RU2607372C1 - Способ диагностики растительного материала на трансгенность - Google Patents
Способ диагностики растительного материала на трансгенность Download PDFInfo
- Publication number
- RU2607372C1 RU2607372C1 RU2015153854A RU2015153854A RU2607372C1 RU 2607372 C1 RU2607372 C1 RU 2607372C1 RU 2015153854 A RU2015153854 A RU 2015153854A RU 2015153854 A RU2015153854 A RU 2015153854A RU 2607372 C1 RU2607372 C1 RU 2607372C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- transgenicity
- reaction
- dna
- primers
- probes
- Prior art date
Links
- 239000000463 material Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 title abstract 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 25
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 4
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000005418 vegetable material Substances 0.000 abstract 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 31
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 3
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 3
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 3
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 3
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001091572 Kalanchoe Species 0.000 description 2
- 101100288095 Klebsiella pneumoniae neo gene Proteins 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000012272 crop production Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000012321 sodium triacetoxyborohydride Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- ZGVSETXHNHBTRK-UDJLNJFBSA-N solanine Chemical compound O([C@H]1[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O1)O)O[C@@H]1CC2=CC[C@H]3[C@@H]4C[C@@H]5N6C[C@@H](C)CC[C@@H]6[C@H]([C@@H]5[C@@]4(C)CC[C@@H]3[C@@]2(C)CC1)C)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O ZGVSETXHNHBTRK-UDJLNJFBSA-N 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
- C12Q2561/113—Real time assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу диагностики растительного материала на трансгенность. Способ включает выделение из биоматериала ДНК и проведение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с зондами, меченными флуоресцентными красителями и гасителями флуоресценции. При этом составляют реакционную смесь, содержащую праймеры aacacatgagcgaaacccta, caagctcgagtttctccata, ccggtcttgcgatgattat, tatattttgttttctatcgcgtatt, tatattttgttttctatcgcgtatt, agatggattgcacgcaggttc, gcatcagagcagccgattgt и зонды FAM-cccttatctgggaactactcacacatta-BHQ1, FAM-tgcgggactctaatcataaaaacccatct-BHQ1, FAM-ccagtcatagccgaatagcctctccacc-BHQ1. Полимеразную цепную реакцию проводят в режиме реального времени, при этом осуществляют непрерывный контроль флуоресценции и по экспоненциальному ее нарастанию диагностируют трансгенность растений. Изобретение позволяет эффективно диагностировать растительный материал на трансгенность. 2 ил., 1 табл.
Description
Изобретение относится к биотехнологии сельскохозяйственных растений и может найти применение для нужд сельского хозяйства и растениеводства при диагностике трангенного растительного материала. Изобретение может быть использовано в пищевой промышленности при выявлении генноинженерно модифицированных организмов (ГМО).
Известен способ определения трансгенных растений [1, 2], сущность которого состоит в анализе нуклеотидных последовательностей методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующей гибридизацией ее продуктов на микрочипах. Основным недостатком этого способа является необходимость переноса амплификата после проведения ПЦР в ячейки биочипов, что создает предпосылку для загрязнения реактивов и лабораторного оборудования продуктами ПЦР и может привести к получению ложных результатов анализа.
Известен способ определения трансгенных растений [3], основанный на амплификации методом ПЦР в реальном времени последовательностей некоторых разновидностей промотора 35S и терминатора nos. Однако этот способ не позволяет выявить значительное количество трансгенных линий, содержащих отличающиеся последовательности данных маркеров.
ПЦР в режиме реального времени позволяет контролировать увеличение количества синтезируемого продукта в ходе реакции и не требует проведения электрофореза на последующих стадиях. Это стало возможным благодаря добавлению в реакционную среду красителей, обеспечивающих флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству синтезированного ПЦР-продукта, - репортерную флуоресценцию.
ПЦР в режиме реального времени существует в двух основных модификациях, различающихся по способам генерации репортерной флуоресценции. Первая из них связана с применением интеркалирующих флуоресцентных агентов, свечение которых значительно возрастает при связывании с двуцепочечной ДНК, вторая связана с использованием меченных флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб, комплементарных участку ПЦР-продукта. Вторая модификация ПЦР является более предпочтительной для диагностических целей, поскольку дает дополнительную возможность контроля специфичности реакции.
