RU2606253C1 - Олигонуклеотидные праймеры и флюоресцентный зонд с внутренним гасителем, комплементарные участку гена Р30 (CP204L) вируса африканской чумы свиней, для использования в полимеразной цепной реакции в режиме реального времени - Google Patents
Олигонуклеотидные праймеры и флюоресцентный зонд с внутренним гасителем, комплементарные участку гена Р30 (CP204L) вируса африканской чумы свиней, для использования в полимеразной цепной реакции в режиме реального времени Download PDFInfo
- Publication number
- RU2606253C1 RU2606253C1 RU2016105022A RU2016105022A RU2606253C1 RU 2606253 C1 RU2606253 C1 RU 2606253C1 RU 2016105022 A RU2016105022 A RU 2016105022A RU 2016105022 A RU2016105022 A RU 2016105022A RU 2606253 C1 RU2606253 C1 RU 2606253C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- swine fever
- african swine
- cp204l
- fever virus
- complementary
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к синтетическим олигонуклеотидным зондам и праймерам для выявления ДНК вируса африканской чумы свиней. Предложенные синтетические олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно меченый зонд с внутренним гасителем комплементарны консервативной области гена Р30 (CP204L) вируса африканской чумы свиней и имеют следующий нуклеотидный состав:
Предложенное изобретение может быть использовано в генодиагностике инфекционных болезней свиней и ветеринарной вирусологии. 4 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к синтетическим олигонуклеотидным зондам и праймерам, комплементарным консервативной области гена P30 (CP204L) вируса африканской чумы свиней, для выявления ДНК вируса африканской чумы свиней. Предложенное изобретение может быть использовано в генодиагностике инфекционных болезней свиней и ветеринарной вирусологии. Способ выявления вируса АЧС основан на постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени с использованием олигонуклеотидных праймеров и флюоресцентного зонда с внутренним гасителем, комплементарных участку гена P30 (CP204L) вируса АЧС. Разработанный зонд и олигонуклеотидные праймеры позволяют повысить чувствительность и специфичность ПЦР для выявления ДНК вируса АЧС по сравнению с системой, основанной на выявлении гена р72 (B646L) вируса АЧС. Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к средствам диагностики.
Африканская чума свиней - контагиозная вирусная болезнь, характеризующаяся лихорадкой, цианозом кожных покровов, тяжелыми дистрофическими и некротическими поражениями клеток ретикулоэндотелиальной системы. Восприимчивы домашние и дикие свиньи независимо от породы и возраста. Различают сверхострое, острое, хроническое и бессимптомное течение болезни [1, 2].
Заболеванию подвержены свиньи всех возрастных групп. Естественным резервуаром вируса являются дикие свиньи Африканского континента [3].
Предварительный диагноз устанавливают комплексно на основании эпизоотологического обследования, клинических признаков, патоморфологических изменений. Окончательный диагноз на АЧС устанавливают с учетом лабораторных исследований, включающих в себя полимеразную цепную реакцию [4], реакцию прямой иммунофлюоресценции [5], реакцию гемадсорбции [6] и биопробу на восприимчивых животных [7].
Существуют функциональные аналоги предложенного изобретения, основанные на «классическом» TaqMan зонде и паре праймеров на ген р72 (B646L) для выявления генома вируса АЧС. Однако флюоресцентных зондов с внутренним гасителем и праймеров на ген P30 (CP204L) для выявления вируса АЧС в России не зарегистрировано. Ране сотрудниками ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии был получен патент на тест-систему для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР с электрофоретической детекцией. Как известно, технология ПЦР в режиме реального времени, для проведения которой и предназначены олигонуклеотидный зонд и праймеры, комплементарные консервативной области гена P30 (CP204L) вируса АЧС, позволяет значительно увеличить чувствительность и специфичность теста. На российском рынке представлены несколько диагностикумов АЧС методом ПЦР в режиме реального времени, в состав которых входят синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонды, которые могут служить прототипами данного изобретения. Примерами таких диагностикумов могут служить тест-система «АЧС» для выявления вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции (ФБУН ЦЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва), тест-система для выявления вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции (АНО «НИИ ДПБ», г. Москва, тест-система для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР в реальном времени (ГНУ Всероссийский НИИ Ветеринарной Вирусологии и Микробиологии Россельхозакадемии, п. Вольгинский). В данных тест-системах используются классические зонды (краситель и гаситель на 5' и 3' концах), что может приводить к образованию ложноположительных результатов за счет высокого уровня фоновой флюоресценции. Предложенные олигонуклеотидный зонд с внутренним гасителем флюоресценции и олигонуклеотидные праймеры, комплементарные участку гена P30 (CP204L) вируса АЧС, позволяют выявлять геном вируса АЧС с более высокой чувствительностью, чем запатентованные и представленные на рынке тест-системы и наборы.
