RU2603061C2 - Функциональное улучшение микроорганизмов для минимизации продукции акриламида - Google Patents
Функциональное улучшение микроорганизмов для минимизации продукции акриламида Download PDFInfo
- Publication number
- RU2603061C2 RU2603061C2 RU2012141896/10A RU2012141896A RU2603061C2 RU 2603061 C2 RU2603061 C2 RU 2603061C2 RU 2012141896/10 A RU2012141896/10 A RU 2012141896/10A RU 2012141896 A RU2012141896 A RU 2012141896A RU 2603061 C2 RU2603061 C2 RU 2603061C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- yeast
- asparagine
- nucleic acid
- food product
- acrylamide
- Prior art date
Links
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 68
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title description 59
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 128
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims abstract description 123
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 121
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims abstract description 121
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 112
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 101
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 96
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 94
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 87
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 87
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 55
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims abstract description 53
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 45
- 108010024976 Asparaginase Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 102000015790 Asparaginase Human genes 0.000 claims abstract description 36
- 230000032258 transport Effects 0.000 claims abstract description 33
- 229960003272 asparaginase Drugs 0.000 claims abstract description 30
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 29
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims abstract description 25
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 17
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 17
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 10
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 102
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 51
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 44
- 101100459248 Mus musculus Mxra8 gene Proteins 0.000 claims description 39
- 101150016874 asp3 gene Proteins 0.000 claims description 39
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M asparaginate Chemical compound [O-]C(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 29
- 108050005273 Amino acid transporters Proteins 0.000 claims description 26
- 101500023488 Lithobates catesbeianus GnRH-associated peptide 1 Proteins 0.000 claims description 26
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 26
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 26
- 102000034263 Amino acid transporters Human genes 0.000 claims description 25
- 102100022463 Alpha-1-acid glycoprotein 1 Human genes 0.000 claims description 24
- 101150088700 URE2 gene Proteins 0.000 claims description 24
- 101150031810 AGP1 gene Proteins 0.000 claims description 22
- 101100165241 Arabidopsis thaliana BCP1 gene Proteins 0.000 claims description 22
- 101000639970 Homo sapiens Sodium- and chloride-dependent GABA transporter 1 Proteins 0.000 claims description 22
- 101150110809 ORM1 gene Proteins 0.000 claims description 22
- 102100033927 Sodium- and chloride-dependent GABA transporter 1 Human genes 0.000 claims description 21
- 102100022460 Alpha-1-acid glycoprotein 2 Human genes 0.000 claims description 17
- 101150052424 AGP3 gene Proteins 0.000 claims description 16
- 101100505264 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GNP1 gene Proteins 0.000 claims description 16
- 101150061681 GZF3 gene Proteins 0.000 claims description 15
- 101000678191 Homo sapiens Alpha-1-acid glycoprotein 2 Proteins 0.000 claims description 15
- 101100284219 Candida albicans (strain SC5314 / ATCC MYA-2876) GZF3 gene Proteins 0.000 claims description 12
- 101100442138 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) DAL80 gene Proteins 0.000 claims description 12
- 101150106148 TOR1 gene Proteins 0.000 claims description 12
- 101100387347 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) DIP5 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150049389 tor2 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 8
- 235000011868 grain product Nutrition 0.000 claims description 7
- 101100175800 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GLN3 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 235000015173 baked goods and baking mixes Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 abstract description 48
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 abstract description 41
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 37
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 238000010411 cooking Methods 0.000 abstract description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 abstract 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 abstract 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 abstract 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 abstract 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 67
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 33
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 31
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 29
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 21
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- 101000579123 Homo sapiens Phosphoglycerate kinase 1 Proteins 0.000 description 14
- KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N PGK1 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@@H]1[C@@H](CCCCCCC(O)=O)C(=O)CC1=O KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N 0.000 description 14
- 102100028251 Phosphoglycerate kinase 1 Human genes 0.000 description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 14
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 14
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 13
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 13
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 12
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 12
- 235000016213 coffee Nutrition 0.000 description 11
- 235000013353 coffee beverage Nutrition 0.000 description 11
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 11
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 11
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 10
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 102100021277 Beta-secretase 2 Human genes 0.000 description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- -1 glucose Chemical class 0.000 description 9
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 9
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 7
- 235000008452 baby food Nutrition 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 101710150190 Beta-secretase 2 Proteins 0.000 description 6
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 6
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 6
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 6
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 6
- 235000012970 cakes Nutrition 0.000 description 6
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 6
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 235000012020 french fries Nutrition 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 235000011888 snacks Nutrition 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000015895 biscuits Nutrition 0.000 description 4
- 235000014510 cooky Nutrition 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 235000014594 pastries Nutrition 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- YQNRVGJCPCNMKT-LFVJCYFKSA-N 2-[(e)-[[2-(4-benzylpiperazin-1-ium-1-yl)acetyl]hydrazinylidene]methyl]-6-prop-2-enylphenolate Chemical compound [O-]C1=C(CC=C)C=CC=C1\C=N\NC(=O)C[NH+]1CCN(CC=2C=CC=CC=2)CC1 YQNRVGJCPCNMKT-LFVJCYFKSA-N 0.000 description 3
- 101150026006 ASP1 gene Proteins 0.000 description 3
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 3
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 3
- 241000186312 Brevibacterium sp. Species 0.000 description 3
- 101100163949 Caenorhabditis elegans asp-3 gene Proteins 0.000 description 3
- 101100462537 Caenorhabditis elegans pac-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 3
- 241000222178 Candida tropicalis Species 0.000 description 3
- 101150073620 DAL80 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000588699 Erwinia sp. Species 0.000 description 3
- FMAZQSYXRGRESX-UHFFFAOYSA-N Glycidamide Chemical class NC(=O)C1CO1 FMAZQSYXRGRESX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 3
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 3
- 244000285963 Kluyveromyces fragilis Species 0.000 description 3
- 235000014663 Kluyveromyces fragilis Nutrition 0.000 description 3
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 3
- 241000186610 Lactobacillus sp. Species 0.000 description 3
- 241000178948 Lactococcus sp. Species 0.000 description 3
- 241001627205 Leuconostoc sp. Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100117764 Mus musculus Dusp2 gene Proteins 0.000 description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 241000222051 Papiliotrema laurentii Species 0.000 description 3
- 241000604136 Pediococcus sp. Species 0.000 description 3
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 3
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 3
- 241000223254 Rhodotorula mucilaginosa Species 0.000 description 3
- 241000235072 Saccharomyces bayanus Species 0.000 description 3
- 235000003534 Saccharomyces carlsbergensis Nutrition 0.000 description 3
- 241001123227 Saccharomyces pastorianus Species 0.000 description 3
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 3
- 244000299461 Theobroma cacao Species 0.000 description 3
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 3
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 235000012180 bread and bread product Nutrition 0.000 description 3
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 3
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 235000012495 crackers Nutrition 0.000 description 3
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 3
- 230000001738 genotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 235000014571 nuts Nutrition 0.000 description 3
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 3
- 235000013606 potato chips Nutrition 0.000 description 3
- 235000013573 potato product Nutrition 0.000 description 3
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 3
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 3
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 235000008371 tortilla/corn chips Nutrition 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- 125000006727 (C1-C6) alkenyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000006728 (C1-C6) alkynyl group Chemical group 0.000 description 2
- 101150035263 AGP11 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150067626 AGP21 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150102830 AGP31 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 2
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 2
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 2
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 2
- 206010007269 Carcinogenicity Diseases 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 101150062828 GAT1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150012684 GNP1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 2
- 244000286779 Hansenula anomala Species 0.000 description 2
- 235000014683 Hansenula anomala Nutrition 0.000 description 2
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 2
- 241000221962 Neurospora intermedia Species 0.000 description 2
- 244000271379 Penicillium camembertii Species 0.000 description 2
- 235000002245 Penicillium camembertii Nutrition 0.000 description 2
- 240000000064 Penicillium roqueforti Species 0.000 description 2
- 235000002233 Penicillium roqueforti Nutrition 0.000 description 2
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 244000205939 Rhizopus oligosporus Species 0.000 description 2
- 235000000471 Rhizopus oligosporus Nutrition 0.000 description 2
- 240000005384 Rhizopus oryzae Species 0.000 description 2
- 235000013752 Rhizopus oryzae Nutrition 0.000 description 2
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 2
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 125000002877 alkyl aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 235000012791 bagels Nutrition 0.000 description 2
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 2
- 231100000260 carcinogenicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000007670 carcinogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 235000019219 chocolate Nutrition 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- OSVXSBDYLRYLIG-UHFFFAOYSA-N dioxidochlorine(.) Chemical compound O=Cl=O OSVXSBDYLRYLIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000012489 doughnuts Nutrition 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 101150110969 gap1 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 2
- 231100000024 genotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 2
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 2
- 235000013550 pizza Nutrition 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 235000020238 sunflower seed Nutrition 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 235000012184 tortilla Nutrition 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 235000020985 whole grains Nutrition 0.000 description 2
- MRTPISKDZDHEQI-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-(tert-butylamino)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(C)(C)C MRTPISKDZDHEQI-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 1
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 1
- 244000003416 Asparagus officinalis Species 0.000 description 1
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 101150085381 CDC19 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100327917 Caenorhabditis elegans chup-1 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- QDHHCQZDFGDHMP-UHFFFAOYSA-N Chloramine Chemical class ClN QDHHCQZDFGDHMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004155 Chlorine dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000006481 Colocasia esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 244000205754 Colocasia esculenta Species 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 description 1
- 240000001980 Cucurbita pepo Species 0.000 description 1
- 235000009852 Cucurbita pepo Nutrition 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 1
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 1
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 1
- 101000582320 Homo sapiens Neurogenic differentiation factor 6 Proteins 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000235395 Mucor Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100030589 Neurogenic differentiation factor 6 Human genes 0.000 description 1
- 101100234604 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) ace-8 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N Nitrous acid Chemical compound ON=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007399 Nuclear hormone receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Chemical group 0.000 description 1
- 241000207836 Olea <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 description 1
- CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N Ozone Chemical compound [O-][O+]=O CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150093629 PYK1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- JMCOUWKXLXDERB-WMZOPIPTSA-N Phe-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 JMCOUWKXLXDERB-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 101150096292 Ppme1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 240000005809 Prunus persica Species 0.000 description 1
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 206010074268 Reproductive toxicity Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000235527 Rhizopus Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 101100507956 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HXT7 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102000013530 TOR Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010065917 TOR Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 235000009470 Theobroma cacao Nutrition 0.000 description 1
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 241000482268 Zea mays subsp. mays Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 108091006088 activator proteins Proteins 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 235000020224 almond Nutrition 0.000 description 1
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 235000012019 baked potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 235000012813 breadcrumbs Nutrition 0.000 description 1
- 235000015496 breakfast cereal Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000004568 cement Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000015228 chicken nuggets Nutrition 0.000 description 1
- 235000019398 chlorine dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N cocaine Chemical compound O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- YSXLJTGZMRNQSG-UHFFFAOYSA-L disodium;6-amino-5-[[2-[4-[2-[4-[2-[(2-amino-5-sulfonatonaphthalen-1-yl)diazenyl]phenyl]sulfonyloxyphenyl]propan-2-yl]phenoxy]sulfonylphenyl]diazenyl]naphthalene-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=C2C(N=NC3=CC=CC=C3S(=O)(=O)OC3=CC=C(C=C3)C(C)(C=3C=CC(OS(=O)(=O)C=4C(=CC=CC=4)N=NC=4C5=CC=CC(=C5C=CC=4N)S([O-])(=O)=O)=CC=3)C)=C(N)C=CC2=C1S([O-])(=O)=O YSXLJTGZMRNQSG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 1
- 244000013123 dwarf bean Species 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 231100000584 environmental toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 235000013332 fish product Nutrition 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 231100000025 genetic toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021331 green beans Nutrition 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N hydron Chemical compound [H+] GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000012994 industrial processing Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 235000021539 instant coffee Nutrition 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 235000012459 muffins Nutrition 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 235000021049 nutrient content Nutrition 0.000 description 1
- 230000009965 odorless effect Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 235000021201 onion's soup Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 235000012771 pancakes Nutrition 0.000 description 1
- 239000011088 parchment paper Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 235000021400 peanut butter Nutrition 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 108010083476 phenylalanyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 230000001699 photocatalysis Effects 0.000 description 1
- 208000017983 photosensitivity disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000434 photosensitization Toxicity 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 235000021018 plums Nutrition 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 235000013613 poultry product Nutrition 0.000 description 1
- 239000013630 prepared media Substances 0.000 description 1
- 235000012434 pretzels Nutrition 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 231100000372 reproductive toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007696 reproductive toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 235000015067 sauces Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000010845 search algorithm Methods 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 235000020374 simple syrup Nutrition 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 235000020354 squash Nutrition 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 235000013547 stew Nutrition 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000563 toxic property Toxicity 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 235000011844 whole wheat flour Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
- A23L5/00—Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
- A23L5/20—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification
- A23L5/28—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification using microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
- C12N9/82—Asparaginase (3.5.1.1)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
- Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
- Preparation Of Fruits And Vegetables (AREA)
Abstract
Изобретение относится к дрожжам для снижения акриламида или аспарагина в пищевом продукте. Дрожжи трансформированы по меньшей мере двумя из следующих модификаций: а) делеция или инактивация гена, кодирующего отрицательный регуляторный фактор, регулируемого азотной катаболитной репрессией, или введение молекулы нуклеиновой кислоты, которая сверхэкспрессирует положительный регуляторный фактор генов, регулируемых азотной катаболитной репрессией, для снижения азотной катаболитной репрессии; b) введение молекулы нуклеиновой кислоты для сверхэкспрессии гена, кодирующего аспарагиназу клеточной стенки, которая расщепляет аспарагин; и c) введение молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей транспортер аминокислот, который транспортирует аспарагин в условиях приготовления/переработки пищевых продуктов. Предложены также варианты способа снижения количества аспарагина или акриламида в пищевых продуктах и пищевые продукты, обладающие сниженным содержанием акриламида, полученные с использованием указанных дрожжей. Изобретение обеспечивает улучшенную способность снижать концентрацию акриламида в пищевых продуктах, приготовленных посредством нагревания. 7 н. и 26 з.п. ф-лы, 20 ил., 2 табл., 4 пр.
Description
Родственные заявки
По настоящей заявке по пункту 35 U.S.C. 119 испрашивается приоритет соответствующих Предварительных Патентных заявок США No. 61/309623 и 61/316634, поданных 2 марта 2010 г. и 23 марта 2010 г., соответственно, полное содержание которых приведено в настоящем документе в качестве ссылки.
Область изобретения
Описание относится к продуктам и способам для уменьшения концентрации акриламида в пище, так же как к пищевым продуктам, обладающим сниженным содержанием акриламида. В частности, описание относится к микроорганизмам, генетически модифицированным для их способности уменьшать количество акриламида.
Предпосылки изобретения
Акриламид представляет собой кристаллическое твердое вещество без цвета и без запаха, которое является важным промышленным мономером, общеупотребительным в качестве связующего для цемента и для синтеза полимеров и гелей. На основании различных исследований in vivo и in vitro получено убедительное доказательство канцерогенных и генотоксических эффектов акриламида и его метаболита глицидамида (Wilson et al., 2006; Rice, 2005). Акриламид оценен Международным агентством онкологических исследований (IARC) в 1994 г. и классифицирован как «возможно канцерогенный для человека» на основании положительных биологических исследований на мышах и крысах, что поддерживается доказательством того, что акриламид подвергается биологической трансформации в тканях млекопитающих до генотоксического метаболита глицидамида (IARC, 1994). Известно, что биологическая трансформация акриламида в глицидамид эффективно происходит в тканях как человека, так и грызунов (Rice, 2005). В дополнение к классификации IARC, как «The Scientific Committee on Toxicity, Ecotoxicity and the Environment» Европейского Союза, так и независимый «Committee on Carcinogenicity of Chemicals in Food, Consumer Products and the Environment» в Великобритании, советуют контролировать воздействие акриламида на людей на уровне, настолько низком, насколько возможно, из-за его по существу токсичных свойств, включающих нейротоксичность и генотоксичность как для соматических, так и для зародышевых клеток, канцерогенность и репродуктивную токсичность.
