RU2464575C1 - Method for determining functional state of blood plasma myeloperoxidase - Google Patents
Method for determining functional state of blood plasma myeloperoxidase Download PDFInfo
- Publication number
- RU2464575C1 RU2464575C1 RU2011125433/15A RU2011125433A RU2464575C1 RU 2464575 C1 RU2464575 C1 RU 2464575C1 RU 2011125433/15 A RU2011125433/15 A RU 2011125433/15A RU 2011125433 A RU2011125433 A RU 2011125433A RU 2464575 C1 RU2464575 C1 RU 2464575C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- myeloperoxidase
- blood plasma
- activity
- plasma
- mpo
- Prior art date
Links
- 102000003896 Myeloperoxidases Human genes 0.000 title claims abstract description 69
- 108090000235 Myeloperoxidases Proteins 0.000 title claims abstract description 69
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 title claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 44
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims abstract description 14
- JRBJSXQPQWSCCF-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dimethoxybenzidine Chemical compound C1=C(N)C(OC)=CC(C=2C=C(OC)C(N)=CC=2)=C1 JRBJSXQPQWSCCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 10
- WPBZMCGPFHZRHJ-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzohydrazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 WPBZMCGPFHZRHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims abstract description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 7
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 4
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 claims description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 claims 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 abstract description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 abstract 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 abstract 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 6
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 5
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 3
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 108010075016 Ceruloplasmin Proteins 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229960004050 aminobenzoic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RVBUGGBMJDPOST-UHFFFAOYSA-N 2-thiobarbituric acid Chemical compound O=C1CC(=O)NC(=S)N1 RVBUGGBMJDPOST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- 101001099460 Homo sapiens Myeloperoxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000010445 Lactoferrin Human genes 0.000 description 1
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 102000051251 human MPO Human genes 0.000 description 1
- CUILPNURFADTPE-UHFFFAOYSA-N hypobromous acid Chemical compound BrO CUILPNURFADTPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWPPOHNGKGFGJK-UHFFFAOYSA-N hypochlorous acid Chemical compound ClO QWPPOHNGKGFGJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 description 1
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 description 1
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно медицинской биохимии, и может быть использовано для определения функционального состояния фермента миелопероксидазы (МПО) в плазме крови путем одновременного измерения ее концентрации и активности.The invention relates to medicine, namely medical biochemistry, and can be used to determine the functional state of the myeloperoxidase (MPO) enzyme in blood plasma by simultaneously measuring its concentration and activity.
Миелопероксидаза (МПО) - фермент, содержащийся в лейкоцитах - секретируется во внеклеточное пространство в очагах воспаления. Этот фермент катализирует образование окислителей (HOCl, HOBr), которые являются не только основой антимикробного потенциала нейтрофилов, но и способны вызывать повреждение собственных тканей организма в очагах воспаления и последующее развитие окислительного стресса. Таким образом, активность фермента определяет не только эффективность клеточного ответа в отношении патогена, но и степень повреждающего действия окислителей в отношении клеток и тканей организма-хозяина.Myeloperoxidase (MPO) - an enzyme found in white blood cells - is secreted into the extracellular space in the foci of inflammation. This enzyme catalyzes the formation of oxidizing agents (HOCl, HOBr), which are not only the basis of the antimicrobial potential of neutrophils, but also can cause damage to the body’s own tissues in the foci of inflammation and the subsequent development of oxidative stress. Thus, the activity of the enzyme determines not only the effectiveness of the cellular response against the pathogen, but also the degree of the damaging effect of oxidizing agents on the cells and tissues of the host organism.
