RU2535002C2

RU2535002C2 - Method for correction of remote consequences of spermatogenesis caused by cytostatic exposure

Info

Publication number: RU2535002C2
Application number: RU2013115146/15A
Authority: RU
Inventors: Андрей Владимирович Артамонов; Андрей Александрович Бекарев; Татьяна Геннадьевна Боровская; Александр Михайлович Дыгай; Вадим Вадимович Жданов; Глеб Николаевич Зюзьков; Павел Геннадьевич Мадонов; Марина Евгеньевна Полуэктова; Юлия Александровна Щемерова; Анна Владимировна Вычужанина
Priority date: 2013-04-04
Filing date: 2013-04-04
Publication date: 2014-12-10
Also published as: RU2013115146A

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: what is presented is using a conjugate of a granulocytic colony-stimulating factor immobilised on low-molecular polyethylene glycol prepared by electron-beam synthesis nanotechnology - the exposure to an accelerated electron flow at an energy of 2.5 MeV, absorbed dose 2-10 kGy and collection rate 1.65 kGy/h as agents for the correction of remote consequences of spermatogenesis caused by the cytostatic exposure.

EFFECT: due to the penetration through the blood-testis barrier, the agent corrects disturbed spermatogenesis caused by the cytostatic exposure by the early stimulation of reticular regeneration processes in the testicular tissues in the whole and rapid spermatogonium population recovery; the agent is almost non-toxic.

3 tbl

Description

Заявка относится к области медицины, конкретно к фармакологии, и касается средства коррекции отдаленных последствий нарушений сперматогенеза, вызванных цитостатическим воздействием.The application relates to the field of medicine, specifically to pharmacology, and relates to a means of correcting the long-term effects of spermatogenesis disorders caused by cytostatic effects.

Несомненный прогресс в клинической онкологии подтверждается увеличением выживаемости больных злокачественными заболеваниями всех типов нозологии [1]. Следует отметить, что в процессе лечения каждого пациента на том или ином этапе заболевания рассматривается вопрос о возможности и целесообразности использования цитостатической химиотерапии [2]. Закономерным следствием любого цитостатического лечения является повреждение активно пролиферирующей сперматогенной ткани [3]. Опрос мужчин, обращающихся по поводу злокачественных новообразований в репродуктивном возрасте, показывает, что 75% из них хотели бы иметь детей в будущем [4]. При цитостатическом воздействии повреждаются не только мейотически делящиеся клетки (сперматоциты), но и митотически делящиеся сперматогонии (быстро, медленно пролиферирующие и стволовые), являющиеся источниками пролиферативного пула сперматогенеза [5]. Повреждение стволовых сперматогониев может быть причиной необратимого бесплодия в отдаленные сроки после цитостатической химиотерапии. В связи с этим восстановление сперматогенеза отмечается только у 20-50% этой категории мужчин [4]. Сохранение фертильности должно стать неотъемлемой частью улучшения качества жизни онкологических пациентов после окончания специфического лечения [3]. Одним из способов решения проблемы отцовства, в данном случае, является криоконсервация семенной жидкости до начала лечения [1]. Однако ограниченная доступность этого способа для большинства пациентов, дороговизна требует поиска других способов сохранения фертильности. К числу таких путей принадлежит способ фармакотерапии. В качестве средств лекарственного лечения в ряде случаев применяют препараты стероидных гормонов или аналогов гонадотропин-рилизинг-гормона. Они снижают скорость сперматогенеза, уменьшая тем самым количество делящихся клеток, однако такое лечение не всегда эффективно [1]. Поиск новых корректоров должен привести к созданию эффективных препаратов, оказывающих защитное действие на источники пролиферативного пула сперматогенеза - сперматогонии, повреждение которых грозит необратимым бесплодием. Восстановление сперматогенеза зависит от количества погибших резервных клеток (стволовых) [6]. Известен ряд лекарственных средств синтетического и растительного происхождения, которые могут снизить повреждения сперматогенной ткани, вызванные цитостатическими препаратами: экстракт левзеи софлоровидной [7], иммуномодулятор AS 101 [8], фосфолицин [9]. Однако по данным средствам отсутствует информация об их способности приводить к увеличению количества сперматогониев.The undoubted progress in clinical oncology is confirmed by the increased survival of patients with malignant diseases of all types of nosology [1]. It should be noted that during the treatment of each patient at a particular stage of the disease, the question of the possibility and advisability of using cytostatic chemotherapy is considered [2]. A logical consequence of any cytostatic treatment is damage to actively proliferating spermatogenic tissue [3]. A survey of men applying for malignant neoplasms at a reproductive age shows that 75% of them would like to have children in the future [4]. Cytostatic exposure damages not only meiotically dividing cells (spermatocytes), but also mitotically dividing spermatogonia (fast, slowly proliferating and stem), which are sources of the proliferative pool of spermatogenesis [5]. Damage to stem spermatogonia can cause irreversible infertility in the long term after cytostatic chemotherapy. In this regard, restoration of spermatogenesis is observed only in 20-50% of this category of men [4]. Preserving fertility should be an integral part of improving the quality of life of cancer patients after the end of specific treatment [3]. One way to solve the problem of paternity, in this case, is cryopreservation of seminal fluid before treatment [1]. However, the limited availability of this method for most patients, the high cost requires the search for other ways to maintain fertility. Among these pathways is the method of pharmacotherapy. In some cases, steroid hormone preparations or analogues of gonadotropin releasing hormone are used as medication. They reduce the rate of spermatogenesis, thereby reducing the number of dividing cells, however, such treatment is not always effective [1]. The search for new correctors should lead to the creation of effective drugs that have a protective effect on the sources of the proliferative pool of spermatogenesis - spermatogonia, the damage of which threatens irreversible infertility. Recovery of spermatogenesis depends on the number of dead reserve cells (stem) [6]. A number of drugs of synthetic and herbal origin are known that can reduce damage to spermatogenic tissue caused by cytotoxic drugs: sofloroid levzea extract [7], immunomodulator AS 101 [8], phospholycin [9]. However, according to these funds there is no information about their ability to lead to an increase in the number of spermatogonia.

Известен лекарственный препарат, используемый в онкологической практике как гемостимулятор - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), обладающий способностью увеличивать численность клеточной популяции сперматогониев после цитостатического воздействия [11], что закономерно приводит к увеличению общего количества зрелых половых клеток в отдаленные сроки после введения цитостатических средств.A known drug used in oncological practice as a hemostatic stimulator - granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), which has the ability to increase the cell population of spermatogonia after cytostatic exposure [11], which naturally leads to an increase in the total number of mature germ cells in the long term after the introduction of cytostatic funds.

Данное средство является наиболее близким к заявляемому и выбрано в качестве прототипа [10].This tool is the closest to the claimed and selected as a prototype [10].