Целью изобретения является дизайн олигонуклеотидного зонда с внутренним гасителем и двух олигонуклеотидных праймеров, комплементарных консервативной области гена p30 (CP204L) вируса АЧС, для выявления генома вируса АЧС методом ПЦР в режиме реального времени.
Для достижения поставленной цели были подобраны и синтезированы специфические олигонуклеотидные праймеры и зонд, которые используются в ПЦР для идентификации вируса АЧС (Таблица 1).
Способ обнаружения ДНК вируса АЧС в пробах органов, образцах крови инфицированных свиней методом ПЦР в режиме реального времени с использованием предложенных олигонуклеотидного зонда с внутренним гасителем и двух олигонуклеотидных праймеров, комплементарных к консервативной области гена p30 (CP204L) вируса АЧС, включает предварительный этап денатурации ДНК при 94°C в течение 2 мин. ПЦР включает 35 циклов амплификации: 94°C - 30 с, 56°C - 30 с, 68°C - 30 с. Затем проводят оценку и учет результатов реакции.
Техническим результатом изобретения является общедоступность, безопасность, высокая диагностическая чувствительность (100% по сравнению с применением олигонуклеотидных праймеров и зонда на ген Р72), а также сокращение времени проведения диагностической работы (на 5-10 минут) с целью выявления генома вируса африканской чумы свиней.
Сущность изобретения заключается в том, что выявление генома вируса АЧС проводят методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, с использованием олигонуклеотидного зонда с внутренним гасителем флюоресценции. Применение зонда с внутренним гасителем позволяет увеличить эффективность накопления флуоресценции в ходе ПЦР в реальном времени.
Существенным отличием заявляемого способа является то, что применение зонда с двумя гасителями позволяет значительно снизить фоновую флуоресценцию и повысить четкость флуоресцентного сигнала при учете результатов ПЦР в режиме реального времени.
Пример 1. Постановка ПЦР в режиме реального времени с использованием олигонуклеотидного зонда с внутренним гасителем и двух олигонуклеотидных праймеров, комплементарных консервативной области гена p30 (CP204L) вируса АЧС.
Состав реакционной смеси для постановки ПЦР в режиме реального времени представлен в таблице 2. В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на N образцов, в число которых входят положительный контроль (с водным раствором ДНК вируса АЧС) и отрицательный контроль (с бидистиллированной водой). Реактивы вносят в последовательности, приведенной в таблице 2. Фермент добавляют в последнюю очередь. В пробирке объемом 0,2 мл вносят общую реакционную смесь в объеме 20 мкл.
В реакции используют 5 мкл ДНК, полученной при выделении.
ПЦР проводят в амплификаторах ДТ-96 (ДНК-Технология, Россия), Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия) и других приборах с флуоресцентной детекцией по каналу FAM/Green. При следующих режимах (Таблица 3):
Пример 2. Определение специфичности и чувствительности метода выявления генома вируса АЧС с использованием олигонуклеотидного зонда с внутренним гасителем и двух олигонуклеотидных праймеров, комплементарных консервативной области гена p30 (CP204L) вируса АЧС.
Синтетические олигонуклеотидные зонды были проверены на специфичность и чувствительность. Установлено, что в ПЦР с использованием разработанных праймеров и зондов не амплифицируется ДНК других бактерий и вирусов, что показывает диагностическую специфичность и чувствительность 100%.
Диагностическая чувствительность. Была подтверждена на панели 20 (14 положительных и 6 отрицательных) проб патологического материала (легкое, селезенка, лимфоузлы), полученных от павших от АЧС (Таблица 4).
