RU2554755C1

RU2554755C1 - Diagnostic technique for rheumatoid arthritis

Info

Publication number: RU2554755C1
Application number: RU2014121267/15A
Authority: RU
Inventors: Дарья Анатольевна Жебрун; Арег Артемович Тотолян
Priority date: 2014-05-26
Filing date: 2014-05-26
Publication date: 2015-06-27

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: patient's synovial fluid is sampled, and patient's supernatant chemokines CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10 and CXCL11/ITAC are measured. A diagnosis of rheumatoid arthritis is diagnosed, if at least one of chemokines exceeds a threshold; the chemokine thresholds make 2625.8 pg/ml for CXCL9/MIG, 3108.2 pg/ml for CXCL9/MIG and 32.4 pg/ml for CXCL11/ITAC respectively. If the measured values are below the thresholds for three chemokines at the same time, the absence of rheumatoid arthritis and potential osteoarthrosis are stated.

EFFECT: using the given method enables differentiating rheumatoid arthritis and osteoarthrosis by measuring specific markers in the synovial fluid taken from the location directly.

2 ex

Description

Изобретение относится к области медицины, в частности к ревматологии.The invention relates to medicine, in particular to rheumatology.

Ревматоидный артрит (РА) является одним из наиболее распространенных аутоиммунных заболеваний. Социальная значимость данного заболевания не вызывает сомнений. Диагностические критерии РА, используемые в настоящее время, были предложены Американской коллегией ревматологов (АКР) в 2010 г. (Aletaha D. et al. 2010. "2010 rheumatoid arthritis classification criteria: an American College of Rheumatology/European League Against Rheumatism collaborative initiative". Ann. Rheum. Dis. 69 (9): 1580-8. doi:10.1136/ard. 2010.138461. PMID 20699241). Согласно данным рекомендациям, лабораторными критериями для диагностики РА являются ревматоидный фактор (РФ) и антитела к циклическому цитруллинсодержащему пептиду (АЦЦП).Rheumatoid arthritis (RA) is one of the most common autoimmune diseases. The social significance of this disease is not in doubt. The currently used diagnostic criteria for RA were proposed by the American College of Rheumatology (AKP) in 2010 (Aletaha D. et al. 2010. "2010 rheumatoid arthritis classification criteria: an American College of Rheumatology / European League Against Rheumatism collaborative initiative" Ann. Rheum. Dis. 69 (9): 1580-8. Doi: 10.1136 / ard. 2010.138461. PMID 20699241). According to these recommendations, laboratory criteria for the diagnosis of RA are rheumatoid factor (RF) and antibodies to the cyclic citrulline-containing peptide (ADC).

Известен способ лабораторного обследования при подозрении на РА, включающий определение скорости оседания эритроцитов, содержания в сыворотке крови С-реактивного белка, электролитов, РФ и АЦЦП (последние - только по мере необходимости); общий анализ мочи; биохимические исследования (печеночные ферменты, креатинин, общий белок), описанный в монографии под ред. Насонова Е.Л., 2008. Ревматология. Клинические рекомендации. - М.: ГЭОТАР-Медиа. Понятно, что большинство вышеуказанных лабораторных показателей не являются специфичными для РА.A known method of laboratory examination for suspected RA, including determining the erythrocyte sedimentation rate, serum C-reactive protein, electrolytes, RF and ADCP (the latter only as necessary); general urine analysis; biochemical studies (liver enzymes, creatinine, total protein), described in the monograph under the editorship of Nasonova EL, 2008. Rheumatology. Clinical recommendations. - M.: GEOTAR-Media. It is understood that most of the above laboratory parameters are not specific for RA.

