RU2453849C1 - Способ определения метаболитов углеводного обмена в биологических тканях - Google Patents
Способ определения метаболитов углеводного обмена в биологических тканях Download PDFInfo
- Publication number
- RU2453849C1 RU2453849C1 RU2011109275/15A RU2011109275A RU2453849C1 RU 2453849 C1 RU2453849 C1 RU 2453849C1 RU 2011109275/15 A RU2011109275/15 A RU 2011109275/15A RU 2011109275 A RU2011109275 A RU 2011109275A RU 2453849 C1 RU2453849 C1 RU 2453849C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- acetone
- metabolites
- tissue
- liquid level
- piece
- Prior art date
Links
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 title claims abstract description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 11
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 claims abstract description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 9
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229910052573 porcelain Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 4
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims abstract 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract 2
- 230000023852 carbohydrate metabolic process Effects 0.000 claims description 9
- 235000021256 carbohydrate metabolism Nutrition 0.000 claims description 9
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000003517 fume Substances 0.000 claims description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 2
- 241000237074 Centris Species 0.000 claims 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 abstract description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 abstract description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 abstract 1
- 229960004319 trichloroacetic acid Drugs 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 15
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 8
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 7
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 7
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 7
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 2
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- KVZLHPXEUGJPAH-UHFFFAOYSA-N 2-oxidanylpropanoic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O.CC(O)C(O)=O KVZLHPXEUGJPAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 239000006004 Quartz sand Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000570 acute poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000002966 varnish Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения метаболитов углеводного обмена в биологических тканях. Для этого каждый кусочек биологической ткани перед исследованием помещают в отдельный флакон с плотно закрывающейся пробкой. Заливают ацетон в соотношении не менее 1:5, выдерживают в течение от 3-х суток и более. Далее достают кусочек ткани, проводят измерение объема ацетона и массы куска биологической ткани. Затем отбирают часть ацетона в фарфоровый тигель. Проводят испарение ацетона в вытяжном шкафу, после этого добавляют такое же количество дистиллированной воды. Тщательно перемешивают и определяют метаболиты углеводного обмена ферментными методами. Далее берут навеску ткани, гомогенизируют в 8% растворе трихлоруксусной кислоты. Гомогенизат сливают в мерные центрифужные пробирки, отмечают уровень жидкости, проводят гидролиз в течение 30 мин, при этом весь гликоген подвергают гидролизу до глюкозы, центрифугируют. Нейтрализуют 10% раствором NaOH до рН 7-8, доводят уровень жидкости до метки, центрифугируют. Определяют в надосадочной жидкости метаболиты углеводного обмена ферментными методами. Изобретение обеспечивает определение ряда метаболитов углеводного обмена в одной пробе биологического материала, возможность исследования объектов в течение длительного периода после забора материала. 1 пр.
Description
Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для изучения количественного определения метаболитов углеводного обмена (гликогена, глюкозы, лактата) в биологических тканях (печени, скелетной и сердечной мышцах) трупов человека и животных для изучения метаболизма углеводов в организме и дальнейшей диагностики патологических состояний и причины смерти.
Известен способ определения метаболитов углеводного обмена (гликогена, глюкозы, молочной кислоты) в биологических тканях (печени, миокарде, скелетной мышце): "Судебно-медицинская оценка некоторых показателей углеводного обмена при смерти от острого отравления этиловым алкоголем и ишемической болезни сердца: Метод. рекоменд. / №583/01-02 бюро главн. суд.-мед. эксперт. М., 1994. 28 с.", заключающийся в том, что исследуют свежие биологические ткани, определение суммарного содержания глюкозы и гликогена проводят по методу Kemp, Kits van Heijningen, определение лактата (молочной кислоты) колориметрическим методом с параоксифенилом по Н.И.Мешковой и С.Е.Северину.
Недостатки известного способа.