Диагностическая специфичность. В результате исследований было показано, что отсутствуют неспецифические реакции при тестировании образцов геномной ДНК свиньи и следующих микроорганизмов: вирус классической чумы свиней (штаммы Ши-Мынь, ЛК-ВНИИВВиМ, ЛК-К), вирус болезни Ауески (интактный), цирковирус свиней-1 и цирковирус свиней 2.
Выделение нуклеиновых кислот. ДНК выделяют из вируссодержащего материала с использованием коммерческих наборов.
Постановка ПЦР в режиме реального времени. На N количество образцов готовят реакционную смесь согласно таблице 2. Амплификация и детекция флюоресценции производятся согласно температурным режимам, указанным в таблице 3.
Учет результатов амплификации. Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне (0.05) пороговой линии - значение Ct.
Образец считается положительным на наличие генома вируса АЧС при значении Ct<33. Образцы, не пересекающие пороговую линию, и образцы со значением Ct>33 считаются отрицательными.
Источники информации
1. Бакулов, И.А. Проблемы современной эволюции африканской чумы свиней / И.А. Бакулов, В.В. Макаров // Вестник сельскохозяйственных наук. - 1990. - №12. - С. 122-128.
2. Бакулов, И.А. Эпизоотология: африканская чума свиней / И.А. Бакулов. - Москва: Колос, 1969. - С. 267-290.
3. Козлова, Д.И. Современные проблемы африканской чумы свиней / Д.И. Козлова, В.А. Бесхлебнов. - М.: ВНИИТЭИСХ, 1980. - 60 с.
4. A highly sensitive and specific gel-based multiplex RT-PCR assay for the simultaneous and differential diagnosis of African swine fever and Classical swine fever in clinical samples / M. Aguero, J. Fernandez, L.J. Romero, M.J. Zamora, C. Sanchez, S. Belak, M. Arias, J.M. Sanchez-Vizcaino // Vet Res. - 2004. - Vol. 35. - P. 551-563.
5. Heuschele, W.P. Fluorescent antibody studies on African swine fever virus / W.P. Heuschele, L. Coggins, S.S. Stone // Amer. J. vet. Res. - 1966. - №27. - 477-484.
6. Malmquist, W.A. Hemadsorption and cytopathic effect produced by African swine fever virus in swine bone marrow and buffy coat cultures/ W.A. Malmquist, D. Hay // Am J Vet Res. - 1960. - №21. - P. 104-108.
7. Sanchez - Botija, C. African swine fever / C. Sanchez- Botija, A. Ordas // Seminar in the EEC Programme. Madrid, 1976. - P. 658-668.
Claims (2)
- Синтетические олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно меченый зонд с внутренним гасителем, комплементарные консервативной области гена Р30 (CP204L) вируса африканской чумы свиней и имеющие следующий нуклеотидный состав:
-
F1 р30 5'-GTTACGACCGCTATAAAAACA-3' R1 р30 5'-TTCCATTCTTCTTGAGACCTG-3' Z1 (int) p30 5'-(FAM)TACTGTT(RTQ1)AAGTATGATATTGTGA(BHQ1)-3'
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016105022A RU2606253C1 (ru) | 2016-02-15 | 2016-02-15 | Олигонуклеотидные праймеры и флюоресцентный зонд с внутренним гасителем, комплементарные участку гена Р30 (CP204L) вируса африканской чумы свиней, для использования в полимеразной цепной реакции в режиме реального времени |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016105022A RU2606253C1 (ru) | 2016-02-15 | 2016-02-15 | Олигонуклеотидные праймеры и флюоресцентный зонд с внутренним гасителем, комплементарные участку гена Р30 (CP204L) вируса африканской чумы свиней, для использования в полимеразной цепной реакции в режиме реального времени |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2606253C1 true RU2606253C1 (ru) | 2017-01-10 |
Family
ID=58452468
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016105022A RU2606253C1 (ru) | 2016-02-15 | 2016-02-15 | Олигонуклеотидные праймеры и флюоресцентный зонд с внутренним гасителем, комплементарные участку гена Р30 (CP204L) вируса африканской чумы свиней, для использования в полимеразной цепной реакции в режиме реального времени |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2606253C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2125089C1 (ru) * | 1996-08-23 | 1999-01-20 | Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии | Способ и набор для обнаружения днк вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции |
| RU2360971C1 (ru) * | 2007-11-23 | 2009-07-10 | ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии | Способ и тест-система для обнаружения днк вируса африканской чумы свиней с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции |
-
2016
- 2016-02-15 RU RU2016105022A patent/RU2606253C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2125089C1 (ru) * | 1996-08-23 | 1999-01-20 | Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии | Способ и набор для обнаружения днк вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции |
| RU2360971C1 (ru) * | 2007-11-23 | 2009-07-10 | ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии | Способ и тест-система для обнаружения днк вируса африканской чумы свиней с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| YVES STEIGER et al., Rapid and Biologically Safe Diagnosis of African Swine Fever Virus Infection by Using Polymerase Chain Reaction, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Jan. 1992., Vol. 30, No. 1, pp. 1-8. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dowgier et al. | A molecular survey for selected viral enteropathogens revealed a limited role of Canine circovirus in the development of canine acute gastroenteritis | |
| Vaidya et al. | Prevalence of Q fever in domestic animals with reproductive disorders | |
| Fuller et al. | Development of an L gene real-time reverse-transcription PCR assay for the detection of avian paramyxovirus type 1 RNA in clinical samples | |
| Woźniakowski et al. | Direct detection of Marek’s disease virus in poultry dust by loop-mediated isothermal amplification | |
| CN109593883B (zh) | 猪圆环病毒多重实时荧光pcr检测引物对、探针、及制备的试剂盒 | |
| Humberd et al. | Detection of infectious laryngotracheitis virus in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by nested polymerase chain reaction | |
| Guionie et al. | Laboratory evaluation of a quantitative real-time reverse transcription PCR assay for the detection and identification of the four subgroups of avian metapneumovirus | |
| CN106048094A (zh) | 猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的双重实时荧光定量pcr检测试剂盒及引物和探针 | |
| Zeng et al. | Development of a real time loop-mediated isothermal amplification method for detection of Senecavirus A | |
| Bootz et al. | Comparison of the sensitivity of in vivo antibody production tests with in vitro PCR-based methods to detect infectious contamination of biological materials | |
| RU2385943C2 (ru) | Олигонуклеотидные праймеры, способ и тест-система для выявления генома вируса блютанга методом полимеразной цепной реакции в формате электрофоретической детекции продуктов амплификации | |
| CN101629217A (zh) | 猪流感病毒rt-lamp检测试剂盒及其检测方法 | |
| RU2761496C2 (ru) | Способ идентификации вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней на основе ПЦР в реальном времени | |
| CN101575649B (zh) | H9型禽流感病毒的快速检测技术 | |
| CN102605104A (zh) | 鸭圆环病毒和鸭肝炎病毒二重pcr检测试剂盒 | |
| Radalj et al. | Detection and molecular characterization of equine herpesviruses 1, 2, and 5 in horses in the Republic of Serbia | |
| RU2606253C1 (ru) | Олигонуклеотидные праймеры и флюоресцентный зонд с внутренним гасителем, комплементарные участку гена Р30 (CP204L) вируса африканской чумы свиней, для использования в полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| Gill et al. | Comparative prevalence and molecular characterization of group A rotavirus in cow calves of Punjab, India | |
| RU2510851C1 (ru) | Тест-система для обнаружения рнк вируса блютанга методом от-пцр в режиме реального времени | |
| KR101617142B1 (ko) | 개선된 검출 정확성을 제공해 줄 수 있는 핵산검사 기반의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 키트 | |
| KR20180124394A (ko) | 뉴캣슬병 바이러스 병원성 신속 감별방법 | |
| RU2714045C1 (ru) | Олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченый зонд, способ и тест-система для выявления генома вируса заразного узелкового дерматита (нодулярного дерматита) КРС в реакции полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2698662C1 (ru) | Тест-система для выявления РНК возбудителя вируса артериита у лошадей | |
| Fiorito et al. | FIRST DESCRIPTION OF SEROLOGICAL EVIDENCE FOR SARS-CoV-2 IN CATTLE | |
| CN105400908A (zh) | 一种利用焦磷酸测序技术检测斑点叉尾鮰病毒的引物、试剂盒和检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180216 |