RU2429848C2

RU2429848C2 - Композиции для лечения системного мастоцитоза

Info

Publication number: RU2429848C2
Application number: RU2008105823/15A
Authority: RU
Inventors: Петер ФАЛЕНТ (AT); Петер ФАЛЕНТ
Original assignee: Петер ФАЛЕНТ
Priority date: 2005-07-20
Filing date: 2006-07-19
Publication date: 2011-09-27
Also published as: US20090221550A1; KR20080039915A; WO2007010014A2; CN101267837B; PT1909837E; CA2615598A1; ES2343542T3; AU2006271652B2; EP1909837A2; PL1909837T3; CA2615598C; US8076321B2; KR101351682B1; JP2009501767A; AU2006271652A1; DE602006013826D1; WO2007010014A3; ATE464911T1; CN101267837A; RU2008105823A

Abstract

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано при лечении системного мастоцитоза. Применение включает комбинацию ингибиторов тирозинкиназы AMN107 и РКС412 для приготовления лекарственного средства для лечения системного мастоцитоза (СМ), в том числе ассоциированного с онкогенной мутацией KIT-D816V. Использование изобретения позволяет повысить эффективность лечения СМ за счет синергического ингибирования роста тучных клеток под действием комбинации AMN107 и РКС412. 2 з.п. ф-лы, 3 табл., 17 ил.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к применению ингибиторов тирозинкиназы для приготовления лекарственного средства для лечения системного мастоцитоза. Настоящее изобретение также относится к способу лечения системного мастоцитоза.

Предпосылки создания изобретения

Системный мастоцитоз (СМ) может быть классифицирован на безболезненный СМ (при котором отсутствуют нарушения функции органа или они незначительны), агрессивный СМ (с нарушением функции органа), СМ-ассоциированное гематологическое нетучноклеточное заболевание (СМ-АГНТЗ) и тучноклеточный лейкоз (ТКЛ). Клинические проявления у взрослых с СМ гетерогенны, к ним относятся: кожный мастоцитоз (обычно пигментная крапивница), симптомы, опосредованные тучными клетками (головная боль, приливы, головокружения, обмороки, анафилаксия и др.) и прямое или опосредованное повреждение органов (боль в костях из-за литических костных повреждений, остеопороз или переломы костей, гепатоспленомегалия, цитопения клеток, формирующихся в костном мозге). Кроме того, примерно у 20% пациентов с СМ может быть выражена существенная и иногда солитарная эозинофилия крови (Tefferi и Pardanani, 2004).

Обычно тучноклеточный лейкоз является терминальной стадией заболевания, на которой продолжительность жизни измеряется месяцами, причем эффективной терапии в настоящее время не существует. Течение безболезненного СМ происходит намного легче, средний период выживания измеряется десятилетиями и редко прогрессирует в форму агрессивного СМ и СМ-АГНТЗ. Исход СМ-АГНТЗ определяется ассоциацией с АГНТЗ, причем такая форма заболевания протекает намного тяжелее, чем СМ без АГНТЗ. И при агрессивной, и при безболезненной форме СМ без АГНТЗ повышенное содержание тучных клеток костного мозга и эозинофилов, повышенное содержание сывороточной щелочной фосфатазы, анемия и гепатоспленомегалия ассоциированы с плохим прогнозом (Tefferi и Pardanani, 2004). Полная гистологическая и клиническая ремиссия достигаются у пациентов с СМ, ассоциированным с генной гибридизацией FIP1L1-PDGFRα, при лечении продуктом Gleevec^® (Pardanani 2003a, Pardanani 20036).

Краткое описание изобретения

Несколько разрабатываемых подходов к лечению миелоидных неоплазм основывается на новых лекарственных средствах, нацеленных на принципиально важный фермент тирозинкиназу (ТК) или расположенные ниже по цепи сигнальные молекулы.^1-5 Системный мастоцитоз (СМ) является гемотопоэтической неоплазмой, которая проявляется в виде безболезненного миелопролиферативного заболевания у большинства пациентов, но также может быть в форме агрессивного заболевания (агрессивный СМ в настоящем изобретении обозначается «АСМ») или даже в форме лейкоза, например тучноклеточного лейкоза (в настоящем изобретении обозначается «ТКЛ»)^6-11. У пациентов с АСМ и ТКЛ ответ на традиционную терапию в большинстве случаев плохой и согласно прогнозу заканчивается смертью.^6-12 В связи с этим был предпринят ряд подходов, направленных на выявление новых мишеней для терапии неопластических тучных клеток и для разработки новых стратегий лечения таких пациентов.^9-12

У большинства пациентов с СМ, в том числе с диагностированным АСМ или ТКЛ, соматическая точечная мутация D816V (Asp816Val) гена c-KIT обнаруживается в неопластических (тучных) клетках.^13-17 Эта точечная мутация ассоциирована с лиганд-независимым фосфорилированием и активированием KIT, а также с автономной дифференциацией и ростом пораженных болезнью клеток.^17,18 Учитывая связь с активностью конститутивной тирозинкиназы (ТК), D816V-мутантный вариант KIT является привлекательной мишенью для терапии.^9-12,19

В предшествующие годы был предпринят ряд усилий по идентификации эффективных лекарственных средств, способных ингибировать ТК-активность KIT D816V.^9-12,19-24 Ранее было установлено, что ингибитор ТК иматиниб (STI571), широко применяемый в клинической гематологии, препятствует росту неопластических тучных клеток, ингибируя дикий тип (дт) KIT или редко встречаемый Р522С-мутантный вариант KIT.^20-23 Кроме того, установлено, что это лекарственное средство блокирует рост неопластических клеток у пациентов с СМ, связанным с клональной эозинофилией и гибридным геном FIP1L1/PDGFRA (СМ с ассоциированным хроническим эозинофильным лейкозом в настоящем изобретении обозначается «СМ-ХЭЛ»).^24-26 Однако иматиниб не ингибирует роста неопластических тучных клеток, несущих мутацию D816Vгена c-KIT^10-22, поэтому очевидна потребность в дальнейшем поиске новых ингибиторов ТК, которые блокируют KIT D816V и, в результате, рост неопластических тучных клеток при СМ.

Новые нацеливающиеся на ТК лекарственные средства РКС412 и AMN107 препятствуют ТК-активности D816V-KIT и ингибируют рост неопластических тучных клеток и Ba/F3 клеток человека с доксициклин-индуцируемой экспрессией KIT-D816V, рост первичных неопластических тучных клеток и ТКЛ клеток человека линии НМС-1, несущих данную мутацию c-KIT. Установлено, что РКС412 является предпочтительным лекарственным средством с величиной IC₅₀ 50-250 нМ, причем оно действует одинаково на клетки НМС-1, проявляющие или утратившие KIT-D816V. Напротив, AMN107 проявляет более сильное воздействие на KIT-D816V-отрицательные клетки НМС-1. Соответствующие результаты получены для клеток Ba/F3 дикого типа или с D816V-мутантным KIT. Действие РКС412 и AMN107, направленное на подавление роста клеток НМС-1, связано с индукцией апоптоза и пониженной регуляцией CD2 и CD63. Установлено, что РКС412 взаимодействует с AMN107, иматинибом и кладрибином (т.е. 2CdA), вызывая подавление роста клеток НМС-1. Также было установлено, что наблюдается синергизм РКС412 с AMN107 и кладрибином (2CdA), влияющий на подавление роста клеток НМС-1. Взятые вместе, РКС412 и AMN107 представляют перспективные новые агенты для целевой терапии СМ.

Настоящее изобретение относится к лечению комбинацией РКС412 и AMN107, эффективной в отношении СМ, особенно СМ, ассоциированного с онкогенной мутацией D816V в c-KIT. Настоящее изобретение также относится к лечению комбинацией РКС412 и ТК-ингибитора, эффективной в отношении СМ, особенно системного мастоцитоза (СМ), в том числе агрессивного CM (ACM) и тучноклеточного лейкоза (ТКЛ). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения СМ, ACM и ТКЛ ассоциированы с онкогенной c-KIT мутацией, особенно мутацией D816V.

Краткое описание чертежей

Фиг.1А-Г показывает действие ТК-ингибиторов на KIT-фосфорилирование в неопластических клетках. Фиг.1А, Б: KIT-фосфорилирование в клетках НМС-1.1 (фиг.1А) и клетках НМС-1.2 (ингибирование KIT D816V, фиг.1Б) после инкубирования в контрольной среде (контроль), с иматинибом STI571 (1 мкмоль), РКС412 (1 мкмоль) или AMN107 (1 мкмоль) в течение 4 ч. Фиг.1В, Г: KIT-фосфорилирование в клетках дикого типа Ton.Kit. (фиг.1В) и клетках Ton.Kit.D816V.27 (фиг.1Г) после инкубирования в контрольной среде (контроль), с иматинибом (т.е. STI571) (1 мкмоль), РКС412 (1 мкмоль) или AMN107 (1 мкмоль) в течение 4 ч. До воздействия лекарственных средств клетки дикого типа Ton.Kit. и клетки Ton.Kit.D816V.27 хранят в присутствии доксициклина в количестве 1 мкг/мл в течение 24 ч для индукции экспрессии KIT. В случае клона дикого типа Ton.Kit. клетки также подергают воздействию ФСК (100 нг/мл, 4 ч) для индукции KIT-фосфорилирования (p-KIT). Для всех клеток иммунопреципитацию проводят, используя анти-KIT моноклональное антитело (мАт) SR-1. Вестерн-блоттинг проводят, используя антитело к фосфо-мАт 4G10 для выявления p-KIT и антитело к KIT Aт 1C1 для выявления общего белка KIT.

Фиг.2А-Г показывает графически действие РКС412, AMN107 и иматиниба на пролиферацию клеток НМС-1. Фиг.2А: зависимость от времени действия РКС412 на потребление ³H-тимидина в клетках НМС-1.2. Клетки НМС-1.2 инкубируют в контрольной среде или в присутствии РКС412 (300 нмолей) при 37°С в атмосфере 5% CO₂ в течение разных установленных сроков. После инкубирования исследуют потребление ³H-тимидина. Результаты выражают в виде процента от контроля (т.е. потребление ³H-тимидина в контрольной среде в каждой временной точке) и представляют средние значения по результатам трех экспериментов ± среднеквадратичное отклонение. Фиг.2Б-Г: зависимость от дозы действия ТК-ингибиторов на потребление ³H-тимидина в клетках НМС-1. Клетки НМС-1.1 (•-•) и НМС-1.2 (■-■) инкубируют в контрольной среде с различными концентрациями РКС412 (фиг.2Б), AMN107 (фиг.2В) или иматиниба (фиг.2Г) или без них (0) при 37°С в течение 48 ч. После инкубирования измеряют потребление ³H-тимидина. Результаты выражают в виде процента от контроля (0, 100%) и представляют средние значения по результатам, по меньшей мере, трех независимых экспериментов ± среднеквадратичное отклонение.

