RU2561582C2 - Injectable dosage form of oligopeptide preparation for treating multiple sclerosis and method for producing it - Google Patents
Injectable dosage form of oligopeptide preparation for treating multiple sclerosis and method for producing it Download PDFInfo
- Publication number
- RU2561582C2 RU2561582C2 RU2010147431/15A RU2010147431A RU2561582C2 RU 2561582 C2 RU2561582 C2 RU 2561582C2 RU 2010147431/15 A RU2010147431/15 A RU 2010147431/15A RU 2010147431 A RU2010147431 A RU 2010147431A RU 2561582 C2 RU2561582 C2 RU 2561582C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- oligopeptides
- liposomes
- gfgyggrasdyksahk
- ggdrgapkrgsgkdshh
- qgtlskifklggrdsrsgspmarr
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, в частности к инъекционному лекарственному средству для лечения рассеянного склероза (PC), а именно фармацевтической композиции, содержащего смесь трех олигопептидов в эквимолярном соотношении,The invention relates to medicine, in particular to an injectable drug for the treatment of multiple sclerosis (PC), namely a pharmaceutical composition containing a mixture of three oligopeptides in an equimolar ratio,
GGDRGAPKRGSGKDSHHGGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHKGFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARRQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
заключенному в липосомы, состоящие из 2,3-Дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина и маннозиалированого дипальмитоилфосфатидилэтаноламина (Man4DOG3K8) и содержащему в качестве стабилизатора и криопротектора лактозу, а в качестве антиокислителя - α-токоферол, и способу ее получения.enclosed in liposomes consisting of 2,3-dipalmitoyl-sn-glycero-1-phosphatidylcholine and mannosialized dipalmitoylphosphatidylethanolamine (Man 4 DOG 3 K 8 ) and containing lactose as a stabilizer and cryoprotectant, and α-tocopherol as an antioxidant, its receipt.
Известны лекарственные средства для лечения рассеянного склероза на основе олигопептидов и смесей олигопептидов. Эти олигопептиды представляют собой по химической структуре (аминокислотной последовательности) фрагменты основного белка миелина человека (ОБМ). Такие олигопептиды обозначаются соответственно порядковому номеру первой и последней аминокислоты, считая от С конца полной аминокислотной цепочки ОБМ. Например, ОБМ 18-32, то есть ASTMDHARHGFLPR или, например, ОБМ 75-98, то есть AGAPWHPPLAIVTPAT.Known drugs for the treatment of multiple sclerosis based on oligopeptides and mixtures of oligopeptides. These oligopeptides are fragments of the basic human myelin protein (MBM) in chemical structure (amino acid sequence). Such oligopeptides are designated according to the sequence number of the first and last amino acids, counting from the end of the complete amino acid chain of MBP from C For example, OBM 18-32, i.e. ASTMDHARHGFLPR or, for example, OBM 75-98, i.e. AGAPWHPPLAIVTPAT.
Известно, что часть пролиферирующих T-клеток у больных рассеянным склерозом направлена против ОБМ (Allegretta et al. Science, 718-721, 1990), и что T-клетки человека могут узнавать множественные эпитопы на молекуле (Richer! et al., J. Neuroimmun 23, 55-66, 1989). ОБМ, по-видимому, также способна к активации некоторых T-клеток без вовлечения антиген-презентирующих клеток [Eur J Immunol. 17, 1635-1640, 1987]. Возможно, что небольшие олигопептиды-фрагменты ОБМ могут распознаваться Т-клетками без внутриклеточного процессинга просто за счет их способности связывать антигены основного комплекса гистосовместимости класса II на поверхности антиген-презентирующих клеток.It is known that part of proliferating T cells in patients with multiple sclerosis is directed against MBP (Allegretta et al. Science, 718-721, 1990), and that human T cells can recognize multiple epitopes on a molecule (Richer! Et al., J. Neuroimmun 23, 55-66, 1989). MBP is also apparently capable of activating certain T cells without involving antigen-presenting cells [Eur J Immunol. 17, 1635-1640, 1987]. It is possible that small MBP oligopeptides fragments can be recognized by T cells without intracellular processing simply due to their ability to bind antigens of the main histocompatibility complex of class II on the surface of antigen presenting cells.
Известны и хорошо изучены эпитопы (участки) ОБМ, ответственные за «узнавание» теми или иными специфическими T-клетками, выделенными из крови больных PC и обеспечивающими иммунологическую «атаку» на ОБМ, а также В-клетками, вырабатывающие аутоантитела, направленные против ОБМ.Epitopes (sites) of MBP are known and well studied, which are responsible for the “recognition” of one or another specific T-cells isolated from the blood of patients with PC and providing an immunological “attack” on MBP, as well as B-cells that produce autoantibodies directed against MBP.
Моделью рассеянного склероза человека у животных служит экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ), представляющий собой демиелинизирующий процесс, опосредованный T-клетками заболевания. Течение ЭАЭ может быть приостановлено путем введения мышам синтетических пептидов, содержащих участки, гомологичные иммунодоминантным эпитопам ОБМ (Gaur, A. et al., Science, 258, 1491-1494, 1992). Введение высоких доз ОБМ снижало количество аутореактивных T-клеток и аннулировало клинические и патологические симптомы ЕАЕ у мышей (Gritchfield, J. M. et al., Science, 263, 1139-1143, 1994). Оральное введение ОБМ модулировало течение ЕАЕ за счет индукции периферической толерантности (Chen, W. et al., Science, 265, 1237-1240, 1394).The model of human multiple sclerosis in animals is experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), which is a demyelinating process mediated by disease T cells. The course of EAE can be stopped by introducing into mice synthetic peptides containing regions homologous to immunodominant MBP epitopes (Gaur, A. et al., Science, 258, 1491-1494, 1992). The introduction of high doses of MBP reduced the number of autoreactive T cells and nullified the clinical and pathological symptoms of EAE in mice (Gritchfield, J. M. et al., Science, 263, 1139-1143, 1994). Oral administration of MBP modulated the course of EAE due to the induction of peripheral tolerance (Chen, W. et al., Science, 265, 1237-1240, 1394).
