RU2540312C1 - Способ получения магнитного аффинного сорбента для выделения рекомбинантных белков - Google Patents
Способ получения магнитного аффинного сорбента для выделения рекомбинантных белков Download PDFInfo
- Publication number
- RU2540312C1 RU2540312C1 RU2013147129/05A RU2013147129A RU2540312C1 RU 2540312 C1 RU2540312 C1 RU 2540312C1 RU 2013147129/05 A RU2013147129/05 A RU 2013147129/05A RU 2013147129 A RU2013147129 A RU 2013147129A RU 2540312 C1 RU2540312 C1 RU 2540312C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- microspheres
- hours
- carried out
- magnetic
- boiling
- Prior art date
Links
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 title claims abstract description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 10
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title abstract description 4
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims abstract description 58
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 48
- BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N Tetraethyl orthosilicate Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)OCC BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 239000003245 coal Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 3
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract 2
- 238000002485 combustion reaction Methods 0.000 claims abstract 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 15
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- 230000003068 static effect Effects 0.000 claims description 11
- 238000001994 activation Methods 0.000 claims description 10
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 9
- 238000001027 hydrothermal synthesis Methods 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 7
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims description 3
- 239000010881 fly ash Substances 0.000 claims description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 2
- 229910001428 transition metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims 5
- ULSGYLVWQIYYRO-UHFFFAOYSA-M hexadecan-2-yl(trimethyl)azanium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCC(C)[N+](C)(C)C ULSGYLVWQIYYRO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 claims 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 abstract description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 23
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 abstract description 14
- 239000002956 ash Substances 0.000 abstract description 6
- 235000002918 Fraxinus excelsior Nutrition 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 150000003624 transition metals Chemical class 0.000 abstract 1
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N nickel Substances [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 50
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 16
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 description 8
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 7
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000005368 silicate glass Substances 0.000 description 5
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- -1 iron ions Chemical class 0.000 description 4
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N Nickel(2+) Chemical compound [Ni+2] VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000003980 solgel method Methods 0.000 description 3
- 238000002336 sorption--desorption measurement Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001126328 Clytia gregaria Species 0.000 description 2
- 229910005335 FePt Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 2
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000001354 calcination Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002815 nickel Chemical class 0.000 description 2
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000005979 thermal decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101710134784 Agnoprotein Proteins 0.000 description 1
- 229910018072 Al 2 O 3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 1
- MWRWFPQBGSZWNV-UHFFFAOYSA-N Dinitrosopentamethylenetetramine Chemical compound C1N2CN(N=O)CN1CN(N=O)C2 MWRWFPQBGSZWNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108091006054 His-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910008051 Si-OH Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910006358 Si—OH Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004139 Sodium stearoyl fumarate Substances 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- MQRWBMAEBQOWAF-UHFFFAOYSA-N acetic acid;nickel Chemical compound [Ni].CC(O)=O.CC(O)=O MQRWBMAEBQOWAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N iron oxide Inorganic materials [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013980 iron oxide Nutrition 0.000 description 1
- VBMVTYDPPZVILR-UHFFFAOYSA-N iron(2+);oxygen(2-) Chemical class [O-2].[Fe+2] VBMVTYDPPZVILR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N iron(II,III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000013335 mesoporous material Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 229940078494 nickel acetate Drugs 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 1
- SCPYDCQAZCOKTP-UHFFFAOYSA-N silanol Chemical compound [SiH3]O SCPYDCQAZCOKTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005372 silanol group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
Изобретение относится к получению сорбентов для выделения и детекции рекомбинантных белков, содержащих полигистидиновые последовательности. Предложен способ получения магнитного аффинного сорбента для выделения рекомбинантных белков. Способ включает нанесение пористого кремнеземного слоя на поверхность магнитных микросфер летучих зол от сжигания угля и пропитку раствором, содержащим ионы переходных металлов. В качестве микросфер используют фракцию магнитных микросфер, содержащую 40-41 мас.% стеклофазы. Нанесение пористого кремнеземного слоя осуществляют в гидротермальных условиях. Магнитные микросферы контактируют с жидкой реакционной смесью, содержащей тетраэтоксисилан и гексадецилтриаммоний бромид в качестве структуроформирующего агента. После нанесения кремнезёмного слоя твердую фазу отделяют, промывают, термообрабатывают и активируют при кипячении в водной среде. Изобретение позволяет повысить прочность кремнезёмной оболочки на поверхности микросфер без снижения сорбционной ёмкости по белкам среднего размера. 6 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл., 9 пр.
Description
Заявляемое техническое решение относится к аффинным сорбентам, полученным на основе техногенного сырья, в частности магнитных микросфер летучих энергетических зол, и может быть использовано в биохимии, медицинской диагностике и биотехнологии для выделения и детекции рекомбинантных белков, содержащих полигистидиновые последовательности.