Активность МПО может регулироваться различными факторами, присутствующими в плазме крови. Так показано, что церулоплазмин, связываясь с МПО, ингибирует ее пероксидазную и хлорирующую активности, претендуя на роль эндогенного ингибитора активности фермента [1, 2]. Важным регулятором активности МПО является также pH среды [3]. Определение функционального состояния МПО позволит прогнозировать развитие ряда заболеваний, ассоциированных с окислительным стрессом и воспалением.MPO activity can be regulated by various factors present in the blood plasma. It has been shown that ceruloplasmin, binding to MPO, inhibits its peroxidase and chlorinating activities, claiming to be an endogenous inhibitor of enzyme activity [1, 2]. An important regulator of MPO activity is also the pH of the medium [3]. Determining the functional state of MPO will make it possible to predict the development of a number of diseases associated with oxidative stress and inflammation.
Известен иммунохимический способ определения количества МПО в биологических жидкостях, основанный на иммуноферментном методе анализа (ИФА) с применением моноклональных антител к этому ферменту [4]. Однако данный метод не дает возможности оценить функциональную активность МПО, от которой, в первую очередь, зависит, насколько интенсивна продукция этим ферментом реакционных окислителей, и которая, в конечном итоге, определяет степень повреждения биологически важных молекул, а вместе с тем - степень тяжести течения заболевания и развитие его осложнений.Known immunochemical method for determining the amount of MPO in biological fluids, based on the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using monoclonal antibodies to this enzyme [4]. However, this method does not make it possible to evaluate the functional activity of MPO, on which, first of all, it depends on how intense the production of reactive oxidizing agents by this enzyme is, and which, ultimately, determines the degree of damage to biologically important molecules, and at the same time, the severity of the course diseases and the development of its complications.
Известен способ определения пероксидазной активности МПО в сыворотке (плазме) крови, который заключается в том, что в 50 мМ фосфатный буфер (pH 6,0) вносят сыворотку крови, затем добавляют пероксид водорода и o-дианизидин, являющийся субстратом пероксидаз, после чего в течение 5 мин измеряют оптическую плотность реакционной смеси при 460 нм, регистрируя скорость окисления о-дианизидина, которая и является мерой пероксидазной активности и функционального состояния МПО [5]. Однако данный метод имеет существенные недостатки, поскольку, во-первых, не учитывает возможного присутствия в сыворотке (плазме), помимо МПО, соединений, обладающих пероксидазной активностью, например, гемоглобина и/или его производных, а во-вторых, не позволяет оценивать удельную активность фермента, а следовательно, и его функциональное состояние, так как остается не ясным, какое количество МПО содержится в образце плазмы и обладает измеряемой активностью.A known method for determining the peroxidase activity of MPO in blood serum (plasma) is that blood serum is added to 50 mM phosphate buffer (pH 6.0), then hydrogen peroxide and o-dianisidine, which is a substrate of peroxidases, are added, and then the optical density of the reaction mixture is measured for 5 minutes at 460 nm, recording the oxidation rate of o-dianisidine, which is a measure of the peroxidase activity and the functional state of MPO [5]. However, this method has significant drawbacks, because, firstly, it does not take into account the possible presence in serum (plasma), in addition to MPO, of compounds with peroxidase activity, for example, hemoglobin and / or its derivatives, and secondly, it does not allow to evaluate the specific the activity of the enzyme, and therefore its functional state, since it remains unclear how much MPO is contained in the plasma sample and has measurable activity.
Наиболее близким техническим решением к заявляемому является способ определения пероксидазной активности МПО плазмы, включающий внесение субстрата о-дианизидина в разбавленную фосфат-цитратным буферным раствором (pH 4,5) плазму крови в отсутствие и в присутствии ингибитора МПО-гидразида 4-аминобензойной кислоты. Пероксидазную активность МПО в плазме крови определяют по разности скоростей окисления субстрата о-дианизидина в отсутствие и в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты [6]. Этот способ дает возможность исключить вклад гемоглобина и других пероксидаз в получаемый результат. Однако данный способ, как и предыдущий, не позволяет определить удельную активность фермента и функциональное состояние МПО, так как не учитывает количество МПО, присутствующее в исследуемом образце плазмы.The closest technical solution to the claimed is a method for determining the peroxidase activity of MPO plasma, including the introduction of a substrate of o-dianisidine in diluted phosphate-citrate buffer solution (pH 4.5) in blood plasma in the absence and in the presence of an MPO hydrazide 4-aminobenzoic acid inhibitor. The peroxidase activity of MPO in blood plasma is determined by the difference in the oxidation rates of the substrate o-dianisidine in the absence and in the presence of 4-aminobenzoic acid hydrazide [6]. This method makes it possible to exclude the contribution of hemoglobin and other peroxidases to the result. However, this method, like the previous one, does not allow to determine the specific activity of the enzyme and the functional state of MPO, since it does not take into account the amount of MPO present in the studied plasma sample.