В связи с обнаружением таких эпитопов предпринимались и предпринимаются попытки с помощью коротких синтетических пептидов (олигопептидов), имеющих последовательность, гомологичную одному или нескольким эпитопам (фрагментам). Также описаны короткие пептиды, которые могут блокировать или связывать так называемые каталитические антитела, обнаруживаемые у больных рассеянным склерозом и вызывающие разрушение ОБМ. Так, показано, что введение животным с экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом (известной моделью рассеянного склероза человека) водных растворов коротких пептидов (олигопептидов)In connection with the discovery of such epitopes, attempts have been and are being made using short synthetic peptides (oligopeptides) having a sequence homologous to one or more epitopes (fragments). Also described are short peptides that can block or bind the so-called catalytic antibodies found in patients with multiple sclerosis and causing the destruction of MBP. Thus, it was shown that the introduction of aqueous solutions of short peptides (oligopeptides) into animals with experimental allergic encephalomyelitis (a known model of multiple human sclerosis)
(1) GGDRGAPKRGSGKDSHH(1) GGDRGAPKRGSGKDSHH
(2) GFGYGGRASDYKSAHK(2) GFGYGGRASDYKSAHK
(3) QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR(3) QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
приводит к уменьшению симптомов заболевания [Belogurov AA et al., Suppression of ongoing experimental allergic encephalomyelitis in DA rats by novel peptide drug, structural part of human myelin basic protein 46-62. Autoimmunity, 2009 May; 42(4): 362-4].reduces symptoms of the disease [Belogurov AA et al., Suppression of ongoing experimental allergic encephalomyelitis in DA rats by novel peptide drug, structural part of human myelin basic protein 46-62. Autoimmunity, 2009 May; 42 (4): 362-4].
Подобный эффект как это предполагается авторами вышеуказанной статьи обусловлен специфическим («антиген-антитело») связыванием и, соответственно, инактивацией каталитических антител, ответственных за развитие и поддержание процесса демиелинизации при экспериментальном аллергическом энцефаломиелите у мышей.A similar effect, as suggested by the authors of the above article, is due to specific (“antigen-antibody”) binding and, accordingly, inactivation of catalytic antibodies responsible for the development and maintenance of the demyelination process in experimental allergic encephalomyelitis in mice.
Однако, как неожиданно было обнаружено авторами настоящего изобретения, лечебный эффект этих олигопептидов опосредуется через непосредственный контакт с антигенпрезентирующими клетками, и такое взаимодействие приводит к возникновению иммунологической толерантности, при этом продукция антител против ОБМ, в том числе каталитических, уменьшается.However, as was unexpectedly discovered by the authors of the present invention, the therapeutic effect of these oligopeptides is mediated through direct contact with antigen-presenting cells, and this interaction leads to the emergence of immunological tolerance, while the production of antibodies against MBP, including catalytic, is reduced.
Соответственно, для усиления лечебного эффекта этих олигопептидов авторы настоящего изобретения предлагают адъювантизацию вышеуказанных олигопептидов с использованием метода интеграции этих олигопептидов в липосомы определенного состава с добавлением других вспомогательных веществ.Accordingly, to enhance the therapeutic effect of these oligopeptides, the authors of the present invention propose adjuvantation of the above oligopeptides using the method of integration of these oligopeptides into liposomes of a certain composition with the addition of other auxiliary substances.
Как известно, для усиления эффекта индукции толерантности к тем или иным антигенам применяются так называемые «адъюванты» - различные неорганические и органические вещества, вводимые совместно или в одной лекарственной форме с самим антигеном (см., например, Adjuvants for Allergen Immunotherapy: Experimental Results and Clinical Perspectives James N Francis; Stephen R Durham, Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2004; 4(6)). К таким адъювантам относятся, в частности, например, 3-о-дезацил-4'-монофосфорил липид А и алюминия гидроксид.As is known, the so-called “adjuvants” are used to enhance the effect of the induction of tolerance to certain antigens — various inorganic and organic substances administered together or in the same dosage form as the antigen itself (see, for example, Adjuvants for Allergen Immunotherapy: Experimental Results and Clinical Perspectives James N Francis; Stephen R Durham, Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2004; 4 (6)). Such adjuvants include, in particular, for example, 3-o-deacyl-4'-monophosphoryl lipid A and aluminum hydroxide.
Известно, что в случае использования липосомальных вакцин иммунный ответ усиливается вследствие того, что антигены, ассоциированные с липосомами, попадают непосредственно в антигенпредставляющие клетки [Gluck R. (1995) In Vaccine Design: The Submit and Adjuvant Approch (Powell M.F., Newman M.J., eds)., Plenum Press. P.325-345], в случае олигопептидов - фрагментов ОМБ, однако, предсказать заранее, не приведет ли подобная адъювантизация к обратному эффекту, то есть к усилению производства каталитических антител сенсибилизированными В-клетками и соответственно к отрицательному клиническому эффекту, невозможно.When liposomal vaccines are used, the immune response is enhanced due to the fact that antigens associated with liposomes directly enter antigen-presenting cells [Gluck R. (1995) In Vaccine Design: The Submit and Adjuvant Approch (Powell MF, Newman MJ, eds )., Plenum Press. P.325-345], in the case of oligopeptides - fragments of OMB, however, it is impossible to predict in advance whether such adjuvantization will lead to the opposite effect, that is, to increased production of catalytic antibodies by sensitized B cells and, accordingly, to a negative clinical effect.
Например, предпринимались попытки усилить лечебное действие олигопептида-фрагмента ОБМ (а именно ОБМ 113-122) при ЭАЭ путем предварительной липофилизации олигопептида и внедрения в липосомы перед введением. Однако такая «липосомальная» адъювантизация не приводила к усилению эффекта при подкожном введении [Avrilionis К. and Boggs J.M. Suppression of experimental allergic encephalomyelitis by the encephalitogenic peptide, in solution or bound to liposomes, J Neuroimmunol. 1991 Dec; 35(1-3): 201-10].For example, attempts have been made to enhance the therapeutic effect of the oligopeptide fragment of OBM (namely, OBM 113-122) in EAE by preliminary lipophilization of the oligopeptide and incorporation into liposomes before administration. However, such “liposomal” adjuvantization did not lead to an increase in the effect with subcutaneous administration [K. Avrilionis and J. Boggs. Suppression of experimental allergic encephalomyelitis by the encephalitogenic peptide, in solution or bound to liposomes, J Neuroimmunol. 1991 Dec; 35 (1-3): 201-10].
В последние десятилетия для адъювантизации тех или иных вакцин используется метод включения самого антигена в состав липосом специально подобранного состава (Заявка США 20070082043).In recent decades, for the adjuvantization of certain vaccines, a method of incorporating the antigen itself into the liposome composition of a specially selected composition has been used (Application US 20070082043).
Описан способ направленного подавления определенного клона Т-клеток, ответственного за развитие ЭАЭ у животных и несущего интерферон - индуцибельный маркер CXCR3 с помощью ДНК-плазмиды, помещенной в липосомы [Chen W et al. In vivo administration of plasmid DNA encoding recombinant immunotoxin DT390-IP-10 attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis. J Autoimmun. 2007 Feb; 28(1): 30-40. Epub 2007 Jan 30].A method for the directed suppression of a specific T-cell clone responsible for the development of EAE in animals and carrying an interferon-inducible marker CXCR3 using a DNA plasmid inserted into liposomes is described [Chen W et al. In vivo administration of plasmid DNA encoding recombinant immunotoxin DT390-IP-10 attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis. J Autoimmun. 2007 Feb; 28 (1): 30-40. Epub 2007 Jan 30].