Наиболее распространен метод дифференциальной диагностики ревматоидного артрита путем определения в сыворотке крови РФ. Он достаточно прост в исполнении и широко внедрен в практику. Ревматоидный фактор выявляется у 70-90% больных РА. Однако главным недостатком определения данного показателя в сыворотке крови является низкая чувствительность и специфичность на ранней стадии РА. К тому же частота выявления РФ, значения которого превышают пороговое, у здоровых людей среднего возраста составляет около 3%, а у пожилых - 15%. Диагностические уровни РФ часто встречаются при синдроме Шегрена, гранулематозе Вегенера, аутоиммунных поражениях печени, системной красной волчанке (СКВ), криоглобулинемии и реже при многих других аутоиммунных заболеваниях, а также хронических инфекциях, в частности подостром септическом эндокардите, туберкулезе, вирусном гепатите С. Кроме того, существует так называемая серонегативная форма РА, при котором уровень ревматоидного фактора не превышает нормальные значения вне зависимости от длительности заболевания (Conrad К., Roggenbuck D., Reinhold D., Dörner T. Profiling of rheumatoid arthritis associated autoantibodies. Autoimmun. Rev. 2010 9 (6):431-435).The most common method is the differential diagnosis of rheumatoid arthritis by determination in the blood serum of the Russian Federation. It is quite simple to implement and widely implemented in practice. Rheumatoid factor is detected in 70-90% of patients with RA. However, the main drawback of determining this indicator in blood serum is the low sensitivity and specificity at an early stage of RA. In addition, the frequency of detection of the RF, the values of which exceed the threshold, in healthy middle-aged people is about 3%, and in the elderly - 15%. Diagnostic levels of the Russian Federation are often found in Sjögren’s syndrome, Wegener's granulomatosis, autoimmune liver lesions, systemic lupus erythematosus (SLE), cryoglobulinemia and less commonly in many other autoimmune diseases, as well as chronic infections, in particular subacute septic endocarditis, C. tuberculosis, and viral hepatitis Moreover, there is the so-called seronegative form of RA, in which the level of the rheumatoid factor does not exceed normal values regardless of the duration of the disease (Conrad K., Roggenbuck D., Reinhol d D., Dörner T. Profiling of rheumatoid arthritis associated autoantibodies. Autoimmun. Rev. 2010 9 (6): 431-435).

Известен способ диагностики PA с помощью относительно новых маркеров заболевания - АЦЦП и антикератиновых антител (АКА), которые обладают более высокой специфичностью (Kamali et al. Anti-CCP and antikeratin antibodies in rheumatoid arthritis, primary Sjogren′s syndrome, and Wegener′s granulomatosis. Clin Rheumatol. 2005. 24 (6): 673-6; Маслянский А.Л., Лапин СВ., Мазинг А.В., Булгакова Т.В., Лазарева Н.М., Чешуина М.Д., Олейник П.А., Иливанова Е.П., Тотолян А.А., Мазуров В.И. Диагностическая значимость серологических маркеров ревматоидного артрита. Научно-практическая ревматология, 2012, №5 (54). С. 20-24). АЦЦП и АКА определяются в сыворотке при помощи иммуноферментного анализа и непрямой иммунофлуоресценции. Чувствительность и специфичность при РА - 77% и 95% для АЦЦП и 42% и 91% для АКА соответственно. Данный способ позволяет выявить РА, серонегативный по РФ. Однако остается некоторая вероятность обнаружения АЦЦП и АКА при других воспалительных поражениях суставов (2-3%) и при других типах аутоиммунных заболеваний. Кроме того, данный способ является достаточно трудоемким, длительным и дорогим в постановке и используется достаточно ограничено, в отличие, например, от определения РФ.A known method for the diagnosis of PA using relatively new disease markers - ADC and anti-keratin antibodies (AKA), which have higher specificity (Kamali et al. Anti-CCP and antikeratin antibodies in rheumatoid arthritis, primary Sjogren's syndrome, and Wegener's granulomatosis Clin Rheumatol. 2005.24 (6): 673-6; Maslyansky A.L., Lapin S.V., Masing A.V., Bulgakova T.V., Lazareva N.M., Cheshuina M.D., Oleinik P.A., Ilivanova E.P., Totolyan A.A., Mazurov V.I. Diagnostic significance of serological markers of rheumatoid arthritis. Scientific and Practical Rheumatology, 2012, No. 5 (54), pp. 20-24). ADC and AKA are determined in serum using enzyme-linked immunosorbent assay and indirect immunofluorescence. The sensitivity and specificity for RA are 77% and 95% for ACCP and 42% and 91% for AKA, respectively. This method allows you to identify RA, seronegative in the Russian Federation. However, there remains some likelihood of detecting ACCP and AKA in other inflammatory joint lesions (2-3%) and in other types of autoimmune diseases. In addition, this method is quite time-consuming, lengthy and expensive to set up and is used quite limitedly, in contrast, for example, from the definition of the Russian Federation.

Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению является способ диагностики РА с использованием синовиальной жидкости (Авторское свидетельство SU 1810829, 1993). Сущность метода состоит в том, что в синовиальной жидкости методом электронного парамагнитного резонанса определяют содержание двухвалентной меди, входящей в состав церулоплазмина, и трехвалентного железа, связанного с трансферрином, и при концентрации Cu+2 - церулоплазмина 1,73×10-5 M и более и уровня Fe3+-трансферрина 7,19 мкмоль/л и менее диагностируют ревматоидный артрит, а при уровне Cu+2 - церулоплазмина 1,64×10-5 M и менее и концентрации Fe3+-трансферрина 11,49 мкмоль/л и более диагностируют деформирующий остеоартроз. Однако в настоящее время данный метод не используется на практике, т.к. требует специализированного оборудования (ЭПР-спектрометр).The closest in essence to the claimed invention is a method for the diagnosis of RA using synovial fluid (Copyright certificate SU 1810829, 1993). The essence of the method is that in the synovial fluid by the method of electron paramagnetic resonance determine the content of divalent copper, which is part of ceruloplasmin, and ferric iron associated with transferrin, and at a concentration of Cu + 2 - ceruloplasmin 1.73 × 10-5 M or more and a Fe3 + -transferrin level of 7.19 μmol / L or less, rheumatoid arthritis is diagnosed, and at a Cu + 2 level of ceruloplasmin 1.64 × 10-5 M or less and a Fe3 + -transferrin concentration of 11.49 μmol / L or more, deforming osteoarthrosis. However, at present, this method is not used in practice, since requires specialized equipment (EPR spectrometer).

