQLAGAPEPFEPAQPDAY

(представляющая собой последовательность с аминокислотами в положениях 132-164 препро-вазопрессина)(which is a sequence with amino acids at positions 132-164 of prepro-vasopressin)

SEQ ID NO. 6 (Пептид P146-164) SEQ ID NO. 6 (Peptide P146-164)

LVQLAGAPEPFEPAQPDAY LVQLAGAPEPFEPAQPDAY

(представляющая собой последовательность с аминокислотами в положениях 146-164 препро-вазопрессина)(which is a sequence with amino acids at positions 146-164 of prepro-vasopressin)

SEQ ID NO. 7 (Пептид P146-163) SEQ ID NO. 7 (Peptide P146-163)

LVQLACAPEPFEPAQPDA LVQLACAPEPFEPAQPDA

(представляющая собой последовательность с аминокислотами в положениях 146-163 препро-вазопрессина)(which is a sequence with amino acids at positions 146-163 of prepro-vasopressin)

SEQ ID NO. 8 (Пептид P146-162) SEQ ID NO. 8 (Peptide P146-162)

LVQLACAPEPFEPAQPD LVQLACAPEPFEPAQPD

(представляющая собой последовательность с аминокислотами в положениях 146-162 препро-вазопрессина)(which is a sequence with amino acids at positions 146-162 of prepro-vasopressin)

SEQ ID NO. 9 (Пептид P146-161) SEQ ID NO. 9 (Peptide P146-161)

LVQLAGAPEPFEPAQP LVQLAGAPEPFEPAQP

(представляющая собой последовательность с аминокислотами в положениях 146-161 препро-вазопрессина)(which is a sequence with amino acids at positions 146-161 of prepro-vasopressin)

SEQ ID NO. 10 (Пептид P146-160) SEQ ID NO. 10 (Peptide P146-160)

LVQLACAPEPFEPAQ LVQLACAPEPFEPAQ

(представляющая собой последовательность с аминокислотами в положениях 146-160 препро-вазопрессина)(which is a sequence with amino acids at positions 146-160 of prepro-vasopressin)

SEQ ID NO. 11 (Пептид P146-159) SEQ ID NO. 11 (Peptide P146-159)

LVQLAGAPEPFEPA LVQLAGAPEPFEPA

(представляющая собой последовательность с аминокислотами в положениях 146-159 препро-вазопрессина)(which is a sequence with amino acids at positions 146-159 of prepro-vasopressin)

SEQ ID NO. 12 (Пептид P146-158) SEQ ID NO. 12 (Peptide P146-158)

LVQLACAPEPFEP LVQLACAPEPFEP

(представляющая собой последовательность с аминокислотами в положениях 146-158 препро-вазопрессина)(representing a sequence with amino acids at positions 146-158 of prepro-vasopressin)

SEQ ID NO. 13 (Пептид P146-157) SEQ ID NO. 13 (Peptide P146-157)

LVQLACAPEPFE LVQLACAPEPFE

(представляющая собой последовательность с аминокислотами в положениях 146-157 препро-вазопрессина)(which is a sequence with amino acids at positions 146-157 of prepro-vasopressin)

БиблиографияBibliography

1. Kluge M, Riedl S, Erhart-Hofmann B, Hartmann J., Waldhauser F. Improved extraction procedure and RIA for determination of arginine-8-vasopressin in plasma: role of premeas-urement sample treatment and reference values in children. Clin Chem 1999;45:98-103. 1. Kluge M, Riedl S, Erhart-Hofmann B, Hartmann J., Waldhauser F. Improved extraction procedure and RIA for determination of arginine-8-vasopressin in plasma: role of premeas-urement sample treatment and reference values in children. Clin Chem 1999; 45: 98-103.

2. Preibisz JJ, Sealey JE, Laragh JH, Cody RJ, Weksler BB. Plasma and platelet vasopressin in essential hypertension and congestive heart failure. Hypertension 1983;5:11 29-38. 2. Preibisz JJ, Sealey JE, Laragh JH, Cody RJ, Weksler BB. Plasma and platelet vasopressin in essential hypertension and congestive heart failure. Hypertension 1983; 5: 11 29-38.