Для усиления взаимодействия инкапсулированного антигена с антигенпрезентирующими клетками иммунной системы в состав липосом вводятся моно- и поли-маннозилированые липидные аналоги, [Garcon, N.; Gregoriadis, G.; Taylor, M. and Summerfield, J. Mannose-mediated targeted immunoadjuvant action of liposomes, Immunology. 1988 August; 64(4): 743-745], [Liposomes: Methods and Protocols, Volume 1: Pharmaceutical Nanocarriers, Series: Methods in Molecular Biology, Volume: 605, 2009, pp.177-188), в частности, например, Man4DOG3K8 [Espuelas, S. et al., Synthesis of an amphiphilic tetraantennary mannosyi conjugate and incorporation into liposome carriers, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volume 13, Issue 15, 4 August 2003, pages 2557-2560].To enhance the interaction of the encapsulated antigen with antigen-presenting cells of the immune system, mono- and poly-mannosylated lipid analogues are introduced into the liposomes, [Garcon, N .; Gregoriadis, G .; Taylor, M. and Summerfield, J. Mannose-mediated targeted immunoadjuvant action of liposomes, Immunology. 1988 August; 64 (4): 743-745], [Liposomes: Methods and Protocols, Volume 1: Pharmaceutical Nanocarriers, Series: Methods in Molecular Biology, Volume: 605, 2009, pp. 177-188), in particular, for example, Man 4 DOG 3 K 8 [Espuelas, S. et al., Synthesis of an amphiphilic tetraantennary mannosyi conjugate and incorporation into liposome carriers, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volume 13, Issue 15, 4 August 2003, pages 2557-2560].
Однако такой подход требует тщательного подбора компонентов липосом и их размеров при обеспечении достаточной нагрузки липосом антигеном (то есть процента включенного в липосомы белка или пептида), а также количества маннозилированого компонента в составе липосом.However, this approach requires careful selection of the liposome components and their sizes while ensuring a sufficient load of liposomes by the antigen (i.e., the percentage of the protein or peptide included in the liposomes), as well as the amount of the mannosylated component in the liposomes.
Вообще, сама по себе «адъювантизация» не предполагает a priory повышения эффективности лечебного действия и не является очевидной для этого в отношении того или иного антигена.In general, “adjuvantization” alone does not imply a priory of increasing the effectiveness of the therapeutic effect and is not obvious for this in relation to one or another antigen.
Так, предпринимались попытки усилить лечебное действие олигопептида-фрагмента ОБМ (а именно ОБМ 113-122) при ЭАЭ путем предварительной липофилизации олигопептида и внедрения в липосомы перед введением. Однако такая «липосомальная» адъюванитизация не приводила к усилению эффекта при подкожном введении [Avrilionis K. and Boggs J.M. Suppression of experimental allergic encephalomyelitis by the encephalitogenic peptide, in solution or bound to liposomes, J Neuroimmunol. 1991 Dec; 35(1-3): 201-10].So, attempts were made to enhance the therapeutic effect of the oligopeptide fragment of MBP (namely, MBP 113-122) in EAE by preliminary lipophilization of the oligopeptide and incorporation into liposomes before administration. However, such “liposomal” adjuvantization did not increase the effect with subcutaneous administration [Avrilionis K. and Boggs J.M. Suppression of experimental allergic encephalomyelitis by the encephalitogenic peptide, in solution or bound to liposomes, J Neuroimmunol. 1991 Dec; 35 (1-3): 201-10].
Кроме того, недостатком водных растворов (или растворов в физиологически совместимых буферах, таких как фосфатный буфер) препаратов на основе пептидов является их быстрая деградация при введении в организм вследствие воздействия пептидаз.In addition, the disadvantage of aqueous solutions (or solutions in physiologically compatible buffers, such as phosphate buffer) of peptide-based preparations is their rapid degradation when introduced into the body due to the action of peptidases.
Как известно, большинство фармацевтических препаратов, содержащих липососомы, представляют лиофильно-высушенные порошки, которые перед применением «восстанавливают» до суспензии липосом путем прибавления водного солевого забуференного раствора, и затем полученную липосомальную суспензию вводят тем или иным путем в организм. Для повышения стабильности лиофильно-высушенных порошков липосомальных препаратов, а также в качестве криопротектора при лиофилизации липосомальных препаратов в их состав вводится стабилизаторы, такие как сахара, а для снижения степени окисления липидов вводятся антиоксиданты, например, альфа-токоферол. Однако введение лактозы или иных сахаров в состав липосомальных препаратов может привести к уменьшению включения водорастворимых белков в липосомальную часть препарата, что закономерно снизит его лечебную эффективность.As is known, most pharmaceutical preparations containing lipososomes are lyophilized powders, which before use are “reconstituted” to a suspension of liposomes by adding an aqueous saline buffered solution, and then the resulting liposomal suspension is injected into the body in one way or another. To increase the stability of freeze-dried powders of liposomal preparations, as well as cryoprotectant during lyophilization of liposomal preparations, stabilizers such as sugars are introduced into their composition, and antioxidants, for example, alpha-tocopherol, are introduced to reduce the degree of lipid oxidation. However, the introduction of lactose or other sugars in the composition of liposomal preparations can lead to a decrease in the inclusion of water-soluble proteins in the liposomal part of the drug, which naturally reduces its therapeutic effectiveness.
Целью настоящего изобретения является создание инъекционной лекарственной формы на основе указанных пептидов с целью повышения эффективности их действия, а также увеличения стабильности препарата при хранении, а также стабильности препарата после его реконституции в полярном растворителе.The aim of the present invention is the creation of an injectable dosage form based on these peptides in order to increase the effectiveness of their action, as well as to increase the stability of the drug during storage, as well as the stability of the drug after its reconstitution in a polar solvent.
Поставленная задача достигается тем, что в качестве средства для лечения рассеянного склероза предлагается инъекционная лекарственная форма олигопептидовThe problem is achieved in that as an agent for the treatment of multiple sclerosis, an injectable dosage form of oligopeptides is proposed
GGDRGAPKRGSGKDSHHGGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHKGFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARRQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
которая содержит:which contains:
олигопептидыoligopeptides
GGDRGAPKRGSGKDSHHGGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHKGFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARRQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
включенные в липосомы размером от 100 до 200 нм, состоящие из 2,3-Дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина и маннозиалированого дипальмитоилфосфатидилэтаноламина (Man4DOG3K8);included in liposomes ranging in size from 100 to 200 nm, consisting of 2,3-dipalmitoyl-sn-glycero-1-phosphatidylcholine and mannosialized dipalmitoylphosphatidylethanolamine (Man 4 DOG 3 K 8 );
лактозу;lactose;
α-токоферол при следующем соотношении компонентов, мас.%:α-tocopherol in the following ratio of components, wt.%:
В процессе работы над настоящим изобретением авторами был неожиданно обнаружен феномен синергического действие вышеуказанных олигопептидов в отношении подавления симптомов экспериментального энцефаломиелита. Было неожиданно установлено, что при совместном применении лечебный эффект этих олигопептидов потенцируется. То есть их лечебный эффект при совместном применении выше, чем сумма эффектов, производимых ими по отдельности. Последнее, возможно, обусловлено тем, что один олигопептид содержит лишь ограниченное количество эпитопов ОБМ.In the process of working on the present invention, the authors unexpectedly discovered the phenomenon of a synergistic effect of the above oligopeptides in relation to the suppression of symptoms of experimental encephalomyelitis. It was unexpectedly found that when used together, the therapeutic effect of these oligopeptides is potentiated. That is, their therapeutic effect when used together is higher than the sum of the effects they produce individually. The latter, possibly, is due to the fact that one oligopeptide contains only a limited number of MBP epitopes.
