RU2493872C1 - Способ очистки вируса гриппа - Google Patents
Способ очистки вируса гриппа Download PDFInfo
- Publication number
- RU2493872C1 RU2493872C1 RU2012134031/15A RU2012134031A RU2493872C1 RU 2493872 C1 RU2493872 C1 RU 2493872C1 RU 2012134031/15 A RU2012134031/15 A RU 2012134031/15A RU 2012134031 A RU2012134031 A RU 2012134031A RU 2493872 C1 RU2493872 C1 RU 2493872C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- virus
- buffer solution
- edta
- influenza virus
- phosphate buffer
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 title claims abstract description 27
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 52
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 39
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims abstract description 26
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 claims abstract description 26
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 23
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims abstract description 22
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 22
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims abstract description 15
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 15
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims abstract description 7
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 15
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 abstract description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 abstract 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 11
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 6
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 6
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 5
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 5
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 5
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 4
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 4
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 3
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 3
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 3
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 241000371980 Influenza B virus (B/Shanghai/361/2002) Species 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- OABYVIYXWMZFFJ-ZUHYDKSRSA-M sodium glycocholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 OABYVIYXWMZFFJ-ZUHYDKSRSA-M 0.000 description 2
- 229940079862 sodium lauryl sarcosinate Drugs 0.000 description 2
- 229940045946 sodium taurodeoxycholate Drugs 0.000 description 2
- YXHRQQJFKOHLAP-FVCKGWAHSA-M sodium;2-[[(4r)-4-[(3r,5r,8r,9s,10s,12s,13r,14s,17r)-3,12-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]ethanesulfonate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 YXHRQQJFKOHLAP-FVCKGWAHSA-M 0.000 description 2
- ADWNFGORSPBALY-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[dodecyl(methyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCN(C)CC([O-])=O ADWNFGORSPBALY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101710091870 Protein 5.3 Proteins 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000012471 diafiltration solution Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и описывает способ получения очищенного концентрата вируса гриппа, способ включает микрофильтрацию вирусосодержащей аллантоисной жидкости на фильтрующих элементах 0,1-0,2 мкм с дальнейшей диафильтрацией фосфатным буферным раствором, содержащим 0,25-0,5 М натрия хлорида, ЭДТА или цитрат натрия, концентрирование вируса гриппа на мембранах с порогом отсечения 300-500 кДа с последующей диафильтрацией фосфатным буферным раствором, содержащим 0,25-0,5 М натрия хлорида, ЭДТА или цитрат натрия, 0,02-0,002% анионного детергента и ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы, приготовленной на фосфатном буферном растворе, содержащем 0,25-0,5 М натрия хлорида, ЭДТА или цитрат натрия и 0,02-0,002% анионного детергента. Технический результат изобретения заключается в получении высокоочищенного концентрата вируса гриппа с выходом более 80%, оптимизации технологического процесса. 3 пр., 2 табл.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в производстве противогриппозных субъединичных и спплит-вакцин, применяемых для профилактики гриппа и острых респираторных вирусных заболеваний.
Несмотря на достижения медицины, грипп остается одной из самых насущных медико-социальных проблем современного общества. Эпидемии гриппа, вспыхивающие с определенной периодичностью по всему земному шару, каждый раз приносят человеческие и экономические потери, подталкивая ученых к поиску новых методов получения высокоэффективных, безопасных лекарственных средств для профилактики, лечения и предотвращения серьезных последствий этого заболевания.
На сегодняшний день разработано множество вакцин против гриппа, различных по типу, составу, форме выпуска и технологии производства. В основе любой из них лежит цельный или расщепленный вирус, выращенный на куриных эмбрионах или клеточных культурах тканей. В связи с этим одной из актуальных задач является поиск наиболее технологичных решений в области очистки гриппозной вакцины от остатков примесных белков аллантоисной жидкости или культуральной среды, негативно влияющих на организм человека и обладающих высокой реактогенностью.
Получение очищенного вирусного концентрата - один из основных этапов производства вакцины. Существуют различные методы концентрирования вирусов, наиболее распространенными среди которых являются осаждение в изоэлектрической точке, сорбционный метод и ультрацентрифугирование [1]. Наряду с перечисленными способами очистки и концентрирования вирусов, широкое распространение получил метод, основанный на микро- и ультрафильтрации. В целом ряде случаев метод микро- и ультрафильтрации имеет преимущества перед методами осаждения, сорбции и ультрацентрифугирования, обеспечивая менее трудоемкий и более мягкий способ очистки. Данный способ отличается экономичностью и позволяет в короткие сроки сконцентрировать большие объемы вируссодержащих сред.
