RU2565548C1 - Method of producing of pluripotent stem cells - Google Patents
Method of producing of pluripotent stem cells Download PDFInfo
- Publication number
- RU2565548C1 RU2565548C1 RU2014132189/10A RU2014132189A RU2565548C1 RU 2565548 C1 RU2565548 C1 RU 2565548C1 RU 2014132189/10 A RU2014132189/10 A RU 2014132189/10A RU 2014132189 A RU2014132189 A RU 2014132189A RU 2565548 C1 RU2565548 C1 RU 2565548C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- stem cells
- cell
- pluripotent stem
- inhibitor
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 132
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 24
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 19
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 claims abstract description 19
- 108700039689 bcl-2 Homologous Antagonist-Killer Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 102000055574 bcl-2 Homologous Antagonist-Killer Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 claims abstract description 14
- FKSFKBQGSFSOSM-QFIPXVFZSA-N 1-[(2S)-butan-2-yl]-N-[(4,6-dimethyl-2-oxo-1H-pyridin-3-yl)methyl]-3-methyl-6-[6-(1-piperazinyl)-3-pyridinyl]-4-indolecarboxamide Chemical compound C1=C2N([C@@H](C)CC)C=C(C)C2=C(C(=O)NCC=2C(NC(C)=CC=2C)=O)C=C1C(C=N1)=CC=C1N1CCNCC1 FKSFKBQGSFSOSM-QFIPXVFZSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 229940123379 Methyltransferase inhibitor Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 239000003697 methyltransferase inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 13
- 108700000707 bcl-2-Associated X Proteins 0.000 claims description 20
- 102000055102 bcl-2-Associated X Human genes 0.000 claims description 20
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 19
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 229940088872 Apoptosis inhibitor Drugs 0.000 claims description 12
- 239000000158 apoptosis inhibitor Substances 0.000 claims description 12
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims description 11
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 4
- 102000018146 globin Human genes 0.000 claims description 3
- 108060003196 globin Proteins 0.000 claims description 3
- 102100025752 CASP8 and FADD-like apoptosis regulator Human genes 0.000 claims 1
- 101000914211 Homo sapiens CASP8 and FADD-like apoptosis regulator Proteins 0.000 claims 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 abstract description 7
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 abstract description 7
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 abstract description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 55
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 24
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 19
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 14
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 102000018813 CASP8 and FADD Like Apoptosis Regulating Protein Human genes 0.000 description 12
- 108010027741 CASP8 and FADD Like Apoptosis Regulating Protein Proteins 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 10
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 229940121372 histone deacetylase inhibitor Drugs 0.000 description 8
- 239000003276 histone deacetylase inhibitor Substances 0.000 description 8
- AEQFSUDEHCCHBT-UHFFFAOYSA-M sodium valproate Chemical compound [Na+].CCCC(C([O-])=O)CCC AEQFSUDEHCCHBT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 229940102566 valproate Drugs 0.000 description 8
- 101150080074 TP53 gene Proteins 0.000 description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 description 7
- -1 1,2-dihydro-4,6-dimethyl-2-oxo-3-pyridinyl Chemical group 0.000 description 6
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 6
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 6
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 6
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 6
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- XAUDJQYHKZQPEU-KVQBGUIXSA-N 5-aza-2'-deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 XAUDJQYHKZQPEU-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 5
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 5
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 5
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 5
- NMUSYJAQQFHJEW-UHFFFAOYSA-N 5-Azacytidine Natural products O=C1N=C(N)N=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 5-azacytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 4
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 4
- 229940123856 Glycogen synthase kinase 3 inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 4
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 4
- 229960002756 azacitidine Drugs 0.000 description 4
- NCNRHFGMJRPRSK-MDZDMXLPSA-N belinostat Chemical compound ONC(=O)\C=C\C1=CC=CC(S(=O)(=O)NC=2C=CC=CC=2)=C1 NCNRHFGMJRPRSK-MDZDMXLPSA-N 0.000 description 4
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 4
- 239000012649 demethylating agent Substances 0.000 description 4
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000003572 glycogen synthase kinase 3 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 4
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 4
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 4
- 229960003741 tranylcypromine Drugs 0.000 description 4
- IGLYMJRIWWIQQE-QUOODJBBSA-N (1S,2R)-2-phenylcyclopropan-1-amine (1R,2S)-2-phenylcyclopropan-1-amine Chemical compound N[C@H]1C[C@@H]1C1=CC=CC=C1.N[C@@H]1C[C@H]1C1=CC=CC=C1 IGLYMJRIWWIQQE-QUOODJBBSA-N 0.000 description 3
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- 102000001267 GSK3 Human genes 0.000 description 3
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 3
- 101000882127 Homo sapiens Histone-lysine N-methyltransferase EZH2 Proteins 0.000 description 3
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 description 3
- 101100325747 Mus musculus Bak1 gene Proteins 0.000 description 3
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 3
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 3
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 3
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 3
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 229960002648 alanylglutamine Drugs 0.000 description 3
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 description 3
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 3
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 3
- NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N di-n-propyl-acetic acid Natural products CCCC(C(O)=O)CCC NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000630 fibrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 3
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 3
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 3
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 description 3
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 3
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 3
- RTKIYFITIVXBLE-QEQCGCAPSA-N trichostatin A Chemical compound ONC(=O)/C=C/C(/C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 RTKIYFITIVXBLE-QEQCGCAPSA-N 0.000 description 3
- 229960000604 valproic acid Drugs 0.000 description 3
- LLOKIGWPNVSDGJ-AFBVCZJXSA-N (3s,6s,9s,12r)-3,6-dibenzyl-9-[6-[(2s)-oxiran-2-yl]-6-oxohexyl]-1,4,7,10-tetrazabicyclo[10.3.0]pentadecane-2,5,8,11-tetrone Chemical compound C([C@H]1C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N1)=O)CCCCCC(=O)[C@H]1OC1)C1=CC=CC=C1 LLOKIGWPNVSDGJ-AFBVCZJXSA-N 0.000 description 2
- BWDQBBCUWLSASG-MDZDMXLPSA-N (e)-n-hydroxy-3-[4-[[2-hydroxyethyl-[2-(1h-indol-3-yl)ethyl]amino]methyl]phenyl]prop-2-enamide Chemical compound C=1NC2=CC=CC=C2C=1CCN(CCO)CC1=CC=C(\C=C\C(=O)NO)C=C1 BWDQBBCUWLSASG-MDZDMXLPSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- NTCCNERMXRIPTR-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-1-naphthaldehyde Chemical class C1=CC=CC2=C(C=O)C(O)=CC=C21 NTCCNERMXRIPTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VMUXSMXIQBNMGZ-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydrocoumarin Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)CCC2=C1 VMUXSMXIQBNMGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000010565 Apoptosis Regulatory Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010063104 Apoptosis Regulatory Proteins Proteins 0.000 description 2
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100031734 Fibroblast growth factor 19 Human genes 0.000 description 2
- 101710153349 Fibroblast growth factor 19 Proteins 0.000 description 2
- 108091005903 Hemoglobin subunit delta Proteins 0.000 description 2
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000003964 Histone deacetylase Human genes 0.000 description 2
- 108090000353 Histone deacetylase Proteins 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 2
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 2
- 229940123685 Monoamine oxidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- HRNLUBSXIHFDHP-UHFFFAOYSA-N N-(2-aminophenyl)-4-[[[4-(3-pyridinyl)-2-pyrimidinyl]amino]methyl]benzamide Chemical compound NC1=CC=CC=C1NC(=O)C(C=C1)=CC=C1CNC1=NC=CC(C=2C=NC=CC=2)=N1 HRNLUBSXIHFDHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JWOGUUIOCYMBPV-UHFFFAOYSA-N OT-Key 11219 Natural products N1C(=O)C(CCCCCC(=O)CC)NC(=O)C2CCCCN2C(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C1CC1=CN(OC)C2=CC=CC=C12 JWOGUUIOCYMBPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- FHYUGAJXYORMHI-UHFFFAOYSA-N SB 431542 Chemical compound C1=CC(C(=O)N)=CC=C1C1=NC(C=2C=C3OCOC3=CC=2)=C(C=2N=CC=CC=2)N1 FHYUGAJXYORMHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100465401 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SCL1 gene Proteins 0.000 description 2
- LLOKIGWPNVSDGJ-UHFFFAOYSA-N Trapoxin B Natural products C1OC1C(=O)CCCCCC(C(NC(CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1)=O)NC(=O)C2CCCN2C(=O)C1CC1=CC=CC=C1 LLOKIGWPNVSDGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTKIYFITIVXBLE-UHFFFAOYSA-N Trichostatin A Natural products ONC(=O)C=CC(C)=CC(C)C(=O)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 RTKIYFITIVXBLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 108700041737 bcl-2 Genes Proteins 0.000 description 2
- 229960003094 belinostat Drugs 0.000 description 2
- JEUUNKOFKDUVMN-UHFFFAOYSA-N benzo[f]chromen-1-one Chemical compound C1=CC=CC2=C3C(=O)C=COC3=CC=C21 JEUUNKOFKDUVMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- DMSHWWDRAYHEBS-UHFFFAOYSA-N dihydrocoumarin Natural products C1CC(=O)OC2=C1C=C(OC)C(OC)=C2 DMSHWWDRAYHEBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 210000001705 ectoderm cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003890 endocrine cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004039 endoderm cell Anatomy 0.000 description 2
- INVTYAOGFAGBOE-UHFFFAOYSA-N entinostat Chemical compound NC1=CC=CC=C1NC(=O)C(C=C1)=CC=C1CNC(=O)OCC1=CC=CN=C1 INVTYAOGFAGBOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000001704 mesoblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000002899 monoamine oxidase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229960005184 panobinostat Drugs 0.000 description 2
- FWZRWHZDXBDTFK-ZHACJKMWSA-N panobinostat Chemical compound CC1=NC2=CC=C[CH]C2=C1CCNCC1=CC=C(\C=C\C(=O)NO)C=C1 FWZRWHZDXBDTFK-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- OHRURASPPZQGQM-GCCNXGTGSA-N romidepsin Chemical compound O1C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)[C@H]2CSSCC\C=C\[C@@H]1CC(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N2 OHRURASPPZQGQM-GCCNXGTGSA-N 0.000 description 2
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012622 synthetic inhibitor Substances 0.000 description 2
- VAZAPHZUAVEOMC-UHFFFAOYSA-N tacedinaline Chemical compound C1=CC(NC(=O)C)=CC=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1N VAZAPHZUAVEOMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 108010060596 trapoxin B Proteins 0.000 description 2