В настоящем изобретении, указанные активные и вспомогательные компоненты (криоконсерванты и антиокислители), в составе предложенного лекарственного средства, в указанном соотношении обеспечивают наилучшее включение олигопептидов в состав липосом, стабильность препарата при хранении, высокую лечебную эффективность.In the present invention, these active and auxiliary components (cryopreservatives and antioxidants), as part of the proposed medicinal product, in the specified ratio provide the best inclusion of oligopeptides in the composition of liposomes, the stability of the drug during storage, high therapeutic efficacy.
Далее согласно изобретению предлагается способ приготовления инъекционной лекарственной формой олигопептидовFurther according to the invention, a method for the preparation of an injectable dosage form of oligopeptides
GGDRGAPKRGSGKDSHHGGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHKGFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARRQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
которая содержит:which contains:
олигопептидыoligopeptides
GGDRGAPKRGSGKDSHHGGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHKGFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARRQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
включенные в липосомы размером от 100 до 200 нм, состоящие из 2,3-Дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина и маннозиалированого дипальмитоилфосфатидилэтаноламина (Man4DOG3K8);included in liposomes ranging in size from 100 to 200 nm, consisting of 2,3-dipalmitoyl-sn-glycero-1-phosphatidylcholine and mannosialized dipalmitoylphosphatidylethanolamine (Man 4 DOG 3 K 8 );
лактозу;lactose;
α-токоферол при следующем соотношении компонентов, мас.%:α-tocopherol in the following ratio of components, wt.%:
при котором механическую смесь олигопептидовin which a mechanical mixture of oligopeptides
GGDRGAPKRGSGKDSHHGGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHKGFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARRQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
растворяют в воде, затем смешивают с водной суспензией моноламеллярных липосом, размером 50-80 нм, предварительно полученных путем регидратации липидной пленки с последующей дезинтеграции получившихся мультиламеллярных липосом, полученную смесь олигопептидов и липосом стерильно фильтруют, разливают по флаконам, лиофильно высушивают, заполняют азотом, укупоривают резиновыми пробками и обкатывают колпачками.dissolved in water, then mixed with an aqueous suspension of monolamellar liposomes, 50-80 nm in size, previously obtained by rehydration of the lipid film with subsequent disintegration of the resulting multilamellar liposomes, the resulting mixture of oligopeptides and liposomes is sterile filtered, poured into vials, lyophilized, filled with nitrogen, rubber stoppers and run in caps.
Далее согласно изобретению предлагается способ лечения рассеянного склероза, отличающийся тем, что пациенту вводят в эффективном количестве инъекционную лекарственную форму олигопептидовThe invention further provides a method for treating multiple sclerosis, characterized in that an injectable dosage form of oligopeptides is administered in an effective amount to a patient
GGDRGAPKRGSGKDSHHGGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHKGFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARRQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
которая содержит:which contains:
олигопептидыoligopeptides
GGDRGAPKRGSGKDSHHGGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHKGFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARRQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
включенные в липосомы размером от 100 до 200 нм, состоящие из 2,3-Дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина и маннозиалированого дипальмитоилфосфатидилэтаноламина (Man4DOG3K8);included in liposomes ranging in size from 100 to 200 nm, consisting of 2,3-dipalmitoyl-sn-glycero-1-phosphatidylcholine and mannosialized dipalmitoylphosphatidylethanolamine (Man 4 DOG 3 K 8 );
лактозу;lactose;
α-токоферол при следующем соотношении компонентов, мас.%:α-tocopherol in the following ratio of components, wt.%:
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.
Синтез олигопептидовSynthesis of Oligopeptides
GGDRGAPKRGSGKDSHHGGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHKGFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARRQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
осуществляли на автоматическом пептидном синтезаторе с использованием стандартной FMOC-стратегии. Строение олигопептидов было подтверждено с помощью MALDI-масс-спектрометрии.carried out on an automatic peptide synthesizer using a standard FMOC strategy. The structure of oligopeptides was confirmed using MALDI mass spectrometry.
Размер липосом в заявляемой инъекционной лекарственной форме определяли при помощи фотокорреляционного спектрометра Zetasizer Nano S. Для этого 100 мг порошка заявляемой лекарственной формы ресуспендировали в 1 мл воды для инъекций. Аликвоту 50 мкл вносили в кювету вместимостью 1 мл, содержащую 950 мкл воды, перемешивали, помещали в прибор и проводили измерения согласно инструкции производителя к прибору.The size of the liposomes in the inventive injectable dosage form was determined using a Zetasizer Nano S photocorrelation spectrometer. For this, 100 mg of the inventive dosage form powder was resuspended in 1 ml of water for injection. An aliquot of 50 μl was added to a 1 ml cuvette containing 950 μl of water, mixed, placed in a device, and measured according to the manufacturer's instructions for the device.
Фосфолипиды были закуплены в компании Sigma-Aldrich.Phospholipids were purchased from Sigma-Aldrich.
Пример 1. Приготовление заявляемой инъекционной лекарственной формы, содержащей олигопептиды GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR, включенные в липосомы.Example 1. Preparation of the inventive injectable dosage form containing oligopeptides GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR included in liposomes.
Приготовление раствора липидов в хлороформе. В круглодонную колбу ротационного испарителя РИ-1.1 объемом 10,0 л с помощью мерного цилиндра наливают 3,3 л хлороформа, добавляют 0,319 г липида Man4K3DOG, 31,95 г 2,3-дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфохолина и 0,319 г α-токоферола. На управляющем терминале ротационного испарителя устанавливают температуру бани 37°С, скорость перемешивания 50 об/мин и перемешивают в течение 15 мин до полного растворения.Preparation of a solution of lipids in chloroform. 3.3 L of chloroform is poured into a 10.0 L round-bottom flask of a RI-1.1 rotary evaporator using a measuring cylinder, 0.319 g of Man 4 K 3 DOG lipid, 31.95 g of 2,3-dipalmitoyl-sn-glycero-1- are added phosphocholine and 0.319 g of α-tocopherol. At the control terminal of the rotary evaporator, the bath temperature is set at 37 ° C, the stirring speed is 50 rpm and stirred for 15 minutes until completely dissolved.