Задачей изобретения является создание способа определения функционального состояния МПО в плазме крови, позволяющего повысить информативность, точность и диагностические возможности.The objective of the invention is to provide a method for determining the functional state of MPO in blood plasma, which improves information content, accuracy and diagnostic capabilities.
Техническим результатом заявленного изобретения является оптимизация, повышение информативности и расширение диагностических возможностей способа, что дает возможность прогнозировать развитие ряда заболеваний, уточнять диагнозы и своевременно принимать меры, направленные на регулирование активности фермента.The technical result of the claimed invention is to optimize, increase information content and expand the diagnostic capabilities of the method, which makes it possible to predict the development of a number of diseases, clarify the diagnoses and take timely measures aimed at regulating the activity of the enzyme.
Поставленная задача достигается тем, что в способе определения функционального состояния МПО в плазме крови, включающем внесение субстрата о-дианизидина в разбавленную буферным раствором плазму крови, спектрофотометрическое определение скорости его окисления после добавления пероксида водорода в концентрации 100-200 мкМ, определение пероксидазной активности миелопероксидазы в плазме крови по разности скоростей окисления о-дианизидина в отсутствие и в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты в фосфатно-цитратном буфере с pH 4,5, дополнительно определяют концентрацию миелопероксидазы в плазме крови путем внесения в лунки планшета аффинных антител крыс против миелопероксидазы, последующего добавления образцов плазмы и стандарта миелопероксидазы, затем добавляют антитела кроликов против миелопероксидазы и конъюгированные с пероксидазой хрена антитела коз против IgG кролика, количество миелопероксидазы в образцах плазмы определяют, сравнивая интенсивность развития хромогенной реакции в лунках со стандартом, далее вычисляют коэффициент удельной активации миелопероксидазы Куа, равный отношению активности фермента к его концентрации, и при значениях коэффициента удельной активности миелопероксидазы выше 1,65 ед.опт.пл./пг/мин констатируют нарушение функционального состояния миелопероксидазы.This object is achieved in that in a method for determining the functional state of MPO in blood plasma, which includes introducing a substrate of o-dianisidine into a blood plasma diluted with a buffer solution, spectrophotometric determination of its oxidation rate after addition of hydrogen peroxide at a concentration of 100-200 μM, determination of peroxidase activity of myeloperoxidase in blood plasma according to the difference in the oxidation rates of o-dianisidine in the absence and in the presence of 4-aminobenzoic acid hydrazide in phosphate-citrate buffer with a pH of 4.5, to the plasma myeloperoxidase concentration is determined by adding affinity rat anti-myeloperoxidase antibodies to the plate wells, then adding plasma samples and the myeloperoxidase standard, rabbit anti-myeloperoxidase antibodies are added and horseradish peroxidase conjugated goat anti-rabbit plasma IgG antibodies are determined, the amount of myelop comparing the intensity of the development of the chromogenic reaction in the wells with the standard, then calculate the specific activation coefficient of myelo eroksidazy ya K, equal to the ratio of enzyme activity to the concentration, and at values of the specific activity of myeloperoxidase coefficient above 1.65 ed.opt.pl. / m / min ascertain violation functional state myeloperoxidase.
