RU2455354C1

RU2455354C1 - Skin and mucosa cell renewal composition

Info

Publication number: RU2455354C1
Application number: RU2010153950/10A
Authority: RU
Inventors: Антонина Ивановна Колесникова (RU); Антонина Ивановна Колесникова
Original assignee: Антонина Ивановна Колесникова
Priority date: 2010-12-29
Filing date: 2010-12-29
Publication date: 2012-07-10

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: skin and mucosa renewal composition contains a culture nutrient medium conditioned by waste products and growth factors of mesenchymal stem cells, prepared at the stages of logarithmic and steady growth phases of a stable cell culture of the mesenchymal stem cells, containing biologically active compounds of low-molecular peptides of molecular weight 6-8 kDa and low-molecular substances of molecular weight 2-3 kDa, corresponding to active cytokines, in the amount of min. n x 10 wherein n in a number of said biologically active compounds in the primary culture nutrient medium. The composition also contains human marrow mesenchymal stem cells (MSCs) in the amount of min 10⁵ cell/ml.

EFFECT: invention enables higher clinical effectiveness in various skin and mucosa damages and solved problems of using human embryo stem cells.

3 cl, 4 dwg, 9 ex

Description

Заявляемое изобретение относится к биомедицинским клеточным технологиям, более точно заявляемое изобретение касается композиции для регенерации клеток кожи и слизистых оболочек.The claimed invention relates to biomedical cellular technologies, more specifically, the claimed invention relates to compositions for the regeneration of skin cells and mucous membranes.

Изобретение найдет широкое применение в медицине, в частности, для лечения трофических поражений кожных и слизистых покровов, развивающихся при сахарном диабете, хронической венозной недостаточности, облитерирующем эндартериите, стоматите, ожогах, заболеваниях слизистых мочеполовых путей.The invention will find wide application in medicine, in particular, for the treatment of trophic lesions of the skin and mucous membranes that develop with diabetes mellitus, chronic venous insufficiency, obliterating endarteritis, stomatitis, burns, diseases of the urinary tract.

Известно, что питательная среда, используемая для культивирования клеток, обычно включает незаменимые аминокислоты, витамины, минералы, углеводы, липиды и нуклеиновые кислоты. Внесение в питательную среду гормонов и ростовых факторов обеспечивает условия для нормального роста и дифференцировки культивируемых клеток. В процессе культивирования клеточная культура продуцирует, секретирует ряд важных клеточных метаболитов, которые регулируют пролиферацию клеток, их адгезию, дифференцировку, миграцию, определяют спектр синтезируемых и секретируемых биологически активных веществ. Спектр продуцируемых веществ напрямую зависит от фенотипического состава культивируемых клеток, а также от факторов роста, которые были исходно привнесены в культуральную среду. Таким образом, в процессе культивирования клетки модифицируют культуральную среду, обогащая ее продуктами своей жизнедеятельности. После инкубирования культуральной среды с клетками эта среда становится так называемой кондиционированной средой. Кондиционированные среды содержат много исходных компонентов самой среды, а также, как сказано выше, различные клеточные метаболиты и секретированные белки, включая, например, биологически активные факторы роста, медиаторы воспаления и другие внеклеточные белки.It is known that the culture medium used to cultivate cells typically includes essential amino acids, vitamins, minerals, carbohydrates, lipids, and nucleic acids. The introduction of hormones and growth factors into the nutrient medium provides the conditions for normal growth and differentiation of cultured cells. During cultivation, the cell culture produces, secrets a number of important cellular metabolites that regulate cell proliferation, their adhesion, differentiation, migration, determine the spectrum of synthesized and secreted biologically active substances. The spectrum of substances produced directly depends on the phenotypic composition of cultured cells, as well as on growth factors that were originally introduced into the culture medium. Thus, in the process of cultivation, the cells modify the culture medium, enriching it with the products of their vital functions. After incubation of the culture medium with cells, this medium becomes the so-called conditioned medium. Conditioned media contain many of the original components of the medium itself, as well as, as mentioned above, various cellular metabolites and secreted proteins, including, for example, biologically active growth factors, inflammatory mediators, and other extracellular proteins.

В последние годы интенсивно проводят исследования возможностей получения из различных типов стволовых клеток разных по направлению дифференцировки клеток, которые посредством трансплантации могут применяться для замещения утраченных или поврежденных клеток в жизненно важных органах или тканях.In recent years, studies have been intensively carried out on the possibility of obtaining from different types of stem cells different in the direction of differentiation of cells, which through transplantation can be used to replace lost or damaged cells in vital organs or tissues.

В процессе роста и индукции направленной дифференцировки исходных стволовых клеток в специализированные клетки происходит формирование соответствующей кондиционированной среды, которая также может обладать различной биологической активностью, в том числе и лечебным эффектом, изучаемым в регенеративной медицине.In the process of growth and induction of directed differentiation of the initial stem cells into specialized cells, the formation of the corresponding conditioned medium occurs, which can also have different biological activity, including the therapeutic effect studied in regenerative medicine.

Известна композиция для стимулирования роста и регенерации клеток, описанная в патенте РФ 2341270 (опубл. 10.07.2008 по кл. МПК A61K 35/12). Эта композиция содержит разрушенные клетки лейкоцитов периферической крови, разрушенные стволовые клетки и/или разрушенные прогениторные клетки, взятые в кондиционированной среде их совместного культивирования в присутствии тканеспецифического антигена, соответствующего органу, регенерацию которого намереваются осуществить, также композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель. При этом указывается, что питательная среда может быть кондиционирована стромальными клетками, клетками костного мозга, паренхиматозными клетками, резервными клетками печени, стволовыми нервными клетками, стволовыми клетками поджелудочной железы и/или эмбриональными стволовыми клетками. Указанные клетки представляют собой клетки животных или человека, а в качестве ростовой среды может быть использована любая известная определенная или неопределенная культуральная питательная среда.A known composition for stimulating the growth and regeneration of cells described in the patent of the Russian Federation 2341270 (publ. 10.07.2008 according to class IPC A61K 35/12). This composition contains destroyed peripheral blood leukocyte cells, destroyed stem cells and / or destroyed progenitor cells taken in a co-cultured conditioned medium in the presence of a tissue-specific antigen corresponding to the organ whose regeneration they intend to carry out, and the composition also contains a pharmaceutically acceptable carrier. It is indicated that the nutrient medium can be conditioned with stromal cells, bone marrow cells, parenchymal cells, reserve liver cells, stem nerve cells, pancreatic stem cells and / or embryonic stem cells. These cells are animal or human cells, and any known defined or undefined culture medium may be used as growth medium.

В качестве прототипа выбрана фармацевтическая композиция, содержащая питательную среду, кондиционированную трехмерной клеточной культурой при культивировании in vitro в течение 10-14 дней (патент РФ 2280459, опубл 27.07.2006 по кл. МПК A61K 35/12). Клеточные культуры, культивированные в трех измерениях, включают стромальные и/или паренхимные клетки, в том числе генетически сконструированные клетки. Указанная фармацевтическая композиция содержит названную кондиционированную культуральную среду, из которой отделены клеточные культуры, при этом включающую такие внеклеточные продукты, как факторы роста, противовоспалительные медиаторы, ферменты, цитокины, гормоны, факторы свертывания крови, регуляторные факторы, ангиогенные факторы или антиангиогенные факторы.As a prototype, a pharmaceutical composition was selected containing a nutrient medium conditioned with a three-dimensional cell culture when cultured in vitro for 10-14 days (RF patent 2280459, published July 27, 2006 according to class IPC A61K 35/12). Cell cultures cultured in three dimensions include stromal and / or parenchymal cells, including genetically engineered cells. The specified pharmaceutical composition contains the named conditioned culture medium from which cell cultures are separated, including extracellular products such as growth factors, anti-inflammatory mediators, enzymes, cytokines, hormones, blood coagulation factors, regulatory factors, angiogenic factors or anti-angiogenic factors.

Помимо кондиционированной культуральной среды фармацевтическая композиция содержит фармацевтический носитель, а также может содержать антибиотики, антивирусные агенты, противогрибковые агенты, стероиды, аналгетики, противоопухолевые лекарственные средства, любые соединения, которые должны приводить к образованию комбинации с присутствующими в кондиционированной среде факторами, обладающей усиливающим или синергическим действием.In addition to the conditioned culture medium, the pharmaceutical composition contains a pharmaceutical carrier, and may also contain antibiotics, antiviral agents, antifungal agents, steroids, analgesics, antitumor drugs, any compounds that should lead to the formation of factors with enhancing or synergistic factors present in the conditioned medium action.

Фармацевтическая композиция предложена для стимуляции заживления ран и лечения ожогов, а также для коррекции косметического дефекта.The pharmaceutical composition is proposed to stimulate wound healing and treatment of burns, as well as to correct a cosmetic defect.