Фиг.3А-В представляет графически действие РКС412, AMN107 и иматиниба на потребление ³H-тимидина в клетках Ton.Kit. Фиг.3А: клетки дикого типа Ton.Kit. выдерживают в контрольной среде (белые прямоугольники) или у них индуцируют экспрессию, активируя KIT дикого типа внесением доксициклина (1 мкг/мл) и ФСК (черные прямоугольники). В обоих случаях на клетки воздействуют либо контрольной средой (Ко), либо с различными установленными концентрациями РКС412, AMN107 или иматиниба (STI571) в течение 48 ч (37°С, 5% CO₂). Затем потребление ³H-тимидина определяют согласно описанию, представленному в тексте. Результаты выражают в виде процента от контроля и представляют среднее значение по результатам трех независимых экспериментов ± среднеквадратичное отклонение. Фиг.3Б: клетки Ton.Kit.D816V.27 выдерживают в контрольной среде (белые прямоугольники) или у них индуцируют экспрессию KIT D816V, добавляя доксициклин (1 мкг/мл) (черные прямоугольники) и затем подвергают воздействию либо контрольной среды (Ко), либо различных установленных концентраций РКС412, AMN107 или иматиниба (STI571) в течение 48 ч (37°С, 5% CO₂). Затем определяют потребление ³H-тимидина. Результаты выражают в виде процента от контроля (клетки, экспонировавшиеся в контрольной среде, являются контролем и обозначаются «Ко») и представляют средние значение по результатам трех независимых экспериментов ± среднеквадратичное отклонение.

Фиг.4 представляет графически снижение регуляции роста под действием РКС412 первичных неопластических (тучных) клеток, проявляющих мутацию D816V. Первичные неопластические клетки костного мозга, экспрессирующие KIT D816V, выделяют от пациентов с медленно развивающимся системным мастоцитозом. Выделенные клетки инкубируют в контрольной среде (Ко) или с различными установленными концентрациями РКС412, AMN107 и иматиниба согласно описанному методу. Рост клеток оценивают количественно, измеряя потребление ³H-тимидина. Результаты выражают в виде процента от контроля (контроль равен 100%) и представляют средние значения по результатам трех независимых экспериментов ± среднеквадратичное отклонение. В нормальных клетках костного мозга не наблюдают действия РКС412 (не показано).

Фиг.5А-Е представляет графически действие ТК-ингибиторов на апоптоз клеток НМС-1. Клетки НМС-1.1 (фиг.5А, В, Д) и НМС-1.2 (фиг.5Б, Г, Е) культивируют при отсутствии (Ко) или в присутствии различных концентраций РКС412 (фиг.5А, В), AMN107 (фиг.5В, Г) или иматиниба (фиг.5Д, Е) согласно указанному при 37°С в течение 24 ч. Затем подсчитывают клетки с апоптозом с помощью световой микроскопии. Результаты выражают в виде среднего значения по результатам трех независимых экспериментов ± среднеквадратичное отклонение.

Фиг.6А-Г представляет электронно-микроскопическое исследование РКС412-индуцированного апоптоза в клетках НМС-1. Клетки НМС-1.2 инкубируют в контрольной среде (фиг.6А), с РКС412, 500 нмолей (фиг.6Б), или РКС412, 900 нмолей (фиг.6В, Г) при 37°С в течение 24 ч. Затем клетки собирают и анализируют на наличие ультраструктурных признаков апоптоза. В культурах, поддерживаемых в контрольной среде (фиг.6А), клетки с признаками апоптоза встречаются редко, а у клеток НМС-1.2, культивируемых с РКС412 (фиг.6Б-Г), часто проявляются признаки апоптоза, а именно сморщивание, складчатость мембраны, формирование вакуолей и конденсация ядерного хроматина.

Фиг.7 представляет клетки НМС-1.2, инкубированные в контрольной среде (контроль), с добавлением РКС412 (1 мкмоля), AMN107 (1 мкмоля) или иматиниба (1 мкмоля) при 37°С в течение 24 ч. Затем клетки собирают и анализируют на жизнеспособность и наличие апоптоза, окрашивая комбинацией пропидиума иодида (ПИ)/аннексина V-FITC.

Фиг.8А-З представляет апоптоз в клетках НМС-1, оценку которого проводили методом Tunel. Клетки НМС-1.1 (фиг.8А-Г) и НСМ-1.2 (фиг.8Д-З) инкубируют в контрольной среде (фиг.8А, Д), с РКС412, 1 мкмоль (фиг.8Б, Е), AMN107, 1 мкмоль (фиг.8В, Ж), или иматимибом, 1 мкмоль (фиг.8Г, З), при 37°С в течение 24 ч. Затем клетки собирают и анализируют методом Tunel. Из фиг. следует, что РКС412 вызывает апоптоз у большинства клеток НМС-1.1 и НМС-1.2, а AMN107 и иматиниб показывают мощное действие, направленное на индукцию апоптоза, только в клетках HNC-1.1 (фиг.8В, Г), но не в клетках НМС-1.2, проявляющих KIT D816V (фиг.8Ж, З).

Фиг.9А-Б представляет графически действие ТК-ингибиторов на экспрессию антигенов на поверхности клеток НМС-1.2. Фиг.9А: клетки НМС-1.2 экспонируют в контрольной среде (Ко, белые полосы), с РКС412, 1 мкмоль (черные полосы), AMN107, 1 мкмоль (заштрихованные полосы), или с иматинибом (т.е. STI571), 1 мкмоль (серые полосы), при 37°С в течение 24 ч. Результаты показывают процент от контроля и представляют среднее значение ± среднеквадратичное отклонение по результатам трех независимых экспериментов. Фиг.9Б: доза-зависимое воздействие РКС412 на экспрессию антигена CD63 на клетках НМС-1.2. Клетки инкубируют с различными концентрациями РКС412 при 37°С в течение 24 ч согласно описанному. Затем клетки собирают и анализируют экспрессию CD63 методом жидкостной цитометрии. На фиг. показан типичный результат одного из экспериментов, свидетельствующий о том, что РКС412 доза-зависимо снижает экспрессию CD63.

Фиг.10А-К показывает графически синергическое действие лекарственных средств на рост клеток НМС-1. Клетки НМС-1.1, утратившие KIT D816V (фиг.10А-Е), и клетки НМС-1.2, проявляющие KIT D816V (фиг.10Ж-К), инкубируют в контрольной среде (0) или с различными указанными комбинациями лекарственных средств (в фиксированных соотношениях) при 37°С в течение 48 ч для определения совместного антипролиферативного действия. Фиг.10А, В, Д, Ж, И: после инкубирования с отдельными лекарственными средствами (фиг.10 А: РКС412, ■-■; AMN107, ●-●; фиг.10В: STI571, ■-■; AMN107, ●-●; фиг.10Д: STI571, ■-■; РКС412, ●-●; фиг.10Ж: РКС412, ■-■; AMN107, ●-●; фиг.10И: РКС412, ■-■; 2CdA, ●-●) или комбинацией лекарственных средств (▲-▲), клетки анализируют на потребление ³H-тимидина. Результаты потребления ³H-тимидина выражены в проценте к контролю (контроль среды, обозначаемый «0» или «100%») и представляют среднее значение ± среднеквадратичное отклонение трех повторов в одном типичном эксперименте (соответствующие результаты получают, по меньшей мере, от двух разных экспериментов для комбинации каждого лекарственного средства). Изображения справа (фиг.10Б, Г, Е, З, К) показывают величины индекса, определенные для каждой фракции, обработанные методом Chou и Talalay³⁹, используя вычислительную компьютерную программу. Величина индекса комбинации, равная 1,0, свидетельствует об аддитивном действии, величина индекса комбинации больше 1,0 свидетельствует об антагонизме, а индекса комбинации меньше 1,0 свидетельствует о синергизме.

Фиг.11А-Г показывает действие дасатиниба на KIT фосфорилирование в неопластических клетках. Фиг.11А, Б показывают фосфорилирование тирозина в KIT в клетках НМС-1.1 (фиг.11А) и НМС-1.2 (проявление KIT D816V) (фиг.11Б) после инкубирования в течение 4 ч в контрольной среде или с различными концентрациями дасатиниба. Фиг.11В, Г представляет KIT-фосфорилирование в обработанных доксициклином клетках дикого типа Ton.Kit. (фиг.11В) и клетках Ton.Kit.D816V.27 (фиг.11Г) после инкубирования в контрольной среде (0) или с дасатинибом (10^-3-10³ нмолей) в течение 4 ч. Перед обработкой лекарственным средством клетки дикого типа Ton.Kit. и клетки Ton.Kit.D816V.27 выдерживают в контрольной среде (контроль) или с доксициклином в течение 24 ч для индукции экспрессии KIT. При использовании клеток дикого типа Ton.Kit. клетки также обрабатывают ФСК (100 нг/мл, 4 ч) для индукции KIT-фосфорилирования (p-KIT). Во всех клетках проводят иммунопреципитацию, используя анти-KIT моноклональное антитело (мАт) 1С1. Вестерн-блоттинг проводят, используя анти-фосфо-tyr-мАт 4G10 для выявления p-KIT и анти-KIT мАт 1С1 для выявления общего KIT-белка (KIT).

Фиг.12А-Е показывает действие дасатиниба на пролиферацию клеток НМС-1, а также на рост и формирование кластера клеток BaF/3. Фиг.12 А представляет зависимое от времени действие дасатиниба на потребление ³H-тимидина в клетках НМС-1.1 (■-■) и НМС-1.2 (●-●). Клетки НМС-1.1 инкубируют с дасатинибом в концентрации 10 нмолей, а клетки НМС-1.2 инкубируют с дасатинибом в концентрации 1 мкмоль, при 37°С в атмосфере 5% СО₂ на протяжении различных установленных периодов времени. После инкубирования измеряют потребление ³H-тимидина. Результаты выражают в виде процента от контроля (потребления ³H-тимидина клетками, инкубировавшимися в контрольной среде), а именно среднего значения по результатам трех независимых экспериментов ± среднеквадратичное отклонение. Фиг.12Б показывает доза-зависимое действие дасатиниба на потребление ³H-тимидина клетками НМС-1.1 (■-■) и НМС-1.2 (●-●). Клетки инкубируют в контрольной среде с различными концентрациями дасатиниба или без него при 37°С в течение 48 ч. После инкубирования измеряют потребление ³H-тимидина. Результаты выражают в виде процента от контроля и представляют в виде среднего значения по результатам трех независимых экспериментов ± среднеквадратичное отклонение. Фиг.12В показывает действие дасатиниба на рост клеток дикого типа Ton.Kit. Клетки либо первоначально поддерживают в среде с ИЛ-3 до или во время инкубирования с дасатинибом (●-●), или предварительно инкубируют с доксициклином (1 мкг/мл) в присутствии ИЛ-3 в течение 24 ч, и затем инкубируют с различными концентрациями дасатиниба в среде, содержащей доксициклин и ФСК (100 нг/мл) без ИЛ-3 в течение 48 ч при 37°С (■-■). После инкубирования клетки собирают и проводят исследование потребления ³H-тимидина. Результаты выражают в виде процента от контроля, а именно среднего значения по результатам трех независимых экспериментов ± среднеквадратичное отклонение. (Фиг.12Г). Влияние дасатиниба на рост клеток Ton.Kit.D816V. Клетки инкубируют в контрольной среде (+ИЛ-3) и в среде с различными установленными концентрациями дасатиниба и без него, а также с доксоциклином (■-■) (1 мкг/мл) или без него (●-●) в течение 48 ч (37°С). Затем жизнеспособность клеток определяют по вытеснению красителя трипана синего. Результаты выражают в виде процента жизнеспособных клеток (определяемых в виде процента трипан синий-положительных клеток) от контроля (количество клеток без дасатиниба = 100%), а именно среднего значения по результатам трех независимых экспериментов ± среднеквадратичное отклонение. (Фиг.12Д, Е). Влияние дасатиниба (фиг.12Д) и AMN107 (фиг.12Е) на формирование KIT-D816V-индуцированных кластеров в клетках Ton.Kit.D816V.27. Клетки инкубируют без доксициклина (Ко) или с доксициклином (1 мкг/мл) в среде с различными установленными концентрациями дасатиниба или AMN107 или без них в течение 24 ч. После инкубирования число кластеров подсчитывают с помощью инвертированного микроскопа. Результаты выражают в виде процента формирования кластеров при сопоставлении с клетками, содержащимися в контрольной среде (Ко) и с доксициклином (=100%), а именно в виде среднего значения по результатам трех независимых экспериментов ± среднеквадратичное отклонение.