Использование ПЦР в реальном времени позволяет свести к минимуму проблему контаминации продуктом реакции, ускорить процедуру анализа за счет отсутствия необходимости проведения электрофореза, позволяет получать количественные характеристики присутствия интересующей ДНК в пробе.
На настоящий момент на основе ПЦР технологии разработано огромное количество диагностических систем различного назначения, в том числе для нужд сельского хозяйства и растениеводства.
Известны аналогичные изобретения «Патент РФ 2386698, Кузнецов В.В., Абрамов Д.Д., Митрохин И.А., Цыдендамбаев В.Д. Способ идентификации трансгенных последовательностей днк в растительном материале и продуктах на его основе» [3].
Однако аналогичные наборы не позволяют выявить все разнообразие коммерческих трансгенных линий растений. Это связано с тем, что в генно-инженерных конструкциях использовано несколько разновидностей последовательностей терминатора nos и большое разнообразие последовательностей промоторов 35S.
По данным базы NCBI (ncbi.nlm.nih.gov) последовательности 35S варьируют по длине от 47 до 485 нуклеотидов, а также по нуклеотидному составу. Данные о последовательностях 35S приведены в приложениях 1 и 2.
Сущность изобретения поясняется фиг. 1 и 2.
Фиг. 1 иллюстрирует нецелесообразность применения праймеров к промотору 35S для диагностики трансгенности в виду большой молекулярной дивергенции ДНК мишеней.
Древо, отражающее сходство последовательностей, построенное в программе Vector NTI, представлено на фиг. 1.
Как видно из фиг. 1, последовательности 35S существенно отличаются друг от друга и формируют не менее 6 групп сходства. При этом варьирование в пределах каждой группы может быть существенным. Эти обстоятельства делают невозможным применение данной последовательности в качестве универсальной мишени для подбора праймеров, детектирующих ГМО. Анализ последовательностей терминатора nos, напротив, показал, что существует 2 его основные вариации.
То есть данная мишень является пригодной для разработки тест-системы, но необходимо учитывать две разновидности последовательности терминатора nos. Анализ распространения селективного маркера nptII (таблица 1) показал, что он присутствует в более сотни линий ГМО и может быть использован как вспомогательный [4].
Заявителю известно, что работа над созданием праймеров, которые используются в подобных наборах, строится обычно следующим образом.
1) С помощью открытых и коммерческих баз данных нуклеотидных последовательностей генно-инженерных конструкций выбирается их консервативный участок, специфичный для как можно большего количества генно-инженерно модифицированных организмов.
2) На основании выбранного участка генома с помощью специального программного обеспечения подбирается последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции (часто 2 праймера и зонд). На данном этапе работа заключается в создании выравнивания многих нуклеотидных последовательностей и выборе участка последовательности рекомбинантной ДНК с наименьшим полиморфизмом.
3) Изготовление праймеров.
4) С помощью практических экспериментов доказывается пригодность подобранных последовательностей для конкретных целей (например, для определения наличия/отсутствия генно-инженерно модифицированных растений в биоматериале).
Наиболее близким способом по достигаемому техническому результату является способ Диагностики ГМО [3], принятый в качестве прототипа. Сущность его состоит в проведении ПЦР с использованием специфических праймеров и флуоресцентномеченых зондов, комплиментарных трансгенным последовательностям ДНК (таблица 1), с последующей детекцией продуктов амплификации в закрытых амплификационных пробирках с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора. Ключевым элементом заявляемого способа является использование флуоресцентномеченых зондов, представляющих собой олигонуклеотиды, меченные молекулами флуорофора и гасителя флуоресценции. Зонды добавляют в реакционную смесь наряду с праймерами и другими компонентами реакции. В ходе ПЦР флуоресцентномеченый зонд гибридизуется на специфических ампликонах и разрушается Taq-полимеразой, в результате чего флуорофор оказывается свободным от гасителя. Таким образом, уровень флуоресценции в амплификационных пробирках возрастает пропорционально количеству образовавшихся специфических продуктов ПЦР.