Как композиция, описанная в патенте РФ 2341270, так и композиция, выбранная в качестве прототипа, содержат кондиционированные среды, специально и направленно получаемые в отношении веществ, продуцируемых культивируемыми клетками. Используются при этом не всегда до конца изученные в отношении влияния на организм человека клеточные линии, а также применяются сложные, затратные и неопробированные технологии, получаемые кондиционированные среды содержат вещества неоднозначного действия на организм человека. Кроме того, свойства/состав кондиционированных сред, присутствующих в указанных композициях, не определены и не изучены, что не исключает возможность проявления непредвиденных свойств фармацевтической композиции. Помимо этого, следует сказать, что свойства композиций, заявленных в патенте РФ 2341270 и в патенте РФ 2280459, обусловлены присутствием разного рода дополнительно вносимого биологического материала и активных веществ, а не собственно кондиционированной средой.Both the composition described in the patent of the Russian Federation 2341270, and the composition selected as a prototype, contain air-conditioned environment, specially and directionally obtained in relation to substances produced by cultured cells. In this case, cell lines that are not fully studied are used to the end, and complex, costly and unproven technologies are used, the resulting conditioned media contain substances of ambiguous action on the human body. In addition, the properties / composition of the conditioned media present in these compositions are not defined and not studied, which does not exclude the possibility of unforeseen properties of the pharmaceutical composition. In addition, it should be said that the properties of the compositions claimed in the patent of the Russian Federation 2341270 and in the patent of the Russian Federation 2280459 are due to the presence of various kinds of additionally introduced biological material and active substances, and not the air-conditioned medium itself.

В основу заявляемого изобретения положена задача путем использования побочных продуктов изученных медицинских клеточных технологий создать такую композицию для стимулирования роста и регенерации клеток, которая обладала бы высокой эффективностью при восстановлении поврежденных клеток в самообновляющихся клеточных системах, в первую очередь, в коже и слизистых, а также безопасностью в медицинском и этическом отношениях.The basis of the claimed invention is the task of using by-products of the studied medical cell technologies to create a composition for stimulating cell growth and regeneration, which would be highly effective in the restoration of damaged cells in self-renewing cell systems, primarily in the skin and mucous membranes, as well as safety in medical and ethical terms.

Технический результат, который может быть достигнут при использовании предлагаемой композиции, заключается в возможности в экономически привлекательных условиях эффективно осуществлять восстановление поврежденных клеток кожи и слизистых оболочек человека в безопасном режиме с точки зрения медицины и этики.The technical result that can be achieved by using the proposed composition is the possibility in an economically attractive environment to effectively restore damaged skin cells and mucous membranes of a person in a safe mode from the point of view of medicine and ethics.

Эта задача решается за счет того, что композиция, включающая культуральную питательную среду, содержащую биологически активные соединения на основе низкомолекулярных пептидов и цитокинов, используемую для культивирования in vitro эукариотических клеток, и кондиционированную продуктами жизнедеятельности и ростовыми факторами эукариотических клеток, выделяемыми ими в питательную среду в процессе их культивирования, согласно заявляемому изобретению, дополнительно содержит костномозговые мезенхимальные стволовые клетки человека в количестве по меньшей мере 10⁵ клеток/мл, а в качестве кондиционированной среды она содержит культуральную питательную среду, кондиционированную продуктами жизнедеятельности и ростовыми факторами мезенхимальных стволовых клеток, полученную на стадиях логарифмической фазы и стационарной фазы роста стабильной клеточной культуры мезенхимальных стволовых клеток, содержащую биологически-активные соединения на основе низкомолекулярных пептидов с молекулярной массой 6-8 кДа и низкомолекулярных веществ с молекулярной массой 2-3 кДа, соответствующих активным цитокинам, в количестве по меньшей мере n×10, где n - количество названных биологически активных соединений в исходной культуральной питательной среде.This problem is solved due to the fact that the composition, including a culture medium containing biologically active compounds based on low molecular weight peptides and cytokines, used for in vitro cultivation of eukaryotic cells, and conditioned with vital products and growth factors of eukaryotic cells secreted by them into the nutrient medium in the process of their cultivation, according to the claimed invention, further comprises human bone marrow mesenchymal stem cells ETS at least 10 ⁵ cells / ml, and the conditioned media as it contains nutrient culture medium conditioned waste products and growth factors of mesenchymal stem cells obtained in stage log phase and stationary phase growth in a stable cell culture of mesenchymal stem cells comprising a biologically active compounds based on low molecular weight peptides with a molecular weight of 6-8 kDa and low molecular weight substances with a molecular weight of 2-3 kDa, active cytokines in an amount of at least n × 10, where n is the number of the aforementioned biologically active compounds in the initial culture medium.

При этом, согласно изобретению, заявляемая композиция содержит костномозговые мезенхимальные стволовые клетки человека преимущественно в количестве от 10⁵ клеток/мл до 10⁶ клеток/мл.Moreover, according to the invention, the claimed composition contains bone marrow mesenchymal stem cells of a person mainly in an amount of from 10 ⁵ cells / ml to 10 ⁶ cells / ml.

Еще одна особенность заявляемого изобретения заключается в том, что в основном заявляемая композиция содержит следующие ингредиенты, г/л: L-аргинин 0,2; L-аспарагин (безводный) 0,05; L-аспарагиновую кислоту 0,02; L-цистин 0,0652; L-глютаминовую кислоту 0,02; L-глютамин 0,3; L-глицин 0,01; L-гистидин 0,015, L-гидроксипролин 0,02; L-изолейцин 0,05, L-лейцин 0,05; L-лизин HCl 0,04; L-метионин 0,015; L-фенилаланин 0,015; L-пролин 0,02, L-серин 0,03; L-треонин 0,02, L-триптофан 0,005; L-тирозин 0,02883; L-валин 0,02; биотин 0,0002; пантотенат 0,00025; холинхлорид 0,00362; фолиевую кислоту 0,001; инозит 0,035; никотинамид 0,001; РАВА 0,001; пиридоксин солянокислый 0,001; рибофлавин 0,0002; тиамин солянокислый 0,001; витамин В12 0,000005; нитрат кальция 0,1; хлорид калия 0,4; сульфат магния 0,04884; хлорид натрия 6,0; фосфат натрия 0,8; Д-глюкоза 2,0; глютатион 0,001; феноловый красный 0,0053.Another feature of the claimed invention is that basically the claimed composition contains the following ingredients, g / l: L-arginine 0.2; L-asparagine (anhydrous) 0.05; L-aspartic acid 0.02; L-cystine 0.0652; L-glutamic acid 0.02; L-glutamine 0.3; L-glycine 0.01; L-histidine 0.015; L-hydroxyproline 0.02; L-isoleucine 0.05; L-leucine 0.05; L-lysine HCl 0.04; L-methionine 0.015; L-phenylalanine 0.015; L-Proline 0.02; L-Serine 0.03; L-threonine 0.02; L-tryptophan 0.005; L-tyrosine 0.02883; L-valine 0.02; biotin 0.0002; pantothenate 0,00025; choline chloride 0.00362; folic acid 0.001; inositol 0.035; nicotinamide 0.001; RAVA 0.001; hydrochloride pyridoxine 0.001; riboflavin 0.0002; thiamine hydrochloride 0.001; Vitamin B12 0.000005; calcium nitrate 0.1; potassium chloride 0.4; magnesium sulfate 0.04884; sodium chloride 6.0; sodium phosphate 0.8; D-glucose 2.0; glutathione 0.001; phenol red 0.0053.

Заявленное изобретение иллюстрируется чертежами, где одинаковые или сходные элементы имеют одни и те же ссылочные позиции.The claimed invention is illustrated by drawings, where the same or similar elements have the same reference position.

На фиг.1 графически представлен результат хроматографического анализа исходной культуральной питательной среды в части распределения белковых фракций (фракция 4 соответствует пептидам с молекулярной массой 6-8 кДа и фракция 5 соответствует веществам (активные цитокины) с молекулярной массой 2-3 кДа).Figure 1 graphically presents the result of chromatographic analysis of the initial culture medium in terms of the distribution of protein fractions (fraction 4 corresponds to peptides with a molecular weight of 6-8 kDa and fraction 5 corresponds to substances (active cytokines) with a molecular weight of 2-3 kDa).

На фиг.2 графически представлен результат хроматографического анализа кондиционированной культуральной питательной среды, собранной из культуры мезенхимальных стволовых клеток на стадии логарифмической фазы их роста, в части распределения белковых фракций (фракция 4 соответствует пептидам с молекулярной массой 6-8 кДа и фракция 5 соответствует веществам (активные цитокины) с молекулярной массой 2-3 кДа).Figure 2 graphically shows the result of chromatographic analysis of an air-conditioned culture medium collected from a culture of mesenchymal stem cells at the stage of the logarithmic phase of their growth, in terms of the distribution of protein fractions (fraction 4 corresponds to peptides with a molecular weight of 6-8 kDa and fraction 5 corresponds to substances ( active cytokines) with a molecular weight of 2-3 kDa).

На фиг.3 графически представлен результат хроматографического анализа кондиционированной культуральной питательной среды, собранной из культуры мезенхимальных стволовых клеток на стадии стационарной фазы их роста, в части распределения белковых фракций (фракция 4 соответствует пептидам с молекулярной массой 6-8 кДа и фракция 5 соответствует веществам (активные цитокины) с молекулярной массой 2-3 кДа).Figure 3 graphically shows the result of chromatographic analysis of an air-conditioned culture medium collected from a culture of mesenchymal stem cells at the stage of their stationary growth phase, in terms of the distribution of protein fractions (fraction 4 corresponds to peptides with a molecular weight of 6-8 kDa and fraction 5 corresponds to substances ( active cytokines) with a molecular weight of 2-3 kDa).