Упаривание раствора липидов. Температуру бани ротационного испарителя устанавливают 40°С, задают скорость вращения 200 об/мин (Кт ТП.6.2-2) и начинают упаривать раствор липидов в хлороформе, полученный на предыдущей стадии, под вакуумом. Раствор упаривают до образования липидной пленки, о полноте отгонки растворителя судят по прекращению каплеотделения и помутнению липидной пленки. Конденсат хлороформа собирают в сборник конденсата. Колбу с липидной пленкой передают на следующую стадию.Evaporation of a lipid solution. The temperature of the bath of the rotary evaporator is set at 40 ° C, the rotation speed is set at 200 rpm (Kt TP.6.2-2) and the lipid solution in chloroform obtained in the previous step is evaporated under vacuum. The solution is evaporated to form a lipid film, the completeness of the distillation of the solvent is judged by the cessation of droplet separation and turbidity of the lipid film. The chloroform condensate is collected in a condensate collector. The lipid film flask is passed to the next step.
Регидратация липидной пленки. Температуру бани ротационного испарителя устанавливают 37°С, задают скорость вращения 200 об/мин. Осторожно приоткрывая вентиль на заборной линии подачи жидкости в колбу ротационного испарителя, содержащую липидную пленку, при помощи вакуума, добавляют первые 10% (305 мл) воды со средней скоростью, не превышающей примерно 10 мл/мин. Следующую порцию воды очищенной 20% (610 мл) добавляют таким образом, чтобы средняя скорость подачи воды не превышала примерно 20 мл/мин. Третью порцию воды 915 мл добавляют со скоростью примерно 30 мл/мин. Последнюю порцию воды 1220 мл добавляют со скоростью примерно 40 мл/мин.Rehydration of the lipid film. The temperature of the bath of the rotary evaporator is set to 37 ° C, the rotation speed of 200 rpm is set. Carefully opening the valve on the intake line of the liquid supply to the flask of the rotary evaporator containing the lipid film, using the vacuum, add the first 10% (305 ml) of water with an average speed not exceeding about 10 ml / min. The next portion of purified water 20% (610 ml) is added so that the average water flow rate does not exceed about 20 ml / min. A third portion of 915 ml of water is added at a rate of about 30 ml / min. A final portion of 1220 ml of water is added at a rate of about 40 ml / min.
По окончании добавления воды реакционную массу перемешивают в колбе ротационного испарителя в токе азота в течение 15-20 мин, затем передают ее на следующую стадиюUpon completion of the addition of water, the reaction mass is stirred in a flask of a rotary evaporator in a stream of nitrogen for 15-20 minutes, then transfer it to the next stage
Дезинтеграция липосом. Дезинтеграцию липосом ведут в гомогенизаторе APV-2000 для получения гомогенных малоразмерных липосом под давлением. Устанавливают давление ударного воздействия 150 МПа, минимальная единовременная загрузка суспензии липосом 100 мл. Рабочий цикл ведется при комнатной температуре в токе азота в течение 2 мин. Суспензию липосом загружают в приемник дезинтегратора Сб-4, осуществляют рабочий цикл, раствор малоразмерных липосом собирают в сборнике дезинтегратора. Таким образом, осуществляют 10 циклов дезинтеграции всего объема суспензии липосом, полученной после регидратации. В процессе 10 цикла дезинтеграции загружают 128,0 г лактозы. По окончании процесса дезинтеграции полученный раствор перемешивают для усреднения и отбирают пробу для определения размера липосом. При удовлетворительном результате контроля размера частиц 50-80 нм раствор передают на следующую стадию. При отрицательном результате контроля (размер частиц более 80 нм) раствор липосом подвергают повторной дезинтеграции.Disintegration of liposomes. Liposome disintegration is carried out in an APV-2000 homogenizer to obtain homogeneous small-sized liposomes under pressure. The pressure of shock is set at 150 MPa, the minimum one-time loading of a suspension of liposomes is 100 ml. The duty cycle is carried out at room temperature in a stream of nitrogen for 2 minutes. A suspension of liposomes is loaded into the receiver of the Sb-4 disintegrator, a work cycle is carried out, a solution of small sized liposomes is collected in a disintegrator collector. Thus, 10 cycles of disintegration of the entire volume of the liposome suspension obtained after rehydration are carried out. During the 10th disintegration cycle, 128.0 g of lactose is charged. At the end of the disintegration process, the resulting solution is mixed for averaging and a sample is taken to determine the size of the liposomes. With a satisfactory result of controlling the particle size of 50-80 nm, the solution is transferred to the next stage. If the control result is negative (particle size greater than 80 nm), the liposome solution is re-disintegrated.
Приготовление смеси целевых олигопептидов и липосом: в смесительный модуль Mobius Single-use Mixing Systems объемом 10,0 л устанавливают разовую полиэтиленовую емкость. К азотному порту разовой полиэтиленовой емкости смесительного модуля присоединяют шланг подачи стерильного азота, остальные загрузочные и разгрузочные порты при этом перекрыты. Разовым кратковременным открытием вентиля на линии подачи азота расправляют полиэтиленовую емкость. После этого открывают порт подачи жидких реагентов и с помощью мерного цилиндра загружают 24 мл воды очищенной, на терминале управления задают параметры перемешивания и включают магнитную мешалку. Открыв порт подачи сухих реагентов, при перемешивании, добавляют 0,479 г комбинации олигопептидов в равном мольном соотношении (0,136 мг - олигопептида GGDRGAPKRGSGKDSHH, 0,135 мг - олигопептида GFGYGGRASDYKSAHK, 0,208 мг - олигопептида QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR). Перемешивают в течение 10 минут до полного растворения. По окончании растворения, через порт подачи жидких реагентов добавляют суспензию липосом, полученную на стадии «Дезинтеграция липосом», перемешивают под азотной подушкой в течение 30 мин, при этом загрузочные порты закрыты. Готовую смесь олигопептидов и липосом передают на следующую стадию.Preparation of a mixture of target oligopeptides and liposomes: a single polyethylene container is installed in a 10.0 L Mobius Single-use Mixing Systems mixing module. A sterile nitrogen supply hose is connected to the nitrogen port of a single polyethylene container of the mixing module, while the remaining loading and unloading ports are closed. A single short-term opening of the valve on the nitrogen supply line straightens the polyethylene container. After that, the liquid reagent supply port is opened and 24 ml of purified water is loaded using a graduated cylinder, the mixing parameters are set at the control terminal and the magnetic stirrer is turned on. Having opened the dry reagent supply port, with stirring, 0.479 g of a combination of oligopeptides in an equal molar ratio are added (0.136 mg of the oligopeptide GGDRGAPKRGSGKDSHH, 0.135 mg of the oligopeptide GFGYGGRASDYKSAHK, 0.208 mg of the oligopeptide QGTLSKIFGLGGRGRGRGRGRGRGRGRGLGGRGL. Stirred for 10 minutes until completely dissolved. At the end of dissolution, the liposome suspension obtained in the “Liposome Disintegration” stage is added through the liquid reagent supply port, stirred under a nitrogen pad for 30 minutes, while the loading ports are closed. The finished mixture of oligopeptides and liposomes is passed to the next stage.