Экспрессия рекомбинантных белков, меченных полигистидиновыми фрагментами (от 6 остатков гистидина и более), широко применяется для упрощения их выделения из различных прокариотических и эукариотических систем. Для этого используют металл-ионные аффинные сорбенты, содержащие на своей поверхности хелатносвязанные ионы переходных металлов (Cu2+, Ni2+, Zn2+, Со2+) [Porath J., Carlsson J., Olsson I., Belfrage G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation, Nature 258 (1975) 598-599; Schmitt J., Hess H., Stunnenberg H.G. Affinity purification of histidine-tagged proteins, Mol. Biol. Rep. 18 (1993) 223-230; Gabert-Porecar V., Menart V. Perspectives of immobilized-metal affinity chromatography, J. Biochem. Biophys. Methods 49 (2001) 335-360]. Адсорбция белков на металл-хелатных сорбентах протекает за счет образования координационной связи между иммобилизованным ионом металла и электронодонорными атомами азота, входящими в состав имидазольного кольца гистидина в молекуле белка.
Усовершенствование аффинных сорбентов с координационно-связанными ионами металлов ведется в направлении придания им магнитных свойств, что обеспечивает возможность манипулирования сорбентами с использованием магнитного поля и таким образом упрощает процедуру извлечения рекомбинантных белков из гетерогенных смесей. Так, известны такие коммерчески доступные магнитоуправляемые аффинные сорбенты, как Ni2+-NTA MABs (Qiagen, Германия) [Schafer F., Romer U., Emmerlich M., Blumer J., Steinert K. Automated high-throughput purification of 6xHis-tagged proteins, J. Biomol. Tech. 13 (2002) 131-142], которые состоят из магнитного ядра на основе оксидов железа и полисахаридной оболочки на основе поперечно-сшитой агарозы с ковалентно привитыми остатками нитрилотриуксусной кислоты (NTA), хелатирующей ионы Ni2+. Частицы сорбента Ni2+-NTA MABs представляют собой микросферы размером 45-165 мкм с емкостью по 6His-меченным белкам (~20 кДа) 5-10 мг/мл. Известны также наноразмерные (~10 нм) металл-хелатные сорбенты с магнитным ядром на основе FePt [Xu С., Xu K., Gu H., Zhong X., Guo Z., Zheng R., Zhang X., Xu B. Nitrilotriacetic Acid-Modified Magnetic Nanoparticles as a General Agent to Bind Histidine-Tagged Proteins, J. Am. Chem. Soc., 126 (2004) 3392-3393], в которых ионы Ni2+ закреплены на поверхности наночастиц FePt также посредством связи с нитрилотриуксусной кислотой. К недостаткам такого рода сорбентов можно отнести многостадийность и сложность их синтеза, требующего применения широкого набора органических реагентов, а также низкую химическую устойчивость в условиях высоких концентраций денатурирующих и хелатирующих реагентов, используемых на стадии сорбции (ЭДТА, мочевина) и регенерации сорбента (имидазол). В частности, при совместном присутствии с Ni2+-NTA MABs допустима концентрация ЭДТА не выше 10-3 М. Более высокие концентрации ЭДТА, благоприятные для выделения белков, чувствительных к присутствию в растворе двухвалентных катионов металлов, вызывают вымывание ионов Ni2+ с поверхности носителя и инактивацию сорбента. Кроме того, инактивация сорбента происходит также на стадии десорбции в процессе элюирования His-меченных белков в условиях высокой концентрации имидазола, что делает необходимым введение ионов Me2+ после каждого цикла адсорбции-десорбции.
Для повышения устойчивости магнитных твердофазных систем с иммобилизованным ионом Me2+ к воздействию более высоких концентраций комплексообразователей (>10-3 М) в ряде работ предложены магнитоуправляемые сорбенты, состоящие из магнитного ядра на основе синтетического магнетита или маггемита и кремнеземной оболочки, в которую без участия хелатирующего полидентатного лиганда инкорпорированы ионы Ni2+ (Ni2+ -SiMAG, Chemicell, Berlin, Germany) [Frenzel A., Bergemann C., Kohl G., Reinard T. Novel purification system for 6His-tagged proteins by magnetic affinity separation // J. Chromatogr. В 793 (2003) 325-329] или Zn2+ [Bele M., Hribar G., Campelj S., Macovec D., Gabert-Porecar V., Zorko M., Gaberscek M., Jamnik J., Venturini P. Zn-decorated silicacoated magnetic nanoparticles for protein binding and controlled release // J. Chromatogr. В 867 (2008) 160-164]. Полученный сорбент характеризуется прочным связыванием ионов Ni2+ в кремнеземной матрице, что позволяет многократное использование сорбента без промежуточной реактивации. Однако сложность процесса получения магнитного компонента удорожает стоимость сорбента.
В работе [Л.А. Франк, В.В. Борисова, Т.А. Верещагина, Е.В. Фоменко, А.Г. Аншиц, И.И. Гительзон. Выделение рекомбинантных белков с использованием аффинных магнитных сорбентов на основе микросфер энергетических зол // Прикладная биохимия и микробиология 45 (2009) 237-242] получен магнитный сорбент Ni2+-SiO2/MM на основе магнитных микросфер энергетических зол от сжигания угля с иммобилизованным ионом Ni2+ на поверхности кремнеземного слоя, синтезированного золь-гель методом. Отсутствие стадии синтеза магнитного компонента существенно упрощает процедуру получения композитного сорбента, а относительно невысокие затраты на выделение узкой фракции микросфер из магнитных концентратов, являющихся фактически отходами производства электроэнергии, и низкая стоимость являются достоинствами сорбента.