Известны различные способы получения концентратов вируса гриппа с применением микро- и ультрафильтрации [2, 3, 4, 5, 6].
Согласно технологии приведенной в статье [3], вирус гриппа очищают низкоскоростным центрифугированием, затем концентрируют ультрафильтрацией на кассетных модулях 300 кДа, с последующей анионообменной хроматографией. Однако общий выход по всем стадиям данного метода составляет всего 25%.
Метод [4], основанный на очистке вируса гриппа глубинной микрофильтрацией в тупиковом режиме через каскад фильтров 5 мкм и 1 мкм с последующим концентрированием ультрафильтрацией на листовой мембране 100 кДа также имеет относительно низкий выход по гемагглютинину (порядка 37%).
Наиболее близкие к представленному способу технологии концентрирования и очистки вируса гриппа раскрыты в ссылках [5, 6].
Способ [5] включает очистку вируссодержащей среды микрофильтрацией на элементе 0,65 мкм с последующим концентрированием и ультрадиафильтрацией на полых волокнах с отсечением по молекулярному весу 500 кДа (буферный раствор, используемый при диафильтрации, содержит 20 мМ Трис, 0,5 М натрия хлорида рН 7,5). Средний выход по всем стадиям процесса 59%.
Микрофильтрация на элементе с отсечением 0,65 мкм не гарантирует полного удаления клеток живых и мертвых микроорганизмов, которые в дальнейшем могут концентрироваться и разрушаться на стадии ультрафильтрации с выделением бактериального эндотоксина под действием буферного раствора с большой ионной силой.
Применение в качестве дезагрегирующего раствора 0,5 М натрия хлорида в сочетании с 20 мМ Трис не всегда обеспечивает полное отщепление животного альбумина и его удаление из концентрата вируса. Кроме того, при осуществлении экспериментальной ультрафильтрации вируссодержащей аллантоисной жидкости (штамм вируса гриппа A/California/07/2009 (H1N1)) на кассетном элементе с мембраной 500 кДа в указанных условиях была отмечена потеря вируса за счет частичного прохождения через мембрану в фильтрат [таблица 2].
Согласно технологии описанной в патенте US №4327182 [6] (прототип) в неочищенную вируссодержащую аллантоисную жидкость добавляют детергент Triton Х-100 до концентрации 0.05%, после чего концентрируют в два раза микрофильтрацией в тангенциальном потоке на фильтрующем элементе с мембраной 0,1 мкм. Затем диафильтрацией фосфатным буферным раствором (рН 7.1-7.2), содержащим 0,87% натрия хлорида и 0,05% Triton Х-100, удаляют из концентрата низкомолекулярные балластные компоненты. По окончании диафильтрации концентрируют вируссодержащую аллантоисную жидкость еще в 5 раз (всего в 10 раз по сравнению с исходным объемом) (стадия I). Полученный концентрат вируса гриппа фильтруют в присутствии той же концентрации детергента через микрофильтрационный элемент с мембраной 0,45 мкм (стадия II). Вируссодержащий фильтрат снова концентрируют и подвергают диафильтрации на микрофильтрационном элементе 0,1 мкм (повторно проводят стадию I) (стадия III).
Однако, приведенная последовательность технологических стадий не является оптимальной, так как предварительно неочищенная аллантоисная жидкость очень тяжело фильтруется через мембрану с таким низким рейтингом, кроме того, даже в присутствии детергента при концентрировании аллантоисной жидкости в 10 раз происходит частичное агрегирование вируса и увеличение концентрации высокомолекулярных примесей, что значительно затрудняет дальнейшую микрофильтрацию на фильтрующем элементе 0,45 мкм (стадия II).