Что касается эпидемиологических исследований на человеке воздействия акриламида, поступающего с пищей, не существует доказательств какого-либо канцерогенного эффекта этого химического вещества; однако известно также, что эти эпидемиологические исследования акриламида могут не являться достаточно чувствительными для выявления потенциальных опухолей у человека после воздействия акриламида (Rice, 2005; Wilson et al., 2006).
В 2002 г. Шведская Национальная Пищевая Организация опубликовала подробное описание концентраций акриламида, обнаруженного в общепринятых пищевых продуктах, особенно подвергнутых тепловой обработке богатых углеводами пищевых продуктах, таких как картофель фри и картофельные чипсы. В настоящее время этот список расширен с включением пищевых продуктов на основе зерна, пищевых продуктов на основе овощей, пищевых продуктов на основе бобовых, напитков, таких как кофе или заменители кофе; в таблице 1 показаны данные FDA по концентрациям акриламида в различных пищевых продуктов.
В настоящее время установлено, что акриламид образуется в ходе приготовления пищевых продуктов в первую очередь посредством реакции Майларда между аминокислотой аспарагином и восстанавливающими сахарами, такими как глюкоза, где аспарагин является лимитирующим предшественником (Amrein et al., 2004; Becalski et al., 2003; Mustafa et al., 2005; Surdyk et al., 2004; Yaylayan et al., 2003).
Существовал также ряд попыток уменьшения содержания акриламида в пищевых продуктах, включая добавление коммерческих препаратов фермента аспарагиназы (Acrylaway®, Novozymes, Denmark и PreventASe, DSM, Netherlands), продолжительную ферментацию дрожжей в течение 6 часов (Fredriksson et al., 2004), применение глицина в тесте до брожения (Brathen et al., 2005; Fink et al., 2006), погружение картофеля в хлорид кальция перед обжариванием во фритюре (Gokmen and Senyuva, 2007), замену восстанавливающих сахаров сахарозой (Amrein et al., 2004), общую оптимизацию условий переработки, таких как температура, pH и влагосодержание (Claus et al., 2007; Gokmen et al., 2007) и исследования, касающиеся различного выбора сырья (Claus et al., 2006). Все из этих перечисленных способов являются до некоторой степени неадекватными или им присущи ограничения, делающие их непрактичными во время изготовления пищевых продуктов, включая стоимость, эффект на органолептические свойства пищевых продуктов и/или неэффективное снижение количества акриламида в условиях переработки пищевых продуктов.
Подобно многим микроорганизмам, Saccharomyces cerevisiae способны естественным образом потреблять/деградировать предшественники акриламида аспарагин и восстанавливающие сахара. Это может являться причиной наблюдаемого снижения количества содержания акриламида в хлебе после продолжительного времени брожения в течение 6 часов (Fredriksson et al., 2004). Однако такое продолжительное время брожения для эффективного снижения количества акриламида является непрактичным для современных способов переработки пищевых продуктов.
В S. cerevisiae генами, ответственными за аспарагин, являются ASP1 и ASP3, кодирующие аспарагиназу цитозоля и аспарагиназу клеточной стенки, соответственно. Существуют также по меньшей мере 41 ген в S. cerevisiae, аннотированные термином «транспорт аминокислот», и известно, что шесть из этих транспортеров способны транспортировать аспарагин в клетку [«Saccharomyces Genome Database» http://www.yeastgenome.org/ (10/01/09)]. Названия генов для этих шести транспортеров аспарагина в S. cerevisiae представляют собой GAP1, AGP1, GNP1, DIP5, AGP2 и AGP3. Хорошо известно также, что S. cerevisiae способны использовать широкое множество источников азота для роста и что в культурах на смешанных субстратах они последовательно выбирают от хороших до плохих источников азота (Cooper, 1982). Это последовательное использование контролируют молекулярные механизмы, состоящие из сенсорной системы и механизма регуляции транскрипции, известного как азотная катаболитная репрессия (NCR). Как правило, NCR относится к различиям экспрессии генов пермеаз и катаболических ферментов, необходимых для деградации источников азота. Экспрессию в путях катаболитов азота регулируют четыре регулятора, известные как Gln3p, Gat1p, Dal80p и Gzf3p, которые связываются с вышестоящей активирующей консенсусной последовательностью 5'-GATAA-3'. Gln3p и Gat1p положительно действуют на экспрессию генов, в то время как Dal80p и Gzf3p действуют отрицательно. В присутствии хорошего источника азота Gln3p и Gat1p фосфорилируются посредством TOR киназ Tor1p и Tor2p; затем образуют цитозольные комплексы с Ure2p и таким образом являются ингибированными против активации NCR-чувствительной транскрипции. В присутствии плохих источников азота или при азотном голодании Gln3p и Gat1p становятся дефосфорилированными, диссоциируют из Ure2p, накапливаются в ядре и активируют NCR-чувствительную транскрипцию.
Хорошо документировано также, что конкретная мутация URE2 приводит к доминантной мутации, обозначаемой [URE3]. [URE3] представляет собой прион дрожжей, образуемый посредством автокаталитического превращения Ure2p в инфекционные, устойчивые к протеазам амилоидные волокна (Wickner, 1994). Фенотипы клеток S. cerevisiae с отсутствием функционального Ure2p и инфицированных [URE3] клеток являются сходными, поскольку они больше не отвечают на NCR (Wickner, 1994; Wickner et al., 1995). Как указано выше, в ответ на хороший источник азота, Ure2p вовлекается в понижающую регуляцию активности Gln3p и Gat1p.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее описание относится к микроорганизму, трансформированному по меньшей мере одной молекулой нуклеиновой кислоты для уменьшения азотной катаболитной репрессии в условиях приготовления/переработки пищевых продуктов. Настоящее описание относится также к микроорганизму, трансформированному по меньшей мере одной молекулой нуклеиновой кислоты для сверхэкспрессии гена, кодирующего внеклеточный белок, вовлеченный в деградацию аспарагина, и/или гена, кодирующего белок, вовлеченный в транспорт аспарагина в условиях приготовления/переработки пищевых продуктов. Настоящее описание относится также к микроорганизму, трансформированному по меньшей мере одной молекулой нуклеиновой кислоты для снижения азотной катаболитной репрессии и/или для сверхэкспрессии гена, кодирующего внеклеточный белок, вовлеченный в деградацию аспарагина, и/или гена, кодирующего белок, вовлеченный в транспорт аспарагина в условиях приготовления/переработки пищевых продуктов.
В одном варианте осуществления микроорганизм трансформируют молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей внеклеточную аспарагиназу, такую как связанная с клеточной стенкой аспарагиназа, Asp3p. В другом варианте осуществления микроорганизм трансформируют молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей транспортер аминокислот, такой как транспортер аминокислоты аспарагина, например, Gap1p, Agp1p, Gnp1p, Dip5p, Agp2p и/или Agp3p.
В другом варианте осуществления микроорганизм трансформируют молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей как Asp3p, так и Gap1p или как Asp3p, так и Gat1p. В другом варианте осуществления микроорганизм трансформируют первой и второй молекулой нуклеиновой кислоты, где первая молекула нуклеиновой кислоты кодирует Asp3p, и вторая молекула нуклеиновой кислоты кодирует Gap1p или Gat1p.
В другом варианте осуществления микроорганизм трансформируют молекулой нуклеиновой кислоты, модифицирующей активность регуляторного фактора азотной катаболитной репрессии транспорта/деградации аспарагина, такого как Ure2p, Dal80p, Gzf3p, Gln3p, Gat1p, Tor1p и/или Tor2p. В другом варианте осуществления микроорганизм трансформируют молекулой нуклеиновой кислоты, модифицирующей активность обоих регуляторных факторов азотной катаболитной репрессии Gln3p и Ure2p. В другом варианте осуществления микроорганизм трансформируют первой и второй молекулой нуклеиновой кислоты, модифицирующей азотную катаболитную репрессию, где первая молекула нуклеиновой кислоты кодирует Gln3p, и вторая молекула нуклеиновой кислоты модифицирует экспрессию Ure2p.
В одном варианте осуществления микроорганизм представляет собой гриб или бактерию. Гриб может представлять собой любой гриб, включая дрожжи, такие как Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces carlsbergensis, Candida albicans, Candida kefyr, Candida tropicalis, Cryptococcus laurentii, Cryptotoccous neoformans, Hansenula anomala, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus var lactis, Pichia pastoris, Rhodotorula rubra, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolyitca или любые виды дрожжей, принадлежащих к царству грибов. Другие грибы, которые можно использовать, включают в себя, но без ограничения, виды из родов Aspergillus, Penicillium, Rhizopus и Mucor. Бактерии могут представлять собой любые бактерии, включая Erwinia sp., Lactobacillus sp., Lactococcus sp., Bacillus sp., Pediococcus sp., Pseudomonas sp., Brevibacterium sp., и Leuconostoc sp. В одном варианте осуществления микроорганизм является неактивным, таким как неактивные дрожжи.
В одном варианте осуществления по меньшей мере одна молекула нуклеиновой кислоты является функционально связанной с констутивно активным промотором. В другом варианте осуществления по меньшей мере одна молекула нуклеиновой кислоты является функционально связанной с промотором, не подверженным азотной катаболитной репрессии.
В настоящем документе представлен также способ снижения количества акриламида в пищевом продукте, включающий в себя добавление микроорганизма, описанного в настоящем документе, в пищевой продукт в условиях приготовления или переработки; где микроорганизм снижает азотную катаболитную репрессию или сверхэкспрессирует ген, вовлеченный в транспорт и/или деградацию аспарагина в условиях приготовления или переработки; таким образом снижая количество акриламида в пищевом продукте.
Кроме того, в настоящем документе представлен способ снижения количества акриламида в пищевом продукте, включающий в себя (a) трансформацию микроорганизма по меньшей мере одной молекулой нуклеиновой кислоты для снижения азотной катаболитной репрессии или для сверхэкспрессии гена, кодирующего внеклеточный белок, вовлеченный в деградацию аспарагина и/или гена, кодирующего белок, вовлеченный в транспорт аспарагина; (b) добавление микроорганизма в пищевой продукт в условиях приготовления или переработки; где микроорганизм снижает азотную катаболитную репрессию или сверхэкспрессирует ген, кодирующий внеклеточный белок, вовлеченный в деградацию аспарагина, и/или ген, кодирующий белок, вовлеченный в транспорт аспарагина, таким образом снижая количество акриламида в пищевом продукте.
В другом варианте осуществления представлен пищевой продукт, обладающий сниженной концентрацией акриламида, полученный с использованием трансформированного микроорганизма, описанного в настоящем документе. В другом варианте осуществления представлен пищевой продукт, обладающий сниженной концентрацией акриламида, полученный с использованием способа, описанного в настоящем документе.
В одном варианте осуществления пищевой продукт представляет собой пищевой продукт на основе зерна, включая, без ограничения, бисквиты, хлеб и крекеры, пищевой продукт на основе овощей включая, без ограничения, картофельные продукты, напиток, включая, без ограничения, кофе и заменители кофе, фруктовый, бобовый, молочный или мясной продукт.
Другие признаки и преимущества по настоящему описанию становятся очевидными из следующего подробного описания. Следует понимать, однако, что подробное описание и конкретные примеры, в то время как в них указаны предпочтительные варианты осуществления, приведены только для иллюстрации, поскольку различные изменения и модификации в пределах содержания и объема изобретения очевидны специалистам в данной области из этого подробного описания.
Краткое описание фигур
Описание поясняется фигурами, на которых:
Фиг.1 представляет собой схематическое представление сконструированной генетической кассеты ASP3 и последующие стадии утраты маркера kanMX после интеграции в локус LEU2 или URA3 штаммов S. cerevisiae. Маркер kanMX удаляют посредством рекомбинации прямых повторов промотора PGK1, что приводит к самоклонирующемуся штамму, содержащему только нативные последовательности ДНК.
Фиг.2 представляет собой схематическое представление сконструированной генетической кассеты GAP1 и последующие стадии утраты маркера kanMX после интеграции в локус URA3 штаммов S. cerevisiae. Маркер kanMX удаляют посредством рекомбинации прямых повторов промотора PGK1, что приводит к самоклонирующемуся штамму, содержащему только нативные последовательности ДНК.
Фиг.3 представляет собой схематическое представление сконструированной генетической кассеты AGP3 и последующие стадии утраты маркера kanMX после интеграции в локус LEU2 штаммов S. cerevisiae. Маркер kanMX удаляют посредством рекомбинации прямых повторов промотора PGK1, что приводит к самоклонирующемуся штамму, содержащему только нативные последовательности ДНК.
Фиг.4 представляет собой схематическое представление сконструированной генетической кассеты AGP2 и последующие стадии утраты маркера kanMX после интеграции в локус LEU2 штаммов S. cerevisiae. Маркер kanMX удаляют посредством рекомбинации прямых повторов промотора PGK1, что приводит к самоклонирующемуся штамму, содержащему только нативные последовательности ДНК.
Фиг.5 представляет собой схематическое представление сконструированной генетической кассеты GNP1 и последующие стадии утраты маркера kanMX после интеграции в локус LEU2 штаммов S. cerevisiae. Маркер kanMX удаляют посредством рекомбинации прямых повторов промотора PGK1, что приводит к самоклонирующемуся штамму, содержащему только нативные последовательности ДНК.
Фиг.6 представляет собой схематическое представление сконструированной генетической кассеты AGP1 и последующие стадии утраты маркера kanMX после интеграции в локус URA3 штаммов S. cerevisiae. Маркер kanMX удаляют посредством рекомбинации прямых повторов промотора PGK1, что приводит к самоклонирующемуся штамму, содержащему только нативные последовательности ДНК.
Фиг.7 представляет собой схематическое представление сконструированной генетической кассеты GAT1 и последующие стадии утраты маркера kanMX после интеграции в локус LEU2 штаммов S. cerevisiae. Маркер kanMX удаляют посредством рекомбинации прямых повторов промотора PGK1, что приводит к самоклонирующемуся штамму, содержащему только нативные последовательности ДНК.
Фиг.8 представляет собой схематическое представление интеграции самоклонирующейся кассеты ure2∆ в локус URE2 штаммов S. cerevisiae с использованием маркера kanMX и последующей утраты маркера посредством рекомбинации части фланкирующих последовательностей 5'URE2, действующих как прямые повторы. Полученная трансформация делетирует ген URE2 из генома.
На фиг.9 показана карта сконструированной плазмиды pAC1, использованной в клонируемых генетических кассетах для интеграции в локус LEU2.
На фиг.10 показаны карты сконструированной плазмиды pAC2, использованной в клонируемых генетических кассетах для интеграции в локус URA3.
На фиг.11 показано потребление аспарагина в хлебном тесте с использованием коммерческих хлебных дрожжей (BY) со сверхэкспрессией гена ASP1 или ASP3.
На фиг.12 показаны концентрации акриламида в образце хлебного теста, взятого во временной точке 5 час из эксперимента, изображенного на фиг.11.