Сущность изобретения состоит в том, что субстрат о-дианизидина вносят в разбавленную буферным раствором плазму крови в отсутствие и в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты, спектрофотометрически определяют скорость окисления субстрата после добавления пероксида водорода (100-200 мкМ), пероксидазную активность МПО в плазме крови определяют по разности скоростей окисления о-дианизидина в отсутствие и в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты в фосфатно-цитратном буфере с pH 4,5, дополнительно определяют концентрацию миелопероксидазы в плазме крови путем внесения в лунки планшета аффинных антител против МПО, полученных от крыс, последующего добавления образцов плазмы и стандарта МПО, количество МПО в образцах плазмы определяют, сравнивая величину изменения оптической плотности в лунках со стандартом, после последовательного добавления антител против МПО, полученных от кроликов, конъюгата пероксидазы хрена с антителами против антител кролика и хромогенного субстрата, далее вычисляют коэффициент удельной активности МПО Куа, равный отношению активности фермента к его концентрации, и при значениях коэффициента удельной активности МПО выше 1,65 ед.опт.пл./пг/мин констатируют нарушение функционального состояния МПО.The essence of the invention lies in the fact that the substrate of o-dianisidine is introduced into blood plasma diluted with a buffer solution in the absence and in the presence of 4-aminobenzoic acid hydrazide, the oxidation rate of the substrate after addition of hydrogen peroxide (100-200 μM), and the peroxidase activity of MPO in plasma is determined spectrophotometrically blood is determined by the difference in the oxidation rates of o-dianisidine in the absence and in the presence of 4-aminobenzoic acid hydrazide in phosphate-citrate buffer with a pH of 4.5, the concentration of myeloper is additionally determined plasma oxidases by adding affinity anti-MPO antibodies obtained from rats to the plate wells, subsequent addition of plasma samples and the MPO standard, the amount of MPO in plasma samples is determined by comparing the amount of optical density change in the wells with the standard after sequential addition of anti-MPO antibodies, obtained from rabbits with a conjugate of horseradish peroxidase anti-rabbit antibody and a chromogenic substrate, more specific activity calculated coefficient K va MPO equal relative activity fe ment to its concentration, and ratio values higher than the specific activity of MPO ed.opt.pl. 1.65 / m / min ascertain violation functional state MPO.
Сущность изобретения поясняется фиг.1, 2 и 3, где:The invention is illustrated in figures 1, 2 and 3, where:
на фиг.1 проиллюстрирована взаимосвязь между концентрацией и пероксидазной активностью МПО в плазме крови здоровых людей;figure 1 illustrates the relationship between the concentration and peroxidase activity of MPO in the blood plasma of healthy people;
на фиг.2 показана взаимосвязь между концентрацией и пероксидазной активностью МПО в плазме крови больных сахарным диабетом 2 типа;figure 2 shows the relationship between the concentration and peroxidase activity of MPO in the blood plasma of patients with type 2 diabetes;
на фиг.3 показана взаимосвязь между концентрацией и пероксидазной активностью МПО в плазме крови больных ишемической болезнью сердца.figure 3 shows the relationship between the concentration and peroxidase activity of MPO in the blood plasma of patients with coronary heart disease.
Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.
Отделенную от клеточного осадка путем центрифугирования плазму крови в количестве 60-70 мкл вносят в спектрофотометрическую кювету объемом 0,8 мл, содержащую смесь лимонной кислоты и Na2HPO4 (pH 4,5) в отсутствие и в присутствии ингибитора МПО-гидразида 4-аминобензойной кислоты (50 мкМ), и субстрат о-дианизидин (380 мкМ). Пробу тщательно перемешивают непосредственно в кювете и начинают регистрацию увеличения ее оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 450-460 нм в течение 8-10 мин после добавления пероксида водорода (100-200 мкМ). Оптическим контролем служит проба, содержащая такой же, как и в опытной пробе, объем буферного раствора и субстрата.60-70 μl of blood plasma separated from the cell pellet by centrifugation was added to a 0.8 ml spectrophotometric cuvette containing a mixture of citric acid and Na 2 HPO 4 (pH 4.5) in the absence and presence of an MPO hydrazide 4- inhibitor aminobenzoic acid (50 μM); and o-dianisidine substrate (380 μM). The sample is thoroughly mixed directly in the cuvette and registration of the increase in its optical density on a spectrophotometer at a wavelength of 450-460 nm is started for 8-10 minutes after the addition of hydrogen peroxide (100-200 μM). An optical control is a sample containing the same volume of a buffer solution and substrate as in the experimental sample.