Имеющиеся данные свидетельствуют о принципиальной возможности использования Г-КСФ с целью коррекции нарушений сперматогенеза в отдаленные сроки после цитостатического воздействия. В отличие от отмеченных ранее корректоров Г-КСФ приводит к увеличению количества сперматогониев, что позволяет обоснованно рассчитывать на восстановление сперматогенеза в отдаленные сроки после введения цитостатического препарата. Однако эффективность его недостаточна высока. Кроме того, Г-КСФ обладает целым рядом побочных эффектов. Так, на фоне его применения нередко выявляются мышечные и костные боли, лейкоцитоз, тромбоцитопения, рвота, анорексия, головная боль, тиреоидиты, васкулиты, аллергические реакции и др., что существенно ограничивает его использование. Белковая природа Г-КСФ, его плейотропные эффекты определяют недостаточную избирательность его действия и большинство побочных эффектов [11].The available data indicate the fundamental possibility of using G-CSF to correct spermatogenesis disorders in the long term after cytostatic exposure. In contrast to the previously noted correctors, G-CSF leads to an increase in the number of spermatogonia, which allows one to reasonably rely on the restoration of spermatogenesis in the long term after administration of the cytostatic drug. However, its effectiveness is not high enough. In addition, G-CSF has a number of side effects. So, against the background of its use, muscle and bone pains, leukocytosis, thrombocytopenia, vomiting, anorexia, headache, thyroiditis, vasculitis, allergic reactions, etc. are often detected, which significantly limits its use. The protein nature of G-CSF, its pleiotropic effects determine the insufficient selectivity of its action and most of the side effects [11].

Задачей, решаемой данным изобретением, является расширение арсенала лекарственных средств для коррекции отдаленных последствий нарушений сперматогенеза, вызванных цитостатическим воздействием.The problem solved by this invention is to expand the arsenal of drugs to correct the long-term consequences of spermatogenesis disorders caused by cytostatic effects.

Поставленная задача достигается техническим решением, представляющим собой применение для коррекции отдаленных последствий нарушений сперматогенеза после цитостатических воздействий принципиально нового вещества - конъюгата ИМГ-КСФ, иммобилизированного на низкомолекулярном полиэтиленгликоле с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза Г-КСФ (воздействие потока ускоренных электронов с энергией 2,5 МэВ, поглощенной дозой 2-10 кГр и скоростью набора дозы 1,65 кГр/ч).The task is achieved by a technical solution, which is the application for the correction of the long-term effects of spermatogenesis disorders after cytostatic effects of a fundamentally new substance - IMG-KSF conjugate immobilized on low molecular weight polyethylene glycol using G-CSF electron-beam synthesis nanotechnology (the action of the flow of accelerated electrons with energy 2, 5 MeV, absorbed dose of 2-10 kGy and dose rate of 1.65 kGy / h).

Новым в предлагаемом изобретении является использование для коррекции отдаленных последствий нарушений сперматогенеза, вызванного цитостатическим воздействием, иммобилизированного (с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза - воздействия потока ускоренных электронов с энергией 2,5 МэВ, поглощенной дозой 2-10 кГр и скоростью набора дозы 1,65 кГр/ч) на низкомолекулярном полиэтиленгликоле Г-КСФ. При этом происходит образование принципиально нового вещества - конъюгата ИМГ-КСФ [11]. Препарат вводят крысам перорально в дозе 100 мкг/кг 1 раз в день в течение 5 дней через 1 мес после введения цитостатического препарата, повреждающего источник пролиферативного пула сперматогенеза (сперматогонии).New in the invention is the use of immobilized (using electron beam synthesis nanotechnology - exposure to a stream of accelerated electrons with an energy of 2.5 MeV, an absorbed dose of 2-10 kGy and a dose rate of 1, to correct the long-term effects of spermatogenesis disturbances caused by cytostatic effects) 65 kGy / h) on low molecular weight G-CSF polyethylene glycol. In this case, the formation of a fundamentally new substance - the conjugate IMG-CSF [11]. The drug is administered to rats orally at a dose of 100 μg / kg 1 time per day for 5 days 1 month after the administration of a cytostatic drug that damages the source of the proliferative pool of spermatogenesis (spermatogonia).

Авторами в проанализированной литературе средства коррекции отдаленных последствий на сперматогенез цитостатического воздействия с помощью ИМГ-КСФ не найдено, и предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности «новизна».The authors in the analyzed literature did not find means for correcting the long-term effects on spermatogenesis of cytostatic effects using IMH-CSF, and the present invention meets the patentability condition “novelty”.

Известна принципиальная возможность снижения токсичности белков за счет иммобилизации их на полиэтиленгликоле (ПЭГ) с помощью технологии электронно-лучевого синтеза [12]. Доказано, что гидрофильные полимеры, в том числе и такие, как полиэтиленгликоль, могут быть связаны с биологически активными веществами путем адсорбции на их поверхности или образования стойких химических связей [11]. При этом происходит образование принципиально нового вещества - конъюгата ИГК-КСФ, иначе называемого пегелированного (ПЕГ-КСФ). Это вещество превосходит по молекулярной массе Г-КСФ в 5 раз. Полиэтиленгликоль модифицирует свойства Г-КСФ, способствует повышению его стабильности, увеличению периода полувыведения, снижает токсичность и увеличивает избирательность действия за счет фармакокинетических и фармакодинамических параметров [11]. Известно, что ИМГ-КСФ стимулирует процессы восстановления локальной системы регуляции гемопоэза в постцитостатическом периоде в большей степени, чем немодифицированный Г-КСФ. Установлено также, что ИМГ-КСФ может вызывать выход стволовых клеток костного мозга, детерминированных на дифференцировку в определенный тип клеток (прогениторных) в кровь, что свидетельствует о перспективности его использования для лечения дегенеративных заболеваний. Причем его эффект по выраженности и длительности превосходил аналогичный у неконъюгированного Г-КСФ [11].Known fundamental possibility of reducing the toxicity of proteins by immobilizing them on polyethylene glycol (PEG) using electron beam synthesis technology [12]. It has been proven that hydrophilic polymers, including such as polyethylene glycol, can be associated with biologically active substances by adsorption on their surface or the formation of stable chemical bonds [11]. In this case, the formation of a fundamentally new substance - the conjugate IGK-KSF, otherwise called pegylated (PEG-KSF). This substance is 5 times superior in molecular weight to G-CSF. Polyethylene glycol modifies the properties of G-CSF, helps to increase its stability, increase the half-life, reduces toxicity and increases the selectivity of action due to pharmacokinetic and pharmacodynamic parameters [11]. It is known that IMH-CSF stimulates the processes of restoration of the local system of hematopoiesis regulation in the post-cytostatic period to a greater extent than unmodified G-CSF. It was also established that IMH-CSF can cause bone marrow stem cells determined to differentiate into a certain type of cell (progenitor) into the blood, which indicates the promise of its use for the treatment of degenerative diseases. Moreover, its effect in severity and duration was superior to that of unconjugated G-CSF [11].

Однако из отмеченных выше данных факт более эффективного применения ИМГ-КСФ, по сравнению с Г-КСФ, для коррекции отдаленных последствий нарушений сперматогенеза, вызванных цитостатическим воздействием, с достижением нового результата: создания нового, высокоэффективного средства для коррекции отдаленных последствий цитостатического воздействия на сперматогенез, для специалиста является не очевидным.However, from the data noted above, the fact of a more effective use of IMH-CSF, compared with G-CSF, for correcting the long-term effects of spermatogenesis disorders caused by cytostatic effects, with the achievement of a new result: the creation of a new, highly effective means for correcting the long-term effects of cytostatic effects on spermatogenesis, for a specialist is not obvious.