На фиг.4 графически представлен результат хроматографического анализа кондиционированной культуральной питательной среды, собранной из культуры мезенхимальных стволовых клеток и обогащенной мезенхимальными стволовыми клетками в количестве 10⁵ клеток/мл, в части распределения белковых фракций (фракция 4 соответствует пептидам с молекулярной массой 6-8 кДа и фракция 5 соответствует веществам (активные цитокины) с молекулярной массой 2-3 кДа).Figure 4 graphically presents the result of chromatographic analysis of conditioned culture medium collected from a culture of mesenchymal stem cells and enriched in mesenchymal stem cells in an amount of 10 ⁵ cells / ml, in terms of the distribution of protein fractions (fraction 4 corresponds to peptides with a molecular weight of 6-8 kDa and fraction 5 corresponds to substances (active cytokines) with a molecular weight of 2-3 kDa).

Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Заявляемая композиция включает культуральную питательную среду, кондиционированную в процессе культивирования in vitro костномозговых мезенхимальных стволовых клеток человека.The inventive composition includes a culture medium, conditioned during in vitro cultivation of bone marrow mesenchymal stem cells.

В качестве основного компонента заявляемой композиции используется продукт культивирования именно мезенхимальных стволовых клеток, так как такие клетки свободны, то есть не содержат фенотипические (мембранные) маркеры, характерные для гемопоэтических клеток (CD34, CD45, CD25, CD14, CD4), а также антигены гистосовместимости (HLA-DR, MH-II), и поэтому могут использоваться как для аутологичной, так и для аллогенной трансплантации. Всего на мезенхимальных стволовых клетках с помощью проточника выявлено более 50 антигенов, однако специфических для них маркеров не выявлено. Наиболее часто для выделения чистой популяции мезенхимальных стволовых клеток используют такие маркеры, как CD90, CD105, CD106, CD73, CD 166, SSEA-4, STRO-1, SH-4, HLA-ABC (MHC-II).As the main component of the claimed composition, the product of cultivation of mesenchymal stem cells is used, since such cells are free, that is, they do not contain phenotypic (membrane) markers characteristic of hematopoietic cells (CD34, CD45, CD25, CD14, CD4), as well as histocompatibility antigens (HLA-DR, MH-II), and therefore can be used for both autologous and allogeneic transplantation. In total, more than 50 antigens were detected on the mesenchymal stem cells with the help of a protocell, but no specific markers were identified. Most often, markers such as CD90, CD105, CD106, CD73, CD 166, SSEA-4, STRO-1, SH-4, HLA-ABC (MHC-II) are used to isolate a pure population of mesenchymal stem cells.

Культуральная питательная среда для культивирования мезенхимальных стволовых клеток может быть любой средой, которая адекватно соответствует потребностям культивируемых клеток в питательных элементах. Примерами таких сред являются, но не ограничиваются ими, модифицированная по методу Дульбекко среда Игла (DMEM), среда Хэма F12, RPMI 1640, среда Исков, среда Маккой и другие композиции сред, известные специалистам, включая среды, описанные в работах Methods For Preparation of Media, Supplements and Substrate For Serum-Free Animal Cell Culture Alan R.Liss, New York (1984) и Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons Ltd., Chichester, England 1996. Питательная среда может быть дополнена любыми компонентами, необходимыми для поддержания клеточной культуры. Если это необходимо, то дополнительно может быть добавлена эмбриональная телячья сыворотка, которая представляет собой комплексный раствор альбуминов, глобулинов, стимуляторов роста и гормонов. Такая сыворотка не должна содержать патогенов и должна быть тщательно проверена на загрязнение микоплазмой, бактериями, грибками и вирусами.The culture medium for the cultivation of mesenchymal stem cells can be any medium that adequately meets the needs of cultured cells for nutrients. Examples of such media include, but are not limited to, Dulbecco’s Eagle’s modified medium (DMEM), Ham’s F12 medium, RPMI 1640, Iscov’s medium, McCoy’s medium, and other media compositions known to those skilled in the art, including those described in Methods For Preparation of Media, Supplements and Substrate For Serum-Free Animal Cell Culture Alan R. Liss, New York (1984) and Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons Ltd., Chichester, England 1996. The culture medium may be supplemented with any components necessary to maintain cell culture. If necessary, fetal calf serum can be added, which is a complex solution of albumin, globulin, growth stimulants and hormones. Such serum should not contain pathogens and should be carefully checked for contamination with mycoplasma, bacteria, fungi and viruses.

Более подробно скажем, что ингредиентами культуральной питательной среды для культивирования мезенхимальных стволовых клеток являются аминокислоты (D- и/или L-аминокислоты), такие как глутамин, аланин, аргинин, аспарагин, цистеин, глутаминовая кислота, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серии, треонин, триптофан, тирозин, валин и их производные; подгруппы растворимых кислот, таких как тиамин, аскорбиновая кислота, соединения железа (3), соединения железа (2), пурины, глутатион и одноосновные фосфаты натрия.In more detail, we say that the ingredients of the culture medium for culturing mesenchymal stem cells are amino acids (D- and / or L-amino acids), such as glutamine, alanine, arginine, asparagine, cysteine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, series, threonine, tryptophan, tyrosine, valine and their derivatives; subgroups of soluble acids such as thiamine, ascorbic acid, iron compounds (3), iron compounds (2), purines, glutathione and monobasic sodium phosphates.

Другими ингредиентами являются сахара, дезоксирибоза, рибоза, нуклеозиды, водорастворимые витамины, рибофлавин, соли, металлы в следовых количествах, липиды, соли уксусной кислоты, соли фосфорной кислоты, HEPES, феноловый красный, соли пировиноградной кислоты и буферы.Other ingredients are sugars, deoxyribose, ribose, nucleosides, water soluble vitamins, riboflavin, salts, trace metals, lipids, acetic acid salts, phosphoric acid salts, HEPES, phenol red, pyruvic acid salts and buffers.

Другими ингредиентами, часто используемыми в композициях сред, являются жирорастворимые витамины (включая A, D, E и K), стероиды и их производные, холестерин, жирные кислоты и липиды, твин 80, 2-меркаптоэтанолпирамидины, а также ряд добавок, включая названную выше сыворотку, белки (инсулин, трансферрин, факторы роста, гормоны и т.п.), антибиотики (гентамицин, пенициллин, стрептамицин, амфотерицин В и т.п.), ультрафильтрат цельного яйца и факторы адгезии (фибронектины, витронектины, коллагены, ламенины, тенасцины и т.п.).Other ingredients commonly used in media compositions are fat-soluble vitamins (including A, D, E and K), steroids and their derivatives, cholesterol, fatty acids and lipids, tween 80, 2-mercaptoethanol pyramidines, as well as a number of additives, including the one mentioned above serum, proteins (insulin, transferrin, growth factors, hormones, etc.), antibiotics (gentamicin, penicillin, streptamycin, amphotericin B, etc.), whole egg ultrafiltrate and adhesion factors (fibronectins, vitronectins, collagen, lamenins , tenascins, etc.).

Само собой разумеется, что в указанные среды могут быть добавлены факторы роста и другие белки.It goes without saying that growth factors and other proteins can be added to these media.

Согласно изобретению, использованная культуральная питательная среда кондиционирована продуктами жизнедеятельности и ростовыми факторами и получена на стадиях логарифмической фазы (S-фаза клеточного цикла) и стационарной фазы (Go-фаза клеточного цикла) роста стабильной клеточной культуры мезенхимальных стволовых клеток. Экспериментально было установлено, что культуральная питательная среда в указанных фазах роста клеточной линии мезенхимальных стволовых клеток преимущественно содержит биологически-активные соединения на основе низкомолекулярных пептидов с молекулярной массой 6-8 кДа и низкомолекулярных веществ с молекулярной массой 2-3 кДа, соответствующих активным цитокинам, в количестве по меньшей мере n×10, где n - количество названных биологически активных соединений в исходной культуральной питательной среде.According to the invention, the used culture medium is conditioned by vital products and growth factors and obtained at the stages of the logarithmic phase (S-phase of the cell cycle) and the stationary phase (Go-phase of the cell cycle) of the growth of a stable cell culture of mesenchymal stem cells. It was experimentally established that the culture medium in the indicated phases of the growth of the cell line of mesenchymal stem cells mainly contains biologically active compounds based on low molecular weight peptides with a molecular weight of 6-8 kDa and low molecular weight substances with a molecular weight of 2-3 kDa corresponding to active cytokines, the amount of at least n × 10, where n is the number of these biologically active compounds in the original culture medium.