Из литературных данных известно [7], что размер вируса гриппа лежит в пределах 80-120 нм (0,08-0,12 мкм). Номинальный предел отсечения мембраны 0,1 мкм очень близок к размеру свободного вируса, поэтому при концентрировании вируса гриппа в присутствии неионного детергента на модулях с мембраной 0,1 мкм происходит частичная потеря вируса за счет проскока через мембрану. Поэтому для полного извлечения вирусных частиц в процессе концентрирования методом микро(ультра)фильтрации целесообразно использовать мембраны с номинальным отсечением по размеру (или молекулярному весу) в 3-4 раза меньше размера (молекулярного веса) отделяемых частиц. В отличие от данного метода, заявляемый метод предусматривает не концентрирование (вирус не проходит через мембрану), а очистку вируса микрофильтрацией на кассетах 0,1-0,2 мкм (при этом вирус проходит через мембрану под действием дезагрегирующего раствора [таблица 1]).
Также недостатком данного способа является дублирование стадии концентрирования и диафильтрации на микрофильтрационном элементе 0,1 мкм (стадия III). Повторное концентрирование и диафильтрация увеличивают потери и продолжительность технологического процесса.
Задачей, на решение которой направлено данное изобретение, является разработка способа получения высокоочищенного концентрата вируса гриппа для производства противогриппозной вакцины.
Технический результат изобретения заключается в получении высокоочищенного концентрата вируса гриппа с выходом более 80%, оптимизации технологического процесса.
Поставленная задача решается следующим образом. Способ предусматривает центрифугирование вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ) с последующей фильтрацией через полипропиленовое волокно, микрофильтрацию ВАЖ на фильтрующих элементах 0,1-0,2 мкм с дальнейшей диафильтрацией фосфатным буферным раствором, содержащим 0,25-0,5 М натрия хлорида, ЭДТА или цитрат натрия, концентрирование вируса гриппа на мембранах с порогом отсечения 300-500 кДа с последующей диафильтрацией фосфатным буферным раствором, содержащим 0,25-0,5 М натрия хлорида, ЭДТА или цитрат натрия, 0,02-0,002% анионного детергента и ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы, приготовленной на фосфатном буферном растворе, содержащем 0,25-0,5 М натрия хлорида, ЭДТА или цитрат натрия и 0,02-0,002% анионного детергента.
Путем усовершенствования существующих методов концентрирования и очистки разработан новый способ получения высокоочищенного концентрата вируса гриппа для производства противогриппозных вакцин. Преимущество представленного способа заключается в простоте, экономичности, высокой конверсии и степени очистки целевого продукта. Изобретение позволяет получать высокоочищенные концентраты вируса гриппа с выходом более 80%, а также повысить технологичность и экологические условия процесса производства. Применение для очистки вируса мембран с пределом отсечения 0,1-0,2 мкм обеспечивает более глубокую степень очистки вируса гриппа по сравнению с существующими методами. Используемый при микрофильтрации фосфатный буферный раствор на основе 0,25-0,5 М натрия хлорида, ЭДТА или цитрата натрия (дезагрегирующий раствор), рН 7,4-7,8 позволяет практически полностью устранить агрегацию вируса гриппа и обеспечивает его прохождение через мембрану с пределом отсечения по размеру частиц 0,1-0,2 мкм. В отличие от существующих методов, концентрирование вируса гриппа проводят ультрафильтрацией на кассетных фильтрующих элементах 300-500 кДа в сочетании с детергентсодержащим дезагрегирующим раствором, позволяющим без разрушения вируса в мягких условиях отщепить и удалить диафильтрацией неспецифические белки (овальбумин), связанные с вирионом. Так при концентрировании вируссодержащей аллантоисной жидкости на кассетных фильтрующих элементах 300 и 500 кДа с последующей диафильтрацией фосфатным буферным раствором получают концентрат вируса гриппа с выходом 80-100% [таблица 2]. При этом содержание овальбумина в концентрате, полученном с применением детергентсодержащего дезагрегирующего раствора, в пять раз ниже, чем при использовании фосфатного буферного раствора, не содержащего детергент (527 мкг/мл и 103 мкг/мл соответственно). Кроме того, данный способ обеспечивает полное удаление клеток микроорганизмов из вируссодержащей среды, предотвращая их концентрирование и расщепление на последующих стадиях технологического процесса с выделением эндотоксина. Содержание эндотоксина в пробах фильтрата при очистке на кассетных элементах с различными рейтингами приведено в таблице 1.
Предложенный способ осуществляется следующим образом:
1. Осветление вируссодержащей среды на проточной центрифуге при 3000-5000 об/мин (1000-1500 g) с последующей фильтрацией через патронный элемент на основе полипропиленового волокна со средним отсечением по размеру частиц 1 мкм.