Расчет активности фермента проводят по формулеThe calculation of the activity of the enzyme is carried out according to the formula
где ΔD и ΔDинг - прирост оптической плотности за t минут в отсутствие и в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты соответственно;where ΔD and ΔD ing is the increase in optical density over t minutes in the absence and in the presence of 4-aminobenzoic acid hydrazide, respectively;
V - общий объем реакционной смеси;V is the total volume of the reaction mixture;
t - время измерения активности;t is the time of measuring activity;
ν - объем образца плазмы.ν is the volume of the plasma sample.
Измерения концентрации фермента проводят с помощью ИФА с использованием антител против МПО человека, полученных иммунизацией кроликов и крыс. В лунки полистирольного планшета на 12 часов при +4°C помещали 0,1 мл аффинных антител крыс против МПО человека (5 мг/л) в 0,1 М натрий-карбонатном буфере, pH 9,4, после промывки планшета 0,05% Tween 20 (v/v) в PBS (PBS-T) проводили блокировку BLOTTO-T (3%-ное обезжиренное молоко (w/v) в PBS-T) в течение 1 часа (0,2 мл), затем в лунках инкубировали в течение 1 часа стандартные растворы МПО (3-250 нг/мл) или пробы плазмы, разведенные BLOTTO-T (в 4-256 раз), после промывки планшета PBS-T в лунки помещали 0,1 мл антител кроликов против МПО (10 мг/л) в BLOTTO-T, после промывки планшета PBS-T в лунки помещали 0,1 мл антител коз против IgG кролика, конъюгированных с пероксидазой хрена (1:5000, «BioRad») в BLOTTO-T. После отмывки планшета PBS-T оценку активности проводили, выявляя пероксидазу с помощью хромогенной смеси: к раствору 10 мг о-фенилендиамина в 1 мл этанола добавляли 11 мл 0,1 М натрий-цитратного буфера, pH 4,0 и 5 мМ H2O2, спустя 4-5 мин к 0,1 мл смеси в лунках добавляли 0,05 мл 6 М H2SO4 и измеряли А492 на планшетном фотометре. Концентрацию МПО во фракциях рассчитывали по калибровочному графику с известными концентрациями МПО в диапазоне 3-250 нг/мл.Measurement of the concentration of the enzyme is carried out using ELISA using antibodies against human MPO obtained by immunization of rabbits and rats. 0.1 ml of affinity rat anti-human MPO antibody (5 mg / L) in 0.1 M sodium carbonate buffer, pH 9.4, after washing the tablet with 0.05 was placed in the wells of a polystyrene plate for 12 hours at + 4 ° C % Tween 20 (v / v) in PBS (PBS-T) blocked BLOTTO-T (3% skim milk (w / v) in PBS-T) for 1 hour (0.2 ml), then in standard solutions of MPO (3-250 ng / ml) or plasma samples diluted with BLOTTO-T (4-256 times) were incubated for 1 hour, after washing the PBS-T plate, 0.1 ml of rabbit anti-MPO antibodies were placed in the wells (10 mg / L) in BLOTTO-T, after washing the PBS-T plate, 0.1 m was placed in the wells l goat anti-rabbit IgG antibodies conjugated to horseradish peroxidase (1: 5000, BioRad) in BLOTTO-T. After washing the PBS-T plate, activity was assessed by detecting peroxidase using a chromogenic mixture: 11 ml of 0.1 M sodium citrate buffer, pH 4.0 and 5 mM H 2 O were added to a solution of 10 mg of o-phenylenediamine in 1 ml of ethanol 2 , after 4-5 minutes, 0.05 ml of 6 M H 2 SO 4 was added to 0.1 ml of the mixture in the wells, and A 492 was measured on a plate photometer. The concentration of MPO in the fractions was calculated according to the calibration graph with known concentrations of MPO in the range of 3-250 ng / ml.
