RU2577882C1 - Medium of cryopreservation of bull semen and method of its preparation - Google Patents
Medium of cryopreservation of bull semen and method of its preparation Download PDFInfo
- Publication number
- RU2577882C1 RU2577882C1 RU2014134592/13A RU2014134592A RU2577882C1 RU 2577882 C1 RU2577882 C1 RU 2577882C1 RU 2014134592/13 A RU2014134592/13 A RU 2014134592/13A RU 2014134592 A RU2014134592 A RU 2014134592A RU 2577882 C1 RU2577882 C1 RU 2577882C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- medium
- cryopreservation
- bull
- seed
- fructose
- Prior art date
Links
- 244000309464 bull Species 0.000 title claims abstract description 40
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 7
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 title abstract description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 51
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 47
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims abstract description 41
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 36
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 23
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims abstract description 18
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims abstract description 18
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000008347 soybean phospholipid Substances 0.000 claims abstract description 18
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims abstract description 17
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims abstract description 15
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 claims description 28
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 claims description 28
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 claims description 24
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 claims description 24
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 21
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 19
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 10
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 7
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 7
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 claims description 6
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 claims description 6
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims description 5
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 5
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 4
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 claims description 4
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 claims description 4
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000131522 Citrus pyriformis Species 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 claims description 3
- 229920001992 poloxamer 407 Polymers 0.000 claims description 3
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 claims description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 abstract description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 abstract description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000012458 free base Substances 0.000 abstract 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 53
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 33
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 21
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 17
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 17
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 17
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 15
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 15
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 15
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 10
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 10
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 10
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 10
- -1 or F168) Polymers 0.000 description 9
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 9
- 102220631423 Very-long-chain (3R)-3-hydroxyacyl-CoA dehydratase 1_A61D_mutation Human genes 0.000 description 8
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 7
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 7
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 5
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 5
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 5
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 5
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 5
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 4
- 210000000991 chicken egg Anatomy 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 3
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 3
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 3
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 3
- PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 1-hexadecanoyl-2-octadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[C@@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 2
- QHQZEEGNGSZBOL-UHFFFAOYSA-N 2-(aminomethyl)-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(CO)(CO)CO QHQZEEGNGSZBOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061041 Chlamydial infection Diseases 0.000 description 2
- 241000498849 Chlamydiales Species 0.000 description 2
- 206010028470 Mycoplasma infections Diseases 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000008344 egg yolk phospholipid Substances 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 230000005672 electromagnetic field Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 230000019100 sperm motility Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- WOEPIQOANYGRGK-RJMJUYIDSA-N (2R,3R,4S,5R,6S)-2-(hydroxymethyl)-6-[(2R,3S,4R,5R)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane-3,4,5-triol propane-1,2,3-triol Chemical compound OCC(O)CO.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O WOEPIQOANYGRGK-RJMJUYIDSA-N 0.000 description 1
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- VIGOAHUTMBFPMD-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid propane-1,2,3-triol Chemical compound OCC(O)CO.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O VIGOAHUTMBFPMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 108010040201 Polymyxins Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- JHECKPXUCKQCSH-UHFFFAOYSA-J calcium;disodium;2-[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].[Ca+2].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O JHECKPXUCKQCSH-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 239000008150 cryoprotective solution Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 229960005150 glycerol Drugs 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 150000004677 hydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 1
- 229960001375 lactose Drugs 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229960002900 methylcellulose Drugs 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005502 peroxidation Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000013630 prepared media Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 235000011083 sodium citrates Nutrition 0.000 description 1
- AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L sodium thiosulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=S AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019345 sodium thiosulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000020712 soy bean extract Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- YTSDVWYUJXKXCC-UHFFFAOYSA-L zinc;2-[2-[carboxylatomethyl(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetate Chemical compound [Zn+2].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O YTSDVWYUJXKXCC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/10—Preservation of living parts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61D—VETERINARY INSTRUMENTS, IMPLEMENTS, TOOLS, OR METHODS
- A61D19/00—Instruments or methods for reproduction or fertilisation
- A61D19/02—Instruments or methods for reproduction or fertilisation for artificial insemination
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к ветеринарии, в частности к искусственному осеменению крупного рогатого скота.The invention relates to veterinary medicine, in particular to artificial insemination of cattle.
Известны среда для замораживания семени быка, включающая в себя лактозу, глицерин, пенициллин, стрептомицин, полимиксин, ЭДТА-кальций, ЭДТА-цинк, ЭДТА-меди, воду и желток куриных яиц (патент RU 2355358, A61D 19/02, опубл. 20.05.2009);Known media for freezing bull's seed, including lactose, glycerin, penicillin, streptomycin, polymyxin, EDTA-calcium, EDTA-zinc, EDTA-copper, water and chicken egg yolk (patent RU 2355358, A61D 19/02, publ. 20.05 .2009);
среда для разбавления и замораживания семени быков, содержащая фруктозу, цитрат натрия, TRIS, липопротеины низкой плотности из свежего желтка, глицерин, пенициллин и дистиллированную воду (патент CN 101220345, C12N 5/6, опубл. 16.07.2008);medium for dilution and freezing of bull seed containing fructose, sodium citrate, TRIS, low-density lipoproteins from fresh yolk, glycerin, penicillin and distilled water (patent CN 101220345,
среда для разбавления и замораживания семени быков, содержащая лактозу, глицерин, антиоксиданты - сорбит или тиосульфат натрия и желток (патент UA 10894, A61D 19/02, опубл. 29.12.1999);a medium for diluting and freezing bull seed, containing lactose, glycerin, antioxidants - sorbitol or sodium thiosulfate and yolk (patent UA 10894, A61D 19/02, publ. 29.12.1999);
среда для разбавления и замораживания семени быков, содержащая лактозу, желток куриных яиц, глицерин, цитрат натрия, дистиллированную воду и тканевый экстракт, полученный из половых органов коров (патент UA 31304, A61D 19/02, 10.04.2008).medium for dilution and freezing of bull seed containing lactose, chicken egg yolk, glycerin, sodium citrate, distilled water and tissue extract obtained from the genitals of cows (patent UA 31304, A61D 19/02, 04/10/2008).
Известен способ подготовки семени животных производителей к ее использованию, включающий смешивание лактозы, лимонной кислоты, трис-(оксиметил)-аминометана, глицерина, бромида-N, воды и желтка куриных яиц, смешивание со спермой и замораживание полученной смеси (патент RU №2393816, A61D 19/02, опубл. 10.07.2010).A known method of preparing the seed of animal producers for its use, including mixing lactose, citric acid, tris (oxymethyl) aminomethane, glycerol, bromide-N, water and yolk of chicken eggs, mixing with sperm and freezing the mixture (patent RU No. 2393816, A61D 19/02, publ. 07/10/2010).
Известен способ обработки семени быка, когда в лактозо-глицерино-желточную среду вводят сукцинат хитозана и полученной синтетической средой разбавляют цельную сперму быка (патент RU №2223718, A61D 19/02, опубл. 20.02.2004).A known method of treating bull seed is when chitosan succinate is introduced into the lactose-glycerol-vitelline medium and whole bull sperm is diluted with the resulting synthetic medium (patent RU No. 2223718, A61D 19/02, publ. 02.20.2004).
