RU2460773C2

RU2460773C2 - Жидкая питательная среда для накопления высокоактивных метаболитов штаммом bacillus pumilus "пашков", обладающих ингибирующим действием в отношении бактерий, грибов и вирусов

Info

Publication number: RU2460773C2
Application number: RU2010131231/10A
Authority: RU
Inventors: Ольга Михайловна Гринько (RU); Ольга Михайловна Гринько; Наталья Александровна Михайлова (RU); Наталья Александровна Михайлова
Priority date: 2010-07-27
Filing date: 2010-07-27
Publication date: 2012-09-10
Also published as: RU2010131231A

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения высокоактивных метаболитов, обладающих бактерицидным действием в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий, фунгистатическим действием в отношении дрожжевых грибов и противовирусным действием в отношении энтеровирусов. Питательная среда содержит железо (II) сернокислое 7-водное, магний сернокислый 7-водный, хлористый марганец, кальций хлористый, калий фосфорно-кислый однозамещенный 3-водный, цитрат аммония, триптон, дрожжевой экстракт, лактозу, глицерин и дистиллированную воду при заданном содержании компонентов. Изобретение позволяет культивировать штамм Bacillus pumilus "Пашков" продуцент высокоактивных метаболитов, обладающих бактерицидным действием в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий, фунгистатическим действием в отношении дрожжевых грибов и противовирусным действием в отношении энтеровирусов. 5 табл., 4 пр.

Description

Изобретение относится к области микробиологии, в частности к питательным средам для получения высокоактивных метаболитов, обладающих бактерицидным действием в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий, фунгистатическим действием в отношении дрожжевых грибов и противовирусным действием в отношении энтеровирусов.

Известна синтетическая питательная среда №9, используемая в производстве споровых пробиотиков, содержащая железо (II) сернокислое 7-водное; магний сернокислый 7-водный; хлористый марганец; кальций хлористый; пептон сухой ферментативный для бактериологических целей - 5,0; глюкоза - 10,0; дрожжевой экстракт - 3,0 (ФСП 4205042435-05).

К недостаткам данной питательной среды следует отнести недостаточное влияние на выработку БАВ В.pumilus «Пашков», обладающих ингибирующими свойствами в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий.

Известна синтетическая питательная среда №5, так же применяемая при производстве споровых пробиотиков, содержащая калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный; аммоний сернокислый двузамещенный; натрий лимоннокислый 5,5-водный; медь сернокислая 5-водная - 0,005; цинк сернокислый 7-водный; железо (II) сернокислое 7-водное; кальций хлористый; марганец (II) сернокислый 5-водный; магний сернокислый 7-водный; пептон сухой ферментативный для бактериологических целей (ФСП 4205042435-05).

К недостаткам данной питательной среды следует отнести слабое влияние на выработку БАВ В.pumilus «Пашков», обладающих ингибирующими свойствами в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий.

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является разработка новой жидкой питательной среды для культивирования штамма Bacillus pumilus «Пашков» с целью получения высокоактивных метаболитов, обладающих бактерицидным действием, а также ингибирующих другие микробы.

Для решения указанной задачи разработана питательная среда для выращивания штамма Bacillus pumilus «Пашков», содержащая при рН 7,3±0,2 железо (II) сернокислое 7-водное, магний сернокислый 7-водный, хлористый марганец, кальций хлористый, калий фосфорно-кислый однозамещенный 3-водный (K₂HPO₄·3H₂O), цитрат аммония (NH₄OOCC(OH)(CH₂COOH)₂), триптон, дрожжевой экстракт, лактозу и глицерин при следующем содержании указанных компонентов на 1 литр дистиллированной воды:

железо (II) сернокислое 7-водное - 0,01 г

магний сернокислый 7-водный - 0,1 г

хлористый марганец - 0,01 г

кальций хлористый - 0,08 г

калий фосфорно-кислый однозамещенный 3-водный - 0,3 г

цитрат аммония - 2,0 г

триптон - 5 г

дрожжевой экстракт - 7,0 г

лактоза - 10 г

глицерин - 40 мл.

Питательную среду готовят следующим образом.

Пример 1. Для приготовления заявленной жидкой питательной среды берут 1 литр дистиллированной воды. Последовательно вносят соли: железо (II) сернокислое 7-водное - 0,01 г; магний сернокислый 7-водный - 0,1 г; хлористый марганец - 0,01 г; кальций хлористый - 0,08 г; калий фосфорнокислый однозамещенный 3-водный (K₂HPO₄·3H₂O) - 0,3 г; цитрат аммония (NH₄OOCC(OH)(CH₂COOH)₂) - 2,0 г/л. Каждую соль размешивают до полного растворения. Затем добавляют триптон - 5 г/л, лактозу 10 г/л, дрожжевой экстракт - 7 г/л и глицерин - 40 мл. Доводят рН среды до 7,3±0,2. После приготовления среду стерилизуют при 1 атм (121°С) 20 мин.

Готовая жидкая среда темно-желтого цвета, не содержит посторонних включений, рН среды до 7,3±0,2.