Стерилизующее фильтрование. По окончании перемешивания при помощи силиконового шланга соединяют разгрузочный порт смесительного модуля с системой стерилизующих фильтров диаметром пор 0,45/0,22 мкм, которая соединена с разовой приемной емкостью стерильной смеси при помощи шланга с обжимным концом. Питающий конец силиконового шланга находится в зоне класса чистоты С. Шланг через уплотнительную муфту входит в изолятор, стерилизующая система, обжимной шланг и приемная емкость находится в изоляторе.Sterilizing filtering. At the end of mixing, the discharge port of the mixing module is connected with a silicone hose to a system of sterilizing filters with a pore diameter of 0.45 / 0.22 μm, which is connected to a single receiving container of the sterile mixture using a hose with a crimp end. The feeding end of the silicone hose is in the zone of cleanliness class C. The hose through the sealing sleeve enters the insulator, the sterilizing system, the crimp hose and the receiving container are in the insulator.
Открывают разгрузочный порт смесительного модуля и вентиль на подачи стерильного азота. Передавливают смесь олигопептидов и липосом через собранную стерилизующую систему в приемную емкость, во время фильтрации смеси контролируют давление на линии подачи стерильного азота по показаниям манометра, корректируя с помощью редуктора значение давления от 0,07 до 0,15 МПа (от 0,7 до 1,5 бар). Прекращают подачу азота в смесительный модуль и перекрывают обжимной шланг к приемной емкости стерильной смеси.The discharge port of the mixing module and the valve for supplying sterile nitrogen are opened. The mixture of oligopeptides and liposomes is pumped through the assembled sterilizing system into the receiving tank, during filtration of the mixture, the pressure on the sterile nitrogen supply line is monitored according to the pressure gauge, adjusting the pressure value from 0.07 to 0.15 MPa (from 0.7 to 1 using a reducer) 5 bar). Stop the nitrogen supply to the mixing module and close the crimp hose to the receiving container of the sterile mixture.
При помощи силиконовых шлангов соединяют приемную емкость стерилизованной смеси с депирогенизирующим фильтром 0,22 мкм и разовой приемной емкостью депирогенизированного раствора, установленной на магнитной мешалке. Включают магнитную мешалку. К емкости стерилизованной смеси присоединяют линию подачи стерильного азота и открытием вентиля подачи азота передавливают смесь через депирогенизирующий фильтр в приемную емкость.Using silicone hoses, the receiving container of the sterilized mixture is connected with a 0.22 μm depyrogenation filter and a one-time depyrogenated solution receiving tank mounted on a magnetic stirrer. Turn on the magnetic stirrer. A sterile nitrogen supply line is connected to the container of the sterilized mixture, and by opening the nitrogen supply valve, the mixture is pressed through the depyrogenation filter into the receiving container.
Силиконовый шланг, соединяющий депирогенизирующий фильтр с финишной приемной емкостью, перекрывают зажимом с образованием блокирующего полукольца. Аналогичным полукольцом блокируют силиконовый шланг, соединяющий разгрузочный порт смесительного модуля с системой стерилизующих фильтров. Отсоединяют силиконовые шланги с входного фитинга стерилизующего фильтра и выходного фитинга депирогенизирующего фильтра. Снимают соединения азотной линии с приемной емкости стерилизованной смеси. Отсоединенную разовую стерилизующую систему сбрасывают в контейнер для отходов, предусмотренный в изоляторе.The silicone hose connecting the depyrogenation filter to the final receiving tank is closed with a clamp to form a blocking half ring. A similar half-ring blocks the silicone hose connecting the discharge port of the mixing module with a sterilizing filter system. Disconnect the silicone hoses from the inlet fitting of the sterilizing filter and the outlet fitting of the depyrogenation filter. Remove the nitrogen line compounds from the receiving tank of the sterilized mixture. The disconnected one-time sterilizing system is dumped into the waste container provided in the isolator.
Стерилизованную и депирогенизированную смесь олигопептидов и липосом перемешивают в течение 15 мин. По окончании перемешивания отбирают пробу для определения концентрации смеси. Готовую стерилизованную и депирогенизированную смесь олигопептидов и липосом передают на следующую стадию.The sterilized and depyrogenated mixture of oligopeptides and liposomes is mixed for 15 minutes. At the end of mixing, a sample is taken to determine the concentration of the mixture. The finished sterilized and depyrogenated mixture of oligopeptides and liposomes is passed to the next stage.
Стерильный розлив и лиофильная сушка. Стерильные флаконы для инъекций объемом 10 мл, в количестве 1000 шт. заносят в передаточный шлюз изолятора, снимают первичную упаковку, закрывают крышку шлюза и обрабатывают флаконы УФ-излучением в течение 15 минут. Тем временем из лиофильной сушилки Epsilon 2-1 OD, находящейся в изоляторе, достают поддоны и устанавливают на стол изолятора. По окончании обработки флаконов УФ-излучением открывают внутреннюю крышку шлюза, ведущую в изолятор, вскрывают первичную упаковку и устанавливают флаконы в поддоны лиофильной сушилки Epsilon 2-10D, использованную упаковку сбрасывают в контейнер для отходов, предусмотренный в изоляторе. Таким же образом заносятся стерильные крышки и колпачки флаконов в изолятор.Sterile filling and freeze drying. Sterile injection vials with a volume of 10 ml, in the amount of 1000 pcs. put into the transfer gateway of the insulator, remove the primary packaging, close the cover of the gateway and process the bottles with UV radiation for 15 minutes. Meanwhile, pallets are removed from the Epsilon 2-1 OD freeze dryer located in the insulator and placed on the insulator table. At the end of the treatment of the vials with UV radiation, the inner gateway cover leading to the insulator is opened, the primary packaging is opened and the vials are placed in the pallets of the Epsilon 2-10D freeze dryer, the used packaging is dumped into the waste container provided in the insulator. In the same way, sterile caps and bottle caps are inserted into the insulator.