Недостатком известного способа, принятого в качестве прототипа, является невозможность выявить некоторые трансгенные линии с его помощью. Например, некоторые линии сои, устойчивой к раундапу (см. последовательности NCBI ##AJ783418.1, АВ209952.1, AF465641.1), кукурузы с геном Bt (см. последовательности NCBI ##EU363768.1 EU363766.1). Изобретение свободно от этих недостатков.
Технический результат изобретения состоит в расширении диапазона генотипов диагностируемых ГМО.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе диагностики биоматериалов на наличие в них трансгенных растений, заключающемся в выделении из биоматериала ДНК и проведении на ней полимеразной цепной реакции в режиме реального времени зондами, меченными флуоресцентными красителями и гасителями флуоресценции, в соответствии с изобретением после выделения из образцов ДНК в концентрации 0,1-100 нг/мкл на ее основе составляют реакционную смесь, содержащую праймеры 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
и зонды 
, 
, 
. Полимеразную цепную реакцию проводят в режиме реального времени с температурой отжига праймеров 60°C при 40 циклах, при этом осуществляют непрерывный контроль флуоресценции и по экспоненциальному ее нарастанию диагностируют трансгенность растений. Кроме этого, указанный технический результат достигается тем, что в качестве термостабильной полимеразы с активностью 0,1-0,3 ед. на 1 мкл смеси берут Taq. Вместе с тем указанный технический результат достигается тем, что в качестве термостабильной полимеразы с активностью 0,1-0,3 ед. на 1 мкл смеси берут Tth.
Сущность изобретения состоит в том, что для диагностики наличия в образце трансгенных растений или продуктов их переработки проводят ПЦР в реальном времени с праймерами и зондами к регуляторным последовательностям ДНК (терминатор nos) нескольких разновидностей и селективному маркеру nptII, используемым в большинстве линий трансгенных растений. Например, при сравнении уровня техники:
По патенту РФ 2386698 (RU):
Способ идентификации трансгенных последовательностей ДНК в растительном материале и продуктах на его основе (RU).
При схожей технологии детекции в известном патенте описывается детекция более узкого набора линий, содержащих трансгены.
Существенными признаками изобретения являются:
из анализируемого образца выделяют ДНК чистоты, достаточной для проведения ферментативных реакций, после этого составляют реакционную смесь, содержащую, по меньшей мере: праймеры 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
и зонды 
, 
, 
, зонд может содержать и другие флуоресцентные красители или гасители флуоресценции;
Полимеразную цепную реакцию проводят в амплификаторе (термоциклире) при температуре отжига праймеров 60°C при 40 циклах, при этом осуществляют непрерывный контроль флуоресценции и по экспоненциальному ее нарастанию диагностируют трансгенность растений. Реакцию можно проводить в амплификаторе, обладающем возможностью детектировать изменение флуоресценции в режиме реального времени или в обычном амплификаторе без детектора (в этом случае о прохождении реакции судят по изменению уровня флуоресценции, измеренной перед началом реакции и после ее прохождения).
В случае, если прохождение реакции в виде увеличения уровня флуоресценции образца будет детектировано, делается вывод о наличии трансгенных растений в анализируемом образце.
Реализация заявленного способа.
Для обнаружения заявленным способом трансгенных растений или продуктов их переработки в образце требуется:
1. Выделить ДНК из образца СТАБ-методом. Для этого нужно гомогенезировать образец в СТАВ-буфере (NaCl 1,4М, Трис HCl (pH 8) 0,1М, ЭДТА (pH 8) 20 мМ, СТАВ 2% m/v), инкубировать полученную смесь 1 ч при 56°C, 40-60 мин экстрагировать хлороформом, разделить фракции центрифугированием, верхнюю (водную), содержащую ДНК фракцию переосадить этанолом, ДНК растворить в воде.
2. Приготовить реакционную смесь для ПЦР, которая должна содержать 1х буфер для полимеразы, катионы Mg 2+ в концентрации 0,1-0,3 мM, нуклеотиды в концентрации 2-10 мкМ, Taq полимеразу (или другую термостабильную полимеразу, обладающую 5' экзонуклеазной активностью), 0,1-0,3 ед. активности на 1 мкл смеси, ДНК матрицу исследуемого образца 0,1-100 нг/мкл, праймеры, следующего состава: 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
и зонды 
, 
, 
, зонд может содержать и другие флуоресцентные красители или гасители флуоресценции.
