RU2587327C2 - Способ диагностики in vitro специфической сенсибилизации организма к бактериальным аллергенам - Google Patents
Способ диагностики in vitro специфической сенсибилизации организма к бактериальным аллергенам Download PDFInfo
- Publication number
- RU2587327C2 RU2587327C2 RU2014146260/15A RU2014146260A RU2587327C2 RU 2587327 C2 RU2587327 C2 RU 2587327C2 RU 2014146260/15 A RU2014146260/15 A RU 2014146260/15A RU 2014146260 A RU2014146260 A RU 2014146260A RU 2587327 C2 RU2587327 C2 RU 2587327C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- samples
- bacterial
- antigens
- bacterial antigens
- blood
- Prior art date
Links
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 title claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 239000013570 bacterial allergen Substances 0.000 title claims abstract description 15
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 91
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 91
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 91
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 65
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 57
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 57
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 37
- PMGQWSIVQFOFOQ-YKVZVUFRSA-N clemastine fumarate Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O.CN1CCC[C@@H]1CCO[C@@](C)(C=1C=CC(Cl)=CC=1)C1=CC=CC=C1 PMGQWSIVQFOFOQ-YKVZVUFRSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 17
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims abstract description 13
- TZCXTZWJZNENPQ-UHFFFAOYSA-L barium sulfate Inorganic materials [Ba+2].[O-]S([O-])(=O)=O TZCXTZWJZNENPQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 11
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims description 47
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 claims description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 15
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 claims description 9
- 201000008225 Klebsiella pneumonia Diseases 0.000 claims description 8
- 206010035717 Pneumonia klebsiella Diseases 0.000 claims description 8
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 claims description 8
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 8
- 239000000043 antiallergic agent Substances 0.000 claims description 4
- 235000010205 Cola acuminata Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000228088 Cola acuminata Species 0.000 claims description 3
- 235000015438 Cola nitida Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000004590 computer program Methods 0.000 claims description 3
- 206010035734 Pneumonia staphylococcal Diseases 0.000 claims 1
- 208000004048 staphylococcal pneumonia Diseases 0.000 claims 1
- 208000011437 staphylococcus aureus pneumonia Diseases 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 19
- 229940122440 HIV protease inhibitor Drugs 0.000 abstract 1
- 230000003266 anti-allergic effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 abstract 1
- 239000004030 hiv protease inhibitor Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000000224 granular leucocyte Anatomy 0.000 description 25
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 17
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 16
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 16
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 14
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 10
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 10
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 description 10
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 9
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 9
- 201000009890 sinusitis Diseases 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 8
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 7
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 7
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 6
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 6
- 208000015768 polyposis Diseases 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 5
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 208000008960 Diabetic foot Diseases 0.000 description 4
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 4
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 4
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 4
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 4
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 4
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 3
- GUGOEEXESWIERI-UHFFFAOYSA-N Terfenadine Chemical compound C1=CC(C(C)(C)C)=CC=C1C(O)CCCN1CCC(C(O)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)CC1 GUGOEEXESWIERI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 3
- 230000001387 anti-histamine Effects 0.000 description 3
- 239000000739 antihistaminic agent Substances 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 3
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 208000034309 Bacterial disease carrier Diseases 0.000 description 2
- 206010006458 Bronchitis chronic Diseases 0.000 description 2
- 206010007882 Cellulitis Diseases 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 241001464937 Neisseria perflava Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- 208000033809 Suppuration Diseases 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 206010000269 abscess Diseases 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 208000007451 chronic bronchitis Diseases 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 230000000403 immunocorrecting effect Effects 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 210000002850 nasal mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 230000004783 oxidative metabolism Effects 0.000 description 2
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 208000033309 Analgesic asthma syndrome Diseases 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000012657 Atopic disease Diseases 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 229920000298 Cellophane Polymers 0.000 description 1
- 206010009137 Chronic sinusitis Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N Methicillin Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S[C@@H]21 RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N 0.000 description 1
- 102000003896 Myeloperoxidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000235 Myeloperoxidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004722 NADPH Oxidases Human genes 0.000 description 1
- 108010002998 NADPH Oxidases Proteins 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 208000037062 Polyps Diseases 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 208000027157 chronic rhinosinusitis Diseases 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 238000004880 explosion Methods 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- KNJDBYZZKAZQNG-UHFFFAOYSA-N lucigenin Chemical class [O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.C12=CC=CC=C2[N+](C)=C(C=CC=C2)C2=C1C1=C(C=CC=C2)C2=[N+](C)C2=CC=CC=C12 KNJDBYZZKAZQNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229960003085 meticillin Drugs 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 210000004493 neutrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000041 non-steroidal anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- -1 tavegil Chemical compound 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- LZMSXDHGHZKXJD-VJANTYMQSA-N trypanothione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H]1CSSC[C@H](NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O)C(=O)NCC(=O)NCCCNCCCCNC(=O)CNC1=O LZMSXDHGHZKXJD-VJANTYMQSA-N 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины и касается способа дифференциальной диагностики in vitro специфической сенсибилизации пациента к бактериальным аллергенам. Сущность способа состоит в отборе и подготовке венозной крови, введении тестируемого препарата, содержащего бактериальные антигены, и сравнении показателей люминол-зависимой хемилюминесценции (ХЛ) с одноименными показателями, полученными для здорового организма. В отобранную кровь пациента вводят антикоагулянт, формируют образцы, содержащие (0,95-1,05)×106 лейкоцитов, и доводят их раствором Хенкса до объема 0,69 мл с получением проб крови. Тестируемый препарат бактериальных антигенов или смесь тестируемого препарата бактериальных антигенов с противоаллергическим препаратом тавегил и контрольный препарат в количестве 0,01 мл вводят в полученные пробы крови и их инкубируют при постоянном перемешивании при температуре 37°С в течение 45 минут. Затем в инкубированные пробы вводят активатор люминол в количестве 2 мМ и хемилюминометром измеряют уровень спонтанной ХЛ для указанного активатора, после чего в те же пробы вводят стимулятор свечения - сульфат бария в количестве 2 мг/мл и регистрируют уровень стимулированной ХЛ также для указанного активатора, причем измерения ХЛ проводят при постоянном перемешивании при температуре 37°С в течение 45 минут с получением временных зависимостей уровня ХЛ. Вычисляют индексы ИП по выражению ИП=Sба/Sк, где Sба; Sк - площадь под кривыми временной зависимости уровня спонтанной и стимулированной ХЛ для тестируемого и контрольного препаратов, соответственно, по которым диагностируют специфическую сенсибилизацию к бактериальным антигенам. 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторным методам контроля состояния организма.