Это заключение основывается на том, что большинство лекарственных веществ при попадании в кровь распределяются в разные органы и ткани неравномерно и не всегда удается достичь желаемой концентрации препарата в органе мишени. С кинетической точки зрения организм можно представить в виде совокупности камер, куда молекулы лекарственного вещества проникают с разной скоростью. Наиболее легко лекарственные препараты проникают в кровь, затем идут в различные ткани организма [13]. Существенное влияние на характер распределения ЛС оказывают гистогематические барьеры, встречающиеся на их пути [14]. Нормальная функция семенников осуществляется только благодаря наличию особого, обладающего селективной проницаемостью, гематотестикулярного барьера. Он образован эндотелиоцитами капилляров, базальной мембраной, собственной оболочкой семенных канальцев, цитоплазмой клеток Сертоли, интерстициальной тканью и белочной оболочкой [15]. Гематотестикулярный барьер изолирует дифференцирующиеся половые клетки от токсических веществ, попадающих в кровь, крупных молекул, в том числе антител и антигенов [15]. В то же время, как было отмечено выше, конъюгирование Г-КСФ с полиэтиленгликолем приводит к увеличению молекулярной массы соединения [11, 16], что может затруднить его проникновение через гематотестикулярный барьер. В доступной литературе данные о возможности проникновения ИМГ-КСФ через гематотестикулярный барьер не найдены.This conclusion is based on the fact that most drugs are distributed unevenly into different organs and tissues when they enter the blood and it is not always possible to achieve the desired concentration of the drug in the target organ. From a kinetic point of view, an organism can be represented as a set of chambers where molecules of a drug substance penetrate at different speeds. Most easily, drugs penetrate the bloodstream, then go to various tissues of the body [13]. A significant influence on the nature of the distribution of drugs is exerted by histohematological barriers encountered on their way [14]. The normal function of the testes is carried out only due to the presence of a special, with selective permeability, hematotesticular barrier. It is formed by capillary endotheliocytes, the basement membrane, the intrinsic membrane of the seminiferous tubules, the cytoplasm of Sertoli cells, interstitial tissue, and the protein membrane [15]. The hematotesticular barrier isolates differentiated germ cells from toxic substances entering the bloodstream, large molecules, including antibodies and antigens [15]. At the same time, as noted above, conjugation of G-CSF with polyethylene glycol leads to an increase in the molecular weight of the compound [11, 16], which may impede its penetration through the hematotesticular barrier. In the available literature, data on the possibility of IMH-CSF penetration through the hematotesticular barrier were not found.

Используемое в предлагаемом изобретении новое средство позволяет вдвое сократить сроки восстановления продуктивности сперматогенеза по сравнению с прототипом, приводя к раннему увеличению количества сперматогониев. Подобранные нами условия введения являются оптимальными для эффективного восстановления сперматогенной ткани. Отмеченный эффект, очевидно, связан со способностью ИМГ-КСФ проходить через гематотестикулярный барьер. Очевидно, благодаря этому новому свойству ИМГ-КСФ оказывает столь эффективное действие.Used in the proposed invention, the new tool allows to halve the recovery time of spermatogenesis productivity compared to the prototype, leading to an early increase in the number of spermatogonia. The conditions of administration chosen by us are optimal for the effective restoration of spermatogenic tissue. The noted effect is obviously associated with the ability of IMH-CSF to pass through the hematotesticular barrier. Obviously, thanks to this new property, IMG-KSF has such an effective effect.

Совокупность отличительных признаков не является очевидной для специалиста и не вытекает явным образом из уровня техники в данной области, что позволяет считать предлагаемое изобретение соответствующим условию патентоспособности «Изобретательский уровень». Предлагаемое изобретение может быть использовано в практическом здравоохранении и соответствует условию «Промышленно применимо».The combination of distinctive features is not obvious to a specialist and does not follow explicitly from the prior art in this field, which allows us to consider the invention in accordance with the patentability condition "Inventive step". The present invention can be used in practical health care and meets the condition "Industrial Applicability".

Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.

Лабораторному животному (крысе-самцу) после цитостатического воздействия, повреждающего стволовые сперматогонии, в течение 5 дней (1 раз в день) через 1 мес после введения цитостатика подкожно вводят препарат ИМГ-КСФ («Саентифик фьючер менеджмент») в дозе 100 мкг/кг.After a cytostatic effect that damages stem spermatogonia, a laboratory animal (male rat) is injected subcutaneously with IMG-CSF (Scientifically Future Management) at a dose of 100 mcg / kg for 5 days (1 time per day) 1 month after cytostatic administration. .

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на аутбредных крысах-самцах (сток СД) в количестве 60 штук, массой 250-300 г. Все животные были получены из отдела экспериментальных биологических моделей ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН, г.Томск (сертификат имеется). Повреждение половых желез моделировалось однократным внутривенным введением цитостатического препарата паклитаксел (митотакс, Dr. Reddy's, Индия) в максимально переносимой дозе, принадлежащего к группе таксанов. Выбор препарата, с одной стороны, обусловлен тем, что паклитаксел относится к числу наиболее востребованных в онкологической практике цитостатических препаратов [2]. С другой стороны, показано, что таксаны принадлежат к числу противоопухолевых препаратов, оказывающих токсическое действие на стволовые сперматогонии [17]. Следует отметить, что избирательность повреждения стволовых сперматогониев характерна для многих широко используемых в онкологической практике препаратов, в частности бисульфата [4]. Истощение пролиферативного пула сперматогенной ткани за счет повреждающего действия на клетки родоначальники (сперматогонии), может быть причиной развития необратимого бесплодия в отдаленные сроки после цитостатического воздействия. Таким образом, цитостатические препараты, повреждающие сперматогонии, оставляют мало перспектив на восстановление сперматогенеза [4]. В связи с этим надежным морфологическим критерием для определения прогноза плодовитости является количество сперматогониев [18].The proposed method was studied in experiments on outbred male rats (stock of diabetes) in the amount of 60 pieces, weighing 250-300 g. All animals were obtained from the department of experimental biological models of the FSBI Research Institute of Pharmacology RAMS, Tomsk (certificate is available) . Damage to the gonads was modeled by a single intravenous administration of the cytostatic drug paclitaxel (mitotax, Dr. Reddy's, India) in the maximum tolerated dose belonging to the group of taxanes. The choice of the drug, on the one hand, is due to the fact that paclitaxel is one of the most popular cytostatic drugs in cancer practice [2]. On the other hand, it has been shown that taxanes are among the antitumor drugs that have a toxic effect on stem spermatogonia [17]. It should be noted that the selectivity of damage to stem spermatogonia is characteristic of many drugs widely used in oncological practice, in particular bisulfate [4]. Depletion of the proliferative pool of spermatogenous tissue due to the damaging effect on the cells of the ancestors (spermatogonia) may be the cause of the development of irreversible infertility in the long term after cytostatic exposure. Thus, cytostatic drugs that damage spermatogonia leave little promise for the restoration of spermatogenesis [4]. In this regard, the number of spermatogonia is a reliable morphological criterion for determining the prognosis of fertility [18].

Для определения эффективности использования ИМГ-КСФ в качестве средства коррекции отдаленных последствий нарушений сперматогенеза, вызванных цитостатическим воздействием, была проведена оценка морфологических и функциональных показателей сперматогенеза в срок, соответствующий по времени проявлению действия цитостатика на сперматогонии (полустволовые и резервные). Этот срок составляет для грызунов 3 мес после введения повреждающего фактора [19].To determine the effectiveness of using IMH-CSF as a means of correcting the long-term consequences of spermatogenesis disorders caused by cytostatic effects, morphological and functional indicators of spermatogenesis were assessed in a time period corresponding to the time it takes for the cytostatic effect on spermatogonia (semi-stem and reserve) to be manifested. This period is 3 months for rodents after the introduction of a damaging factor [19].