Фиг.13 показывает, что дасатиниб снижает регуляцию роста первичных неопластических клеток у пациентов с KIT D816V-положительным СМ с ассоциированным лейкозом. Первичные неопластические клетки костного мозга выделяют от пациента с KIT D816V-положительным АСМ, ассоциированным с острым миелолейкозом (ОМЛ). Выделенные клетки инкубируют в контрольной среде или с различными установленными концентрациями дасатиниба (●-●), РКС412 (■-■), AMN107 (▲-▲) или иматиниба (▼-▼). Рост клеток оценивают количественно, измеряя потребление ³Н-тимидина. Результаты выражают в виде процента от контроля (количество клеток в контрольной среде = 100%), а именно среднего значения по результатам трех независимых экспериментов ± среднеквадратичное отклонение. В клетках нормального костного мозга не установлено действия ингибиторов ТК (не показано).

Фиг.14А-В показывает индукцию дасатинибом апоптоза в клетках НМС-1. (Фиг.14А, Б) клетки НМС-1.1 (фиг.14А) и НМС-1.2 (фиг.14Б) культивируют в отсутствии (Ко) или присутствии установленных различных концентраций дасатиниба в течение 24 ч. Затем подсчитывают процент клеток на стадии апоптоза с помощью световой микроскопии. Результаты выражают в виде среднего значения ± среднеквадратичное отклонение по результатам трех независимых экспериментов. Звездочка обозначает величину p<0,05. (Фиг.14В): электронно-микроскопическое исследование дасатиниб-индуцированного апоптоза в клетках НМС-1.1 и НМС-1.2. Клетки НМС-1 инкубируют в контрольной среде или с дасатинибом (1 мкмоль) при 37°С в течение 24 ч. В культурах, поддерживаемых в контрольной среде, клетки с признаками апоптоза встречаются редко, а у большинства клеток НМС-1, культивируемых с дасатинибом, часто проявляются признаки апоптоза, а именно сморщивание, складчатость мембраны, формирование вакуолей и конденсация ядерного хроматина. (Фиг.14Г, Д) Дасатиниб-индуцированный апоптоз в клетках НМС-1 по оценке методом Tunel. Клетки НМС-1.1 (фиг.14Г) и НМС-1.2 (фиг.14Д) инкубировали в контрольной среде, с различными установленными концентрациями дасатиниба или РКС412 (100 нмоль и 1 мкмоль) при 37°С в течение 24 ч. Затем клетки собирают и исследуют методом Tunel. На фиг. показано, что дасатиниб вызывает доза-зависимый апоптоз в клетках НМС-1.1 и НМС-1.2.

Фиг.15А-Е представляет действие дасатиниба на экспрессию антигенов на поверхности клеток НМС-1. (Фиг.15А): клетки НМС-1.1 и НМС-1.2 (фиг.15В) выдерживали в контрольной среде или при разных установленных концентрациях дасатиниба или РКС412 (1 мкмоль) при 37°С в течение 24 ч. После инкубирования исследуют экспрессию клетками различных антигенов CD с помощью жидкостной цитометрии, используя CD-специфические моноклональные антитела (мАт). Фиг.15В, Г показывает среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ) в процентах к контролю (=100%). Результаты выражают в виде среднего значения по результатам трех независимых экспериментов ± среднеквадратичное отклонение. Звездочка обозначает величину p<0,05. (Фиг.15Д, Е): экспрессия CD63 на поверхности клеток НМС-1.1 (фиг.15 Д) и НМС-1.2 (фиг.15Е) после инкубирования в контрольной среде, с различными концентрациями дасатиниба или РКС412 (1 мкмоль) при 37°С в течение 24 ч. Жидкостную цитометрию проводят с CD63 мАт CLB-gran12 (черная линия). Пунктирная линия показывает соответствующее изотипу контрольное антитело.

Фиг.16А-Г представляет синергическое лекарственное действие на рост клеток НМС-1. Клетки НМС-1.1 (фиг.16А, Б) и клетки НМС-1.2, проявляющие KIT D816V (фиг.16В-Г), инкубировали с отдельными лекарственными средствами или с различными комбинациями лекарственных средств (в фиксированном соотношении) при 37°С в течение 48 ч перед определением потребления ³H-тимидина. (Фиг.16А): клетки НМС-1.1 инкубировали с различными концентрациями дасатиниба (■-■), или РКС412 (●-●), или с комбинациями обоих лекарственных средств (▲-▲). (Фиг.16Б): клетки НМС-1.1 инкубировали с различными концентрациями дасатиниба (●-●), или иматиниба (■-■), или комбинациями обоих лекарственных средств (▲-▲). (Фиг.16В): клетки НМС-1.2 инкубировали с различными концентрациями дасатиниба (■-■), или РКС412 (●-●), или с комбинациями обоих лекарственных средств (▲-▲). (Фиг.16Г): клетки НМС-1.2 инкубировали с различными концентрациями дасатиниба (■-■), или 2CdA (•-•), или с комбинациями обоих лекарственных средств (▲-▲). Результаты выражают в виде среднего значения по результатам трех повторов из одного типичного эксперимента ± среднеквадратичное отклонение. Оценка с помощью компьютерной программы вычисления показывает, что природа взаимодействия лекарственных средств является синергетической (фиг.16А-Г).

Фиг.17 представляет клетки НМС-1.2, которые инкубируют с контрольной средой или с различными установленными концентрациями дасатиниба при 37°С в течение 48 ч. Затем измеряют потребление ³H-тимидина. Результаты выражают в виде процента от контроля (клетки, хранившиеся в контрольной среде, =100%) и представляют среднее значение по результатам трех независимых экспериментов ± среднеквадратичное отклонение.

Подробное описание изобретения

Задача, решаемая в настоящем изобретении, заключается в применении комбинации РКС412 и AMN107 для лечения системного мастоцитоза, особенно СМ, ассоциированного с онкогенной мутацией D816V в гене с-KIT.

У большинства пациентов с системным мастоцитозом (СМ), в том числе агрессивным СМ и тучноклеточным лейкозом (ТКЛ), неопластические клетки экспрессируют онкогенную мутацию D816V в гене с-KIT. Эта мутация активирует тирозинкиназу (ТК) KIT-рецептора, т.е. представляет привлекательную мишень для терапии. Однако большинство доступных ТК-ингибиторов, в том числе ингибитор STI571 (иматиниб, фирма Novartis Pharma AG), не может блокировать ТК-активность KIT D816V в диапазоне фармакологических концентраций. В настоящем изобретении доказано, что новые ТК-нацеливающие лекарственные средства РКС412 и AMN107 (фирма Novartis) блокируют ТК-активность D816V-мутантного KIT и препятствуют росту клеток Ba/F3 с доксициклин-индуцированной экспрессией KIT D816V, а также росту клеток тучноклеточного лейкоза человека линии НМС-1, экспрессирующих данную мутацию c-KIT. Установлено, что РКС412 является более сильнодействующим агентом с величиной IC₅₀ 50-200 нМ, одинаково эффективным в отношении клеток НМС-1, проявляющих или утративших KIT D816V. Лекарственное средство AMN107, напротив, проявляет сильное воздействие только на клетки НМС-1, не обладающие KIT D816V (величина IC₅₀ составляет 5-10 нМ, а в KIT D816V-экспрессирующих клетках НМС-1 величина IC₅₀ составляет 1-5 мкМ). Соответствующие результаты получают на клетках Ba/F3 дикого типа или D816V-мутантного варианта KIT.

Впоследствии было изучено действие РКС412 на первичные неопластические тучные клетки, полученные из костного мозга пациентов с СМ, проявляющих KIT D816V. Данные, совпадающие с нашими данными по линии клеток, заключаются в том, что наблюдают РКС412 доза-зависимое ингибирование потребления ³H-тимидина в неопластических тучных клетках (IC₅₀: 50 нМ) у данного пациента, несмотря на то, что не обнаружено значительного воздействия AMN107 (0,1-3 мкМ) и иматиниба (1 мкМ). Ингибирование роста клеток НМС-1 продуктами РКС412 и AMN107 связано с ТК-ингибированием KIT в экспериментах по фосфоблоттингу, а также с индукцией апоптоза, что было установлено методами традиционной морфологии и электронной микроскопии. Кроме того, установлено, что РКС412 снижает экспрессию CD2 и CD63 (при СМ повышена регуляция этих двух поверхностных клеточных антигенов) на поверхности клеток НМС-1. В экспериментах по совместному культивированию установлено, что РКС412 проявляет синергизм с AMN107, иматинибом и кладрибином (2CdA) в подавлении роста клеток НМС-1, обладающих KIT D816V, а также в клетках НМС-1, утративших KIT D816V. Вкратце, данные, представленные в настоящем изобретении показывают, что РКС412 и AMN107, отдельно или в комбинации, препятствуют росту неопластических тучных клеток, экспрессирующих D816V-мутантный вариант KIT. В связи с этим оба лекарственных средства можно рассматривать в качестве новых перспективных агентов для целевой терапии пациентов с агрессивным СМ и ТКЛ.

Таким образом, настоящее изобретение относится к применению N-[(9S,10R,11R,13R)-2,3,10,11,12,13-гексагидро-10-метокси-9-метил-1-оксо-9,13-эпокси-1Н,9Н-дииндоло[1,2,3-gh:3',2',1'-lm]пирроло[3,4-j][1,7]бензодиазонин-11-ил]-N-метилбензамида формулы (I) (в настоящем изобретении обозначается «РКС412»):

в комбинации с 4-метил-3-[[4-(3-пиридинил)-2-пиримидинил]амино]-N-[5-(4-метил-1Н-имидазол-1-ил)-3-(трифторметил)фенил]бензамидом формулы (II) (в настоящем изобретении обозначается «AMN107»):

или с фармацевтически приемлемой солью одного из этих соединений или обоих соединений, для лечения системного мастоцитоза.