2. Очистка осветленной вируссодержащей среды микрофильтрацией в тангенциальном потоке на кассетных фильтрующих элементах с мембраной 0,1-0,2 мкм с последующей диафильтрацией фосфатным буферным раствором, содержащим 0,25-0,5 М натрия хлорида, ЭДТА или цитрат натрия, рН 7,4-7,8.
3. Концентрирование очищенной вируссодержащей среды ультрафильтрацией в тангенциальном потоке на кассетных ультрафильтрационных элементах с мембраной 300-500 кДа с последующей 5-кратной диафильтрацией фосфатным буферным раствором, содержащим 0,02-0,002% анионного детергента, 0.25-0.5 М натрия хлорида, ЭДТА или цитрат натрия, рН 7,4-7,8.
4. Ультрацентрифугирование в градиенте плотности 60% сахарозы, приготовленной на фосфатном буферном растворе, содержащем 0,02-0,002% анионного детергента, 0.25-0.5 М натрия хлорида, ЭДТА или цитрат натрия, рН 7,4-7,8 при 28 тыс. об/мин.
Пример 1.
100 л вируссодержащей аллантоисной жидкости (штамм вируса гриппа A/California/07/2009 (H1N1)), собранной через 48 ч после заражения куриных эмбрионов и охлажденной до температуры 2-4°С осветляют на проточной центрифуге при 3000-5000 об/мин (1000-1500 g), после чего дополнительно фильтруют через глубинный фильтрующий элемент на основе полипропиленового волокна 1 мкм (титр РГА 1:240, содержание овальбумина 1 015 мкг/мл). Микрофильтрацию осветленной аллантоисной жидкости проводят на кассетных фильтрующих элементах 0,2 мкм, при этом вирус проходит через мембрану в фильтрат. Для более полного извлечения вируса по окончании микрофильтрации проводят диафильтрацию непрофильтрованного остатка 20 л фосфатного буферного раствора, содержащего 0,25 М натрия хлорида и 10 мМ ЭДТА, рН 7,6. Фильтрат с кассет 0,2 мкм концентрируют в 10 раз ультрафильтрацией в тангенциальном потоке на фильтрующих элементах 300 кДа. По окончании концентрирования проводят 5-кратную диафильтрацию концентрата фосфатным буферным раствором, содержащим 0,002% лаурилсаркозината натрия, 0,5 М натрия хлорида и 10 мМ ЭДТА, рН 7,6. Титр РГА концентрата 1:2560, что составляет порядка 100% от теоретического выхода, содержание овальбумина 6 мкг/мл. Проводят ультрацентрифугирование концентрата в градиенте 60% сахарозы, приготовленной на буфере содержащим 0,002% лаурилсаркозината натрия, 0.5 М натрия хлорида и 10 мМ ЭДТА, рН 7,6 при 28 тыс. об/мин. Содержание эндотоксина 0,15 IU/мкг.
Пример 2.
100 л вируссодержащей аллантоисной жидкости (штамм вируса гриппа A/California/07/2009 (H1N1)), собранной через 48 ч после заражения куриных эмбрионов и охлажденной до температуры 2-4°С осветляют на проточной центрифуге при 3000-5000 об/мин (1000-1500 g), после чего дополнительно фильтруют через глубинный фильтрующий элемент на основе полипропиленового волокна 1 мкм (титр РГА 1:320, содержание овальбумина 1 102 мкг/мл). Микрофильтрацию осветленной аллантоисной жидкости проводят на кассетных фильтрующих элементах 0,2 мкм, при этом вирус проходит через мембрану в фильтрат. Для более полного извлечения вируса по окончании микрофильтрации проводят диафильтрацию непрофильтрованного остатка 20 л фосфатного буферного раствора, содержащего 0,5 М натрия хлорида и 0,1 М цитрата натрия, рН 7,8. Фильтрат с кассет 0,2 мкм концентрируют в 10 раз ультрафильтрацией в тангенциальном потоке на фильтрующих элементах 500 кДа. По окончании концентрирования проводят 5-кратную диафильтрацию концентрата фосфатным буферным раствором, содержащим 0,002% тауродезоксихолат натрия, 0,5 М натрия хлорида и 0,1 М цитрата натрия, рН 7,8. Титр РГА концентрата 1:2560, что составляет 80% от теоретического выхода, содержание овальбумина 10 мкг/мл. Проводят ультрацентрифугирование концентрата в градиенте плотности 60% сахарозы, приготовленной на буфере содержащим 0,002% тауродезоксихолат натрия, 0.5 М натрия хлорида и 0,1 М цитрата натрия, рН 7,8 при 28 тыс. об/мин. Содержание эндотоксина 0,15 IU/мкг.