- 229940070710 valerate Drugs 0.000 description 2
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N valeric acid Chemical compound CCCCC(O)=O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MSRILKIQRXUYCT-UHFFFAOYSA-M valproate semisodium Chemical compound [Na+].CCCC(C(O)=O)CCC.CCCC(C([O-])=O)CCC MSRILKIQRXUYCT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- WAEXFXRVDQXREF-UHFFFAOYSA-N vorinostat Chemical compound ONC(=O)CCCCCCC(=O)NC1=CC=CC=C1 WAEXFXRVDQXREF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JWOGUUIOCYMBPV-GMFLJSBRSA-N (3S,6S,9S,12R)-3-[(2S)-Butan-2-yl]-6-[(1-methoxyindol-3-yl)methyl]-9-(6-oxooctyl)-1,4,7,10-tetrazabicyclo[10.4.0]hexadecane-2,5,8,11-tetrone Chemical compound N1C(=O)[C@H](CCCCCC(=O)CC)NC(=O)[C@H]2CCCCN2C(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN(OC)C2=CC=CC=C12 JWOGUUIOCYMBPV-GMFLJSBRSA-N 0.000 description 1
- GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-M 3-Methylbutanoic acid Natural products CC(C)CC([O-])=O GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OMKHWTRUYNAGFG-IEBDPFPHSA-N 3-deazaneplanocin a Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=CC=2N1[C@@H]1C=C(CO)[C@@H](O)[C@H]1O OMKHWTRUYNAGFG-IEBDPFPHSA-N 0.000 description 1
- OBKXEAXTFZPCHS-UHFFFAOYSA-N 4-phenylbutyric acid Chemical compound OC(=O)CCCC1=CC=CC=C1 OBKXEAXTFZPCHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HFDKKNHCYWNNNQ-YOGANYHLSA-N 75976-10-2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)N)C(C)C)[C@@H](C)O)C1=CC=C(O)C=C1 HFDKKNHCYWNNNQ-YOGANYHLSA-N 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 102000005234 Adenosylhomocysteinase Human genes 0.000 description 1
- 108020002202 Adenosylhomocysteinase Proteins 0.000 description 1
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- 102000051485 Bcl-2 family Human genes 0.000 description 1
- 108700038897 Bcl-2 family Proteins 0.000 description 1
- 102100026596 Bcl-2-like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 1
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 1
- 229940100513 Caspase 8 inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 102000009058 Death Domain Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010049207 Death Domain Receptors Proteins 0.000 description 1
- 229940122680 Demethylase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N Deoxycoleonol Natural products C12C(=O)CC(C)(C=C)OC2(C)C(OC(=O)C)C(O)C2C1(C)C(O)CCC2(C)C SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100477411 Dictyostelium discoideum set1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000038624 GSKs Human genes 0.000 description 1
- 108091007911 GSKs Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 101800001586 Ghrelin Proteins 0.000 description 1
- 102400000442 Ghrelin-28 Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 102100038970 Histone-lysine N-methyltransferase EZH2 Human genes 0.000 description 1
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001056180 Homo sapiens Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000615488 Homo sapiens Methyl-CpG-binding domain protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100026539 Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 101150118523 LYS4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100021299 Methyl-CpG-binding domain protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000018886 Pancreatic Polypeptide Human genes 0.000 description 1
- 102000052651 Pancreatic hormone Human genes 0.000 description 1
- 108700020479 Pancreatic hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000013535 Proto-Oncogene Proteins c-bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010090931 Proto-Oncogene Proteins c-bcl-2 Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 101000983124 Sus scrofa Pancreatic prohormone precursor Proteins 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 230000004156 Wnt signaling pathway Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 108091006088 activator proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 108010082820 apicidin Proteins 0.000 description 1
- 229930186608 apicidin Natural products 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000008668 cellular reprogramming Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N colforsin Natural products OC12C(=O)CC(C)(C=C)OC1(C)C(OC(=O)C)C(O)C1C2(C)C(O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000994 depressogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000547 effect on apoptosis Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N forskolin Natural products O=C([C@@]12O)C[C@](C)(C=C)O[C@]1(C)[C@@H](OC(=O)C)[C@@H](O)[C@@H]1[C@]2(C)[C@@H](O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- GNKDKYIHGQKHHM-RJKLHVOGSA-N ghrelin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)COC(=O)CCCCCCC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 GNKDKYIHGQKHHM-RJKLHVOGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000000548 hind-foot Anatomy 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-N isovaleric acid Chemical compound CC(C)CC(O)=O GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000004025 pancreas hormone Substances 0.000 description 1
- 229940032957 pancreatic hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 229950009215 phenylbutanoic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000006555 post-translational control Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000025915 regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000031539 regulation of cell division Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000004511 skin melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано при искусственном получении и выращивании живых тканей и также при лечении раковых клеток.The invention relates to the field of biotechnology and can be used in the artificial preparation and cultivation of living tissues and also in the treatment of cancer cells.
Существующие пути перепрограммирования соматических клеток в плюрипотентные стволовые клетки (Nature, Volume 465, Number 7299, pp. 665-836, 10.06.2010) сопровождаются рядом недостатков.Existing ways of reprogramming somatic cells into pluripotent stem cells (Nature, Volume 465, Number 7299, pp. 665-836, 06/10/2010) are accompanied by a number of disadvantages.
Пересадка ядер, взятых из соматических клеток, в оплодотворенную яйцеклетку, из которой предварительно удалено ядро, является очень сложным процессом и включает в себя стадию клонированных эмбрионов.The transplantation of nuclei taken from somatic cells into a fertilized egg from which the nucleus has been previously removed is a very complex process and involves the stage of cloned embryos.
Слияние соматических клеток с плюрипотентными стволовыми клетками требует уже изначально выделенных плюрипотентных стволовых клеток.The fusion of somatic cells with pluripotent stem cells requires the initially isolated pluripotent stem cells.
Модификация соматической клетки, индуцирующая ее превращение в стволовую, с помощью: генетического материала, кодирующего белковые репрограммирующие факторы, рекомбинантных белков, микроРНК, синтетической самореплицирующейся полицистронной РНК и низкомолекулярных биологически активных веществ, в большинстве случаев является очень длительным процессом. Полное перепрограммирование соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые может занять целый месяц.Modification of a somatic cell, inducing its transformation into a stem, with the help of: genetic material encoding protein reprogramming factors, recombinant proteins, microRNAs, synthetic self-replicating polycistronic RNA and low molecular weight biologically active substances, in most cases is a very long process. Complete reprogramming of somatic cells into induced pluripotent stem cells can take a whole month.
Общим недостатком всех известных методов перепрограммирования является то, что формируемые из полученных плюрипотентных стволовых клеток дифференцированные клетки получаются недозрелыми и склонными к образованию злокачественной опухоли, что связано с внезапной активацией в зрелых клетках, из которых выводятся недифференцированные клетки, «стволовых» генов, многие из которых управляют клеточным делением.A common drawback of all known methods of reprogramming is that the differentiated cells formed from the obtained pluripotent stem cells are immature and prone to the formation of a malignant tumor, which is associated with the sudden activation of “stem” genes in undifferentiated cells from which undifferentiated cells are derived, many of which control cell division.
Исключением не является также и наиболее эффективный способ перепрограммирования клеток с помощью 4-х факторов Яманаки: Oct4, Klf4, Sox2 и с-Мус (Cell, Volume 126, Issue 4, p. 663-676, 25.08.2006).The exception is also not the most effective way of reprogramming cells using 4 Yamanaki factors: Oct4, Klf4, Sox2 and c-Myc (Cell, Volume 126, Issue 4, p. 663-676, 08.25.2006).
Известен способ дифференцирования, преобразующий человеческие эмбриональные стволовые клетки (чЭС) в эндокринные клетки, способные синтезировать гормоны поджелудочной железы, инсулин, глюкагон, соматостатин, панкреатический полипептид и грелин. Данный процесс имитирует органогенез поджелудочной железы in vivo, проводя клетки через стадии, напоминающие образование сформированной эндодермы, эндодермы кишечной трубки, панкреатической эндодермы и превращение предшественников эндокринных клеток в клетки, экспрессирующие эндокринные гормоны (Nature Biotechnology - 24, 1392-1401, 11.11.2006).There is a differentiation method that converts human embryonic stem cells (hES) into endocrine cells capable of synthesizing pancreatic hormones, insulin, glucagon, somatostatin, pancreatic polypeptide and ghrelin. This process imitates pancreatic organogenesis in vivo, passing cells through stages resembling the formation of a formed endoderm, endoderm of the intestinal tube, pancreatic endoderm and the conversion of endocrine cell precursors into cells expressing endocrine hormones (Nature Biotechnology - 24, 1392-1401, 11.11.2006) .
Основная проблема данного способа заключается в том, что выделение стволовых клеток из эмбриона несовместимо с его дальнейшим развитием.The main problem of this method is that the isolation of stem cells from the embryo is incompatible with its further development.
Известен способ выделения линии плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека, включающий следующие стадии: выделение человеческих бластоцистов, выделение клеток из внутренней клеточной массы бластоцистов, нанесение внутренней клеточной массы бластоцистов на эмбриональные фибробласты, при котором полученная внутренняя клеточная масса формирует массив клеток, диссоциацию полученного массива в диссоциированные клетки, нанесение диссоциированных клеток на эмбриональные клетки-фидеры, подготовку колонии клеток с плотной морфологической структурой, крупными ядрами и ядрышками, и культивирование клеток приготовленной колонии с получением линии плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека (US 6200806 B1, C12N 5/073, 13.03.2001).A known method of isolating a line of human pluripotent embryonic stem cells, comprising the following stages: isolating human blastocysts, isolating cells from the inner cell mass of the blastocysts, applying the inner cell mass of the blastocysts to embryonic fibroblasts, in which the resulting inner cell mass forms an array of cells, dissociation of the resulting array into dissociated cells, application of dissociated cells to embryonic feeder cells, preparation of a cell colony with dense m rfologicheskoy structure, large nuclei and nucleoli, and culturing colonies of cells prepared to obtain lines of pluripotent human embryonic stem cells (US 6,200,806 B1, C12N 5/073, 13.03.2001).