Аббревиатуры, используемые в настоящем изобретении, имеют следующие значения:

АСМ	агрессивный системный мастоцитоз
км	костный мозг
кладрибин	2-хлордезоксиаденозин
ФСТ	фетальная сыворотка теленка
ИФНα	интерферон-альфа
ИП	иммунопреципитация
ТКЛ	тучноклеточный лейкоз
ФСБ	фосфатно-солевой буфер
ФЭ	фикэритрин
рч	рекомбинантный человеческий
КТ	комнатная температура
ФСК	фактор стволовых клеток
СМ	системный мастоцитоз
ССМ	скрытый системный мастоцитоз
ТК	тирозинкиназа
дт	дикий тип

Основные понятия, используемые в настоящем изобретении, предпочтительно разъяснены ниже в контексте настоящего изобретения, если не указано их иное значение.

Если использована форма множественного числа применительно к соединениям, солям и др. соединениям, следует учитывать, что может подразумеваться единственное соединение, соль или др. соединение.

Какие-либо асимметричные атомы углерода могут находиться в (R)-, (S)- или (R,S)-конфигурации, предпочтительно (R)- или (S)-конфигурации. Поэтому эти соединения могут быть в виде смеси изомеров или в виде чистых изомеров, предпочтительно в виде энантиомер-чистых диастериоизомеров.

Настоящее изобретение также относится к возможным таутомерам соединений формулы I и формулы II.

Солями предпочтительно являются фармацевтически приемлемые соли соединений формулы I и формулы II. Соединения формулы I и формулы II могут быть введены одновременно или последовательно. Соединения формулы I и формулы II могут комбинироваться в виде единого состава или в виде отдельных составов.

Такие соли формируются, например, в виде аддитивных солей, предпочтительно органических или неорганических кислот, из соединений формулы I и/или формулы II с основным атомом азота, особенно фармацевтически приемлемые соли. Приемлемыми неорганическими кислотами являются, например, галоидоводородные кислоты, например соляная кислота, серная кислота или фосфорная кислота. Приемлемыми органическими кислотами являются, например, карбоновая, фосфоновая, сульфоновая или сульфаминовая кислота, например уксусная кислота, пропионовая кислота, каприловая кислота, декановая кислота, додекановая кислота, гликолевая кислота, молочная кислота, фумаровая кислота, янтарная кислота, адипиновая кислота, пимелиновая кислота, субериновая кислота, азелаиновая кислота, яблочная кислота, винно-каменная кислота, лимонная кислота, аминокислоты, например глутаминовая кислота или аспарагиновая кислота, малеиновая кислота, гидроксималеиновая кислота, метилмалеиновая кислота, циклогексанкарбоновая кислота, адамантанкарбоновая кислота, бензойная кислота, салициловая кислота, 4-аминосалициловая кислота, фталевая кислота, фенилуксусная кислота, миндальная кислота, коричная кислота, метан- или этансульфоновая кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота, этан-1,2-дисульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, 2-нафталинсульфоновая кислота, 1,5-нафталиндисульфоновая кислота, додецилсерная кислота, 2-, 3- или 4-метилбензолсульфоновая кислота, метилсерная кислота, этилсерная кислота, N-циклогексилсульфаминовая кислота, N-метил-, N-этил- или N-пропилсульфаминовая кислота или другие органические протонные кислоты, например аскорбиновая кислота.

В присутствии отрицательно заряженных радикалов, например карбокси- или сульфогрупп, соли также могут формироваться с основаниями, например соли металлов или аммония, например соли щелочных или щелочноземельных металлов, например натрия, калия, магния или кальция, или соли аммония с аммонием или пригодными органическими аминами, например третичными моноаминами, например триэтиламином или три(2-гидроксиэтил)амином, или гетероциклическими основаниями, например N-этил-пиперидином или N,N'-диметилпиперазином.

Если в одной и той же молекуле присутствуют одновременно щелочная и кислотная группы, соединения формулы I и/или формулы II также могут формировать внутренние соли.

Для выделения или очистки также можно использовать фармацевтически неприемлемые соли, например пикраты или перхлораты. Для фармацевтического применения используют только фармацевтически приемлемые соли или свободные соединения (при потребности в форме фармацевтических препаратов), которые являются предпочтительными.

Учитывая тесную связь между новыми соединениями в свободной форме и соединениями в форме их солей, в том числе солей, которые могут использоваться в качестве промежуточных продуктов, например, для очистки или идентификации новых соединений, какие-либо ссылки на свободные соединения (а также на соответствующие соли) в настоящем изобретении следует рассматривать в качестве подходящих и выгодных.

Каждый раз при цитировании патентных заявок или научных публикаций информация о сущности конечных продуктов, фармацевтических препаратов, а также формулы изобретения включены в настоящее изобретение в виде ссылок на эти работы. В случае появления расхождения между изложением включенной ссылки и настоящим описанием доминирующими являются данные настоящего изобретения.

Структура действующих агентов, обозначаемых кодовыми номерами, генерическими или торговыми наименованиями, может быть почерпнута из текущего издания «The Merck Index» или из баз данных, например международной базы данных патентов (например, IMS World Publications). Соответственно их содержание указано в настоящем изобретении в виде ссылок.

Неожиданно было установлено, что комбинация AMN107 и РКС412 проявляет терапевтические свойства, которые оказываются особенно применимыми для подавления активности тирозинкиназы, особенно для лечения и профилактики онкогенных KIT-D816V-индуцированных заболеваний, например системного мастоцитоза.

В контексте настоящего изобретения обозначение «KIT-D816V» относится к мутантному продукту гена c-Kit, в котором нуклеиновая кислота, кодирующая аспарагиновую кислоту в положении 816 полипептида KIT, изменена в результате мутации и кодирует валин. Обозначение KIT-D816V также относится к полипептидному продукту мутантного онкогенного гена c-KIT.

Таким образом, настоящее изобретение относится к применению комбинации AMN107 и РКС412 для приготовления лекарственного средства для лечения системного мастоцитоза, индуцированного онкогенной мутацией c-KIT D816V, или других заболеваний, ассоциированных с онкогенной мутацией c-KIT D816V или схожими мутациями, активирующими тирозинкиназу.

К системному мастоцитозу (СМ) относятся безболезненный, агрессивный СМ и СМ-ассоциированное гематологическое нетучноклеточное заболевание, а также тучноклеточный лейкоз.

Понятие «мастоцитоз» в контексте настоящего изобретения относится к системному мастоцитозу, например мастоцитоме, а также к неоплазмам тучных клеток собак. Мастоцитоз является миелопролиферативным нарушением, причем возможности его лечения ограничены и прогноз обычно неблагоприятный. Патогенез мастоцитоза связан с конститутивным активированием рецепторной тирозинкиназы KIT. У подавляющего большинства пациентов с мастоцитозом нарушенная регуляция активности тирозинкиназы вызвана мутацией в кодоне 816 белка (D816V), которая также отвечает за устойчивость in vitro и in vivo к иматинибу или иматинибмезилату, имеющихся на рынке США в виде продукта Gleevec®, а в других странах - в виде продукта Glivec®.

Тучные клетки играют важную роль в качестве первичных эффекторных клеток при аллергических расстройствах, упоминаемых в настоящем изобретении. Антиген-специфическая IgE-опосредованная дегрануляция тучных клеток приводит к высвобождению химических медиаторов и большого числа цитокинов, а также к синтезу лейкотриенов. Кроме того, тучные клетки участвуют в патогенезе рассеянного склероза.

Неоплазмы тучных клеток имеются и у людей, и у животных. У собак неоплазмы тучных клеток называют мастоцитомами, причем это заболевание распространено и наблюдается в 7-21% опухолей собак. Следует различать мастоцитоз человека, который обычно скоротечен и протекает безболезненно, и неоплазию тучных клеток собак, которая протекает непредсказуемо и зачастую агрессивно с метастазами. Например, одиночные мастоцитомы человека редко формируют метастазы, и напротив, 50% мастоцитом собак протекают злокачественно, что было констатировано Hottendorf и Nielsen (1969) после анализа 46 публикаций, в которых в общей сложности было изучено 938 собак.

Участие рецепторов KIT в патогенезе мастоцитоза подтверждено наблюдением, заключающимся в том, что несколько мутаций, приводящих к конститутивной активации KIT, выявлено в ряде линий тучных клеток. Например, точечная мутация в гене с-KIT человека, вызывающая замену Val на Asp816 в домене фосфотрансферазы, и автоактивация рецептора, присутствует в линии долгоживущих тучных клеток человека (НМС-1) и в соответствующем кодоне двух линий тучных клеток грызунов. Кроме того, эта активирующая мутация выявлена в некоторых случаях мастоцитоза человека. Две другие активирующие мутации обнаружены во внутриклеточной околомембранной области KIT, т.е. замена Val560Gly в линии тучных клеток НМС-1 человека, а также делеция семи аминокислот (Thr573-His579) в линии тучных клеток грызунов, называемой FMA3.

Более конкретно настоящее изобретение относится к применению комбинации AMN107 и РКС412 для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения системного мастоцитоза.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ лечения системного мастоцидоза, заключающийся во введении млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества комбинации AMN107 и РКС412, или их фармацевтически приемлемых солей, или их пролекарств.

Предпочтительно настоящее изобретение предусматривает способ лечения млекопитающих, особенно людей, с системным мастоцитозом, заключающийся во введении млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, KIT-D816V-ингибирующего количества комбинации AMN107 и РКС412 или их фармацевтически приемлемых солей.

В контексте настоящего изобретения понятие «лечение» относится и к профилактике, и к лечению (исправительному или супрессивному), в том числе к лечению пациентов с риском заражения или предположительно уже заразившихся пациентов, а также пациентов с уже развившимся заболеванием. К этому понятию также относится лечение или отсрочка прогрессирования заболевания.

В контексте настоящего изобретения понятие «исправительное лечение» означает эффективность лечения уже имеющихся эпизодов, в том числе системного мастоцитоза.

В контексте настоящего изобретения понятие «профилактическое лечение» означает предупреждение начала или рецидив заболеваний, в том числе системного мастоцитоза.

В контексте настоящего изобретения понятие «отсрочка прогрессирования» означает введение действующего соединения пациентам, находящимся на стадии, предшествующей заболеванию, или на ранней стадии заболевания, подвергаемого лечению, причем эти пациенты, например, находящиеся на ранней стадии диагностированного заболевания или пребывающие в состоянии, например, в ходе медицинского лечения, или в состоянии, возникающем в результате определенной ситуации, при которой существует вероятность того, что соответствующее заболевание разовьется.

Такой прогнозируемый диапазон признаков означает, что применение комбинации AMN107 и РКС412 представляет особый интерес для получения лекарственного средства для лечения системного мастоцитоза.

Этот эффект может быть особенно клинически существенным для пациентов с системным мастоцитозом.

Для того чтобы показать, что комбинация AMN107 и РКС412 особенно применима для лечения системного мастоцитоза с хорошим терапевтическим эффектом и другими преимуществами, клинические исследования могут быть выполнены способом, известным специалистам.