Кондиционированная среда, являющаяся одним из ингредиентов заявляемой композиции, представляет собой побочный продукт медицинской технологии получения высококачественных мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга человека. Эта технология основана на размножении в культуре при строго определенных условиях чистой популяции мезенхимальных стволовых клеток в большом количестве (100-500 млн) из малого исходного количества костного мозга (0,5-1,0 мл), получаемого при пункции грудины или подвздошной кости у пациентов любого возраста. Такое количество мезенхимальных стволовых клеток достаточно для проведения эффективной их трансплантации (локальной, внутривенной). Преимущество данной предпочтительной технологии перед другими заключается в том, что костный мозг человека является универсальным источником получения в культуре мезенхимальных стволовых клеток, которые в отличие от мезенхимальных стволовых клеток, получаемых из других источников (эмбриональные, фетальные мезенхимальные стволовые клетки), являются наиболее безопасными при их применении в медицинской практике.An air-conditioned environment, which is one of the ingredients of the claimed composition, is a by-product of medical technology for producing high-quality mesenchymal stem cells from human bone marrow. This technology is based on propagation in culture under strictly defined conditions of a pure population of mesenchymal stem cells in a large number (100-500 million) from a small initial amount of bone marrow (0.5-1.0 ml) obtained by sternum or ilium puncture patients of any age. Such a quantity of mesenchymal stem cells is sufficient to carry out their effective transplantation (local, intravenous). The advantage of this preferred technology over others is that the human bone marrow is a universal source for the production of mesenchymal stem cells in culture, which, unlike mesenchymal stem cells obtained from other sources (embryonic, fetal mesenchymal stem cells), are the safest application in medical practice.

В соответствии со сказанным, кондиционированная среда с показателями, указанными выше и пригодная для использования в заявляемой композиции для регенерации клеток кожи и слизистых оболочек, предпочтительно получена в процессе нескольких циклов культивирования ядросодержащих костномозговых клеток в питательной среде, pH которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0. При этом в процессе каждого цикла культивирования регулярно элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, и увеличивают популяцию мезенхимальных стволовых клеток до образования из нее сплошного монослоя, который обрабатывают 0,03-0,1%-ным раствором трипсина. Перед и после указанной обработки мезенхимальные стволовые клетки отмывают в изотоническом растворе от следов питательной среды и следов трипсина соответственно, при этом в процессе каждого последующего цикла культивирования используют мезенхимальные стволовые клетки предыдущего цикла культивирования. Более подробно эта технология культивирования мезенхимальных стволовых клеток описана в патенте РФ 2323252, выданном на изобретение «Способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток человека ex vivo».In accordance with the foregoing, an air-conditioned medium with the parameters indicated above and suitable for use in the claimed composition for the regeneration of skin cells and mucous membranes is preferably obtained during several cycles of cultivation of nucleated bone marrow cells in a nutrient medium, the pH of which ranges from 6.0 up to 8.0. Moreover, during each cultivation cycle, cells that are not related to the population of mesenchymal stem cells are regularly eliminated and the population of mesenchymal stem cells is increased to form a continuous monolayer from it, which is treated with a 0.03-0.1% trypsin solution. Before and after this treatment, mesenchymal stem cells are washed in isotonic solution from traces of the nutrient medium and traps of trypsin, respectively, while mesenchymal stem cells from the previous cultivation cycle are used during each subsequent cultivation cycle. In more detail, this technology for the cultivation of mesenchymal stem cells is described in RF patent 2323252, issued for the invention "Method of cultivating human mesenchymal stem cells ex vivo".

При исследовании автором настоящей заявки разработанной им медицинской технологии получения высококачественных мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга человека было выявлено, что на стадии фазы логарифмического роста клеточной линии мезенхимальных стволовых клеток (иначе говоря, фазы удваивания количества мезенхимальных стволовых клеток за определенный промежуток времени, называемый «периодом генерации») происходит интенсивное, активное синтезирование мезенхимальными стволовыми клетками биологически активных соединений, таких как ростовые факторы, низкомолекулярные пептиды, и выделение их в окружающую питательную среду. При сравнении данных, показанных на фиг.1 и на фиг.2, видно, что на стадии фазы логарифмического роста в питательной среде резко возрастает содержание фракции 4 (соответствует пептидам с молекулярной массой 6-8 кДа) и фракции 5 (соответствует веществам (активным цитокинам) с молекулярной массой 2-3 кДа).When the author of this application studied the medical technology developed by him for producing high-quality mesenchymal stem cells from human bone marrow, it was revealed that at the stage of the logarithmic growth of the mesenchymal stem cell cell line (in other words, the phase of doubling the number of mesenchymal stem cells over a certain period of time, called the “period generation ”) there is an intensive, active synthesis of biologically active compounds by mesenchymal stem cells states such as growth factors, low molecular weight peptides and isolating them into the surrounding medium. When comparing the data shown in Fig. 1 and Fig. 2, it can be seen that at the stage of the logarithmic growth phase in the nutrient medium, the content of fraction 4 (corresponding to peptides with a molecular weight of 6-8 kDa) and fraction 5 (corresponding to substances (active cytokines) with a molecular weight of 2-3 kDa).

Также активное синтезирование ростовых факторов и низкомолекулярных пептидов отмечено на стадии стационарной фазы роста клеточной линии мезенхимальных стволовых клеток (см. фиг.3).Also, the active synthesis of growth factors and low molecular weight peptides was noted at the stage of the stationary phase of growth of the mesenchymal stem cell cell line (see Fig. 3).

Полученные данные позволили использовать кондиционированную культуральную питательную среду, полученную при реализации способа, защищенного патентом РФ 2323252, на стадиях логарифмической фазы и стационарной фазы роста мезенхимальных стволовых клеток, в качестве компонента заявляемой композиции.The data obtained made it possible to use the conditioned culture medium obtained by implementing the method protected by RF patent 2323252 at the stages of the logarithmic phase and the stationary growth phase of mesenchymal stem cells as a component of the claimed composition.

Исследованиями установлено, что для эффективного стимулирования роста и регенерации клеток кожных и слизистых покровов композиция должна содержать мезенхимальные стволовые клетки в количестве по меньшей мере 10⁵ клеток/мл. Преимущественно заявляемая композиция содержит костномозговые мезенхимальные стволовые клетки человека в количестве от 10⁵ клеток/мл до 10⁶ клеток/мл.Studies have found that to effectively stimulate the growth and regeneration of skin and mucous membrane cells, the composition must contain mesenchymal stem cells in an amount of at least 10 ⁵ cells / ml. Advantageously, the claimed composition contains bone marrow mesenchymal stem cells from 10 ⁵ cells / ml to 10 ⁶ cells / ml.

Следует отметить, что при хроматографическом анализе выявлена прямая корреляция между содержанием фракций 4 и 5 (фиг.4) и числом добавленных мезенхимальных стволовых клеток в кондиционированную среду. Однако при добавлении мезенхимальных стволовых клеток в количестве свыше 10⁶ кл/мл отмечают снижение фракции 3 (альбуминов), что свидетельствует о распаде белка. В связи с этим наиболее оптимальным обогащением кондиционированной среды мезенхимальными стволовыми клетками нам представляется добавление их в концентрации от 10⁵ кл/мл до 10⁶ кл/мл.It should be noted that during chromatographic analysis, a direct correlation was revealed between the content of fractions 4 and 5 (Fig. 4) and the number of added mesenchymal stem cells to the conditioned medium. However, when adding mesenchymal stem cells in an amount of more than 10 ⁶ cells / ml, a decrease in fraction 3 (albumin) is noted, which indicates protein breakdown. In this regard, the most optimal enrichment of the conditioned medium with mesenchymal stem cells seems to us to add them at a concentration of 10 ⁵ cells / ml to 10 ⁶ cells / ml.

В процессе исследований было определено, что преимущественно заявляемая композиция содержит следующие ингредиенты, г/л: L-аргинин 0,2; L-аспарагин (безводный) 0,05; L-аспарагиновую кислоту 0,02; L-цистин 0,0652; L-глютаминовую кислоту 0,02, L-глютамин 0,3; L-глицин 0,01, L-гистидин 0,015; L-гидроксипролин 0,02; L-изолейцин 0,05; L-лейцин 0,05; L-лизин HCl 0,04, L-метионин 0,015; L-фенилаланин 0,015; L-пролин 0,02; L-серин 0,03, L-треонин 0,02; L-триптофан 0,005; L-тирозин 0,02883; L-валин 0,02; биотин 0,0002; пантотенат 0,00025; холинхлорид 0,00362; фолиевую кислоту 0,001; инозит 0,035, никотинамид 0,001; РАВА 0,001; пиридоксин солянокислый 0,001; рибофлавин 0,0002; тиамин солянокислый 0,001, витамин В12 0,000005; нитрат кальция 0,1; хлорид калия 0,4; сульфат магния 0,04884; хлорид натрия 6,0; фосфат натрия 0,8; Д-глюкоза 2,0; глютатион 0,001, феноловый красный 0,0053.In the process of research, it was determined that mainly the claimed composition contains the following ingredients, g / l: L-arginine 0.2; L-asparagine (anhydrous) 0.05; L-aspartic acid 0.02; L-cystine 0.0652; L-glutamic acid 0.02; L-glutamine 0.3; L-glycine 0.01; L-histidine 0.015; L-hydroxyproline 0.02; L-isoleucine 0.05; L-Leucine 0.05; L-lysine HCl 0.04; L-methionine 0.015; L-phenylalanine 0.015; L-Proline 0.02; L-serine 0.03; L-threonine 0.02; L-tryptophan 0.005; L-tyrosine 0.02883; L-valine 0.02; biotin 0.0002; pantothenate 0,00025; choline chloride 0.00362; folic acid 0.001; inositol 0.035, nicotinamide 0.001; RAVA 0.001; hydrochloride pyridoxine 0.001; riboflavin 0.0002; thiamine hydrochloride 0.001, vitamin B12 0.000005; calcium nitrate 0.1; potassium chloride 0.4; magnesium sulfate 0.04884; sodium chloride 6.0; sodium phosphate 0.8; D-glucose 2.0; glutathione 0.001, phenol red 0.0053.