Многостадийность и сложность данного процесса усугубляется тем, что эмбриональные стволовые клетки человека культивируются в очень специфических условиях, малейшее нарушение которых приводит к отсутствию результата.The multi-stage and complexity of this process is compounded by the fact that human embryonic stem cells are cultivated under very specific conditions, the slightest violation of which leads to a lack of result.
Наиболее близким аналогом является способ получения клеток дефинитивной эндодермы, мезодермы, эктодермы или эндодермы, включающий культивирование стволовых клеток в присутствии агента, изменяющего эпигенетический статус клетки (деметилирующего агента, ингибитора деацетилазы гистонов или их сочетания) и последующее культивирование стволовых клеток в отсутствие агента с получением таким образом клеток дефинитивной эндодермы, мезодермы, эктодермы или эндодермы. Стволовые клетки могут быть получены посредством дедифференцировки соматических клеток. Деметилирующий агент может представлять собой 5-азацитидин или 5-аза-2′-дезоксицитидин. Ингибитор деацетилазы гистонов (HDAC) может быть выбран из группы, состоящей из: трихостатина А, вориностата (SAHA), белиностата (PXD101), LAQ824/LBH589, трапоксина В, энтиностата (MS-275), CI994, моцетиностата (MGCD0103), фенилбутирата, вальпроевой кислоты, изовалерата, валерата, вальпроата, никотинамида, дигидрокумарина, нафтопиранона и 2-гидроксинафтальдегидов, апицидина, FK228 и натрия бутирата (WO 2010065679 A1, C12N 5/071, 10.06.2010).The closest analogue is a method for producing definitive endoderm, mesoderm, ectoderm or endoderm cells, including culturing stem cells in the presence of an agent that changes the epigenetic status of the cell (demethylating agent, histone deacetylase inhibitor, or a combination thereof) and subsequent cultivation of stem cells in the absence of an agent to obtain such image of definitive endoderm, mesoderm, ectoderm or endoderm cells. Stem cells can be obtained by dedifferentiation of somatic cells. The demethylating agent may be 5-azacytidine or 5-aza-2′-deoxycytidine. Histone deacetylase inhibitor (HDAC) can be selected from the group consisting of: trichostatin A, vorinostat (SAHA), proteinostat (PXD101), LAQ824 / LBH589, trapoxin B, entinostat (MS-275), CI994, mocetinostat (MGCD0103) , valproic acid, isovalerate, valerate, valproate, nicotinamide, dihydrocoumarin, naphthopyranone and 2-hydroxynaphthaldehydes, apicidine, FK228 and sodium butyrate (WO 2010065679 A1, C12N 5/071, 06/10/2010).
Основным недостатком всех описанных способов является большая вероятность возникновения канцерогенеза дифференцированных клеток, что связано с нарушенным процессом клеточного деления и апоптоза.The main disadvantage of all the described methods is the high likelihood of carcinogenesis of differentiated cells, which is associated with a disturbed process of cell division and apoptosis.
Техническим результатом заявленного изобретения является получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, способных к полному дозреванию и способных дифференцироваться в клетки с низкой вероятностью развития их канцерогенеза, а также увеличение скорости получения плюрипотентных стволовых клеток и дифференцированных клеток, впоследствии полученных из них.The technical result of the claimed invention is the production of induced pluripotent stem cells capable of full maturation and capable of differentiating into cells with a low probability of developing their carcinogenesis, as well as an increase in the rate of production of pluripotent stem cells and differentiated cells subsequently obtained from them.
Технический результат достигается предложенным способом получения плюрипотентных стволовых клеток, включающим процесс дедифференцировки соматических клеток, культивирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в присутствии агента, изменяющего эпигенетический статус клетки, и культивирование стволовых клеток в отсутствие указанного агента, при этом процесс дедифференцировки соматических клеток проводят посредством их модификации с помощью факторов перепрограммирования в среде, содержащей ингибитор метилтрансферазы GSK126, а культивирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в присутствии агента, изменяющего эпигенетический статус клетки, проводят в среде, содержащей белки Bax и Bak.The technical result is achieved by the proposed method for producing pluripotent stem cells, including the process of dedifferentiation of somatic cells, cultivation of induced pluripotent stem cells in the presence of an agent that changes the epigenetic status of the cell, and cultivation of stem cells in the absence of the specified agent, while the process of dedifferentiation of somatic cells is carried out by modifying them with using reprogramming factors in a medium containing methyltransferase inhibitor GSK126, and the cultivation of induced pluripotent stem cells in the presence of an agent that changes the epigenetic status of the cell is carried out in a medium containing Bax and Bak proteins.
Предпочтительно, чтобы плотность монослоя индуцируемых клеток непосредственно перед процессом дедифференцировки составляла 30-60%. В данном случае предпочтительно, чтобы концентрация ингибитора метилтрансферазы GSK126 в среде составляла 0,8-2 мас.%.Preferably, the density of the monolayer of induced cells immediately before the process of dedifferentiation was 30-60%. In this case, it is preferable that the concentration of the GSK126 methyltransferase inhibitor in the medium is 0.8-2 wt.%.
Культивирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток предпочтительно проводить также в присутствии ингибитора пролиферации.The cultivation of induced pluripotent stem cells is also preferably carried out in the presence of a proliferation inhibitor.
В качестве ингибитора пролиферации предпочтительно использовать по меньшей мере одну пептидную цепь глобина.At least one globin peptide chain is preferably used as a proliferation inhibitor.
Культивирование стволовых клеток предпочтительно проводить в присутствии монооксида азота.Stem cell cultivation is preferably carried out in the presence of nitric monoxide.
Культивирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток предпочтительно проводить в присутствии по меньшей мере одного ингибитора апоптоза.The cultivation of induced pluripotent stem cells is preferably carried out in the presence of at least one apoptosis inhibitor.
В качестве ингибитора апоптоза предпочтительно использовать ингибитор FLIP.As an apoptosis inhibitor, it is preferable to use a FLIP inhibitor.
Необходимость введения в среду дедифференцировки соматических клеток ингибитора метилтрансферазы GSK126 объясняется следующим. Наличие метки H3K9me3 препятствует перепрограммированию соматических клеток в индуцированные стволовые, так как мешает посадке белковых репрограммирующих факторов плюрипотенции на гены мишени. В связи с этим модификацию клеток необходимо проводить при высоком содержании маркера репрессии H3K27me3, который исключает работу препятствующего процессу маркера репрессии H3K9me3, а также, помимо всего прочего, способствует сохранению эпигенетической памяти в процессе деления клетки, что позволяет избежать канцерогенных и деструктивных явлений в клетках. Это можно подтвердить тем, что установка маркера H3K27me3 обычно происходит в промежуток клеточного цикла до репликации ДНК.The necessity of introducing a methyltransferase inhibitor GSK126 into the environment of dedifferentiation of somatic cells is explained by the following. The presence of the H3K9me3 label impedes the reprogramming of somatic cells into induced stem cells, as it interferes with the landing of protein reprogramming pluripotency factors on target genes. In this regard, cell modification must be carried out with a high content of the H3K27me3 repression marker, which eliminates the work of the H3K9me3 repression marker that impedes the process, and also, among other things, contributes to the preservation of epigenetic memory in the process of cell division, which avoids carcinogenic and destructive phenomena in cells. This can be confirmed by the fact that the installation of the H3K27me3 marker usually occurs during the cell cycle before DNA replication.
Кроме того, следует отметить, что триметилирование лизина 27 в гистоне Н3 (H3K27me3) в принципе является необходимым условием перепрограммирования соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые, однако присутствие данного маркера в малом количестве не только тормозит процесс перепрограммирования, но и еще чревато дальнейшим образованием в дифференцированных клетках воспалительных процессов.In addition, it should be noted that trimethylation of lysine 27 in histone H3 (H3K27me3) is, in principle, a necessary condition for the reprogramming of somatic cells into induced pluripotent stem cells, however, the presence of this marker in small quantities not only inhibits the reprogramming process, but is also fraught with further formation in differentiated cells of inflammatory processes.
В связи с вышеописанным во время дедифференцировки соматических клеток возникает необходимость искусственной установки маркера H3K27me3. Это можно осуществить посредством введения в среду дедифференцировки N-[(1,2-дигидро-4,6-диметил-2-оксо-3-пиридинил)метил]-3-метил-1-[(1S)-1-метилпропил]-6-[6-1-пиперазинил)-3-пиридинил]-1Н-индол-4-карбоксиамида (ингибитора метилтрансферазы GSK126).In connection with the above, during the dedifferentiation of somatic cells, the need arises for the artificial installation of the H3K27me3 marker. This can be done by introducing N - [(1,2-dihydro-4,6-dimethyl-2-oxo-3-pyridinyl) methyl] -3-methyl-1 - [(1S) -1-methylpropyl] into the dedifferentiation medium -6- [6-1-piperazinyl) -3-pyridinyl] -1H-indole-4-carboxyamide (GSK126 methyltransferase inhibitor).
Ингибитор метилтрансферазы GSK126 способствует образованию метилтрансферазы гистонов EZH2, входящей в состав комплекса PRC2 белковой группы policomb. Образовавшаяся субъединица EZH2 в свою очередь осуществляет тройное метилирование гистона Н3 с образованием маркера репрессии H3K27me3.The GSK126 methyltransferase inhibitor promotes the formation of histone methyltransferase EZH2, which is part of the PRC2 complex of the policomb protein group. The resulting subunit of EZH2, in turn, performs triple methylation of histone H3 with the formation of a repression marker H3K27me3.