Стерилизованная и депирогенизированная смесь олигопептидов и липосом из приемной емкости при помощи диспенсера eLINE Pro дозируется во флаконы примерно по 2,5 мл с учетом концентрации смеси, таким образом, чтобы концентрация действующего вещества в конечном лиофилизате составляла 0,45 мг в одном флаконе. По окончании дозирования смеси на каждый флакон легким нажатием устанавливается крышка, таким образом, чтобы оставалось отверстие для испарения жидкости. Не плотно укупоренные флаконы на поддонах устанавливаются в лиофильную сушилку Epsilon 2-10D.A sterilized and depyrogenized mixture of oligopeptides and liposomes from the receiving container is dispensed with the eLINE Pro dispenser into approximately 2.5 ml vials, taking into account the concentration of the mixture, so that the concentration of the active substance in the final lyophilisate is 0.45 mg in one vial. At the end of the dosing of the mixture, a cap is placed on each bottle with a light pressure, so that there remains an opening for the evaporation of the liquid. Vials on pallets that are not tightly sealed are installed in an Epsilon 2-10D freeze dryer.
Производится процесс лиофильного высушивания: задается температура полок -(45±2)°С и время замораживания 3-4 часа. После достижения материалом указанной температуры производится выдержка в течение 5-6 часов. Конденсатор сушилки охлаждается до -(80±5)°С и включается вакуумный насос. Остаточное давление в сушилке задают 0,01 mbar (1 Па), время выхода на режим сублимации составляет 55-65 мин. Производится сушка препарата в течение 6 часов при указанных параметрах. По истечении указанного времени начинается постепенный нагрев полок и материала со скоростью (5-6)°С в час, задается остаточное давление 0,005 mbar. При достижении температуры (8-10)°С нагрев прекращается и выдерживается материал в этих условиях в течение 3 часов. Об окончании процесса высушивания свидетельствует постоянная температура материала, равная температуре полок, постоянный уровень вакуума (0,005 mbar), срабатывает датчик понижения давления паров. По окончании сушки отключается вакуумный насос, камера сушилки заполняется сухим стерильным азотом и в автоматическом режиме происходит заключительное укупоривание флаконов.The process of freeze drying is carried out: the temperature of the shelves is set - (45 ± 2) ° С and the freezing time is 3-4 hours. After the material reaches the specified temperature, exposure is carried out for 5-6 hours. The dryer condenser is cooled to - (80 ± 5) ° С and the vacuum pump is turned on. The residual pressure in the dryer is set to 0.01 mbar (1 Pa), the time for reaching the sublimation mode is 55-65 minutes. The drug is dried for 6 hours at the specified parameters. After the specified time, gradual heating of the shelves and material begins at a speed of (5-6) ° C per hour, the residual pressure of 0.005 mbar is set. Upon reaching a temperature of (8-10) ° C, heating ceases and the material is maintained under these conditions for 3 hours. The end of the drying process is evidenced by a constant material temperature equal to the temperature of the shelves, a constant vacuum level (0.005 mbar), a vapor pressure reduction sensor is triggered. At the end of the drying process, the vacuum pump is switched off, the dryer chamber is filled with dry sterile nitrogen and the final corking of the bottles takes place automatically.
Получают 1000 флаконов лиофилизированного продукта, каждый флакон содержит 125,98±6,0 мг лиофилизата.1000 vials of lyophilized product are obtained, each vial containing 125.98 ± 6.0 mg of lyophilisate.
Также применялись различные варианты приготовления лекарственной формы, в том числе оптимальное количество лактозы, что определялось по количеству включенного пептидного компонента после регидратации.Various options for the preparation of the dosage form were also used, including the optimal amount of lactose, which was determined by the amount of the included peptide component after rehydration.
Пример 2. Лечебная эффективность заявляемой инъекционной лекарственной формы, содержащей олигопептиды GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR в отношении развития и течения экспериментального аллергического энцефаломиелита у крыс линии DA.Example 2. Therapeutic efficacy of the inventive injectable dosage form containing oligopeptides GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR regarding the development and course of experimental allergic encephalomyelitis in rats of the DA strain.
Для индукции ЭАЭ крысам линии DA, массой 220-250 г (возраст 12-14 месяцев), подкожно в переднюю лапку вводили 10 мкг энцефалогенного фрагмента основного белка миелина (ARTTHYGSLPQKSQRSQ), («Anaspec»,CUJA), эмульсифицированного в полном адъюванте Фрейнда («Difco», США) (1:10, вес/объем). Крысы взвешивались каждый день и оценивались на наличие неврологических симптомов ЭАЭ. Оценка производилась в соответствии со следующей шкалой: (0) - отсутствие симптомов ЭАЭ; (1) - снижение тонуса хвоста; (2) - снижение рефлекса выпрямления; (3) - парезы; (4) - полный паралич; (5) - агония или смерть. Менее выраженные симптомы ЭАЭ оценивались в 0,5 балла. На 6 день после индукции ЭАЭ животные случайным образом распределялись в различные группы (по 12 животных в группе). Животным соответствующей группы, с 6 по 11 дни включительно (после индукции) вводили подкожно: либо заявляемую инъекционную лекарственную форму, приготовленную, как это описано в Примере 1, разведенную (эмульгированные в фосфатном солевом растворе, рН 7.4) (ФБР), либо плацебо (растворитель - забуференный фосфатный солевой раствор (ФБР) (рН 7.4)), либо раствор механической смеси олигопептидов GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR, взятых в эквимолярном соотношении в (ФБР) (рН 7.4). Все растворы готовили с использованием в качестве растворителя забуференного фосфатного солевого раствора (ФБР) (рН 7.4). Препараты вводились в объеме 0,1 мл/животное ежедневно один раз в день. Разовая доза препаратов составляла (в пересчете на пептидный компонент) 160 мкг на животное.To induce EAE, rats of the DA line weighing 220–250 g (age 12–14 months) were injected subcutaneously in the foreleg with an encephalogen fragment of the myelin basic protein (ARTTHYGSLPQKSQRSQ), (Anaspec, CUJA), emulsified in Freund’s complete adjuvant ( Difco, USA) (1:10, weight / volume). Rats were weighed every day and evaluated for neurological symptoms of EAE. The assessment was carried out in accordance with the following scale: (0) - absence of symptoms of EAE; (1) - a decrease in the tone of the tail; (2) - reduction of the straightening reflex; (3) - paresis; (4) - complete paralysis; (5) - agony or death. Less severe symptoms of EAE were rated at 0.5 points. On the 6th day after the induction of EAE, the animals were randomly distributed into various groups (12 animals per group). Animals of the corresponding group, from 6 to 11 days inclusive (after induction) were injected subcutaneously: either the inventive injectable dosage form, prepared as described in Example 1, diluted (emulsified in phosphate saline, pH 7.4) (FBI), or placebo ( the solvent is a buffered phosphate saline (FBI) (pH 7.4)), or a solution of a mechanical mixture of oligopeptides GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR taken in equimolar ratio in (FBI) (pH 7.4). All solutions were prepared using buffered phosphate saline (PBS) as a solvent (pH 7.4). Drugs were administered in a volume of 0.1 ml / animal daily once a day. A single dose of the preparations was (in terms of the peptide component) 160 μg per animal.