Таким образом, как видно из вышесказанного, одним из компонентов заявляемой композиции является побочный продукт изученной медицинской клеточной технологии, что благоприятно с точки зрения медицины и этики, а также экономически привлекательно.Thus, as can be seen from the above, one of the components of the claimed composition is a by-product of the studied medical cell technology, which is favorable from the point of view of medicine and ethics, as well as economically attractive.

В соответствии с изобретением, заявляем композицию для регенерации клеток кожи и слизистых оболочек.In accordance with the invention, we declare a composition for the regeneration of skin cells and mucous membranes.

Известно, что мезенхимальные стволовые клетки в процессе культивирования секретируют ряд цитокинов (IL-6, -7, -8, -11, -12, -14, -15, -27, LIF, SCF, M-CSF)), некоторые из которых обеспечивают критические взаимодействия «клетка-клетка», ускоряя дифференцировку гемопоэтических стволовых клеток;It is known that mesenchymal stem cells secrete a number of cytokines during cultivation (IL-6, -7, -8, -11, -12, -14, -15, -27, LIF, SCF, M-CSF)), some of which provide critical cell-to-cell interactions, accelerating the differentiation of hematopoietic stem cells;

мезенхимальные стволовые клетки in vitro синтезируют различные ростовые факторы, включая фактор роста для эндотелия сосудов (VEGF), стимулирующий ангиогенез, IL-1, IL-6, TNF-, которые относятся к воспалительным цитокинам, обусловливая выраженное противовоспалительное действие мезенхимальных стволовых клеток, а также гепатоцитарный фактор роста (ГФР), который индуцирует митогенную и антиапоптогенную активность в различных системах, ускоряет заживление ран, что подтверждает активную роль мезенхимальных стволовых клеток в регенеративной медицине (в тканевой репарации). На мезенхимальные стволовые клетки костного мозга человека выявлены также рецепторы для тромбоцитарного фактора роста (PDGF), эпидермального фактора роста (EGF), нейротрофического фактора роста ((NGF), инсулиноподобного фактора роста (IGF) и др., что также расширяет возможности клинического применения мезенхимальных стволовых клеток.In vitro mesenchymal stem cells synthesize various growth factors, including vascular endothelial growth factor (VEGF), stimulating angiogenesis, IL-1, IL-6, TNF-α, which are inflammatory cytokines, causing a pronounced anti-inflammatory effect of mesenchymal stem cells, as well as hepatocytic growth factor (GHF), which induces mitogenic and anti-apoptogenic activity in various systems, accelerates wound healing, which confirms the active role of mesenchymal stem cells in regenerative medicine ( in tissue repair). Receptors for platelet-derived growth factor (PDGF), epidermal growth factor (EGF), neurotrophic growth factor ((NGF), insulin-like growth factor (IGF), etc.) have also been identified on human bone marrow mesenchymal stem cells, which also expands the clinical possibilities of mesenchymal stem cells.

Мезенхимальные стволовые клетки обладают также иммуномодулирующим эффектом, ингибируют пролиферацию Т-клеток и снижают вероятность и степень выраженности реакции трансплантата против хозяина при их совместной трансплантации с гемопоэтическими стволовыми клетками; при этом они существенно ускоряют восстановление поврежденного гемопоэза. В экспериментах по совместному культивированию разных клеток показано, что мезенхимальные стволовые клетки не подвергаются аллогенному отторжению как у людей, так и у экспериментальных животных.Mesenchymal stem cells also have an immunomodulatory effect, inhibit the proliferation of T cells and reduce the likelihood and severity of the transplant reaction against the host during their joint transplantation with hematopoietic stem cells; however, they significantly accelerate the restoration of damaged hematopoiesis. In experiments on the co-cultivation of different cells, it was shown that mesenchymal stem cells do not undergo allogeneic rejection in both humans and experimental animals.

Эти данные по соединениям, которые секретируют мезенхимальные стволовые клетки в процессе их культивирования, и названные свойства мезенхимальных стволовых клеток являлись отправной точкой при создании заявляемого продукта. В процессе исследований, как указано выше, было обнаружено, что культуральная питательная среда именно на стадиях логарифмической фазы и стационарной фазы роста клеточной линии мезенхимальных стволовых по меньшей мере на порядок (в 10 раз) обогащается различными биологически активными веществами, включая пептиды и другие низкомолекулярные вещества (цитокины), уровни которых определены хроматографически, что показано на фиг.2 и фиг.3.These data on the compounds that secrete mesenchymal stem cells during their cultivation, and the named properties of mesenchymal stem cells were the starting point for the creation of the claimed product. In the process of research, as indicated above, it was found that the culture medium at the stages of the logarithmic phase and the stationary phase of growth of the mesenchymal stem cell line is enriched with at least an order (10 times) of various biologically active substances, including peptides and other low molecular weight substances (cytokines), the levels of which are determined chromatographically, as shown in figure 2 and figure 3.

Такая среда, как показали тесты, обладает выраженным противовоспалительным и ранозаживляющим действием.Such an environment, as shown by tests, has a pronounced anti-inflammatory and wound healing effect.

Кроме того, для достижения стабильной активности кондиционированной питательной среды, описанной выше, ее дополнительно обогащают костномозговыми мезенхимальными стволовыми клетками человека в различном количестве от 10⁵ клеток/мл до 10⁶ клеток/мл, но не менее 10 клеток/мл, при этом предпочтительно использовать здоровые высокачественные клетки, полученные в соответствии с технологией, защищенной патентом РФ 2323252.In addition, to achieve the stable activity of the conditioned nutrient medium described above, it is additionally enriched with bone marrow mesenchymal stem cells of a person in various amounts from 10 ⁵ cells / ml to 10 ⁶ cells / ml, but not less than 10 cells / ml, while it is preferable to use healthy high-quality cells obtained in accordance with the technology protected by RF patent 2323252.

Разработанная новая композиция для стимулирования роста и регенерации клеток кожи и слизистых оболочек расширяет возможности клинического применения костного мозга человека, при этом она безопасна в медицинском и этическом отношениях. Как показали исследования, заявляемый продукт обладает противовоспалительным, иммуномодулирующим, выраженным ранозаживляющим, антистрессовым и адаптогенным действием; продукт способствует клеточному обновлению, стимулирует и повышает собственный потенциал клеток, усиливает выработку коллагена, укрепляет стенки сосудов, стимулирует микроциркуляцию и регенерацию тканей. Заявляемый продукт проявляет высокую эффективность при борьбе со всеми видами повреждения тканей, в том числе с трофическими, лучевыми, послеоперационными. Заявляемая композиция проявляет высокую эффективность при лечении трофических поражений кожных и слизистых покровов, развивающихся при сахарном диабете, хронической венозной недостаточности, облитерирующем эндартериите, стоматите, ожогах, заболеваниях слизистых мочеполовых путей.The developed new composition for stimulating the growth and regeneration of skin cells and mucous membranes expands the clinical use of human bone marrow, while it is safe in medical and ethical terms. As studies have shown, the claimed product has anti-inflammatory, immunomodulatory, pronounced wound healing, anti-stress and adaptogenic effects; the product promotes cell renewal, stimulates and increases the cell’s own potential, enhances collagen production, strengthens the walls of blood vessels, stimulates microcirculation and tissue regeneration. The inventive product is highly effective in the fight against all types of tissue damage, including trophic, radiation, postoperative. The claimed composition is highly effective in the treatment of trophic lesions of the skin and mucous membranes, developing with diabetes mellitus, chronic venous insufficiency, obliterating endarteritis, stomatitis, burns, diseases of the urinary tract mucous membranes.

ПРИМЕР 1EXAMPLE 1

Забор аутологичных клеток костного мозга проводят под местной анестезией в условиях операционной путем пункции гребня подвздошной кости донора в количестве 1,0 мл.Autologous bone marrow cells are harvested under local anesthesia under operating conditions by puncture of the donor iliac crest in an amount of 1.0 ml.

Пунктат костного мозга помещают в пробирку с гепарином (100 ЕД/мл пунктата).Bone marrow punctate was placed in a test tube with heparin (100 U / ml punctate).

После отстаивания эритроцитов в течение 1 часа при комнатной температуре супернатант отсасывают пастеровской пипеткой, выделенные клетки отмывают, центрифугируют с последующим суспендированием осадка в ростовой среде RPMI-1640 ("Sigma", USA), содержащей пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 mM ("Sigma", USA), 15% эмбриональной телячьей сыворотки ("Sigma", USA) и низкомолекулярные пептиды.After erythrocyte sedimentation is maintained for 1 hour at room temperature, the supernatant is sucked off with a Pasteur pipette, the isolated cells are washed, centrifuged, followed by suspension of the pellet in growth medium RPMI-1640 (Sigma, USA) containing penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 μg / ml), amphotericin (100 ng / ml), L-glutamine 2 mM (Sigma, USA), 15% fetal calf serum (Sigma, USA) and low molecular weight peptides.