Однако все вышеописанные среды содержат вещество животного происхождения (желток куриного яйца), который при высокой криозащитной эффективности обладает рядом существенных недостатков: непостоянство состава, сложность стерилизации, быстрая потеря криозащитных свойств при хранении, способность вызывать иммунную сенсибилизацию при введении в половые пути самки, опасность патогенной передачи вирусов.However, all of the above media contain a substance of animal origin (chicken egg yolk), which, with high cryoprotective efficiency, has a number of significant drawbacks: inconstancy of composition, difficulty in sterilization, rapid loss of cryoprotective properties during storage, the ability to cause immune sensitization when introduced into the genital tract of a female, and the danger of pathogenic virus transmission.
Известен способ криоконсервации животных клеток и тканей, включающий смешивание фруктозы, лимонной кислоты, трис-(гидроксиметил)-аминоэтана, глицерина, очищенной воды и фосфотидилхолина из фосфолипидов сои (патент WO 2003/022046 A1, A01N 1/02, опубл. 20.03.2003);A known method of cryopreservation of animal cells and tissues, comprising mixing fructose, citric acid, tris- (hydroxymethyl) aminoethane, glycerin, purified water and phosphotidylcholine from soybean phospholipids (patent WO 2003/022046 A1, A01N 1/02, publ. 20.03.2003 );
известен способ криоконсервации животных клеток и тканей, включающий смешивание клеток и тканей фруктозы, лимонной кислоты, трис-(гидроксиметил)-аминоэтана, глицерина, очищенной воды, гиалуроновой кислоты и фосфолипидов сои с животными клетками, в том числе семенем быка сои (патент US 2003/0077566 A1, A01N 1/02, опубл. 24.04.2003).A method of cryopreservation of animal cells and tissues is known, including mixing cells and tissues of fructose, citric acid, tris (hydroxymethyl) aminoethane, glycerin, purified water, hyaluronic acid and soybean phospholipids with animal cells, including soybean seed (patent US 2003 (0077566 A1, A01N 1/02, publ. 04.24.2003).
Однако все известные способы не обеспечивают длительного хранения среды для криоконсервации, т.к. разработанные способы не включают стерилизацию среды для криоконсервации, также среда для криоконсервации содержит лецитин в виде грубой суспензии, что делает среду для криоконсервации совершенно непрозрачной, что крайне затрудняет визуальный анализ качества замороженно-оттаяного семени.However, all known methods do not provide long-term storage of the environment for cryopreservation, because the developed methods do not include sterilization of the cryopreservation medium, and the cryopreservation medium also contains lecithin in the form of a coarse suspension, which makes the cryopreservation medium completely opaque, which makes visual analysis of the quality of the frozen-thawed seed extremely difficult.
Известны способы приготовления среды для разбавления семени производителей: способ, включающий смешивание углеводных, криогенно-протекторных и липидно-белковых компонентов в водной среде с последующей стерилизацией раствора разбавителя, при этом стерилизацию раствора разбавителя осуществляют в герметично закрытых емкостях электромагнитным полем определенной частоты, удельной энергоемкости при температуре нагрева 70-75°C (патент RU 1769422, 6 A61D 19/02, опубл. 27.06.1995);Known methods of preparing a medium for diluting the seeds of producers: a method comprising mixing carbohydrate, cryogenic-protective and lipid-protein components in an aqueous medium followed by sterilization of a diluent solution, while sterilizing the diluent solution is carried out in hermetically sealed containers with an electromagnetic field of a certain frequency, specific energy consumption at a heating temperature of 70-75 ° C (
способ, включающий смешивание углеводных, криогенно-протекторных и липидно-белковых компонентов в водной среде, при этом смесь компонентов герметизируют в емкостях, которые помещают в водную среду с температурой 18-20°C и воздействуют на смесь электромагнитным полем СВЧ-диапазона, затем данные емкости выдерживают в течение 16-20 часов, а потом осуществляют их нагрев до 58-60°C в течение 20-25 мин (патент RU 2073499, A61D 19/02, опубл. 20.02.1997).a method comprising mixing carbohydrate, cryogenic-protective and lipid-protein components in an aqueous medium, the mixture of components being sealed in containers that are placed in an aqueous medium with a temperature of 18-20 ° C and affect the mixture with an electromagnetic field of the microwave range, then the data the containers are kept for 16-20 hours, and then they are heated to 58-60 ° C for 20-25 minutes (patent RU 2073499, A61D 19/02, publ. 02.20.1997).
Основными недостатками этих решений являются необходимость наличия сложной дорогостоящей техники, и, следовательно, высокая стоимость затрат на их выполнение, а также непостоянство состава среды и недостаточная для полного уничтожения патогенных микроорганизмов, вызывающих хламидийную и микоплазменную инфекции, степень стерилизации.The main disadvantages of these solutions are the need for complex and expensive equipment, and, therefore, the high cost of their implementation, as well as the inconsistency of the composition of the medium and insufficient for the complete destruction of pathogenic microorganisms that cause chlamydial and mycoplasma infections, the degree of sterilization.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является синтетическая среда для замораживания семени быка, которая включает в себя трис-(гидроксиметил)-аминометан - 2,65-2,85%, фруктоза - 0,70-0,80%, лимонная кислота - 1,3-1,5%, глицерин - 5-7%, сухой соевый лецитин Центролекс Ф - 8-12%, вода дистиллированная - остальное (патент RU 2323701, A61D 19/02, опубл. 10.05.2008).The closest in technical essence and the achieved positive effect is a synthetic environment for freezing bull seed, which includes tris- (hydroxymethyl) aminomethane - 2.65-2.85%, fructose - 0.70-0.80%, lemon acid - 1.3-1.5%, glycerin - 5-7%, dry soya lecithin Centrolex F - 8-12%, distilled water - the rest (patent RU 2323701, A61D 19/02, publ. 10.05.2008).
Данная среда, взятая в качестве прототипа, готовится следующим способом. В чистую химическую колбу вносят по рецепту трис-(гидроксиметил)-аминометан, фруктозу, лимонную кислоту и заливают прокипяченной дистиллированной водой с температурой 80-90°C. Тщательно растворяют все компоненты. Затем раствор охлаждают до 40°C и вносят туда глицерин и сухой соевый лецитин. Соевый лецитин в предложенном варианте криозащитной среды гидратируется спонтанно и образует крупные липосомы со средним диаметром более 1000 нм.This environment, taken as a prototype, is prepared in the following way. Tris (hydroxymethyl) aminomethane, fructose, citric acid are added to a clean chemical flask according to the recipe and poured with boiled distilled water at a temperature of 80-90 ° C. Thoroughly dissolve all components. Then the solution is cooled to 40 ° C and glycerol and dry soya lecithin are added there. Soy lecithin in the proposed variant of the cryoprotective medium hydrates spontaneously and forms large liposomes with an average diameter of more than 1000 nm.