Способ рассчитан на проведение анализа в первые сутки после взятия объектов исследования (в течение нескольких часов). Для практических целей необходим больший срок. В постмортальном периоде даже при хранении образцов в холодильнике происходит изменение показателей углеводного обмена, поэтому рекомендуется замораживать объекты исследования до момента исследования. Транспортировка объектов исследования в данных условиях представляет определенные трудности. Способ позволяет определять отдельно суммарное содержание глюкозы и гликогена в тканях и отдельно содержание лактата, то есть используются две пробы биологического материла. Способ не позволяет определять раздельное содержание глюкозы и гликогена. Используются неспецифические химические методы определения метаболитов углеводного обмена, результаты которых недостоверны.
Технический результат: определение ряда метаболитов углеводного обмена в одной пробе биологического материала, возможность исследования объектов в течение длительного периода после забора материала - количественный результат не зависит от длительности периода между забором объекта и проведением лабораторного исследования.
Указанные задачи достигаются путем предварительного фиксирования биологического материала в ацетоне с последующей пробоподготовкой и определением метаболитов углеводного обмена в фиксаторе (в ацетоне), при этом исследуют содержание метаболитов в межтканевой жидкости и самой ткани высокоспецифичными ферментными методами.
Способ осуществляют следующим образом: биологические ткани, например части печени, скелетной мышцы, миокарда и др. массой около 0,5-2,0 г, помещают в отдельные стеклянные или пластиковые флаконы с плотно закрывающимися пробками, заливают ацетоном для фиксирования объектов в объемном соотношении не менее 1:5. Исследования проводят через трое и более суток (для более полной фиксации).
Из флаконов аккуратно извлекают кусочки тканей, помещают на фильтровальную бумагу. Проводят измерение количества фиксатора (в мл). В предварительно маркированные фарфоровые тигли вносят фиксатор (по 0,5-1,0 мл) и проводят испарение в вытяжном шкафу. Для ускорения процесса используют электрический фен. Далее в тигли вносят соответствующий объем дистиллированной воды (0,5-1,0 мл) и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. В полученном растворе определяют метаболиты углеводного обмена ферментными методами.
Кусочки тканей освобождают на фильтровальной бумаге от остатка фиксатора в вытяжном шкафу, помещают в термостат (37°C) на 10-15 мин, проводят взвешивание. Навески тканей растирают с небольшим количеством кварцевого песка в фарфоровых ступках с добавлением 8% раствора трихлоруксусной кислоты. Гомогенизат сливают в мерные центрифужные пробирки. Отмечают уровень жидкости. Пробирки, прикрытые резиновыми пробками, ставят в термоблок или на кипящую водяную баню на 30 минут (при этом весь гликоген подвергают гидролизу до глюкозы). После охлаждения центрифугируют 10 минут при 1600 g. Нейтрализуют до рН 7-8 10% NaOH и доводят уровень жидкости до метки дистиллированной водой. Вновь центрифугируют 15 минут при вышеуказанных условиях. В надосадочной жидкости определяют содержание метаболитов углеводного обмена ферментными методами.
Количественное определение глюкозы проводят стандартным унифицированным глюкозооксидазным методом [Балаховский И.С.в кн. «Лабораторные исследования в клинике» под ред. Меньшикова В.В., 1987 г., с.230-234] (набор реагентов «Фотоглюкоза» фирмы «Импакт» - Москва). Количественное определение молочной кислоты (лактата) проводят энзиматическим колоримертическим методом (набор реагентов "Lactic Acid" фирмы "Vital Diagnostics SPb" - Санкт-Петербург).
Расчет проводят по формуле:
С - концентрация метаболита в образце (мкмоль/г);
DОП - оптическая плотность образца при исследуемой длине волны;
DCT - оптическая плотность стандартного раствора исследуемого вещества;
CCT - концентрация стандартного раствора (ммоль/л);
М - масса фиксированного объекта или навески (г);
V - объем раствора (мл), в котором гомогенизировали ткань или объем фиксатора (мл);
Р - коэффициент дополнительного разведения.
Пример
Определение метаболитов углеводного обмена в фиксаторе позволяет выявлять их количественное содержание в межтканевой жидкости, а в фиксированной ткани - в самой ткани.