3. Robertson CL, Mahr EA, Athar S, Sinha T. Development and clinical application of a new method for the radioimmunoassay of arginine vasopressin in human plasma. J. Clin Invest 1973;52:2340-52. 3. Robertson CL, Mahr EA, Athar S, Sinha T. Development and clinical application of a new method for the radioimmunoassay of arginine vasopressin in human plasma. J. Clin Invest 1973; 52: 2340-52.

4. Morgenthaler NC, Struck J., Alonso C, Bergmann A. Assay for the measurement of co-peptin, a stable peptide derived from the precursor of vasopressin. Clin Chem 2006;52:112-9. 4. Morgenthaler NC, Struck J., Alonso C, Bergmann A. Assay for the measurement of co-peptin, a stable peptide derived from the precursor of vasopressin. Clin Chem 2006; 52: 112-9.

5. Morgenthaler NC, Struck J., Jochberger S, Dunser MW. Copeptin: clinical use of a new bio-marker. Trends Endocrinol Metab 2008;19:43-9. 5. Morgenthaler NC, Struck J., Jochberger S, Dunser MW. Copeptin: clinical use of a new bio-marker. Trends Endocrinol Metab 2008; 19: 43-9.

6. Struck J., Morgenthaler NG, Bergmann A. Copeptin, a stable peptide derived from the vasopressin precursor, is elevated in serum of sepsis patients. Peptides 2005;26:2500-4. 6. Struck J., Morgenthaler NG, Bergmann A. Copeptin, a stable peptide derived from the vasopressin precursor, is elevated in serum of sepsis patients. Peptides 2005; 26: 2500-4.

7. Fenske W, Stork S, Blechschmidt A, Maier SG, Morgenthaler NG, Allolio B. Copeptin in the differential diagnosis of hyponatremia. J. Clin Endocrinol Metab 2009;94: 123-9.7. Fenske W, Stork S, Blechschmidt A, Maier SG, Morgenthaler NG, Allolio B. Copeptin in the differential diagnosis of hyponatremia. J. Clin Endocrinol Metab 2009; 94: 123-9.

Claims

1. A method of producing a binding agent or a mixture of binding agents capable of binding to an epitope contained in the amino acid sequence corresponding to the C-terminal portion of prepro-vasopressin (SEQ ID NO. 1), consisting of amino acids 146-163, but not containing amino acid 164, where the specified method includes the following stages:

a) obtaining a binding agent using a forming agent containing an amino acid sequence of at least 12 amino acids in length that is contained in the amino acid sequence corresponding to the C-terminal portion but does not contain amino acid 164 prepro-vasopressin (SEQ ID NO. 1);

b) determining the ability of the binding agent to bind to an amino acid sequence of at least 12 amino acids in length that is contained in the amino acid sequence corresponding to the C-terminal portion but does not contain amino acid 164 prepro-vasopressin (SEQ ID NO. 1);

c) selecting a binding agent capable of binding to an amino acid sequence of at least 12 amino acids in length contained in the amino acid sequence corresponding to the C-terminal portion but not containing amino acid 164 prepro-vasopressin (SEQ ID NO. 1) from a plurality of binding agents capable of binding to the amino acid sequence contained in the amino acid sequence corresponding to the C-terminal portion but not containing amino acid 164 prepro-vasopressin (SEQ ID NO. 1).

2. The method of claim 1, further comprising isolating a binding agent capable of binding to an amino acid sequence of at least 12 amino acids in length contained in the amino acid sequence corresponding to the C-terminal portion but not containing amino acid 164 prepro-vasopressin (SEQ ID NO. 1), from a variety of binding agents capable of binding to the amino acid sequence contained in the amino acid sequence corresponding to the C-terminal portion, but not containing amino acid 164 prep o-vasopressin (SEQ ID NO. 1).