Точная дозировка комбинации AMN107 и РКС412 для ингибирования системного мастоцитоза зависит от нескольких факторов, включая организм хозяина, природу и тяжесть подвергаемого лечению состояния, способа введения. Компоненты комбинация AMN107 и РКС412 могут быть введена либо вместе, либо по отдельности, каким-либо способом, том числе перорально, парентерально, например внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, подкожно, внутрь опухоли или ректально, или энтерально. Предпочтительно комбинацию AMN107 и РКС412 вводят перорально, предпочтительно в суточной дозировке 1-300 мг/кг массы тела или, для наиболее крупных приматов, в суточной дозировке 50-5000, предпочтительно 500-3000 мг. Предпочтительная пероральная суточная дозировка составляет 1-75 мг/кг массы тела или, для наиболее крупных приматов, в суточной дозировке 10-2000 мг, введенных в виде одной дозы или в виде нескольких доз, например двух доз в сутки.

Точная дозировка РКС412 вводится в комбинации с AMN107 в зависимости от нескольких факторов, включая организм хозяина, природу и тяжесть подвергаемого лечению состояния и способа введения. Однако обычно удовлетворительные результаты достигаются, если РКС412 вводят парентерально, например внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, подкожно, внутрь опухоли или ректально, или энтерально, например перорально, предпочтительно внутривенно, или предпочтительно перорально, предпочтительно внутривенно, или предпочтительно перорально, предпочтительно в суточной дозе 0,1-10 г/кг массы тела, предпочтительно 1-5 мг/кг массы тела. При исследованиях на людях общая суточная доза 225 мг по-видимому представляет наивысшую максимально переносимую дозу (МПД). Предпочтительная внутривенная суточная доза составляет 0,1-10 мг/кг массы тела, или для наиболее крупных приматов суточная доза составляет 200-300 мг. Обычная внутривенная доза составляет 3-5 мг/кг, введение три-пять раз в неделю.

Наиболее предпочтительно РКС412 вводят перорально в виде дозированных форм, например микроэмульсий, мягких гелей или твердых дисперсий, в дозировках примерно до 250 мг/сутки, особенно 225 мг/сутки, введенных однократно, два или три раза в сутки.

Обычно первоначально вводят низкие дозы, а затем дозы ступенчато повышают до достижения оптимальной дозы для лечения организма конкретного хозяина. Верхний предел дозировки определяется побочными эффектами и может быть установлен экспериментально для подвергаемого лечению индивидуума.

Комбинации AMN107 и РКС412 могут быть объединены, по отдельности или вместе, с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и необязательно с одним или несколькими обычными фармацевтическими адъювантами, причем комбинации вводят энтерально, например перорально, в форме таблеток, капсул, каплеток и т.п., или парентерально, например внутрибрюшинно или внутривенно, в форме стерильных инъекционных растворов или суспензий. Энтеральные и парентеральные композиции могут быть приготовлены обычными способами.

Комбинация AMN107 и РКС412 может применяться одна или в сочетании, по меньшей мере, с одним фармацевтически действующим соединением для лечения данных патологий. Эти соединения могут объединяться в одном фармацевтическом препарате или в форме комбинированных препаратов «наборов частей» в том смысле, что комбинируемые составляющие могут быть дозированы независимо или применяться в виде разных фиксированных комбинаций с разными количествами комбинируемых составляющих, т.е. одновременно или в разное время. Части набора частей затем могут, например, вводиться одновременно или ступенчато, т.е. в разное время, а именно через разные или одинаковые временные интервалы для каких-либо частей набора частей. Примерами, которые могут применяться в комбинации AMN107 и РКС412, но которыми настоящее изобретение не ограничивается, являются цитотоксические лекарственные средства, например цитозинарабинозид, даунорубицин, доксорубицин, циклофосфан, VP-16 или иматиниб и др. Кроме того, комбинация AMN107 и РКС412 может объединяться с другими ингибиторами сигнальной трансдукции или другими нацеленными на онкоген лекарственными средствами, если в результате ожидается эффект синергизма.

Настоящее изобретение также имеет отношение к комбинации AMN107 и РКС412, описанной в настоящем изобретении, с иматинибом для лечения заболеваний и состояний, описанных в настоящем изобретении. Введение компонентов такой комбинации может быть одновременным, например в форме фиксированной комбинированной фармацевтической композиции или препарата, или последовательно в разное время. Введение комбинации AMN107 и РКС412 в дозированной форме согласно описанному в настоящем изобретении и иматиниба в форме его коммерческого продукта GLEEVEC^® в США (продукта GLIVEC^® в Европе) в дозах, предусмотренных для этих дозированных форм, в настоящее время является предпочтительным.

Лечение системного мастоцитоза с помощью описанной выше комбинации может быть лечением первой линии, т.е. лечением впервые диагностированного заболевания без какой-либо предварительной химиотерапии или другого лечения, или это может быть лечением второй линии, т.е. лечением заболевания после предшествующего лечения иматинибом или комбинацией AMN107 и РКС412, в зависимости от тяжести или стадии заболевания, а также от общего состояния пациента и т.д.

Эффективность комбинации AMN107 и РКС412 в лечении системного мастоцитоза подтверждается приводимыми ниже примерами. Эти примеры иллюстрируют настоящее изобретение, но не ограничивают каким-либо образом области его охвата.

Примеры

Пример 1: клиническое исследование

Оценивают действие соединения (II) на уровни транскрипта c-KIT и мутационный статус гена c-KIT в злокачественных клетках, выделенных из крови и/или костного мозга. СМ может возникнуть из-за измененной активности киназы. СМ, ассоциированный с c-KIT D816V, также может возникнуть в результате активирующей мутации в гене KIT. Q-RT-PCR для транскрипта c-KIT D816V на исходном уровне, цикл 1 сутки 15, цикл 1, 2, 3 сутки 28 и каждый третий последующий цикл, завершение исследования. Мутационный анализ с-KIT: три отдельные группы, каждая со следующими группами пациентов: СМ конечные точки: степени ответа через 3 месяца лечения.

Пример 2: комбинация AMN107 и РКС412

В данном изобретении установлено, что новые ингибиторы ТК РКС412⁵ и AMN 107²⁷ прерывают рост неопластических тучных клеток человека и клеток Ba/F3, чрезвычайно эффективно экспрессирующих KIT D816V. В этом отношении РКС412 представляется более мощным соединением. Также было установлено, что РКС412 и AMN107 действуют синергидно, вызывая подавление роста клеток НМС-1, экспрессирующих или утративших KIT D816V. Эти данные показывают, что РКС412 и AMN107 могут быть новыми перспективными лекарственными средствами направленного действия для лечения мастоцитоза.

Материалы и методы

Реагенты

ТК-ингибиторы иматиниб (STI571), AMN107²⁷ и РКС412⁵ приобретают в фирме Novartis Pharma AG (Базель, Швейцария). Исходные растворы AMN107 и РКС412 получают растворением в диметилсульфоксиде (ДМСО) (фирма Merck, Дармштадт, Германия). Рекомбинантный человеческий (рч) фактор стволовых клеток (ФСК) получают от фирмы Strathmann Biotech (Ганновер, Германия), среду RPMI 1640 и фетальную сыворотку теленка (ФСТ) получают от фирмы РАА laboratories (Pasching, Австрия), L-глутамин и среду Дульбекко, модифицированную по способу Исков (Iscove's modified Dulbecco's medium - IMDM), получают от фирмы Gibco Life Technologies (Gaithersburg, Мэриленд), ³H-тимидин получают от фирмы Amersham (Buckinghamshire, Великобритания), а пропидиум иодид получают от фирмы Sigma (Сэнт-Луис, Монтана).

Интерферон альфа (ИФНα) получают от фирмы Roche (Базель, Швейцария), 2-хлордезоксиаденозин (кладрибин, обозначаемый в настоящем изобретении «2CdA») получают от фирмы Janssen Cilag (Titusville, Нью-Джерси), а рч интерлейкин-4 (ИЛ-4) получают от фирмы Peprotech (Rocky Hill, Нью-Джерси). Меченые фикоэритрином (ФЭ) моноклональные антитела (мАт) IVTО85 (CD2), WM15 (CD13), YB5.B8 (CD117), N6B6.2 (CD164) и 97А6 (CD203c) получают от фирмы Becton Dickinson (San Jose, Калифорния), а ФЭ-конъюгированное мАт CLB-gran12 (CD63) получают от фирмы Immunotech (Марсель, Франция).

Клетки НМС-1, экспрессирующие или утратившие с-KIT D816V

Тучные клетки человека линии НМС-1²⁸, полученные от пациента с тучноклеточным лейкозом (ТКЛ), любезно предоставил доктор J. H. Butterfield (клиника Mayo Clinic, Рочестер, Миннесота). Используют два субклона НМС-1: субклон НМС-1.1, несущий мутацию с-KIT, V560G, но не мутацию с-KIT D816V²⁰, и второй субклон, НМС-1.2, несущий две мутации с-KIT, т.е. V560G и D816V.²⁰ Клетки НМС-1 выращивают в среде IMDM с добавлением 10% ФСТ, L-глутамина и антибиотиков при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Клетки НМС-1, содержащиеся в исходном растворе, оттаивают каждые 4-8 недель и еженедельно пересевают. Для контроля «фенотипической стабильности» клетки НМС-1 периодически проверяют по следующим критериям: i) наличию метахроматических гранул, ii) экспрессии поверхностной KIT, и iii) понижению модулирования действия ИЛ-4 (100 мкг/мл, 48 ч) на экспрессию KIT.²⁹ Такие контрольные исследования проводят перед каждой серией экспериментов и используют только те клетки, которые проявляют все свойства исходного клона.²⁹

Клетки Ba/F3 с индуцируемой экспрессией с-KIT дикого типа или с-KIT D816V

Получение клеток Ba/F3 с доксициклин-индуцируемой экспрессией дт с-KIT (Ton.Kit.дт) или с-KIT D816V подробно описаны в работе³⁰. Вкратце, клетки Ba/F3, экспрессирующие обратный тет-трансактиватор^31,32 подвергают совместной трансфекции вектором pTRE2 (фирма Clontech, Palo Alto, Калифорния), содержащим с-KIT D816V кДНК (или дт с-KIT кДНК, обе любезно предоставленные доктором J.В.Longley, Колумбийский университет, Нью-Йорк, США) и pTK-Hyg (фирма Clontech), путем электропортации. После электропортации отбирают стабильно трансфецированные клетки по росту на гигромицине и клонируют, ограничивая разведения. В настоящем исследовании во всех экспериментах используют субклон Ton.Kit.D816V.27. Клетки Ton.Kit.D816V медленно растут при обработке доксициклином.³⁰ По результатам вестерн-блоттинга, иммуноцитохимии, ПЦР и анализа длины полученных рестрикцией фрагментов полиморфизмов (restriction fragment length polymorphism - RFLP)¹⁶, экспрессия KIT D816V может быть индуцирована в клетках Ton.Kit.D816V.27 в течение 12 ч экспозиции доксициклином (1 мкг/мл).³⁰