3. Провести полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени с температурой отжига праймеров 60°C при 40 циклах. Пример программы: 95°C - 5 мин, 40 циклов (95°C - 18 с, 60°C - 30 с, 72°C - 30 с). Прохождение реакции контролируют посредством прибора для измерения уровня флуоресценции в ходе реакции, при прохождении реакции хотя бы в одной из реакционных смесей, наблюдается повышение уровня флуоресценции, делается вывод о наличии трансгенных растений в исследуемом образце.
Заявленный способ апробирован в реальном времени на лабораторной базе Санкт-Петербургского государственного университета и поясняется конкретными примерами.
Пример конкретной реализации.
Для обнаружения описываемым методом трансгенных растений и продуктов их переработки в образце требуется:
1. Выделить ДНК из образца СТАБ-методом (подготовительный этап).
2. Провести ПЦР в реальном времени (собственно анализ).
Выделение ДНК из образцов трансгенных корней каланхоэ (трансформированных штаммом А4 Agrobacterium rhizogenes), клубней картофеля семян сои и мясного фарша с добавлением сои.
Гомогенезировать образец в СТАВ-буфере (NaCl 1,4М, Трис HCl (pH 8) 0,1М, ЭДТА (pH 8) 20 мМ, СТАВ 2% m/v), инкубировать полученную смесь 1 ч при 56°C, 40-60 мин экстрагировать хлороформом, разделить фракции центрифугированием, верхнюю (водную), содержащую ДНК фракцию переосадить этанолом, ДНК растворить в воде.
ПОСТАНОВКА ПЦР
В ходе апробации заявленного способа были приготовлены 2 реакционные смеси для ПЦР. Первая смесь содержала 1х буфер для полимеразы, катионы Mg 2+ в концентрации 0,2 мМ, нуклеотиды в концентрации 2 мкМ, Taq полимеразу, 0,2 ед. активности на 1 мкл смеси, ДНК матрицу исследуемого образца 10-100 нг/мкл, праймеры, следующего состава: 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
в концентрации 2 mM и зонды 
, 
, 
Полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени проводили по программе:
95°C - 5 мин, 40 циклов (95°C - 18 с, 60°C - 30 с, 72°C - 30 с).
Прохождение реакции контролировали посредством прибора для измерения уровня флуоресценции в ходе реакции, например амплификатор АНК32 (испытания проводились на лабораторной базе Института Аналитического приборостроения РАН), или CFX96 (Biorad, США). Результаты реакции представлены в качестве примера на фиг. 2.
Фиг. 2 иллюстрирует прохождение реакции с разработанными авторами праймерами на трансгенном и контрольном растительном материале. ПЦР с разработанными авторами праймерами и зондами для детекции ГМО (графики 1-8) и праймерами к гену лектина сои (графики 9-11) на контрольных ДНК плазмиды pART27 (график 1), штаммов агробактерии Т37, С58 (графики 2-3), опытных ДНК трансгенной сои (графики 4, 9), трансгенного картофеля (графики 5-7), трансгенного каланхоэ (график 8), нетрансгенной сои (график 10), мясного фарша (график 11).
Как видно из фиг. 2, амплификация фрагмента гена лектина проходит только на ДНК сои, амплификация терминатора nos - только на трансгенных растениях. Значения пороговых циклов для лектина и nos отличаются на 1 у трансгенной сои, что может быть объяснено большей дозой генов с терминатором nos по сравнению с референсом. Аналогичные результаты получены на трансгенных линиях картофеля с референсным геном соланина и терминатором nos.
Таким образом, наблюдается прохождение реакции, свидетельствующей о работе апробированной диагностической системы. Можно сделать вывод об успешной работе диагностической системы при использовании ДНК заявленных концентраций.
Технико-экономическая эффективность изобретения состоит в том, что предлагаемый новый способ диагностики растительного материала на предмет трансгенности направлен на решение проблемы быстрой диагностики биологического материала растительного происхождения (растения и продукты их переработки), т.е. на эффективное и оперативное выявление наличия в исследуемых биоматериалах трансгенных растений. Заявленный способ по достигаемому техническому результату отличается от известных в данной области аналогов: позволяет расширить список детектируемых трансгенных линий растений.