Пример 2. Влияние новой жидкой питательной среды на выработку БАВ, обладающих ингибирующими свойствами в отношении бактерий и дрожжевых грибов.

Штамм В.pumilus «Пашков» выращивали методом периодического культивирования в течение 72 часов. О наличии биологически-активных веществ (БАВ) в культуральной жидкости В.pumilus «Пашков» судили по их влиянию на кинетику роста тест-культур с помощью микробиологического анализатора с планшетным фотометром «BIOSCREEN/iEMS-reader MF» (фирма «LabMetod», Финляндия). Задержка вступления тест-штаммов или дрожжевых грибов в стадию экспоненциального роста свидетельствовала о бактериостатическом (фунгистатическом) эффекте БАВ, а отсутствие роста более 18 часов оценивалось как бактерицидный (фунгицидный) эффект (табл.1, 2, 3).

Таблица 1
Показатели ингибирующего эффекта БАВ, синтезируемых при культивировании В.pumilus «Пашков» в отношении тест-штаммов условно-патогенных и патогенных бактерий
Тест-штаммы	Бактериостатический эффект (%)
S.aureus «Никифоров»	100
S.aureus «Филиппов»	100
S.xylosus 25	100
S.flexneri 337	100
S.sonnei 170	100
E.coli O157:H55	100
P.aeruginosa 9022	100
P.mirabilis 24a	100
P.vulgaris 177	100
* - задержка роста более 18 часов (бактерицидныйэффект).

Таблица 2
Характеристика ингибирующего эффекта БАВ, синтезируемых при культивировании В. pumilus «Пашков» в отношении бактерий Pseudomonas aeruginosa
№	Название штамма	БСЭ (%)	№	Название штамма	БСЭ (%)
1	170001	100*	22	170022	100*
2	170002	100*	23	170023	100*
3	170003	100*	24	170025 (Habs1)	100*
4	170004	100*	25	170026 (Habs2)	100*
5	170005	100*	26	170027 (Habs3)	100*
6	170006	100*	27	170028 (Habs4)	100*
7	170007	100*	28	170029 (Habs5)	100*
8	170008	100*	29	170030 (Habs6)	100*
9	170009	100*	30	170031 (Habs7)	100*
10	170010	100*	31	170032 (Habs8)	100*
11	170011	100*	32	170033 (Habs9)	100*
12	170012	100*	33	170034 (Habs10)	100*
13	170013	100*	34	170035 (Habs1)	100*
14	170014	100*	35	170036 (Habs12)	100*
15	170015	100*	36	170041 (Fisher1)	100*
16	170016	100*	37	170042 (Fisher2)	100*
17	170017	100*	38	170043 (Fisher3)	100*
18	170018	100*	39	170044 (Fisher4)	100*
19	170019	100*	40	170045 (Fisher5)	100*
20	170020	100*	41	170046 (Fisher6)	100*
21	170021	100*	42	170047 (Fisher7)	100*
* - задержка роста более 18 часов (бактерицидный эффект)

Таблица 3
Показатели активности БАВ, выделяемых при культивировании штамма В. pumilus «Пашков» в отношении клинических штаммов дрожжевых грибов
Название штамма дрожжевых грибов	Задержка роста грибов (фунгистатический эффект %)
C.albicans (№1)	94,6±8,4
C.albicans (№2)	92,2±7,4
C.haemuloni	91,7±6,6
C.tropicalis	89,5±8,1
Rhodotomla spp.	88,4±9,2
Debaryomyces hansenii	92,6±8,6

Таблицы 1, 2, 3 показывают, что БАВ, выделяемые при культивировании штамма В.pumilus «Пашков» на разработанной питательной среде, обладают бактерицидным действием в отношении 9 тест-штаммов бактерий, 42 клинических штаммов Р.aeruginosa и выраженным фунгистатическим эффектом в отношении 6 клинических штаммов дрожжевых грибов.

Пример 3. Влияние новой жидкой питательной среды на выработку БАВ, обладающих ингибирующими свойствами в отношении энтеровирусов.

Противовирусную активность культуральной жидкости определяли по лечебной и профилактической схемам воздействия в отношении вирусов полиомиелита I типа, ECHO 3, ECHO 6 и Коксаки В.

Лечебная схема.

На монослой клеток, выращенных в 24-луночных планшетах, после удаления ростовой среды и однократного промывания ФСБ вносили различные дозы энтеровирусов - от 100 ТЦД_{50/0,5 мл}до 12,5 ТЦД_{50/0,5 мл} с последующей инкубацией в термостате с 5% СO₂ при 37°С в течение часа. После удаления неадсорбировавшегося вируса монослой клеток дважды промывали ФСБ и вносили различные разведения КЖ В.pumilus «Пашков» от неразведенной до 1:640 в поддерживающей среде. Учет результатов проводили через 48 и 72 часа инкубации.

Профилактическая схема.