Среда обладает высокой криозащитной эффективностью, не содержит компонентов животного происхождения, что обеспечивает ее санитарно-эпидемиологическую безопасность, но обладает двумя существенными недостатками. Данная среда не предназначена для длительного хранения и предполагает использование в течение 6 ч после приготовления; среда содержит лецитин в виде грубой суспензии, что делает среду совершенно непрозрачной. Это свойство среды затрудняет визуальный анализ качества замороженно-оттаяного семени и делает невозможным использование более прогрессивного инструментального анализа качества семени, требующего оптически прозрачной среды.The medium has high cryoprotective efficiency, does not contain components of animal origin, which ensures its sanitary and epidemiological safety, but has two significant drawbacks. This medium is not intended for long-term storage and is intended for use within 6 hours after preparation; the medium contains lecithin in the form of a coarse suspension, which makes the medium completely opaque. This property of the medium complicates the visual analysis of the quality of the frozen-thawed seed and makes it impossible to use a more advanced instrumental analysis of the quality of the seed, which requires an optically transparent medium.
Целью изобретения является повышение биологической безопасности синтетической среды для криоконсервации семени быка и повышение ее технологических свойств (прозрачность, увеличение срока хранения).The aim of the invention is to increase the biological safety of the synthetic environment for cryopreservation of bull seed and increase its technological properties (transparency, increase shelf life).
Технический результат изобретения достигается тем, что предложена среда для криоконсервации семени быка, включающая трис-(гидроксиметил)-аминометан, фруктозу, лимонную кислоту, сахарозу, глицерин, сухой соевый лецитин (фосфолипиды сои), в качестве источника которого могут выступать коммерческий растительный лецитин разных марок (Липоид C75, Липоид C100, Липоид C40, Азолектин, Леци-Про-90, Лецигран и бидистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит высокомолекулярное нетоксическое поверхностно-активное вещество, в качестве которого используют метилцеллюлозу, или плуроник (F68, или F127, или F168), или каррагинан, или альгинат натрия, или гиалуроновую кислоту, или бычий сывороточный альбумин при следующих соотношениях компонентов, мас.%:The technical result of the invention is achieved by the fact that the proposed environment for cryopreservation of bull seed, including tris- (hydroxymethyl) -aminomethane, fructose, citric acid, sucrose, glycerin, dry soya lecithin (soybean phospholipids), which can be used as a source of commercial vegetable lecithin of various brands (Lipoid C75, Lipoid C100, Lipoid C40, Azolectin, Lezi-Pro-90, Lecigran and bidistilled water, characterized in that it additionally contains a high molecular weight non-toxic surfactant, as Which uses methyl cellulose, or pluronic (F68, or F127, or F168), or carrageenan, or sodium alginate, or hyaluronic acid, or bovine serum albumin in the following ratios of components, wt.%:
Предложен способ приготовления среды для криоконсервации семени быка, включающий приготовление безлипидной основы среды для криоконсервации семени быка путем разведения в горячей бидистилированной воде с температурой 80-90°C трис-(гидроксиметил)-аминометана, лимонной кислоты, фруктозы, добавления глицерина и охлаждения до комнатной температуры, доведения pH раствора до 6,8, отличающийся тем, что отдельно готовят липосомальный концентрат посредством добавления в 10%-ный раствор сахарозы 0,2-20,0 мас.% фосфолипидов сои, поверхностно-активное вещество, выдерживают при комнатной температуре, периодически помешивая 4-24 часа, затем обрабатывают суспензию на ультразвуковом дезинтеграторе в течение 5-30 минут и смешивают безлипидную основу среды для криоконсервации семени быка и липосомальный концентрат в соотношении 4:1, стерилизуют автоклавированием при температуре 115°C и давлении 1,4 атмосферы в течение 1 часа или стерилизуют фильтрацией через фильтр с порами 0,22 мкм.A method of preparing a medium for cryopreservation of bull seed is proposed, which includes preparing a non-lipid base for the medium for cryopreservation of bull seed by diluting tris- (hydroxymethyl) -aminomethane, citric acid, fructose, adding glycerin and cooling to room temperature in hot bidistilled water at a temperature of 80-90 ° C temperature, bringing the pH of the solution to 6.8, characterized in that the liposome concentrate is separately prepared by adding 0.2-20.0 wt.% soy phospholipids to a 10% sucrose solution, a surfactant the substance is kept at room temperature, stirring occasionally for 4-24 hours, then the suspension is treated with an ultrasonic disintegrator for 5-30 minutes and the non-lipid base medium for cryopreservation of bull seed and liposome concentrate are mixed in a ratio of 4: 1, sterilized by autoclaving at a temperature of 115 ° C and a pressure of 1.4 atmospheres for 1 hour or sterilized by filtration through a 0.22 μm pore filter.
Общеизвестно, что для замораживания семени быка в основном используют среды, содержащие яичный желток. Яичный желток снижает чувствительность сперматозоидов к холодовому шоку и замораживаию. Носитель криозащитных свойств яичного желтка - легкая липопротеиновая фракция желтка. Основная часть легких липопротеинов ЯЖ организованна в небольшие конгломераты со средней молекулярной массой около 5×106 (Cook, Martin, 1969). Легкая липопротеиновая фракция желтка состоит из фосфолипидов (яичного лецитина) и белковой компоненты. Полагают, что криопротекторными свойствами обладает яичный лецитин. У очищенных белков легкой липопротеиновой фракции не обнаружено криопротекторных свойств. Тем не менее очищенные яичные фосфолипиды обладают более слабыми криозащитными свойствами по сравнению с полной фракцией легких липопротеинов. Яичный желток обладает высокой эффективностью в защите сперматозоидов от холодового шока как при охлаждении, так и при замораживании. Достаточно сказать, что удаление яичного желтка из стандартной среды для замораживания семени быка приводит к падению выживаемости сперматозоидов в цикле замораживания-оттаивания примерно в 6 раз, в то время как удаление из той же среды традиционного криопротектора - глицерина - только в 2 раза. Но, при высокой криозащитной эффективности желток обладает целым рядом нежелательных свойств: непостоянство состава, сложность стерилизации, быстрая потеря криозащитных свойств при хранении (несколько часов), способность вызывать иммунную сенсибилизацию при введении в половые пути самки. Кроме того, в последнее время в связи с массовым импортом племенных быков в Россию участились случаи абортов, вызванных хламидийной и микоплазменной инфекциями. В настоящее время нет четкой методики выявления возбудителей данных инфекций, а применяемая реакция цепной полимеризации не всегда дает возможности видового определения возбудителя. Таким образом, желток куриного яйца при наличии в нем антител к микоплазме часто является причиной выбраковки доброкачественной криоконсервированной семени быков-производителей.It is well known that media containing egg yolk are mainly used to freeze bull seed. Egg yolk reduces sperm sensitivity to cold shock and freezing. The carrier of the cryoprotective properties of the egg yolk is a light lipoprotein fraction of the yolk. The main part of the lung lipoproteins of SJ is organized into small conglomerates with an average molecular weight of about 5 × 106 (Cook, Martin, 1969). The light lipoprotein fraction of the yolk consists of phospholipids (egg lecithin) and a protein component. It is believed that egg lecithin has cryoprotective properties. The purified proteins of the light lipoprotein fraction showed no cryoprotective properties. Nevertheless, purified egg phospholipids have weaker cryoprotective properties compared to the full fraction of light lipoproteins. Egg yolk is highly effective in protecting spermatozoa from cold shock during both cooling and freezing. Suffice it to say that the removal of egg yolk from a standard medium for freezing bull seed leads to a decrease in sperm survival in the freeze-thaw cycle by about 6 times, while the removal of the traditional cryoprotectant, glycerol, from the same medium is only 2 times. But, with high cryoprotective efficiency, the yolk has a number of undesirable properties: inconstancy of composition, difficulty in sterilization, rapid loss of cryoprotective properties during storage (several hours), and the ability to induce immune sensitization when a female is introduced into the genital tract. In addition, in recent years, in connection with the massive import of breeding bulls into Russia, cases of abortion caused by chlamydial and mycoplasma infections have become more frequent. Currently, there is no clear methodology for identifying the causative agents of these infections, and the chain polymerization reaction used does not always provide the possibility of species-specific determination of the pathogen. Thus, the yolk of a chicken egg in the presence of antibodies to mycoplasma in it is often the reason for rejection of the benign cryopreserved seed of manufacturing bulls.