На фиг.13 показано потребление аспарагина в хлебном тесте с использованием коммерческих хлебопекарных дрожжей (BY) со сверхэкспрессией ASP3 или GAP1 и комбинации ASP3/GAP1.
На фиг.14 показано потребление аспарагина в хлебном тесте с использованием лабораторных (LY) с нокаутом гена DAL80 или URE2.
На фиг.15 показаны концентрации акриламида в образце хлебного теста, взятого во временной точке 5 час из эксперимента, изображенного на фиг.14.
На фиг.16 показано потребление аспарагина в комплексной среде с использованием коммерческих хлебопекарных дрожжей (BY) со сверхэкспрессией AGP2 или AGP3 после 5 часов роста.
На фиг.17 показано потребление аспарагина в синтетической среде, содержащей аспарагин и аммиак, с использованием коммерческих хлебопекарных дрожжей (BY) со сверхэкспрессией GAT1 или ASP3 и комбинации GAT1/ASP3.
На фиг.18 показано потребление аспарагина в синтетической среде, содержащей аспарагин и аммиак, с использованием коммерческих хлебопекарных дрожжей (BY) со сверхэкспрессией GNP1.
На фиг.19 показано потребление аспарагина в синтетической среде, содержащей аспарагин и аммиак, с использованием лабораторных дрожжей (LY) со сверхэкспрессией ASP3 или делецией TOR1 и с комбинацией tor1∆/ASP3.
На фиг.20 показано потребление аспарагина в синтетической среде, содержащей аспарагин, с использованием коммерческих хлебопекарных дрожжей (BY) со сверхэкспрессией AGP1 и лабораторных дрожжей (LY) с нокаутом GZF3 после 5 часов роста.
Подробное описание
Авторы настоящего изобретения получили штаммы дрожжей, обладающие увеличенной способностью к потреблению и/или деградации аспарагина, который является лимитирующим предшественником, получаемым в ходе переработки или приготовления пищевого продукта, который приводит к продукции акриламида.
Микроорганизмы
В одном варианте осуществления представлен микроорганизм, трансформированный по меньшей мере одной молекулой нуклеиновой кислоты для снижения азотной катаболитной репрессии и/или для сверхэкспрессии гена, кодирующего внеклеточный белок, вовлеченный в деградацию аспарагина, и/или гена, кодирующего белок, вовлеченный в транспорт аспарагина, в условиях приготовления/переработки пищевых продуктов.
В другом варианте осуществления микроорганизм трансформируют по меньшей мере двумя, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5 или более молекулами нуклеиновой кислоты.
Фраза «сверхэкспрессия гена, кодирующего внеклеточный белок, вовлеченный в деградацию аспарагина, и/или гена, кодирующего белок, вовлеченный в транспорт аспарагина», как применяют в настоящем документе, относится к увеличенной экспрессии мРНК или белков, которые транспортируются к мембране клетки или секретируются к клеточной стенке и которые вовлечены в транспорт и/или деградацию аминокислоты аспарагина по сравнению с контролем, не трансформированным молекулой нуклеиновой кислоты.
Молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой любую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, вовлеченный, напрямую или опосредованно, в транспорт аспарагина, и/или внеклеточный белок, вовлеченный напрямую или опосредованно в деградацию аспарагина. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует аспарагиназу клеточной стенки или ее фрагмент, обладающий активностью деградации аспарагина. Внеклеточные аспарагиназы представляют собой ферменты, известные в данной области, и включают в себя, без ограничения, внеклеточные аспарагиназы, такие как аспарагиназы клеточной стенки из любого источника, способные превращать аспарагин в аспартат, такого как дрожжи Asp3p, или их гомологи, и могут быть кодированы любыми генами аспарагиназы, кодирующие аспарагиназы клеточной стенки, включая, без ограничения, ASP3 или их гомологи. В одном варианте осуществления аспарагиназа клеточной стенки является кодированной молекулой нуклеиновой кислоты ASP3, как показано на SEQ ID NO:2 или ее гомолог или фрагмент, или содержит аминокислотную последовательность Asp3p, как показано на SEQ ID NO:1, или ее гомолог или фрагмент. Микроорганизмы, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие внеклеточные аспарагиназы, способные деградировать аспарагин в условиях приготовления и переработки пищевых продуктов.
В другом варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует транспортер аминокислот или его фрагмент, обладающий способностью транспортировать аспарагин в клетку. Транспортеры аминокислот известны в данной области и включают в себя, без ограничения, транспортеры аминокислот из любого источника, способные к активному транспорту аспарагина в микроорганизм, такой как дрожжи Gap1p, Agp1p, Gnp1p, Dip5p, Agp2p и Agp3p (NP_012965, NP_009905, NP_010796, NP_015058, NP_009690 и NP_116600), или их гомолог, и могут быть кодированы любым геном транспортера аминокислот, включая, без ограничения, GAP1, AGP1, GNP1, DIP5, AGP2 и AGP3 (SGD:S000001747, SGD:S000000530, SGD:S000002916, SGD:S000006186, SGD:S000000336 и SGD:S000001839) или их гомолог. Соответственно, в одном варианте осуществления транспортер аминокислот кодирован молекулой нуклеиновой кислоты GAP1, AGP3, AGP2, GNP1, AGP1 или DIP5, как показано на SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12 или 30 соответственно, или ее гомологом или фрагментом, или содержит аминокислотную последовательность Gap1p, Agp3p, Agp2p, Gnp1p, Agp1p или Dip5p, как показано на SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11 или 29 соответственно, или ее гомолог или фрагмент. Микроорганизмы, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие транспортеры аминокислот, способны потреблять или поглощать аспарагин в условиях приготовления и переработки пищевых продуктов.
В другом варианте осуществления микроорганизм трансформируют нуклеиновой кислотой, кодирующей аспарагиназу клеточной стенки, и нуклеиновой кислотой, кодирующей транспортер аминокислот. В таком варианте осуществления микроорганизм является способным потреблять и деградировать аспарагин.
Фраза «снижать азотную катаболитную репрессию (NCR)» транспорта/деградации аспарагина, как применяют в настоящем документе, относится к действительному снижению репрессии генов для NCR-чувствительных генов или относится к увеличенной эндогенной экспрессии или гетерологичной экспрессии NCR-чувствительных генов. Например, молекула нуклеиновой кислоты для снижения NCR может представлять собой регуляторный фактор, который модифицирует выражение азотной катаболитной репрессии или может представлять собой сверхэкспрессию NCR-чувствительного гена.
В другом варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты модифицирует активность регуляторного фактора азотной катаболитной репрессии. Регуляторные факторы для азотной катаболитной репрессии известны в данной области и включают в себя, без ограничения, регуляторные факторы из любого источника, такого как дрожжи Gat1p, Ure2p, Tor1p, Dal80p, Gzf3p, Tor2p, или Gln3p, как показано на SEQ ID NO:13, 15, 17, 19, 21, 33 или 31, или их гомолог или фрагмент, и могут быть кодированы любым геном, кодирующим регуляторный фактор, такой как GAT1, URE2, TOR1, DAL80, GZF3, TOR2, или GLN3, как показано на SEQ ID NO:14, 16, 18, 20, 22, 34 или 32. Например, можно получить микроорганизм, больше не обладающий функциональным отрицательным регулятором, таким как Ure2p, Tor1p, Tor2p Dal80p или Gzf3p. Этого можно достигать, например, посредством молекулы нуклеиновой кислоты, приводящей к делеции гена URE2, выделения и экспрессии мутантного фенотипа ure2, так что он больше не осуществляет понижающей регуляции активности Gln3p и Gat1p, посредством скрещивания штамма дикого типа со штаммом [URE3], или индукции фенотипа [URE3] любыми способами молекулярной биологии, включая цитодукию и сверхэкспрессию URE2. Последствия отсутствия у клеток функционального Ure2p приводят к тому, что чувствительные к NCR гены, такие как гены, вовлеченные в транспорт и утилизацию аспарагина (т.е. ASP3, AGP1, GAP1, GAT1, DAL80 и GZF3), больше не репрессированы в присутствии хорошего источника азота, такого как аммиак или глутамин. Соответственно, в одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит делеционную кассету URE2, TOR1, TOR2, DAL80 и/или GZF3. Микроорганизмы с отсутствием функционального Ure2p, Tor1p, Dal80p и/или Gzf3p способны потреблять и деградировать аспарагин в условиях приготовления и переработки пищевых продуктов. Альтернативно, этого можно достигать посредством молекулы нуклеиновой кислоты, приводящей к сверхэкспрессии функционального положительного регулятора, такого как Gat1p и/или Gln3p.
Термин «ген», как применяют в настоящем документе, находится в соответствии с его обычным определением, для обозначения функционально связанной группы последовательностей нуклеиновой кислоты. Модификация гена в контексте настоящего описания может включать в себя модификацию любой из различных последовательностей, функционально связанной с геном. Под «функционально связанными» понимают, что конкретные последовательности взаимодействуют напрямую или опосредованно для выполнения предназначенной им функции, такой как опосредование или модуляция экспрессии гена. Взаимодействие функционально связанных последовательностей может быть, например, опосредовано белками, которые, в свою очередь, взаимодействуют с последовательностями нуклеиновой кислоты.
Последовательности различных генов и нуклеиновых кислот по описанию могут представлять собой рекомбинантные последовательности. Термин «рекомбинантный», как применяют в настоящем документе, относится к чему-либо, что подвергали рекомбинации, так что по отношению к конструкции нуклеиновой кислоты термин относится к молекуле, содержащей последовательности нуклеиновой кислоты, соединенные вместе в некоторой точке или полученные способами молекулярной биологии. Термин «рекомбинантный» по отношению к белку или полипептиду обозначает молекулу белка или полипептида, которую экспрессируют с использованием рекомбинантной конструкции нуклеиновой кислоты, полученной способами молекулярной биологии. Термин «рекомбинантный» по отношению к генетической композиции относится к гамете или потомству, или клетке, или геному с новыми комбинациями аллелей, не встречающимися в природных родительских геномах. Рекомбинантные конструкции нуклеиновых кислот могут включать в себя нуклеотидную последовательность, лигированную, или подвергнутую манипуляциям для лигирования с последовательностью нуклеиновой кислоты, с которой она не лигирована в природе, или с которой она лигирована в природе в другой локализации. Обозначение конструкции нуклеиновой кислоты как «рекомбинантной» таким образом, обозначает, что с молекулой нуклеиновой кислоты манипулировали посредством вмешательства человека с использованием генной инженерии.
Молекулы нуклеиновой кислоты можно химически синтезировать с использованием таких способов, как описанные, например, в Itakura et al., Патент США No. 4598049; Caruthers et al., Патент США No. 4458066; и Itakura, Патенты США No. 4401796 и 4373071. Такие синтетический нуклеиновые кислоты по их природе являются «рекомбинантными», как этот термин применяют в настоящем документе (являясь продуктом последовательных стадий объединения составляющих частей молекулы).
Степень гомологии между последовательностями (такими как природные аминокислотные последовательности Asp3p, Gap1p, Dip5p, Gnp1p, Agp1p, Agp2p, Agp3p, Tor1p, Tor2p, Gat1p, Gln3p, Dal80p, Gzf3p или Ure2p, или природные последовательности нуклеиновой кислоты ASP3, GAP1, DIP5, GNP1, AGP1, AGP2, AGP3, TOR1, TOR2, GAT1, GLN3, DAL80, GZF3 или URE2, и последовательность гомолога) можно выражать как процент идентичности, когда последовательности оптимально выровнены, подразумевая существование точных совпадений между последовательностями. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнений идентичности можно проводить с использованием множества алгоритмов, таких как алгоритм поиска локальных гомологий Смита и Уотермана, 1981, Adv. Appl. Math 2: 482, алгоритм выравнивания по гомологии Нидлемана и Вунша, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, способ поиска сходства по Пирсону и Липману, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, и компьютеризированные реализации этих алгоритмов (такие как GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WI, U.S.A.). Выравнивание последовательностей можно проводить также с использованием алгоритма BLAST, описанного в Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-10 (с использованием опубликованных параметров по умолчанию). Программное обеспечение для проведения анализа BLAST может быть доступно через Национальный центр биотехнологической информации (через Интернет на http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Алгоритм BLAST включает в себя первичную идентификацию пар последовательностей с высокой степенью сходства (HSP) посредством идентификации коротких слов длиной W в запрашиваемой последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторому положительно оцениваемому пороговому показателю T при выравнивании со словом той же длины в последовательности из базы данных. T обозначает пороговую оценку сходства соседних слов. Первоначальное попадание в соседнее слово является источником для инициации поисков с целью найти более длинные HSP. Попадания в слова расширяются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности, пока кумулятивная оценка выравнивания может увеличиваться. Расширение попадания в слова в каждом направлении прекращается, когда встречаются следующие параметры: кумулятивная оценка выравнивания уменьшается на количество Х от ее максимально достигнутого значения; кумулятивная оценка стремится к нулю или ниже из-за накопления одного или нескольких отрицательно оцениваемых выравниваний остатков; или достигнут конец какой-либо из последовательностей. Параметры алгоритма BLAST W, T и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программы BLAST могут использовать по умолчанию длину слова (W), оценочную матрицу BLOSUM62 (Henikoff and Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919) выравнивания (B) 50, ожидание (E) 10 (которое может меняться в альтернативных вариантах осуществления до 1 или 0,1 или 0,01 или 0,001 или 0,0001; хотя значения E, намного превышающие 0,1, могут не идентифицировать функционально сходные последовательности, полезно проверять попадания с более низкой значимостью, значениями E между 0,1 и 10 по коротким областям сходства), M=5, N=4, для сравнения обеих цепей нуклеиновых кислот. Для сравнения белков BLASTP можно использовать со следующими параметрами по умолчанию: G=11 (штраф за открытие пропуска); E=1 (штраф за расширение пропуска); E=10 (величина ожидания, в этом параметре предполагают ожидание того, что 10 попаданий с показателями, равными или лучшими, чем определенный показатель выравнивания, S, появляются случайно в базе данных того же размера, что и та, в которой ведется поиск; значение E можно увеличивать или уменьшать для изменения строгости поиска.); и W=3 (длина слова, по умолчанию 11 для BLASTN, 3 для других программ blast). Матрица BLOSUM определяет оценку вероятности для каждого положения при выравнивании, которая основана на частоте, с которой, как известно, эта замена встречается среди консенсусных блоков в пределах родственных белков. Матрицу замен BLOSUM62 (штраф за существование пропуска = 11; штраф за пропуск остатка = 1; соотношение лямбда = 0,85) используют по умолчанию в BLAST 2.0. Множество других матриц может быть использовано в качестве альтернативных для BLOSUM62, включая: PAM30 (9,1,0.87); PAM70 (10,1,0.87) BLOSU 80 (10,1,0.87); BLOSUM62 (1,1,0.82) и BLOSUM45 (14,2,0.87). Одним из измерений статистического сходства между двумя последовательностями с использованием алгоритма BLAST является наименьшая сумма вероятностей (P(N)), которая указывает на вероятность, с которой совпадение двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей может происходить случайно. В альтернативных вариантах осуществления нуклеотидные или аминокислотные последовательности считают по существу идентичными, если наименьшая сумма вероятностей при сравнении тестируемых последовательностей составляет менее приблизительно 1, менее приблизительно 0,1, менее приблизительно 0,01 или менее приблизительно 0,001. Сходство между последовательностями можно также выражать как процентную идентичность.