Далее подсчитывают число ядросодержащих клеток костного мозга в суспензии с последующим разбавлением ростовой средой до концентрации, при которой в 1 мл ростовой среды количество ядросодержащих клеток составляет (1-2)×10⁶.Next, the number of nucleated bone marrow cells in suspension is calculated, followed by dilution with growth medium to a concentration at which the amount of nucleated cells in 1 ml of growth medium is (1-2) × 10 ⁶ .

Осуществляют первый цикл культивирования. Для этого в пластиковый флакон Карреля ("Sigma", USA) с площадью дна 25 см² высевают взятые в виде суспензии выделенные клетки костного мозга из расчета 5×10³ клеток на 1 кв.см дна пластикового флакона.The first cultivation cycle is carried out. To do this, in a plastic bottle of Carrel (Sigma, USA) with a bottom area of 25 cm ^{2, the} selected bone marrow cells taken as a suspension are seeded at the rate of 5 × 10 ³ cells per 1 cm ^{2 of the} bottom of the plastic bottle.

Культивирование проводят в атмосфере газовой смеси, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха, при 37°C.Cultivation is carried out in an atmosphere of a gas mixture containing 5% carbon dioxide and 95% air, at 37 ° C.

В процессе культивирования регулярно определяют pH питательной среды. Регистрируют изменение pH среды до значения не менее 6,0.In the process of cultivation regularly determine the pH of the nutrient medium. Record the change in pH of the medium to a value of at least 6.0.

Осуществляют удаление такой питательной среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления загрязненной среды вводят свежую питательную среду, pH которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.This nutrient medium is removed, while cells that are not related to the mesenchymal stem cell population are eliminated, and a fresh nutrient medium is introduced into the Karrel plastic bottle immediately after removal of the contaminated medium, the pH of which ranges from 6.0 to 8.0.

По истечении 5 суток культивирования регистрируют изменение pH среды до значения не менее 6,0.After 5 days of cultivation, a change in the pH of the medium to a value of at least 6.0 is recorded.

Осуществляют удаление такой питательной среды, при этом элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток, а в пластиковый флакон Карреля сразу после удаления среды с продуктами метаболизма клеток вводят свежую питательную среду, pH которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0.This nutrient medium is removed, while cells that are not related to the population of mesenchymal stem cells are eliminated, and a fresh nutrient medium is introduced into the Karrel plastic bottle immediately after removal of the medium with the products of cell metabolism, the pH of which ranges from 6.0 to 8.0 .

После введения в пластиковый флакон Карреля свежей питательной среды осуществляют продувание флакона газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха.After introducing fresh nutrient medium into the Carrel plastic bottle, the bottle is blown with a gas mixture containing 5% carbon dioxide and 95% air.

По истечении 6 суток культивирования регистрируют изменение pH среды до значения не менее 6,0.After 6 days of cultivation, a change in the pH of the medium to a value of at least 6.0 is recorded.

На 10-й день после образования на дне пластикового флакона Карреля сплошного монослоя мезенхимальных стволовых клеток, покрывающего полностью дно флакона, проводят подготовку для перенесения выращенной популяции клеток во флакон с большей площадью дна. Для этого сначала проводят удаление из пластикового флакона Карреля собственно питательной среды, затем монослой мезенхимальных стволовых клеток промывают в физиологическом растворе и удаляют следы питательной среды. После этого в пластиковый флакон Карреля вводят 0,03%-ный раствор трипсина и отделяют выращенную в виде монослоя клеточную популяцию от дна флакона.On the 10th day after the formation of a continuous monolayer of mesenchymal stem cells at the bottom of the Carrel plastic vial covering the entire bottom of the vial, preparations are made to transfer the grown cell population to a vial with a larger bottom area. To do this, first, the nutrient medium itself is removed from the Carrel plastic bottle, then the monolayer of mesenchymal stem cells is washed in physiological saline and traces of the nutrient medium are removed. After that, a 0.03% trypsin solution is introduced into the Carrel plastic bottle and the cell population grown as a monolayer is separated from the bottom of the bottle.

Затем раствор трипсина удаляют и вводят в пластиковый флакон Карреля раствор Хэнкса, содержащий 5% эмбриональной телячьей сыворотки, при этом инактивируют следы трипсина и исключают пролонгирование его действия и, значит, повреждение клеток.Then the trypsin solution is removed and Hanks solution containing 5% fetal calf serum is introduced into the plastic bottle of Carrel, while traces of trypsin are inactivated and the prolongation of its action and, therefore, cell damage are excluded.

В аналогичном растворе Хэнкса мезенхимальные стволовые клетки снимают со дна пластикового флакона Карреля, подвергают центрифугированию при 1000 об/мин в течение 10 мин, при этом удаляют раствор Хэнкса, и суспендируют в питательной среде RPMI-1640 ("Sigma", USA).In a similar Hanks solution, mesenchymal stem cells are removed from the bottom of a Carrel plastic vial, centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes, the Hanks solution is removed and suspended in RPMI-1640 growth medium (Sigma, USA).

Далее осуществляют второй, третий и четвертый циклы культивирования. В каждом цикле культивирования используют флаконы Карреля, суммарная площадь дна которых превосходит суммарную площадь дна флаконов Карреля, используемых на предыдущем цикле культивирования. В каждый флакон Карреля последующего цикла высевают взятые в виде суспензии в указанной питательной среде мезенхимальные стволовые клетки, полученные и выделенные в процессе предыдущего цикла культивирования.Next, carry out the second, third and fourth cycles of cultivation. In each cultivation cycle, Carrel bottles are used, the total bottom area of which exceeds the total bottom area of the Carrel bottles used in the previous cultivation cycle. In each Carrel vial of the subsequent cycle, mesenchymal stem cells taken in the form of a suspension in the indicated nutrient medium are obtained and obtained during the previous culture cycle.

При этом посев осуществляют с плотностью 10³-10⁴ мезенхимальных стволовых клеток на 1 кв.см дна флакона Карреля.In this case, sowing is carried out with a density of 10 ³ -10 ⁴ mesenchymal stem cells per 1 cm 2 of the bottom of the Carrel vial.

Каждый цикл культивирования осуществляют примерно 10 дней до получения заданного количества мезенхимальных стволовых клеток в виде чистой популяции.Each cultivation cycle is carried out for approximately 10 days until a given number of mesenchymal stem cells is obtained in the form of a pure population.

Необходимое для трансплантации количество клеток порядка (2-5)×10⁸ выращено за 40 суток культивирования.The number of cells required for transplantation of the order of (2-5) × 10 ^{8 was} grown in 40 days of cultivation.

При этом среды, удаляемые как на стадии логарифмической фазы (до формирования сплошного монослоя мезенхимальных стволовых клеток), так и на стадии стационарной фазы (после формирования сплошного монослоя мезенхимальных стволовых клеток) собирают в стерильную посуду, объединяют и используют для исследования и лечения.At the same time, the media removed both at the stage of the logarithmic phase (before the formation of a continuous monolayer of mesenchymal stem cells) and at the stage of the stationary phase (after the formation of a continuous monolayer of mesenchymal stem cells) are collected in sterile dishes, combined and used for research and treatment.

Собранную на стадиях логарифмической фазы и стационарной фазы роста культуральную питательную среду, кондиционированную продуктами жизнедеятельности и ростовыми факторами мезенхимальных стволовых клеток, подвергают анализу. Анализы молекулярно-массового распределения в образце собранной кондиционированной среды и в образце исходной питательной среды, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, проведены методом ВЭЖХ (гель-фильтрации) на колонке TSK-gel 7,5×66 мм, подвижная фаза 0,2 М K₂HPO₄, pH 6,8 с 0,01% азидом натрия. Скорость потока 1 мл/мин. На уравновешенную буфером колонку наносили по 20 мкл образцов, предварительно разбавленных буфером в 10 раз. Регистрацию проводили по измерению оптической плотности при 280 нм. Результаты анализов показаны на фиг.1, 2, 3 и фиг.4, где фракция 4 соответствует низкомолекулярным пептидам (мол. масса 6-8 кДа), фракция 5 соответствует низкомолекулярным веществамам (мол. масса 2-3 кДа) - наблюдают значительное, не менее чем в 10 раз увеличение относительного содержания фракции 4 и фракции 5.The culture medium collected at the stages of the logarithmic phase and the stationary phase of growth, conditioned by vital products and growth factors of mesenchymal stem cells, is analyzed. Molecular mass distribution analyzes in the sample of the collected conditioned medium and in the sample of the initial nutrient medium containing 10% fetal calf serum were performed by HPLC (gel filtration) on a TSK-gel column 7.5 × 66 mm, mobile phase 0.2 M K ₂ HPO ₄ , pH 6.8 with 0.01% sodium azide. Flow rate 1 ml / min. 20 μl of samples preliminarily diluted with buffer 10 times were applied to a column equilibrated with buffer. Registration was carried out by measuring the optical density at 280 nm. The analysis results are shown in figures 1, 2, 3 and figure 4, where fraction 4 corresponds to low molecular weight peptides (mol. Mass of 6-8 kDa), fraction 5 corresponds to low molecular weight substances (mol. Mass of 2-3 kDa) - a significant not less than 10 times an increase in the relative content of fraction 4 and fraction 5.