Морфологическое исследование семенников проводили с изучением количественных показателей, характеризующих степень выраженности структурных повреждений и процессов репаративной регенерации. Для этого на гистологических парафиновых срезах, окрашенных гематоксилин-эозином, определяли: численность клеточной популяции сперматогониев, [19], количество клеток Сертоли (сустентоцитов) [20]. Рассчитывали степень зрелости сперматогенного пласта (на основании подсчета числа клеток Сертоли) [20]. Продуктивность сперматогенеза оценивали по общему количеству зрелых мужских половых клеток (ОКС), приходящихся на эпидидимис [19]. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием непараметрического критерия U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.A morphological study of the testes was carried out with the study of quantitative indicators characterizing the severity of structural damage and reparative regeneration processes. For this, on histological paraffin sections stained with hematoxylin-eosin, the following were determined: the number of the spermatogonia cell population [19], the number of Sertoli cells (Sustentocytes) [20]. The degree of maturity of the spermatogenic layer was calculated (based on counting the number of Sertoli cells) [20]. Spermatogenesis productivity was assessed by the total number of mature male germ cells (ACS) per epididymis [19]. Statistical processing of the obtained results was carried out using the nonparametric Wilcoxon-Mann-Whitney U-test.

Пример 1Example 1

Недостаточность сперматогенеза в отдаленные сроки цитостатического воздействия моделировали однократным внутривенным введением в максимально переносимой дозе цитостатического препарата паклитаксел. Учитывая длительность сперматогенеза у грызунов [19], последствия повреждения сперматогонии должны проявиться через 3 мес после введения цитостатического препарата. Животным экспериментальной группы для стимуляции регенераторных процессов с 31-х сут после введения паклитаксела вводили подкожно 1 раз в день препарат ИМГ-КСФ («Саентифик фьючер менеджмент») в течение 5 дней в дозе 100 мкг/кг.Long-term spermatogenesis insufficiency was modeled by a single intravenous administration of paclitaxel at the maximum tolerated dose of the cytostatic drug. Given the duration of spermatogenesis in rodents [19], the consequences of damage to spermatogonia should occur 3 months after the administration of the cytostatic drug. Animals of the experimental group to stimulate regenerative processes from the 31st day after the administration of paclitaxel were injected subcutaneously once a day with IMG-CSF (Scientific Future Management) for 5 days at a dose of 100 μg / kg.

Животным контрольной группы (паклитаксел) вводили по той же схеме эквиобъемное количество растворителя ИМГ-КСФ - буферный раствор, содержащий 20 мМ ацетат натрия, рН=4,4. В эксперименте были использованы также интактные животные (фон). В качестве препарата сравнения использовали препарат рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ - Нейпоген, F.Hoffmann-La Roche, Швейцария) в той же дозе и по той же схеме введения.Animals of the control group (paclitaxel) were injected according to the same scheme with an equivalent volume of IMG-CSF solvent — a buffer solution containing 20 mM sodium acetate, pH = 4.4. Intact animals (background) were also used in the experiment. A recombinant human granulocyte colony-stimulating factor preparation (G-CSF - Neupogen, F. Hoffmann-La Roche, Switzerland) was used as a comparison drug in the same dose and according to the same administration schedule.

Проводили эвтаназию животных (в С02 камере), извлекали эпидидимис. Определяли: количество нормальных сперматогониев, общее количество половых клеток, приходящихся на придаток семенника; количество клеток Сертоли (сустентоцитов); вычисляли степень зрелости сперматогенного пласта.The animals were euthanized (in a CO2 chamber), and the epididymis was removed. The following were determined: the number of normal spermatogonia, the total number of germ cells per appendage of the testis; the number of Sertoli cells (Sustentocytes); the maturity of the spermatogenic layer was calculated.

Установлено (табл.1), что через 3 мес после введения паклитаксела численность клеточной популяции сперматогониев оказалась сниженной и составила 67% от фоновых значений. Эта клеточная популяция гетерогенна, состоит из быстро и медленно обновляющихся сперматогониев и резервных клеток, делящихся только при повреждении. Восстановление пролиферативного пула сперматогенного эпителия при повреждении происходит за счет резервных (стволовых) сперматогониев [6]. Сроком проявления их повреждений с учетом длительности сперматогенеза является 3 мес. В связи с этим полученный факт свидетельствует о сокращении количества стволовых сперматогоний под действием паклитаксела.It was established (Table 1) that 3 months after the introduction of paclitaxel, the number of the spermatogonia cell population was reduced and amounted to 67% of the background values. This cell population is heterogeneous, consists of rapidly and slowly renewing spermatogonia and reserve cells, dividing only when damaged. Recovery of the proliferative pool of spermatogenous epithelium in case of damage occurs due to the reserve (stem) spermatogonia [6]. The term for the manifestation of their damage, taking into account the duration of spermatogenesis, is 3 months. In this regard, the fact obtained indicates a decrease in the number of stem spermatogonia under the action of paclitaxel.

Таблица 1Table 1 Морфологические и функциональные показатели генеративной функции семенников крыс через 3 мес после сочетанного введения паклитаксела, Г-КСФ и ИМГ-КСФMorphological and functional indicators of the generative function of rat testes 3 months after the combined administration of paclitaxel, G-CSF and IMG-CSF ПоказателиIndicators ФонBackground Контроль (паклитаксел)Control (paclitaxel) Паклитаксел +ГКСФPaclitaxel + GCSF Паклитаксел+ИМГ-КСФPaclitaxel + IMG-CSF Количество сперматогониев (усл.ед.)The number of spermatogonia (conventional units) 18,44±0,2718.44 ± 0.27 12,35±0,17#12.35 ± 0.17 # 16,72±0,1416.72 ± 0.14 18,36±0,29*▲18.36 ± 0.29 * ▲ Количество клеток Сертоли (усл.ед.)The number of Sertoli cells (conventional units) 2,51±0,182.51 ± 0.18 2,10±0,09#2.10 ± 0.09 # 2,53±0,13*2.53 ± 0.13 * 2,90±0,15*2.90 ± 0.15 * Степень зрелости сперматогенного пласта (усл. ед.)The degree of maturity of the spermatogenic layer (conventional units) 6,12±0,046.12 ± 0.04 5,57±0,02#5.57 ± 0.02 # 5,49±0,02#*5.49 ± 0.02 # * 5,43±0,03#*5.43 ± 0.03 # * Общее количество сперматозоидов, процент от фонаTotal sperm count, percent of background 100one hundred 63#63 # 98*98 * 132▲132 ▲ Примечание: здесь и далееNote: hereinafter # - статистическая значимость различий по сравнению с фоном# - statistical significance of differences compared to background *- статистическая значимость различий по сравнению с контролем (паклитакселом)* - statistical significance of differences compared with control (paclitaxel) ▲ - статистическая значимость различий по сравнению с ГКСФ▲ - statistical significance of differences compared with GCSF