Источники информации
1. Патент РФ №2453605, Грановский И.Э., Белецкий И.П., Шляпникова Е.А., Шляпников Ю.М., Гаврюшкин А.В., Бирюков С.В. Дифференцирующий и специфический олигонуклеотиды для идентификации последовательностей днк трансгенных растений в пищевых продуктах, способ идентификации трансгенных продуктов, биочип, комбинация олигонуклеотидов (варианты) и набор для осуществления этого способа.
2. Патент РФ 2270254, Мирзабеков А.Д., Грядунов Д.А., Михайлович В.М., Заседателев А.С., Романов Г.А., Кузнецов В.В., Цыденедамбаев В.Д., Митрохин И.А., Крылова Е.М. Способ идентификации трансгенных последовательностей днк в растительном материале и продуктах на его основе, набор олигонуклеотидов и биочип для осуществления этого способа.
3. Патент РФ 2386698, Кузнецов В.В., Абрамов Д.Д., Митрохин И.А., Цыдендамбаев В.Д. Способ идентификации трансгенных последовательностей ДНК в растительном материале и продуктах на его основе (RU 2386698) – прототип.
4. Navarro M.J., Natividad-Tome K.G. Gimutao K.A / From Monologue to Stakeholder Engagement: The Evolution of Biotech Communication ISAAA Briefs N48, 2012, 137. P.
Claims (1)
- Способ диагностики растительного материала на трансгенность, заключающийся в выделении из биоматериала ДНК и проведении на ней полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с зондами, меченными флуоресцентными красителями и гасителями флуоресценции, отличающийся тем, что после выделения из образцов ДНК в концентрации 0,1-100 нг/мкл на основе ее составляют реакционную смесь, которая содержит праймеры aacacatgagcgaaacccta, caagctcgagtttctccata, ccggtcttgcgatgattat, tatattttgttttctatcgcgtatt, tatattttgttttctatcgcgtatt, agatggattgcacgcaggttc, gcatcagagcagccgattgt и зонды FAM-cccttatctgggaactactcacacatta-BHQ1, FAM-tgcgggactctaatcataaaaacccatct-BHQ1, FAM-ccagtcatagccgaatagcctctccacc-BHQ1, праймеры в составе реакционных смесей имеют концентрацию 0,2-2 мM, а зонды 0,1-1 мM, реакционные смеси содержат буфер для полимеразы, катионы Mg 2+ в концентрации 0,1-0,3 мM, нуклеотиды в концентрации 2-10 мкМ, Taq полимеразу 0,1-0,3 ед. активности на 1 мкл смеси, полимеразную цепную реакцию проводят в режиме реального времени с температурой отжига праймеров 60°С при 40 циклах, при этом осуществляют непрерывный контроль флуоресценции и по экспоненциальному ее нарастанию диагностируют трансгенность растений.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015153854A RU2607372C1 (ru) | 2015-12-15 | 2015-12-15 | Способ диагностики растительного материала на трансгенность |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015153854A RU2607372C1 (ru) | 2015-12-15 | 2015-12-15 | Способ диагностики растительного материала на трансгенность |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2607372C1 true RU2607372C1 (ru) | 2017-01-10 |
Family
ID=58452586
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015153854A RU2607372C1 (ru) | 2015-12-15 | 2015-12-15 | Способ диагностики растительного материала на трансгенность |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2607372C1 (ru) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090239234A1 (en) * | 2005-05-17 | 2009-09-24 | Eppendorf Array Technologies S.A. | Identification and/or quantification method of nucleotide sequence(s) elements specific of genetically modified plants on arrays |
| EP2118312A1 (en) * | 2007-01-29 | 2009-11-18 | Scientific Institute of Public Health (IPH) | Transgenic plant event detection |
| RU2386698C1 (ru) * | 2008-11-24 | 2010-04-20 | Учреждение Российской академии наук Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН | Способ идентификации трансгенных последовательностей днк в растительном материале и продуктах на его основе |