Пример 3.
10 л вируссодержащей аллантоисной жидкости (штамм вируса гриппа A/California/07/2009 (H1N1)), собранной через 48 ч после заражения куриных эмбрионов и охлажденной до температуры 2-4°С осветляют на проточной центрифуге при 3000-5000 об/мин (1000-1500 g), после чего дополнительно фильтруют через глубинный фильтрующий элемент на основе полипропиленового волокна 1 мкм (титр РГА 1:160, общий белок 3,1 мг/мл). Проводят микрофильтрацию осветленной аллантоисной жидкости на кассетных фильтрующих элементах 0,1 мкм, при этом вирус проходит через мембрану в фильтрат (титр РГА 1:80, общий белок 2,9 мг/мл, объем 9 л; непрофильтрованный остаток - 1 л, титр РГА 1:1280, общий белок 5,3 мг/мл). По окончании микрофильтрации проводят диафильтрацию непрофильтрованного остатка 6 л фосфатного буферного раствора, содержащего 0,5 М натрия хлорида и 10 мМ ЭДТА, рН 7,4. После диафильтрации титр РГА непрофильтрованного остатка составил 1:80 (объем 0,55 л, общий белок 0,09 мг/мл). Исходя из данного значения, 97% вируса прошло через мембрану. Фильтрат с кассет 0,1 мкм концентрируют в 10 раз ультрафильтрацией в тангенциальном потоке на фильтрующих элементах 300 кДа. По окончании концентрирования проводят 5-кратную диафильтрацию концентрата фосфатным буферным раствором, содержащим 0,02% гликохолат натрия, 0,5 М натрия хлорида и 10 мМ ЭДТА, рН 7,4. Титр РГА концентрата 1:1280, что составляет 80% от теоретического выхода. Проводят ультрацентрифугирование концентрата в градиенте плотности 60% сахарозы, приготовленной на буфере содержащим 0,02% гликохолат натрия, 0.5 М натрия хлорида и 10 мМ ЭДТА, рН 7,4 при 28 тыс. об/мин. Содержание эндотоксина 0,025 IU/мкг.
Источники информации
1. Brok Т., Membrane filtration // Science Tech, Inc. Madison, - 1987. P.335-347.
2. Патент ЕР №1878791 публ. 2008.01.16., C12N 7/00.
3. Elisabeth Maurer, Matjaz Peterka, Manuela Gassner, Helena Seper, Franz Gelhart, Marko Banjac, Marko Jarc, Barbara Lah, Petra Kramberger, Ales Strancar and Thomas Muster. Influenza virus purification platform // Avir Green Hills Biotechnology.
4. Deba Prasad Nayak, Sylvia Lehmann, Udo Reichl. Downstream processing of MDCK cell-derived equine influenza virus // Journal of Chromatography B, 823 (2005) P.75-81.
5. Bernd Kalbfuss, Yvonne Genzel, Michael Wolff, Anke Zimmermann, Robert Moren-weiser, Udo Reich. Harvesting and concentration of human influenza a virus produced in serum-free mammalian cell culture for the production of vaccines // Biotechnology and Bioengi-neering, Vol.97, No.1, May 1, 2007.
6. Патент US №4327182 публ. 1982.04.27., C12N 7/06 A61K 39/145.
7. Под. ред. Воробьева А.А. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология // М:. OOO «Медицинское информационное агентство», 2008. - с.560.