Далее вычисляют коэффициент удельной активности Куа, равный отношению активности фермента к его концентрации (С), который выражается в единицах, количественно равных изменению оптической плотности в минуту на пг фермента.Then calculate the coefficient of specific activity K ya , equal to the ratio of the activity of the enzyme to its concentration (C), which is expressed in units quantitatively equal to the change in absorbance per minute per pg of enzyme.
Расчет коэффициента удельной активации фермента проводят по формулеThe calculation of the coefficient of specific activation of the enzyme is carried out according to the formula
Куа=АМПО/СK ya = A MPO / S
Коэффициент удельной активности МПО выше 1,65 ед.опт.пл./пг/мин позволяет говорить о нарушении функционального состояния фермента.The coefficient of specific activity of MPO above 1.65 units of opt.pl. / pg / min suggests a violation of the functional state of the enzyme.
Сущность и практическая применимость заявляемого способа иллюстрируются следующими примерами.The essence and practical applicability of the proposed method are illustrated by the following examples.
Пример 1. Проведено клиническое обследование 47 добровольцев без выраженных признаков острых, инфекционных или аллергических заболеваний, без нарушений сердечного ритма и проводимости, без признаков воспаления и ишемической болезни сердца. Плазма крови была исследована описанным выше способом. Коэффициент удельной активности МПО был равен 1,35±0,30 ед.опт.пл./пг/мин, что соответствует нормальному функциональному состоянию МПО. Действительно, было показано, что в группе этих людей существует достоверная положительная корреляционная зависимость между активностью и содержанием МПО в плазме крови, что иллюстрирует фиг.1. Эти данные подтверждают нормальное функциональное состояние МПО.Example 1. A clinical examination was conducted of 47 volunteers without pronounced signs of acute, infectious or allergic diseases, without disturbances in heart rhythm and conduction, without signs of inflammation and coronary heart disease. Blood plasma was investigated as described above. The coefficient of specific activity of MPO was equal to 1.35 ± 0.30 units opt.pl. / pg / min, which corresponds to the normal functional state of MPO. Indeed, it was shown that in the group of these people there is a significant positive correlation between the activity and the content of MPO in the blood plasma, as illustrated in Fig. 1. These data confirm the normal functional state of MPO.
Пример 2. В НИИ кардиологии (г.Минск) было проведено обследование группы больных с установленным диагнозом сахарный диабет (СД) 2 типа и ишемическая болезнь сердца (ИБС). Плазма крови была исследована описанным выше способом. Коэффициент удельной активности МПО в плазме крови больных СД 2 типа был равен 3,54±1,15 ед.опт.пл./пг/мин, а в группе больных ИБС - 1,71±0,37 ед.опт.пл./пг/мин, что соответствует нарушению функционального состояния МПО. Действительно, при исследовании показателей, характеризующих окислительно-восстановительные процессы в плазме крови как больных СД 2 типа, так и больных ИБС было достоверно увеличено количество окисленного глутатиона и продуктов, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой, что свидетельствует о развитии окислительного стресса. Подтверждением нарушения функционального состояния МПО явилось также отсутствие достоверной корреляционной зависимости между активностью и содержанием МПО в плазме крови как больных СД 2 типа, так и ИБС, что иллюстрируют фиг.2 и 3.Example 2. At the Research Institute of Cardiology (Minsk), a survey was conducted of a group of patients with a diagnosis of type 2 diabetes mellitus (DM) and coronary heart disease (CHD). Blood plasma was investigated as described above. The coefficient of specific activity of MPO in the blood plasma of patients with type 2 diabetes was 3.54 ± 1.15 units of opt.pl. / pg / min, and in the group of patients with coronary artery disease - 1.71 ± 0.37 units of opt. / PG / min, which corresponds to a violation of the functional state of MPO. Indeed, in the study of indicators characterizing the oxidation-reduction processes in the blood plasma of both patients with type 2 diabetes and IHD patients, the amount of oxidized glutathione and products reacting with 2-thiobarbituric acid was significantly increased, which indicates the development of oxidative stress. Confirmation of the violation of the functional state of MPO was also the lack of a reliable correlation between the activity and the content of MPO in the blood plasma of both patients with type 2 diabetes and coronary heart disease, as illustrated by figures 2 and 3.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить информативность, точность и расширить диагностические возможности по сравнению с существующим способом, благодаря одновременной регистрации и количества, и активности МПО.Thus, the proposed method allows to increase the information content, accuracy and expand diagnostic capabilities compared to the existing method, due to the simultaneous registration of both the quantity and activity of MPO.