Наиболее перспективным заменителем желтка является фосфолипиды растительного происхождения (соевый лецитин). Известно, что криозащитная эффективность фосфолипидов существенно зависит от формы организации фосфолипидных частиц в криопротектирующем растворе. Мы предлагаем вводить растительные фосфолипиды в виде липосом малого размера (30-350 нм). Лецитин в виде липосом малого размера образует более стабильную суспензию, не склонен к образованию осадка, легче взаимодействует с мембраной сперматозоида. Кроме того, фосфолипиды в виде липосом малого размера позволяет получить оптически прозрачную суспензию, что важно для визуальной и инструментальной оценки качества семени, разбавленного криосредой. Помимо фосфолипидов в среду вводится высокомолекулярное повехностно-активное веществово. Таким веществом может быть сухой очищенный альбумин либо высокомолекулярные поверхностно-активные вещества небелковой природы, а именно метилцеллюлоза, альгинат натрия, гиалуроновая кислота, каррагинан, плуроник и некоторые другие. Перечисленные вещества не только стабилизируют липосомы, но и меняют взаимодействие липосом с клеточной мембраной сперматозоида, повышая криозащитный эффект липосом.The most promising substitute for yolk is plant-derived phospholipids (soya lecithin). It is known that the cryoprotective effectiveness of phospholipids significantly depends on the organization form of phospholipid particles in a cryoprotective solution. We propose to introduce plant phospholipids in the form of small liposomes (30-350 nm). Lecithin in the form of small liposomes forms a more stable suspension, is not prone to the formation of sediment, interacts more easily with the sperm membrane. In addition, phospholipids in the form of small liposomes make it possible to obtain an optically transparent suspension, which is important for visual and instrumental assessment of the quality of the seed diluted with cryomedium. In addition to phospholipids, a high molecular weight surfactant is introduced into the medium. Such a substance can be dry purified albumin or high molecular weight surfactants of a non-protein nature, namely methyl cellulose, sodium alginate, hyaluronic acid, carrageenan, pluronic and some others. The listed substances not only stabilize liposomes, but also change the interaction of liposomes with the sperm cell membrane, increasing the cryoprotective effect of liposomes.
Приготовление среды для криоконсервации семени быка заключалось в следующем.The preparation of the medium for cryopreservation of bull seed was as follows.
Готовят безлипидную основу криозащитной среды для семени быка. Для этого в горячей бидистилированной воде с температурой 80-90°C разводят трис-(гидроксиметил)-аминометан, лимонной кислоту, фруктозу, глицерина. Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры, доводят pH раствора до 6,8.A non-lipid base is prepared for the cryoprotective environment for bull seed. To do this, tris (hydroxymethyl) aminomethane, citric acid, fructose, and glycerol are diluted in hot bidistilled water with a temperature of 80-90 ° C. The resulting solution was cooled to room temperature, the pH of the solution was adjusted to 6.8.
Дополнительно готовят липосомальный концентрат следующего состава: сахароза 9-10 г, фосфолипиды сои (коммерческий соевый лецитин марок Липоид C75, Липоид C100, Липоид C40, Азолектин, Леци-Про-90, Лецигран) 0,2-10 г. Для получения суспензии фосфолипидов навеску сухого лецитина в растворе сахарозы и выдерживают при комнатной температуре, периодически помешивая 4-24 часа. После гидратации лецитина в течение указанного времени получают первичную грубодисперсную суспензию фосфолипидов, содержащую мультиламмелярные липосомы со средним диаметром 1000-2000 нм (размер зависит от длительности гидратации, интенсивности помешивания и температуры раствора). Первичную грубодисперсную суспензию обрабатывают на ультразвуковом дезинтеграторе в течение 5-30 минут. В результате обработки ультразвуком крупные липосомы в суспензии дробятся и переходят в форму преимущественно моноламмелярных липосом со средним диаметром 30-350 нм. Затем к суспензии липосом добавляют стабилизатор, в качестве которого может выступать: метилцеллюлоза в концентрации 0,05-0,25%, или плуроник (F68, или F127, или F168) в концентрации 0.05-0.25%, или каррагинан в концентрации 0,05-0,25%, или альгинат натрия в концентрации 0,05-0,5%), или гиалуроновая кислота в концентрации 0,1-0,5%), или бычий сывороточный альбумин в концентрации 1-5%).Additionally, a liposome concentrate of the following composition is prepared: sucrose 9-10 g, soy phospholipids (commercial soy lecithin of the brands Lipoid C75, Lipoid C100, Lipoid C40, Azolectin, Lezi-Pro-90, Lecigran) 0.2-10 g. To obtain a suspension of phospholipids a portion of dry lecithin in a solution of sucrose and incubated at room temperature, stirring occasionally for 4-24 hours. After hydration of lecithin for a specified time, an initial coarse suspension of phospholipids is obtained containing multilamellar liposomes with an average diameter of 1000-2000 nm (the size depends on the duration of hydration, the intensity of stirring, and the temperature of the solution). The primary coarse suspension is treated on an ultrasonic disintegrator for 5-30 minutes. As a result of ultrasonic treatment, large liposomes in suspension are crushed and transform into the form of predominantly monolamellar liposomes with an average diameter of 30-350 nm. Then, a stabilizer is added to the suspension of liposomes, which can be: methyl cellulose at a concentration of 0.05-0.25%, or pluronic (F68, or F127, or F168) at a concentration of 0.05-0.25%, or carrageenan at a concentration of 0.05 -0.25%, or sodium alginate at a concentration of 0.05-0.5%), or hyaluronic acid at a concentration of 0.1-0.5%), or bovine serum albumin at a concentration of 1-5%).