Согласно данному способу на первой стадии получают кремнеземный компонент в виде гидрогеля при взаимодействии жидкого силикатного стекла с раствором азотнокислого аммония при выбранном соотношении NH4 +/Na+=1,2 в присутствии азотной кислоты с целью поддерживания в суспензии заданного постоянного значения pH=1. Затем осадок отфильтровывают, тщательно промывают дистиллированной водой, подвергают катионному обмену с солями аммония для освобождения от хемосорбированных ионов натрия, затем снова отфильтровывают и промывают. На следующей стадии осуществляют нанесение кремнеземного компонента на поверхность магнитных микросфер путем смешивания полученного гидрогеля с магнитными микросферами в соотношении 1:3, тщательно перемешивают, затем сушат в сушильном шкафу при 120°C в течение 6 часов. Из сухого образца методом магнитной сепарации отбирают магнитную фракцию, которую многократно подвергают процедуре очистки от немагнитного кремнеземного компонента промывкой дистиллированной водой и последующей мокрой магнитной сепарацией. Выделенный магнитный продукт отфильтровывают и сушат при 120°C. Для модифицирования поверхности композитных микросфер введением ионов никеля микросферы пропитывают 10%-ным раствором ацетата никеля в соотношении 0,6 г микросфер на 2 мл раствора Ni(CH3COO)2. Образцы сушат при комнатной температуре, затем прокаливают при 500°C в течение 6 часов, после чего подвергают мокрой магнитной сепарации и сушке при 120°C.
В качестве магнитного ядра композитного сорбента используют узкую фракцию магнитных микросфер, выделенную из летучих зол от сжигания ирша-бородинского угля, которая характеризовалась следующим составом (мас.%):SiO2 - 4,30; Fe2O3 - 83,17. Содержание феррошпинельной фазы в микросферах составляло 76,4 мас.%, а силикатной стеклофазы - 16,5 мас.%.
В случае тестового выделения рекомбинантного зеленого флуоресцентного белка, имеющего в своем составе фрагмент из 6 повторяющихся гистидиновых остатков по NH2-концу (6His-CLGFP), адсорбционная специфическая емкость указанного аффинного сорбента составила 1-3,5 мг на грамм сорбента.
К недостаткам данного способа получения следует отнести многостадийность создания кремнеземного слоя на поверхности магнитных микросфер и низкую адгезионную прочность силикатного покрытия, вызывающую снижение адсорбционной емкости сорбента в многоцикловом процессе сорбции-десорбции белка. Способ принят за прототип.
Поставлена задача упростить синтез сорбента и повысить адгезионную прочность кремнеземной оболочки на поверхности магнитных микросфер без ухудшения сорбционной емкости в отношении белков среднего размера (20-30 кДа).
Эта задача решена следующим образом. Для достижения поставленного технического результата при получении сорбента в качестве магнитного компонента используют магнитные микросферы летучих зол от сжигания углей, содержащие аморфную силикатную фазу. На поверхность микросфер нанесят пористый кремнеземный слой, в который вводят ионы Ni2+ методом пропитки солью никеля с последующим ее термическим разложением. В отличие от прототипа содержание силикатной стеклофазы в магнитных микросферах составляет около 40 мас.%, а создание пористого кремнеземного покрытия проводят методом гидротермального синтеза при совместном присутствии в реакционной среде микросфер, гексадецилтриметиламмония бромида и тетраэтоксисилана с последующей высокотемпературной обработкой продукта. Затем продукт синтеза подвергают активации кипячением в водных средах с различным pH. Гидротермальный синтез проводят в динамических или статических условиях, в кислой или аммиачно-спиртовой среде при температурах 60-120°C в течение 2-120 часов.