Известно, что бактериальная инфекция является причиной развития инфекционно-аллергических заболеваний, таких как гломерулонефрит, ревматизм, крупозная пневмония, некоторые формы бронхиальной астмы (БА) и др. [Патология: курс лекций / Под ред. М.А. Пальцева. - 2-e изд., стереотипное. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2007]. Среди инфекционно-аллергических заболеваний особое место занимает инфекционно-аллергическая БА, являющаяся наиболее распространенной формой БА. [Пыцкий В.И. Механизмы возникновения и развития бронхиальных астм и основные принципы их лечения. - М.: «Фармарус Принт Медиа», 2008. - 56 с. ]. В качестве причинных факторов, которые могут вызвать развитие этой формы БА, выступают инфекционные факторы (вирусы, бактерии, грибки). Адо А.Д, Адрианова Н.В., Федосеева В.Н., Довжик В.П. [Клиническая аллергология: Рук-во для практических врачей / Под. ред. акад. РАМН, проф. P.M. Хаитова - М.: МЕДпресс-информ, 2002. - 624 с. ] при изучении микробного пейзажа слизистых дыхательного тракта пациентов с инфекционно-аллергической формой бронхиальной астмы выявлено разнообразие микрофлоры, которая была представлена в основном 14 видами условно-патогенных и сапрофитных микроорганизмов. Чаще всего определялось 4-5 видов микроорганизмов у 57,4+5% больных, моноштаммная культура выделялась у 72+2,6%. Из полости носа чаще выделялся Staphylococcus aureus, из зева - Corinobakteria, Streptococcus viridau, Staphylococcus aureus, из бронхов - Neisseria perflava и Streptococcus viricbeus, Candida albicans. При внутрикожном тестировании с бактериальными аллергенами обнаружено положительных внутрикожных тестов на аллерген из Neisseria perflava у 95%, Staphylococcus aureus и alb. - у 83%, Klebsiella pneumonia- у 78%, Pneumococcus- у 7% больных. Условно-патогенная и слабовирулентная флора дыхательных путей у атопиков может вызвать сенсибилизацию и развитие инфекционно-аллергической формы БА. Основным методом лечения больных этой формы БА является специфическая иммунотерапия (СИТ) [Пыцкий В.И. Механизмы возникновения и развития бронхиальных астм и основные принципы их лечения. - М.: «Фармарус Принт Медиа», 2008. - 56 с. ], суть которой заключается в снижении степени сенсибилизации больных к тем аллергенам, которые являются причинами данных атопических заболеваний. Поскольку СИТ проводится у больных инфекционно-аллергической БА с доказанной сенсибилизацией к конкретным бактериям или грибкам, вегетирующим в дыхательных путях, целесообразно определять наличие сенсибилизации к причинным инфекционным аллергенам.
Известно, что при инфекционно-аллергической БА обнаруживается патология придаточных пазух носа (аллергический риносинусит, полипоз носа, признаки инфекции) [Пыцкий В.И., Адрианова Н.В.. Артомасова А.В. Аллергические заболевания. - 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Издательство «Триада-Х». - 1999. - 470 с. ]. В настоящее время широко обсуждается роль Staphylococcus aureus в этиологии и патогенезе полипозного риносинусита больных БА. Так, показано, что колонизация золотистого стафилококка в среднем носовом ходе у пациентов с полипозом носа выше (64%), чем у здоровых лиц (33%) и больных хроническим синуситом без полипов (27%) [Г.П. Бондарева, А.Б. Туровский, О.В. Семкина. Роль золотистого стафилококка при полипозном синусите / Российский Аллергологический Журнал. - 2013. - №6. - С. 5-8]. Также установлено, что уровень колонизации золотистого стафилококка прямо пропорционален содержанию специфических IgE-антител к его энтеротоксинам [Gevaert P., Holtappels G., Johansson S.G. et al. Organization of secondary lymphoid tissue and local IgE formation to Staphylococcus aureus enterotoxins in nazal polyptissue. Allergy. 2005, v. 60, p. 71-79]. Van Zele и соавт. [Van Zele Т., Gevaert P., Watelet J.B. Staphylococcus aureus colonization and IgE antibody formation to enterotoxins in increased in nazal poliposis. J. Allergy Clin. Immunol. 2004. - v. 114. - p. 981-983] в своей работе показали, что наличие у пациента с полипозным риносинуситом непереносимости аспирина и бронхиальной астмы повышает распространенность стафилококковой колонизации слизистой оболочки носовых путей до 87,5%, при этом IgE-антитела к стафилококковым энтеротоксинам обнаруживают в 80% случаев.
При обнаружении стафилококковой колонизации слизистой оболочки носовых путей у пациентов с подтвержденной сенсибилизацией к антигенам стафилококка показана системная антибактериальная терапия, что повышает эффективность противорецидивной консервативной терапии полипозного риносинусита и терапии БА [Г.П. Бондарева, А.Б. Туровский, О.В. Семкина. Роль золотистого стафилококка при полипозном синусите / Российский Аллергологический Журнал. - 2013. - №6. - С. 5-8]. Таким образом, выявление сенсибилизации к антигенам золотистого стафилококка открывает возможность применения эффективных методов лечения, которые позволяют предотвратить возникновение рецидивов заболевания и улучшить его прогноз.
Основным методом иммунодиагностики гиперчувствительности к бактериальным аллергенам служит метод иммуноферментного анализа (ИФА), позволяющий производить количественное определение аллергенспецифических IgE-антител в крови больного. Однако данная методика является дорогостоящей и требует специально обученных сотрудников. Кроме того, данный анализ направлен на выявление гиперчувствительности к определенному бактериальному аллергену, а не к их группе. В тех случаях, когда конкретный бактериальный возбудитель неизвестен, для диагностики гиперчувствительности необходимо исследовать целый спектр антигенов, что существенно повышает стоимость исследования. Отрицательный ответ в этом случае не обязательно означает отсутствие сенсибилизации к бактериальным аллергенам - может оказаться так, что исследование на антиген, к которому существует гиперчувствительность, просто не проводили.