Результаты эксперимента представлены в Таблице 1:The results of the experiment are presented in Table 1:
Как следует из таблицы 1, заявленная инъекционная лекарственная форма обладает гораздо большей способностью уменьшать выраженность и скорость развития симптомов ЭАЭ у животных, чем механическая смесь олигопептидов GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR.As follows from table 1, the claimed injectable dosage form has a much greater ability to reduce the severity and rate of development of symptoms of EAE in animals than the mechanical mixture of oligopeptides GGDRGAPKRGSGKDSHH; GFGYGGRASDYKSAHK; QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR.
Claims (2)
GGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
отличающаяся тем, что содержит:
олигопептиды
GGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
включенные в липосомы размером от 80 до 50 нм и состоящие из 2,3-Дипальмитоил-sn-глицеро-1-фосфатидилхолина и маннозиалированого дипальмитоилфосфатидилэтаноламина (Man4DOG3K8);
лактозу;
α-токоферол при следующем соотношении компонентов, мас.%:
GGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
characterized in that it contains:
oligopeptides
GGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
included in liposomes ranging in size from 80 to 50 nm and consisting of 2,3-dipalmitoyl-sn-glycero-1-phosphatidylcholine and mannosialized dipalmitoylphosphatidylethanolamine (Man 4 DOG 3 K 8 );
lactose;
α-tocopherol in the following ratio of components, wt.%:
олигопептидов
GGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
по п.1, отличающийся тем, что механическую смесь олигопептидов
GGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
растворяют в воде, затем смешивают с водной суспензией моноламеллярных липосом, размером 50-80 нм, предварительно полученных путем регидратации липидной пленки с последующей дезинтеграцией получившихся мультиламеллярных липосом и контролем размера частиц, и добавлением лактозы, полученную смесь олигопептидов и липосом стерильно фильтруют, разливают по флаконам, лиофильно высушивают, заполняют азотом, укупоривают резиновыми пробками и обкатывают колпачками. 2. A method of preparing an injectable dosage form
oligopeptides
GGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
according to claim 1, characterized in that the mechanical mixture of oligopeptides
GGDRGAPKRGSGKDSHH
GFGYGGRASDYKSAHK
QGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR
dissolved in water, then mixed with an aqueous suspension of monolamellar liposomes, 50-80 nm in size, previously obtained by rehydration of the lipid film followed by disintegration of the resulting multilamellar liposomes and particle size control, and lactose added, the resulting mixture of oligopeptides and liposomes is sterile filtered, poured into vials , freeze-dried, filled with nitrogen, corked with rubber stoppers and wrapped in caps.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010147431/15A RU2561582C2 (en) | 2010-11-19 | 2010-11-19 | Injectable dosage form of oligopeptide preparation for treating multiple sclerosis and method for producing it |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010147431/15A RU2561582C2 (en) | 2010-11-19 | 2010-11-19 | Injectable dosage form of oligopeptide preparation for treating multiple sclerosis and method for producing it |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2010147431A RU2010147431A (en) | 2012-05-27 |
| RU2561582C2 true RU2561582C2 (en) | 2015-08-27 |
Family
ID=46231393
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010147431/15A RU2561582C2 (en) | 2010-11-19 | 2010-11-19 | Injectable dosage form of oligopeptide preparation for treating multiple sclerosis and method for producing it |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2561582C2 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0393707A2 (en) * | 1989-04-21 | 1990-10-24 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Bioactive compounds associated with liposomes and their use in pharmaceutical preparations |
| RU2266129C2 (en) * | 1996-03-05 | 2005-12-20 | Риджентс оф Дзе Юниверсити оф Калифорния | Method for treating neurodegenerative disorder or myelinogenesis disorder |
| WO2010113984A1 (en) * | 2009-03-30 | 2010-10-07 | エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 | Liposome composition |
-
2010
- 2010-11-19 RU RU2010147431/15A patent/RU2561582C2/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0393707A2 (en) * | 1989-04-21 | 1990-10-24 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Bioactive compounds associated with liposomes and their use in pharmaceutical preparations |
| RU2266129C2 (en) * | 1996-03-05 | 2005-12-20 | Риджентс оф Дзе Юниверсити оф Калифорния | Method for treating neurodegenerative disorder or myelinogenesis disorder |
| WO2010113984A1 (en) * | 2009-03-30 | 2010-10-07 | エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 | Liposome composition |
Non-Patent Citations (1)
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2010147431A (en) | 2012-05-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2010206854A1 (en) | Compositions and methods for induction of antigen-specific tolerance | |
| WO2013184976A2 (en) | Compositions and methods for antigen-specific tolerance | |
| JP2012072157A (en) | Improved saponin adjuvant composition, and method relating thereto | |
| JP2000514035A (en) | Method for producing liposome preparation | |
| JP2019196363A (en) | Liposome-based immunotherapy | |
| RU2448685C2 (en) | Liposomes containing oligopeptides - fragments of myelin basic protein, pharmaceutical composition and method of treating multiple sclerosis | |
| TW201138805A (en) | Composition of organic compounds | |
| Liu et al. | A biomimetic yeast shell vaccine coated with layered double hydroxides induces a robust humoral and cellular immune response against tumors | |
| ES2260070T3 (en) | METHOD IN CONTINUOUS FLOW TO PREPARE MICROPARTICLES. | |
| RU2561582C2 (en) | Injectable dosage form of oligopeptide preparation for treating multiple sclerosis and method for producing it | |
| EP2643344A1 (en) | Human lactoferrin derived peptide for use as an antigen masking agent | |
| AU2019337456A1 (en) | Methods for the preparation of a pharmaceutical-vesicle formulation and associated products and uses | |
| US9539321B2 (en) | HMGB1-derived peptides enhance immune response to antigens | |
| JP4724000B2 (en) | Polypeptide | |
| CN102188379B (en) | Preparation method of drug-carrying liposome | |
| KR102047910B1 (en) | Fish Oral Vaccine Liposomes and Preparation Method Thereof | |
| EP4215186A1 (en) | Treatment of celiac disease with tolerizing particles | |
| CN101502649A (en) | A liposomal influenza vaccine | |
| AU2012285710B2 (en) | Dosage of DnaK | |
| CA2528292A1 (en) | A method for treating cancer patients undergoing chemotherapy | |
| KR101627455B1 (en) | Chimeric peptide having antimicrobial activity and antimicrobial composition comprising the same | |
| RU2600031C2 (en) | Dosage form of specific immunobiological medicine for treating and preventing hiv infection and preparation method thereof | |
| EP2735314B1 (en) | Sugar-coated liposome composition | |
| US20030095975A1 (en) | Vaccine adjuvants comprising ginseng plant extract and added aluminium salt | |
| CN116437938A (en) | Peptide formulations and methods of use thereof |