Сущность заявляемого технического решения заключается в следующем. Разделение концентратов магнитных микросфер энергетических зол с использованием комбинированной схемы, включающей стадии гранулометрической классификации, гравитационной и магнитной сепарации, позволяет получать магнитные микросферические продукты стабилизированного состава и морфологии [Шаронова О.М., Аншищ Н.Н., Оружейников А.И., Акимочкина Г.В., Саланов А.Н., Низовский А.И., Семенова О.Н., Аншиц А.Г. Состав и морфология магнитных микросфер энергетической золы каменных углей Экибастузского и Кузнецкого бассейнов // Химия в интересах устойчивого развития 11 (2003) 673-682]. Текстура магнитных микросфер образована кристаллитами феррошпинели с примесью минорных фаз, капсулированных в силикатном стекле разного состава. Различия в содержании железа, стеклофазы и других компонентов приводят к формированию магнитных глобул различной морфологии. Стеклофаза служит своего рода защитной оболочкой, препятствующей окислению магнитного компонента и его потенциально возможному растворению в случае контактирования с водными средами. Наряду с этим, силикатное стекло содержит на своей поверхности реакционноспособные силанольные группы ≡Si-OH, которые могут служить якорными группами для закрепления катионов d-металлов по типу координационного взаимодействия или, в случае их невысокого содержания, для связывания дополнительного функционального слоя SiO2 высокой поверхности. Учитывая, что ионы никеля имеют 6 центров связывания лигандов в своей координационной сфере, которые могут быть полностью насыщены взаимодействием с атомами кислорода ОH-групп при их высокой плотности, важным является обеспечение ненасыщенности как минимум 2-х координационных связей Me2+ для сохранения величины связывания белков на уровне сорбентов-аналогов (до 3,5 мг/г). Как показано в способе получения сорбента-прототипа, координационная ненасыщенность связей инкорпорированных ионов Ni2+ может быть обеспечена при введении избытка ионов Ni2+ методом пропитки поверхности водным раствором соли никеля с последующим ее термическим разложением.
Достижение заявленных преимуществ обеспечивается выбором магнитных микросфер с высоким содержанием силикатной составляющей, способа получения силикатного покрытия с оптимальными пористой структурой и концентрацией поверхностных гидроксильных групп и способом нанесения ионов Ni2+.
На рисунке 1 приведен электронно-микроскопический снимок магнитных микросфер фракции -0,063+0,05 мм.
На рисунке 2 приведены рентгенограммы эталонного МСМ-41 (1) и модифицированных микросфер (2).
Сущность изобретения демонстрируется следующими примерами.
ПРИМЕР 1. Для получения аффинного сорбента используют узкую фракцию магнитных микросфер (Рис.1), выделенную из летучих зол от сжигания экибастузского угля, характеристики которой приведены в таблице 1. Условия получения сорбента приведены в таблице 2.
| Таблица 1 | ||||||
| Характеристики исходной фракции магнитных микросфер | ||||||
| Фракция, мм/насыпная плотность | Содержание элементов (в расчете на оксиды), мас.% | Содержание феррошпинельной фазы, мас.% | Содержание стеклофазы, мас.% | Удельная поверхность, м2/г | ||
| SiO2 | Al2O3 | Fe2O3 | ||||
| -0,063+0,05/1,5 г/см3 | 26,48 | 9,44 | 59,82 | 48,8 | 41,2 | 1,0 |
Синтез пористого кремнеземного покрытия на поверхности магнитных микросфер проводят «темплатным» методом в водной кислой среде в стационарном режиме при 80°C в течение 120 часов. Использовались реагенты в следующем мольном соотношении: 100 H2O:0,9 HCl:0,11 гексадецилтриметиламмония бромид (HTABr):0,13 тетраэтоксисилан (TEOS) при объемном соотношении твердая фаза (микросферы):жидкая фаза = 1:20. По окончании синтеза микросферы отделяют и промывают дистиллированной водой до отрицательной реакции на хлорид-ионы раствором 0,1 н AgNO3, сушат при 80°C, прокаливают в течение 4 часов при 540°C. По данным рентгенофазового анализа (Рис.2) и низкотемпературной адсорбции азота в составе модифицированных микросфер присутствует фаза мезопористого силиката с диаметром пор 36 Å, аналогичная материалу МСМ-41 [Meynen, V., Cool, Р., Vansant, E.F. Verified syntheses of mesoporous materials // Micropor. Mesopor. Mater. 125 (2009) 170-223]. Слабовыраженный рефлекс в области основного пика МСМ-41 на дифрактограмме полученного материала (Рис.2, рентгенограмма 2) свидетельствует о низком содержании синтезированного силикатного компонента и/или низкой упорядоченности его структуры по сравнению с эталонным образцом МСМ-41. Исходя из сопоставления величин удельной поверхности полученного материала (~10 м2/г) и МСМ-41 (~1000 м2/г), оценочное содержание мезопористого SiO2 в составе микросферического композитного материала составило около 1 мас.%.
Активацию поверхности мезопористого покрытия микросфер проводят при кипячении в воде в течение 4 часов.
Магнитный сорбент тестируют на примере выделения рекомбинантного белка размером 27 кДа, имеющего в своем составе фрагмент из шести повторяющихся гистидиновых остатков по NH2-концу - зеленого флуоресцентного белка медузы Clytia gregaria (6His-CLGFP). Рекомбинантные клетки E.coli BL21-gold, экспрессирующие этот белок, суспендируют в трис-HCl - солевом буфере (0,02М ТрисНСl, pH 7, 0,15М NaCl - TBS) и разрушают с помощью ультразвукового дезинтегратора UD-20 (Techpan, Польша) (6 импульсов по 20 сек, 0°C). Смесь центрифугируют и полученный супернатант («лизат»), содержащий 6His-CLGFP, используют для тестирования образцов сорбента.