Приготовленную безлипидную основу (первого либо второго вариантов) смешивают с липосомальным концентратом в соотношении 4:1.The prepared non-lipid base (first or second options) is mixed with liposome concentrate in a ratio of 4: 1.
Полученную криозащитную среду для семени быка можно использовать без дополнительной обработки либо подвергнуть стерилизации.The obtained cryoprotective environment for bull seed can be used without additional processing or sterilized.
Метод стерилизации зависит от разновидности добавляемого стабилизатора и от среднего размера частиц, который находится в зависимости от конкретной марки коммерческих лецитинов и от режима ультразвуковой обработки.The sterilization method depends on the type of stabilizer added and on the average particle size, which depends on the particular brand of commercial lecithins and on the ultrasonic treatment regimen.
Криозащитную среду стерилизуют фильтрацией или автоклавированием. Криозащитную среду стерилизуют фильтрацией через фильтр с порами 0,22 нм. Метод пригоден для суспензии липосом со средним размером частиц примерно до 150-170 нм. При более высоком среднем размере частиц в суспензии фильтры быстро забиваются и дальнейшая фильтрация становится невозможной.The cryoprotective medium is sterilized by filtration or autoclaving. The cryoprotective medium is sterilized by filtration through a 0.22 nm filter. The method is suitable for suspension of liposomes with an average particle size of up to about 150-170 nm. With a higher average particle size in the suspension, the filters clog quickly and further filtering becomes impossible.
Криозащитную среду стерилизуют автоклавированием при температуре 115°C и давлении 1,4 атмосферы в течение 1 часа. Более высокотемпературное автоклавирование недопустимо, т.к. будет вызывать карамелизацию сахаров. Автоклавирование недопустимо, если в качестве стабилизатора липосом используют бычий сывороточный альбумин.Cryoprotective medium is sterilized by autoclaving at a temperature of 115 ° C and a pressure of 1.4 atmospheres for 1 hour. Higher temperature autoclaving is unacceptable, as will cause caramelization of sugars. Autoclaving is unacceptable if bovine serum albumin is used as a liposome stabilizer.
Готовую среду хранят при температуре +4°C в темном месте, т.к. свет и высокие температуры могут вызвать перекисное окисление в липосомах. Без стерилизации среда сохраняет стабильность и криозащитные свойства не менее 5 дней. Стерилизация может увеличивать срок хранения готовой криозащитной среды для семени быка до 2-3 месяцев.The finished medium is stored at a temperature of + 4 ° C in a dark place, because light and high temperatures can cause peroxidation in liposomes. Without sterilization, the medium remains stable and cryoprotective for at least 5 days. Sterilization can increase the shelf life of the finished cryoprotective environment for bull seed up to 2-3 months.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.
Пример 1. Определение размера частиц в суспензии соевых фосфолипидов марки Lecy-Pro-90 в растворе сахарозы.Example 1. The determination of particle size in a suspension of soybean phospholipids of the brand Lecy-Pro-90 in a solution of sucrose.
В эксперименте использовали пищевой лецитин марки Lecy-Pro-90, приобретенные в компании «Протеин плюс». Первичную (грубодисперсную) суспензию «сухого лецитина» Lecy-Pro-90 получали спонтанной гидратацией сухого лецитина. Известно, что «сухие» соевые лецитины, которые содержат не менее 95% полярных липидов, способны при помещении в водную среду спонтанно образовывать суспензию, состоящую из мультиламеллярных липосом. Для получения суспензии навеску сухого лецитина Lecy-Pro-90 из расчета 6% помещали в раствор сахарозы и выдерживали при комнатной температуре, при постоянном помешивании 4 часа. Затем часть суспензии помещали в холодильник (+4°C) на 20-24 часа. В течение этого времени происходит практически полная гидратация лецитина и образуется суспензия, содержащая мультламеллярные липосомы. Данную суспензию далее называем суспензий, полученной спонтанной гидратацией. Вторую часть подвергали обработке ультразвуком на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т. Суспензию обрабатывали ультразвуком 22 Гц, 60 Вт/см2 в течение 5 минут при помощи погружного зонда с диаметром торца 2 мм. Для предотвращения окисления лецитина во время ультразвуковой обработки суспензию охлаждали до +10°C на ледяной бане. Затем полученную суспензию хранили в холодильнике (+4°C) до измерений. Данный раствор далее назван суспензией, полученной ультразвуковым дроблением.In the experiment used food lecithin brand Lecy-Pro-90, purchased in the company "Protein plus". The primary (coarse) suspension of Lecy-Pro-90 “dry lecithin” was obtained by spontaneous hydration of dry lecithin. It is known that “dry” soya lecithins, which contain at least 95% polar lipids, are capable of spontaneously forming a suspension of multilamellar liposomes when placed in an aqueous medium. To obtain a suspension, a sample of Lecy-Pro-90 dry lecithin at the rate of 6% was placed in a sucrose solution and kept at room temperature with constant stirring for 4 hours. Then part of the suspension was placed in a refrigerator (+ 4 ° C) for 20-24 hours. During this time, almost complete hydration of lecithin occurs and a suspension containing multamellar liposomes forms. This suspension is hereinafter referred to as suspensions obtained by spontaneous hydration. The second part was subjected to sonication on an ultrasonic disintegrator UZDN-2T. The suspension was treated with ultrasound at 22 Hz, 60 W / cm 2 for 5 minutes using an immersion probe with an end diameter of 2 mm. To prevent lecithin oxidation during ultrasonic treatment, the suspension was cooled to + 10 ° C in an ice bath. Then, the resulting suspension was stored in a refrigerator (+ 4 ° C) until measurements. This solution is hereinafter referred to as a suspension obtained by ultrasonic crushing.
Измерение размеров частиц проводили через сутки после приготовления.Particle sizes were measured one day after preparation.
Размеры липосом или липидных мицелл в полученной суспензии определяли методом измерения динамического светорассеяния на анализаторе размеров субмикронных частиц «N5 Submicron Particle Size Analyser «BeckmanCoulter». Размеры липидных частиц в суспензии определяли через 1 сутки после приготовления. Также визуально оценивали внешний вид суспензии.The sizes of liposomes or lipid micelles in the resulting suspension were determined by measuring dynamic light scattering on a BeckmanCoulter N5 Submicron Particle Size Analyzer. The sizes of lipid particles in suspension were determined 1 day after preparation. The appearance of the suspension was also visually evaluated.
Результаты измерений представлены в таблице 1.The measurement results are presented in table 1.
Помимо исследования характеристик суспензии были сделаны визуальные исследования сперматозоидов в 5% суспензии лецитина LeCy-Pro-90, полученной спонтанной гидратацией и в 1% суспензии лецитина LeCy-Pro-90, полученной ультразвуковым дроблением. Как видно на фиг.1, суспензия, обработанная ультразвуком, не препятствует визуальному исследованию сперматозоидов (фиг. 1б), в то время как в суспензии, полученной спонтанной гидратацией, сперматозоиды трудно различимы (фиг.1а).In addition to studying the characteristics of the suspension, visual studies of spermatozoa were made in a 5% LeCy-Pro-90 lecithin suspension obtained by spontaneous hydration and in a 1% LeCy-Pro-90 lecithin suspension obtained by ultrasonic crushing. As can be seen in figure 1, the suspension treated with ultrasound does not interfere with the visual examination of sperm (Fig. 1B), while in the suspension obtained by spontaneous hydration, sperm are difficult to distinguish (Fig. 1a).