Согласно иммунофлюрисцентному анализу, большинство колоний индуцированных плюрипотентных клеток, полученных иными способами, отличными от предложенного, дают средней силы сигнал о наличии H3K27me3 в ядрах 40-100% клеток в колонии. В таком случае при наиболее стабильной плотности монослоя индуцируемых клеток в начале процесса дедифференцировки 30-60% для образования необходимого количества метилтрансферазы гистонов EZH2 предпочтительно, чтобы концентрация ингибитора метилтрансферазы GSK126 в среде составляла 0,8-2 мас.%.According to immunofluorescence analysis, most colonies of induced pluripotent cells obtained by other methods than those proposed give an average signal about the presence of H3K27me3 in the nuclei of 40-100% of the cells in the colony. In this case, at the most stable monolayer density of the induced cells at the beginning of the dedifferentiation process of 30-60% for the formation of the required amount of histone methyltransferase EZH2, it is preferable that the concentration of the GSK126 methyltransferase inhibitor in the medium is 0.8-2 wt.%.
Касательно совершенствования последующего культивирования и дифференцировки стволовых клеток следует отметить следующее. Известно, что в организме среднестатистического взрослого человека в результате апоптоза ежедневно погибает порядка 50-70 миллиардов клеток. Для среднестатистического ребенка в возрасте от 8 до 14 лет число клеток, погибших путем апоптоза, составляет порядка 20-30 миллиардов в день. Суммарная масса клеток, которые на протяжении 1 года жизни подвергаются разрушению, эквивалентна массе тела человека. При этом восполнение утраченных клеток обеспечивается за счет пролиферации - увеличения клеточной популяции путем деления.Regarding the improvement of subsequent cultivation and differentiation of stem cells, the following should be noted. It is known that in the body of an average adult, about 50-70 billion cells die every day as a result of apoptosis. For an average child aged 8 to 14 years, the number of cells killed by apoptosis is about 20-30 billion per day. The total mass of cells that undergo destruction during 1 year of life is equivalent to human body mass. In this case, the replenishment of lost cells is ensured by proliferation - an increase in the cell population by division.
Наиболее перспективным способом получения плюрипотентных стволовых клеток является модификация соматических клеток, индуцирующая их превращение в стволовые с помощью факторов перепрограммирования - рекомбинантных белков, микроРНК, синтетической самореплицирующейся полицистронной РНК или низкомолекулярных биологически активных веществ.The most promising way to obtain pluripotent stem cells is to modify somatic cells, inducing their transformation into stem cells using reprogramming factors - recombinant proteins, microRNAs, synthetic self-replicating polycistronic RNA, or low molecular weight biologically active substances.
Одними из известных вышеупомянутых факторов являются факторы Яманаки (Oct4, Klf4, Sox2 и с-Мус).One of the known factors mentioned above are Yamanaki factors (Oct4, Klf4, Sox2 and c-Myc).
Также существуют факторы перепрограммирования, представляющие собой низкомолекулярные соединения, позволяющие преобразовать взрослые клетки в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, способные поддерживать свою жизнеспособность на высоком уровне в течение нескольких месяцев. В число указанных соединений входят семь факторов:There are also reprogramming factors, which are low molecular weight compounds that convert adult cells into induced pluripotent stem cells that can maintain their viability at a high level for several months. These compounds include seven factors:
- вальпроевая кислота или ингибитор гистондезацетилазы, которая способствует активации генов плюрипотентности и репрессии генов линейной дифференцировки;- valproic acid or histone deacetylase inhibitor, which promotes the activation of pluripotency genes and repression of linear differentiation genes;
- GSK3 - ингибитор гликоген-синтазы-киназы 3. Ингибирование GSK3 имитирует активацию сигнального пути Wnt, в результате чего β-катенин, избежав деградации, входит в ядро, где активирует синтез ферментативной субъединицы теломеразы;- GSK3 - glycogen synthase kinase inhibitor 3. Inhibition of GSK3 mimics the activation of the Wnt signaling pathway, as a result of which β-catenin, avoiding degradation, enters the nucleus, where it activates the synthesis of the enzymatic telomerase subunit;
- Е-616452 - ингибитор трансформирующего ростового фактора бета TGF-[бета], который в ходе перепрограммирования заменяет Sox2, активируя Nanog;- E-616452 - inhibitor of transforming growth factor beta TGF- [beta], which during reprogramming replaces Sox2, activating Nanog;
- транилципромин - ингибитор моноаминоксидазы или ингибитор деметилазы, которая избирательно удаляет метальные группы с лизина в положении Лиз4 или Лиз9 гистона Н3. Действуя на хроматин, транилципромин вызывает глобальное увеличение Н3К4 метилирования и, как следствие этого, дерепрессию генов. Ингибиторы деметилазы обладают способностью подавлять избыточную пролиферацию клеток и таким образом подавлять развитие раковых опухолей;- tranylcypromine - a monoamine oxidase inhibitor or demethylase inhibitor that selectively removes methyl groups from lysine at the Lys4 or Lys9 position of histone H3. Acting on chromatin, tranylcypromine causes a global increase in H3K4 methylation and, as a result, gene repression. Demethylase inhibitors have the ability to suppress excessive cell proliferation and thus inhibit the development of cancerous tumors;
- форсколин - препарат, активирующий аденилатциклазу - фермент, катализирующий превращение АТФ в цАМФ;- Forskolin - adenylate cyclase activating drug - an enzyme that catalyzes the conversion of ATP to cAMP;
- 3-деазанепланоцин - ингибитор гидролазы S-аденозилгомоцистеина, который вызывает разрушение репрессорного комплекса PRC2 и ингибирующее метилирование гистонов;- 3-deazaneplanocin - an inhibitor of S-adenosylhomocysteine hydrolase, which causes the destruction of the PRC2 repressor complex and inhibits histone methylation;
- PD-0325901 - высокоизбирательный и сильнодействующий синтетический ингибитор митоген-активируемой протеинкиназы МЕК, избирательно фосфорилирующей серин/треонин и остатки тирозина в активационной петле ее субстратов.- PD-0325901 - a highly selective and potent synthetic inhibitor of mitogen-activated protein kinase MEK, selectively phosphorylating serine / threonine and tyrosine residues in the activation loop of its substrates.
Разнообразие существующих методов перепрограммирования позволяет предложенным способом получать стволовые клетки из клеток любой зрелости - как малодифференцированных, так и дефинитивно. Например, известно, что с использованием факторов Яманаки можно дедифференцировать фибробласты любой зрелости (Журнал Nature Cell Biology, 2006 Aug 25, volume 126(4), page 663).The variety of existing methods of reprogramming allows the proposed method to obtain stem cells from cells of any maturity - both poorly differentiated and definitive. For example, it is known that, using Yamanaki factors, fibroblasts of any maturity can be differentiated (Journal of Nature Cell Biology, 2006 Aug 25, volume 126 (4), page 663).
Общая проблема всех известных способов индуцирования стволовых клеток заключается в том, что получаемые из них дифференцированные клетки оказываются недозрелыми и соответствуют примерно второму месяцу развития плода.A common problem with all known methods of inducing stem cells is that the differentiated cells obtained from them turn out to be immature and correspond to approximately the second month of fetal development.
У естественных зрелых клеток и полученных лабораторным путем около сотни генов работают по-разному. Половина из них в норме активна только в стволовых клетках, и со временем эти гены прекращают свою деятельность. У дифференцированных же клеток, полученных искусственно, эти гены продолжают работать. Более того, внезапная активация в зрелых клетках «стволовых» генов, многие из которых управляют клеточным делением, чревата возникновением злокачественной опухоли.About 100 mature genes work differently in naturally mature cells and laboratory-derived ones. Half of them are normally active only in stem cells, and over time, these genes cease to function. In differentiated cells, obtained artificially, these genes continue to work. Moreover, the sudden activation of "stem" genes in mature cells, many of which control cell division, is fraught with the appearance of a malignant tumor.
Причиной возникновения злокачественных опухолей является нарушение апоптоза и процесса деления клеток. В качестве основной причины данной патологии были рассмотрены соматические мутации гена, кодирующего белок р53. Порядка 50% искусственно трансформированных клеток экспрессируют мутантную форму р53.The cause of malignant tumors is a violation of apoptosis and the process of cell division. Somatic mutations of the gene encoding the p53 protein were considered as the main cause of this pathology. About 50% of artificially transformed cells express a mutant form of p53.
Регуляция деления и апоптоза клеток и доведение их "до кондиции" до пересадки в человеческий организм наравне с увеличением количества маркера репрессии H3K27me3 в период дедифференцировки позволят решить проблему "недозревания" и возникновения раковых клеток.The regulation of cell division and apoptosis and bringing them “to condition” before transplantation into the human body, along with an increase in the number of the H3K27me3 repression marker during dedifferentiation, will solve the problem of “overriding” and the occurrence of cancer cells.
Культивирование полученных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в присутствии агента, изменяющего эпигенетический статус клетки, позволит сделать эпигенетический статус клеток «подвижным», то есть с помощью механизмов, не затрагивающих последовательности ДНК, обеспечит изменчивость экспрессии генов (фенотипа клетки).Cultivation of the obtained induced pluripotent stem cells in the presence of an agent that changes the epigenetic status of the cell will make the epigenetic status of the cells “mobile,” that is, using mechanisms that do not affect the DNA sequence, will ensure variability in gene expression (cell phenotype).
В качестве агента, изменяющего эпигенетический статус клетки, можно использовать, например, как указано в прототипе, деметилирующий агент, ингибитор деацетилазы гистонов или их сочетание. Ингибитор деацетилазы гистонов (HDAC) может представлять собой трихостатин А, вориностат (SAHA), белиностат (PXD101), LAQ824/LBH589, трапоксин В, энтиностат (MS-275), CI994, моцетиностат (MGCD0103), фенилбутират, вальпроевую кислоту, изовалерат, валерат, вальпроат, никотинамид, дигидрокумарин, нафтопиранон и 2-гидроксинафтальдегид, апицидин, FK228 и натрия бутират. Ингибитор HDAC может представлять собой трихостатин A (TSA). Деметилирующий агент может представлять собой 5-азацитидин или 5-аза-2′-дезоксицитидин. Необходимое количество агента, изменяющего эпигенетический статус клетки, варьируется в зависимости от его активности, вида и концентрации получаемых клеток в среде культивирования.As an agent that changes the epigenetic status of a cell, for example, as indicated in the prototype, a demethylating agent, a histone deacetylase inhibitor, or a combination thereof can be used. Histone deacetylase inhibitor (HDAC) can be Trichostatin A, Vorinostat (SAHA), Belinostat (PXD101), LAQ824 / LBH589, Trapoxin B, Entinostat (MS-275), CI994, Mocetinostat (MGCD0103), Phenylbutyrate, Valotur, Acid, Valpu valerate, valproate, nicotinamide, dihydrocoumarin, naphthopyranone and 2-hydroxynaphthaldehyde, apicidin, FK228 and sodium butyrate. The HDAC inhibitor may be trichostatin A (TSA). The demethylating agent may be 5-azacytidine or 5-aza-2′-deoxycytidine. The required amount of an agent that changes the epigenetic status of a cell varies depending on its activity, type and concentration of the resulting cells in the culture medium.