При подсчете количества клеток Сертоли через 3 мес после введения паклитаксела их число оказалось сниженным. При определении степени зрелости сперматогенного пласта было установлено, что в семенниках крыс, получавших цитостатик, несмотря на невысокое содержание клеток Сертоли, идет обновление ткани семенника. Об этом свидетельствует достоверно более низкий, чем у фона, показатель степени зрелости сперматогенного пласта. Судя по общему количеству зрелых половых клеток (ОКС), приходящихся на эпидидимис, на фоне введения паклитаксела (табл.1) продуктивность сперматогенеза составила всего 63% от фонового значения. Учитывая то, что общее количество половых клеток является одним из лабораторных показателей фертильности эякулята [6], то отмеченное выше значительное уменьшение их числа может приводить к снижению плодовитости животных. Таким образом, в отдаленные сроки после введения паклитаксела наблюдается, судя по числу сперматогониев, - дефицит пролиферативного пула, судя по ОКС - недостаточность продуктивности сперматогенеза. В то же время имеет место реакция ткани на повреждение - идут процессы репаративной регенерации на уровне ткани в целом (степень зрелости сперматогенного пласта снижена). Однако ее интенсивность невысока, судя по количеству сперматогониев и ОКС.When counting the number of Sertoli cells 3 months after the introduction of paclitaxel, their number was reduced. When determining the degree of maturity of the spermatogenic layer, it was found that in the testes of rats treated with cytostatic, despite the low content of Sertoli cells, the testis tissue is being updated. This is evidenced by a significantly lower than the background indicator of the degree of maturity of the spermatogenic layer. Judging by the total number of mature germ cells (ACS) per epididymis, against the background of paclitaxel administration (Table 1), spermatogenesis productivity was only 63% of the background value. Considering that the total number of germ cells is one of the laboratory indicators of ejaculate fertility [6], the significant decrease in their number noted above can lead to a decrease in the fecundity of animals. Thus, in the long term after the administration of paclitaxel, judging by the number of spermatogonia, proliferative pool deficiency is observed, judging by ACS, there is a lack of spermatogenesis productivity. At the same time, the tissue reacts to damage - reparative regeneration processes are taking place at the level of the tissue as a whole (the degree of maturity of the spermatogenic layer is reduced). However, its intensity is low, judging by the number of spermatogonia and ACS.

При морфологическом изучении семенников крыс, получавших на фоне введения паклитаксела препарат сравнения Г-КСФ (табл.1), было выявлено, что количество сперматогониев статистически значимо превышает таковое при введении одного цитостатика, хотя и не достигает фоновых значений. Полученные данные свидетельствуют о способности Г-КСФ приводить к увеличению численности клеточной популяции сперматогониев. Количество клеток Сертоли превышало контрольные значения и не отличалось от фона. Степень зрелости сперматогенного пласта оказалась сниженной по сравнению с контролем и фоном. Это свидетельствует о том, что под действием препарата сравнения идут процессы репаративной регенерации ткани и интенсивность их выше, чем в контроле. Полученные результаты подтверждают данные о том, что Г-КСФ обладает способностью стимулировать сперматогенез животных после цитостатического воздействия за счет стимуляции процессов репаративной регенерации [10]. В пользу этого свидетельствует также тот факт, что ОКС на фоне введения препарата сравнения возрастало и достигало фоновых значений.A morphological study of the testes of rats treated with paclitaxel compared with the G-CSF comparison drug (Table 1) revealed that the number of spermatogonia was statistically significantly higher than when a single cytostatic agent was administered, although it did not reach the background values. The obtained data indicate the ability of G-CSF to increase the number of spermatogonia in the cell population. The number of Sertoli cells exceeded the control values and did not differ from the background. The degree of maturity of the spermatogenic layer was reduced compared with the control and background. This indicates that, under the influence of the comparison drug, the processes of reparative tissue regeneration proceed and their intensity is higher than in the control. The obtained results confirm the data that G-CSF has the ability to stimulate the spermatogenesis of animals after cytostatic exposure by stimulating the processes of reparative regeneration [10]. This fact is also supported by the fact that ACS against the background of administration of the reference drug increased and reached background values.

В группе животных, получавших сочетанное введение ИМГ-ГКС и паклитаксела, численность клеточной популяции сперматогониев не отличалась от фоновых значений (при введении препарата сравнения этот показатель не достигал фоновых значений), оказалась выше таковой в контроле и статистически выше такового у животных, получавших Г-КСФ. Количество клеток Сертоли достоверно возрастало по сравнению с контролем (также, как и в группе препарата сравнения). Степень зрелости сперматогенного пласта снижалась по сравнению с контролем и фоном (также, как и у препарата сравнения). В то же время при подсчете продуктивности сперматогенеза было установлено, что ОКС на фоне ведения ИМГ-КСФ достоверно превышает в 2,3 раза контрольные значения, в 1,3 раза фоновые и в 1,4 раза у препарата сравнения. Учитывая, что в основе продуктивности сперматогенеза лежит количество сперматогониев, то возрастание ОКС на фоне ИМГ-КСФ, очевидно, является результатом восстановления их численности. Однако полученных данных не достаточно для объяснения причин более высокой эффективности ИМГ-КСФ по сравнению с препаратом сравнения. Это связано с тем, что сравниваемые группы не отличались друг от друга по интенсивности течения регенераторных процессов, т.е. по таким показателям, как степень зрелости сперматогенного пласта и количество клеток Сертоли.In the group of animals treated with the combined administration of IMH-GCS and paclitaxel, the number of spermatogonia cell populations did not differ from the background values (when the reference drug was administered, this indicator did not reach the background values), it was higher than that in the control and statistically higher than that in animals treated with G- CSF. The number of Sertoli cells significantly increased compared with the control (as well as in the comparison drug group). The degree of maturity of the spermatogenic layer decreased compared to the control and background (as well as the comparison drug). At the same time, when calculating the productivity of spermatogenesis, it was found that ACS against the background of IMH-CSF significantly exceeds 2.3 times the control values, 1.3 times the background and 1.4 times for the comparison drug. Given that the number of spermatogonia is at the heart of the productivity of spermatogenesis, the increase in ACS against the background of IMH-CSF is obviously the result of the restoration of their numbers. However, the data obtained are not sufficient to explain the reasons for the higher efficacy of IMH-CSF compared with the reference drug. This is due to the fact that the compared groups did not differ from each other in the intensity of the course of regenerative processes, i.e. by indicators such as the degree of maturity of the spermatogenic layer and the number of Sertoli cells.

Для образования стволовых сперматогониев, а следовательно, и для восстановления сперматогенеза необходимо наличие ниш, которые формируют клетки Сертоли (клетки микроокружения) [21]. Последние утрачивают способность к делению в зрелых извитых семенных канальцах [22]. Регенерация семенных канальцев в целом возможна только одним путем - путем формирования семенных канальцев незрелого типа из регенерационной зоны, которые характеризуются повышенным содержанием клеток Сертоли [22].For the formation of stem spermatogonia, and, consequently, for the restoration of spermatogenesis, the presence of niches that form Sertoli cells (microenvironment cells) is necessary [21]. The latter lose their ability to divide in mature convoluted seminiferous tubules [22]. Regeneration of the seminiferous tubules as a whole is possible in only one way — by forming the immature tubules of the immature type from the regeneration zone, which are characterized by an increased content of Sertoli cells [22].

Таким образом, количество сперматогониев может увеличиться только за счет увеличения клеток Сертоли и степени зрелости сперматогенного пласта.Thus, the number of spermatogonia can only increase due to an increase in Sertoli cells and the degree of maturity of the spermatogenic layer.

Представленные выше результаты свидетельствуют лишь о более высокой эффективности ИМГ-КСФ по сравнению с препаратом сравнения.The results presented above only indicate a higher efficacy of IMH-CSF compared with the reference drug.

Очевидно, что стимуляция процессов репаративной регенерации происходит в более ранние сроки. В таблице 2 представлены результаты всех исследуемых показателей через 2 мес после начала эксперимента.Obviously, the stimulation of reparative regeneration processes occurs at an earlier date. Table 2 presents the results of all the studied parameters 2 months after the start of the experiment.

Таблица 2table 2 Морфологические и функциональные показатели генеративной функции семенников крыс через 2 мес после сочетанного введения паклитаксела, Г-КСФ и ИМГ-КСФMorphological and functional indicators of the generative function of rat testes 2 months after the combined administration of paclitaxel, G-CSF and IMG-CSF ПоказателиIndicators ФонBackground КонтрольThe control Паклитаксел+ГКСФPaclitaxel + GCSF Паклитаксел+ИМГ-КСФPaclitaxel + IMG-CSF Количество сперматогониев (усл.ед.)The number of spermatogonia (conventional units) 18,03±0,3218.03 ± 0.32 12,57±0,46#12.57 ± 0.46 # 16,41±0,10#*16.41 ± 0.10 # * 18,08±0,16*▲18.08 ± 0.16 * ▲ Количество клеток Сертоли (усл.ед.)The number of Sertoli cells (conventional units) 2,75±0,022.75 ± 0.02 2,58±0,06#2.58 ± 0.06 # 4,89±0,18#*4.89 ± 0.18 # * 2,47±0,02#▲2.47 ± 0.02 # ▲ Степень зрелости сперматогенного пласта (усл. ед.)The degree of maturity of the spermatogenic layer (conventional units) 6,07±0,006.07 ± 0.00 5,49±0,01#5.49 ± 0.01 # 5,07±0,03#*5.07 ± 0.03 # * 5,51±0,00#▲5.51 ± 0.00 # ▲ Общее количество сперматозоидов, процент от фонаTotal sperm count, percent of background 100one hundred 78#78 # 138#*138 # * 225#*▲225 # * ▲

Установлено, что количество сперматогониев у крыс, получавших ИМГ-КСФ, не отличалось от фона и превосходило таковое у контрольных животных и крыс, получавших препарат сравнения. Количество ОКС превышало даже фоновые значения. Таким образом, эффективность ИМГ-КСФ была выше, чем Г-КСФ, и через 2 мес после начала эксперимента. Однако, судя по показателям, характеризующим интенсивность регенераторных процессов, они шли более интенсивно в группе крыс, получавших препарат сравнения. Об этом свидетельствует достоверно повышенное по сравнению с контролем количество клеток Сертоли и самая низкая по сравнению с таковой у крыс других групп степень зрелости сперматогенного пласта. Таким образом, факт восстановления основных показателей сперматогенеза (количества сперматогониев и ОКС) через 3 мес после введения Г-КСФ (табл.1) является результатом более интенсивных, чем в контроле, процессов репаративной регенерации сперматогенной ткани, зафиксированной через 2 мес после введения препарата сравнения.It was found that the number of spermatogonia in rats treated with IMH-CSF did not differ from the background and exceeded that in control animals and rats treated with the comparison drug. The number of ACS exceeded even background values. Thus, the effectiveness of IMH-CSF was higher than G-CSF, and 2 months after the start of the experiment. However, judging by the indicators characterizing the intensity of regenerative processes, they proceeded more intensively in the group of rats treated with the reference drug. This is evidenced by the significantly increased in comparison with the control the number of Sertoli cells and the lowest degree of maturity of the spermatogenic layer compared to that in rats of other groups. Thus, the fact of the restoration of the main indicators of spermatogenesis (the number of spermatogonia and ACS) 3 months after the administration of G-CSF (Table 1) is the result of more intensive than in the control processes of reparative regeneration of spermatogenic tissue, recorded 2 months after the administration of the comparison drug .

В то же время полученные данные, касающиеся высокой численности популяции сперматогониев и продуктивности сперматогенеза в данный период на фоне введения ИМГ-КСФ, не сопровождаются интенсификацией процессов репаративной регенерации (количество клеток Сертоли даже ниже, чем у фона, степень зрелости сперматогенного пласта не превышает контрольные значения). Повышенное количество сперматогониев и ОКС, возможно только в том случае, если процессы репаративной регенерации сперматогенной ткани начались раньше таковых у препарата сравнения.At the same time, the data obtained regarding the high population of spermatogonia and spermatogenesis productivity in this period against the background of IMH-CSF administration are not accompanied by intensification of reparative regeneration processes (the number of Sertoli cells is even lower than the background, the degree of maturity of the spermatogenic layer does not exceed the control values ) An increased number of spermatogonia and ACS is possible only if the processes of reparative regeneration of spermatogenic tissue began earlier than those of the comparison drug.

В связи с этим были изучены все исследуемые показатели через 1,5 мес после введения паклитаксела (табл.3). Установлено, что численность клеточной популяции сперматогониев в контроле оставалась ниже фона, и во всех остальных экспериментальных группах этот показатель не отличался от контрольных значений. В то же время при введении ИМГ-КСФ этот показатель превышал таковой в группе препарата сравнения. Продуктивность сперматогенеза (ОКС) в контрольной группе составляла лишь 57,9% от контроля. Она была снижена по сравнению с фоном и при введении Г-КСФ. Напротив, у животных, получавших ИМГ-КСФ, этот показатель превышал контрольные значения и таковые в группе препарата сравнения, а также достоверно не отличался от фона. При подсчете количества клеток Сертоли на фоне введения ИМГ-КСФ выявлялось их повышенное содержание по сравнению с фоном, контролем, с таковыми значениями в группе препарата сравнения. Степень зрелости сперматогенного пласта оказалась самой низкой только у животных, получавших ИМГ-КСФ (табл.3).In this regard, all the studied parameters were studied 1.5 months after the administration of paclitaxel (Table 3). It was established that the number of the spermatogonia cell population in the control remained below the background, and in all other experimental groups this indicator did not differ from the control values. At the same time, with the introduction of IMH-CSF, this indicator exceeded that in the comparison drug group. Spermatogenesis productivity (ACS) in the control group was only 57.9% of the control. It was reduced compared to the background and with the introduction of G-CSF. On the contrary, in animals treated with IMH-CSF, this indicator exceeded the control values and those in the comparison drug group, and also did not significantly differ from the background. When counting the number of Sertoli cells against the background of IMH-CSF administration, their increased content was revealed compared to the background, control, with those values in the comparison drug group. The degree of maturity of the spermatogenic layer was the lowest only in animals treated with IMH-CSF (Table 3).

Оценивая в целом состояние тестикулярной ткани через 1,5 мес после введения паклитаксела, следует отметить, что в контроле признаки начала репаративной регенерации ткани, судя по снижению степени зрелости сперматогенного пласта, уже начали выявляться, однако их интенсивность была невысока и сходна с таковой в группе животных, получавших Г-КСФ. У животных, которым вводили ИМГ-КСФ, степень зрелости сперматогенного пласта оказалась в этот период наблюдения достоверно ниже, чем в контрольной группе и группе крыс, получавших Г-КСФ. Это подтверждается и достоверно повышенным содержанием клеток Сертоли.Assessing the overall condition of the testicular tissue 1.5 months after the introduction of paclitaxel, it should be noted that in the control the signs of the beginning of reparative tissue regeneration, judging by the decrease in the maturity of the spermatogenic layer, have already begun to be detected, however, their intensity was low and similar to that in the group animals treated with G-CSF. In animals that were injected with IMH-CSF, the maturity of the spermatogenic layer was significantly lower during this observation period than in the control group and the group of rats treated with G-CSF. This is confirmed by a significantly increased content of Sertoli cells.

Таким образом, через 1,5 мес после введения паклитаксела и ИМГ-КСФ отчетливо проявляется процесс стимулирования репаративной регенерации семенников, чего не выявлено на фоне введения Г-КСФ. При введении Г-КСФ регенерация началась через 2 мес после начала опыта.Thus, 1.5 months after the introduction of paclitaxel and IMH-CSF, the process of stimulating the reparative regeneration of the testes is clearly manifested, which was not detected during the administration of G-CSF. With the introduction of G-CSF, regeneration began 2 months after the start of the experiment.