В то же время существует универсальный метод исследования биологических жидкостей, в котором используется хемилюминесценция, сопровождающая реакции с участием радикалов. Хемилюминесцентный метод позволяет изучать патологические процессы, в патогенезе которых важную роль играет оксидативный стресс (Владимиров Ю.А., Проскурина Е.В. Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция. // Успехи биологической химии, - т. 49, - 2009, - с. 341-388). В частности, известно, что бактериальные антигены могут инициировать развитие оксидативного стресса и, следовательно, оказывать стимулирующее действие на люминол-зависимую хемилюминесценцию гранулоцитов [Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П. Хемилюминесценция клеток животных // Итоги науки и техники. Серия биофизика. 1989 - Том 24. - 176 с. ]. Поэтому мы решили использовать хемилюминесцентный метод для диагностики гиперчувствительности к бактериальным антигенам.
В патенте (RU 2445626 C1, КрасГМУ, 20.03.2012) оценивают параметры кинетики хемилюминесценции, индуцированной взвесью клинического штамма метицилленрезистентного Staphylococcus aureus, по которым оценивают функциональную способность фагоцитирующих клеток. Взвесь клинического штамма Staphylococcus aureus используют в качестве индуктора «дыхательного взрыва» лейкоцитов, то есть индуктора фагоцитоза. Однако в этом случае возможно образование иммунных комплексов и выброс медиаторов из базофилов, что изменит параметры ХЛ и затруднит интерпретацию результатов.
В патенте (RU 2289138 С2, НИИ микробиологии…, 10.12.2006) описан способ аллергодиагностики, в котором выделяют нейтрофильные лейкоциты, проводят формирование иммунных комплексов, измеряют фоновую люминесценцию среды инкубации, добавляют нейтрофилы, измеряют уровень спонтанной хемилюминесценции, затем вносят иммунный комплекс и определяют значение стимулированной хемилюминисценции, по которым диагностируют аллергическую реакцию. К недостаткам следует отнести как большой объем крови (10 мл), так и сложность и длительность анализа.
В патенте (RU 2320991 С2, Матела и др., 27.03.2008) описан способ подбора иммунокоррегирующего препарата, при котором производят забор периферической крови, получают лейкоцитарную суспензию, суспензию клеток инкубируют с иммунокоррегирующими препаратами в течение 60 мин при 37°С. Затем производят запись кривых люминол-зависимой хемилюминесцентной реакции (ХЛ) и рассчитывают индекс стимуляции препарата (ИС). К недостаткам следует отнести большой расход крови и реактивов (для выделения лейкоцитов), длительность исследования.
Наиболее близким по назначению является способ определения индивидуальной чувствительности к антибактериальным препаратам, которые могут выступать в роли аллергенов для лиц, сенсибилизированных к данным антигенам, в части выбора антибиотика при лечении инфекционно-воспалительных заболеваний (RU 2495422 С2, Савченко и др., 10.10.2013 - прототип). Проводят измерение спонтанной и модифицированной антибиотиками люцигенин-зависимой хемилюминесценции цельной крови пациента. Затем рассчитывают коэффициент, представляющий собой отношение разности площадей под кривой хемилюминесценции с антибиотиком (SАНТ) и под кривой спонтанной хемилюминесценции (SСП), отнесенный к SСП, выраженный в процентах. По этим величинам осуществляют оптимальный подбор антибиотиков.
Однако способ-прототип не предусматривает определение у пациента специфической сенсибилизации к бактериальным антигенам, а также не устанавливает факта наличия бактериальных инфекций, в том числе скрытых.
Задачей настоящего изобретения является расширение функциональных возможностей способа-прототипа, а именно определение не только сенсибилизации к тем или иным бактериальным антигенам, но и выявления бактериального воспаления в организме пациента, в том числе скрытой бактериальной инфекции, что и является техническим результатом изобретения.
Патентуемый способ дифференциальной диагностики in vitro специфической сенсибилизации пациента к бактериальным аллергенам состоит в отборе и подготовке венозной крови, введении тестируемого препарата, содержащего бактериальные антигены, и сравнении показателей люминол-зависимой хемилюминесценции (ХЛ) с одноименными показателями, полученными для здорового организма.
Отличие состоит в следующем. В отобранную кровь пациента вводят антикоагулянт, формируют образцы, содержащие (0,95-1,05)×106 лейкоцитов, и доводят их раствором Хенкса до объема 0,69 мл с получением проб крови.
Тестируемый препарат бактериальных антигенов или смесь тестируемого препарата бактериальных антигенов с противоаллергическим препаратом тавегил и контрольный препарат в количестве 0,01 мл вводят в полученные пробы крови и их инкубируют при постоянном перемешивании при температуре 37°C в течение 45 минут. Затем в инкубированные пробы вводят активатор люминол в количестве 2 мМ и хемилюминометром измеряют уровень спонтанной ХЛ для указанного активатора, после чего в те же пробы вводят стимулятор свечения - сульфат бария в количестве 2 мг/мл и регистрируют уровень стимулированной ХЛ также для указанного активатора, причем измерения ХЛ проводят при постоянном перемешивании при температуре 37°C в течение 45 минут с получением временных зависимостей уровня ХЛ.
Вычисляют индексы ИП по выражению ИП=Sба/Sк, где Sба; Sк - площадь под кривыми временной зависимости уровня спонтанной и стимулированной ХЛ для тестируемого и контрольного препаратов соответственно, по которым диагностируют специфическую сенсибилизацию к бактериальным аллергенам.
Тестируемый препарат бактериальных антигенов Staphylococcus aureus разводят в физиологическом растворе и вводят в пробы крови в количестве 5×104 микр. кл/мл, и при индексе ИП выше 3,25 относительно индекса ИП для контрольного препарата в виде физиологического раствора диагностируют наличие сенсибилизации организма к антигенам Staphylococcus aureus.
Тестируемый препарат бактериальных антигенов Klebsiella pneumonia разводят в физиологическом растворе и вводят в пробы крови в количестве 5×104 микр. кл/мл, и при индексе ИП выше 3,78 относительно индекса ИП для контрольного препарата в виде физиологического раствора, диагностируют наличие сенсибилизации организма к антигенам Klebsiella pneumonia.
При тестировании смеси препарата бактериальных антигенов с противоаллергическим препаратом тавегил сначала в пробы крови вводят упомянутый препарат, растворенный в растворе Хенкса в конечной концентрации 1,1×10-4 М, после чего пробы инкубируют при постоянном перемешивании при температуре 37°С в течение 10 минут, затем одну часть полученных проб используют в качестве контрольных, а другую часть - в качестве тестируемых, для чего в пробы вводят тестируемый препарат бактериальных антигенов и осуществляют повторное инкубирование при том же режиме, а
специфическую сенсибилизацию организма к упомянутым бактериальным антигенам диагностируют при значении отношения (ИПТ:ИП) меньшем или равном 0,8, где ИПТ - индекс, вычисленный для пробы с бактериальными антигенами в смеси с тавегилом; ИП - индекс, вычисленный для пробы с бактериальными антигенами.