8. Influenza vaccine split virion, inactivated. European Pharmacopoeia 7.0. Monograph №0158, p.788-789.
9. Influenza vaccine surface antigen, inactivated. European Pharmacopoeia 7.0. Monograph №0869, p.789-791.
| Таблица 1. | |||||||
| Результаты очистки вируса гриппа на различных микрофильтрационных модулях. | |||||||
| Штамм вируса | Раствора для диафильтрации | Микрофильтрационный модуль | Титр РГА исходная ВАЖ (объем 10 л) | Титр РГА очищенная ВАЖ (объем 12 л) | Титр РГА концентрат (объем 1 л) | Степень прохождения вируса, % | Содержание эндотоксина5, IU/мкг |
| ФБР1, 0,5М | 1000 кДа, RC2 (Millipore) | 1:320 | 1:80 | 1:1920 | 40 | 0,010 | |
| A(H3N2) | NaCl, 10 мМ ЭДТА | 0,1 мкм, PES3 (Владисарт) | 1:240 | 1:240 | 1:40 | 98,4 | 0,025 |
| 0,2 мкм, PVDF4 (Millipore) | 1:320 | 1:320 | 0 | 100 | 0,150 | ||
| 0,45 мкм, PES (Владисарт) | 1:320 | 1:320 | 0 | 100 | 25,00 | ||
| 1 ФБР - фосфатный буферный раствор; | |||||||
| 2 RC - регенерированная целлюлоза; | |||||||
| 3 PES - полиэфирсульфон; | |||||||
| 4 PVDF - поливинилидендифторид; | |||||||
| 5 согласно монографии №0158 на противогриппозную сплит-вакцину Европейской фармакопеи 7.0 [8] содержание эндотоксина не должно превышать 100 IU на человеческую дозу (0,5 мл) или менее 200 IU/мл. Допустимое содержание общего белка согласно той же монографии Европейской фармакопеи - не более 300 мкг на человеческую дозу (0,5 мл) или не более 600 мкг/мл. Таким образом, в пересчете на 1 мгк общего белка содержание эндотоксина не должно превышать 0,33 IU/мкг. | |||||||
Согласно монографии №0869 на противогриппозную субъединичную вакцину Европейской фармакопеи 7.0 [9] содержание эндотоксина не должно превышать 100 IU на человеческую дозу (0,5 мл) или менее 200 IU/мл. Допустимое содержание общего белка согласно той же монографии Европейской фармакопеи - не более 165 мкг на человеческую дозу (0,5 мл), состоящую из 45 мкг гемаггллютинина по трем штаммам вируса гриппа и 120 мкг белка негемагглютининового или не более 330 мкг/мл. Следовательно, допустимое содержание эндотоксина IU на 1 мкг общего белка должно быть менее 0,61 IU/мкг.
Claims (1)
- Способ получения очищенного концентрата вируса гриппа, включающий микро- и ультрафильтрацию в тангенциальном потоке, отличающийся тем, что микрофильтрацию проводят на фильтрующих элементах 0,1-0,2 мкм с последующей диафильтрацией фосфатным буферным раствором, содержащим 0,25-0,5 М натрия хлорида, ЭДТА или цитрат натрия, концентрирование вируса осуществляют на мембранах с пределом отсечения по молекулярному весу 300-500 кДа с последующей диафильтрацией фосфатным буферным раствором, содержащим 0,25-0,5 М натрия хлорида, ЭДТА или цитрат натрия и 0,02-0,002% анионного детергента, ультрацентрифугирование проводят в градиенте плотности сахарозы, приготовленной на фосфатном буферном растворе, содержащем 0,25-0,5 М натрия хлорида, ЭДТА или цитрат натрия и 0,02-0,002% анионного детергента.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012134031/15A RU2493872C1 (ru) | 2012-08-08 | 2012-08-08 | Способ очистки вируса гриппа |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012134031/15A RU2493872C1 (ru) | 2012-08-08 | 2012-08-08 | Способ очистки вируса гриппа |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2493872C1 true RU2493872C1 (ru) | 2013-09-27 |
Family
ID=49253934
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012134031/15A RU2493872C1 (ru) | 2012-08-08 | 2012-08-08 | Способ очистки вируса гриппа |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2493872C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2710239C1 (ru) * | 2019-06-14 | 2019-12-25 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов" Федерального медико-биологического агентства | Способ получения антигена или антигенов для производства противогриппозной вакцины и вакцина на его основе |