Последовательности нуклеиновой кислоты и белка, описанные в настоящем документе, могут в некоторых вариантах осуществления являться по существу идентичными, например, по существу идентичными аминокислотным последовательностям Asp3p, Gap1p, Gnp1p, Agp1p, Agp2p, Agp3p, Gat1p, Tor1p, Tor2p, Dip5p, Gln3p, Dal80p, Gzf3p или Ure2p, или последовательностям нуклеиновой кислоты ASP3, GAP1, GNP1, AGP1, AGP2, AGP3, TOR1, TOR2, DIP5, GLN3, GAT1, DAL80, GZF3 или URE2. Значительная идентичность таких последовательностей может быть отражена в проценте идентичности при оптимальном выравнивании, который может составлять, например, более 50%, 80%-100%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95%, что в случае нацеливаемых на гены субстратов может относиться к идентичности части нацеливаемого на ген субстрата части последовательности-мишени, где степень идентичности может облегчать гомологичное спаривание и рекомбинацию и/или репарацию. Альтернативным указанием на то, что две последовательности нуклеиновой кислоты являются, по существу, идентичными, является то, что эти две последовательности гибридизуются друг с другом в умеренно строгих или высоко строгих условиях. Гибридизацию со связанными с фильтром последовательностями в умеренно строгих условиях можно проводить, например, в 0,5M NaHPO4, 7% додецилсульфате натрия (SDS), 1 мМ ЭДТА при 65°C, а отмывку в 0,2×SSC/0,1% SDS при 42°C (см. Ausubel, et al. (eds), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Green Publishing Associates, Inc., и John Wiley & Sons, Inc., New York, p. 2.10.3). Альтернативно, гибридизацию со связанными с фильтром последовательностями в высоко строгих условиях можно проводить, например, в 0,5M NaHPO4, 7% SDS, 1 мМ ЭДТА при 65°C, а отмывку в 0,1×SSC/0,1% SDS при 68°C (см. Ausubel, et al. (eds), 1989, выше). Условия гибридизации можно модифицировать в соответствии с известными способами в зависимости от интересующей последовательности (см. Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Часть I, Глава 2 «Обзор принципов гибридизации и стратегии анализов с использованием нуклеотидных зондов», Elsevier, New York). Как правило, выбирают строгие условия, которые приблизительно на 5°C ниже, чем точка плавления специфической последовательности при определенной ионной силе и pH. Отмывки для строгой гибридизации могут, например, составлять по меньшей мере 15 минут, 30 минут, 45 минут, 60 минут, 75 минут, 90 минут, 105 минут или 120 минут.
В данной области хорошо известно, что некоторые модификации и изменения можно вносить в структуру полипептида, такого как Asp3p, Gap1p, Gnp1p, Agp1p, Agp2p, Agp3p, Gatp, Tor1p, Tor2p, Dip5p, Gln3p, Dal80p, Gzf3p или Ure2p, без существенного изменения биологической функции этого пептида, для получения биологически эквивалентного полипептида. В одном аспекте белки, обладающие активностью транспорта аспарагина, могут включать в себя белки, отличающиеся от аминокислотных последовательностей природных Gap1p, Gnp1p, Dip5p, Agp1p, Agp2p, Agp3p или других транспортеров консервативными заменами аминокислот. Подобным образом, белки, обладающие активностью аспарагиназы, могут включать в себя белки, отличающиеся от последовательностей природного Asp3p, или других аспарагиназ клеточной стенки консервативными аминокислотными заменами. Как применяют в настоящем документе, термин «законсервированные или консервативные аминокислотные замены» обозначает замену одной аминокислоты на другую в заданном положении в белке, где замену можно осуществлять без существенной потери соответствующей функции. При осуществлении таких изменений, замены сходных аминокислотных остатков можно осуществлять на основании относительного сходства заместителей боковых цепей, например, их размера, заряда, гидрофобности, гидрофильности и тому подобного, и можно анализировать эффект таких замен на функцию белка посредством общепринятого тестирования.
В некоторых вариантах осуществления можно выполнять консервативные замены аминокислот, где аминокислотный остаток замещен на другой аминокислотный остаток, имеющий сходную величину гидрофильности (например, в пределах значения плюс или минус 2,0), где нижеследующее может представлять собой аминокислоту, обладающую индексом гидропатичности приблизительно -1,6, например, Tyr (-1,3) или Pro (-1,6), приписанным аминокислотным остаткам (как подробно описано в Патенте США No. 4554101, содержание которого приведено в настоящем документе в качестве ссылки): Arg (+3,0); Lys (+3,0); Asp (+3,0); Glu (+3,0); Ser (+0,3); Asn (+0,2); Gln (+0,2); Gly (0); Pro (-0,5); Thr (-0,4); Ala (-0,5); His (-0,5); Cys (-1,0); Met (-1,3); Val (-1,5); Leu (-1,8); Ile (-1,8); Tyr (-2,3); Phe (-2,5); и Trp (-3,4).
В альтернативных вариантах осуществления можно выполнять консервативные замены аминокислот, где аминокислотный остаток замещен на другой аминокислотный остаток, имеющий сходную величину гидропатичности (например, в пределах значения плюс или минус 2,0). В таких вариантах осуществления каждому аминокислотному остатку можно приписать индекс гидропатичности на основании характеристик его гидрофобности и заряда следующим образом: Ile (+4,5); Val (+4,2); Leu (+3,8); Phe (+2,8); Cys (+2,5); Met (+1,9); Ala (+1,8); Gly (-0,4); Thr (-0,7); Ser (-0,8); Trp (-0,9); Tyr (-1,3); Pro (-1,6); His (-3,2); Glu (-3,5); Gln (-3,5); Asp (-3,5); Asn (-3,5); Lys (-3,9); и Arg (-4,5).
В альтернативных вариантах осуществления можно выполнять консервативные замены аминокислот, где аминокислотный остаток замещен на другой аминокислотный остаток того же класса, где аминокислоты подразделяются на классы неполярных, кислых, основных и нейтральных аминокислот, следующим образом: неполярные: Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro, Met; кислые: Asp, Glu; основные: Lys, Arg, His; нейтральные: Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr.
В альтернативных вариантах осуществления консервативные замены аминокислот включают в себя замены, основанные на представлениях о гидрофильности или гидрофобности, размере, или объеме, или заряде. Как правило, аминокислоты могут быть охарактеризованы как гидрофобные или гидрофильные главным образом в зависимости от свойств боковой цепи аминокислот. Гидрофобная аминокислота имеет гидрофобность больше нуля, а гидрофильная аминокислота имеет гидрофильность менее нуля, на основании нормализованной консенсусной шкалы гидрофобности Eisenberg et al. (J. Mol. Bio. 179:125-142, 184). Генетически кодируемые гидрофобные аминокислоты включают в себя Gly, Ala, Phe, Val, Leu, Ile, Pro, Met и Trp, и генетически кодируемые гидрофильные аминокислоты включают в себя Thr, His, Glu, Gln, Asp, Arg, Ser и Lys. Негенетически кодируемые гидрофобные аминокислоты включают в себя т-бутилаланин, в то время как негенетически кодируемые гидрофильные аминокислоты включают в себя цитруллин и гомоцистеин.
Гидрофобные или гидрофильные аминокислоты можно дополнительно подразделять на основании характеристик их боковых цепей. Например, ароматическая аминокислота представляет собой гидрофобную аминокислоту с боковой цепью, содержащей по меньшей мере одно ароматическое или гетероароматическое кольцо, которое может содержать один или несколько заместителей, таких как -OH, -SH, -CN, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, -NO, -NH2, -NHR, -NRR, -C(O)R, -C(O)OH, -C(O)OR, -C(O)NH2, -C(O)NHR, -C(O)NRR и т.д., где R независимо представляет собой (C1-C6) алкил, замещенный (C1-C6) алкил, (C1-C6) алкенил, замещенный (C1-C6) алкенил, (C1-C6) алкинил, замещенный (C1-C6) алкинил, (C5-C20) арил, замещенный (C5-C20) арил, (C6-C26) алкарил, замещенный (C6-C26) алкарил, 5-20-членный гетероарил, замещенный 5-20-членный гетероарил, 6-26-членный алкгетероарил или замещенный 6-26-членный алкгетероарил. Генетически кодируемые ароматические аминокислоты включают в себя Phe, Tyr и Tryp.
Неполярная аминокислота представляет собой гидрофобную аминокислоту с боковой цепью, которая является незаряженной при физиологическом pH, и которая имеет связи, в которых пара электронов, обобществленная двумя атомами, как правило, в равной степени удерживается каждым из двух атомов (т.е. боковая цепь является неполярной). Генетически кодируемые неполярные аминокислоты включают в себя Gly, Leu, Val, Ile, Ala и Met. Неполярные аминокислоты можно дополнительно подразделять с включением алифатических аминокислот, которые представляют собой гидрофобные аминокислоты, имеющие алифатическую углеводородную боковую цепь. Генетически кодируемые алифатические аминокислоты включают в себя Ala, Leu, Val и Ile.
Полярная аминокислота представляет собой гидрофильную аминокислоту с боковой цепью, которая является незаряженной при физиологическом pH, но имеет одну связь, в которой пара электронов, обобществленная двумя атомами, находится ближе к одному из атомов. Генетически кодируемые полярные аминокислоты включают в себя Ser, Thr, Asn и Gln.
Кислая аминокислота представляет собой гидрофильную аминокислоту со значением pKa боковой цепи менее 7. Кислые аминокислоты, как правило, имеют отрицательно заряженные боковые цепи при физиологическом pH из-за потери иона водорода. Генетически кодируемые кислые аминокислоты включают в себя Asp и Glu. Основная аминокислота представляет собой гидрофильную аминокислоту со значением pKa боковой цепи более 7. Основные аминокислоты, как правило, имеют положительно заряженные боковые цепи при физиологическом pH из-за ассоциации с ионом гидроксония. Генетически кодируемые основные аминокислоты включают в себя Arg, Lys и His.
Специалисту в данной области понятно, что вышеупомянутые классификации не являются абсолютными, и что аминокислота может быть классифицирована в более чем одной категории. Кроме того, аминокислоты можно классифицировать на основании известного поведения и/или характерных химических, физических или биологических свойств на основании специфических анализов или по сравнению с предварительно идентифицированными аминокислотами.
Микроорганизм может представлять собой любой микроорганизм, пригодный для добавления в пищевые продукты, включая, без ограничения, грибы и/или бактерии. Грибы, пригодные по настоящему описанию, включают в себя, без ограничения, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Neurospora crassa, Neurospora intermedia var. oncomensis, Penicillium camemberti, Penicillium candidum, Penicillium roqueforti, Rhizopus oligosporus, Rhizopus oryzae. В другом варианте осуществления грибы представляют собой дрожжи, такие как Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces carlsbergensis, Candida albicans, Candida kefyr, Candida tropicalis, Cryptococcus laurentii, Cryptotoccous neoformans, Hansenula anomala, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus var lactis, Pichia pastoris, Rhodotorula rubra, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolyitca или любой штамм, принадлежащий к царству грибов. Существует множество коммерческих источников штаммов дрожжей, таких как Lallemand Inc. (Canada), AB Mauri (Australia) и Lesaffre (France). В другом варианте осуществления бактерии могут представлять собой любые бактерии, включая Erwinia sp., Lactobacillus sp., Lactococcus sp., Bacillus sp., Pediococcus sp., Pseudomonas sp., Brevibacterium sp. и Leuconostoc sp.
В одном варианте осуществления микроорганизм является неактивным, таким как неактивные дрожжи. Термин «неактивный», как применяют в настоящем документе, относится к композиции неактивных, нежизнеспособных и/или мертвых микроорганизмов, которые все еще сохраняют их содержание питательных веществ и другие свойства. Например, дрожжи можно выращивать в условиях, позволяющих сверхэкспрессию желательного белка или белков. Затем дрожжи можно использовать для получения неактивных дрожжей, например, посредством множества способов пастеризации, включая, без ограничения, высокотемпературную пастеризацию и кратковременную пастеризацию, множества способов стерилизации, включая, без ограничения, стерилизацию влажным паром и облучение, множества способов инактивации, включая, без ограничения, инактивацию под высоким давлением, фотокаталитическую инактивацию и инактивацию импульсным излучением, фотосенсибилизацию, инактивацию электрическими полями, включая RF и пульсирующие поля, разрушение клеток, обработку ультразвуком, гомогенизацию, автолиз и инактивацию на основе химических веществ, включая, без ограничения, формальдегид, тимеросол, хлорамины, диоксид хлора, иод, серебро, медь, антибиотики и озон.
Рекомбинантные конструкции нуклеиновых кислот можно, например, вводить в клетку-хозяина микроорганизма посредством трансформации. Такие рекомбинантные конструкции нуклеиновых кислот могут включать последовательности, полученные из того же самого вида клетки-хозяина или из других видов клеток-хозяев, выделенные и повторно введенные в клетки вида-хозяина.
Рекомбинантные последовательности нуклеиновой кислоты могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина, либо в результате первичной трансформации клеток-хозяев, либо в результате последующих событий рекомбинации и/или репарации. Альтернативно, рекомбинантные последовательности могут сохраняться в виде внехромосомных элементов. Такие последовательности можно репродуцировать, например, с использованием организма, такого как трансформированный штамм дрожжей, в качестве исходного штамма для способов улучшения штамма, осуществляемых посредством мутации, массового скрещивания или слияния протопластов. Полученные штаммы, сохраняющие рекомбинантную последовательность по изобретению, сами считаются «рекомбинантными», как этот термин применяют в настоящем документе.
Трансформация представляет собой способ, посредством которого генетический материал, переносимый клеткой, изменяют посредством включения одной или нескольких экзогенных нуклеиновых кислот в клетку. Например, дрожжи можно трансформировать с использованием множества способов (Gietz et al., 1995). Такая трансформация может происходить посредством включения экзогенной нуклеиновой кислоты в генетический материал клетки или посредством изменения эндогенного генетического материала клетки, происходящего в результате воздействия на клетку экзогенной нуклеиновой кислоты. Трансформанты или трансформированные клетки являются клетками или потомками клеток, которые были функционально улучшены посредством поглощения экзогенной нуклеиновой кислоты. Как эти термины применяют в настоящем документе, их применяют к потомкам трансформированных клеток, где желательное генетическое изменение сохранено на протяжении последующих поколений клеток, независимо от других мутаций или изменений, которые также могут присутствовать в клетках последующих поколений.
В одном варианте осуществления может быть представлен вектор, содержащий рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, обладающую кодирующей последовательностью аспарагиназы или транспортера аминокислот или положительного регуляторного фактора NCR, или мутантного отрицательного регуляторного фактора NCR, или их гомологов, под контролем гетерологичной промоторной последовательности, опосредующей регулируемую экспрессию полипептида. Для предоставления таких векторов открытую рамку считывания (ORF), например, открытую рамку считывания, полученную из микроорганизма-хозяина, можно вставлять в плазмиду, содержащую экспрессирующую кассету, которая может регулировать экспрессию рекомбинантного гена. Альтернативно, молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой делеционную кассету для делеции отрицательного регуляторного фактора NCR. Рекомбинантную молекулу можно вводить в избранный микроорганизм для предоставления трансформированного штамма, обладающего измененным транспортом аспарагина и деградирующей активностью. В альтернативных вариантах осуществления на экспрессию природной кодирующей последовательности аспарагиназы или транспортера аминокислот или регуляторного фактора NCR или гомолога у хозяина можно влиять также посредством замены природного промотора на другой промотор. Дополнительные регуляторные элементы также можно использовать для конструирования рекомбинантных экспрессирующих кассет с использованием эндогенной кодирующей последовательности. Рекомбинантные гены или экспрессирующие кассеты можно интегрировать в хромосомную ДНК хозяина.