В пробирку с навеской частиц сорбента вносят 1 мл «лизата» и перемешивают в течение 2 минут. Частицы сорбента фиксируют у стенки пробирки с помощью магнита, а раствор белка удаляют пипеткой и записывают спектр поглощения на спектрофотометре UVIKON 943 («Kontron Instruments», Италия). Оценку сорбционной емкости сорбента проводят по разнице оптических плотностей растворов при длине волны 485 нм до и после поглощения с использованием значения молярной экстинкции 6His-CLGFP в зеленой области (Е485=63·103 M-1 см-1) [S.V. Markova, L.P. Burakova, L.A. Frank, S. Golz, K.A. Korostileva, E.S. Vysotski. Green-fluorescent protein from the bioluminescent jellyfish Clytia gregaria: cDNA cloning, expression, and characterization of novel recombinant protein // Photochem. Photobiol Sci. 9 (2010) 757-765].
Сорбент без введения катионов Ni2+ характеризуется сорбционной активностью в отношении белка, не превышающей 0,6 мг/г, которая, скорее всего, связана с участием ионов железа, вошедших в структуру мезопористого силиката в процессе синтеза в кислых условиях, способствующих выщелачиванию железа из магнитных микросфер в жидкую фазу. Для сравнения в таблице 2 приведены результаты сорбционной емкости сорбента, взятого за прототип.
После модифицирования поверхности образца нанесением катионов Ni2+ пропиткой 10%-ным раствором Ni(CH3COO)2 при соотношении 0,3 г микросфер: 1 мл раствора Ni(CH3COO)2 с последующим прокаливанием при 500°C в течение 4 часов (как в прототипе), адсорбционная емкость полученного сорбента ЕМТ1-H2O-Ni2+ составила 1,3 мг/г.
ПРИМЕР 2. Условия получения сорбента (EMT1-H2O-S, Ni2+) и тестирования те же, что и в примере 1, за исключением того, что модифицирование силикатного покрытия катионами Ni2+ проводят сорбцией из 10% водного раствора Ni(CH3COO)2 при перемешивании при 50°C в течение 8 часов с последующей сушкой и прокалкой при 500°C в течение 4 часов. Как следует из приведенных в таблице 2 данных, сорбент характеризуется низкой адсорбционной емкостью в отношении белка (0,7 мг/г), близкой к величине адсорбционной емкости композитного носителя без нанесения ионов никеля. Вероятно, это связано с низкой сорбцией катионов Ni2+ на поверхности микросфер и/или с инактивацией сорбированных форм Ni2+ за счет полного насыщения координационных связей Ni2+ при взаимодействии с силанольным покрытием.
ПРИМЕР 3. Получение сорбента (EMT1-HCl-Ni2+) и его тестирование проводят как в примере 1, кроме того, что активацию поверхности мезопористого покрытия осуществляют кипячением в 1М растворе HCl в течение 4-х часов.
ПРИМЕР 4. Получение сорбента EMT1-NH4 +-Ni2+, модифицирование поверхности и его тестирование проводили, как в примере 1, за исключением того, что активацию поверхности мезопористого покрытия микросфер осуществляют кипячением в 1М растворе NH4OH в течение 4 часов.
ПРИМЕР 5. Синтез мезопористого силикатного покрытия на поверхности микросфер проводят в аммиачно-спиртовом растворе в динамическом режиме в тефлоновом автоклаве в течение 2 часов при температуре 120°C с использованием реагентов в следующем мольном соотношении: 1 TEOS:0,2 HTABr:22 NH3:52 EtOH:475 H2O, при объемном соотношении твердая фаза:жидкая фаза = 1:20. Вращение автоклава, закрепленного перпендикулярно оси вала, осуществлялось со скоростью 30 об/мин. После проведения синтеза отделенную твердую фазу промывают, сушат при 80°C, затем прокаливают при 540°C в течение 4 часов. Активацию, модификацию SiO2-оболочки катионами Ni и тестирование проводят по методу, приведенному в примере 1.
ПРИМЕР 6. Получение сорбента (EMT4-H2O-Ni2+) включает те же стадии, что и в примере 5, за исключением того, что синтез мезопористого покрытия проводят в статическом режиме при температуре 80°C в течение 120 часов, а активацию, модификацию кремнеземной оболочки и тестирование проводят, как в примере 1.
ПРИМЕР 7. Получение сорбента (EMT-7-NH4+-Ni2+) проводят, как в примере 5, но при температуре 60°C в течение 72 часов. Активацию и модификацию кремнеземной оболочки проводят, как в примере 4, а тестирование сорбента, как в примере 1.
ПРИМЕР 8. Получение сорбента (EMT5-NH4 +-Ni2+) проводят, как в примере 5, только при температуре 80°C в течение 15 часов. Активацию и модификацию кремнеземной оболочки осуществляют по методу, описанному в примере 4. Тестирование сорбента проводят, как в примере 1.