| RU2721535C2 (ru) * | 2015-05-07 | 2020-05-19 | Байер Акциенгезельшафт | Способ непрерывного сокращающего микроорганизмы получения и/или обработки продукта |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4327182A (en) * | 1981-01-22 | 1982-04-27 | Connaught Laboratories Incorporated | Purification of influenza sub-unit vaccine |
| RU2033182C1 (ru) * | 1991-11-19 | 1995-04-20 | Альберт Иванович Крашенюк | Способ получения живой гриппозной вакцины |
| RU2080124C1 (ru) * | 1995-10-19 | 1997-05-27 | Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток | Способ получения живой гриппозной вакцины |
| RU2215033C2 (ru) * | 2001-06-27 | 2003-10-27 | Научно-исследовательский институт микробиологии МО РФ | Способ получения концентрата микробных клеток в производстве чумных вакцин |
| EP1780269A2 (en) * | 2004-02-23 | 2007-05-02 | Crucell Holland B.V. | Virus purification methods |
-
2012
- 2012-08-08 RU RU2012134031/15A patent/RU2493872C1/ru active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4327182A (en) * | 1981-01-22 | 1982-04-27 | Connaught Laboratories Incorporated | Purification of influenza sub-unit vaccine |
| RU2033182C1 (ru) * | 1991-11-19 | 1995-04-20 | Альберт Иванович Крашенюк | Способ получения живой гриппозной вакцины |
| RU2080124C1 (ru) * | 1995-10-19 | 1997-05-27 | Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток | Способ получения живой гриппозной вакцины |
| RU2215033C2 (ru) * | 2001-06-27 | 2003-10-27 | Научно-исследовательский институт микробиологии МО РФ | Способ получения концентрата микробных клеток в производстве чумных вакцин |
| EP1780269A2 (en) * | 2004-02-23 | 2007-05-02 | Crucell Holland B.V. | Virus purification methods |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2721535C2 (ru) * | 2015-05-07 | 2020-05-19 | Байер Акциенгезельшафт | Способ непрерывного сокращающего микроорганизмы получения и/или обработки продукта |
| RU2710239C1 (ru) * | 2019-06-14 | 2019-12-25 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов" Федерального медико-биологического агентства | Способ получения антигена или антигенов для производства противогриппозной вакцины и вакцина на его основе |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2009034115A5 (ru) | ||
| EP1878791A1 (en) | Method for influenza virus purification | |
| JP2010275321A5 (ru) | ||
| PT2007883E (pt) | Processos de purificação para o isolamento do vírus da estomatite vesicular purificado de cultura de células | |
| JPH10504033A (ja) | インフルエンザウィルスの調製方法と、それによって得られる抗原と、抗原の利用 | |
| CN111920944B (zh) | 一种流感病毒亚单位疫苗原液制备方法 | |
| EP0480949A1 (en) | PRODUCTION OF A VIRUS AND CLEANING OF VIRUS COATING PROTEINS FOR VACCINE USE. | |
| RU2493872C1 (ru) | Способ очистки вируса гриппа | |
| AU2002361382B2 (en) | Enveloped virus vaccine and method for production | |
| KR20090057442A (ko) | Ｉｐｖ―ｄｐｔ 백신 | |
| AU2004249802B2 (en) | Improvements in virus production | |
| CN111662883A (zh) | 一种制备及纯化溶瘤病毒的方法及重组溶瘤弹状病毒 | |
| RU2535153C1 (ru) | Способ получения высокоочищенных вирионных концентратов | |
| WO2011110073A1 (zh) | 细胞培养混合物的分离纯化方法 | |
| CN114645024A (zh) | 降低狂犬病病毒产品中细胞蛋白及dna残留的方法 | |
| US20180273909A1 (en) | Purification of respiratory syncytial virus | |
| CN107779441B (zh) | 一种禽流感抗原的浓缩纯化方法、禽流感抗原 | |
| US11123423B2 (en) | Zika virus vaccine | |
| Onen et al. | Development and preclinical evaluation of equine-derived hyperimmune serum against SARS-CoV-2 infection in K-18 hACE2 transgenic (Tg) mice. | |
| RU2033182C1 (ru) | Способ получения живой гриппозной вакцины | |
| CN103642760A (zh) | 一种制备柯萨奇a16型病毒完整实心颗粒的方法 | |
| CN103566367B (zh) | 一种口服过敏原疫苗及其制备和应用 | |
| CN109943536B (zh) | 一种戊型肝炎病毒的培养方法及其灭活疫苗的制备方法 | |
| RU2445116C1 (ru) | СПОСОБ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ НАТИВНОГО О-АНТИГЕНА Vidrio cholerae | |
| KR20100017593A (ko) | 바이러스의 증식을 위한 ２-단계 온도 프로파일 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20180716 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner |