RU2499043C1 - Стимулятор пролиферации регуляторных т-лимфоцитов и способ их стимуляции - Google Patents
Стимулятор пролиферации регуляторных т-лимфоцитов и способ их стимуляции Download PDFInfo
- Publication number
- RU2499043C1 RU2499043C1 RU2012140939/10A RU2012140939A RU2499043C1 RU 2499043 C1 RU2499043 C1 RU 2499043C1 RU 2012140939/10 A RU2012140939/10 A RU 2012140939/10A RU 2012140939 A RU2012140939 A RU 2012140939A RU 2499043 C1 RU2499043 C1 RU 2499043C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- regulatory
- lymphocytes
- proliferation
- cells
- sirs
- Prior art date
Links
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 title description 20
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 title 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 21
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 3
- LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N (2s,3r)-2-[[(2r)-1-[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N 0.000 claims description 2
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 abstract 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 abstract 1
- 108010041956 soluble immune response suppressor Proteins 0.000 description 26
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 15
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 12
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 10
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 10
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 10
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- DMBKPDOAQVGTST-LBPRGKRZSA-N (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-3-phenylmethoxypropanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)COCC1=CC=CC=C1 DMBKPDOAQVGTST-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- ZQEBQGAAWMOMAI-ZETCQYMHSA-N (2s)-1-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O ZQEBQGAAWMOMAI-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- IMUSLIHRIYOHEV-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-4-methylsulfanylbutanoic acid Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OC(C)(C)C IMUSLIHRIYOHEV-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- PYGOCFDOBSXROC-QHCPKHFHSA-N (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-4-oxo-4-(tritylamino)butanoic acid Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(C=1C=CC=CC=1)(NC(=O)C[C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 PYGOCFDOBSXROC-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 1
- AJDUMMXHVCMISJ-ZDUSSCGKSA-N (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-5-oxo-5-phenylmethoxypentanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(=O)OCC1=CC=CC=C1 AJDUMMXHVCMISJ-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- QVHJQCGUWFKTSE-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)OC(C)(C)C QVHJQCGUWFKTSE-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- NLPQIWFEEKQBBN-NSHDSACASA-N (2s)-4-cyclohexyloxy-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(=O)OC1CCCCC1 NLPQIWFEEKQBBN-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- ATUMDPHEFWGCJF-HNNXBMFYSA-N (2s)-6-[(2-chlorophenyl)methoxycarbonylamino]-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]hexanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCNC(=O)OCC1=CC=CC=C1Cl ATUMDPHEFWGCJF-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- CTXPLTPDOISPTE-YPMHNXCESA-N (2s,3r)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-3-phenylmethoxybutanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)[C@@H](C)OCC1=CC=CC=C1 CTXPLTPDOISPTE-YPMHNXCESA-N 0.000 description 1
- QJCNLJWUIOIMMF-YUMQZZPRSA-N (2s,3s)-3-methyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]pentanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OC(C)(C)C QJCNLJWUIOIMMF-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VADKRMSMGWJZCF-UHFFFAOYSA-N 2-bromophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1Br VADKRMSMGWJZCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 5-azacytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 description 1
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 201000009594 Systemic Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 206010042953 Systemic sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- RTKIYFITIVXBLE-UHFFFAOYSA-N Trichostatin A Natural products ONC(=O)C=CC(C)=CC(C)C(=O)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 RTKIYFITIVXBLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 1
- 125000000266 alpha-aminoacyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 201000004995 autoimmune glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 229960002756 azacitidine Drugs 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N diisopropylcarbodiimide Natural products CC(C)NC(=O)NC(C)C BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 201000000306 sarcoidosis Diseases 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 1
- RTKIYFITIVXBLE-QEQCGCAPSA-N trichostatin A Chemical compound ONC(=O)/C=C/C(/C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 RTKIYFITIVXBLE-QEQCGCAPSA-N 0.000 description 1
- 230000005951 type IV hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, биотехнологии и медицины. Предложен N-концевой фрагмент растворимого супрессора иммунного ответа длиной в 21 аминокислоту, имеющий последовательность аминокислот по Seq ID NО: 1, позволяющий стимулировать образование регуляторных Т-лимфоцитов, а также способ стимуляции образования регуляторных Т-лимфоцитов N-концевым фрагментом растворимого супрессора иммунного ответа с Seq ID NО: 1, при введении его в концентрации 0,1-50 мкг/мл. Изобретение может быть использовано для размножения регуляторных Т-лимфоцитов, полученных от больного, страдающего от аутоиммунного заболевания, с целью последующего введения полученных Т-лимфоцитов данному больному. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к биопрепаратам медицинского назначения, предназначенных для воздействия на иммунную систему организма, а именно на активность Т-лимфоцитов, а именно к стимуляторам пролиферации регуляторных Т-лимфоцитов.
Минорная субпопуляция Т-лимфоцитов, называемая регуляторными Т-лимфоцитами (Treg), способна, с помощью нескольких механизмов, ингибировать пролиферацию обычных Т-лимфоцитов, выполняя важную функцию подавления активности Т-клеток, направленной против собственных антигенов организма. Фенотипически регуляторные Т-лимфоциты отличаются наличием маркеров CD4+CD25+FoxP3+ [Aune Т.М. et al. // J. Immunol. - 1983. - v. 131. - p.2848-2852; Webb D.R. et al. // International Immunology. - 1990. -v.2. - p.765-774].
Повышенное содержание регуляторных Т-лимфоцитов наблюдается в лимфоцитах опухолей и дренирующих лимфоузлов опухолей, что, возможно, является одной из причин подавления Т-клеточного иммунного ответа организма на антигены опухоли. В связи с этим повышение активности и/или содержания Treg в организме может стать способом лечения ряда аутоиммунных заболеваний, осложнений, связанных с пересадкой органов и тканей, включая пересадку костного мозга, например болезни «трансплантат против хозяина». В частности, в настоящее время предложен способ лечения аутоиммунных и аллоиммунных заболеваний путем забора у больного, нуждающегося в данном лечении, лейкоцитарной массы, выделении из нее клеток с фенотипом CD4+CD25+, последующем культивировании данных клеток in vitro продолжительностью до 4-х недель с целью их размножения и обратном введении полученных клеток больному (WO 2005086781, 2004).
В качестве агентов, стимулирующих пролиферацию регуляторных Т-клеток предлагается использовать азацитидин, фактор некроза опухоли-бета, ретиноевую кислоту, трихостатин А, анти-CD3, анти-CD28, окисленный АТФ, интерлейкин-2 (WO 2009126877, 2008; WO 2009114097, 2008).
Недостатком данных стимуляторов является то, что они не являются строго избирательными стимуляторами пролиферации регуляторных Т-лимфоцитов, что вызывает необходимость в поиске более специфичного активатора пролиферации таких клеток.
Наиболее близким к заявляемому изобретению является использование в качестве стимулятора цитокинов, в частности, интерлейкина-2, который вводят в культуральную среду в дозе 100 Ед/мл (WO 2005086781, 2004). Недостатком этого стимулятора является недостаточная специфичность.
Задачей, стоящей перед авторами, являлось расширение арсенала стимуляторов пролиферации регуляторных Т-клеток на пролиферацию регуляторных Т-лимфоцитов.
Технический результат был достигнут в результате синтеза пептида, представляющего собой N-концевой фрагмент растворимого супрессора иммунного ответа (SIRS1-21), последовательность аминокислот которого представлена в приложении 1 Seq ID NO: 1, который оказался обладающим избирательным стимулирующим влиянием на пролиферацию регуляторных Т-клеток (Treg) в популяциях лимфоцитов тимуса и селезенки.
Белок SIRS (soluble immune response suppressor), полная последовательность аминокислот которого до сих пор неизвестна, представляет собой полипептид с молекулярным весом около 10-14 кДа, который продуцируется CD8+ клетками, активированными митогенами, антигеном или интерферонами (US 4771125, 1984) и обладает способностью ингибировать продукцию антител и угнетать реакцию гиперчувствительности замедленного типа in vivo [Aune T.M. et al. // J. Immunol. - 1983. - v. 131. - p.2848-2852; Webb D.R. et al. // International Immunology. - 1990. - v.2. - p.765-774]. Последовательность аминокислот N-концевого участка SIRS мыши, содержащего 21 аминокислотный остаток (SIRS 1-21), установлена [Webb D.R. et al. // International Immunology. - 1990. - v.2. - р.765-774]. Информация о возможности использования SIRS или его фрагментов в качестве стимуляторов пролиферации клеток Treg в просмотренной литературе не найдена.
В ходе проведенных исследований авторами было установлено, что пептид SIRS 1-21 при культивировании популяции клеток, содержащих Т-лимфоциты, избирательно стимулирует пролиферацию регуляторных Т-лимфоцитов (Treg, CD4+CD25+FoxP3+ клеток), практически не оказывая влияния на пролиферацию общей популяции клеток, что может быть связано с угнетением регуляторными Т-лимфоцитами пролиферации обычных лимфоцитов.
Стимуляция образования регуляторных Т-лимфоцитов осуществляется путем введения культуральную жидкость стимулятора SIRS 1-21 в концентрации 0,1-10 мкг/мл. При этом эффективность воздействия повышается при одновременном введении в систему интерлейкина-1-бета в дозе 100-300 пг/мл.
Сущность и преимущества заявляемой группы изобретений иллюстрируются следующими примерами.
Пример 1. Химический синтез N-концевого фрагмента SIRS (SIRS1-21)
Синтез пептида SIRS1-21 проводили твёрдофазным способом на синтезаторе Vega Coupler 250 по методу in situ с использованием Nα-Boc-защищённых производных аминокислот. В работе были использованы следующие производные аминокислот Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Pro-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asn(Trt)-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Glu(OBzl)-OH, Boc-Met-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Lys(ClZ)-OH. Исходным аминоацил-полимером служил Boc-Ser(Bzl)-PAM с удельной емкостью 0,64 мМол/грамм.
Деблокирование временной трет-бутилоксикарбонильной защиты проводили 50% трифторуксусной кислотой (TFA) в хлористом метилене (DCM). Реакции конденсации проводили в диметилформамиде (DMF). Нейтрализацию при первой конденсации осуществляли путем добавления трехкратного избытка диизопропилэтиламина (DIPEA) непосредственно в реакционную смесь на стадии присоединения аминокислотного остатка; повторную конденсацию проводили после дополнительной промывки пептидил-полимера 10% раствором DIPEA в DMF. Присоединение аминокислотных остатков проводили методом активированных эфиров, полученных из соответствующих производных аминокислот с помощью диизопропил-карбодиимида, используя 5-кратные избытки реагентов в DMF. Смесь производных аминокислот готовили непосредственно перед внесением в реакционный сосуд. Контроль полноты реакции конденсации проводили с помощью нингидринового и бромфенолового тестов.
После завершения наращивания пептидной цепи пептидил-полимер обрабатывали 50% TFA два раза по 1 минуте, промывали DCM и диэтиловым эфиром, извлекали из реактора и сушили до постоянного веса.
Отщепление пептида от полимера и удаление боковых защитных группировок проводили с помощью жидкого фтористого водорода по Snl механизму в присутствии скавенджеров.
Выделенный грубый продукт подвергался очистке методом полупрепаративной обращено-фазовой ВЭЖХ на колонке Waters Prep Nova-Pak HR С-18, 6ц, 60Å, 19×300 mm (детекция при 220 нм).
Фракцию, соответствующую пику основного продукта, после лиофильной сушки подвергали масс-спектральному и ВЭЖХ-анализам.
По данным MALDI-TOF-спектрометрии молекулярная масса пептида (М+Н)+ - 2281. Теоретическая молекулярная масса в расчете на свободный пептид - 2280,38.
Содержание основного вещества, пептида SIRS1-21 составило более 95% по данным ВЭЖХ.
Пример 2. Влияние SIRS1-21 на пролиферацию спленоцитов
Пептид SIRS1-21 разводили в среде RPMI-1640 с 1% эмбриональной сыворотки теленка в концентрации 1 мг/мл, далее готовили последовательные разведения и вносили в лунки 96-лу ночного плоскодонного планшета по 50 мкл на лунку. Далее в лунки вносили суспензию спленоцитов в 100 мкл среды RPMI-1640, содержавшей 10% эмбриональной сыворотки теленка (ТЭС), по 3×105 клеток на лунку. Постановка теста осуществлялась не менее чем в 4 параллелях для каждой экспериментальной точки.
Платы помещали в СО2-инкубатор и инкубировали при 37°С в условиях абсолютной влажности. Через 48 ч от начала инкубации в культуры клеток вносили 3H-тимидин (Изотоп, Санкт-Петербург) в конечной концентрации 5 мкКю/мл. Через сутки клетки переносили на стекловолоконные фильтры с помощью харвестера FilterMate 96 (Perkin-Elmer) и определяли интенсивность включения тимидина на планшетном β-счетчике MicroBeta TriLux 1450 (Perkin-Elmer).
Результаты, выраженные в количестве Н3-тимидина, включенного в кислотонерастворимый осадок (имп/мин) представлены в таблице 1.
| Таблица 1 | |
| Влияние пептида SIRS1-21 на пролиферацию спленоцитов мыши in vitro | |
| SIRS1-21, мкг/мл | Интенсивность пролиферации спленоцитов (имп/мин) |
| 10 | 8319±387 |
| 1 | 7306±715 |
| 0,1 | 7019±386* |
| 0,01 | 8416±1132 |
| 0 (контроль) | 8305±1254 |
Анализ полученных результатов указывают на слабое угнетение пролиферации спленоцитов в присутствии 0,1 мкг/мл исследуемого пептида. Более низкие и более высокие концентрации SIRS1-21 в течение исследуемого периода времени (1 сутки) влияния на пролиферацию спленоцитов не оказывали.
Пример 3. Оценка влияния пептида SIRS1-21 на пролиферацию регуляторных Т-клеток in vitro.
В ходе эксперимента исходили из того, что цитофлюориметрически регуляторные Т-клетки могут быть идентифицированы так CD4+ CD25+ лимфоциты, экспрессирующие также транскрипционный фактор FoxP3.
Тимоциты или спленоциты мыши инкубировали с пептидом SIRS1-21 в присутствии 100-300 пг/мл рекомбинантного ИЛ-1β или без него в течение 3 суток. Для определения процента регуляторных Т-клеток в суспензии тимоцитов и спленоцитов клетки окрашивали моноклональными антителами к поверхностным маркерам CD4, CD8 и CD25, а также к внутриклеточному маркеру FoxP3. Использовали антитела к антигенам мыши производства eBioscience: анти-РохР3-FITC (клон FJK-16s), анти-CD4-РЕ (клон GK1.5), анти-CD25-РЕ-Cy5 (клон РС61.5), анти-CD8a-РЕ-Cy5 (клон 53-6.7). Для окрашивания антителами к FoxP3 пользовались набором Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience) по инструкции изготовителя. Анализ экспрессии соответсвующих маркеров проводили в трехцветном режиме на цитофлюориметре EPICS-XL (Beckman-Coulter). Полученные результаты представлены в таблице 2.
| Таблица 2 | ||||||||
| Влияние SIRS1-25 на содержание CD4+CD25+FoxP3+клеток в культивируемых тимоцитах и спленоцитах мыши | ||||||||
| SIRS1-21, мкг/мл | Содержание CD4+CD25+FoxP3+ клеток (%) | |||||||
| Тимоциты | Спленоциты | |||||||
| Без ИЛ-1β | С ИЛ-1β | 3 пг/мл | Без ИЛ-1β | С ИЛ-1β | 3 пг/мл | |||
| 100 | 200 | 300 | 100 | 200 | 300 | |||
| 0 | 0,43 | 0,38 | 0,38 | 0,37 | 2,4 | 2,5 | 2,8 | 2,7 |
| 0,1 | 0,48 | 0,50 | 0,50 | 0,54 | 3,0 | 3,0 | 3,0 | 3,4 |
| 16,5 | 0,63 | 0,77 | 0,85 | 0,79 | 7,37 | 5,4 | 5,56 | 5,1 |
| 40 | 0,48 | 0,83 | 0,92 | 0,88 | 7,39 | 5,52 | 5,58 | 5,55 |
| 50 | 0,41 | 0,90 | 0,99 | 0,95 | 7,39 | 5,58 | 5,61 | 5,60 |
Из таблицы 2 видно, что лучшие результаты достигаются при инкубации клеток в присутствии 16,5 мкг/мл SIRS1-21. При этом наблюдается 1,5-2-кратное увеличение содержания CD4+CD25+FoxP3+ в суспензии тимоцитов и 2-3-кратное увеличение содержания клеток этого фенотипа в суспензии спленоцитов.
Для тимоцитов эффект SIRS1-21 на содержание CD4+CD25+FoxP3+клеток более выражен на фоне ИЛ-1β, который сам на содержание данных клеток в популяции тимоцитов практически не влияет. Таким образом, SIRS1-21 стимулирует пролиферацию Treg в популяциях тимоцитов и спленоцитов, в том числе в присутствии в среде культивирования ИЛ-1β.
Из приведенных выше данных следует, что пептид SIRS1-21 при культивировании популяции клеток, содержащих Т-лимфоциты, избирательно стимулирует пролиферацию регуляторных Т-лимфоцитов (Treg, CD4+CD25+FoxP3+клеток), практически не оказывая влияния на пролиферацию общей популяции клеток.
Указанное свойство делает данный пептид перспективным для размножения ex vivo регуляторных Т-лимфоцитов, полученных от больного, страдающего от аутоиммунного заболевания, связанного с хроническим воспалением, например, больного ревматоидным артритом, псориазом и псориатрическим артритом, диабетом 1-го типа, аутоиммунным тироидитом (болезнь Хашимото), язвенным колитом, болезнью Крона, грануломатозным васкулитом, саркоидозом, склеродермией, множественным склерозом, системным склерозом, гломерулонефритом аутоиммунной природы и другими подобными заболеваниями, при отторжении трансплантата, болезни «трансплантат против хозяина», с целью последующего введения полученных Т-регуляторных Т-лимфоцитов данному больному для лечения вышеперечисленных заболеваний и патологических состояний.
Claims (3)
1. N-концевой фрагмент растворимого супрессора иммунного ответа длиной в 21 аминокислоту, имеющий последовательность аминокислот по Seq ID NО: 1, в качестве стимулятора образования регуляторных Т-лимфоцитов.
2. Способ стимуляции образования регуляторных Т-лимфоцитов путем культивирования клеток, содержащих Т-лимфоциты, в присутствии стимулятора, отличающийся тем, что в качестве стимулятора в культуральную среду вводят N-концевой фрагмент растворимого супрессора иммунного ответа по п.1 в концентрации 0,1-50 мкг/мл.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в среду культивирования дополнительно вводят интерлейкин-1-бета в дозе 100-300 пг/мл.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012140939/10A RU2499043C1 (ru) | 2012-09-26 | 2012-09-26 | Стимулятор пролиферации регуляторных т-лимфоцитов и способ их стимуляции |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012140939/10A RU2499043C1 (ru) | 2012-09-26 | 2012-09-26 | Стимулятор пролиферации регуляторных т-лимфоцитов и способ их стимуляции |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2499043C1 true RU2499043C1 (ru) | 2013-11-20 |
Family
ID=49710126
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012140939/10A RU2499043C1 (ru) | 2012-09-26 | 2012-09-26 | Стимулятор пролиферации регуляторных т-лимфоцитов и способ их стимуляции |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2499043C1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030039628A1 (en) * | 1998-08-24 | 2003-02-27 | Kristoffer Hellstrand | Activation and protection of T-cells (CD4+ and CD8+) using an H2 receptor agonist and other T-cell activating agents |
| US20070185030A1 (en) * | 2004-06-09 | 2007-08-09 | Research Development Foundation | Immune response suppressor and treatment of multiple sclerosis |
| RU2436796C2 (ru) * | 2006-05-30 | 2011-12-20 | Дженентек, Инк. | Антитела и иммуноконъюгаты и их применения |
-
2012
- 2012-09-26 RU RU2012140939/10A patent/RU2499043C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030039628A1 (en) * | 1998-08-24 | 2003-02-27 | Kristoffer Hellstrand | Activation and protection of T-cells (CD4+ and CD8+) using an H2 receptor agonist and other T-cell activating agents |
| US20070185030A1 (en) * | 2004-06-09 | 2007-08-09 | Research Development Foundation | Immune response suppressor and treatment of multiple sclerosis |
| RU2436796C2 (ru) * | 2006-05-30 | 2011-12-20 | Дженентек, Инк. | Антитела и иммуноконъюгаты и их применения |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3138399B1 (en) | Composition for organ, tissue, or cell transplantation, kit, and transplantation method | |
| EP2987497B1 (en) | Composition for treating and preventing ischemic damage | |
| EP2707014B1 (en) | High-affinity, dimeric inhibitors of psd-95 and their use for treating ischemic brain damage and pain | |
| US4395404A (en) | Synthetic thymosin β3 and β4 analogues | |
| EP0559756B1 (en) | Nonapeptide bombesin antagonists | |
| CN102775490B (zh) | 具有趋化活性的分泌蛋白及其应用 | |
| CN101389653A (zh) | 肽和肽衍生物以及含有它们的药物组合物 | |
| US20070161545A1 (en) | Triple polypeptide complexes | |
| KR102040867B1 (ko) | 면역 관용 유도 및 면역진단을 위한 ｆｖｉｉｉ 펩타이드 | |
| WO1986004334A1 (en) | Immunoregulatory peptides | |
| NO177713B (no) | Analogifremgangsmåte ved fremstilling av hemoreguleringspeptider | |
| RU2398776C2 (ru) | Тимус-специфический белок | |
| EP0310887A2 (en) | Vasoconstrictor peptide | |
| Takahashi et al. | Prevention of type I diabetes with lymphotoxin in BB rats | |
| RU2499043C1 (ru) | Стимулятор пролиферации регуляторных т-лимфоцитов и способ их стимуляции | |
| AU2002339227A1 (en) | Triple polypeptide complexes | |
| Subrahmanyan et al. | Effects of culture substrates and normal hepatic sinusoidal cells on in vitro hepatocyte synthesis of Apo‐SAA | |
| HU200479B (en) | Process for producing peptides having immunosuppressive activity and pharmaceutical compositions comprising same | |
| US9393271B2 (en) | GHRH agonists for islet cell transplantation and function and the treatment of diabetes | |
| Evans et al. | Mapping of the Epitope Recognized by Non‐Specific Cytotoxic Cells: Determination of the Fine Specificity Using Synthetic Peptides | |
| KR102445492B1 (ko) | 신규한 펩타이드를 포함하는 자연살해세포 대량증식용 조성물 및 이를 이용한 자연살해세포 대량증식방법 | |
| CN105232576A (zh) | 基于dc的神经胶质瘤治疗性疫苗及其制备方法 | |
| EP4483894A1 (en) | Pharmaceutical composition for treatment or prevention of adult t-cell leukemia | |
| JPH05194594A (ja) | 新規ペプチド | |
| EP0532716B1 (en) | New synthethic peptides with imunomodulating activity and preparation thereof |