Способ может характеризоваться тем, что хемилюминометр представляет собой биохемилюминесцентный автоматический анализатор БЛМ 3606М-01 с компьютерной программой BLM - Obrab, производства СКТБ «Наука» КНЦ СО РАН, Россия.
Достижение технического результата основано на проведенных заявителем детальных исследованиях. Определялось воздействие бактериальных антигенов, в частности комплексных антигенов Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae на секрецию АФК полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЛ) у здоровых доноров и больных с астматической триадой (бронхиальная астма, полипозный риносинусит, непереносимость НПВП). Также было установлено, что предварительная инкубация крови больных с гнойно-воспалительными процессами (абсцесс, флегмона, синдром диабетической стопы, нагноение ран и др.), вызванными микроорганизмами Staphylococcus aureus и/или Streptococcus pyogenes (при микробиологическом исследовании гнойного экссудата выявлялся Staphylococcus aureus и/или Streptococcus pyogenes), сопровождается увеличением показателей ИП относительно значений ИП у здоровых доноров [Е.А. Усанова, Ю.П. Сюсюкин, Е.Э. Арутюнова, Ю.В. Балякин. Праймирующее действие Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes на полиморфно-ядерные лейкоциты крови при острых гнойно-воспалительных заболеваниях. // Сб. тезисных докладов научно-практической конференции, посвященной 40-летию МБФ «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины». - 2003. - С. 94]. В связи с вышеотмеченным целесообразно проводить дифференциальную диагностику между гнойно-воспалительными процессами, вызванными микроорганизмами, и сенсибилизацией организма к бактериальным антигенам этих же микроорганизмов.
Дифференциальная диагностика обосновывается следующими результатами: обследован 41 пациент с астматической триадой (AT) со смешанной (неинфекционно + инфекционно-зависимой) и инфекционно-зависимой формами бронхиальной астмы в фазе ремиссии. Противопоказания к включению пациентов в исследование: проявления острой или обострение хронической инфекции, прием системных глюкокортикостероидов за 2 недели до исследования. У 17 пациентов с AT в сыворотке крови определялись специфические IgE к различным стафилококковым энтеротоксинам (SEA, SEB, TSST). У 10 пациентов с AT в сыворотке крови определялись специфические IgE к антигенам Klebsiella pneumonia. У 14 пациентов с AT сенсибилизации к стафилокококковым энтеротоксинам и другим бактериальным антигенам выявлено не было. Контрольная группа практически здоровых людей состояла из 20 человек, не сенсибилизированных стафилококковыми энтеротоксинами и другими бактериальными антигенами и не болевших острыми воспалительными заболеваниями в течение трех недель до срока проведения испытания.
Подготовку крови и исследование осуществляют следующим образом.
Используется гепаринизированная венозная кровь (концентрация гепарина - 50 ЕД/мл). Непосредственно перед проведением исследования во взятых образцах цельной крови определяется количество и жизнеспособность лейкоцитов. Из образцов крови отбирались пробы, содержащие 1×106 лейкоцитов (объем крови составлял около 95-100 мкл), и доводят их объем до 0,69 мл средой Хенкса.
Затем к полученным образцам добавляют 0,01 мл препарата антигенов Staphylococcus aureus в различных разведениях (от 5×106 до 1000×106 микробных клеток на 1 мл суспензии). В контрольные пробы вместо комплексного препарата антигенов добавляют физиологический раствор в том же объеме.
Препараты бактериальных антигенов, содержащие 109 микробных клеток на 1 мл суспензии, продукты жизнедеятельности, фрагменты бактериальных стенок, ферменты и токсины данного микроорганизма, готовили по методу В.Н. Федосеевой и В.А. Камышовой (RU 2183970 С1 от 27.06.2002) из штаммов бактерий клинических изолятов путем приготовления бактериальных комплексов на целлофановом диске.
Затем каждую пробу инкубировали при постоянном перемешивании при 37°С в течение 45 мин. После инкубации проводят измерение интенсивности хемилюминесценции (ХЛ) проб на 36-кюветном биохемилюминесцентном анализаторе БЛМ 3606-01 (г. Красноярск), сигнал от которого поступает на персональный компьютер и анализируется с помощью программы BLM-Obrab. В качестве активатора свечения используют люминол (регистрируется суммарная секреция активных форм кислорода).
Далее, в кювету хемилюминометра вносят 0,7 мл пробы после инкубации и 0,15 мл активатора (2 мМ). Далее измеряют уровень спонтанной ХЛ. После регистрации спонтанной ХЛ добавляют 0,15 мл стимулятора свечения - сульфата бария (2 мг/мл) и регистрируют уровень стимулированной ХЛ. Измерение ХЛ крови проводят в режиме постоянного перемешивания при температуре 37°С.
Определяют следующие параметры хемилюминесценции: интенсивность спонтанной ХЛ, интенсивность максимальной ХЛ, время достижения максимальной вспышки ХЛ, площадь под кривой ХЛ, отражающую светосумму ХЛ.
Для оценки праймирующего влияния рассчитывают индекс (ИП) соотношения площадей под кривыми, равный отношению светосуммы ХЛ (Sба) опытной пробы (праймированной комплексным препаратом бактериальных антигенов) к светосумме ХЛ контрольной пробы (Sк). О повышенной чувствительности к бактериальному антигену судят по индексу ИП, определяемому по выражению ИП=Sба/Sк, где Sба; Sк - площадь под кривыми временной зависимости уровня спонтанной и стимулированной ХЛ для тестируемого и контрольного препаратов соответственно.
Зависимость ИП от концентрации комплексного препарата антигенов Staphylococcus aureus у доноров и больных с астматической триадой представлена в Табл. 1. У здоровых доноров комплексный антиген Staphylococcus aureus стимулирует секрецию АФК ПМЛ цельной крови. При этом эффект прайминга имеет характер обратно пропорциональный дозе бактериального антигена. Так, самая большая концентрация антигена 1000×104 микр. кл./мл вызывала максимальное подавление секреции АФК ПМЛ. Стимуляция суммарной секреции АФК ПМЛ крови доноров выявлялась в диапазоне концентраций (5-50)×104 микр. кл./мл. Максимальная стимуляция суммарной выработки АФК ПМЛ наблюдалась на самой минимальной концентрации 5×104 микр. кл./мл., на указанной концентрации ИП=2,13.