В одном варианте осуществления микроорганизмы трансформируют для постоянной деградации и/или поглощения молекул аспарагина в условиях приготовления/переработки пищевых продуктов. Например, молекулу нуклеиновой кислоты можно функционально связывать с конститутивно активным промотором. Конститутивно активные промоторы известны в данной области и включают в себя, без ограничения, промотор PGK1, промотор TEF, усеченный промотор HXT7. Альтернативно, молекулу нуклеиновой кислоты можно функционально связывать с промотором, который не подвергается азотной катаболитной репрессии, таким как ADH1, GAL1, CUP1, PYK1 или CaMV 35S.
Термин «промотор», как применяют в настоящем документе, относится к нуклеотидной последовательности, способной опосредовать или модулировать транскрипцию интересующей нуклеотидной последовательности с желательной пространственной или временной картиной и до желательной степени, когда регулирующая транскрипцию область функционально связана с интересующей последовательностью. Регулирующая транскрипцию область и интересующая последовательность являются «функционально или оперативно связанными», когда последовательности функционально соединены, так чтобы позволять опосредование или модуляцию транскрипции интересующей последовательности регулирующей транскрипцию областью. В некоторых вариантах осуществления, чтобы являться функционально связанной, регулирующая транскрипцию область может быть локализована на той же цепи, что и интересующая последовательность. Регулирующая транскрипцию область может в некоторых вариантах осуществления быть локализована на 5' от интересующей последовательности. В таких вариантах осуществления регулирующая транскрипцию область может находится непосредственно на 5' от интересующей последовательности, или могут существовать промежуточные последовательности между этими областями. Регулирующие транскрипцию последовательности могут в некоторых вариантах осуществления быть локализованы на 3' от интересующей последовательности. Для функциональной связи регулирующей транскрипцию области и интересующей последовательности может являться необходимым связывание соответствующих молекул (таких как белки - активаторы транскрипции) с регулирующей транскрипцию областью, таким образом, описание включает варианты осуществления, в которых представлены такие молекулы, in vitro или in vivo.
Промоторы для использования включают в себя, без ограничения, промоторы, выбранные из подходящих природных промоторов S. cerevisiae, таких как промотор PGK1. Такие промоторы можно использовать с дополнительными регуляторными элементами, такими как терминатор PGK1. Можно использовать множество природных или рекомбинантных промоторов, где промоторы выбирают или конструируют для опосредования проявления активности деградации аспарагина, такой как активность Asp3p, в выбранных условиях, таких как условия приготовления и переработки пищевых продуктов. Множество конститутивных промоторов могут быть, например, функционально связаны с кодирующей последовательностью.
В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит генетическую кассету ASP3 или GNP1, или AGP2, или AGP3, или GAT1 (фиг.1, 3, 4, 5 или 7), которую вставляют в локус LEU2. В другом варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит кассету GAP1 или AGP1 или ASP3, которую вставляют в локус URA3 (фиг.1, 2 и 6). В другом варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит кассету ure2Δ, которую вставляют в локус URE2 (фиг.8).
Методы
В другом аспекте представлен способ снижения количества аспарагина во время приготовления или переработки пищевых продуктов, включающий в себя добавление микроорганизма, описанного в настоящем документе, в пищевой продукт в условиях приготовления или переработки; где микроорганизм снижает азотную катаболитную репрессию и/или сверхэкспрессирует ген, кодирующий внеклеточный белок, вовлеченный в деградацию аспарагина, и/или ген, кодирующий белок, вовлеченный в транспорт аспарагина, таким образом снижая количество аспарагина в пищевом продукте. Также в настоящем документе представлено использование микроорганизмов, описанных в настоящем документе, для снижения количества аспарагина в условиях приготовления или переработки пищевых продуктов.
В другом варианте осуществления представлен способ снижения количества аспарагина во время приготовления или переработки пищевых продуктов, включающий в себя
a) трансформацию микроорганизма по меньшей мере одной молекулой нуклеиновой кислоты для снижения азотной катаболитной репрессии и/или для сверхэкспрессии гена, кодирующего внеклеточный белок, вовлеченный в деградацию аспарагина, и/или гена, кодирующего белок, вовлеченный в транспорт аспарагина;
b) добавление микроорганизма в пищевой продукт в условиях приготовления или переработки пищевого продукта;
где микроорганизм снижает азотную катаболитную репрессию и/или сверхэкспрессирует ген, кодирующий внеклеточный белок, вовлеченный в деградацию аспарагина, и/или ген, кодирующий белок, вовлеченный в транспорт аспарагина, таким образом, снижая количество аспарагина.
Аспарагин является лимитирующим предшественником в реакции, образующей акриламид во время приготовления или переработки пищевого продукта. Соответственно, в другом варианте осуществления представлен способ снижения количества акриламида в пищевом продукте, включающий в себя добавление микроорганизма, описанного в настоящем документе, в пищевой продукт в условиях приготовления или переработки; где микроорганизм снижает азотную катаболитную репрессию и/или сверхэкспрессирует ген, кодирующий внеклеточный белок, вовлеченный в деградацию аспарагина и/или ген, кодирующий белок, вовлеченный в транспорт аспарагина, таким образом снижая количество акриламида в пищевом продукте. В настоящем документе представлено также использование микроорганизмов, описанных в настоящем документе, для снижения концентрации акриламида в условиях приготовления или переработки пищевых продуктов.
В другом варианте осуществления представлен способ снижения количества акриламида в пищевом продукте, включающий в себя
a) трансформацию микроорганизма по меньшей мере одной молекулой нуклеиновой кислоты для снижения азотной катаболитной репрессии и/или для сверхэкспрессии гена, кодирующего внеклеточный белок, вовлеченный в деградацию аспарагина, и/или гена, кодирующего белок, вовлеченный в транспорт аспарагина;
b) добавление микроорганизма в пищевой продукт в условиях приготовления или переработки пищевого продукта;
где микроорганизм снижает азотную катаболитную репрессию и/или сверхэкспрессирует ген, кодирующий внеклеточный белок, вовлеченный в деградацию аспарагина и/или ген, кодирующий белок, вовлеченный в транспорт аспарагина, таким образом, снижая количество акриламида в пищевом продукте.
В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует аспарагиназу клеточной стенки, как описано в настоящем документе, и в условиях приготовления или переработки пищевого продукта микроорганизм экспрессирует аспарагиназу, например, посредством конститутивной экспрессии. В другом варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует транспортер аминокислот, как описано в настоящем документе, и в условиях приготовления или переработки пищевого продукта экспрессирует транспортер аминокислот, например, посредством конститутивной экспрессии. В другом варианте осуществления, молекула нуклеиновой кислоты кодирует как аспарагиназу клеточной стенки, так и транспортер аминокислот. В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота модифицирует регуляторный фактор азотной катаболитной репрессии, как описано в настоящем документе, и в условиях приготовления или переработки пищевого продукта регуляторный фактор не экспрессируется, так что NCR-чувствительные гены экспрессируются в присутствии хороших источников азота. В другом варианте осуществления, после трансформации микроорганизм выращивают в условиях, позволяющих сверхэкспрессию желаемых белков, и затем микроорганизм инактивируют и перерабатывают для добавления в пищевой продукт в условиях приготовления или переработки пищевого продукта. В таком варианте осуществления белки в неактивном микроорганизме обладают активностью деградации аспарагина, таким образом, снижая количество акриламида в пищевом продукте.
В одном варианте осуществления условия приготовления или переработки пищевого продукта включают в себя ферментацию. Например, способы и применения в настоящем документе являются пригодными для ферментации пищевого продукта, включая, без ограничения, углеводы в процессе выпечки хлеба, переработки картофеля, изготовления печенья, изготовления кофе или изготовления закусочных пищевых продуктов.
В другом варианте осуществления в описании представлен способ отбора природных мутантов ферментирующего организма, обладающих желательным уровнем активности деградации аспарагина в условиях приготовления и переработки пищевых продуктов. Например, можно отбирать штаммы с отсутствием NCR транспортера аминокислот или аспарагиназы клеточной стенки, например, ASP3, GAP1, GNP1, AGP1, AGP2, AGP3, TOR1, TOR2, DIP5, GLN3, GAT1, DAL80, GZF3 или URE2. Пример мутации и протоколов отбора для дрожжей, см. в Патенте Соединенных Штатов No. 6140108, выданном Mortimer et al. 31 октября 2000 г., содержание которого приведено в настоящем документе посредством ссылки. В таких способах штамм дрожжей можно обрабатывать мутагеном, таким как этилметансульфонат, азотистая кислота, или гидроксиламин, образующим мутанты с помощью замен пар оснований. Можно проводить скрининг мутантов с измененной активностью деградации аспарагина, например, посредством рассева на подходящую среду.
В другом варианте осуществления можно использовать сайт-специфический мутагенез для изменения уровня транспорта аспарагина или активности деградации аспарагина у хозяина. Например, сайт-специфический мутагенез можно использовать для удаления опосредующих NCR элементов из промотора, такого как промотор дрожжей AGP1, ASP3, GAP1, DIP5, GAT1, TOR2, DAL80 или GZF3. Например, GATAA(G) боксы в природных последовательностях промоторов AGP1, ASP3, GAP1, DIP5, GAT1, TOR2, DAL80 или GZF3, как показано на SEQ ID NO:23-28, 35 и 36, соответственно, можно делетировать или модифицировать посредством замены. В одном варианте осуществления, например, один или все из GATAA боксов можно модифицировать посредством замены T вместо G, так что последовательность становится TATAA. Способы сайт-специфического мутагенеза описаны, например, в: Rothstein, 1991; Simon and Moore, 1987; Winzeler et al., 1999; и Negritto et al., 1997. Отобранные или модифицированные промоторы с отсутствием NCR можно затем функционально связывать с кодирующей последовательностью аспарагиназы или транспортера аминокислот, для опосредования экспрессии белка в условиях приготовления и переработки пищевых продуктов. В альтернативных вариантах осуществления гены, кодирующие Gln3p, Gat1p, Ure2p, Tor1/2p, Dal80p или Gzf3p, которые опосредуют NCR в S. cerevisiae, также можно подвергать мутации для модуляции NCR.
Относительный транспорт аспарагина или деградирующую ферментативную активность штамма микроорганизма можно измерять относительно нетрансформированного исходного штамма. Например, можно отбирать трансформированные штаммы по наличию большего транспорта аспарагина или деградирующей активности, чем исходный штамм, в условиях приготовления и переработки пищевых продуктов, или активности, которая составляет несколько больший процент, чем активность исходного штамма в тех же условиях ферментации, например, по меньшей мере 150%, 200%, 250%, 300%, 400% или 500% активности исходного штамма. Подобным образом, активность ферментов, экспрессируемых или кодируемых рекомбинантными нуклеиновыми кислотами по описанию, можно определять относительно нерекомбинантных последовательностей, из которых они получены, с использованием сходных коэффициентов активности.
В одном варианте осуществления способов и применений, описанных в настоящем документе, микроорганизм представляет собой любой активный или неактивный микроорганизм, пригодный для добавления в пищевые продукты, включая, без ограничения, грибы и/или бактерии. Как описано в настоящем документе, грибы, пригодные для настоящих способов и применений, включают в себя, без ограничения, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Neurospora crassa, Neurospora intermedia var. oncomensis, Penicillium camemberti, Penicillium candidum, Penicillium roqueforti, Rhizopus oligosporus, Rhizopus oryzae. В другом варианте осуществления грибы представляют собой дрожжи, такие как Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces carlsbergensis, Candida albicans, Candida kefyr, Candida tropicalis, Cryptococcus laurentii, Cryptotoccous neoformans, Hansenula anomala, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus var lactis, Pichia pastoris, Rhodotorula rubra, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolyitca или любой штамм, принадлежащий к царству грибов. Бактерии могут представлять собой любые бактерии, включая Erwinia sp., Lactobacillus sp., Lactococcus sp., Bacillus sp., Pediococcus sp., Pseudomonas sp., Brevibacterium sp. и Leuconostoc sp.
Пищевые продукты
В другом аспекте настоящее описание относится к пищевому продукту, обладающему сниженной концентрацией акриламида, полученному с использованием трансформированного микроорганизма, описанного в настоящем документе.
В другом варианте осуществления настоящее описание относится к пищевому продукту, обладающему сниженной концентрацией акриламида, полученному с использованием способов, описанных в настоящем документе.
Пищевой продукт может представлять собой любой пищевой продукт, полученный в условиях приготовления или переработки, приводящих к продукции аспарагина и в конечном счете к продукции акриламида. Типичные условия приготовления и переработки, приводящие к продукции акриламида, включают в себя приготовление, включающее в себя высокие температуры кулинарной обработки (более 120°C) и включают в себя, без ограничения, обжаривание во фритюре и выпекание, поджаривание, обжаривание, приготовление на гриле, тушение и жарение на открытом огне. Акриламид, как правило, обнаруживают в высокой концентрации в полученных из картофеля продуктах, хлебобулочных изделиях и в любых продуктах из злаков или зерна (см. также таблицу 1). Соответственно, в одном варианте осуществления пищевой продукт представляет собой полученный из овощей продукт, такой как полученный из картофеля, таро или оливок продукт, хлебобулочное изделие или продукт из злаков или зерна. Продукты из картофеля включают в себя, без ограничения, картофель фри, картофельные чипсы, обжаренные во фритюре/выпеченные закуски из картофеля и формованные продукты из картофеля. Хлебобулочные изделия включают в себя, без ограничения, бисквиты, печенье, крекеры, хлеб, безопарные хлебные продукты, обжаренные в кляре продукты, тортильи из кукурузы и муки, мучные кондитерские изделия, коржи для тортов, смеси для тортов и кексов и тесто для мучных кондитерских изделий. Например, хлеб может включать в себя, без ограничения, свежие и замороженные хлеб и тесто, закваску, тесто для пиццы, сдобные булки и рулеты и различные виды хлеба, так же как родственные хлебопродукты, такие как обжаренные во фритюре или выпеченные закуски или панировочные сухари; и мучные кондитерские изделия могут включать в себя, без ограничения, сладкие сдобные булки, пончики и торты. Продукты из злаков или зерна включают в себя, без ограничения, типичные сухие завтраки, пивной солод и продукты из молочной сыворотки, кукурузные чипсы и соленые крендели. Другие пищевые продукты, которые перерабатывают при высоких температурах включают в себя, без ограничения, кофе, обжаренные орехи, обжаренную спаржу, пиво, солод и напитки из молочной сыворотки, порошок шоколада, продукты из рыбы, продукты из мяса и домашней птицы, луковый суп и смесь для макания, ореховая паста, глазированный арахис, обжаренные соевые бобы, обжаренные семена подсолнечника, обжаренные во фритюре или выпеченные пищевые продукты, такие как фалафель и кеббе и шоколадные батончики.
Настоящее описание в общем описано в приведенном выше описании. Более полное понимание можно получить по отношению к следующим ниже конкретным примерам. Эти примеры описаны единственно с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения объема описания. Предусмотрены изменения формы и замена эквивалентов, как могут диктовать условия или как представляется целесообразным. Хотя в настоящем документе используют конкретные термины, такие термины подразумевают в описательном смысле, а не с целью ограничения.