Выделение первичных неопластических тучных клеток

Первичные тучные клетки костного мозга получают от женщины (в возрасте 54 лет) со скрытым системным мастоцитозом (ССМ) - особым подвариантом СМ, отличающимся вовлечением множественных гематопоэтических поколений клеток и выявлением c-KIT D816V в поколении тучных и нетучных миелоидных клеток.^34-36 Для контроля исследуют костный мозг, полученный от пациента со злокачественной лимфомой (без участия костного мозга), претерпевающей стадийность. От обоих пациентов получают согласие на взятие путем пункции образца костного мозга. Аспират костного мозга получают из заднего подвздошного гребня и собирают в шприцы, содержащие гепарин без консерванта. Клетки наслаивают на Ficoll для выделения мононуклеарных клеток (МНК). Установлено, что фракции МНК содержат 5% тучных клеток у пациентов со ССМ, и менее 1% тучных клеток в контрольном образце (нормальном костном мозге). Жизнеспособность клеток составляет более >90%. Наличие мутации D816V в c-KIT МНК костного мозга у пациентов с ССМ подтверждают методами RT-PCR и RFLP, описанными ранее.¹⁶

Анализ KIT-фосфорилирования методом вестерн-блоттинга

Клетки НМС-1 (10⁶/мл) и Ba/F3 (10⁶/мл), содержащие или KIT дикого типа (Tоn.Kit.дт), или KIT D816V (Ton.Kit.D816V.27), инкубируют с РКС412 (1 мкмоль), AMN107 (1 мкмоль), иматинибом (1 мкмоль) или в контрольной среде при 37°С в течение 4 ч. До обработки ингибирующими лекарственными средствами клетки Ton.Kit.дт и Ton.Kit.D816V.27 инкубируют с доксициклином (1 мкг/мл) при 37°С в течение 24 ч для индукции экспрессии KIT. В случае клеток Ton.Kit.дт KIT-фосфорилирование индуцируют добавлением рекомбинантного человеческого (рч) фактора стволовых клеток (ФСК) (100 нг/мл). Иммунопреципитацию (ИП) и вестерн-блоттинг выполняют согласно ранее описанному.³² Вкратце, клетки промывают при 4°С и повторно суспендируют в буфере RIPA (1 мл буфера на 10⁸ клеток), содержащем 50 мМ Tris, 150 мМ натрия хлорида (NaCl), 1% нонидета Р40 (NP-40), 0,25% дезоксихолевой кислоты, 0,1% натрия додецилсульфата (НДС), 1 мМ этилен-диамин-тетрауксусной кислоты (EDTA), 1 мМ натрия фторида (NaF), 1 мМ фенилметилсульфонил фторида (ФМСФ) и 1 мМ натрия ортованадата (Na₃VO₄). После инкубирования в буфере RIPA, в который вносят смесь ингибитора протеиназы (фирма Roche) и выдерживают в течение 30 мин при 4°С (энергично встряхивая каждые 5 мин), лизаты центрифугируют для удаления нерастворимых частиц. Для ИП лизаты 1×10⁷ клеток инкубируют с анти-KIT антителом SR1³⁷ (любезно предоставленным доктором V.Broudy, Университет штата Вашингтон, Сиэтл, Вашингтон) или с анти-KIT антителом 1С1³⁸ (любезно предоставленным доктором H.-J.Bühring, Университет Тюбингене, Германия) и белковые G Sepharose гранулы (фирма Amersham) в ИП-буфере (50 мМ Tris-Cl, pH 7.4, 150 мМ NaCl, 100 мМ NaF и 1% NP40) при 4°С в течение ночи. Затем гранулы промывают трижды в ИП буфере. Лизаты и иммунопреципитаты затем разделяют гель-электрофорезом в условиях восстановления 7,5% СДС-полакриламидным гелем и переносят на нитроцеллюлозную мембрану (фирма Protran, Schleicher & Schuell, Keene, Нью-Хэмпшир) в буфере, содержащем 25 мМ Tris, 192 мМ глицин и 20% метанол при 4°С. Мембраны блокируют в течение 1 ч в 5% блокирующем реагенте (фирма Roche) и затем инкубируют с анти-KIT антителом 1С1 или с моноклональным антителом 4G10 (фирма Upstate Biotechnology, Лейк-Плэсид, Нью-Йорк), направленных против тирозин-фосфорилированных белков, при 4°С в течение ночи. Реакционноспособность антител визуализируют овечьим антителом к IgG мыши и реагентом для определения Lumingen PS-3 (оба реактива фирмы Amersham) и пленку CL-Xposure (фирма Pierce Biotechnology, Rockford, Иллинойс).

Измерение потребления ³H-тимидина

Для определения способности лекарственных средств ингибировать рост клеток НМС-1 и Ba/F3, содержащих либо ФСК-активированный дт KIT (Ton.Kit.дт), либо KIT D816V (Ton.Kit.D816V.27), клетки инкубируют с разными концентрациями РКС412 (100 пкмолей - 10 мкмолей), AMN107 (1 нмоль - 100 мкмолей) или иматиниба (3 нмоля - 300 мкмолей) в 96-луночных планшетках для культуры клеток (фирма РТТ, Trasadingen, Швейцария) при 37°С в атмосфере 5% СО₂ в течение 48 ч. Для определения длительности курсов лечения клетки НМС-1 подвергают воздействию РКС412 (300 нмолей) на протяжении разных периодов времени (1, 12, 24, 36 и 48 ч). В отдельных экспериментах клетки НМС-1 (оба субклона) инкубируют с разными концентрациями ИФНα (0,1-500000 Ед/мл) или 2CdA (0,005-10 мкг/мл). Первичные клетки (клетки костного мозга пациента с ССМ и контрольные клетки костного мозга) культивируют с ингибиторами (РКС412, 50-500 нмолей, AMN107, 100 нмолей - 30 мкмолей, иматиниб, 1 мкмоль) или без них в течение 48 ч.

После инкубирования добавляют 1 мкмоль ³H-тимидина в каждую лунку и выдерживают в течение 12 ч (37°С). Затем клетки собирают фильтрацией на мембранах (фирма Packard Bioscience, Мэриден, Коннектикут) в приборе Filtermate 196 (Packard Bioscience). Фильтры высушивают на воздухе и связанную радиоактивность подсчитывают в β-счетчике (прибор Top-Count NXT, фирма Packard Bioscience).

В отдельной серии экспериментов определяют действие комбинаций лекарственных средств (аддитивное или синергическое) на рост неопластических тучных клеток. Для этого клетки НМС-1 (оба субклона) обрабатывают разными концентрациями лекарственных средств (РКС412, AMN107, иматиниба, ИНФα, 2CdA) в фиксированном соотношении концентраций лекарственных средств. Взаимодействие лекарственных средств (аддитивное или синергическое) определяют путем подсчета величин индекса комбинации с применением коммерчески доступного программного обеспечения (программа Calcusyn, фирма Biosoft, Фергюсон, Монтана).³⁹ Все эксперименты проводят в трех повторах.

Оценка апоптоза по морфологии и по результатам электронной микроскопии

Действие ТК-ингибиторов на апоптоз клеток НМС-1 исследуют морфологически, методом жидкостной цитометрии и с помощью электронной микроскопии. В типичных экспериментах клетки НМС-1 инкубируют с различными концентрациями РКС412 (500 нмолей - 1 мкмоль), AMN107 (50 нмолей - 10 мкмолей), иматиниба (50 нмолей - 10 мкмолей) или в контрольной среде в 6-луночных планшетах для культивирования (РТТ) в среде IMDM, содержащей 10% ФСТ при 37°С в течение 24 ч. Процент апоптических клеток подсчитывают в препаратах, полученных центрифугированием клеток, окрашенных по Райт-Гимзе. Апоптоз определяют по общепринятым цитоморфологическим критериям (сморщиванию клеток, конденсации структур хроматина).⁴⁰

Для подтверждения апоптоза клетки НМС-1 исследуют с помощью электронной микроскопии по описанной методике ^41,42, используя клетки НМС-1 (оба субклона), обработанные PKC412 (500 нмоль, 900 нмоль или 1 мкмоль), AMN107 (1 мкмоль), иматинибом (1 мкмоль) или контрольной средой в пластиковых колбах для культивирования объемом 25 мл (РТТ) в течение 24 ч. После инкубирования клетки отмывают и фиксируют в 2% параформальдегиде, 2,5% глутаральдегиде и 0,025% CaCl₂, буферизованных в 0,1 моль/л натрия какодилата (pH 7,4) при комнатной температуре в течение 60 мин. Затем клетки трижды отмывают в буфере 0,1 моль/л натрия какодилата, суспендируют в 2% агаре и центрифугируют. Затем пеллеты фиксируют 1,3% OsO₄ (буферизованном в 0,66 моль/л коллидина) и окрашивают «совместно» в буфере 2% уранил ацетат и натрий малеат (pH 4,4) в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем пеллеты промывают, обезвоживают в серии разведения спирта и погружают в EPON 812. Ультратонкие срезы (85 нмолей) нарезают и помещают на золотые сеточки. Срезы контрастируют в уранилацетате и цитрате свинца, затем просматривают с помощью трансмиссивного электронного микроскопа JEOL 1200 EX II (фирма JEOL, Токио, Япония). Наличие апоптических клеток определяют с помощью общепринятых критериев (см. выше).

Оценка апоптоза методом Tunel и жидкостной цитометрией

Для подтверждения апоптоза в клетках НМС-1, экспонированных РКС412 (1 мкмоль), AMN107 (1 мкмоль) или иматинимоб (1 мкмоль) на протяжении 24 ч, используют ранее описанный метод Tunel (Terminal transferase-mediated dUTP-fluorescene Nick End-Labeling - Tunel).^43,44 Вкратце, клетки сначала отмывают фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и затем фиксируют в 1% формальдегиде pH 7,4 при 0°С в течение 15 мин. После этого клетки обрабатывают 70% этанолом (ледяным) в течение 1 ч, промывают ФСБ и инкубируют в растворе, тормозящем трансферазную реакцию и содержащим CoCl₂, ДНК-дезоксинуклеотидилэкзотрансферазу и биотин-16-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфат (раствор приготовляют, руководствуясь инструкциями производителя фирмы Boehringer, Мангейм, Германия) при 37°С в течение 10 мин. После инкубации клетки промывают и затем инкубируют со стрептавидином в комплексе с флуоресцеином (фирма Boehringer, Мангейм) (10 мкг/мл) при 37°С в течение 20 мин. Клетки НМС-1 затем промывают и анализируют методом Nikon Microphot-FXA флуоресцентной микроскопии (Токио, Япония).