Пример 2. Определение оптимальной концентрации лецитина LeCy-Pro-90 в суспензии, обработанной ультразвуком для обеспечения криозащитного воздействия на сперматозоиды быка при криоконсервации.Example 2. Determination of the optimal concentration of LeCy-Pro-90 lecithin in a suspension treated with ultrasound to provide cryoprotective effects on bovine spermatozoa during cryopreservation.
В эксперименте использовали пищевые лецитины марок LeCy-Pro-90, приобретенные в компании «Протеин плюс». Суспензии лецитина готовили на основе 10% раствора сахарозы. Первичную (грубодисперсную) суспензию «сухого лецитина» LeCy-Pro-90 получали спонтанной гидратацией сухого лецитина. Для получения суспензии навеску сухого лецитина в раствор сахарозы и выдерживали при комнатной температуре, периодически помешивая 4 часа. Затем обрабатывали суспензию на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т (22 Гц, 60 Вт/см2 в течение 5 минут). Семя быков голштинской породы разбавляли 1/4 или более (в зависимости от концентрации спермиев в эякуляте) лактозо-глицериновой средой (10% лактозы, 0,2% HEPES, 5% глицерина с добавлением либо 20% яичного желтка (контроль), либо 20% липосомального концентрата с разной концентрацией липосом так, чтобы конечная концентрация липидов в среде составляла от 0,03 до 3%. Замораживание осуществляли в открытых гранулах на пластинах твердой двуокиси углерода (сухом льду) по стандартной методике (В.Н. Виноградов и др. Национальная технология замораживания и использования спермы племенных быков производителей // М., 2008, 160 с.). Оттаивание гранул проводили в растворе оттаивателя (130 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 1 мМ CaCl2, 0,5 мМ MgCl2, 14 мМ фруктозы, 10 мМ Hepes, 0,1% бычьего сывороточного альбумина) на водяной бане при температуре 39-40°C.In the experiment, food grade lecithins of the LeCy-Pro-90 grades purchased from the Protein Plus company were used. Lecithin suspensions were prepared based on a 10% sucrose solution. The primary (coarse) suspension of LeCy-Pro-90 “dry lecithin” was obtained by spontaneous hydration of dry lecithin. To obtain a suspension, a sample of dry lecithin in a sucrose solution was kept at room temperature, stirring occasionally for 4 hours. Then the suspension was processed on an ultrasonic disintegrator UZDN-2T (22 Hz, 60 W / cm 2 for 5 minutes). Seed of Holstein bulls was diluted 1/4 or more (depending on the concentration of sperm in the ejaculate) with lactose-glycerin medium (10% lactose, 0.2% HEPES, 5% glycerol with the addition of either 20% egg yolk (control) or 20 % liposome concentrate with different liposome concentrations so that the final concentration of lipids in the medium was from 0.03 to 3%. Freezing was carried out in open granules on plates of solid carbon dioxide (dry ice) according to the standard method (V.N. Vinogradov et al. National technology of freezing and using Bani sperm breeding bulls manufacturers // Moscow, 2008, 160 pp.). Thawing was performed in granules deicing solution (130 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM CaCl 2, 0.5 mM MgCl 2, 14 mM fructose, 10 mM Hepes, 0.1% bovine serum albumin) in a water bath at 39–40 ° C.
Криозащитную эффективность соевых фосфолипидов определяли по выживаемости сперматозоидов в процессе криоконсервации. О жизнеспособности судили по подвижности замороженно-оттаяной спермы через 5 минут после оттаивания и через 5 часов выдерживания замороженно-оттаяной спермы при 38°C. Подвижность определяли на спермоанализаторе "Биола" SFA-500.The cryoprotective efficacy of soybean phospholipids was determined by sperm survival during cryopreservation. Viability was judged by the mobility of frozen thawed
Результаты исследований, представленые на фиг.2, свидетельствуют, что оптимальные концентрации соевого лецитина в виде суспензии липосом со средним диаметром 80-100 нм лежат в довольно широких пределах, от 0,1 до 1% лецитина в криозащитной среде. Подвижность сперматозоидов через 10 минут после оттаивания в экспериментальных группах с указанными концентрациями не имела достоверных отличий от контрольной группы с добавлением яичного желтка.The research results presented in figure 2, indicate that the optimal concentration of soya lecithin in the form of a suspension of liposomes with an average diameter of 80-100 nm lie in a fairly wide range, from 0.1 to 1% lecithin in a cryoprotective environment.
Пример 3. Сравнение криозащитной эффективности трис-цитрат-фруктозо-глицериновой среды с яичным желтком и трис-цитрат-фруктозо-глицериновой среды с добавлением растительных фосфолипидов в виде липосом малого размера.Example 3. Comparison of the cryoprotective efficacy of tris-citrate-fructose-glycerol medium with egg yolk and tris-citrate-fructose-glycerol medium with the addition of plant phospholipids in the form of small liposomes.
В данном примере проводили сравнение криозащитного воздействия на спермин быка яичного желтка и липосомального концентрата, изготовленного из фосфолипидов сои на фоне трис-цитрат-фруктозо-глицериновой среды. В качестве контроля выступало семя быка, криоконсервированное в трис-цитрат-фруктозо-глицериновой среде с добавлением 20% яичного желтка. В эксперименте к трис-цитрат-фруктозо-глицериновой среде вместо желтка добавляли 20% липосомального концентрата следующего состава: сахароза 10 г, фосфолипиды сои (азолектин) 1,8 г, альгинат натрия 0,5 г, бидистиллированной воды 88 мл. Липосомы дробили ультразвуком на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т (22 Гц, 60 Вт/см2 в течение 5 минут).In this example, a comparison was made of the cryoprotective effect on sperm of a bull of egg yolk and a liposomal concentrate made from soy phospholipids against a background of tris-citrate-fructose-glycerol medium. The control was bull seed, cryopreserved in Tris-citrate-fructose-glycerol medium with the addition of 20% egg yolk. In the experiment, 20% liposome concentrate of the following composition was added to tris-citrate-fructose-glycerol medium instead of yolk: sucrose 10 g, soy phospholipids (azolectin) 1.8 g, sodium alginate 0.5 g, bidistilled water 88 ml. Liposomes were crushed by ultrasound on an ultrasonic disintegrator UZDN-2T (22 Hz, 60 W / cm 2 for 5 minutes).