Источники информацииInformation sources
1. Sokolov A.V., Ageeva K.V., Pulina M.O. et al. Free Rad. Res. 2008. V.42. P.989-998.1. Sokolov A.V., Ageeva K.V., Pulina M.O. et al. Free Rad. Res. 2008. V. 42. P.989-998.
2. Панасенко О.М., Чеканов А.В., Власова И.И. и др. Влияние церулоплазмина и лактоферрина на хлорирующую активность лейкоцитарной миелопероксидазы. Изучение методом хемилюминесценции. // Биофизика. 2008. Т.53. №5. С.573-581.2. Panasenko O.M., Chekanov A.V., Vlasova I.I. et al. Effect of ceruloplasmin and lactoferrin on the chlorinating activity of leukocyte myeloperoxidase. Chemiluminescence study. // Biophysics. 2008.V. 53. No. 5. S.573-581.
3. Власова И.И., Арнхольд Ю., Осипов А.Н., Панасенко О.М. рН-Зависимая регуляция активности миелопероксидазы. // Биохимия. 2006. Т.71. С.825-837.3. Vlasova I.I., Arnhold Yu., Osipov A.N., Panasenko O.M. pH-dependent regulation of myeloperoxidase activity. // Biochemistry. 2006.V. 71. S.825-837.
4. Zhang R., Brennan M.-L., Fu X. et al. JAMA. 2001. V.286. P.2136-2142.4. Zhang R., Brennan M.-L., Fu X. et al. JAMA. 2001. V.286. P.2136-2142.
5. Baskol G., Demir H., Baskol M. et al. 2006. V.24. P.307-311.5. Baskol G., Demir H., Baskol M. et al. 2006. V.24. P.307-311.