| RU2009123913A (ru) * | 2009-06-24 | 2010-12-27 | Закрытое акционерное общество "НПФ ДНК-Технология" (RU) | Способ выявления генно-инженерно-модифицированных организмов и источников растительного происхождения, не зарегистрированных в "государственном реестре пищевых продуктов, материалов и изделий, разрешенных для изготовления на территории российской федерации или ввоза на территорию российской федерации и оборота", геном которых содержит промотор 35 s и/или терминатор nos |
-
2015
- 2015-12-15 RU RU2015153854A patent/RU2607372C1/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090239234A1 (en) * | 2005-05-17 | 2009-09-24 | Eppendorf Array Technologies S.A. | Identification and/or quantification method of nucleotide sequence(s) elements specific of genetically modified plants on arrays |
| EP2118312A1 (en) * | 2007-01-29 | 2009-11-18 | Scientific Institute of Public Health (IPH) | Transgenic plant event detection |
| RU2386698C1 (ru) * | 2008-11-24 | 2010-04-20 | Учреждение Российской академии наук Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН | Способ идентификации трансгенных последовательностей днк в растительном материале и продуктах на его основе |
| RU2009123913A (ru) * | 2009-06-24 | 2010-12-27 | Закрытое акционерное общество "НПФ ДНК-Технология" (RU) | Способ выявления генно-инженерно-модифицированных организмов и источников растительного происхождения, не зарегистрированных в "государственном реестре пищевых продуктов, материалов и изделий, разрешенных для изготовления на территории российской федерации или ввоза на территорию российской федерации и оборота", геном которых содержит промотор 35 s и/или терминатор nos |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sawyer et al. | Real-time PCR for quantitative meat species testing | |
| Alemu | Real-time PCR and its application in plant disease diagnostics | |
| Leal et al. | Development of two reverse transcription‐PCR methods to detect living pinewood nematode, B ursaphelenchus xylophilus, in wood | |
| RU2607372C1 (ru) | Способ диагностики растительного материала на трансгенность | |
| Akiyama et al. | A screening method for the detection of the 35S promoter and the nopaline synthase terminator in genetically modified organisms in a real-time multiplex polymerase chain reaction using high-resolution melting-curve analysis | |
| WO2016203246A1 (en) | Method | |
| CN104830857B (zh) | 转基因玉米mon88017品系特异定量pcr精准检测的引物和探针及方法 | |
| CN110564822B (zh) | 基于LAMP技术的转基因玉米Bt176相关基因检测方法及试剂盒 | |
| Ijaz et al. | Molecular phytopathometry | |
| KR101288419B1 (ko) | 특정 프라이머 세트를 포함하는 배추무름병균을 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 배추무름병균을 검출하는 방법 | |
| JP7091237B2 (ja) | 遺伝子組換え作物の検出方法 | |
| Waeyenberge et al. | Molecular identification of cereal cyst nematodes: status, prospects and recommendations | |
| Bhattacharya | Application of genomics tools in meat quality evaluation | |
| RU2763933C1 (ru) | Тест-система для выявления мутации в гене btpkd собаки домашней (canis lupus familiaris), вызывающей поликистоз почек | |
| RU2386698C1 (ru) | Способ идентификации трансгенных последовательностей днк в растительном материале и продуктах на его основе | |
| JP2007174973A (ja) | Ｓｓｒプライマーを用いるマルチプレックスｐｃｒによる品種識別法。 | |
| US20240410024A1 (en) | Method for relative quantification of gm crops using digital pcr without certified reference material | |
| CN102482697B (zh) | 用于定量生物样品中dna的改良方法 | |
| Kaur | Pollen identification using sequencing techniques | |
| Wen-Tao et al. | Research progress in techniques for detecting genetically modified organisms | |
| Wilkes et al. | Recent developments in DNA-based screening approaches for detection of GMO’s | |
| Naserzadeh et al. | COMPARISON BETWEEN REAL-TIME PCR AND CONVENTIONAL PCR FOR IDENTIFICATION OF THE DROSOPHILA SUZUKII | |
| WO2016114675A1 (en) | Method and kit for identification of nematodes, forest plant pests, by real-time pcr | |
| Oblap | Determination of genetically modified rape and monitoring of its spread | |
| KR101725647B1 (ko) | 식물성 식품원료 판별용 바이오마커 및 이를 이용한 판별방법 |