ПРИМЕР 9. Получение сорбента (EMT8-NH4 +-Ni2+) проводят, как в примере 5, только при температуре 60°C в течение 15 часов. Активацию и модификацию силикатного покрытия проводят, как в примере 4, а тестирование - как в примере 1. Для элюирования адсорбированного белка, частицы промывают фосфатным буфером, содержащим 0,25 М имидазола. В результате целевой белок элюировался практически полностью. После обработки сорбента раствором имидазола количество белка, перешедшего в раствор, составило 4,3 мг/г сорбента. Наблюдаемые потери белка (0,1 мг/г) находятся в пределах ошибки определения.
Была исследована стабильность сорбционных свойств сорбента при многократном использовании, результаты приведены в таблице 3. Установлено, что адсорбционная емкость магнитного сорбента EMT8-NH4 +-Ni2+ сохранялась при 3-кратном использовании. После 7-кратного использования емкость снижалась в 1,5 раза. В аналогичных условиях адсорбционная емкость сорбента-прототипа уменьшалась в 5 раз. Стабильность сорбционных свойств в отношении зеленого флуоресцентного белка в многоцикловом сорбционном процессе свидетельствует о повышенной прочности силикатного покрытия по сравнению с сорбентом, полученным по способу-прототипу.
Приведенные примеры подтверждают возможность получения магнитного аффинного сорбента с иммобилизованными ионами Ni2+ в процессе синтеза, содержащем меньшее число стадий по сравнению со способом-прототипом. Достигнутым техническим результатом является также повышенная прочность силикатного покрытия и сопоставимая с сорбентом-прототипом адсорбционная емкость в отношении рекомбинантного белка размером 20-30 кДа (1,3-4,4 мг/г).
Реализация заявленного технического решения не ограничивается приведенными примерами. В качестве магнитного компонента могут быть использованы ферросферы других источников с высоким содержанием аморфной силикатной фазы. Высокое сродство сорбента к белкам, имеющим полигистидиновые последовательности, может быть обеспечено введением не только катионов никеля, но и других катионов переходных металлов, таких как Fe3+, Cu2+, Со2+, Zn2+. Гидротермальный синтез пористого силикатного покрытия может проводиться с использованием других органических структуроформирующих реагентов, требующих применения близких условий синтеза и последующей термической обработки.
| Таблица 2 | ||||||||
| Условия получения кремнеземного покрытия на магнитных микросферах и характеристики сорбентов | ||||||||
| Пример (№ образца) | Маркировка образца | Условия синтеза | Sуд, м2/г | D пор, Å | Адсорбционная емкость, мг/г | |||
| Состав реакционной смеси в жидкой фазе, моль | T, °С | τ, час | Режим | |||||
| прототип | Ni2+ -SiO2/MM | «золь-гель» метод | 61 | н/о | 1,0 | |||
| прототип | Ni2+ -SiO2/MM | «золь-гель» метод | 61 | н/о | 3,5 | |||
| 1 | EMT1-H2O-Ni2 | 100 H2O : 0.9 HCl : 0.11 HTABr : 0.13 TEOS | 80 | 120 | Статический | 10,6 | 36 | 1,3 |
| 2 | EMT1-H2O-S, Ni2+ | 100 H2O : 0.9 HCl : 0.11 HTABr : 0.13 TEOS | 80 | 120 | Статический | 10,6 | 36 | 0,7 |
| 3 | EMT1-HCl-Ni2+ | 100 H2O : 0.9 HCl : 0.11 HTABr : 0.13 TEOS | 80 | 120 | Статический | 10,6 | 36 | 1,6 |
| 4 | EMT1-NH4 +-Ni2+ | 100 H2O : 0.9 HCl : 0.11 HTABr : 0.13 TEOS | 80 | 120 | Статический | 10,6 | 36 | 2,0 |
| 5 | EMT2-H2O-Ni2 | 1 TEOS : 0,2 HTABr : 22 NH3 : 52 EtOH :475 H2O | 120 | 2 | Динамический | 0,8 | полимодальный | 1,3 |
| 6 | EMT4-H2O-Ni2 | 1 TEOS :0,2 HTABr : 22 NH3 : 52 EtOH : 475 H2O | 80 | 120 | Статический | 3,2 | 25 | 2,3 |
| 7 | EMT7-NH4+-Ni2+ | 1 TEOS :0,2 HTABr : 22 NH3 : 52 EtOH : 475 H2O | 60 | 72 | Статический | 7,6 | н/о | 2,6 |
| 8 | EMT5-NH4 +-Ni2+ | 1 TEOS : 0,2 HTABr : 22 NH3 : 52 EtOH : 475 H2O | 80 | 15 | Динамический | 2,8 | 33 | 2,4 |
| 9 | EMT8-NH4 +-Ni2+ | 1 TEOS : 0,2 HTABr : 22 NH3 : 52 EtOH : 475 H2O | 60 | 15 | Динамический | 8,2 | 29 | 4,4 |
| Таблица 3 | ||
| Адсорбционные свойства сорбента EMT8-NH4 +-Ni2+ в 7 циклах адсорбции-десорбции белка | ||
| Цикл | Адсорбционная емкость, мг/г | Количество десорбированного белка, мг/г |
| I | 4,4 | 4,3 |
| II | 4,3 | 4,2 |
| III | 4,3 | 4,2 |
| IV | 4,0 | 4,1 |
| V | 4,3 | 3,5 |
| VI | 3,9 | 3,3 |
| VII | 3,0 | 2,8 |
Claims (7)
1.Способ получения магнитного аффинного сорбента для выделения рекомбинантных белков, включающий нанесение пористого кремнеземного слоя на поверхность магнитных микросфер летучих зол от сжигания угля и последующую пропитку раствором, содержащим ионы переходных металлов, отличающийся тем, что в качестве микросфер используют фракцию магнитных микросфер, содержащую 40-41 мас.% стеклофазы, а нанесение пористого кремнеземного слоя осуществляют в гидротермальных условиях, подвергая микросферы контактированию с жидкой реакционной смесью, содержащей тетраэтоксисилан и гексадецилтриаммоний бромид в качестве структуроформирующего агента, с последующим выделением полученной твердой фазы, ее промывкой, термообработкой и активацией кипячением в водной среде.