Для того чтобы скорость разрушения клеток не превышала скорость поглощения их разрушенного материала соседними клетками, что, в свою очередь, приводит к воспалительным процессам, необходимо урегулировать проницаемость наружной мембраны митохондрий клеток, отвечающую за поглощение и переработку отмершего материала. Существенную роль в повышении проницаемости наружной мембраны митохондрий играют белки Bax и Bak. Они встраиваются в наружную мембрану митохондрий и олигомеризуются. При этом нарушается целостность внешней мембраны митохондрий.In order for the cell destruction rate not to exceed the absorption rate of their destroyed material by neighboring cells, which, in turn, leads to inflammatory processes, it is necessary to regulate the permeability of the outer mitochondrial membrane of cells, which is responsible for the absorption and processing of dead material. A significant role in increasing the permeability of the outer membrane of mitochondria is played by the Bax and Bak proteins. They integrate into the outer mitochondrial membrane and oligomerize. This violates the integrity of the outer membrane of the mitochondria.
Функционирование белков Вах и Bak зависит от их предварительной активации, например, белками Bid и Bim, которые относятся к подсемейству ВН3 белков. С другой стороны, активация и функционирование Bax и Bak может блокироваться антиапоптотическими белками семейства Bcl-2: Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1 и др. В свою очередь, антиапоптотические белки также могут блокироваться белками-депрессорами (например, Bad), относящимися к подсемейству ВН3 белков. В итоге достигается комбинированная регуляция мембранной проницаемости митохондрий и, соответственно, апоптоза за счет взаимодействия апоптотических, антиапоптотических, а также ВН3 белков-активаторов и депрессоров. Регуляция функций ВН3 белков осуществляется на уровне транскрипции, стабильности молекул, при взаимодействии с другими белками и при различных модификациях.The functioning of the Bax and Bak proteins depends on their preliminary activation, for example, Bid and Bim proteins, which belong to the subfamily of BH3 proteins. On the other hand, the activation and functioning of Bax and Bak can be blocked by anti-apoptotic proteins of the Bcl-2 family: Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, etc. In turn, anti-apoptotic proteins can also be blocked by depressant proteins (for example, Bad) related to the subfamily of BH3 proteins. As a result, combined regulation of the membrane permeability of mitochondria and, accordingly, apoptosis is achieved due to the interaction of apoptotic, antiapoptotic, as well as BH3 activator proteins and depressants. The functions of BH3 proteins are regulated at the level of transcription, the stability of molecules, when interacting with other proteins and with various modifications.
Несмотря на то что на данном этапе невозможно установить все причины нарушения апоптоза, добавление белков bax и bak в среду культивации способно выровнять скорость разрушения и поглощения отмерших клеток за счет регуляции проницаемости наружной мембраны митохондрий. Кроме того, в присутствии агента, изменяющего эпигенетический статус клетки, это позволит «вылечить» ген ТР53, нарушенная модификация которого обнаружена в клетках около 50% раковых опухолей.Despite the fact that at this stage it is not possible to establish all the causes of apoptosis disturbance, the addition of bax and bak proteins to the cultivation medium can equalize the rate of destruction and absorption of dead cells by regulating the permeability of the outer mitochondrial membrane. In addition, in the presence of an agent that changes the epigenetic status of the cell, this will make it possible to “cure” the TP53 gene, a disturbed modification of which is found in about 50% of cancerous cells.
Данное явление можно объяснить следующим. На наличие и частоту мутаций гена ТР53 существенно влияют факторы окружающей среды, в том числе изменение параметров апоптоза, которое можно спровоцировать белками bax и bak. Повышение активности гена ТР53 в присутствии агента, изменяющего эпигенетический статус клетки, может повышать восприимчивость клеток к сигналам входа в апоптоз через опосредованное влияние белка р53 на экспрессию генов bax и bcl2. Такие р53-опосредованные изменения экспрессии генов bax и bcl2 могут изменять соотношение количества белков Вах и Bcl2, тем самым переводя клетку в состояние повышенной чувствительности к апоптозу. Таким образом, помимо химического выравнивания скорости разрушения и поглощения клеток, белки bax и bak через непосредственное влияние на апоптоз способны также оказывать обратное воздействие на ген ТР53, которое заключается в предварительном повреждении гена с его последующей нормальной структуризацией.This phenomenon can be explained as follows. Environmental factors significantly influence the presence and frequency of TP53 gene mutations, including changes in apoptosis parameters that can be triggered by bax and bak proteins. An increase in the activity of the TP53 gene in the presence of an agent that changes the epigenetic status of the cell can increase the susceptibility of cells to apoptosis entry signals through the indirect effect of the p53 protein on the expression of the bax and bcl2 genes. Such p53-mediated changes in the expression of the bax and bcl2 genes can change the ratio of the amount of Bax and Bcl2 proteins, thereby putting the cell in a state of increased sensitivity to apoptosis. Thus, in addition to chemically equalizing the rate of cell destruction and uptake, bax and bak proteins, through a direct effect on apoptosis, can also exert a reverse effect on the TP53 gene, which consists in preliminary damage to the gene with its subsequent normal structuring.
Если культивирование стволовых клеток проводить в присутствии монооксида азота, это позволит несложным способом создать стрессовый стимул для гена ТР53, таким образом спровоцировав его дополнительную активацию для последующего лечения.If stem cell cultivation is carried out in the presence of nitric monoxide, this will allow an easy way to create a stress stimulus for the TP53 gene, thus provoking its additional activation for subsequent treatment.
При этом монооксид азота можно добавлять в атмосферу культивирования как перед стадией культивирования в присутствии агента, изменяющего эпигенетический статус клеток, так и перед стадией культивирования в его отсутствии. Функцию создания стрессового стимула для гена ТР53 он будет выполнять в любом случае, а предпочтительное время его действия будет зависеть от вида и количества получаемых клеток.Moreover, nitrogen monoxide can be added to the atmosphere of cultivation both before the stage of cultivation in the presence of an agent that changes the epigenetic status of cells, and before the stage of cultivation in its absence. The function of creating a stress stimulus for the TP53 gene will be performed in any case, and the preferred time of its action will depend on the type and number of cells received.
При этом следует отметить, что вследствие строгого "посттрансляционного контроля активации белка р53", непосредственно сама по себе высокая концентрация белка р53 не ведет к собственной активации и лечению гена ТР53.It should be noted that due to the strict "post-translational control of p53 protein activation", a high concentration of p53 protein itself does not directly lead to the activation and treatment of the TP53 gene.
Для ускорения "выздоровления" индуцированных плюрипотентных стволовых клеток их культивирование в присутствии агента, изменяющего эпигенетический статус клетки, а также культивирование в отсутствие указанного агента предпочтительно проводить в присутствии ингибитора пролиферации.To accelerate the "recovery" of induced pluripotent stem cells, their cultivation in the presence of an agent that changes the epigenetic status of the cell, as well as cultivation in the absence of the specified agent, is preferably carried out in the presence of a proliferation inhibitor.
В качестве ингибитора пролиферации предпочтительно использовать по меньшей мере одну пептидную цепь глобина. Указанный ингибитор не только позволит быстрее "выздоравливать" стволовым клеткам в отношении канцерогенных полиморфизмов генов, но еще экспериментально было установлено, что он способствует регулированию всего цикла развития индуцированных стволовых клеток.At least one globin peptide chain is preferably used as a proliferation inhibitor. The indicated inhibitor not only allows stem cells to “recover” faster in relation to carcinogenic polymorphisms of genes, but it has also been experimentally established that it helps to regulate the entire development cycle of induced stem cells.
Культивирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток предпочтительно проводить также в присутствии по меньшей мере одного ингибитора апоптоза. За счет белков bak и bax клеточная смерть проходит посредством апоптоза. Указанные белки также способствуют регуляции самого процесса апоптоза, при том как ингибитор апоптоза желателен для контроля его скорости.The cultivation of induced pluripotent stem cells is also preferably carried out in the presence of at least one apoptosis inhibitor. Due to the bak and bax proteins, cell death occurs through apoptosis. These proteins also contribute to the regulation of the apoptosis process itself, while an apoptosis inhibitor is desirable to control its speed.
В качестве ингибитора апоптоза предпочтительно использовать ингибитор FLIP. Указанное вещество является внутриклеточным ингибитором каспазы-8, блокирующим передачу сигнала апоптоза через рецепторы смерти. Несмотря на то что его роль является противоречивой, так как влияние его сверхэкспрессии на апоптоз неизвестно, при добавлении его в малом количестве он способен откорректировать механизм деления клеток и увеличить скорость переработки их отмирающего материала.As an apoptosis inhibitor, it is preferable to use a FLIP inhibitor. The specified substance is an intracellular caspase-8 inhibitor that blocks the transmission of apoptosis signal through death receptors. Despite the fact that its role is controversial, since the effect of its overexpression on apoptosis is unknown, when added in small quantities, it is able to adjust the cell division mechanism and increase the processing rate of their dying material.
После культивации стволовых клеток следует провести последующую дифференцировку указанных клеток в присутствии по меньшей мере одного фактора роста, некоторые из которых, помимо самой дифференцировки клеток, способны стимулировать также их пролиферацию. В зависимости от того, какие дифференцированные клетки следует получить в конечном итоге, в качестве факторов роста можно использовать различные пептидные или стероидные гормоны.After cultivation of stem cells, subsequent differentiation of these cells in the presence of at least one growth factor should be carried out, some of which, in addition to the differentiation of cells themselves, can also stimulate their proliferation. Depending on which differentiated cells should ultimately be obtained, various peptide or steroid hormones can be used as growth factors.
Примеры осуществления.Examples of implementation.