Пример 2 (эксперимент)Example 2 (experiment)

Термический ожог кожи моделировали на 20 крысах-самцах популяции Wistar, массой 180-220 г. Площадь ожоговой раны составляла 12 см².A thermal skin burn was modeled on 20 male rats of the Wistar population, weighing 180-220 g. The area of the burn wound was 12 cm ² .

При проведении эксперимента животные были разделены на 2 группы по 10 животных: 1) крысы с глубоким термическим ожогом III-Б степени и применение заявленной композиции (опыт); 2) крысы с глубоким термическим ожогом III-Б без применения раневого покрытия с использованием только сухой асептической повязки (контроль).During the experiment, the animals were divided into 2 groups of 10 animals: 1) rats with a deep thermal burn of III-B degree and the use of the claimed composition (experiment); 2) rats with a deep thermal burn III-B without the use of wound dressing using only dry aseptic dressings (control).

На 2-й день после механического удаления струпа и стандартного туалета ожеговых ран на ожоговую поверхность животных опытной группы наносили покрытие, смоченное композицией, содержащей культуральную питательную среду, кондиционированную продуктами жизнедеятельности и ростовыми факторами мезенхимальных стволовых клеток, полученную на стадиях логарифмической фазы и стационарной фазы роста клеточной линии мезенхимальных стволовых клеток, и мезенхимальные стволовые клетки в количестве 10^-5 клеток/мл, полученные в примере 1.On the 2nd day after mechanical removal of the scab and standard toilet of the burn wounds on the burn surface of the animals of the experimental group, a coating moistened with a composition containing a culture medium, conditioned with vital products and growth factors of mesenchymal stem cells obtained at the stages of the logarithmic phase and stationary growth phase cell line mesenchymal stem cells, and mesenchymal stem cells in the amount of 10 ^-5 cells / ml obtained in example 1.

Для животных группы контроля использовали асептическую марлевую повязку, смачивали ее в стерильном физиологическом растворе и наносили на ожоговую поверхность.For animals of the control group, an aseptic gauze dressing was used, it was moistened in sterile saline and applied to the burn surface.

Клиническую оценку результатов производили на основе динамического визуального, планиметрического контроля состояния ожоговой поверхности.Clinical evaluation of the results was carried out on the basis of dynamic visual, planimetric control of the state of the burn surface.

Сроки анализа репарации ожоговой поверхности составляли 3, 7, 13, 16 и 30 суток с момента травмы.The terms of the analysis of the repair of the burn surface were 3, 7, 13, 16 and 30 days from the moment of injury.

Результаты анализа планиметрического исследования показали, что при использовании заявляемой композиции происходит существенное ускорение процессов заживления, что отражается в сроках полного восстановления кожи. Применение при обширной глубокой ожоговой ране III-Б приводит к формированию прочного раневого струпа, играющего роль наружного барьера, препятствующего суперинфицированию дефектной поверхности. Имеющая место микробная флора мало активизирована. Собственно раневая ожоговая поверхность уже в ранние сроки не содержит микробной флоры. Имеет место в сроки 15-20 дней после аппликации раневого покрытия на раны активное формирование краевой пролиферативной реакции эпидермиса, на дне раны формируется слой зрелой и незрелой соединительной ткани, образуется морфологический субстрат будущей тканевой подложки для появления элементов дермы. Активное формирование элементов дермы начинается после 20 суток лечения, имеет место хорошая фибробластная реакция, способная формировать и закрывать дно раны слоем молодой соединительной ткани. В поздние сроки лечения появляется морфологическая волокнисто-клеточная структура, способная сформировать дермальный слой кожи. При использовании для закрытия ожоговой поверхности раневых покрытий очевидна более ранняя реакция продуктивного воспаления как по краям ожогового дефекта кожи, так и в центре обширного ожога, вся поверхность ожогового дефекта выстлана послойно молодой и зрелой грануляционной тканью, содержащей множество вновь образованных микрососудов. Деградация раневого покрытия начинается с 20-х суток. Характерной особенностью является быстрое формирование дермального слоя кожи, содержащего необходимое клеточное микроокружение.The results of the analysis of a planimetric study showed that when using the inventive composition, a significant acceleration of the healing process occurs, which is reflected in the timing of complete skin recovery. The use of III-B with an extensive deep burn wound leads to the formation of a durable wound scab, which plays the role of an external barrier that prevents the superinfection of a defective surface. The microbial flora taking place is slightly activated. Actually, the wound burn surface already in the early stages does not contain microbial flora. The formation of an edge proliferative reaction of the epidermis takes place within 15-20 days after the application of wound dressing on wounds, a layer of mature and immature connective tissue forms at the bottom of the wound, a morphological substrate of the future tissue substrate is formed for the appearance of dermal elements. Active formation of the elements of the dermis begins after 20 days of treatment, there is a good fibroblast reaction that can form and close the bottom of the wound with a layer of young connective tissue. In the later stages of treatment, a morphological fiber-cell structure appears that is able to form the dermal layer of the skin. When using wound dressings to close the burn surface, an earlier reaction of productive inflammation is evident both at the edges of the skin burn defect and in the center of the extensive burn, the entire surface of the burn defect is lined with layer-by-layer young and mature granulation tissue containing many newly formed microvessels. The degradation of wound dressing begins from the 20th day. A characteristic feature is the rapid formation of the dermal layer of the skin containing the necessary cellular microenvironment.

Таким образом, применение композиции для лечения глубокого ожога III-Б степени существенно ускоряет процесс заживления, создавая благоприятные условия для полноценного восстановления дермального слоя кожи.Thus, the use of the composition for the treatment of a deep burn of the III-B degree significantly speeds up the healing process, creating favorable conditions for the full restoration of the dermal layer of the skin.

Пример 3 (клинический)Example 3 (clinical)

Больная М., 11 лет, находилась на лечении в ожоговом отделении с диагнозом: ожог пламенем 2%, II-III-A степени правой голени.Patient M., 11 years old, was treated in the burn department with a diagnosis of 2% flame burn, II-III-A degree of the right lower leg.

Первая помощь не оказывалась. В стационар поступила через 7 часов после травмы.First aid was not provided. She was admitted to the hospital 7 hours after the injury.

При первичном осмотре пациентка предъявляла жалобы на резко выраженную боль в области ожоговой раны. На передней поверхности правой голени имелась ожоговая рана с отслоенным эпидермисом, обнаженная дерма преимущественно розового цвета с небольшими участками белого цвета. Кожа вокруг раны гиперемирована и отечна. Примерно 80% раневой поверхности составляет ожог II степени, остальная часть - III-А степени.At the initial examination, the patient complained of pronounced pain in the burn wound. On the front surface of the right lower leg there was a burn wound with exfoliated epidermis, the exposed dermis is predominantly pink in color with small patches of white. The skin around the wound is hyperemic and swollen. Approximately 80% of the wound surface is a burn of the II degree, the rest - III-A degree.

Выполнен первичный туалет ожоговых поверхностей - на раневые поверхности наложены повязки с композицией, аналогичной полученной в примере 1 (содержание мезенхимальных стволовых клеток составляет 10⁵ клеток/мл).The primary toilet of burn surfaces was made — dressings with a composition similar to that obtained in Example 1 (the content of mesenchymal stem cells was 10 ⁵ cells / ml) were applied to the wound surfaces.

В клиническом анализе крови при поступлении лейкоцитоз (11,7·10⁹/л), остальные показатели в норме. Клинический анализ мочи без особенностей. В первичном посеве из раны роста какой-либо микрофлоры не обнаружено. Показатели неспецифической резистентности были также в пределах нормы.In the clinical analysis of blood upon receipt of leukocytosis (11.7 · 10 ⁹ / l), the remaining indicators are normal. Clinical analysis of urine without features. No microflora was found in the initial seeding from the growth wound. Non-specific resistance indicators were also within normal limits.

Больной ежедневно производили смену повязок с названной композицией (всего 7 процедур).The patient was daily changed dressings with the named composition (a total of 7 procedures).

После первых двух процедур отмечено уменьшение болевого синдрома и отека, также снижение гиперемии прилежащих тканей. После 7 сеансов показатели неспецифической резистентности были в пределах нормы. В ранах интенсивно шли процессы эпителизации.After the first two procedures, a decrease in pain and edema was noted, as well as a decrease in hyperemia of adjacent tissues. After 7 sessions, nonspecific resistance indicators were within normal limits. In the wounds, the processes of epithelization went on intensively.

Пример 4Example 4

Больной О., 9 лет, находился на лечении в ожоговом отделении с диагнозом: ожог горячей водой 5%, II-III-A степени стоп, голеней.Patient O., 9 years old, was treated in the burn department with a diagnosis of a burn with hot water 5%, II-III-A degree of feet, legs.

Первая помощь не оказывалась. В стационар поступил через 7 часов после травмы.First aid was not provided. He was admitted to the hospital 7 hours after the injury.