Замораживание осуществляли в открытых гранулах на пластинах твердой двуокиси углерода (сухом льду) по стандартной методике (В.Н. Виноградов и др. Национальная технология замораживания и использования спермы племенных быков производителей // М., 2008,160 с). Оттаивание гранул проводили в растворе оттаивателя (130 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 1 мМ CaCl2, 0,5 мМ MgCl2, 14 мМ фруктозы, 10 мМ Hepes, 0,1% бычьего сывороточного альбумина) на водяной бане при температуре 39-40°C.Freezing was carried out in open granules on plates of solid carbon dioxide (dry ice) according to a standard method (V.N. Vinogradov et al. National technology for freezing and using semen from breeding bulls of producers // M., 2008, 160 s). Granules were thawed in a thawing solution (130 mm NaCl, 4 mm KCl, 1 mm CaCl 2 , 0.5 mm MgCl 2 , 14 mm fructose, 10 mm Hepes, 0.1% bovine serum albumin) in a water bath at a temperature of 39- 40 ° C.
Криозащитную эффективность соевых фосфолипидов определяли по выживаемости сперматозоидов в процессе криоконсервации. О жизнеспособности судили по подвижности замороженно-оттаяной спермы через 5 минут после оттаивания и через 5 часов выдерживания замороженно-оттаяной спермы при 38°C. Подвижность определяли на спермоанализаторе "Биола" SFA-500. Результаты эксперимента представлены в таблице 2.The cryoprotective efficacy of soybean phospholipids was determined by sperm survival during cryopreservation. Viability was judged by the mobility of frozen thawed
Как можно видеть из таблицы двигательные характеристики семени, криоконсервированного в трис-цитрат-фруктозо-глицериновой среде с яичным желтком (контроль) и с липосомальным концентратом, содержащим сахарозу, растительные фосфолипиды в виде липосом со средним диаметром 80-100 нм и альгинат натрия, не имеют достоверных различий. Так подвижность после размораживания в контроле и экспериментальной группе составила соответственно 39,5±2,8% и 36,5±1,2% подвижных сперматозоидов, подвижность через 5 часов после оттаивания 21,1±5,5% в контроле и 19,5±2,3 в экспериментальной группе. Данные свидетельствуют об эффективности предлагаемой криозащитной среды.As can be seen from the table, the motor characteristics of a seed cryopreserved in tris-citrate-fructose-glycerol medium with egg yolk (control) and with a liposome concentrate containing sucrose, plant phospholipids in the form of liposomes with an average diameter of 80-100 nm and sodium alginate, not have significant differences. So the mobility after thawing in the control and the experimental group was 39.5 ± 2.8% and 36.5 ± 1.2% of motile sperm cells, respectively,
Пример 4. Исследование влияния хранения криозащитной среды перед использованием на ее криозащитную эффективность.Example 4. The study of the effect of storage of cryoprotective medium before use on its cryoprotective effectiveness.
В эксперименте использовали семя быков Голштинской и черно-пестрой пород. Липосомальный концентрат готовили на основе 10% раствора сахарозы, в качестве источника растительных фосфолипидов использовали экстракт соевых бобов «Азолектин»(«Сигма»). Суспензию лецитина обрабатывали на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т (22 Гц, 60 Вт/см2 в течение 5 минут). После озвучивания в липосомальный концентрат в качестве стабилизатора добавляли 0,1% плуроника Р68. Использовали безлипосомальную основу следующего состава (в весовых процентах): трис-(гидроксиметил)-аминометан - 2,4; фруктоза - 0,9; лимонная кислота - 1,3; глицерин - 6, бидистиллированная вода. Безлипосомальную основу и липосомальный концентрат смешивали в соотношении 4:1. Среду стерилизовали автоклавированием при 115°C в течение 1 часа и запечатывали до использования. Среду хранили в холодильнике (+4°). Криоконсервацию семени быков проводили по стандартному методу замораживания в гранулах. Для замораживания использовали среду после 1 суток (контроль) и 10 суток хранения (В.Н. Виноградов и др. Национальная технология замораживания и использования спермы племенных быков производителей // М., 2008, 160 с.). Оттаивание гранул проводили в растворе оттаивателя (130 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 1 мМ CaCl2, 0,5 мМ MgCl2, 14 мМ фруктозы, 10 мМ Нереs, 0,1% бычьего сывороточного альбумина) на водяной бане при температуре 39-40°C.In the experiment, the seed of bulls of Holstein and black-motley breeds was used. A liposomal concentrate was prepared on the basis of a 10% sucrose solution; the soybean extract Azolectin (Sigma) was used as a source of plant phospholipids. The lecithin suspension was processed on an ultrasonic disintegrator UZDN-2T (22 Hz, 60 W / cm 2 for 5 minutes). After sonication, 0.1% pluronic P68 was added to the liposome concentrate as a stabilizer. The non-liposomal base of the following composition was used (in weight percent): tris- (hydroxymethyl) aminomethane - 2.4; fructose - 0.9; citric acid - 1.3; glycerin - 6, double-distilled water. The non-liposomal base and liposome concentrate were mixed in a 4: 1 ratio. The medium was autoclaved at 115 ° C for 1 hour and sealed until use. The medium was stored in the refrigerator (+ 4 °). Cryopreservation of bull seed was carried out according to the standard method of freezing in granules. For freezing, we used the medium after 1 day (control) and 10 days of storage (V.N. Vinogradov et al. National technology for freezing and using sperm of breeding bulls of producers // M., 2008, 160 pp.). Granules were thawed in a thawing solution (130 mm NaCl, 4 mm KCl, 1 mm CaCl 2 , 0.5 mm MgCl 2 , 14 mm fructose, 10 mm Heps, 0.1% bovine serum albumin) in a water bath at a temperature of 39- 40 ° C.
Криозащитную эффективность среды определяли по выживаемости сперматозоидов в процессе криоконсервации. О жизнеспособности судили по подвижности замороженно-оттаяной спермы через 5 минут после оттаивания и через 5 часов выдерживания замороженно-оттаяной спермы при 38°C. Подвижность определяли на спермоанализаторе "Биола" SFA-500.Cryoprotective effectiveness of the medium was determined by the survival of sperm during cryopreservation. Viability was judged by the mobility of frozen thawed
приготовления*Seed cryopreservation in the medium 1 day after
cooking *
приготовления*.Seed cryopreservation in the medium 10 days after
cooking *.
Результаты исследований, представленные в таблице 4, свидетельствуют, что среда сохраняет криозащитную эффективность в течение 10 суток хранения. Так, двигательные характеристики семени составили: после криоконсервации в свежеприготовленной среде подвижность сразу после размораживания - 80±1% подвижных сперматозоидов, подвижность через 5 часов после размораживания -15±5% подвижных сперматозоидов; после криоконсервации в среде, сохранявшейся при +4 в течение 10 суток подвижность сразу после размораживания - 79±1% подвижных сперматозоидов, подвижность через 5 часов после размораживания - 17±6% подвижных сперматозоидов Таким образом, десятидневное хранение среды с соевым лецитинов в виде липосом малого размера не влияло на ее криозащитные характеристики.The research results presented in table 4 indicate that the medium retains cryoprotective effectiveness for 10 days of storage. So, the motor characteristics of the seed were: after cryopreservation in a freshly prepared medium, the mobility immediately after thawing is 80 ± 1% of motile spermatozoa,
Предлагаемая среда имеет повышенную биологическую безопасность, т.к. не содержит в своем составе яичного желтка или других сложных компонентов животного происхождения, которые могут быть носителями опасных патогенов.The proposed environment has increased biological safety, because does not contain egg yolk or other complex components of animal origin, which can be carriers of dangerous pathogens.