Пример 1.Example 1
Из фиброцитов кончика хвоста мыши получали химически индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ХИПСК). Для этого фиброциты были разморожены и посеяны в луночный планшет в питательную среду RPMI-1640 с глутамином. Изначальная плотность монослоя фиброцитов составляла 20%. Через 18,5 часов после рассева плотность монослоя достигла 40%.Chemically induced pluripotent stem cells (HIPSCs) were obtained from fibrocytes of the tail end of the mouse. For this, the fibrocytes were thawed and seeded in a well plate in RPMI-1640 nutrient medium with glutamine. The initial density of the fibrocyte monolayer was 20%. 18.5 hours after sieving, the monolayer density reached 40%.
По достижении заданной плотности в питательную среду были введены три фактора химического перепрограммирования, представляющие собой низкомолекулярные соединения, при следующем их содержании на единицу объема клеточной среды, г/л:Upon reaching the desired density, three chemical reprogramming factors were introduced into the nutrient medium, which are low molecular weight compounds, with the following content per unit volume of the cell medium, g / l:
вальпроевая кислота - 0,0001,valproic acid - 0.0001,
хлорид лития - 0,00007,lithium chloride - 0.00007,
4-[4-(1,3-бензодиоксол-5-ил)-5-(2-пиридинил)-1Н-имидазол-2-ил]бензамид(ингибитор SB-431542, чистота 99%) - 0,00009.4- [4- (1,3-benzodioxol-5-yl) -5- (2-pyridinyl) -1H-imidazol-2-yl] benzamide (SB-431542 inhibitor, 99% pure) - 0.00009.
Также в среду был введен концентрированный диметилсульфоксидный раствор N-[(1,2-дигидро-4,6-диметил-2-оксо-3-пиридинил)метил]-3-метил-1-[(1S)-1-метилпропил]-6-[6-1-пиперазинил)-3-пиридинил]-1Н-индол-4-карбоксиамид (ингибитор метилтрансферазы GSK126, чистота 98%) в количестве 0,8 мас.%.A concentrated dimethyl sulfoxide solution of N - [(1,2-dihydro-4,6-dimethyl-2-oxo-3-pyridinyl) methyl] -3-methyl-1 - [(1S) -1-methylpropyl] was also added to the medium -6- [6-1-piperazinyl) -3-pyridinyl] -1H-indole-4-carboxiamide (GSK126 methyltransferase inhibitor, purity 98%) in an amount of 0.8 wt.%.
Через 35 часов клетки были пересеяны в питательную среду RPMI-1640 с глутамином, в которую заранее были введены протеин Вах (марки 6А7), протеин Bak (марки (G-23)-G) и агент, изменяющий эпигенетический статус клетки, в качестве которого был взят 5-аза-2′-дезоксицитидин, при следующем их содержании на единицу объема клеточной среды, г/л:After 35 hours, the cells were seeded into RPMI-1640 nutrient medium with glutamine, into which Bax protein (grade 6A7), Bak protein (grade (G-23) -G) and an agent that alters the epigenetic status of the cell, in which 5-aza-2′-deoxycytidine was taken, with the following content per unit volume of the cell medium, g / l:
протеин Bax (марки 6А7) - 2,5,Bax protein (grades 6A7) - 2.5,
протеин Bak (марки (G-23)-G) - 2,5,Bak protein (grades (G-23) -G) - 2.5,
5-аза-2′-дезоксицитидин - 0,00005.5-aza-2′-deoxycytidine - 0.00005.
В указанную среду в количестве 0,00003 г/л клеточной среды был также добавлен ингибитор пролиферации, представлявший собой композицию из дельта-глобиновой цепи гемоглобина и фармацевтически приемлемого носителя.A proliferation inhibitor, which is a composition of a hemoglobin delta globin chain and a pharmaceutically acceptable carrier, was also added to the medium in an amount of 0.00003 g / l of the cell medium.
В описанных условиях клетки культивировали в течение 7 часов. После этого среда была заменена на питательную среду RPMI-1640 с глутамином. Последующее культивирование проводили уже в отсутствие 5-аза-2′-дезоксицитидина в течение 9 часов в атмосфере, содержащей монооксид азота.Under the described conditions, the cells were cultured for 7 hours. After that, the medium was replaced with RPMI-1640 nutrient medium with glutamine. Subsequent cultivation was carried out already in the absence of 5-aza-2′-deoxycytidine for 9 hours in an atmosphere containing nitrogen monoxide.
Для выращенных индуцированных плюрипотентных клеток среду заменили на питательную среду Игла MEM с солями Эрла, без глутамина, в которую был добавлен фактор роста нервов - Mouse Nerve Growth Factor (mNGF), в количестве 4 г/л клеточной среды. Дифференцировку клеток проводили в течение 32 часов.For the grown induced pluripotent cells, the medium was replaced with Nutrient medium MEM with Earl salts, without glutamine, into which nerve growth factor Mouse Nerve Growth Factor (mNGF) was added, in an amount of 4 g / l of cell medium. Cell differentiation was performed for 32 hours.
Среднее ядерно-цитоплазматическое отношение в клетках составляло 0,04. Ядрышко имело плохую выраженность. Наличие диспергированного хроматина в ядре обнаружено не было. Данные показатели свидетельствуют о высокой степени созревания клеток и неактивном состоянии «стволовых» генов, работа которых в зрелых клетках чревата возникновением злокачественной опухоли.The average nuclear cytoplasmic ratio in the cells was 0.04. The nucleolus was poorly expressed. The presence of dispersed chromatin in the nucleus was not detected. These indicators indicate a high degree of cell maturation and the inactive state of the “stem” genes, whose work in mature cells is fraught with the appearance of a malignant tumor.
40-дневное наблюдение за колонией полученных клеток не выявило признаков канцерогенеза, о чем свидетельствовало отсутствие клеточной атипии и, как следствие, клеточной дисплазии. Отклонения от нормальной структуры всего тканевого комплекса в течение указанного срока не наблюдались.A 40-day observation of the colony of the obtained cells did not reveal signs of carcinogenesis, as evidenced by the absence of cell atypia and, as a consequence, cell dysplasia. Deviations from the normal structure of the entire tissue complex during the indicated period were not observed.
Пример 2.Example 2
Из среднедифференцированных миобластов задней лапы лягушки получали химически индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ХИПСК). Для этого указанные миобласты были разморожены и посеяны в луночный планшет в питательную среду Игла MEM с солями Эрла, без глутамина. Изначальная плотность монослоя миобластов составляла 15%. Через 15,2 часа после рассева плотность монослоя достигла 30%.Chemically induced pluripotent stem cells (HIPSCs) were obtained from medium-differentiated myoblasts of the frog hind paw. To do this, these myoblasts were thawed and seeded in a well plate in the nutrient medium Needle MEM with Earle salts, without glutamine. The initial density of the myoblast monolayer was 15%. 15.2 hours after sieving, the monolayer density reached 30%.
По достижении заданной плотности в питательную среду были введены два фактора химического перепрограммирования, представляющие собой низкомолекулярные соединения, при следующем их содержании на единицу объема клеточной среды, г/л:Upon reaching the specified density, two chemical reprogramming factors were introduced into the nutrient medium, which are low molecular weight compounds, with the following content per unit volume of the cell medium, g / l:
транилципромин (ингибитор моноаминоксидазы) - 0,00008, tranylcypromine (monoamine oxidase inhibitor) - 0.00008,
PD-0325901 (синтетический ингибитор митоген-активируемой протеинкиназы МЕК) - 0,0001.PD-0325901 (synthetic inhibitor of mitogen-activated protein kinase MEK) - 0.0001.
Также в среду был введен концентрированный диметилсульфоксидный раствор N-[(1,2-дигидро-4,6-диметил-2-оксо-3-пиридинил)метил]-3-метил-1-[(1S)-1-метилпропил]-6-[6-1-пиперазинил)-3-пиридинил]-1Н-индол-4-карбоксиамид (ингибитор метилтрансферазы GSK126, чистота 98%) в количестве 0,6 мас.%.A concentrated dimethyl sulfoxide solution of N - [(1,2-dihydro-4,6-dimethyl-2-oxo-3-pyridinyl) methyl] -3-methyl-1 - [(1S) -1-methylpropyl] was also added to the medium -6- [6-1-piperazinyl) -3-pyridinyl] -1H-indole-4-carboxyamide (GSK126 methyltransferase inhibitor, purity 98%) in an amount of 0.6 wt.%.
Через 26 часов клетки были пересеяны в питательную среду Игла MEM с солями Эрла, без глутамина, в которую заранее были введены протеин Вах (марки В-9), протеин Bak (марки Ab-2) и агент, изменяющий эпигенетический статус клетки, в качестве которого служила смесь белиностата (PXD101) и 5-азацитидина, при следующем их содержании на единицу объема клеточной среды, г/л:After 26 hours, the cells were subcultured into Eagle MEM nutrient medium with Earl salts, without glutamine, into which Bax protein (grade B-9), Bak protein (grade Ab-2), and an agent that changes the epigenetic status of the cell were introduced which was a mixture of proteinostat (PXD101) and 5-azacytidine, with the following content per unit volume of the cell medium, g / l:
протеин Bax (марки В-9) - 4,Bax protein (B-9 grade) - 4,
протеин Bak (марки Ab-2) - 2,protein Bak (brand Ab-2) - 2,
белиностат (PXD101) - 0,00003,Belinostat (PXD101) - 0.00003,
5-азацитидин - 0,00004.5-azacytidine - 0.00004.
В описанных условиях клетки культивировали в течение 6,5 часов. После этого среда была заменена на питательную среду Игла MEM с солями Эрла, без глутамина. Последующее культивирование проводили уже в отсутствие агента, изменяющего эпигенетический статус клетки, в течение 8 часов (без монооксида азота).Under the described conditions, the cells were cultured for 6.5 hours. After this, the medium was replaced by the nutrient medium Needle MEM with Earl salts, without glutamine. Subsequent cultivation was carried out already in the absence of an agent that changes the epigenetic status of the cell, for 8 hours (without nitrogen monoxide).