На монослой клеток, выращенных в 24-луночных планшетах, после удаления ростовой среды и однократного промывания ФСБ вносили различные разведения КЖ В.pumilus «Пашков» от неразведенной до 1:640 в поддерживающей среде с последующей инкубацией в термостате с 5% СO₂ при 37°С в течение 24 часов. Затем КЖ удаляли, вносили различные дозы вируса от 100 ТЦД_{50/0,5 мл} до 12,5 ТЦД_{50/0,5 мл} и помещали в инкубатор на 1 ч при 37°С. Затем клетки дважды промывали ФСБ, вносили поддерживающую среду и продолжали инкубировать в течение 72 часов.

Противовирусную активность в обеих схемах оценивали по цитопатогенному действию вируса (ЦПД). Разведение КЖ, вызывающее ингибирование вирусного ЦПД на 50% по отношению к контролю, принимали за ингибирующую дозу (ИД₅₀) (табл.4, 5).

Таблица 4
Эффективность лечебного действия КЖ штамма B. pumilus «Пашков» в отношении энтеровирусов в зависимости от разведения препарата и дозы вирусов в опытах in vitro
Вирусы	Время наблюдения (час)	Разведение препарата, обеспечивающее 100% защитный эффект
		Доза вируса в log ТЦД_{50/0,5 мл}
		100	50	25	12,5
Polio-1	48	1:80	1:160	1:640	1:640
Polio-1	72	1:80	1:80	1:640	1:640
ЕСНО 3	48	1:40	1:40	1:640	1:640
ЕСНО 3	72	1:40	1:40	1:160	1:320
ECHO 6	48	1:40	1:640	1:640	1:640
ECHO 6	72	1:40	1:160	1:160	1:640
Сох В (1-6)	48	1:80	1:80	1:40	1:40
Сох В (1-6)	72	1:80	1:80	1:40	1:40

Из результатов, представленных в табл.4, следует, что лечебный эффект КЖ B.pumilus «Пашков» в отношении вируса полиомиелита типа I четко зависит от дозы вируса. При дозах вируса 12,5-25,0 lg ТЦД_{50/0,5 мл} 100% защита инфицированных клеток после обработки КЖ проявлялась при максимально исследованном разведении 1:640 и сохранялась в течение 72 ч. При заражении культуры клеток высокими дозами вируса 50-100 ТЦД_{50/0,5 мл} полная защита клеток наступала при обработке КЖ в разведениях 1:160-1:80 соответственно, а частичная защита сохранялась при разведениях препарата 1:320-1:160 соответственно в течение 48 часов наблюдения.

Полученные результаты свидетельствуют, что наиболее эффективное лечебное действие КЖ проявлялось в отношении вируса полиомиелита I типа и ECHO 6 и менее в отношении вируса Коксаки В (1-6).

Таблица 5
Эффективность профилактического действия КЖ в отношении энтеровирусов в зависимости от разведения препарата и дозы вирусов в опытах in vitro
Вирусы	Время учета (час)	Разведение препарата, обеспечивающее 100% профилактический эффект
		Доза вируса в log ТЦД_{50/0,5 мл}
		100	50	25	12,5
Polio-1	48	1:40	1:160	1:160	1:640
Polio-1	72	1:40	1:160	1:160	1:640
ЕСНО 3	48	0	1:160	1:640	1:640
ЕСНО 3	72	0	1:160	1:640	1:640
ECHO 6	48	0	1:20	1:640	1:640
ECHO 6	72	0	1:20	1:640	1:640
Сох В (1-6)	48	0	1:20	1:640	1:640
Сох В (1-6)	72	0	1:20	1:320	1:640

Результаты, представленные в табл.5, показывают профилактический эффект КЖ В.pumilus «Пашков», зависящий от дозы вируса, концентрации препарата, вида вируса и наиболее выраженный в отношении вируса полиомиелита I типа.

Пример 4. Исходные данные состава среды (г/л) рН 7,3±0,2: железо (II) сернокислое 7-водное - 0,01 г/л; магний сернокислый 7-водный - 0,1 г/л; хлористый марганец - 0,01 г/л; кальций хлористый - 0,08 г/л; калий фосфорно-кислый однозамещенный 3-водный (K₂HPO₄·3H₂O) - 0,3 г/л; цитрат аммония (NH₄OOCC(OH)(CH₂COOH)₂) - 2,0 г/л; триптон - 5 г/л; дрожжевой экстракт - 7,0 г/л; лактоза - 10 г/л; глицерин - 40 мл/л.

Claims

Питательная среда для выращивания штамма Bacillus pumilus «Пашков», содержащая при рН 7,3±0,2 железо (II) сернокислое 7-водное, магний сернокислый 7-водный, хлористый марганец, кальций хлористый, калий фосфорнокислый однозамещенный 3-водный, цитрат аммония, триптон, дрожжевой экстракт, лактозу и глицерин при следующем содержании указанных компонентов на 1 литр дистиллированной воды:
железо (II) сернокислое 7-водное 0,01 г магний сернокислый 7-водный 0,1 г хлористый марганец 0,01 г кальций хлористый 0,08 г К₂НРO₄·3Н₂O 0,3 г цитрат аммония 2,0 г триптон 5 г дрожжевой экстракт 7,0 г лактоза 10 г глицерин 40 мл