В отличие от прототипа, среда с растительными лецитином в виде липосом, размером до 350 нм обладает оптической прозрачностью. Новая среда для криоконсервации семени быка не препятствует визуальному и инструментальному контролю качества семени.Unlike the prototype, a medium with plant lecithin in the form of liposomes, up to 350 nm in size, has optical transparency. The new environment for cryopreservation of bull seed does not interfere with visual and instrumental quality control of the seed.
За счет более эффективного взаимодействия липосом малого размера с клеточной мембраной сперматозоида оптимальные концентрации фосфолипида в криозащитной среде снижаются с 4-8% до 0,1-1%.Due to the more effective interaction of small liposomes with the sperm cell membrane, the optimal concentration of phospholipid in the cryoprotective medium decreases from 4-8% to 0.1-1%.
За счет высокой стабильности размеров липосом и стерилизации срок возможного использования готовой криосреды возрастает от 5 часов до 2-3-х месяцев, что позволяет оптимизировать затраты труда технологов на племпредприятиях.Due to the high stability of liposome sizes and sterilization, the period of possible use of the finished cryo-medium increases from 5 hours to 2-3 months, which allows optimizing the labor costs of technologists at breeding enterprises.
Изобретение применимо в предприятиях, деятельность которых заключается в получении и криоконсервации семени быков-производителей.The invention is applicable in enterprises whose activity is to obtain and cryopreserve the seed of bulls.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014134592/13A RU2577882C1 (en) | 2014-08-22 | 2014-08-22 | Medium of cryopreservation of bull semen and method of its preparation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014134592/13A RU2577882C1 (en) | 2014-08-22 | 2014-08-22 | Medium of cryopreservation of bull semen and method of its preparation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2577882C1 true RU2577882C1 (en) | 2016-03-20 |
Family
ID=55648055
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014134592/13A RU2577882C1 (en) | 2014-08-22 | 2014-08-22 | Medium of cryopreservation of bull semen and method of its preparation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2577882C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106106433A (en) * | 2016-06-22 | 2016-11-16 | 湖北省畜禽育种中心 | A kind of Binglangjiang waterbuffalo freezing of semen process |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997014785A2 (en) * | 1995-10-19 | 1997-04-24 | Advanced Reproduction Technologies, Inc. | Methods and compositions to improve germ cell and embryo survival and function |
| RU2323701C2 (en) * | 2006-07-05 | 2008-05-10 | ФГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт племенного дела (ВНИИплем) | Synthetic medium for bull sperm freezing |
| US20100137676A1 (en) * | 2005-04-21 | 2010-06-03 | Goldstein Glenn A | N-acetylcysteine amide (nac amide) for treatment of oxidative stress associated with infertility |
| RU2436599C2 (en) * | 2006-06-27 | 2011-12-20 | Оцука Фармасьютикал Ко., Лтд. | Powder inhaler |
-
2014
- 2014-08-22 RU RU2014134592/13A patent/RU2577882C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997014785A2 (en) * | 1995-10-19 | 1997-04-24 | Advanced Reproduction Technologies, Inc. | Methods and compositions to improve germ cell and embryo survival and function |
| US20100137676A1 (en) * | 2005-04-21 | 2010-06-03 | Goldstein Glenn A | N-acetylcysteine amide (nac amide) for treatment of oxidative stress associated with infertility |
| RU2436599C2 (en) * | 2006-06-27 | 2011-12-20 | Оцука Фармасьютикал Ко., Лтд. | Powder inhaler |
| RU2323701C2 (en) * | 2006-07-05 | 2008-05-10 | ФГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт племенного дела (ВНИИплем) | Synthetic medium for bull sperm freezing |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106106433A (en) * | 2016-06-22 | 2016-11-16 | 湖北省畜禽育种中心 | A kind of Binglangjiang waterbuffalo freezing of semen process |
| CN106106433B (en) * | 2016-06-22 | 2019-04-16 | 湖北省畜禽育种中心 | A kind of Binglangjiang waterbuffalo freezing of semen process |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Andrabi | Factors affecting the quality of cryopreserved buffalo (Bubalus bubalis) bull spermatozoa | |
| Pillet et al. | Egg yolk plasma can replace egg yolk in stallion freezing extenders | |
| Salmani et al. | In vitro assessment of soybean lecithin and egg yolk based diluents for cryopreservation of goat semen | |
| Lotfi et al. | Hyaluronic acid improves frozen-thawed sperm quality and fertility potential in rooster | |
| Shahverdi et al. | Fertility and flow cytometric evaluations of frozen-thawed rooster semen in cryopreservation medium containing low-density lipoprotein | |
| Papa et al. | Replacing egg yolk with soybean lecithin in the cryopreservation of stallion semen | |
| Amini et al. | Effects of supplementation of Tris-egg yolk extender with royal jelly on chilled and frozen-thawed ram semen characteristics | |
| Turri et al. | Influence of recovery methods and extenders on bull epididymal spermatozoa quality | |
| US9629357B2 (en) | Cryopreservation of cells and tissue for clinical application | |
| Curry | Cryopreservation of mammalian semen | |
| CN103141471B (en) | A kind of Kunming hangquan semen freezing formula of liquid and compound method | |
| Bavister | The effect of variations in culture conditions on the motility of hamster spermatozoa | |
| CN104604843A (en) | Semen freeze preservation solution and preparation method thereof | |
| CN105519521B (en) | A kind of horse semen cryopreservation liquid and its preparation method | |
| RU2577882C1 (en) | Medium of cryopreservation of bull semen and method of its preparation | |
| Andrabi | Applied andrology in water buffalo. | |
| Yousef et al. | Evaluation of Soy Lecithin Efficacy in Comparison with Egg Yolk on Freezing of Epididymal Sperm in Dogs. | |
| CN110742058B (en) | Method for cryopreservation of animal sperm | |
| Diaz-Jimenez et al. | Effect of warming temperatures on donkey sperm vitrification in 0.5 mL straws in comparison to conventional freezing | |
| Wang et al. | Exosomes from porcine serum as endogenous additive maintain function of boar sperm during liquid preservation at 17 C in vitro | |
| Pearodwong et al. | Comparison of egg yolk-based and soybean lecithin-based extenders for cryopreservation of boar semen | |
| US20030077566A1 (en) | Method for cryopreserving mammalian cells and tissues | |
| Sariozkan et al. | The effects of different egg yolk concentrations used with soy bean lecithin-based extender on semen quality to freeze bull semen | |
| Ali et al. | Antioxidative protection by Strawberry and green tea extracts during cryopreservation of Sahiwal bull semen | |
| Shishova et al. | The use of nanosized liposomes from vegetable phospholipids in combination with albumine and some polysaccharides as cryoprotective agents in the course of cryopreservation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170823 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20181109 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200823 |