Таким образом, восстановление количества сперматогониев до фоновых значений и существенное возрастание ОКС через 3 мес после введения паклитаксела и ИМГ-КСФ является следствием более раннего, чем при введении Г-КСФ, начала стимулирования процесса репаративной регенерации (через 1,5 мес после начала эксперимента). На фоне введения ИМГ-КСФ стимулирующее действие начинается позднее (через 2 мес).Thus, the restoration of the number of spermatogonia to baseline values and a significant increase in ACS 3 months after the administration of paclitaxel and IMH-CSF is a consequence of the earlier than with the introduction of G-CSF stimulation of the process of reparative regeneration (1.5 months after the start of the experiment) . Against the background of the introduction of IMH-CSF, the stimulating effect begins later (after 2 months).

Результатом более раннего стимулирования репаративных процессов на фоне введения ИМГ-КСФ является более раннее, чем после введения И-ГКСФ, восстановление количества сперматогониев (через 1,5 мес) и более раннее восстановление продуктивности сперматогенеза (через 1,5 мес). На фоне введения Г-КСФ отмеченные эффекты выявлялись на 2 недели позднее. Следует обратить внимание, что при использовании ИМГ-КСФ стимулирование регенерации семенника происходило не только в более ранние сроки, но интенсивность ее была повышенной по сравнению с таковой при введении Г-КСФ. Об этом свидетельствует существенное возрастание продуктивности сперматогенеза. Так, ОКС через 1,5; 2 и 3 мес оказалось выше при введении ИМГ-КСФ, чем при использовании Г-КСФ, на 34,87 и 16% соответственно. Через 3 мес после начала эксперимента общее количество половых клеток в 2 раза превышало фоновые значения. Это может существенно повысить фертильность животных, надежность которой обеспечивается как можно большим дублированием половых клеток.The result of earlier stimulation of reparative processes against the background of the introduction of IMH-CSF is earlier than after the administration of I-GCSF, the restoration of the number of spermatogonia (after 1.5 months) and earlier restoration of the productivity of spermatogenesis (after 1.5 months). Against the background of the introduction of G-CSF, the noted effects were detected 2 weeks later. It should be noted that when using IMH-CSF, stimulation of testis regeneration occurred not only at earlier dates, but its intensity was increased compared to that with the introduction of G-CSF. This is evidenced by a significant increase in the productivity of spermatogenesis. So, ACS after 1.5; 2 and 3 months was higher with the introduction of IMH-CSF than with the use of G-CSF, by 34.87 and 16%, respectively. 3 months after the start of the experiment, the total number of germ cells was 2 times higher than the background values. This can significantly increase the fertility of animals, the reliability of which is ensured by the greatest possible duplication of germ cells.

Таблица 3Table 3 Морфологические и функциональные показатели генеративной функции семенников крыс через 1,5 мес после сочетанного введения паклитаксела и ИМГ-КСФMorphological and functional indicators of the generative function of rat testes 1.5 months after the combined administration of paclitaxel and IMG-CSF ПоказателиIndicators ФонBackground КонтрольThe control Паклитаксел+Г-КСФPaclitaxel + G-CSF Паклитаксел+ИМГ-КСФPaclitaxel + IMG-CSF Количество сперматогониев (усл.ед.)The number of spermatogonia (conventional units) 18,47±0,2818.47 ± 0.28 16,45±0,18#16.45 ± 0.18 # 16,56±0,34#16.56 ± 0.34 # 17,13±0,36#▲17.13 ± 0.36 # ▲ Количество клеток Сертоли (усл.ед.)The number of Sertoli cells (conventional units) 1,07±0,031.07 ± 0.03 1,11±0,031.11 ± 0.03 1,20±0,03#1.20 ± 0.03 # 1,96±0,20#*▲1.96 ± 0.20 # * ▲ Степень зрелости сперматогенного пласта (усл. ед.)The degree of maturity of the spermatogenic layer (conventional units) 6,45±0,016.45 ± 0.01 5,75±0,01 #5.75 ± 0.01 # 5,73±0,01#5.73 ± 0.01 # 5,60±0,04#*▲5.60 ± 0.04 # * ▲ Общее количество сперматозоидов (млн)Total sperm count (million) 100one hundred 57,91#57.91 # 66,00#66.00 # 86,005*▲86,005 * ▲

Предлагаемое изобретение позволяет провести высокоэффективную коррекцию нарушений сперматогенеза, вызванных цитостатическим воздействием, за счет ранней стимуляции процессов репаративной регенерации тестикулярной ткани в целом, приводящей к восстановлению численности клеточной популяции сперматогониев, что в свою очередь обеспечивает быстрое восстановление сперматогенеза. Следует отметить, что ИМГ-КСФ, в отличие от Г-КСФ, является практически нетоксичным соединением [23].The present invention allows for highly effective correction of spermatogenesis disorders caused by cytostatic effects due to early stimulation of the reparative regeneration of testicular tissue as a whole, leading to a restoration of the number of spermatogonia cell populations, which in turn provides rapid recovery of spermatogenesis. It should be noted that IMH-CSF, in contrast to G-CSF, is a practically non-toxic compound [23].

Источники информацииInformation sources

1. Быстрова О.В., Калугина А.С., Цыбытова Е.В., Тапильская Н.И., Диникина Ю.В. и др. Способы восстановления фертильности у онкологических больных. // Практическая онкология. 2009. Т.10. №4. С.245-246.1. Bystrova OV, Kalugina A.S., Tsybytova E.V., Tapilskaya N.I., Dinikina Yu.V. et al. Methods of restoring fertility in cancer patients. // Practical oncology. 2009.V.10. Number 4. S.245-246.

2. Корман Д.Б. Основы противоопухолевой химиотерапии. - М.: Практическая медицина. 2006. С.18-20.2. Corman DB Basics of antitumor chemotherapy. - M .: Practical medicine. 2006. S.18-20.

3. Киселева М.В., Карпейкина М.М., Денисов М.С. Сохранение фертильности у молодых онкологических пациентов // Материалы VI съезда онкологов и радиологов стран СНГ. 1-10 октября 2010 г. Душанбе. С.346.3. Kiseleva M.V., Karpeykina M.M., Denisov M.S. Preservation of fertility in young oncological patients // Materials of the VI Congress of Oncologists and Radiologists of the CIS countries. October 1-10, 2010 Dushanbe. S.346.

4. Адамян Л.В. Белобородов СМ. Возможность сохранения репродуктивной функции у онкологических больных (обзор литературы) // Проблемы репродукции 2003. №6. С.29.4. Adamyan L.V. Beloborodov SM. The ability to preserve reproductive function in cancer patients (literature review) // Reproduction Problems 2003. No. 6. S.29.

5. Резниченко А.Г. Влияние химио- и радиотерапии на сперматогенез у онкологических больных (Обзор литературы) // Проблемы репродукции. 2007. №7. С.72.5. Reznichenko A.G. The effect of chemo- and radiotherapy on spermatogenesis in cancer patients (Literature review) // Problems of reproduction. 2007. No7. S.72.

6. Липатова Н.А. Лабораторные критерии фертильности эякулята // Клиническая лабораторная диагностика. 1998. Т.5. С.14.6. Lipatova N.A. Laboratory criteria for ejaculate fertility // Clinical laboratory diagnostics. 1998.V.5. S.14.