Изобретение направлено на разработку способа дифференциальной диагностики РА с остеоартрозом (OA), обладающего достаточной чувствительностью и специфичностью, с использованием синовиальной жидкости в качестве исследуемого биоматериала. Поставленная задача достигается тем, что производится взятие синовиальной жидкости пациента, центрифугирование пробы с отделением супернатанта, с последующим установлением диагноза по содержанию белковых продуктов в супернатанте. Авторами предложено в качестве определяемых белковых продуктов использовать хемокины класса СХС, а именно CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10 и CXCL11/ITAC. Для диагностики ревматоидного артрита необходимо определить значения содержания хемокинов в супернатанте. В результате проведенных исследований были установлены пороговые значения для данных хемокинов, которые составляют, соответственно, 2625,8 пг/мл для CXCL9/MIG, 3108,2 пг/мл для CXCL9/MIG и 32,4 пг/мл для CXCL11/ITAC. При превышении порогового значения хотя бы одним из хемокинов диагностируется РА. Если значения содержания хемокинов в супернатанте ниже пороговых для трех хемокинов одновременно констатируют отсутствие РА и возможное наличие OA. Преимуществами предлагаемого способа по сравнению с традиционными методами являются то, что определение специфичных маркеров проводится в синовиальной жидкости, полученной непосредственно в месте локализации процесса (внутри сустава), а не в сыворотке крови. Для проведения анализа необходимо очень небольшое количество биоматериала (достаточно 100 мкл синовиальной жидкости), при этом достигается высокая диагностическая значимость в дифференциации между лицами с РА и лицами с OA. Риск для пациента от применения данного способа сведен к минимуму, данный способ не влияет на здоровье пациентов и позволяет ускорить, стандартизировать и автоматизировать процесс получения окончательного результата диагностики.The invention is directed to the development of a method for differential diagnosis of RA with osteoarthrosis (OA), which has sufficient sensitivity and specificity, using synovial fluid as a test material. The task is achieved in that the patient’s synovial fluid is taken, the sample is centrifuged to separate the supernatant, followed by a diagnosis of protein products in the supernatant. The authors proposed to use chemokines of the CXC class as defined protein products, namely CXCL9 / MIG, CXCL10 / IP-10 and CXCL11 / ITAC. For the diagnosis of rheumatoid arthritis, it is necessary to determine the values of the chemokine content in the supernatant. As a result of the studies, threshold values were established for these chemokines, which are, respectively, 2625.8 pg / ml for CXCL9 / MIG, 3108.2 pg / ml for CXCL9 / MIG and 32.4 pg / ml for CXCL11 / ITAC. If the threshold value is exceeded, at least one of the chemokines is diagnosed with RA. If the chemokine content in the supernatant is lower than the threshold for three chemokines, the absence of RA and the possible presence of OA are simultaneously observed. The advantages of the proposed method compared to traditional methods are that the determination of specific markers is carried out in the synovial fluid obtained directly at the localization of the process (inside the joint), and not in blood serum. An analysis requires a very small amount of biomaterial (100 μl of synovial fluid is sufficient), while achieving high diagnostic significance in the differentiation between individuals with RA and those with OA. The risk for the patient from the use of this method is minimized, this method does not affect the health of patients and allows you to speed up, standardize and automate the process of obtaining the final diagnostic result.

Изобретение реализуется следующим образом.The invention is implemented as follows.

Пример 1. Выбор порогового значения содержания хемокинов.Example 1. The choice of the threshold value of the content of chemokines.

Для расчетов пороговых значений использовали значения содержания исследуемых хемокинов в группах с РА и OA. Образцы синовиальной жидкости (не менее 100 мкл) от лиц с подозрением на РА или OA отбираются в стерильный шприц при проведении артроскопических манипуляций (диагностическая или ревизионная артроскопия, артроскопическая синовэктомия), далее переносятся в стерильные пробирки и центрифугируются при 1000 g при +4°С в течение 15 минут. Супернатант отбирается в промаркированную сухую пробирку и может храниться при -80°С до постановки эксперимента. Для определения содержания хемокинов в супернатанте используют технологию мультиплексного иммуноферментного анализа по стандартным методикам согласно инструкциям производителя (Millipore, США). Статистическую обработку проводили в программах GRAPH Pad Prism 6.02 и GMP 11.0. Использовали непараметрические тесты (тест Манна-Уитни), данные были представлены в виде медианы с указанием первого и третьего квартилей (Me [Q25;Q75]. Для оценки диагностической ценности анализируемых биомаркеров был проведен анализ характеристической кривой (receiver-operating-characteristic curve-ROC) при фиксированном значении специфичности (87,5%). Были рассмотрены графические изображения характеристических кривых и определены значения площади под кривой - AUC (Area Under the Curve), а также отношение правдоподобия положительного результата (ОПП), которые определяют значимость теста для диагностики. Результаты анализа показали, что все три биомаркера в отдельности обладают достаточно высокой чувствительностью (78,5-94,7%), что позволяет их использование с диагностической целью. Значения AUC для всех трех хемокинов были более 0,8, что говорит об очень хорошем качестве выбранной модели. Для всех трех хемокинов ОПП было более 6, а это говорит о хорошей диагностической информативности. В результате анализа были получены следующие пороговые значения: для CXCL9/MIG - 4461 пг/мл, для CXCL10/IP-10 - 3893 пг/мл, для CXCL11/ITAC - 31,92 пг/мл.To calculate the threshold values, the values of the content of the studied chemokines in groups with RA and OA were used. Synovial fluid samples (at least 100 μl) from individuals with suspected RA or OA are taken into a sterile syringe during arthroscopic procedures (diagnostic or revision arthroscopy, arthroscopic synovectomy), then transferred to sterile tubes and centrifuged at 1000 g at + 4 ° С for 15 minutes. The supernatant is collected in a labeled dry tube and can be stored at -80 ° C until experiment. To determine the chemokine content in the supernatant, the technology of multiplex enzyme-linked immunosorbent assay using standard methods according to the manufacturer's instructions (Millipore, USA) is used. Statistical processing was performed in GRAPH Pad Prism 6.02 and GMP 11.0 programs. We used nonparametric tests (Mann-Whitney test), the data were presented as a median with the first and third quartiles (Me [Q25; Q75]. To evaluate the diagnostic value of the analyzed biomarkers, a characteristic-receiver-operating-characteristic curve-ROC analysis was performed ) for a fixed value of specificity (87.5%). Graphic images of characteristic curves were examined and the area under the curve was determined - AUC (Area Under the Curve), as well as the likelihood ratio of a positive result (OPP), which determine the start of the test for diagnostics The analysis results showed that all three biomarkers individually have a fairly high sensitivity (78.5-94.7%), which allows their use for diagnostic purposes.The AUC values for all three chemokines were more than 0.8, which indicates a very good quality of the chosen model.For all three chemokines, there were more than 6 AKI, and this indicates good diagnostic information content. The analysis resulted in the following threshold values: for CXCL9 / MIG - 4461 pg / ml, for CXCL10 / IP-10 - 3893 pg / ml, for CXCL11 / ITAC - 31.92 pg / ml.