При первичном осмотре пациент предъявлял жалобы на резко выраженную боль в области ожоговой раны. В области нижней трети обеих голеней, на тыльной и боковой поверхностях обеих стоп имеется ожоговая рана с бледно-розовым дном, обильным серозным отделяемым, остатками эпидермальных пузырей. Кожа вокруг раны гиперемирована и отечна.At the initial examination, the patient complained of pronounced pain in the burn wound. In the region of the lower third of both legs, on the back and side surfaces of both feet, there is a burn wound with a pale pink bottom, copious serous discharge, and the remains of epidermal blisters. The skin around the wound is hyperemic and swollen.

На раневые поверхности наложены повязки с композицией, аналогичной полученной в примере 1 (содержание мезенхимальных стволовых клеток составляет 10⁵ клеток/мл. Больному ежедневно производили смену повязок (всего 10 процедур).Dressings were applied on the wound surfaces with a composition similar to that obtained in Example 1 (the content of mesenchymal stem cells was 10 ⁵ cells / ml. The patient was changed daily dressings (10 procedures in total).

После первых двух процедур отмечено уменьшение болевого синдрома и хорошая переносимость данной процедуры. Исчезли отек и гиперемия прилежащих тканей.After the first two procedures, a decrease in pain and a good tolerance of this procedure were noted. Swelling and hyperemia of adjacent tissues disappeared.

Болевой синдром при выписке на 12-е сутки ребенок оценил как незначительный.Pain on discharge on the 12th day the child rated as insignificant.

После 10 сеансов в ранах наблюдают интенсивные процессы эпителизации. Таким образом, после проведения лечения с применением 10 процедур у пациента отмечалось практически полное выздоровление с купированием болевого синдрома.After 10 sessions in the wounds, intense processes of epithelization are observed. Thus, after treatment using 10 procedures, the patient experienced almost complete recovery with relief of pain.

Пример 5Example 5

Больной Р., 28 лет, с обширными пролежнями пояснично-крестовой области и тазобедренных суставов.Patient R., 28 years old, with extensive bedsores of the lumbosacral region and the hip joints.

На фоне общей антибактериальной и дезонтоксикационной терапии 1 раз в сутки проводили смазывание пролежней композицией, аналогичной полученной в примере 1 (содержание мезенхимальных стволовых клеток составляет 10⁶ клеток/мл).Against the background of general antibacterial and detoxification therapy, once a day lubrication was performed with pressure sores with a composition similar to that obtained in Example 1 (the content of mesenchymal stem cells was 10 ⁶ cells / ml).

Полное очищение и эпителизация наступили на 7-8 сутки.Complete cleansing and epithelization occurred on the 7-8th day.

Пример 6Example 6

Больная К., 60 лет. Диагноз: сахарный диабет, 2-й тип, тяжелая форма. Синдром диабетической стопы. Флегмона тыла правой стопы.Patient K., 60 years old. Diagnosis: diabetes mellitus, type 2, severe. Diabetic foot syndrome. Phlegmon of the rear of the right foot.

В день поступления произведено вскрытие и дренирование флегмоны, некрэктомия. В послеоперационном периоде рана ежедневно перевязывалась с использованием композиции, аналогичной полученной в примере 1 (содержание мезенхимальных стволовых клеток составляет 10⁶ клеток/мл).On the day of admission, autopsy and drainage of phlegmon, necrectomy was performed. In the postoperative period, the wound was ligated daily using a composition similar to that obtained in example 1 (the content of mesenchymal stem cells is 10 ⁶ cells / ml).

Рана очистилась на 3-и сутки от начала лечения. Полное заживление наступило на 12-13-е сутки.The wound cleared on the 3rd day from the start of treatment. Complete healing occurred on the 12-13th day.

Пример 7Example 7

Больной И., 27 лет, прооперирован но поводу абсцесса предплечья. После оперативного вмешательства в течение 7 суток на раневую поверхность наносили композицию, аналогичной полученной в примере 1 (содержание мезенхимальных стволовых клеток составляет 10⁵ клеток/мл).Patient I., 27 years old, was operated on for a forearm abscess. After surgery for 7 days, a composition similar to that obtained in Example 1 was applied to the wound surface (the content of mesenchymal stem cells was 10 ⁵ cells / ml).

На седьмые сутки произошло полное заживление раневой поверхности.On the seventh day there was a complete healing of the wound surface.

Пример 8Example 8

Больной С., 30 лет. Диагноз: карбункул межлопаточной области.Patient S., 30 years old. Diagnosis: carbuncle of the interscapular region.

После предварительной предоперационной подготовки больному под внутривенным наркозом произведено иссечение карбункула спины, в первой фазе раневого процесса рана перевязывалась ежедневно композицией, аналогичной полученной в примере 1 (содержание мезенхимальных стволовых клеток составляет 10⁶ клеток/мл.After preliminary preoperative preparation, the patient underwent intravenous anesthesia excision of the back carbuncle, in the first phase of the wound process, the wound was ligated daily with a composition similar to that obtained in Example 1 (the content of mesenchymal stem cells was 10 ⁶ cells / ml.

Полное очищение раны наступило на 2-3 сутки от начала лечения.Complete wound cleansing occurred on 2-3 days from the start of treatment.

Пример 9Example 9

Больной С., 72 года, находился на стационарном лечении с диагнозом: трофическая язва нижней трети левой голени на фоне сахарною диабета. При местном применении композиции, аналогичной полученной в примере 1 (содержание мезенхимальных стволовых клеток составляет 10⁶ клеток/мл; в течение трех дней уменьшилась отечность, появились свежие грануляции, уменьшилась болезненность. Произошла полная эпителизация раневой поверхности на 12-е сутки.Patient S., 72 years old, was hospitalized with a diagnosis of trophic ulcer of the lower third of the left lower leg against diabetes mellitus. With topical application of a composition similar to that obtained in example 1 (the content of mesenchymal stem cells is 10 ⁶ cells / ml; swelling decreased within three days, fresh granulations appeared, and soreness decreased. There was complete epithelization of the wound surface on the 12th day.

Таким образом, предлагаемая композиция для регенерации кожи и слизистых оболочек обладает выраженным противовоспалительным и ранозаживляющим лечебным эффектом и может быть использована в медицинской практике для лечения трофических поражений кожи и слизистых, развивающихся при различных заболеваниях, например, таких как сахарный диабет, хроническая венозная недостаточность, облитерирующий эндартериит, пролежни, стоматит, ожоги, заболевания слизистых мочеполовых путей.Thus, the proposed composition for the regeneration of the skin and mucous membranes has a pronounced anti-inflammatory and wound healing therapeutic effect and can be used in medical practice for the treatment of trophic lesions of the skin and mucous membranes that develop in various diseases, such as diabetes mellitus, chronic venous insufficiency, obliterating endarteritis, bedsores, stomatitis, burns, diseases of the mucous urogenital tract.

Claims

1. Composition for the regeneration of the skin and mucous membranes, including a cultural nutrient medium, including biologically active compounds based on low molecular weight peptides and cytokines, used for in vitro cultivation of eukaryotic cells, and conditioned with vital products and growth factors of eukaryotic cells secreted by them into the nutrient medium in the process of their cultivation, characterized in that the composition further comprises bone marrow mesenchymal stem cells in the amount of at least 10 ⁵ cells / ml, and as a conditioned medium, it contains a culture nutrient medium conditioned with vital products and growth factors of mesenchymal stem cells obtained at the stages of the logarithmic phase and stationary growth phase of a stable mesenchymal stem cell culture containing biologically active compounds based on low molecular weight peptides with a molecular weight of 6-8 kDa and low molecular weight substances with a molecular weight of 2-3 kDa, respectively active cytokines, in an amount of at least n · 10, where n is the number of these biologically active compounds in the original culture medium.

2. The composition for the regeneration of the skin and mucous membranes according to claim 1, characterized in that it contains mainly bone marrow mesenchymal stem cells from 10 ³ cells / ml to 10 ⁶ cells / ml.

3. The composition for the regeneration of the skin and mucous membranes according to claim 1, characterized in that it mainly contains the following ingredients, g / l: L-arginine 0.2; L-asparagine (anhydrous) 0.05; L-aspartic acid 0.02; L-cystine 0.0652; L-glutamic acid 0.02; L-glutamine 0.3; L-glycine 0.01; L-histidine 0.015; L-hydroxyproline 0.02; L-isoleucine 0.05; L-Leucine 0.05; L-lysine HCl 0.04; L-methionine 0.015; L-phenylalanine 0.015; L-Proline 0.02; L-serine 0.03; L-threonine 0.02; L-tryptophan 0.005; L-tyrosine 0.02883; L-valine 0.02; biotin 0.0002; pantothenate 0,00025; choline chloride 0.00362; folic acid 0.001; inositol 0.035; nicotinamide 0.001; RAVA 0.001; hydrochloride pyridoxine 0.001; riboflavin 0.0002; thiamine hydrochloride 0.001; Vitamin B12 0.000005; calcium nitrate 0.1; potassium chloride 0.4; magnesium sulfate 0.04884; sodium chloride 6.0; sodium phosphate 0.8; D-glucose 2.0; glutathione 0.001; phenol red 0.0053.