2. Способ получения по п.1, отличающийся тем, что гидротермальный синтез проводят в водной кислой среде в статическом режиме при температуре 80°С в течение 120 часов при соотношении реагентов (мол.): 100 H2O:0,9 HCl:0,11 гексадецилтриметиламмоний бромид: 0,13 тетраэтоксисилан и объемном соотношении твердая фаза (микросферы):жидкая фаза = 1:20, а активацию поверхности микросфер проводят при кипячении в воде в течение 4 часов, либо в 1 М растворе соляной кислоты, либо в 1 М растворе гидроксида аммония.
3. Способ получения по п.1, отличающийся тем, что гидротермальный синтез проводят в аммиачно-спиртовой среде в динамическом режиме при температуре 120°С в течение 2 часов при соотношении реагентов (мол.): 1 тетраэтоксисилан:0,2 гексадецилтриметиламмоний бромид:22 NH3:52 этиловый спирт:475 H2O и объемном соотношении твердая фаза (микросферы):жидкая фаза = 1:20, а активацию поверхности микросфер проводят при кипячении в воде в течение 4 часов.
4. Способ получения по п.1, отличающийся тем, что гидротермальный синтез проводят в аммиачно-спиртовой среде в статическом режиме при температуре 80°С в течение 120 часов при соотношении реагентов (мол.): 1 тетраэтоксисилан:0,2 гексадецилтриметиламмоний бромид:22 NH3:52 этиловый спирт:475 Н2О и объемном соотношении твердая фаза (микросферы):жидкая фаза = 1:20, а активацию поверхности микросфер проводят при кипячении в воде в течение 4 часов.
5. Способ получения по п.1, отличающийся тем, что гидротермальный синтез проводят в аммиачно-спиртовой среде в статическом режиме при температуре 60°С в течение 72 часов при соотношении реагентов (мол.): 1 тетраэтоксисилан:0,2 гексадецилтриметиламмоний бромид:22 NH3:52 этиловый спирт: 475 H2O и объемном соотношении твердая фаза (микросферы):жидкая фаза=1:20, а активацию поверхности микросфер проводят при кипячении в 1 М растворе NH4OH в течение 4 часов.
6. Способ получения по п.1, отличающийся тем, что гидротермальный синтез проводят в аммиачно-спиртовой среде в динамическом режиме при температуре 80°С в течение 15 часов при соотношении реагентов (мол.): 1 тетраэтоксисилан:0,2 гексадецилтриметиламмоний бромид:22 NH3:52 этиловый спирт:475 Н2О и объемном соотношении твердая фаза (микросферы):жидкая фаза = 1:20, а активацию поверхности микросфер проводят при кипячении в 1 М растворе NH4OH в течение 4 часов.