Пример 2. Диагностика заболевания на основе предлагаемого метода.Example 2. Diagnosis of the disease based on the proposed method.

Больной З., 51 год.Patient Z., 51 years old.

Диагноз: серонегативный (РФ-, АЦЦП-) ревматоидный артрит, с системными проявлениями, поздняя стадия, активность 3. При поступлении высокая клинико-лабораторная активность течения РА определила показания к интенсификации терапии. В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации биомаркеров: для CXCL9/MIG - 18503,822 пг/мл, CXCL10/IP-10 - 9845,156 пг/мл, CXCL11/ITAC - 69,181 пг/мл. Сравниваем полученные значения с пороговыми: по всем трем показателям наблюдается превышение пороговых значений. Заключение: РА, что подтверждает клинический диагноз.Diagnosis: seronegative (RF-, ACCP-) rheumatoid arthritis, with systemic manifestations, late stage, activity 3. Upon admission, high clinical and laboratory activity of the course of RA determined the indications for the intensification of therapy. During the studies, the following biomarker concentrations were obtained: for CXCL9 / MIG - 18503.822 pg / ml, CXCL10 / IP-10 - 9845.156 pg / ml, CXCL11 / ITAC - 69.181 pg / ml. We compare the obtained values with the threshold: for all three indicators, the threshold values are exceeded. Conclusion: RA, which confirms the clinical diagnosis.

Больная Α., 78 лет.Patient Α., 78 years old.

Диагноз: деформирующий артроз тазобедренных и коленных суставов, 2-3 стадии. Поступила для проведения санационной артроскопии левого коленного сустава. В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации биомаркеров: для CXCL9/MIG - 955,375 пг/мл, CXCL10/IP-10 - 1183,208 пг/мл, CXCL11/ITAC - 5,84 пг/мл. Сравниваем полученные значения с пороговыми: ни по одному показателю не наблюдается превышения пороговых значений. Заключение: отсутствие РА, наличие OA, что подтверждает клинический диагноз.Diagnosis: deforming arthrosis of the hip and knee joints, stages 2-3. Received for debridement arthroscopy of the left knee joint. During the research, the following biomarker concentrations were obtained: for CXCL9 / MIG - 955.375 pg / ml, CXCL10 / IP-10 - 1183.208 pg / ml, CXCL11 / ITAC - 5.84 pg / ml. We compare the obtained values with the threshold ones: in no indicator is the threshold value exceeded. Conclusion: the absence of RA, the presence of OA, which confirms the clinical diagnosis.