Для определения апоптоза и жизнеспособности клеток методом жидкостной цитометрии клетки окрашивают комбинацией аннексина V/пропидиума. Для этой цели клетки НМС-1 обрабатывают РКС412 (0,5, 1 и 2,5 мкмолей), AMN107 (0,5, 1 и 2,5 мкмолей), иматинибом (0,5, 1 и 2,5 мкмолей) или контрольной средой при 37°С в течение 24 ч. После этого клетки промывают в ФСБ и затем инкубируют с аннексином V-APC (фирма Alexis Biochemicals, Лозанна, Швейцария) в связывающем буфере, содержащем HEPES (10 мМ, pH 7,4), NaCl (140 мМ) и CaCl₂ (2,5 мМ). Затем добавляют пропидиум иодид (1 мкг/мл). После этого клетки промывают и анализируют жидкостной цитометрией с помощью прибора FACSCalibur (фирма Becton Dickinson).

Оценка экспрессии связанных с активацией поверхностных антигенов на поверхности клеток линии НМС-1

Экспрессию антигенов на поверхности клеток НМС-1, несущих KIT D816V (НМС-1.2 клетки), определяют жидкостной цитометрией после краткосрочного культивирования (в течение 24 ч) в контрольной среде или среде, с добавкой ТК ингибиторов (РКС412, 1 мкмоль, AMN107, 1 мкмоль, иматиниб, 1 мкмоль). В отдельных экспериментах применяют разные концентрации РКС412 (50, 100, 250, 500 и 1000 молей). После инкубирования с лекарственными средствами клетки НМС-1 отмывают и подвергают однократной цветовой жидкостной цитометрии, используя ФЭ-конъюгированные антитела против антигенов тучных клеток, о которых известно, что они сверхэкспрессируются на неопластических тучных клетках при СМ (по сравнению с нормальными тучными клетками) и/или экспрессируются на ранней стадии мастопоэза (CD2, CD13, CD63, CD117, CD164, CD203c),⁴⁵,⁴⁷ Жидкостную цитометрию выполняют на приборе FACSan (фирма Becton Dickinson) по ранее описанной методике.²⁹

Статистический анализ

Для определения существенных различий между темпами пролиферации, апоптозом и уровнями поверхностной экспрессии после обработки клеток НМС-1 ингибиторами, к зависимым выборкам применяют критерий Стьюдента. Результаты рассматривают статистически значимыми при величине p<0,05.

Результаты

Влияние РКС412 и AMN107 на ТК-активность D816V-мутантной KIT

Оценка методами ИП и вестерн-блоттинга показывает, что РКС412 (1 мкмоль) снижает фосфорилирование KIT в клетках НМС-1.1 (проявляющих мутацию V560G c-KIT, но не мутацию D816V с-KIT), а также в клетках НМС-1.2, несущих и V560G-мутантный, и D816V-мутантный вариант KIT (фиг.1А и 1Б). Новый ТК-ингибитор AMN107 (1 мкмоль) сильно снижает KIT-фосфорилирование в клетках НМС-1.1, но незначительно влияет на KIT-фосфорилирование в клетках НМС-1.2 в концентрации 1 мкмоль. Сходным образом иматиниб (1 мкмоль) снижает KIT-фосфорилирование в клетках НМС-1.1, но не подавляет KIT-фосфорилирование в клетках НМС-1.2 (фиг.1А и 1Б). На следующем этапе исследуют действие ТК-ингибиторов на клетки Ba/F3, проявляющие дт KIT (Ton.Kit-дт) или KIT D816V (Ton.Kit.D816V.27) после обработки доксициклином. В клетках Ton.Kit-дт KIT может фосфорилироваться в присутствии ФСТ (но не в отсутствии ФСК), также установлено, что KIT фосфорилируется конститутивно в клетках Ton.Kit.D816V.27 (фиг.1В). На фиг.1В показано, что все три ТК-ингибитора (РКС412, AMN107, иматиниб, каждый в концентрации 1 мкмоль) снижают ФСК-индуцированное фосфорилирование KIT в клетках Ton.Kit.дт. Напротив, только РКС412, и в меньшей степени AMN107, снижают ФСК-независимое фосфорилирование KIT в клетках Ton.Kit.D816V-27. Иматиниб (1 мкмоль) не оказывает заметного воздействия на фосфорилирование KIT в этих клетках (фиг.1Г). Эти данные показывают, что РКС412 является новым мощным ингибитором активности ТК дтKIT, KIT V560G и KIT D816V, и что AMN107 является новым мощным ингибитором дтKIT и KIT V560G, и более слабым ингибитором (ауто)фосфорилирования KIT D816V.

Влияние ТК-ингибиторов на потребление ³H-тимидина клетками НМС-1

При изучении длительности курса лечения максимальное подавляющее действие РКС412, AMN107 и иматиниба на рост клеток НМС-1.1 и НМС-1.2 исследуют через 36-48 ч. Фиг.2А показывает зависящее от времени воздействие РКС412 (300 нмолей) на рост клеток НМС-1.2. На фиг.2Б и 2В показано, что РКС412 и AMN107 противодействуют потреблению ³H-тимидина клетками НМС-1.1 и НМС-1.2 доза-зависимым образом. Интересно, что величины IC₅₀ для этих двух субклонов находятся в одном и том же диапазоне (50-250 нмолей) (фиг.2В). Напротив, величины IC₅₀ влияния AMN107 на пролиферацию существенно выше в клетках НМС-1.2 (1-5 мкмолей) по сравнению с клетками НМС-1.1 (3-10 нмолей) (фиг.2В). Подтверждено предположение, что иматиниб эффективен в фармакологически релевантных концентрациях только в отношении клеток НМС-1.1 (IC₅₀: 10-30 нмолей), и не наблюдают существенного антипролиферативного действия иматиниба на клетки НМС-1.2 (фиг.2Г), что подтверждает ранее полученные данные.^20-22 Интересным является наблюдение, заключающееся в том, что AMN107 - наиболее эффективное соединение (при сопоставлении молярных концентраций) при оценке подавления тремя лекарственными средствами роста клеток НМС-1.1, проявляющих мутацию V560G гена с-KIT (но не мутацию D816V c-KIT) (фиг.2Б-Г).

Воздействие ТК-ингибиторов на рост клеток Ba/F3, экспрессирующих дтKIT или KIT D816V

Установлено и показано на фиг.3, что все три ТК-ингибитора препятствуют ФСК-зависимому росту обработанных доксициклином (KIT-экспрессирующих) клеток Ton.Kit-дт доза-зависимым образом с величинами IC₅₀ 3-30 нмолей для РКС412, 30-300 нмолей для AMN107 и 3-30 нмолей для иматиниба. Напротив, установлено, что в клетках Ton.Kit.D816V только РКС412 (IC₅₀: 100-300 нмолей) и, в меньшей степени, AMN107 (IC₅₀: 1-3 мкмоля) ингибируют включение ³H-тимидина, причем не обнаружено существенного воздействия иматиниба в исследуемом диапазоне концентраций (фиг.3Б). Установлено, что ни один из трех используемых ингибиторов не прерывает роста клеток Ton.Kit.дт или Ton.Kit.D816V.27 в отсутствии доксициклина, т.е. в отсутствии KIT (фиг.3А и 3Б). В других контрольных экспериментах ни доксициклин (1 мкг/мл), ни ТК-ингибиторы (иматиниб, РКС412, AMN107), не показывают подавления роста контрольных (не подвергнутых трансфекции) клеток Ba/F3 (данные не представлены).

РКС412 и AMN107 прерывают рост первичных неопластических (тучных) клеток, экспрессирующих KIT D816V

Для подтверждения антипролиферативного действия РКС412 и AMN107 при системном мастоцитозе исследуют ответ тучных клеток, производных первичного неопластического костного мозга, у пациента со скрытым CM - особым вариантом СМ, при котором большинство миелоидных клеток (и являющихся, и не являющихся потомством тучных клеток) проявляет KIT D816V. В самом деле, хотя чистота тучных клеток составляет только 4%, большинство миелоидных клеток в данном образце проявляет KIT D816V. Установлено, что в этих неопластических клетках костного мозга РКС412 и AMN107 ингибируют спонтанное потребление ³H-тимидина доза-зависимым образом, но не установлено существенного воздействия иматиниба (1 мкмоля) (фиг.4). В контрольном образце (нормальный костный мозг, нет гематологического заболевания) установлено, что РКС412 не влияет на потребление ³H-тимидина (не показано).

РКС412 и AMN107 индуцируют апоптоз в клетках НСМ-1

Для изучения механизмов, лежащих в основе действия РКС412 и AMN107, выражаемого в подавлении роста неопластических тучных клеток человека, обладающих или утративших KIT D816V, анализируют морфологические и биохимические признаки апоптоза в клетках НМС-1.1 и НМС-1.2 после воздействия лекарственных средств. В этих исследованиях установлено, что РКС412 индуцирует апоптоз в обоих субклонах клеток НМС-1 доза-зависимым образом (фиг.5А и 5Б). Также установлено, что AMN107 индуцирует апоптоз в обоих субклонах клеток НМС-1 доза-зависимым образом, но действие этого соединения намного более выражено в клетках НМС-1.1 (фиг.5В) по сравнению с эффектом, наблюдаемым в клетках НМС-1.2 (фиг.5Г). Сходным образом было установлено, что иматиниб вызывает апоптоз в клетках НМС-1.1 (фиг.5Е), но не в клетках НМС-1.2 (фиг.5Е). Апоптоз-индуцирующее действие этих лекарственных средств на клетки НМС-1 может быть подтверждено электронной микроскопией. Кроме того, все три лекарственных средства (каждое в концентрации 1 мкМ) индуцируют апоптоз в клетках НМС-1.1, но в клетках НМС-1.2 только РКС412 и, в меньшей степени, AMN107, способны индуцировать апоптоз. Фиг.6 показывает апоптоз-индуцирующий эффект РКС412 (1 мкМ, 24 ч) на клетки НМС-1.2. На фиг. показано, что многие клетки НМС-1, обработанные РКС412 (фиг.6Б-Г), проявляют типичные ультраструктурные признаки апоптоза в отличие от клеток, полученных в контрольной среде (фиг.6А). В итоге можно показать апоптоз-индуцирующее действие РКС412 и AMN107 в клетках НМС-1 совместным окрашиванием аннексином V/пропидиум иодидом, жидкостной цитометрий (фиг.7) и методом Tunel (фиг.8). В обоих исследованиях установлено, что РКС412 (1 мкМ) и в меньшей степени AMN107 (1 мкМ), индуцируют апоптоз в клетках НМС-1.2, а иматиниб не оказывает такого действия (фиг.7 и 8 Д-З). Напротив, в клетках НМС-1.1 все три соединения индуцируют апоптоз, что было подтверждено методом Tunel (фиг.8А-Г).

Приведенные данные показывают, что действие РКС412 и AMN107 на клетки НМС-1, подавляющее рост, ассоциировано с индукцией апоптоза.