Таким образом, у здоровых доноров комплексный бактериальный антиген Staphylococcus aureus оказывает праймирующее воздействие на секрецию АФК ПМЛ цельной крови. При этом эффект прайминга наблюдается в диапазоне концентраций (5-50)×104 микр. кл./мл. Можно предположить, что прайминг ПМЛ запускается посредством контакта патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (РАМР) микроорганизмов с соответствующими им рецепторами лейкоцитов (Toll-like receptors), в результате чего реализуются процессы, ведущие к увеличению функционального потенциала ПМЛ, что в свою очередь влечет за собой усиление интенсивности ответа на последующее добавление этого же или другого стимула.
Исходя из полученных закономерностей влияния комплексного антигена Staphylococcus aureus на секрецию АФК ПМЛ доноров, исследовано, в какой мере они сохранятся у больных с астматической триадой. С этой целью исследовали влияние антигенов Staphylococcus aureus на секрецию АФК ПМЛ пациентов с астматической триадой. Поскольку предварительные исследования показали существенные различия в секреции АФК ПМЛ под воздействием антигенов Staphylococcus aureus при наличии или отсутствии у пациентов сенсибилизации к стафилококковым энтеротоксинам, все пациенты с AT были разделены на две подгруппы: сенсибилизированные и несенсибилизированные вышеупомянутыми антигенами.
Как видно из Табл. 1, у пациентов, не сенсибилизированных к стафилококковым энтеротоксинам, наблюдается снижение секреции АФК ПМЛ по сравнению со здоровыми донорами. Незначительное праймирующее воздействие комплексного препарата антигенов Staphylococcus aureus на суммарную секрецию АФК ПМЛ цельной крови больных отмечалось только на самой малой концентрации АГ 5×104 микр. кл./мл. ИП на указанной концентрации антигенов составлял 1,25. Затем по мере увеличения концентрации антигенов развивалось угнетение суммарной секреции АФК ПМЛ крови.
При исследовании стимулированной сульфатом бария люминол-зависимой ХЛ крови больных, сенсибилизированных стафилококковыми энтеротоксинами, была выявлена выраженная стимуляция суммарной секреции АФК ПМЛ в широком диапазоне используемых концентраций комплексного антигена Staphylococcus aureus, значительно превышающая таковую здоровых доноров. Увеличение суммарной секреции АФК ПМЛ при предынкубации проб крови больных с комплексным антигеном Staphylococcus aureus отмечалось в диапазоне (5-250)×104 микр. кл./мл и имело характер обратной дозовой зависимости. В частности, на концентрации 5×104 микр. кл./мл ИП имел максимальное значение и составлял 3,34, в то время как у здоровых доноров ИП на данной концентрации был ниже (на 37%) и составлял 2,13.
Таким образом, у пациентов с астматической триадой, сенсибилизированных стафилококковыми энтеротоксинами, при предынкубации проб крови с комплексным антигеном Staphylococcus aureus наблюдалось значительное увеличение суммарной секреции АФК ПМЛ по сравнению со здоровыми донорами. Выраженная стимуляция люминол-зависимой ХЛ крови, по-видимому, происходит вследствие действия на нейтрофилы медиаторов (в частности, гистамина), высвобождающихся из базофилов при образовании на их поверхности иммунного комплекса аллерген - IgE, где в качестве аллергена выступают энтеротоксины стафилококка. По-видимому, биологически активные вещества, воздействуя на ПМЛ, способны изменять активность ферментов окислительного метаболизма ПМЛ и, следовательно, модифицировать исимую ХЛ крови. Наше предположение согласуется с ранними работами [Искусных А.Ю., Башарина О.В., Артюхов В.Г., Алабовский В.В. Влияние гистамина на функциональные свойства нейтрофилов и интенсивность процесса пероксидного окисления нейтрофилов в крови доноров // Вестник ВГУ, Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2008. - №1. - С. 93-96], в которых при изучении влияния гистамина, используемого в различных концентрациях, на окислительный метаболизм ПМЛ, было выявлено, что гистамин дозозависимо изменяет активность НАДФН-оксидазной и миелопероксидазной ферментных систем ПМЛ.
Выраженные различия ХЛ крови больных, сенсибилизированных энтеротоксинами стафилококка, и здоровых доноров открывают возможность применения метода стимулированной сульфатом бария люминол-зависимой ХЛ в качестве диагностического теста для определения специфической сенсибилизации организма к бактериальным аллергенам, в частности к Staphylococcus aureus и другим бактериальным аллергенам.
Рекомендуемая концентрация комплексного препарата бактериальных антигенов Staphylococcus aureus для диагностики специфической сенсибилизации организма к данному микроорганизму составляет 5×104 микр. кл./мл. Если на концентрации бактериального антигена 5×104 микр. кл./мл ИП выше 3,0, следует, что у пациента имеется сенсибилизация к стафилококковым антигенам.
Аналогичные результаты были получены при использовании в качестве бактериальных антигенов и других микроорганизмов: Klebsiella pneumonia (см. Табл. 2), Pseudomonas aerogenosa, Е. Coli.
Известно, что микроорганизмы способны оказывать праймирующее действие на ПМЛ крови у пациентов гнойными инфекционными заболеваниями (в частности, абсцесс, флегмона, синдром диабетической стопы, нагноение ран и т.д.) [Е.А. Усанова, Ю.П. Сюсюкин, Е.Э. Арутюнова, Ю.В. Балякин. Праймирующее действие Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes на полиморфно-ядерные лейкоциты крови при острых гнойно-воспалительных заболеваниях. // Сборник тезисных докладов научно-практической конференции, посвященной 40-летию МБФ «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины». - 2003. - С. 94; Е.А. Усанова, Ю.В. Балякин. Изменение фагоцитарной активности и эффект прайминга полиморфно-ядерных лейкоцитов крови при синдроме диабетической стопы. // Вестник РГМУ. Материалы Пироговской конференции студентов и молодых ученых - 2004. С. 47]. У таких пациентов значения ИП также выше значений здоровых доноров, так как микроорганизмы, вызвавшие воспалительный процесс, оказывают предстимулирующее действие на ПМЛ крови.
Для дифференциальной диагностики специфической сенсибилизации к бактериальным аллергенам или выявления наличия воспалительного инфекционного процесса (гнойно-воспалительных процессов) выполняются следующие действия:
1. Для исследования используется гепаринизированная венозная кровь (концентрация гепарина - 50 ЕД/мл) объемом 0,5 мл.