7. Способ получения по п.1, отличающийся тем, что гидротермальный синтез проводят в аммиачно-спиртовой среде в динамическом режиме при температуре 60°С в течение 15 часов при соотношении реагентов (мол.):1 тетраэтоксисилан:0,2 гексадецилтриметиламмоний бромид:22 NH3:52 этиловый спирт:475 Н2О и объемном соотношении твердая фаза (микросферы):жидкая фаза = 1:20, а активацию поверхности микросфер проводят при кипячении в 1 М растворе NH4OH в течение 4 часов.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013147129/05A RU2540312C1 (ru) | 2013-10-22 | 2013-10-22 | Способ получения магнитного аффинного сорбента для выделения рекомбинантных белков |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013147129/05A RU2540312C1 (ru) | 2013-10-22 | 2013-10-22 | Способ получения магнитного аффинного сорбента для выделения рекомбинантных белков |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2540312C1 true RU2540312C1 (ru) | 2015-02-10 |
Family
ID=53286828
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013147129/05A RU2540312C1 (ru) | 2013-10-22 | 2013-10-22 | Способ получения магнитного аффинного сорбента для выделения рекомбинантных белков |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2540312C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2794889C1 (ru) * | 2022-10-07 | 2023-04-25 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук" | Магнитный аффинный сорбент для выделения рекомбинантных белков |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6296937B2 (en) * | 1997-01-21 | 2001-10-02 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Silica adsorbent on magnetic substrate |
| US20050261479A1 (en) * | 2004-04-29 | 2005-11-24 | Christian Hoffmann | Method for purifying and recovering silk proteins using magnetic affinity separation |
| US7304015B2 (en) * | 2002-10-18 | 2007-12-04 | Promega Corporation | Compositions for separating molecules |
| US8129118B2 (en) * | 1995-06-08 | 2012-03-06 | Roche Diagnostics Gmbh | Magnetic glass particles, method for their preparation and uses thereof |
-
2013
- 2013-10-22 RU RU2013147129/05A patent/RU2540312C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8129118B2 (en) * | 1995-06-08 | 2012-03-06 | Roche Diagnostics Gmbh | Magnetic glass particles, method for their preparation and uses thereof |
| US6296937B2 (en) * | 1997-01-21 | 2001-10-02 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Silica adsorbent on magnetic substrate |
| US7304015B2 (en) * | 2002-10-18 | 2007-12-04 | Promega Corporation | Compositions for separating molecules |
| US20050261479A1 (en) * | 2004-04-29 | 2005-11-24 | Christian Hoffmann | Method for purifying and recovering silk proteins using magnetic affinity separation |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ФРАНК Л.А. и др. "Выделение рекомбинантных белков и использованием аффинных магнитных сорбентов на основе микросфер энергетических зол", Прикладная биохим. микробиол., 2009, т.45, с. 237-242; . КЕЛЬЦИЕВА О.А. и др. "Металл-аффинная хроматография. Основы и применение", Научное приборостроение, 2013, т. 23, т.23, N1б стр.74-85. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2794889C1 (ru) * | 2022-10-07 | 2023-04-25 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук" | Магнитный аффинный сорбент для выделения рекомбинантных белков |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sprynskyy et al. | The separation of uranium ions by natural and modified diatomite from aqueous solution | |
| Yuan et al. | Surface silylation of mesoporous/macroporous diatomite (diatomaceous earth) and its function in Cu (II) adsorption: The effects of heating pretreatment | |
| Yoshitake | Design of functionalization and structural analysis of organically-modified siliceous oxides with periodic structures for the development of sorbents for hazardous substances | |
| JP2007532477A5 (ru) | ||
| Ma et al. | Polyethyleneimine-facilitated high-capacity boronate affinity membrane and its application for the adsorption and enrichment of cis-diol-containing molecules | |
| Yang et al. | Enhanced removal of U (VI) from aqueous solution by chitosan-modified zeolite | |
| Vieira et al. | Study on determination and removal of metallic ions from aqueous and alcoholic solutions using a new POSS adsorbent | |
| CN104045095A (zh) | 直链烷烃吸附用多孔5a分子筛的制备方法 | |
| Mirzajani et al. | Nanoporous calcined MCM-41 silica for adsorption and removal of Victoria blue dye from different natural water samples | |
| Moghimi | Selective Pre‐concentration and Solid Phase Extraction of Mercury (II) from Natural Water by Silica Gel‐loaded (E)‐N‐(1‐Thien‐2′‐ylethylidene)‐1, 2‐phenylenediamine Phase | |
| CN102921372A (zh) | 一种层状羟基复合金属氧化物及其制备方法和应用 | |
| Hanzel et al. | Sorption of cobalt on modified silica gel materials | |
| RU2540312C1 (ru) | Способ получения магнитного аффинного сорбента для выделения рекомбинантных белков | |
| Zhao et al. | Synthesis of micron-sized magnetic agarose beads chelated with nickel ions towards the affinity-based separation of histidine-tagged/rich proteins | |
| CN102923754A (zh) | 含有稀土元素的层状双羟基复合金属氧化物及制法和应用 | |
| JPS61500078A (ja) | 添加物を含む改良シリカベ−スクロマトグラフィ−支持体 | |
| Kanoh et al. | Chromatographic purification of histidine-tagged proteins using zirconia particles modified with phosphate groups | |
| JP2017128499A (ja) | 非晶質アルミニウムケイ酸塩及びその製造方法 | |
| Hashemian | Removal of Acid Red 151 from water by adsorption onto nano-composite MnFe 2O 4/kaolin | |
| EP0157549A2 (en) | Silica gel linked to a phthalocyanine compound and a method for treating polycyclic organic substances therewith | |
| He et al. | Preparation of a novel Zr4+-immobilized metal affinity membrane for selective adsorption of phosphoprotein | |
| Słota et al. | The use of H-form clinoptilolite to preconcentrate trace amounts of Nd (III) from aqueous solution under dynamic conditions | |
| Li et al. | Adsorption of U (VI) from aqueous solution by cross-linked rice straw | |
| Stechynska et al. | Preconcentration of Lutetium from Aqueous Solution by Transcarpathian Clinoptilolite. | |
| Saleem et al. | Extraction of Pb (II) from water samples by ionic liquid-modified silica sorbents |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20181023 |