Следующие неограничивающие примеры иллюстрируют настоящее описание:
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Клонирование и конститутивная экспрессия генов ASP3, ASP1, GAP1, GNP1, AGP1, AGP2, AGP3 и GAT1 в штамме Saccharomyces cerevisiae и делеция URE2, TOR1, DAL80 и GZF3
Для отбора клонов использовали маркер устойчивости к антибиотику kanMX. Штамм промышленных/коммерческих хлебных дрожжей или лабораторный штамм трансформировали для конститутивной экспрессии ASP3, ASP1, GAP1, GNP1, AGP1, AGP2, AGP3 или GAT1, или комбинации ASP3 и GAP1, или комбинации ASP3 и GAT1, или для делеции гена URE2, TOR1, DAL80 или GZF3, или для комбинации tor1Δ и сверхэкспрессии ASP3. Единственными генетическими и метаболическими модификациями являлись намеченная конститутивная экспрессия ASP3, ASP1, GAP1, GNP1, AGP1, AGP2, AGP3 или GAT1, или комбинации ASP3 и GAP1, или комбинации ASP3 и GAT1, или наличие делеции гена URE2 TOR1, DAL80 и GZF3, или комбинация tor1Δ и сверхэкспрессии ASP3.
Пример 2: Трансформация дрожжей генной кассетой ASP3, ASP1, GAP1, GNP1, AGP1, AGP2, AGP3 или GAT1 или делеционной кассетой гена URE2
Дрожжи трансформировали рекомбинантной нуклеиновой кислотой, содержащей ген ASP3, ASP1, GAP1, GNP1, AGP1, AGP2, AGP3 или GAT1 под контролем промотора и сигнала терминации PGK1. Промотор PGK1 не подвержен NCR. Делеционная кассета URE2 содержала 5'- и 3'-фланкирующие последовательности URE2 для направленной делеции гена.
Пример 3: Самоклонирующаяся кассета, позволяющая удаление селективного маркера
Фиг.1-8 иллюстрируют, как разработанные генетические кассеты позволяют отбор трансформированных дрожжей и последующее удаление маркера устойчивости к антибиотику посредством рекомбинации прямых повторов, используемых в этом примере, как описано ниже. Самоклонирующуюся кассету ASP1 конструировали сходным образом, проводили трансформацию и удаление маркера устойчивости к антибиотику, как проиллюстрировано для других примеров.
Пример 4: Исследования снижения количества аспарагина и акриламида с помощью самоклонирующихся дрожжей для определения случаев снижения количества акриламида или лимитирующего предшественника аспарагина
На фиг.11-20 показано значительное снижение количества аспарагина и/или акриламида для дрожжей, трансформированных с помощью ASP3, GAP1, GNP1, AGP1, AGP2, AGP3 или GAT1, или комбинации ASP3 и GAP1, или комбинации ASP3 и GAT1, или обладающих делецией гена URE2, TOR1, DAL80 или GZF3 или комбинацией tor1Δ и сверхэкспрессии ASP3. На фигуре 11 ясно показано также, что сверхэкспрессия цитозольного ASP1 не действует по сравнению со сверхэкспрессией ASP3, кодирующего связанную с клеточной стенкой аспарагиназу.
Некоторые из трансформированных штаммов тестировали в хлебе, например, ASP3, GAP1/ASP3 и ure2∆ (фиг.11, 13 и 14). Как трансформированные штаммы, так и контрольные штаммы коммерческих хлебных дрожжей выращивали одновременно в двух отдельных ферментерах, и клетки собирали на следующие сутки для исследований теста. Аспарагин добавляли в тесто для мониторирования потребления аспарагина с использованием ферментного анализа. После смешивания трансформированных дрожжей с тестом отмечали, что уровни аспарагина немедленно начинали снижаться; в отличие от этого, заметного уменьшения количества аспарагина не измеряли при использовании контрольного штамма. После формирования теста с момента добавления дрожжей периодически отбирали образцы для тестирования концентрации аспарагин. Тесто из некоторых из этих экспериментов (с более высокими уровнями аспарагина) использовали также для получения выпеченного образца для определения концентрации акриламида в конечном хлебном продукте. Результаты для акриламида из этого эксперимента показаны на фиг.12 и 14, и выявлено, что штаммы трансформированных дрожжей снижали количество акриламида значительно больше, чем контрольные образцы дрожжей. Этот результат согласуется со снижением количества аспарагина, обнаруженным при анализе теста.
Трансформированные дрожжи тестировали также в жидкой среде для имитации промышленных условий переработки, где условия внешней среды для дрожжей могут иметь более высокое содержание влажности (т.е. производство картофеля, злаков и кофе). Равные количества клеток каждого штамма инокулировали в отдельные пробирки, содержащие комплексную среду или синтетическую лабораторную среду с точным добавлением различных уровней аспарагина. Образцы отбирали периодически, и концентрацию аспарагина определяли с использованием ферментного набора или посредством LC-MS/MS. На фиг.16-20 показаны штаммы трансформированных дрожжей с улучшенной деградацией аспарагина.
Для снижения количества акриламида в пищевых продуктах, производители сталкиваются с задачей изменения параметров процессов и/или продуктов без ухудшения вкуса, текстуры и внешнего вида их продуктов. В качестве примера изготовлены различные виды хлеба с использованием трансформированных дрожжей и контрольных коммерческих хлебных дрожжей. Для конечных продуктов не показано различий в цвете, размере или текстуре. Важно, что не потребовалось никаких изменений в способе выпечки для достижения этого значительного снижения образования акриламида в хлебе.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СПОСОБЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ВЫШЕУКАЗАННЫХ ПРИМЕРАХ
1. Конструирование pAC1-ASP3, pAC1-AGP1, pAC1-AGP3, pAC1-GNP1 и pAC1-GAT1
Для помещения ASP3, AGP1, GNP1 и GAT1 под контроль конститутивного промотора и сигналов терминации PGK1, каждую из ORF клонировали в pAC1 (фиг.9). Каждую ORF от старта до стоп-кодона амплифицировали с геномной ДНК S. cerevisiae с использованием праймеров, содержащих участки для ферментов рестрикции Mlu1 и Bmt1 на 5'-концах.
После ПЦР, визуализации в 0,8% агарозном геле и очистки продуктов ПЦР (Qiagen, USA - PCR Purification Kit), как продукт ПЦР (вставку), так и pAC1 (вектор) расщепляли Mlu1 и Bmt1 (Fermentas, Canada). После обработки расщепленного вектора щелочной фосфатазой rAPiD (Roche, USA) для предотвращения рециркуляризации, вставку и дефосфорилированный вектор лигировали при комнатной температуре (ДНК-лигаза T4 - Roche, USA); смесь после лигирования (2 мкл) использовали для трансформации компетентных клеток DH5α™ (Invitrogen, USA), которые затем выращивали на чашках с LB (Difco, USA), дополненных 100 мкг/мл ампициллина (Sigma-Aldrich, USA). Плазмиды из случайной выборки трансформированных колоний собирали (Qiagen, USA - QIAprep Spin Miniprep kit) и расщепляли Mlu1 и Bmt1 (Fermentas, Canada) для идентификации плазмид с корректным размером вставки; секвенирование подтвердило, что вставка соответствовала AGP1, AGP3, GNP1 или GAT1.
2. Конструирование pAC2-GAP1, pAC2-AGP1 и pAC2-ASP3
Для помещения GAP1, AGP1 и ASP3 под контроль конститутивных промоторного и терминаторного сигналов PGK1, каждую ORF клонировали в pAC2 (фиг.10). Каждую ORF от старта до стоп-кодона амплифицировали из геномной ДНК S. cerevisiae с использованием праймеров, содержащих участки для ферментов рестрикции Mlu1 и Bmt1, встроенные в 5'-концы.
После ПЦР, визуализации в 0,8% агарозном геле и очистки продуктов ПЦР (Qiagen, USA - PCR Purification Kit), как продукт ПЦР (вставку), так и pAC2 (вектор) расщепляли Mlu1 и Bmt1 (Fermentas, Canada). После обработки расщепленного вектора щелочной фосфатазой rAPiD (Roche, USA) для предотвращения рециркуляризации вставку и дефосфорилированный вектор лигировали при комнатной температуре (ДНК-лигаза T4 - Roche, USA); смесь после лигирования (2 мкл) использовали для трансформации компетентных клеток DH5α™ (Invitrogen, USA), которые затем выращивали на чашках с LB (Difco, USA), дополненных 100 мкг/мл ампициллина. Плазмиды из случайной выборки трансформированных колоний собирали (Qiagen, USA - QIAprep Spin Miniprep kit) и расщепляли Mlu1 и Bmt1 (Fermentas, Canada) для идентификации плазмид с корректным размером вставки; секвенирование подтвердило, что вставка соответствовала GAP1, AGP1 или ASP3.
3. Конструирование кассеты ure2∆
Кассету ure2∆ полностью получали синтезом ДНК (MrGene, Germany).
4. Трансформация линейными кассетами S. cerevisiae и отбор трансформантов
Каждую кассету вырезали из соответствующей плазмиды с использованием Swa1 (Fermentas, Canada) и визуализовали в 0,8% агарозном геле. Полосу ожидаемого размера из геля вырезали и экстрагировали (Qiagen, USA - Gel extraction kit). После экстракции, очистки и количественного определения 500 нг линейной кассеты использовали для трансформации штаммов S. cerevisiae. Штаммы дрожжей трансформировали с использованием способа с ацетатом лития/полиэтиленгликолем/оцДНК. После трансформации клетки оставляли для восстановления в YEG при 30°C на 3 часа перед рассевом на чашки с YPD, дополненной 500 мкг/мл G418 (Sigma, USA). Чашки инкубировали при 30°C до появления колоний.
5. Трансформация линейной кассетой ure2∆ S. cerevisiae и отбор трансформантов
Кассету ure2∆ размером 3149 п.о. вырезали из pMrG-ure2∆ с использованием Pme1 (Fermentas, Canada) и визуализовали в 0,8% агарозном геле. Полосу ожидаемого размера 3149 п.о. вырезали и экстрагировали (Qiagen, USA - Gel extraction kit). После экстракции, очистки и количественного определения, 500 нг линейной кассеты использовали для трансформации штаммов PDM S. cerevisiae. Штаммы дрожжей трансформировали с использованием способа с ацетатом лития/полиэтиленгликолем/оцДНК. После трансформации клетки оставляли для восстановления в YEG при 30°C на 3 часа перед рассевом на чашки с YPD, дополненной 500 мкг/мл G418 (Sigma, USA). Чашки инкубировали при 30°C до появления колоний.
Штаммы лабораторных дрожжей, являющихся делеционными мутантами для tor1∆, dal80∆, gzf3∆ и ure2∆, также получали из коммерческого источника для комплектации некоторых тестов.
6. Исследования снижения концентрации аспарагина и акриламида
Тесто для хлеба из цельнозерновой пшеничной муки получали со следующими ингредиентами: мука из цельной пшеницы, нативная пшеничная клейковина, соль, растительное масло, меласса, вода и дрожжи (либо тестируемый штамм, либо контроль). Способ близко следовал процессу из способа «безопарного теста». Во временной точке 5 час образцы также нагревали для получения данных по акриламиду (подробности приведены ниже).
1. Охладить сосуд Дьюара для жидкого азота в морозильнике при -30°C и наполнить жидким N2.
2. В 250-мл бутыли для среды растворить L-аспарагин в 50-мл фильтрованной воды.
3. Определить содержание влаги/твердых веществ в дрожжах (влажных или сухих), подлежащих добавлению по рецептуре теста.
4. Отмерить вычисленное количество дрожжей в 200-мл коническую пробирку Falcon.
5. Определить необходимое количество очищенной с помощью обратного осмоса воды с учетом содержания влаги, поступающей с дрожжами, подлежащими добавлению. Отмерить необходимое количество очищенной с помощью обратного осмоса воды по массе на чашечных весах.
6. Ресуспендировать соответствующее количество дрожжей с помощью 2/3 оставшейся очищенной с помощью обратного осмоса воды (30°C). Использовать оставшуюся 1/3 для промывки.
7. Определить массу чаши для смешивания.
8. Отвесить сухие ингредиенты (муку, глютен и соль) в чашу для смешивания Kitchen Aid. Перемешать сухие ингредиенты с помощью лопатки в течение 20-30 с. Заменить лопатку на крюк.
9. Добавить отмеренное растительное масло и мелассу, и раствор L-аспарагина в чашу для смешивания. Перемешивать на скорости 2 до достижения равномерной консистенции теста.
10. Установить таймер на 10 минут.
11. Добавить суспензию дрожжей к перемешиваемому тесту. Немедленно запустить таймер и перемешивать на скорости 2.
Время добавления дрожжей:
12. Промыть пробирку Falcon с помощью оставшейся воды и добавить смыв в чашу для смешивания.
13. Продолжать перемешивание до сигнала таймера через 10 минут.
14. Определить конечную массу чаши для смешивания + тесто:
15. Немедленно раскатать тесто до толщины ~1,0 см и использовать круглый штамп для печенья для вырезания соответствующего количества образцов теста для эксперимента.
Быстро отобрать 1 образец теста и разломить, и затем налить жидкий азот в ступку для замораживания кусков теста. Это представляет собой образец «T=15 мин».
Сохранять замороженные куски теста в маркированной 50-мл пробирке Falcon при -80°C для дальнейшего анализа.
16. Поместить оставшиеся образцы теста на бумагу для выпечки и инкубировать при 30°C.
17. Отбирать образец теста в желательной для эксперимента временной точке и разламывать на мелкие куски, и замораживать с помощью жидкого азота.
Сохранять замороженные куски в маркированной 50-мл пробирке Falcon при -80°C.
18. Для некоторых экспериментов при T=5 часов вырезать дополнительное печенье и выпекать при 400°F (204°C) в течение 20 мин, и сохранять при -80°C.
Препараты жидкой среды получали общепринятым способом и точно добавляли различные количества аспарагина. Равные количества клеток каждого штамма инокулировали в отдельные пробирки, содержащие стерильную подготовленную среду и периодически отбирали образы, концентрацию аспарагина определяли с использованием ферментного набора (Megazyme, K-ASNAM) или посредством LC-MS/MS (описана ниже).
7. Количественное определение аспарагина и акриламида
Ранее полученные образцы теста обрабатывали жидким азотом во время получения, чтобы прекратить активность аспарагиназы. Затем образцы размалывали и хранили при -80 градусов Цельсия до анализа. Анализ количества аспарагина в образцах теста проводили посредством ферментного анализа (K-ASNAM - Megazyme), следуя способу экстракции производителя для хлебобулочных изделий со следующими изменениями: Гомогенизированные образцы теста (2 г) быстро взвешивали и переносили в 100 мл мерные колбы. Приблизительно 90 мл MilliQ H2O при 80 градусов Цельсия добавляли для предотвращения любого повторного появления ферментативной активности, и образцы инкубировали в водяной бане при 80 градусах Цельсия в течение 20 минут. Затем образцы оставляли охлаждаться до комнатной температуры, доводили до метки и аликвоту осаждали центрифугированием (RT, 4000×g, 15 мин.) для анализа.
Акриламид в полученных в лаборатории выпеченных образцах анализировали способом ELISA. Образцы хлеба измельчали в мельнице, что тоже обеспечивало гомогенность. Образцы хранили при -80 градусов Цельсия до анализа. 2 г гомогенатов образцов взвешивали и экстрагировали водой в течение 30 минут. Затем образцы фильтровали и центрифугировали перед очисткой твердофазной экстракцией и элюцией акриламида. Затем экстрагированный аналит анализировали посредством анализа ELISA (Abraxis).
Для анализа аспарагина посредством LC-MS/MS образцы культуры клеток, полученные в жидкой среде, анализировали с использованием следующих параметров. Колонка 2×250 мм Aquasil (Thermo) и бинарная подвижная фаза, состоящая из 12% MeOH и 1 мМ формиата аммония, мониторирование ионных переходов аспарагина 133,0→74,0 и 133,0→87,0 (MRM). Внутренний стандарт из меченного изотопом 13C - акриламида (Cambridge Isotope Laboratories) использовали в концентрации 0,01 г/л, добавленным непосредственно в осветленные супернатанты культуры клеток.