Определение количественного содержания глюкозы в фиксаторе (ацетоне): Сст=1,25 ммоль/л; Dст=0,408
| Объект исследования | М (г) | V (мл) | Р | D | С (мкмоль/г) |
| Печень | 0,86 | 7,2 | 3 | 0,562 | 43,3 |
| Скелетная мышца | 0,55 | 7,1 | - | 0,087 | 3,4 |
| Миокард | 0,61 | 7,9 | - | 0,309 | 12,3 |
Определение количественного содержания лактата в фиксаторе (ацетоне): Сст=3,33 ммоль/л; Dст=0,369
| Объект исследования | М (г) | V (мл) | Р | D | С (мкмоль/г) |
| Печень | 0,86 | 7,2 | - | 0,244 | 18,4 |
| Скелетная мышца | 0,66 | 7,1 | - | 0,134 | 15,6 |
| Миокард | 0,61 | 7,9 | 3 | 0,180 | 63,1 |
Определение количественного содержания гликогена в тканях (в пересчете на глюкозу): Сст=1,25 ммоль/л; Dст=74
| Объект исследования | М г) | V (мл) | Р | D | С (мкмоль/г) |
| Печень | 0,25 | 6,0 | 3 | 0,380 | 91,4 |
| Скелетная мышца | 0,50 | 6,0 | - | 0,281 | 11,3 |
| Миокард | 0,50 | 6,0 | - | 0,385 | 15,4 |
Определение количественного содержания лактата в тканях: Сст=3,33 ммоль/л; Dст=0,280
| Объект исследования | М (г) | V(мл) | Р | D | С (мкмоль/г) |
| Печень | 0,25 | 6,0 | - | 0,077 | 22,0 |
| Скелетная мышца | 0,50 | 6,0 | - | 0,244 | 34,8 |
| Миокард | 0,50 | 6,0 | 3 | 0,196 | 83,9 |
Аналогично проводят исследования и других тканей, а также измерения других интересующих метаболитов, например пировиноградной кислоты.
Положительный эффект.
Способ определения метаболитов углеводного обмена в тканях позволяет проводить измерения ряда параметров в одном объекте исследования, результат не зависит от длительности периода между забором объекта и проведением лабораторного исследования.
Claims (1)
- Способ определения метаболитов углеводного обмена в биологических тканях путем гомогенизации биологической ткани, проведения гидролиза в растворе трихлоруксусной кислоты, центрифугирования и определения в супернатанте метаболитов углеводного обмена, отличающийся тем, что каждый кусочек биологической ткани перед исследованием помещают в отдельный флакон с плотно закрывающейся пробкой, заливают ацетоном в соотношении не менее 1:5, выдерживают в течение от 3-х суток и более, достают кусочек ткани, проводят измерение объема ацетона и массы кусочка биологической ткани, затем отбирают часть ацетона в фарфоровый тигель, проводят испарение ацетона в вытяжном шкафу, после этого добавляют такое же количество дистиллированной воды, тщательно перемешивают и определяют метаболиты углеводного обмена ферментными методами, далее берут навеску ткани, гомогенизируют в 8%-ном растворе трихлоруксусной кислоты, гомогенизат сливают в мерные центрифужные пробирки, отмечают уровень жидкости, проводят гидролиз в течение 30 мин, при этом весь гликоген подвергают гидролизу до глюкозы, центрифугируют, нейтрализуют 10%-ным раствором NaOH до рН 7, 8, доводят уровень жидкости до метки, вновь центрифугируют и определяют в надосадочной жидкости метаболиты углеводного обмена ферментными методами.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011109275/15A RU2453849C1 (ru) | 2011-03-11 | 2011-03-11 | Способ определения метаболитов углеводного обмена в биологических тканях |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011109275/15A RU2453849C1 (ru) | 2011-03-11 | 2011-03-11 | Способ определения метаболитов углеводного обмена в биологических тканях |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2453849C1 true RU2453849C1 (ru) | 2012-06-20 |
Family
ID=46681167
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011109275/15A RU2453849C1 (ru) | 2011-03-11 | 2011-03-11 | Способ определения метаболитов углеводного обмена в биологических тканях |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2453849C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2302001C1 (ru) * | 2006-02-26 | 2007-06-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пермская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" | Способ диагностики механической асфиксии в результате сдавления органов шеи петлей |