Больной Д., 27 лет.Patient D., 27 years old.

Диагноз: ревматоидный артрит, серонегативный (РФ-, АЦЦП-), неэрозивный (2 рентгенологическая стадия), с системными проявлениями (ревматоидный васкулит, тромбоцитоз, лихорадка, снижение веса), активность III. В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации биомаркеров: для CXCL9/MIG - 15652,58 пг/мл, CXCL10/IP-10 - 508,127 пг/мл, CXCL11/ITAC - 388,352 пг/мл. Сравниваем полученные значения с пороговыми: по двум показателям (CXCL9/MIG и CXCL11/ITAC) наблюдается превышение пороговых значений. Заключение: наличие РА, что подтверждает клинический диагноз.Diagnosis: rheumatoid arthritis, seronegative (RF-, ACCP-), non-erosive (X-ray stage 2), with systemic manifestations (rheumatoid vasculitis, thrombocytosis, fever, weight loss), activity III. During the research, the following biomarker concentrations were obtained: for CXCL9 / MIG - 15652.58 pg / ml, CXCL10 / IP-10 - 508.127 pg / ml, CXCL11 / ITAC - 388.352 pg / ml. We compare the obtained values with the threshold ones: for two indicators (CXCL9 / MIG and CXCL11 / ITAC), the threshold values are exceeded. Conclusion: the presence of RA, which confirms the clinical diagnosis.

Больная С, 28 лет.Patient C, 28 years old.

Диагноз: ревматоидный артрит, серопозитивный (РФ+, АЦЦП+), эрозивный (4 рентгенологическая стадия), ФК1, с системными проявлениями (лихорадка, лимфоаденопатия, снижение веса, анемия), активность 2. В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации биомаркеров: для CXCL9/MIG - 6171,923 пг/мл, CXCL10/IP-10 - 6407,466 пг/мл, CXCL11/ITAC - 14,869 пг/мл. Сравниваем полученные значения с пороговыми: по двум показателям (CXCL9/MIG и CXCL10/IP-10) наблюдается превышение пороговых значений. Заключение: наличие РА, что подтверждает клинический диагноз.Diagnosis: rheumatoid arthritis, seropositive (RF +, ACCP +), erosive (X-ray stage 4), FC1, with systemic manifestations (fever, lymphadenopathy, weight loss, anemia), activity 2. In the course of the studies, the following concentrations of biomarkers were obtained: for CXCL9 / MIG - 6171.923 pg / ml, CXCL10 / IP-10 - 6407.466 pg / ml, CXCL11 / ITAC - 14.869 pg / ml. We compare the obtained values with the threshold ones: for two indicators (CXCL9 / MIG and CXCL10 / IP-10) the threshold values are exceeded. Conclusion: the presence of RA, which confirms the clinical diagnosis.

Claims

A method for diagnosing rheumatoid arthritis by examining synovial fluid, characterized in that the sample is centrifuged to separate the supernatant and the chemokines CXCL9 / MIG, CXCL10 / IP-10 and CXCL11 / ITAC in the supernatant are determined and a rheumatoid arthritis diagnosis is made if at least one of chemokines exceeds the threshold value, and the threshold values for chemokines are 2625.8 pg / ml for CXCL9 / MIG, 3108.2 pg / ml for CXCL9 / MIG and 32.4 pg / ml for CXCL11 / ITAC, respectively, and for content values below threshold for three hems okinas simultaneously note the absence of rheumatoid arthritis and the possible presence of osteoarthrosis.