В то время как настоящее описание описано в отношении того, что в настоящее время рассматривают как предпочтительные примеры, следует понимать, что описание не является ограниченным описанными примерами. Напротив, описание предназначено, чтобы охватывать различные модификации и эквивалентные схемы, включенные в содержание и объем прилагаемой формулы изобретения.
Полное содержание всех публикаций, патентов и патентных заявок приведено в настоящем документе в качестве ссылки в такой степени, как если бы конкретно и отдельно было указано, что полное содержание каждой отдельной публикации, патента или патентной заявки приведено в качестве ссылки.
| Таблица 1 | |
| Обобщение данных FDA по концентрациям акриламида в пищевых продуктах (U.S. FDA 2004a, 2004b) | |
| Пищевой продукт | Концентрация акриламида (част. на млрд) Средневзвешенная величина |
| Пищевые продукты на основе зерна | |
| Неподжаренные бублики | 31,00 |
| Поджаренные бублики | 55,36 |
| Бисквиты | 36,75 |
| Виды хлеба из цельного зерна и пшеницы | 38,70 |
| Все виды дрожжевого хлеба | 30,80 |
| Виды пшеничного хлеба | 10,82 |
| Тост | 213,00 |
| Шоколадные пирожные | 16,6 |
| Торт | 9,83 |
| Хлопья из злаков, готовые к употреблению | 86,11 |
| Овсяные хлопья в виде колец | 174,07 |
| Кукурузные хлопья | 60,04 |
| Хлопья из обжаренной пшеницы | 737,67 |
| Печенье | 188,16 |
| Гранола и энергетические батончики | 55,93 |
| Кукурузные чипсы и чипсы из тортильи | 198,88 |
| Крекеры (включая детское питание) | 166,50 |
| Пончики | 18,47 |
| Блины | 15,25 |
| Пай | 21,81 |
| Попкорн | 180,40 |
| Кукурузный хлеб | 8,13 |
| Поджаренный английский кекс | 31,25 |
| Тортильи | 6,44 |
| Закуски на основе пшеницы | 163,31 |
| Пищевые продукты на основе овощей | |
| Все виды картофеля-фри | 413,46 |
| Приготовленный в ресторане картофель-фри | 350,46 |
| Картофель-фри домашней выпечки | 648,27 |
| Картофельные чипсы | 466,09 |
| Другие закуски из картофеля и батата | 1337,50 |
| Маслины, консервированные | 413,63 |
| Бататы, консервированные | 93,25 |
| Бобовые, орехи и масла | |
| Обжаренный миндаль | 320,25 |
| Арахисовое масло | 88,06 |
| Обжаренный арахис | 27,13 |
| Тушеная фасоль | 76,50 |
| Семена подсолнечника | 39,50 |
| Напитки | |
| Кофе обычной обжарки (молотый) | 222,50 |
| Кофе темной обжарки (молотый) | 189,92 |
| Сухой быстрорастворимый кофе | 360,33 |
| Кофе, сваренный | 7,35 |
| Заменители кофе на основе зерна (сухие) | 4573 |
| Сливовый сок | 159,00 |
| Мясо, домашняя птица и рыба | |
| Куриные наггетсы/палочки | 24,00 |
| Рыба, жаренная в хлебной панировке | 8,53 |
| Молочные продукты | Уровни являлись низкими |
| Соусы и заправки | Очень различные; в основном низкие |
| Конфеты, сладости, сахарные сиропы, какао | Очень различные; в основном низкие |
| Смеси | |
| Чили кон карне | 130,25 |
| Пицца | 19,50 |
| Тако/Тостада | 26,75 |
| Подвергнутое тепловой обработке детское питание, содержащее сливы | 35,50 |
| Персиковый коблер - детское питание | 40,25 |
| Детское питание с морковью | 54,14 |
| Детское питание со стручковой фасолью | 23,23 |
| Детское питание - кабачковая икра | 19,29 |
| Детское питание - бататы | 77,44 |
Список литературы
Amrein, T.M., Schonbachler, B., Escher, F., Amado, R., 2004. Acrylamide in gingerbread: critical factors for formation and possible ways for reduction. Journal of Agricultural and Food Chemistry 52, 4282-4288.
Becalski, A., Lau, B.P.Y., Lewis, D., Seaman, S.W., 2003. Acrylamide in foods: occurrence, sources and modeling. Journal of Agricultural and Food Chemistry 51, 802-808.
Brathen, E., Kita, A., Knutsen, S.H., Wicklund, T., 2005. Addition of glycine reduces the content of acrylamide in cereal and potato products. Journal of Agricultural and Food Chemistry 53, 3259-3264.
Claus, A., Schreiter, P., Weber, A., Graeff, S., Hermann, W., Claupein, W., Schieber, A., Carle, R., 2006. Influence of agronomic factors and extraction rate on the acrylamide contents in yeast-leavened breads. Journal of Agricultural and Food Chemistry 54, 8968-8976.
Claus, A., Mongili, M., Weisz, G., Schieber, A., Carle, R., 2007. Impact of formulation and technological factors on the acrylamide content of wheat bread and bread rolls. Journal of Cereal Science 47, 546-554.
Cooper, T.G., 1982. In The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression, eds Strathern J.N., Jones E.W., Borach J. (Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), pp 39-99.
Fink, M., Andersson, R., Rosen, J., Aman, P., 2006. Effect of added asparagine and glycine on acrylamide content in yeast-leavened bread. Cereal Chemistry 83, 218-222.
Fredriksson, H., Tallving, J., Rosen, J., Aman, P., 2004. Fermentation reduces free asparagine in dough and acrylamide content in bread. Cereal Chemistry 81, 650-653.
Gietz, R.D., Schiestl, R.H., 1995. Transforming Yeast with DNA. Methods in Molecular and Cellular Biology. Vol 5, #5, 255-269.
Gokmen, V., Senyuva, H.Z., 2007. Acrylamide formation is prevented by divalent cations during the Maillard reaction. Food Chemistry 103, 196-203.
International Agency on Research on Cancer, 1994. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. Some Industrial Chemicals, vol. 60. Acrylamid, Lyon, France, IARC 1994, pp. 389-433.
Mustafa, A., Andersson, R., Rosen, J., Kamal-Eldin, A., Aman, P., 2005. Factors influencing acylamide content and color in rye crisp bread. Journal of Agricultural and Food Chemistry 53, 5985-5989.
Negritto, M.T., Wu, X., Kuo, T., Chu, S., Bailis, A.M., 1997. Influence of DNA sequence identity on efficiency of targeted gene replacement. Mol Cell Biol 17, 278-286.
Rice, J.M., 2005. The carcinogenicity of acrylamide. Mutation Research 580, 3-20.
Rothstein, R., 1991. Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast. Methods Enzymol. 194, 281-301.
Simon, J.R., Moore, P.D., 1987. Homologous recombination between single-stranded DNA and chromosolmal genes in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biochem 7, 2329-2334.
Surdyk, N., Rosen, J., Andersson, R., Aman, P., 2004. Effects of asparagine, fructose and baking conditions on acrylamide content in yeast-leavened wheat bread. Journal of Agricultural and Food Chemistry 52, 2047-2051.
Wilson, K.M., Rimm, E.B., Thompson, K.M., Mucci, L.A., 2006. Dietary acrylamide and cancer risk in humans: a review. Journal fur Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit 1, 19-27. Cited in Claus, A., Carle, R., Schieber, A., 2008. Acrylamide in cereal products: a review. Journal of Cereal Science 47, 118-133.
Winzeler EA, Shoemaker DD, Astromoff A, Liang H, Anderson K, Andre B, Bangham R, Benito R, Boeke JD, Bussey H, Chu AM, Connelly C, Davis K, Dietrich F, Dow SW, El Bakkoury M.Foury F, Friend SH, Gentalen E, Giaever G, Hegemann JH, Jones T, Laub M, Liao H, Liebundguth N, Lockhart DJ, Lucau-Danila A, Lussier M, M'Rabet N, Menard P, Mittmann M,Pai C, Rebischung C, Revuelta JL, Riles L, Roberts CJ, Ross-MacDonald P, Scherens B, Snyder M, Sookhai-Mahadeo S, Storms RK, Veronneau S, Voet M, Volckaert G, Ward TR.Wysocki R, Yen GS, Yu K, Zimmermann K, Philippsen P, Johnston M, Davis RW., 1999. Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science 285, 901-906.
Yaylayan, V.A., Wnorowski, A., Locas Perez, C, 2003. Why asparagine needs carbohydrates to generate acrylamide. Journal of Agricultural and Food Chemistry 51, 1753-1757.
Wickner, R.B., 1994. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science 264(5158), 566-9.
Wickner, R.B., Masison, D.C., Edskes, H.K., 1995. [PSI] and [URE3] as yeast prions. Yeast 11(16), 1671-85.
Claims (33)
1. Дрожжи для снижения акриламида или аспарагина в пищевом продукте, где упомянутые дрожжи имеют по меньшей мере две из следующих модификаций:
a) делецию или инактивацию гена, кодирующего отрицательный регуляторный фактор, регулируемого азотной катаболитной репрессией, или молекулу нуклеиновой кислоты, которая сверхэкспрессирует положительный регуляторный фактор генов, регулируемых азотной катаболитной репрессией, для снижения азотной катаболитной репрессии;
b) молекулу нуклеиновой кислоты для сверхэкспрессии гена, кодирующего аспарагиназу клеточной стенки, которая расщепляет аспарагин; и
c) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей транспортер аминокислот, который транспортирует аспарагин в условиях приготовления/переработки пищевых продуктов.
a) делецию или инактивацию гена, кодирующего отрицательный регуляторный фактор, регулируемого азотной катаболитной репрессией, или молекулу нуклеиновой кислоты, которая сверхэкспрессирует положительный регуляторный фактор генов, регулируемых азотной катаболитной репрессией, для снижения азотной катаболитной репрессии;
b) молекулу нуклеиновой кислоты для сверхэкспрессии гена, кодирующего аспарагиназу клеточной стенки, которая расщепляет аспарагин; и
c) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей транспортер аминокислот, который транспортирует аспарагин в условиях приготовления/переработки пищевых продуктов.
2. Дрожжи по п.1, где аспарагиназу кодирует ASP3.
3. Дрожжи по п.1, где аспарагиназа представляет собой Asp3p.
4. Дрожжи по п.1, где транспортер аминокислот кодируют GAP1, AGP1, GNP1, DIP5, AGP2 или AGP3.
5. Дрожжи по п.1, где транспортер аминокислот представляет собой Gap1p, Agp1p, Gnp1p, Dip5p, Agp2p или Agp3p.
6. Дрожжи по п.1, где положительный регуляторный фактор кодируют GAT1 или GLN3 или где отрицательный регуляторный фактор кодируют URE2, TOR1, TOR2, DAL80, или GZF3.
7. Дрожжи по п.1, где положительный регуляторный фактор представляет собой Gat1p или Gln3p, или где отрицательный регуляторный фактор представляет собой Ure2p, Tor1p, Tor2p, Dal80p, или Gzf3p.
8. Дрожжи по п.1, где по меньшей мере одна молекула нуклеиновой кислоты подпункта (а) содержит делеционную кассету URE2.
9. Дрожжи по п.1, где по меньшей мере одна молекула нуклеиновой кислоты подпункта (а) кодирует [URE3].
10. Дрожжи по любому из пп.1-9, где дрожжи являются неактивными.
11. Дрожжи по пп.1-10, где дрожжи представляют собой S. cerevisiae.
12. Дрожжи по любому из пп.1-11, трансформированные для непрерывной деградации и/или поглощения молекул аспарагина в условиях приготовления/переработки пищевых продуктов.
13. Дрожжи по любому из пп.1-11, где по меньшей мере одна молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с конститутивно активным промотором.
14. Дрожжи по любому из пп.1-11, где по меньшей мере одна молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с промотором, который не подвержен азотной катаболитной репрессии.
15. Дрожжи по п.1, трансформированные первой и второй молекулой нуклеиновой кислоты, где первая молекула нуклеиновой кислоты кодирует Asp3p и вторая молекула нуклеиновой кислоты кодирует Gap1p или Gat1p.
16. Способ снижения количества аспарагина во время приготовления или переработки пищевого продукта, включающий в себя добавление дрожжей по любому из пп. 1-15 в пищевой продукт в условиях приготовления или переработки пищевого продукта; где дрожжи снижают азотную катаболитную репрессию и/или сверхэкспрессируют ген, кодирующий аспарагиназу клеточной стенки, которая расщепляет аспарагин, и/или ген, кодирующий транспортер аминокислот, который транспортирует аспарагин во время приготовления или переработки пищевого продукта, таким образом снижая количество аспарагина во время приготовления или переработки пищевого продукта.
17. Способ снижения количества акриламида в пищевом продукте, включающий в себя добавление дрожжей по любому из пп. 1-15 в пищевой продукт в условиях приготовления или переработки пищевого продукта; где дрожжи снижают азотную катаболитную репрессию и/или сверхэкспрессируют ген, кодирующий аспарагиназу клеточной стенки, которая расщепляет аспарагин, и/или ген, кодирующий транспортер аминокислот, который транспортирует аспарагин во время приготовления или переработки пищевого продукта, таким образом, снижая количество акриламида в пищевом продукте.
18. Способ снижения количества аспарагина во время приготовления или переработки пищевого продукта, включающий в себя
а) введение в дрожжи по меньшей мере двух из следующих модификаций:
i) делеции или инактивации гена, кодирующего отрицательный регуляторный фактор, регулируемого азотной катаболитной репрессией, или молекулы нуклеиновой кислоты, которая сверхэкспрессирует положительный регуляторный фактор генов, регулируемых азотной катаболитной репрессией, для снижения азотной катаболитной репрессии;
ii) молекулы нуклеиновой кислоты для сверхэкспрессии гена, кодирующего аспарагиназу клеточной стенки, которая расщепляет аспарагин; и
iii) молекулы нуклеиновой кислоты кодирующей транспортер аминокислот, который транспортирует аспарагин;
b) добавление дрожжей в пищевой продукт в условиях приготовления или переработки пищевого продукта;
где дрожжи снижают азотную катаболитную репрессию и/или сверхэкспрессируют ген, кодирующий аспарагиназу клеточной стенки, которая расщепляет аспарагин, и/или ген, кодирующий транспортер аминокислот, который транспортирует аспарагин, таким образом, снижая количество аспарагина во время приготовления или переработки пищевого продукта.
а) введение в дрожжи по меньшей мере двух из следующих модификаций:
i) делеции или инактивации гена, кодирующего отрицательный регуляторный фактор, регулируемого азотной катаболитной репрессией, или молекулы нуклеиновой кислоты, которая сверхэкспрессирует положительный регуляторный фактор генов, регулируемых азотной катаболитной репрессией, для снижения азотной катаболитной репрессии;
ii) молекулы нуклеиновой кислоты для сверхэкспрессии гена, кодирующего аспарагиназу клеточной стенки, которая расщепляет аспарагин; и
iii) молекулы нуклеиновой кислоты кодирующей транспортер аминокислот, который транспортирует аспарагин;
b) добавление дрожжей в пищевой продукт в условиях приготовления или переработки пищевого продукта;
где дрожжи снижают азотную катаболитную репрессию и/или сверхэкспрессируют ген, кодирующий аспарагиназу клеточной стенки, которая расщепляет аспарагин, и/или ген, кодирующий транспортер аминокислот, который транспортирует аспарагин, таким образом, снижая количество аспарагина во время приготовления или переработки пищевого продукта.