2. Непосредственно перед проведением исследования во взятых образцах цельной крови определяется количество и жизнеспособность лейкоцитов.
3. Из образцов крови отбирают объемы, содержащие 1×106 лейкоцитов (объем крови составляет около 95-100 мкл), и доводят их до 0,68 мл средой Хенкса.
4. К полученным образцам добавляют 0,01 мл растворенного в среде Хенкса антигистаминного препарата тавегила в конечной концентрации 1,1×10-4 M, после чего пробы инкубируют в течение 10 минут при 37°С при постоянном перемешивании.
5. Затем в пробы крови вносят 0,01 мл комплексного бактериального препарата антигенов и производят повторную инкубацию в течение 45 минут в тех же условиях. В качестве контрольных используют пробы, содержащие 0,01 мл раствора тавегила. Состав контрольной пробы: 100 мкл крови, 0,01 мл раствора тавегила, 0,01 мл физиологического раствора, 0,68 мл среды Хенкса.
6. После инкубации измеряют интенсивность ХЛ проб. В качестве активатора свечения используют люминол и регистрируют суммарную секрецию активных форм кислорода.
7. В кювету хемилюминометра вносят 0,7 мл пробы после инкубации и 0,15 мл активатора (2 мМ). Далее измеряют уровень спонтанной ХЛ. После регистрации спонтанной ХЛ добавляют 0,15 мл стимулятора свечения - сульфата бария (2 мг/мл) и регистрируют уровень стимулированной ХЛ. Измерение ХЛ крови проводится в режиме постоянного перемешивания при температуре 37°С.
8. С помощью компьютерной программы BLM-Obrab определяются следующие параметры хемилюминесценции: интенсивность спонтанной ХЛ, интенсивность максимальной ХЛ, время достижения максимальной вспышки ХЛ, площадь под кривой ХЛ (Sхл), которая отражает светосумму ХЛ. Проведенные нами контрольные исследования показывают, что ошибка определения параметров кривой ХЛ не превышает 0,5%.
При оценке влияния тестируемого агента (тавегила) на ХЛ крови рассчитывают индекс соотношения площадей (ИП), представляющий собой отношение Sхл опытной пробы (с тавегилом в смеси с бактериальным антигеном) к Sхл контрольной пробы, содержащей тавегил (Sхл опыт/Sхл контр.). По величине ИП люминол-зависимой ХЛ судят о наличии сенсибилизации организма к бактериальным антигенам.
Если после инкубации с тавегилом в смеси с комплексным препаратом бактериальных антигенов ИП возвращается к нормальным значениям, близким к таковым у здоровых добровольцев, следует, что у пациента имеется специфическая сенсибилизация к бактериальным аллергенам.
Если после инкубации с тавегилом в смеси с комплексным препаратом бактериальных антигенов значение ИП практически не изменяется (с точностью до 5%), можно заключить, что у пациента отсутствует специфическая сенсибилизация к бактериальным антигенам.
Пример 1. Дифференциальная диагностика специфической сенсибилизации к бактериальным антигенам или выявления наличия гнойно-воспалительного процесса в организме
Больная А., 45 лет (история болезни №1050/11-5970/04). Клинический диагноз: Бронхиальная астма, инфекционно-аллергическая форма, средней тяжести течения, фаза обострения при поступлении, фаза ремиссии при выписке. Хронический бронхит, фаза обострения при поступлении, фаза ремиссии при выписке. Хронический полипозный риносинусит. Исследование проводилось на биохемилюминесцентном анализаторе БЛМ 3606-01 (СКТБ «Наука» КНЦ СО РАН, Россия) в фазу ремиссии основного заболевания.
Подготовка проб проводилась по описанной выше методике. Получены следующие показатели ИП люминол-зависимой ХЛ для исследуемых бактериальных антигенов.
Заключение: Выявлено выраженное праймирующее действие бактериальных антигенов Staphylococcus aureus на ПМЛ крови пациента.
Результаты дифференциальной диагностики специфической сенсибилизации к стафилококковым энтеротоксинам или наличия гнойно-воспалительного процесса, в развитии которого важное значение имеет микроорганизм Staphylococcus aureus, представлены ниже.
Выявлено снижение ИПТ (индекса, вычисленного для пробы с бактериальными антигенами в смеси с тавегилом) относительно индекса ИП (индекса, вычисленного для пробы с бактериальными антигенами) на 30%. То есть значение отношения (ИПТ:ИП)=0,7. С нашей точки зрения, увеличение ИП после предынкубации проб крови с комплексным препаратом бактериальных антигенов Staphylococcus aureus у пациентов, сенсибилизированных энтеротоксинами стафилококка, происходит вследствие действия на нейтрофилы медиаторов (в частности, гистамина), высвобождающихся из базофилов при образовании на их поверхности иммунного комплекса аллерген - IgE, где в качестве аллергена выступают энтеротоксины стафилококка. Поэтому добавление антигистаминного препарата тавегила снижает ИП, приближая его к показателю ИП здоровых доноров.
Диагноз: выявлена специфическая сенсибилизация к бактериальным антигенам Staphylococcus aureus у данного пациента.
Пример 2. Больная К., 68 лет (история болезни №1711/14С/6677/14). Клинический диагноз: Инсулиннезависимый сахарный диабет. Гнойно-воспалительное заболевание в области стопы (синдром диабетической стопы). Поражение стопы IV степени. Увеличение глюкозы в крови >8 ммоль/ л. Сопутствующие заболевания: Бронхиальная астма, смешанная форма, средней тяжести течения, фаза ремиссии. Хронический бронхит, фаза ремиссии. Хронический полипозный риносинусит.
Исследование проводилось на биохемилюминесцентном анализаторе БЛМ 3606-01, как и для примера 1, в фазу ремиссии основного заболевания.
Подготовка проб проводилась по описанной выше методике. Получены следующие показатели ИП люминол-зависимой хемилюминесценции для исследуемых бактериальных антигенов: Staphylococcus aureus - ИП=4,15 отн.ед.; Staphylococcus aureus + тавегил - ИПТ=3,94 отн. ед.
Выявлено увеличение ИП пациента на 95% относительно показателя ИП здоровых доноров (ИП здоровых доноров равен 2,13±0,27) после предынкубации проб крови с комплексным препаратом антигенов Staphylococcus aureus в дозе 5×104 микр. кл./мл. Воздействие тавегила не оказывает значительного влияния на ИП (снижение ИПТ (индекса, вычисленного для пробы с бактериальными антигенами в смеси с тавегилом) относительно индекса ИП (индекса, вычисленного для пробы с бактериальными антигенами на 5%, то есть значение отношения (ИПТ:ИП)=0,95. Это свидетельствует об отсутствии специфической сенсибилизации организма к антигенам Staphylococcus aureus.