7. Патент РФ №2318529 «Средство для профилактики и коррекции нарушений сперматогенеза, вызванного цитостатическим воздействием» // Гольдберг Е.Д., Боровская Т.Г., Щемерова Ю.А., и др. 2008 г. Опубликован 10.03.2008. Бюл. №7.7. RF patent No. 2318529 "Means for the prevention and correction of disorders of spermatogenesis caused by cytostatic effects" // Goldberg ED, Borovskaya TG, Schemerova Yu.A., et al. 2008. Published on March 10, 2008. Bull. Number 7.

8. Carmely A., Meirow D., Pepetz A. et al. Patologia indotta da chtmotherahe // Argumenti Reproduction 2009. Vol 24, №6. P.1322-1329.8. Carmely A., Meirow D., Pepetz A. et al. Patologia indotta da chtmotherahe // Argumenti Reproduction 2009. Vol 24, No. 6. P.1322-1329.

9. Yoshi S., Monabe F., Hiroshi T. et al. Huxon ragary pexo tarray dsasel // Chemotherapy. 1990. Vol.38, №7. P. 670-675.9. Yoshi S., Monabe F., Hiroshi T. et al. Huxon ragary pexo tarray dsasel // Chemotherapy. 1990. Vol. 38, No. 7. P. 670-675.

10. Патент РФ №2406527 «Способ коррекции нарушений сперматогенеза, вызванных цитостатическим воздействием» // Боровская Т.Г., Дыгай A.M., Жданов В.В., Румпель О.А. и др. Опублткован 2.12.2010. Бюл. №35.10. RF patent No. 2406527 "Method for the correction of spermatogenesis disorders caused by cytostatic effects" // Borovskaya TG, Dygay A.M., Zhdanov VV, Rumpel OA et al. Published on December 2, 2010. Bull. Number 35.

11. Дыгай A.M., Артамонов А.В., Бекарев А.А., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Мадонов П.Г., Удут В.В. Нанотехнологии в фармакологии. - М.: Изд-во РАМН. 2011. С.36-37, 39, 55, 70, 79.11. Digay A.M., Artamonov A.V., Bekarev A.A., Zhdanov V.V., Zyuzkov G.N., Madonov P.G., Udut V.V. Nanotechnology in pharmacology. - M.: Publishing House of RAMS. 2011. S. 36-37, 39, 55, 70, 79.

12. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Чурин А.А., Жданов В.В., Артамонов А.В. и др. Фармакологические свойства пегелированного с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза соматотропина // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2012. Т153. №3. С 232.12. Dygay A.M., Zyuzkov G.N., Churin A.A., Zhdanov V.V., Artamonov A.V. et al. Pharmacological properties of electron-beam synthesis of somatotropin pegelated using nanotechnology // Bull. an experiment. biol. and honey. 2012. T153. Number 3. C 232.

13. Каркищено Н.Н., Хоронько В.В., Сергеева С.А., Каркищенко В.Н. Фармакокинетика. Ростов-на Дону. 2001. С.25.13. Karkischenko N.N., Khoronko V.V., Sergeeva S.A., Karkishchenko V.N. Pharmacokinetics Rostov-on-Don. 2001. P.25.

14. Клиническая фармакокинетика, теоретические, прикладные и аналитические процессы / под. Ред. В.Г. Кукеса. 2009. Глава 4.1. Савельева И.И., Сокова Е.А. Общие представления о распределении лекарственных средств с белками плазмы крови. С.72.14. Clinical pharmacokinetics, theoretical, applied and analytical processes / under. Ed. V.G. Kukes. 2009. Chapter 4.1. Savelyeva I.I., Sokova E.A. General ideas about the distribution of drugs with plasma proteins. S.72.

15. Хэм. А., Кормак Д. Гистология. 1983. - М.: Мир. Том 5. С.204.15. Ham. A., Cormac D. Histology. 1983. - M.: World. Volume 5. P.204.

16. Дыгай A.M., Скурихин Е.Г., Андреева Т.В., Мадонов П.Г., Верещагин Е.И. и др. Действие иммобилизированного гранул оцитарного колониестимулирующего фактора на кроветворные предшественники разных классов при цитостатической миелосупрессии // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2010. Т.149. №3. С.255.16. Digay A.M., Skurikhin EG, Andreeva T.V., Madonov P.G., Vereshchagin E.I. et al. The effect of immobilized granules of an oocyte colony stimulating factor on hematopoietic precursors of different classes during cytostatic myelosuppression // Bull. an experiment. biol. and honey. 2010.V. 149. Number 3. S.255.

17. Сухачева Т.В. Афтореф. дисс.на соискание ученой степени канд. биол. наук «Роль ДНК-топоизомераз I и II типов в организации синаптонемных комплексов в и хромосом в сперматогенез у мыши». - М. 2001. С.18.17. Sukhacheva T.V. Aftoref. thesis for the degree of Cand. biol. Sciences "The role of DNA topoisomerases of types I and II in the organization of synaptonemal complexes in and chromosomes in spermatogenesis in mice." - M. 2001.P.18.

18. Ухов Ю.И., Астраханцев А.Ф. Морфологические методы в оценке функционального состояния семенников // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии 1983. №3. С.68.18. Ukhov Yu.I., Astrakhantsev A.F. Morphological methods in assessing the functional state of the testes // Archive of Anatomy, Histology and Embryology 1983. No. 3. S.68.

19. Саноцкий И.В., Фоменко В.И. Отдаленные последствия влияния химических соединений на организм. - М.: Наука. 1979. С.73,145.19. Sanotsky I.V., Fomenko V.I. Long-term effects of the influence of chemical compounds on the body. - M .: Science. 1979. S. 73,145.

20. Сухоруков B.C., Шамшад Д.С. Определение степени зрелости сперматогенного пласта крысы при его регенерации и в процессе созревания интактного семенника // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. 1989. Т.97. №9. С.89.20. Sukhorukov B.C., Shamshad D.S. Determining the degree of maturity of the rat spermatogenic layer during its regeneration and in the process of maturation of the intact testis // Archive of Anatomy, Histology and Embryology. 1989.V. 97. No. 9. S.89.

21. Meachem S., Schonfeldt V., Schlatt S. Spermatogonia: stem cells with a great perspective // Reprod. 2001. Vol.121. №6. P 825-834.21. Meachem S., Schonfeldt V., Schlatt S. Spermatogonia: stem cells with a great perspective // Reprod. 2001. Vol. 121. No. 6. P 825-834.

22. Курносова Т.Р., Вербицкий М.Ш., Сухих Г.Т., Молнар Е.М. Современные представления о структурных основах репаративной регенерации семенника млекопитающих животных и человека // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1994. №4. С.397.22. Kurnosova T.R., Verbitsky M.Sh., Sukhikh G.T., Molnar E.M. Modern views on the structural foundations of reparative regeneration of the testis of mammalian animals and humans // Bulletin of experimental biology and medicine. 1994. No4. S.397.

23. Piedmonte D.М., Treuheit M.J. // Ad.v. Drug. Delis Rev. 2008. Vol.60. P.50-58.23. Piedmonte D.M., Treuheit M.J. // Ad.v. Drug. Delis Rev. 2008. Vol.60. P.50-58.

Claims

The use of a conjugate of granulocyte colony-stimulating factor immobilized on low molecular weight polyethylene glycol obtained using electron beam synthesis nanotechnology - exposure to a stream of accelerated electrons with an energy of 2.5 MeV, an absorbed dose of 2-10 kGy and a collection speed of 1.65 kGy / h, as a means to correct the long-term effects of spermatogenesis disorders caused by cytostatic effects.