| WO2010132440A2 (en) * | 2009-05-11 | 2010-11-18 | Cytotech Labs, Llc | Methods for treatment of oncological disorders using epimetabolic shifters, multidimensional intracellular molecules, or environmental influencers |
-
2011
- 2011-03-11 RU RU2011109275/15A patent/RU2453849C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2302001C1 (ru) * | 2006-02-26 | 2007-06-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пермская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" | Способ диагностики механической асфиксии в результате сдавления органов шеи петлей |
| WO2010132440A2 (en) * | 2009-05-11 | 2010-11-18 | Cytotech Labs, Llc | Methods for treatment of oncological disorders using epimetabolic shifters, multidimensional intracellular molecules, or environmental influencers |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ГАЙФУЛИН Н.М. Судебно-медицинская оценка показателей углеводного обмена при некоторых видах гипоксической смерти у новорожденных и детей грудного возраста: Автореферат-диссертация кандидата медицинских наук. - М., 2005, 129 с. * |
| Судебно-медицинская оценка некоторых показателей углеводного обмена при смерти от острого отравления этиловым алкоголем и ишемической болезни сердца: Метод. рекоменд. // №583/01-02 Бюро главн. суд.-мед. эксперт. - М., 1994. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Boulagnon et al. | Post-mortem biochemistry of vitreous humor and glucose metabolism: an update | |
| CN104316692B (zh) | 一种新生儿总半乳糖检测试剂盒、其使用方法及制备方法 | |
| JP5916130B2 (ja) | 病気の重症度の検査方法 | |
| Edwards et al. | Needle biopsy for muscle chemistry | |
| Nord et al. | A whole blood approach improves speed and accuracy when measuring mitochondrial respiration in intact avian blood cells | |
| RU2453849C1 (ru) | Способ определения метаболитов углеводного обмена в биологических тканях | |
| Palmeiro et al. | Plasma biochemical reference intervals for koi | |
| CN103235143A (zh) | 一种时间分辨免疫荧光法定量测定新生儿17α-OHP的试剂盒 | |
| Cole et al. | Assessment of a portable lactate meter for field use in the white rhinoceros (Ceratotherium simum) | |
| CN112067398A (zh) | 一种尿液化学分析质控品 | |
| Acierno et al. | Evaluation of the agreement among three handheld blood glucose meters and a laboratory blood analyzer for measurement of blood glucose concentration in Hispaniolan Amazon parrots (Amazona ventralis) | |
| Loyo et al. | Kato-Katz slide preservation technique: Extension of viability and the benefits for schistosomiasis control programs | |
| Wernick et al. | Plasma chemistry reference values in the gyr falcon (Falco rusticolus) | |
| JPH04500912A (ja) | 乏精子症男性における受精能の客観的生化学的測定法 | |
| CN107475424B (zh) | 线粒体dna检测试剂在诊断奶牛脂肪肝的应用 | |
| Sheikh | Estimation of postmortem interval according to time course of potassium ion activity in cadaveric synovial fluid | |
| Sumarsono et al. | Detection of Plasma Membrane Alpha Enolase (ENO1) and Its Relationship with Sperm Quality of Bali Cattle | |
| CN110530694A (zh) | 一种动物毛发皮质醇检测的预处理方法 | |
| Varela et al. | Evaluation of biochemical analytes in vitreous humor collected after death in West Indian manatees | |
| RU2542457C1 (ru) | Способ дифференциальной диагностики хронического вирусного гепатита и жировой болезни печени у больных с синдромом дислипидемии | |
| Komal et al. | Postmortem biochemical evaluation in vitreous humor of Indian rhinoceros (Rhinoceros unicornis) | |
| Sakas | Understanding avian laboratory tests | |
| RU2731474C1 (ru) | Способ диагностики скрыто протекающего воспалительного процесса в репродуктивных органах свиноматок | |
| Kopytov et al. | The method of complex determining of biochemical composition of microalgae | |
| RU2768753C2 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидных праймеров и зондов для выявления вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота и гена GAPDH крупного рогатого скота и способ выявления РНК вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20130312 |