Для выращенных индуцированных плюрипотентных клеток среду заменили на питательную среду Игла MEM с солями Эрла, без глутамина, в которую был добавлен фактор роста нервов - Mouse Nerve Growth Factor (mNGF), в количестве 3,5 г/л клеточной среды. Дифференцировку клеток проводили в течение 30 часов.For the grown induced pluripotent cells, the medium was replaced with Eagle MEM nutrient medium with Earl salts, without glutamine, to which Mouse Nerve Growth Factor (mNGF) was added, in an amount of 3.5 g / l of cell medium. The differentiation of the cells was carried out for 30 hours.
Среднее ядерно-цитоплазматическое отношение в клетках составляло 0,035. Ядрышко имело плохую выраженность. Наличие диспергированного хроматина в ядре обнаружено не было.The average nuclear cytoplasmic ratio in the cells was 0.035. The nucleolus was poorly expressed. The presence of dispersed chromatin in the nucleus was not detected.
40-дневное наблюдение за колонией полученных клеток не выявило признаков канцерогенеза, о чем свидетельствовало отсутствие клеточной атипии и, как следствие, клеточной дисплазии. Отклонения от нормальной структуры всего тканевого комплекса в течение указанного срока не наблюдались.A 40-day observation of the colony of the obtained cells did not reveal signs of carcinogenesis, as evidenced by the absence of cell atypia and, as a consequence, cell dysplasia. Deviations from the normal structure of the entire tissue complex during the indicated period were not observed.
Пример 3.Example 3
Из меланоцитов человеческой кожи получали химически индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ХИПСК). Для этого меланоциты были разморожены и посеяны в луночный планшет в питательную среду RPMI-1640 с аланил-глутамином. Изначальная плотность монослоя меланоцитов составляла 12%. Через 26 часов после рассева плотность монослоя достигла 60%.Chemically induced pluripotent stem cells (HIPSCs) were obtained from human skin melanocytes. For this, melanocytes were thawed and seeded in a well plate in RPMI-1640 growth medium with alanyl-glutamine. The initial density of the monolayer of melanocytes was 12%. 26 hours after sieving, the monolayer density reached 60%.
По достижении заданной плотности в питательную среду были введены факторы Яманаки (Oct4, Klf4, Sox2 и с-Мус) в количестве 0,00015 г/л клеточной среды.Upon reaching the desired density, Yamanaki factors (Oct4, Klf4, Sox2, and c-Myc) were introduced into the nutrient medium in an amount of 0.00015 g / l of the cell medium.
Также в среду был введен концентрированный диметилсульфоксидный раствор N-[(1,2-дигидро-4,6-диметил-2-оксо-3-пиридинил)метил]-3-метил-1-[(1S)-1-метилпропил]-6-[6-1-пиперазинил)-3-пиридинил]-1Н-индол-4-карбоксиамид (ингибитор метилтрансферазы GSK126, чистота 98%) в количестве 1,6 мас.%.A concentrated dimethyl sulfoxide solution of N - [(1,2-dihydro-4,6-dimethyl-2-oxo-3-pyridinyl) methyl] -3-methyl-1 - [(1S) -1-methylpropyl] was also added to the medium -6- [6-1-piperazinyl) -3-pyridinyl] -1H-indole-4-carboxyamide (GSK126 methyltransferase inhibitor, purity 98%) in an amount of 1.6 wt.%.
Через 37 часов клетки были пересеяны в питательную среду RPMI-1640 с аланил-глутамином, в которую заранее были введены протеин Вах (марки 6А7), протеин Bak (марки (G-23)-G), ингибитор апоптоза FLIP (FLICE-inhibitory protein) и агент, изменяющий эпигенетический статус клетки, в качестве которого был взят вальпроат, при следующем их содержании на единицу объема клеточной среды, г/л:After 37 hours, the cells were seeded into RPMI-1640 nutrient medium with alanyl-glutamine, into which Bax protein (grade 6A7), Bak protein (grade (G-23) -G), and apoptosis inhibitor FLIP (FLICE-inhibitory protein) were introduced ) and an agent that changes the epigenetic status of the cell, for which valproate was taken, at their next content per unit volume of the cell medium, g / l:
протеин Bax (марки 6А7) - 5,Bax protein (grades 6A7) - 5,
протеин Bak (марки (G-23)-G) - 4,Bak protein (grades (G-23) -G) - 4,
FLIP (FLICE-inhibitory protein) - 0,00003,FLIP (FLICE-inhibitory protein) - 0.00003,
вальпроат - 0,0002.valproate - 0.0002.
В указанную среду в количестве 0,00003 г/л клеточной среды был также добавлен ингибитор пролиферации, представлявший собой композицию из дельта-глобиновой цепи гемоглобина и фармацевтически приемлемого носителя.A proliferation inhibitor, which is a composition of a hemoglobin delta globin chain and a pharmaceutically acceptable carrier, was also added to the medium in an amount of 0.00003 g / l of the cell medium.
В атмосферу клеточного инкубатора был впрыснут монооксид азота.Nitrogen monoxide was injected into the atmosphere of the cell incubator.
В описанных условиях клетки культивировали в течение 9,5 часов. После этого среда была заменена на питательную среду Игла MEM с солями Эрла, без глутамина, в которую был добавлен ингибитор апоптоза FLIP (FLICE-inhibitory protein) в количестве 0,00002 г/л клеточной среды.Under the described conditions, the cells were cultured for 9.5 hours. After this, the medium was replaced by the nutrient medium Eagle MEM with Earl salts, without glutamine, to which the FLIP-inhibitory protein apoptosis inhibitor was added in an amount of 0.00002 g / l of the cell medium.
Последующее культивирование проводили уже в отсутствие вальпроата в течение 10 часов в атмосфере, по-прежнему содержащей монооксид азота.Subsequent cultivation was carried out already in the absence of valproate for 10 hours in an atmosphere still containing nitrogen monoxide.
Для выращенных индуцированных плюрипотентных клеток среду заменили на питательную среду RPMI-1640 с аланил-глутамином, в которую был добавлен фактор роста гепатоцитов (HGF) в количестве 6 г/л клеточной среды. Дифференцировку клеток проводили в течение 40 часов.For grown induced pluripotent cells, the medium was replaced with RPMI-1640 nutrient medium with alanyl-glutamine, to which hepatocyte growth factor (HGF) was added in an amount of 6 g / l of cell medium. The differentiation of the cells was carried out for 40 hours.
Среднее ядерно-цитоплазматическое отношение в клетках составляло 0,04. Ядрышко имело плохую выраженность. Наличие диспергированного хроматина в ядре обнаружено не было.The average nuclear cytoplasmic ratio in the cells was 0.04. The nucleolus was poorly expressed. The presence of dispersed chromatin in the nucleus was not detected.
50-дневное наблюдение за колонией полученных клеток не выявило признаков канцерогенеза, о чем свидетельствовало отсутствие клеточной атипии и, как следствие, клеточной дисплазии. Отклонения от нормальной структуры всего тканевого комплекса в течение указанного срока не наблюдались.A 50-day observation of the colony of the obtained cells did not reveal signs of carcinogenesis, as evidenced by the absence of cell atypia and, as a consequence, cell dysplasia. Deviations from the normal structure of the entire tissue complex during the indicated period were not observed.
Пример 4.Example 4
Из хондроцитов задней лапы крысы получали химически индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ХИПСК). Для этого хондроциты были разморожены и посеяны в луночный планшет в питательную среду Игла MEM с солями Эрла, без глутамина. Изначальная плотность монослоя хондроцитов составляла 25%. Через 30 часов после рассева плотность монослоя достигла 67%.Chemically induced pluripotent stem cells (HIPSCs) were obtained from rat chondrocytes. For this, chondrocytes were thawed and seeded in a well plate in the nutrient medium Eagle MEM with Earl salts, without glutamine. The initial density of the monolayer of chondrocytes was 25%. 30 hours after sieving, the density of the monolayer reached 67%.
По достижении заданной плотности в питательную среду были введены три фактора химического перепрограммирования, представляющие собой низкомолекулярные соединения, при следующем их содержании на единицу объема клеточной среды, г/л:Upon reaching the desired density, three chemical reprogramming factors were introduced into the nutrient medium, which are low molecular weight compounds, with the following content per unit volume of the cell medium, g / l:
GSK3 (ингибитор гликоген-синтазы-киназы 3) - 0,00002,GSK3 (glycogen synthase kinase 3 inhibitor) - 0.00002,
транилципромин 0,0001,tranylcypromine 0.0001,
3-деазанепланоцин 0,00001.3-deazaneplanocin 0.00001.
Также в среду был введен концентрированный диметилсульфоксидный раствор N-[(1,2-дигидро-4,6-диметил-2-оксо-3-пиридинил)метил]-3-метил-1-[(1S)-1-метилпропил]-6-[6-1-пиперазинил)-3-пиридинил]-1Н-индол-4-карбоксиамид (ингибитор метилтрансферазы GSK126, чистота 98%) в количестве 2 мас.%.A concentrated dimethyl sulfoxide solution of N - [(1,2-dihydro-4,6-dimethyl-2-oxo-3-pyridinyl) methyl] -3-methyl-1 - [(1S) -1-methylpropyl] was also added to the medium -6- [6-1-piperazinyl) -3-pyridinyl] -1H-indole-4-carboxyamide (GSK126 methyltransferase inhibitor, purity 98%) in an amount of 2 wt.%.
Через 33 часа клетки были пересеяны в питательную среду Игла MEM с солями Эрла, без глутамина, в которую заранее были введены протеин Вах (марки 2D2), протеин Bak (марки Fl-211), ингибитор апоптоза FLIP (FLICE-inhibitory protein), ингибитор апоптоза Bcl-w (марки G-21) и агент, изменяющий эпигенетический статус клетки, в качестве которого была взята смесь Е-616452 (ингибитора трансформирующего ростового фактора бета TGF-[бета]) и вальпроата, при следующем их содержании на единицу объема клеточной среды, г/л:After 33 hours, the cells were transplanted into Eagle MEM nutrient medium with Earl salts, without glutamine, into which Bax protein (grade 2D2), Bak protein (grade Fl-211), apoptosis inhibitor FLIP (FLICE-inhibitory protein), and inhibitor were introduced apoptosis Bcl-w (brand G-21) and an agent that changes the epigenetic status of the cell, which was taken as a mixture of E-616452 (an inhibitor of transforming growth factor beta TGF- [beta]) and valproate, with the following content per unit volume of cell environment, g / l:
протеин Bax (марки 2D2) - 2,5,Bax protein (brand 2D2) - 2.5,
протеин Bak (марки (G-21) - 5,protein Bak (brands (G-21) - 5,
FLIP (FLICE-inhibitory protein) - 0,00001,FLIP (FLICE-inhibitory protein) - 0.00001,
Bcl-w (марки G-21) - 0,00002,Bcl-w (grades G-21) - 0.00002,
Е-616452 (ингибитор трансформирующего ростового фактора бета TGF-[бета]) - 0,00008,E-616452 (inhibitor of transforming growth factor beta TGF- [beta]) - 0.00008,
вальпроат - 0,00015.valproate - 0.00015.