3. The method of claim 1 or 2, wherein amino acids 163-164, preferably amino acids 162-164, and most preferably amino acids 161-164 are absent in the amino acid sequence corresponding to the C-terminal portion of prepro-vasopressin (SEQ ID NO. 1).

4. The method according to p. 1 or 2, where the amino acid sequence contained in the forming agent and / or the amino acid sequence contained in the amino acid sequence corresponding to the C-terminal portion of prepro-vasopressin (SEQ ID NO. 1) is selected from the group including peptides consisting of amino acids 146-163 (SEQ ID NO. 7), 146-162 (SEQ ID NO. 8), 146-161 (SEQ ID NO. 9), 146-160 (SEQ ID NO. 10), 146-159 (SEQ ID NO. 11), 146-158 (SEQ ID NO. 12) and 146-157 (SEQ ID NO. 13) prepro-vasopressin (SEQ ID NO. 1).

5. The method according to p. 1 or 2, where the specified binding agent has the ability to bind to an amino acid sequence selected from the group consisting of amino acids 146-162 (SEQ ID NO. 8), 146-161 (SEQ ID NO. 9), 146-160 (SEQ ID NO. 10), 146-159 (SEQ ID NO. 11), 146-158 (SEQ ID NO. 12) and 146-157 (SEQ ID NO. 13) prepro-vasopressin (SEQ ID NO. . one).

6. The method of claim 1 or 2, wherein the step of determining (b) comprises mapping epitopes.

7. The method according to p. 1 or 2, where they determine the specificity of binding of the binding agent with the specified epitope.

8. The method according to p. 1 or 2, where the stage of selection includes affinity separation.

9. Forming agent for producing a binding agent or a mixture of binding agents capable of binding to an epitope contained in the amino acid sequence corresponding to the C-terminal portion of preprovazopressin (SEQ ID NO. 1), consisting of amino acids 146-163, but not containing amino acid 164, selected from the group comprising peptides consisting of amino acids 146-163 (SEQ ID NO. 7), 146-162 (SEQ ID NO. 8), 146-161 (SEQ ID NO. 9), 146-160 (SEQ ID NO .10), 146-159 (SEQ ID NO. 11), 146-158 (SEQ ID NO. 12) and 146-157 (SEQ ID NO. 13) prepro-vasopressin (SEQ ID NO. 1).

10. The forming agent according to claim 9, containing biotin as a binding part.

11. The use of a forming agent according to claim 10 as a forming agent in the method according to any one of paragraphs. 1-8.

12. A binding agent obtained by the method according to any one of paragraphs. 1-8.

13. The binding agent of claim 12, namely, an antibody, preferably a monoclonal antibody, a polyclonal antiserum, an enriched or purified polyclonal antibody, a recombinant antibody, or functional derivatives thereof.

14. The use of a binding agent according to paragraphs. 12 or 13 for the qualitative or quantitative detection of prepro-vasopressin or its fragments in a biological sample.

15. The use of claim 14, wherein the prepro-vasopressin fragment is copeptin.

16. The use of claim 14, wherein said biological sample is a physiological fluid selected from the group consisting of blood, serum, plasma, urine, cerebrospinal fluid, and saliva.

17. The use of PP. 14 or 15, wherein at least one additional binding agent is used that is capable of binding to an epitope that is fully or partially contained in the amino acid sequence corresponding to amino acids 126-164 of prepro-vasopressin (SEQ ID NO. 1).

18. The use of claim 17, wherein said at least one additional binding agent is an antibody, preferably a monoclonal antibody, a polyclonal antiserum, an enriched or purified polyclonal antibody, a recombinant antibody, or functional derivatives thereof.

19. A kit for the qualitative or quantitative detection of prepro-vasopressin or its fragments in a biological sample, where the kit contains a binding agent according to claim 12 or 13.

20. The kit of claim 19, wherein the prepro-vasopressin fragment is copeptin.