19. Способ снижения количества акриламида в пищевом продукте, включающий в себя
а) введение в дрожжи по меньшей мере двух из следующих модификаций:
i) делеции или инактивации гена, кодирующего отрицательный регуляторный фактор, регулируемого азотной катаболитной репрессией, или молекулы нуклеиновой кислоты, которая сверхэкспрессирует положительный регуляторный фактор генов, регулируемых азотной катаболитной репрессией, для снижения азотной катаболитной репрессии;
ii) молекулы нуклеиновой кислоты для сверхэкспрессии гена, кодирующего аспарагиназу клеточной стенки, которая расщепляет аспарагин; и
iii) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей транспортер аминокислот, который транспортирует аспарагин;
b) добавление дрожжей в пищевой продукт в условиях приготовления или переработки;
где дрожжи снижают азотную катаболитную репрессию и/или сверхэкспрессируют ген, кодирующий аспарагиназу клеточной стенки, которая расщепляет аспарагин, и/или ген, кодирующий транспортер аминокислот, который транспортирует аспарагин, таким образом снижая количество акриламида в пищевом продукте.
а) введение в дрожжи по меньшей мере двух из следующих модификаций:
i) делеции или инактивации гена, кодирующего отрицательный регуляторный фактор, регулируемого азотной катаболитной репрессией, или молекулы нуклеиновой кислоты, которая сверхэкспрессирует положительный регуляторный фактор генов, регулируемых азотной катаболитной репрессией, для снижения азотной катаболитной репрессии;
ii) молекулы нуклеиновой кислоты для сверхэкспрессии гена, кодирующего аспарагиназу клеточной стенки, которая расщепляет аспарагин; и
iii) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей транспортер аминокислот, который транспортирует аспарагин;
b) добавление дрожжей в пищевой продукт в условиях приготовления или переработки;
где дрожжи снижают азотную катаболитную репрессию и/или сверхэкспрессируют ген, кодирующий аспарагиназу клеточной стенки, которая расщепляет аспарагин, и/или ген, кодирующий транспортер аминокислот, который транспортирует аспарагин, таким образом снижая количество акриламида в пищевом продукте.
20. Способ по п.18 или 19, где аспарагиназу кодирует ASP3.
21. Способ по п.18 или 19, где аспарагиназа представляет собой Asp3p.
22. Способ по п.18 или 19, где транспортер аминокислот кодируют GAP1, AGP1, GNP1, DIP5, AGP2 или AGP3.
23. Способ по п.18 или 19, где транспортер аминокислот представляет собой Gap1p, Agp1p, Gnp1p, Dip5p, Agp2p или Agp3p.
24. Способ по п.18 или 19, где положительный регуляторный фактор кодируют GAT1 или GLN3 или где отрицательный регуляторный фактор кодируют URE2, TOR1, TOR2, DAL80, или GZF3.
25. Способ по п.18 или 19, где положительный регуляторный фактор представляет собой Gat1p или Gln3p, или где отрицательный регуляторный фактор представляет собой Ure2p, Tor1p, Tor2p, Dal80p, или Gzf3p.
26. Способ по п.18 или 19, где нуклеиновая кислота, которая модифицирует активность регуляторного фактора азотной катаболитной репрессии, содержит делеционную кассету URE2.
27. Способ по п.18 или 19, где дрожжи являются неактивными.
28. Способ по любому из пп.18-27, где дрожжи представляют собой S. cerevisiae.
29. Способ по любому из пп.16-19, где молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с конститутивно активным промотором.
30. Способ по любому из пп.16-19, где молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с промотором, который не подвержен азотной катаболитной репрессии.
31. Способ по любому из пп.16-19, где пищевой продукт представляет собой пищевой продукт на основе овощей, напиток, хлебобулочное изделие, продукт из зерна, фрукты, бобовые, молочный или мясной продукт.
32. Пищевой продукт, обладающий сниженной концентрацией акриламида, полученный добавлением трансформированных дрожжей по любому из пп. 1-15 в пищевой продукт в условиях приготовления или переработки.
33. Пищевой продукт, обладающий сниженной концентрацией акриламида, полученный с использованием способа по любому из пп. 16-31.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US30962310P | 2010-03-02 | 2010-03-02 | |
| US61/309,623 | 2010-03-02 | ||
| US31663410P | 2010-03-23 | 2010-03-23 | |
| US61/316,634 | 2010-03-23 | ||
| PCT/CA2011/000222 WO2011106874A1 (en) | 2010-03-02 | 2011-03-01 | Functional enhancement of microorganisms to minimize production of acrylamide |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012141896A RU2012141896A (ru) | 2014-04-10 |
| RU2603061C2 true RU2603061C2 (ru) | 2016-11-20 |
Family
ID=44541573
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012141896/10A RU2603061C2 (ru) | 2010-03-02 | 2011-03-01 | Функциональное улучшение микроорганизмов для минимизации продукции акриламида |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9353173B2 (ru) |
| EP (1) | EP2542665B1 (ru) |
| JP (1) | JP6013195B2 (ru) |
| CN (1) | CN102869765B (ru) |
| AR (1) | AR080372A1 (ru) |
| AU (1) | AU2011223445B2 (ru) |
| BR (1) | BR112012022054A2 (ru) |
| CA (1) | CA2791091C (ru) |
| MX (1) | MX338016B (ru) |
| RU (1) | RU2603061C2 (ru) |
| WO (1) | WO2011106874A1 (ru) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9427008B2 (en) | 2012-09-06 | 2016-08-30 | Mycotechnology, Inc. | Method of myceliation of agricultural substates for producing functional foods and nutraceuticals |
| US9068171B2 (en) | 2012-09-06 | 2015-06-30 | Mycotechnology, Inc. | Method for myceliating coffee |
| CN103750216A (zh) * | 2013-12-31 | 2014-04-30 | 江南大学 | 一种低丙烯酰胺含量油炸薯片的制备方法 |
| US10231469B2 (en) | 2014-03-15 | 2019-03-19 | Mycotechnology, Inc. | Myceliated products and methods for making myceliated products from cacao and other agricultural substrates |
| US9572364B2 (en) | 2014-08-26 | 2017-02-21 | Mycotechnology, Inc. | Methods for the production and use of mycelial liquid tissue culture |
| US10709157B2 (en) | 2014-08-26 | 2020-07-14 | Mycotechnology, Inc. | Methods for the production and use of mycelial liquid tissue culture |
| KR102034835B1 (ko) | 2014-08-26 | 2019-10-21 | 마이코테크놀로지, 인코포레이티드 | 균사체 액체 조직 배양물의 생산방법 및 용도 |
| CN105647958B (zh) * | 2014-12-08 | 2020-05-05 | 中国科学院微生物研究所 | 一种产2-苯乙醇的酿酒酵母工程菌及其制备方法与应用 |
| WO2016138476A1 (en) | 2015-02-26 | 2016-09-01 | Mycotechnology, Inc. | Methods for lowering gluten content using fungal cultures |
| CA2991325A1 (en) * | 2015-07-07 | 2017-01-12 | Renaissance Bioscience Corp. | Development of an asparagine-reducing yeast by adaptive evolution and uses thereof to reduce acrylamide formation |
| PL3377518T3 (pl) * | 2015-11-16 | 2022-09-26 | Synlogic Operating Company, Inc. | Bakterie modyfikowane do celów zmniejszenia hiperfenyloalaninemii |
| CN105274132A (zh) * | 2015-11-20 | 2016-01-27 | 江南大学 | 一种改造调控因子降低酵母尿素积累的方法 |
| CN105296525A (zh) * | 2015-11-20 | 2016-02-03 | 江南大学 | 一种提高酿酒酵母非偏好型氮源利用的方法 |
| US10806101B2 (en) | 2016-04-14 | 2020-10-20 | Mycotechnology, Inc. | Methods for the production and use of myceliated high protein food compositions |
| US11166477B2 (en) | 2016-04-14 | 2021-11-09 | Mycotechnology, Inc. | Myceliated vegetable protein and food compositions comprising same |
| CN109068710B (zh) | 2016-04-14 | 2022-11-18 | 麦可科技有限公司 | 一种用于生产和使用菌丝体化的高蛋白质食物组合物的方法 |
| US11879123B2 (en) | 2017-06-21 | 2024-01-23 | Synlogic Operating Company, Inc. | Bacteria for the treatment of disorders |
| EP4501127A3 (en) | 2018-09-20 | 2025-05-14 | The Better Meat Company | Enhanced aerobic fermentation methods for producing edible fungal mycelium blended meats and meat analogue compositions |
| US12274283B2 (en) | 2018-09-20 | 2025-04-15 | The Better Meat Co. | Enhanced aerobic fermentation methods for producing edible fungal mycelium blended meats and meat analogue compositions |
| CN109504699B (zh) * | 2018-11-29 | 2021-01-29 | 江南大学 | 一种降低黄酒酵母尿素积累的方法及应用 |
| CN110343652B (zh) * | 2019-07-24 | 2021-06-25 | 天津科技大学 | 一种低产高级醇啤酒酵母菌株及其构建方法 |
| US11425922B2 (en) | 2019-11-18 | 2022-08-30 | Intercontinental Great Brands Llc | Methods and systems for reducing acrylamide concentration in heat-processed products |
| IL295353A (en) | 2020-03-20 | 2022-10-01 | Synlogic Operating Co Inc | Genetically engineered microorganisms to reduce hyperphenylalaninemia |
| US12053009B2 (en) | 2021-01-08 | 2024-08-06 | Intercontinental Great Brands Llc | Method of reducing asparagine in whole grain flours |
| CN113717874B (zh) * | 2021-09-27 | 2023-04-11 | 四川大学 | 一种耐高温、耐高糖的酿酒酵母菌株及其构建方法和应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004032648A1 (en) * | 2002-10-11 | 2004-04-22 | Novozymes A/S | Method of preparing a heat-treated product |
| RU2335998C2 (ru) * | 2003-02-21 | 2008-10-20 | Фрито-Лей Норс Америка, Инк. | Способ уменьшения образования акриламида в термически обработанных пищевых продуктах |
| US7666652B2 (en) * | 2007-03-09 | 2010-02-23 | Novozymes A/S | Asparaginases |
| EP2156750A1 (en) * | 2002-12-19 | 2010-02-24 | DSM IP Assets B.V. | Novel food production process |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8414940B2 (en) | 2002-11-06 | 2013-04-09 | Urth Tech, LLC | Reduction of acrylamide formation in cooked starchy foods |
| US20050214411A1 (en) | 2004-03-29 | 2005-09-29 | Lindsay Robert C | Methods for suppressing acrylamide formation and restoring browned color and flavor |
| EP1896576A1 (en) | 2005-05-31 | 2008-03-12 | DSMIP Assets B.V. | Novel process for enzymatic acrylamide reduction in food products |
| DK1971219T4 (da) * | 2005-12-28 | 2020-08-10 | Dsm Ip Assets Bv | Reaktionsaromaer med lavt acrylamidindhold |
| EP3357345B1 (en) | 2005-12-28 | 2020-02-12 | DSM IP Assets B.V. | Process flavours with low acrylamide |
| US20100080868A1 (en) | 2008-09-26 | 2010-04-01 | Frito-Lay North America, Inc. | Mash Process Offering Better Control |
| US9215886B2 (en) | 2008-12-05 | 2015-12-22 | Frito-Lay North America, Inc. | Method for making a low-acrylamide content snack with desired organoleptical properties |
| CN101473865B (zh) * | 2009-01-20 | 2011-04-06 | 黄卫宁 | 一种冷冻发酵油条及其生产方法 |
| WO2014037837A1 (en) | 2012-09-05 | 2014-03-13 | Gokmen Vural | Instant coffee or coffee substitute with reduced acrylamide and hydroxymethyl furfural content and production method thereof |
-
2011
- 2011-03-01 WO PCT/CA2011/000222 patent/WO2011106874A1/en active Application Filing
- 2011-03-01 CA CA2791091A patent/CA2791091C/en active Active
- 2011-03-01 BR BR112012022054A patent/BR112012022054A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2011-03-01 US US13/581,087 patent/US9353173B2/en active Active
- 2011-03-01 EP EP11750113.0A patent/EP2542665B1/en not_active Not-in-force
- 2011-03-01 AU AU2011223445A patent/AU2011223445B2/en not_active Ceased
- 2011-03-01 JP JP2012555263A patent/JP6013195B2/ja active Active
- 2011-03-01 MX MX2012010124A patent/MX338016B/es active IP Right Grant
- 2011-03-01 RU RU2012141896/10A patent/RU2603061C2/ru active
- 2011-03-01 CN CN201180022157.9A patent/CN102869765B/zh active Active
- 2011-03-02 AR ARP110100656A patent/AR080372A1/es not_active Application Discontinuation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004032648A1 (en) * | 2002-10-11 | 2004-04-22 | Novozymes A/S | Method of preparing a heat-treated product |
| EP2156750A1 (en) * | 2002-12-19 | 2010-02-24 | DSM IP Assets B.V. | Novel food production process |
| RU2335998C2 (ru) * | 2003-02-21 | 2008-10-20 | Фрито-Лей Норс Америка, Инк. | Способ уменьшения образования акриламида в термически обработанных пищевых продуктах |
| US7666652B2 (en) * | 2007-03-09 | 2010-02-23 | Novozymes A/S | Asparaginases |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR112012022054A2 (pt) | 2015-09-15 |
| AU2011223445A1 (en) | 2012-10-25 |
| CA2791091A1 (en) | 2011-09-09 |
| US20120321744A1 (en) | 2012-12-20 |
| EP2542665A4 (en) | 2014-01-08 |
| CN102869765A (zh) | 2013-01-09 |
| AU2011223445B2 (en) | 2015-07-16 |
| EP2542665B1 (en) | 2019-01-09 |
| US9353173B2 (en) | 2016-05-31 |
| JP2013520964A (ja) | 2013-06-10 |
| JP6013195B2 (ja) | 2016-10-25 |
| EP2542665A1 (en) | 2013-01-09 |
| RU2012141896A (ru) | 2014-04-10 |
| CA2791091C (en) | 2019-11-12 |
| MX2012010124A (es) | 2013-05-01 |
| CN102869765B (zh) | 2016-08-03 |
| WO2011106874A1 (en) | 2011-09-09 |
| MX338016B (es) | 2016-03-30 |
| AR080372A1 (es) | 2012-04-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2603061C2 (ru) | Функциональное улучшение микроорганизмов для минимизации продукции акриламида | |
| ES2351426T3 (es) | Enzimas lipolíticas fúngicas. | |
| AU2016289705B2 (en) | Development of an asparagine-reducing yeast by adaptive evolution and uses thereof to reduce acrylamide formation | |
| CN100591212C (zh) | 改善生面团和面包质量的方法 | |
| CN111132553A (zh) | 表达抗老化/保鲜淀粉酶的面包酵母 | |
| JP2012531197A (ja) | タンパク質 | |
| CN112292037B (zh) | 脂解酶变体 | |
| HK1180721A (en) | Functional enhancement of microorganisms to minimize production of acrylamide | |
| HK1180721B (en) | Functional enhancement of microorganisms to minimize production of acrylamide | |
| CA2998263A1 (en) | Asparaginase | |
| US6485761B1 (en) | Methods for using lactonohydrolases in baking | |
| WO2017050652A1 (en) | Asparaginase | |
| US20180273929A1 (en) | Asparaginase | |
| WO2017050651A1 (en) | Asparaginase | |
| BR112018000198B1 (pt) | Método de isolamento de uma estirpe de levedura industrial que degrada l-asparagina, estirpes de levedura industrial isolada, método para reduzir a asparagina durante a preparação ou o processamento de alimentos e produto alimentar | |
| MXPA06010403A (en) | Protein |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HZ9A | Changing address for correspondence with an applicant |