В атмосферу клеточного инкубатора был впрыснут монооксид азота.Nitrogen monoxide was injected into the atmosphere of the cell incubator.
В описанных условиях клетки культивировали в течение 7 часов. После этого среда была заменена на питательную среду Игла MEM с солями Эрла, без глутамина, в которую были добавлены ингибитор апоптоза FLIP (FLICE-inhibitory protein) в количестве 0,00001 г/л объема клеточной среды и ингибитор апоптоза Bcl-w (марки G-21) в количестве 0,00002 г/л объема клеточной среды.Under the described conditions, the cells were cultured for 7 hours. After this, the medium was replaced with nutrient medium Eagle MEM with Earl salts, without glutamine, to which were added an apoptosis inhibitor FLIP (FLICE-inhibitory protein) in an amount of 0.00001 g / l of cell volume and an apoptosis inhibitor Bcl-w (brand G -21) in an amount of 0.00002 g / l of the volume of the cell medium.
Последующее культивирование проводили уже в отсутствие Е-616452 и вальпроата в течение 10 часов в атмосфере, по-прежнему содержащей монооксид азота.Subsequent cultivation was carried out already in the absence of E-616452 and valproate for 10 hours in an atmosphere still containing nitrogen monoxide.
Для выращенных индуцированных плюрипотентных клеток среду заменили на питательную среду Игла MEM с солями Эрла, без глутамина, в которую был добавлен фактор роста фибробластов 19 (FGF19) в количестве 10 г/л клеточной среды. Дифференцировку клеток проводили в течение 36 часов.For grown, induced pluripotent cells, the medium was replaced by Eagle MEM nutrient medium with Earl salts, without glutamine, to which fibroblast growth factor 19 (FGF19) was added in an amount of 10 g / l of cell medium. The differentiation of the cells was carried out for 36 hours.
Среднее ядерно-цитоплазматическое отношение в клетках составляло 0,037. Ядрышко имело плохую выраженность. Наличие диспергированного хроматина в ядре обнаружено не было.The average nuclear cytoplasmic ratio in the cells was 0.037. The nucleolus was poorly expressed. The presence of dispersed chromatin in the nucleus was not detected.
40-дневное наблюдение за колонией полученных клеток не выявило признаков канцерогенеза, о чем свидетельствовало отсутствие клеточной атипии и, как следствие, клеточной дисплазии. Отклонения от нормальной структуры всего тканевого комплекса в течение указанного срока не наблюдались.A 40-day observation of the colony of the obtained cells did not reveal signs of carcinogenesis, as evidenced by the absence of cell atypia and, as a consequence, cell dysplasia. Deviations from the normal structure of the entire tissue complex during the indicated period were not observed.
Таким образом, предложенный способ позволяет за относительно короткий промежуток времени получить зрелые дифференцированные клетки, не склонные к образованию злокачественной опухоли.Thus, the proposed method allows for a relatively short period of time to obtain mature differentiated cells that are not prone to the formation of a malignant tumor.
Предложенный способ может найти применение в биоинженерии при получении и культивировании стволовых клеток и преобразования их в дифференцированные клетки, в частности при печати и выращивании искусственных живых тканей и органов.The proposed method can find application in bioengineering in the preparation and cultivation of stem cells and their conversion into differentiated cells, in particular in the printing and growing of artificial living tissues and organs.
В завершение можно отметить, что дальнейшее изучение вопроса перепрограммирования и дифференцировки клеток сделает возможным улучшение качества всего человека - начиная с его здоровья и заканчивая его личностью. Человек полностью состоит из клеток, жизненный цикл каждой из которых определяется ее потентностью и факторами роста, и, следовательно, жизненный цикл и развитие характеристик каждого человека также зависят от этих же условий.In conclusion, it can be noted that further study of the reprogramming and differentiation of cells will make it possible to improve the quality of the whole person - starting with his health and ending with his personality. A person consists entirely of cells, the life cycle of each of which is determined by its potency and growth factors, and, therefore, the life cycle and development of the characteristics of each person also depend on the same conditions.
Claims (8)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014132189/10A RU2565548C1 (en) | 2014-08-05 | 2014-08-05 | Method of producing of pluripotent stem cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014132189/10A RU2565548C1 (en) | 2014-08-05 | 2014-08-05 | Method of producing of pluripotent stem cells |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2565548C1 true RU2565548C1 (en) | 2015-10-20 |
Family
ID=54327234
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014132189/10A RU2565548C1 (en) | 2014-08-05 | 2014-08-05 | Method of producing of pluripotent stem cells |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2565548C1 (en) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2333243C2 (en) * | 2002-03-28 | 2008-09-10 | Бластикон Биотехнологише Форшунг Гмбх | Dedifferentiated programmed stem cells of monocytic origin, their obtaining and application |
| RU2421208C2 (en) * | 2006-05-11 | 2011-06-20 | Ридженикс Ас | Cell and cell extract introduction for rejuvenation |
| RU2010139426A (en) * | 2008-03-17 | 2012-04-27 | Зе Скрипс Ресеч Инститьют (Us) | COMBINATION OF CHEMICAL AND GENETIC APPROACHES TO OBTAINING INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS |
| RU2458983C1 (en) * | 2011-07-18 | 2012-08-20 | Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Образования И Науки Российской Федерации | Method of producing induced pluripotent stem cells from fibroblasts of patients with huntington's disease |
| US20130072545A1 (en) * | 2010-03-04 | 2013-03-21 | Interna Technologies B.V. | MiRNA MOLECULE DEFINED BY ITS SOURCE AND ITS DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC USES IN DISEASES OR CONDITIONS ASSOCIATED WITH EMT |
| WO2013049770A2 (en) * | 2011-09-30 | 2013-04-04 | Glaxosmithkline Llc | Methods of treating cancer |
-
2014
- 2014-08-05 RU RU2014132189/10A patent/RU2565548C1/en active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2333243C2 (en) * | 2002-03-28 | 2008-09-10 | Бластикон Биотехнологише Форшунг Гмбх | Dedifferentiated programmed stem cells of monocytic origin, their obtaining and application |
| RU2421208C2 (en) * | 2006-05-11 | 2011-06-20 | Ридженикс Ас | Cell and cell extract introduction for rejuvenation |
| RU2010139426A (en) * | 2008-03-17 | 2012-04-27 | Зе Скрипс Ресеч Инститьют (Us) | COMBINATION OF CHEMICAL AND GENETIC APPROACHES TO OBTAINING INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS |
| US20130072545A1 (en) * | 2010-03-04 | 2013-03-21 | Interna Technologies B.V. | MiRNA MOLECULE DEFINED BY ITS SOURCE AND ITS DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC USES IN DISEASES OR CONDITIONS ASSOCIATED WITH EMT |
| RU2458983C1 (en) * | 2011-07-18 | 2012-08-20 | Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Образования И Науки Российской Федерации | Method of producing induced pluripotent stem cells from fibroblasts of patients with huntington's disease |
| WO2013049770A2 (en) * | 2011-09-30 | 2013-04-04 | Glaxosmithkline Llc | Methods of treating cancer |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| V RADULOVIV, Polycomb-group proteins in hematopoietic stem cell regulation and hematopoietic neoplasms.Leukemia (2013) 27, 523-533. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Xie et al. | Chemical reprogramming and transdifferentiation | |
| Wang et al. | Chemical reprogramming for cell fate manipulation: Methods, applications, and perspectives | |
| JP6544726B2 (en) | Isolation and culture technology of large intestine epithelial stem cells and large intestine epithelial transplantation technology using the same | |
| US11466256B2 (en) | Stem cell derived islet differentiation | |
| US9394524B2 (en) | Chemical approaches for generation of induced pluripotent stem cells | |
| US9670463B2 (en) | Inhibition and enhancement of reprogramming by chromatin modifying enzymes | |
| Medvedev et al. | Induced pluripotent stem cells: problems and advantages when applying them in regenerative medicine | |
| Nie et al. | Cellular reprogramming: a small molecule perspective | |
| CN104894060B (en) | Inducing somatic transdifferentiation is the method and its application of neural stem cell | |
| ES2929758T3 (en) | Methods for the in vitro manufacture of gastric fundus tissue and compositions related thereto | |
| JP2024513094A (en) | Chemical reprogramming of human somatic cells into pluripotent cells | |
| CN111154726A (en) | Scalable skeletal muscle lineage specification and breeding method | |
| Kearns et al. | Generation of organized anterior foregut epithelia from pluripotent stem cells using small molecules | |
| JP2016510996A5 (en) | ||
| Brevini et al. | Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells | |
| EP3421598A1 (en) | Method for promoting differentiation of pluripotent stem cells by reducing undifferentiated state thereof | |
| RU2565548C1 (en) | Method of producing of pluripotent stem cells | |
| US20210395692A1 (en) | Method For Reducing Differentiation Resistance Of Pluripotent Stem Cells | |
| US20140186944A1 (en) | Use of cellular extracts for obtaining pluripotent stem cells | |
| EP4424817A1 (en) | Method for producing intestinal endocrine cells, pluripotent stem cell-derived intestinal endocrine cells, medium or medium kit, and use of the same | |
| KR101768581B1 (en) | Generation of Reprogramming Cell Line from Single Cells of spontaneously Immortalized Somatic cell | |
| AU2022203937B2 (en) | Combined chemical and genetic approaches for generation of induced pluripotent stem cells | |
| WO2023169076A1 (en) | Induced totipotent potential stem cells, methods of making and using | |
| Shi et al. | Chemicals facilitating reprogramming | |
| Hui Hu He et al. | Small Molecule-induced Beta-cell Regeneration from Alternate Cell Sources |