6. Патент BY №13675, G01N 33/48, 30.10.2010.6. Patent BY No. 13675, G01N 33/48, 10.30.2010.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011125433/15A RU2464575C1 (en) | 2011-06-20 | 2011-06-20 | Method for determining functional state of blood plasma myeloperoxidase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011125433/15A RU2464575C1 (en) | 2011-06-20 | 2011-06-20 | Method for determining functional state of blood plasma myeloperoxidase |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2464575C1 true RU2464575C1 (en) | 2012-10-20 |
Family
ID=47145515
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011125433/15A RU2464575C1 (en) | 2011-06-20 | 2011-06-20 | Method for determining functional state of blood plasma myeloperoxidase |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2464575C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2180114C1 (en) * | 2000-10-13 | 2002-02-27 | Азнабаева Лилия Фаритовна | Method for determining peroxidase activity in biological fluids |
| CN101358228A (en) * | 2008-09-24 | 2009-02-04 | 李德海 | Neutrophilic granulocyte activity detection method |
-
2011
- 2011-06-20 RU RU2011125433/15A patent/RU2464575C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2180114C1 (en) * | 2000-10-13 | 2002-02-27 | Азнабаева Лилия Фаритовна | Method for determining peroxidase activity in biological fluids |
| CN101358228A (en) * | 2008-09-24 | 2009-02-04 | 李德海 | Neutrophilic granulocyte activity detection method |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| THOMAS E.L. et al. Leukocyte myeloperoxidase and salivary lactoperoxidase: identification and quantitation in human mixed saliva. J Dent Res. 1994 Feb; 73(2): 544-55. Найдено из БД PubMed, PMID: PubMed: 8120219. ГОРУДКО И.В. и др. Новые подходы к определению концентрации и пероксидазной активности миелопероксидазы в плазме крови человека. - Биоорганическая химия, 2009, т.35, №5, с.629-639. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Harma et al. | Measurement of the total antioxidant response in preeclampsia with a novel automated method | |
| Shimamura et al. | Serum levels of soluble secreted α-Klotho are decreased in the early stages of chronic kidney disease, making it a probable novel biomarker for early diagnosis | |
| JP6449247B2 (en) | In vitro early detection method for potential inflammation particularly associated with transplant rejection, neurodegenerative disease or depression | |
| Romuk et al. | Superoxide dismutase activity as a predictor of adverse outcomes in patients with nonischemic dilated cardiomyopathy | |
| Ates et al. | Thiol/disulphide homeostasis, ischemia modified albumin, and ferroxidase as oxidative stress markers in women with obesity with insulin resistance | |
| US5427951A (en) | Diagnostic test for determining the antioxidant status of a sample | |
| US20040015101A1 (en) | Rapid non-invasive method for differential acute cardiovascular disease diagnosis | |
| Hallows et al. | Association of baseline urinary metabolic biomarkers with ADPKD severity in TAME-PKD clinical trial participants | |
| Lee et al. | Association between serum uric acid and α-klotho protein levels in the middle-aged population | |
| Çakıcı et al. | Evaluation of the level of dynamic thiol/disulphide homeostasis in adolescent patients with newly diagnosed primary hypertension | |
| Udy et al. | Point of care measurement of plasma creatinine in critically ill patients with acute kidney injury | |
| CN112424604A (en) | Method and kit for detecting 11-dehydro-thromboxane B2 | |
| US20110287468A1 (en) | Methods and compositions for assaying enzymatic activity of myeloperoxidase in blood samples | |
| Mohammed et al. | A case-control study to determination FBXW7 and Fetuin-A levels in patients with type 2 diabetes in Iraq | |
| RU2464575C1 (en) | Method for determining functional state of blood plasma myeloperoxidase | |
| US20070209950A1 (en) | Methods and devices for the detection and measurement of free metals in fluids and methods for diagnosing metal-related diseases and for determining pharmacologic dosing regimens | |
| Wong et al. | Development of a plasminogen activator inhibitor (PAI-1) assay and comparison of plasma PAI-1 activity in hyperlipidemic/dyslipidemic dogs with either hyperadrenocorticism or diabetes mellitus, and healthy dogs | |
| EP4370926A1 (en) | Method for quantifying ahsp protein and its use for prognosing a haemoglobin-related disorder | |
| Steinert et al. | Complement C3, eosinophil cationic protein and symptom evaluation in interstitial cystitis | |
| CN107966564B (en) | Human proprotein convertase subtilisin/kexin 9 enzyme-linked immunoassay reagent and detection kit and application | |
| Acibucu et al. | Proptosis is associated with thiol-disulfide in patients with Graves’ ophthalmopathy | |
| RU2315305C2 (en) | Method for predicting infectious complications after chemotherapy in patients with acute leukosis | |
| Babinets et al. | Analysis of antioxidant protection indicators from the position of age changes in chronic pancreatitis patients | |
| Jokar et al. | Serum lysyl oxidase concentration increases in long-standing systemic sclerosis: Can lysyl oxidase change over time? | |
| WO2002037105A1 (en) | Diagnostic kit for schizophrenia |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140621 |