Диагноз: специфическая сенсибилизация организма к АГ Staphylococcus aureus отсутствует. В развитии гнойно-воспалительного процесса участвует Staphylococcus aureus.
Таким образом, дифференциацией специфической сенсибилизации к бактериальным аллергенам от бактериальной инфекции служит значение ИП. Как видно из данных, представленных в Табл. 1 и проведенных ранее исследований, ИП повышается как при наличии гиперчувствительности к бактериальным антигенам, так и при бактериальной инфекции. Поскольку в сенсибилизированном организме после контакта со специфическим аллергеном происходит массивное высвобождение из базофилов (и тучных клеток) биологически активных веществ, в частности, гистамина, то дифференциальная диагностика между гнойно-воспалительным процессом, вызванным бактериальной инфекцией и гиперчувствительностью к бактериальным аллергенам, может быть проведена путем добавления в среду инкубации антигистаминного препарата, например тавегила.
Нами было показано, что при предынкубации проб крови с тавегилом ИПТ (индекс, вычисленный для пробы с бактериальными антигенами в смеси с тавегилом) значительно не изменялся у пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями для дозы 5×104 микр. кл./мл Staphylococcus aureus (ИПТ снизился на 5% относительно ИП, вычисленного для пробы с бактериальными антигенами; значение отношения (ИПТ:ИП)=0,95). Тавегил уменьшил ИПТ для проб крови больных с гиперчувствительностью к данным бактериальным антигенам на 30% ((ИПТ:ИП)=0,70). У больных с астматической триадой без гиперчувствительности к золотистому стафилококку подобная инкубация не привела к изменению ИПТ.
Таким образом, представленные данные свидетельствуют о достижении технического результата в части расширения функциональных возможностей способа - возможности определения не только сенсибилизации к тем или иным бактериальным антигенам, но и выявления бактериального воспаления в организме пациента, в том числе скрытой бактериальной инфекции.
Claims (5)
1. Способ дифференциальной диагностики in vitro специфической сенсибилизации пациента к бактериальным аллергенам, состоящий в отборе и подготовке венозной крови, введении тестируемого препарата, содержащего бактериальные антигены и сравнении показателей люминол-зависимой хемилюминесценции (ХЛ) с одноименными показателями, полученными для здорового организма,
отличающийся тем, что
в отобранную кровь пациента вводят антикоагулянт, формируют образцы, содержащие (0,95-1,05)×106 лейкоцитов, и доводят их раствором Хенкса до объема 0,69 мл с получением проб крови,
тестируемый препарат бактериальных антигенов или смесь тестируемого препарата бактериальных антигенов с противоаллергическим препаратом тавегил, и контрольный препарат в количестве 0,01 мл вводят в полученные пробы крови, и их инкубируют при постоянном перемешивании при температуре 37°C в течение 45 минут, затем
в инкубированные пробы вводят активатор люминол в количестве 2 мМ и хемилюминометром измеряют уровень спонтанной ХЛ для указанного активатора, после чего в те же пробы вводят стимулятор свечения - сульфат бария в количестве 2 мг/мл, и регистрируют уровень стимулированной ХЛ также для указанного активатора, причем измерения ХЛ проводят при постоянном перемешивании при температуре 37°C в течение 45 минут с получением временных зависимостей уровня ХЛ, далее
вычисляют индексы ИП по выражению ИП=Sба/Sк, где Sба; Sк - площадь под кривыми временной зависимости уровня спонтанной и стимулированной ХЛ для тестируемого и контрольного препаратов, соответственно, по которым диагностируют специфическую сенсибилизацию к бактериальным антигенам.
отличающийся тем, что
в отобранную кровь пациента вводят антикоагулянт, формируют образцы, содержащие (0,95-1,05)×106 лейкоцитов, и доводят их раствором Хенкса до объема 0,69 мл с получением проб крови,
тестируемый препарат бактериальных антигенов или смесь тестируемого препарата бактериальных антигенов с противоаллергическим препаратом тавегил, и контрольный препарат в количестве 0,01 мл вводят в полученные пробы крови, и их инкубируют при постоянном перемешивании при температуре 37°C в течение 45 минут, затем
в инкубированные пробы вводят активатор люминол в количестве 2 мМ и хемилюминометром измеряют уровень спонтанной ХЛ для указанного активатора, после чего в те же пробы вводят стимулятор свечения - сульфат бария в количестве 2 мг/мл, и регистрируют уровень стимулированной ХЛ также для указанного активатора, причем измерения ХЛ проводят при постоянном перемешивании при температуре 37°C в течение 45 минут с получением временных зависимостей уровня ХЛ, далее
вычисляют индексы ИП по выражению ИП=Sба/Sк, где Sба; Sк - площадь под кривыми временной зависимости уровня спонтанной и стимулированной ХЛ для тестируемого и контрольного препаратов, соответственно, по которым диагностируют специфическую сенсибилизацию к бактериальным антигенам.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что тестируемый препарат антигенов Staphylococcus aureus разводят в физиологическом растворе и вводят в пробы крови в количестве 5×104 микр. кл/мл, и при индексе ИП выше 3,25 относительно индекса ИП для контрольного препарата в виде физиологического раствора, диагностируют наличие сенсибилизации организма к антигенам Staphylococcus aureus.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что тестируемый препарат антигенов Klebsiella pneumonia разводят в физиологическом растворе и вводят в пробы крови в количестве 5×104 микр. кл/мл, и при индексе ИП выше 3,78 относительно индекса ИП для контрольного препарата в виде физиологического раствора, диагностируют наличие сенсибилизации организма к антигенам Klebsiella pneumonia.
4. Способ по любому пп. 1-3, отличающийся тем, что при тестировании смеси препарата бактериальных антигенов с противоаллергическим препаратом тавегил сначала в пробы крови вводят упомянутый препарат, растворенный в растворе Хенкса в конечной концентрации 1,1×10-4 M, после чего пробы инкубируют при постоянном перемешивании при температуре 37°C в течение 10 минут, затем одну часть полученных проб используют в качестве контрольных, а другую часть - в качестве тестируемых, для чего в пробы вводят тестируемый препарат бактериальных антигенов и осуществляют повторное инкубирование при том же режиме, а
специфическую сенсибилизацию организма к бактериальным антигенам Staphylococcus aureus и Klebsiella pneumonia диагностируют при значении отношения (ИПТ : ИП), меньшем или равном 0,8, где ИПТ - индекс, вычисленный для пробы бактериальных антигеном в смеси с тавегилом; ИП - индекс, вычисленный для пробы бактериальных антигенов.
специфическую сенсибилизацию организма к бактериальным антигенам Staphylococcus aureus и Klebsiella pneumonia диагностируют при значении отношения (ИПТ : ИП), меньшем или равном 0,8, где ИПТ - индекс, вычисленный для пробы бактериальных антигеном в смеси с тавегилом; ИП - индекс, вычисленный для пробы бактериальных антигенов.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что хемилюминометр представляет собой биохемилюминесцентный автоматический анализатор БЛМ 3606М-01 с компьютерной программой BLM- Obrab, производства СКТБ «Наука» КНЦ СО РАН, Россия.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014146260/15A RU2587327C2 (ru) | 2014-11-19 | 2014-11-19 | Способ диагностики in vitro специфической сенсибилизации организма к бактериальным аллергенам |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014146260/15A RU2587327C2 (ru) | 2014-11-19 | 2014-11-19 | Способ диагностики in vitro специфической сенсибилизации организма к бактериальным аллергенам |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2014146260A RU2014146260A (ru) | 2016-06-10 |
| RU2587327C2 true RU2587327C2 (ru) | 2016-06-20 |
Family
ID=56114845
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014146260/15A RU2587327C2 (ru) | 2014-11-19 | 2014-11-19 | Способ диагностики in vitro специфической сенсибилизации организма к бактериальным аллергенам |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2587327C2 (ru) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1464088A1 (ru) * | 1986-06-02 | 1989-03-07 | Челябинский государственный медицинский институт | Способ определени специфической сенсибилизации организма к аллергенам |
| WO1992019970A1 (en) * | 1991-04-26 | 1992-11-12 | Emanuel Calenoff | Methods to detect and treat diseases caused by bacterial allergens |
| RU2323441C2 (ru) * | 2006-05-24 | 2008-04-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Уфимский научно-исследовательский институт медицины труда и экологии человека "Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" | Способ диагностики сенсибилизации к водорастворимым промышленным аллергенам |
| RU2445626C1 (ru) * | 2011-02-28 | 2012-03-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации" | Способ определения функциональной способности фагоцитирующих клеток |
-
2014
- 2014-11-19 RU RU2014146260/15A patent/RU2587327C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1464088A1 (ru) * | 1986-06-02 | 1989-03-07 | Челябинский государственный медицинский институт | Способ определени специфической сенсибилизации организма к аллергенам |
| WO1992019970A1 (en) * | 1991-04-26 | 1992-11-12 | Emanuel Calenoff | Methods to detect and treat diseases caused by bacterial allergens |
| RU2323441C2 (ru) * | 2006-05-24 | 2008-04-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Уфимский научно-исследовательский институт медицины труда и экологии человека "Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" | Способ диагностики сенсибилизации к водорастворимым промышленным аллергенам |
| RU2445626C1 (ru) * | 2011-02-28 | 2012-03-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации" | Способ определения функциональной способности фагоцитирующих клеток |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2014146260A (ru) | 2016-06-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Vijayan et al. | Procalcitonin: a promising diagnostic marker for sepsis and antibiotic therapy | |
| Chen et al. | Usefulness of fecal lactoferrin in predicting and monitoring the clinical severity of infectious diarrhea | |
| Coppola et al. | Cell-mediated immune responses to in vivo-expressed and stage-specific Mycobacterium tuberculosis antigens in latent and active tuberculosis across different age groups | |
| Brys et al. | Serum interleukin-6 and endotoxin levels and their relationship with fatigue and depressive symptoms in patients on chronic haemodialysis | |
| US20250003969A1 (en) | Methods to identify and treat subjects having corticosteroid-resistant inflammatory diseases | |
| Goggs et al. | Serial analysis of blood biomarker concentrations in dogs with pneumonia, septic peritonitis, and pyometra | |
| Lazzaro et al. | The interplay between host defense, infection, and clinical status in septic patients: a narrative review | |
| Zhang et al. | Circulating CD14+ CD163+ CD115+ M2 monocytes are associated with the severity of new onset severe acute pancreatitis in Chinese patients | |
| Sakalauskiene et al. | Peripheral blood leukocytes interleukin-1 beta (IL-1β) cytokine hyper-reactivity in chronic periodontitis | |
| RU2587327C2 (ru) | Способ диагностики in vitro специфической сенсибилизации организма к бактериальным аллергенам | |
| Ay et al. | Serum intestinal fatty acid-binding protein and calprotectin concentrations to assess clinical severity and prognosis of canine parvovirus enteritis | |
| Kahveci et al. | The role of plasma presepsin levels in determining the incidence of septic shock and mortality in patients with sepsis | |
| RU2289138C2 (ru) | Способ аллергодиагностики по показателям хемилюминесцентного свечения нейтрофилов | |
| EP2598650B1 (en) | Diagnosis of bacterial meningitis based on the measure of ros production in a sample of cerebrospinal fluid | |
| Soud et al. | New era “soluble triggering receptor expressed on myeloid cells-I” as a marker for early detection of infection in trauma patients | |
| Pellon et al. | Fungal infection drives metabolic reprogramming in epithelial cells via aerobic glycolysis and an alternative TCA cycle shunt | |
| Berlina et al. | Monitoring antibiotics and inflammatory markers in human blood: impact in choice of antibiotic therapy and used methods | |
| RU2366953C2 (ru) | Биохемилюминесцентный способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов | |
| WEINSTEIN et al. | Sulfonamide Blood Levels and Serum Antibacterial Activity: Studies of Relationships at Chemically Determined Blood Levels | |
| RU2143696C1 (ru) | Способ выявления сенсибилизации к лекарственным аллергенам | |
| Amer et al. | Comparison of the in vitro activities of ceftazidime/avibactam with other drugs used to treat carbapenem-resistant Enterobacteriaceae | |
| Gao et al. | Transcriptomic analysis of key genes and signaling pathways in sepsis-associated intestinal mucosal barrier damage | |
| Priyadarshini et al. | Expression of NLRC4 Inflammasome and Its Correlation with Treponema denticola in Stage III/IV Periodontitis with Type II Diabetes Mellitus | |
| ASMAA et al. | Presepsin: A anew marker for early diagnosis of septicemia | |
| Sherkatolabbasieh et al. | Serum Procalcitonin level and other biological markers in children with bacterial or non-bacterial meningitis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201120 |