РКС412 снижает регуляцию экспрессии связанных с активацией и СМ-связанных антигенов на поверхности клеток НМС-1

Некоторые поверхностные клеточные антигены, обычно экспрессируемые (или сверэкспрессируемые) на поверхности неоплазматических тучных клеток при СМ, могут участвовать в росте, активации или разрушении неопластических клеток.^45,46 Регуляция некоторых из этих молекул может быть непосредственно повышена D816V-мутантным вариантом KIT.³⁰ В связи с этим был поставлен вопрос: могут ли РКС412, AMN107 или иматиниб влиять на экспрессию поверхностных клеточных антигенов клеток НМС-1.2. Установлено, что необработанные клетки НМС-1.2 экспрессируют LFA-2 (CD2), аминопептидазу-N (CD13), CD63, KIT (CD117), CD164 и E-NPP3 (CD203c), подтверждая ранее полученные результаты.^45-47 Инкубирование клеток НМС-1.2 с РКС412 приводит к существенному снижению экспрессии CD2, CD63 и CD164 (p<0,05) (фиг.9А). Напротив, не обнаружено существенного воздействия РКС412 на экспрессию CD13 или CD203c (фиг.9А). В случае KIT установлено небольшое понижение экспрессии на клетках НМС-1.2 под воздействием РКС412 (а также AMN107 или иматиниба), но это воздействие незначительно (p>0,05) (фиг.9А). Установлено, что действие РКС412 на экспрессию CD2 и CD63 является доза-зависимым. Фиг.9Б показывает действие различных концентраций РКС412 на экспрессию CD63 на клетках НМС-1.2. В отличие от РКС412, AMN107 или иматиниб не оказывают существенного воздействия на экспрессию антигенов CD на поверхности клеток НМС-1.2 (Фиг.9А).

РКС412 взаимодействует с другими лекарственными средствами направленного действия или традиционными лекарственными средствами, что приводит к подавлению роста клеток НМС-1

По включению ³H-тимидина установлено, что РКС412 взаимодействует с AMN107, ингибируя рост клеток НМС-1.1 и НМС-1.2 (фиг.10; табл.1). В случае клеток НМС-1.1 взаимодействие лекарственных средств, очевидно, является синергетическим, а в случае клеток НМС-1.2 взаимодействие является скорее аддитивным, чем синергетическим (фиг.10, табл.1). Кроме того, установлено, что РКС412 и 2CdA, лекарственные средства для лечения системного мастоцитоза, синергетически ингибируют рост клеток НМС-1.1, синергизм также установили для РКС412 и иматиниба (табл.1). Однако не установлено синергетического действия РКС412 и 2CdA на рост клеток НМС-1.2. Кроме того, AMN107 и иматиниб вызывают синергетический ингибирующий эффект только в отношении клеток НМС-1.1 (фиг.10), но не в клетках НМС-1.2, несущих KIT D816V (табл.1). Синергетического или аддитивного эффекта на рост клеток НМС-1 не наблюдают при комбинировании РКС412 и интерферона-альфа (ИФНα) или AMN107 и ИФНα (табл.1). Вкратце взаимодействия лекарственных средств представлены в табл.1.

В табл.1 показано действие различных комбинаций лекарственных средств на рост клеток НМС-1.1 (вверху справа, белые квадраты) и НМС-1.2 (слева внизу, серые квадраты), определенное методом включения ³H-тимидина. Каждую комбинацию лекарственного средства исследуют, по меньшей мере, в трех независимых экспериментах. Лекарственные средства применяют в фиксированном соотношении, а полученные результаты (и тип лекарственного взаимодействия) определяют с помощью вычислительной программы. Результаты исследования: +, синергизм, подавление роста; +/-, аддитивный эффект; -, эффект, меньше аддитивного (антагонизм); н.и. - не исследовали.

Обсуждение

Соматическая мутация D816V c-KIT является дефектом гена, который приводит к конститутивному активированию домена ТК в KIT-рецепторе, который принципиально важен для роста (неопластических) тучных клеток и, таким образом, для патогенеза СМ.^13-17 Таким образом, современные усилия сосредоточены на идентификации и развитии фармакологических соединений, которые могут ингибировать ТК-активность D816V-мутантного варианта KIT и, следовательно, могут ингибировать рост неопластических тучных клеток у пациентов с СМ.^9-12 Установили, что ТК-ингибитор РКС412, а также в меньшей степени AMN107, ингибируют ТК-активность KIT-D816V, а также рост неопластических тучных клеток человека, несущих данную мутацию c-KIT. Кроме того, установлено, что оба лекарственных средства взаимодействуют друг с другом и с другими лекарственными средствами направленного действия и традиционными лекарственными средствами, вызывая подавление роста неопластических тучных клеток.

РКС412 является новым стауроспорин-родственным ингибитором РКС и нескольких ТК, включая KDR, PDGFRA, FLT3 и KIT.⁵ В настоящем исследовании установлено, что РКС412 прерывает рост неопластических тучных клеток человека и клеток Ba/F3, экспрессирующих D816V-мутантный вариант KIT. Что касается клеток Ba/F3, установлено, что полученные данные согласуются с результатами Growney и др.⁴⁸ Интересно, что эффективный диапазон доз для клеток Ba/F3 такой же, что и установленный для клеток НМС-1.2, несущих KIT D816V. Другое интересное наблюдение заключается в том, что IC₅₀ действия РКС412 на два субклона НМС-1 (экспрессирующих или утративших KIT D816V) пребывает в том же диапазоне. В итоге, возможно подтверждение действия по ингибированию РКС412 в отношении первичных неопластических (тучных) клеток, экспрессирующих KIT D816V. Поскольку мутация c-KIT D816V выявляется у большинства пациентов с СМ независимо от субтипа заболевания,^13-17 полученные данные являются весьма важными. По существу, РКС412 представляется первым ТК-ингибитором, о котором известно, что он прекращает рост KIT D816V-несущих тучных клеток человека таким же образом, что и KIT дт-экспрессирующих тучных клеток. Также в связи с этим является заслуживающим внимания то обстоятельство, что эффект РКС412, проявляющийся в подавлении KIT D816V-положительных клеток, очевидно превышает антипролиферативное действие AMN107 и иматиниба. Основываясь на этой информации, представляется, что РКС412 является новым привлекательным лекарственным средством направленного действия для применения в клинической практике для лечения пациентов с (агрессивным) СМ или тучноклеточным лейкозом.

Ранее полученные данные показывают, что AMN107 является наиболее мощным ингибитором BCR/ABL ТК действия.²⁷ Также было описано, что AMN107 ингибирует активность ТК дикого типа KIT.²⁷ В настоящем исследовании установлено, что AMN107 оказывает сильное воздействие на клетки НМС-1, несущие мутацию V560G мутанта c-KIT, но лишь незначительно воздействуют на клетки НМС-1, несущие две мутации: KIT V560G и KIT D816V. Сходным образом AMN107 оказывает незначительное воздействие на рост клеток Ba/F3, экспрессирующих D816V-мутантный вариант KIT. Эти данные означают, что мутация D816V c-KIT, но не мутация V560G c-KIT, обеспечивает относительную устойчивость в отношении AMN107, хотя AMN107 сохраняет ингибиторное действие на KIT D816V-положительные клетки НМС-1 по сравнению с иматинибом. Выраженное антипролиферативное действие AMN107 на V560G-позитивные клетки также означает, что это соединение может быть наиболее привлекательным лекарственным средством для опухолей желудочно-кишечных стромальных клеток (gastrointestinal stroma cell tumors - GIST), в которых ранее были установлены мутации в кодоне 560 гена c-KIT.⁴⁹

Ряд фармакологических ингибиторов, нацеленных на активность ТК проонкогенных молекул, был ранее разработан для клинической гематологии.^5,12,19,27 Подавление этими ТК-ингибиторами роста неопластических клеток (экспрессирующих соответствующую мишень) обычно ассоциировано с утратой ТК-активности и последующего апоптоза. В настоящем исследовании установлено, что действие РКС412, направленное на неопластические тучные клетки человека (НМС-1), ассоциировано с ТК-подавлением KIT (мутантного) и с апоптозом. По сути, можно продемонстрировать, что РКС412 индуцирует апоптоз в клетках НМС-1.1 (экспрессирующих KIT V560G, но не KIT D816V) и НМС-1.1 (экспрессирующих KIT V560G и KIT D816V). Апоптоз-индуцирующее действие РКС412 может быть продемонстрировано с помощью световой и электронной микроскопии, а также жидкостной цитометрией и методом Tunel. Согласно прогнозу AMN107 и иматиниб показывают значительное апоптоз-индуцирующее действие на клетки НМС-1.1, но не на клетки НМС-1.2.

Ряд поверхностных клеточных антигенов обычно экспрессируется (или сверхэкспрессируется) на тучных клетках человека. И напротив, в отличие от нормальных тучных клеток неопластические тучные клетки у пациентов с СМ экспрессируют CD2 и CD25.^45,46 Кроме того, уровни CD63 и CD203c, экспрессированные на неопластических тучных клетках при СМ, сравнимы с нормальными тучными клетками. В некоторых случаях, например при CD63, D816V-мутантные варианты KIT могут непосредственно привести к повышенной экспрессии на поверхности клеток.³⁰ В связи с этим важно установить, связано ли нацеливание D816V-мутантных KIT в клетках НМС-1 за счет РКС412 со снижением экспрессии «СМ-связанных» поверхностных CD-антигенов. В результате исследований, выполненных в настоящем изобретении, установлено, что РКС412 понижают экспрессию CD2, CD63 и CD 164 в клетках НМС-1.2, проявляющих KIT D816V. Также установили небольшое действие РКС412 (а также AMN107) на экспрессию KIT. Интересно, что AMN107 не подавляет экспрессию CD2 и CD63 на клетках НМС-1.2. Возможно, это происходит из-за более слабого воздействия данного соединения на ТК-активность KIT D816V при сравнении с действием РКС412.

Ряд ранее полученных данных подтверждает, что лечение миелоидных неоплазм ингибиторами ТК в качестве единственных агентов может быть несущественным для подавления заболевания в течение пролонгированных отрезков времени. Это было подтверждено в случае применения иматиниба для лечения хронического миелолейкоза (ХМЛ) (прогрессирующего)^50,51, а также для лечения пациентов с АСМ или ТКЛ.⁵² У последних пациентов это особенно важная проблема, поскольку мутация D816V обусловливает первичную (относительную) устойчивость KIT в отношении иматиниба и, в меньшей степени, относительную устойчивость в отношении AMN107. Для преодоления устойчивости может быть предусмотрен ряд различных фармакологических стратегий. Одна из возможностей заключается в применении комбинаций лекарственных средств. В связи с этим важно установить, будут ли РКС412 и AMN107 проявлять синергическое антипролиферативное действие на клетки НМС-1.1 и НМС-1.2. В настоящем изобретении было установлено, что РКС412 кооперируются с иматинибом и AMN107 при проявлении подавления роста обоих клонов НМС-1. Кроме того, РКС412 и 2CdA, лекарственное средство, которое прерывает рост неопластических тучных клеток in vivo у пациентов с агрессивной формой СМ, совместно проявляют подавляющее действие на рост клеток НМС-1.1- и НМС-1.2. Интересно отметить, что взаимодействие лекарственных средств является синергетическим только по отношению к клеткам НМС-1.1, но не НМС-1.2. Это может быть объяснено относительно слабым действием (AMN107) или отсутствием действия (иматиниб) одновременно применяемых лекарственных средств на KIT ТК активность и, таким образом, на рост клеток НМС-1.2, несущих мутацию D816V, по сравнению со значительно более выраженным действием тех же лекарственных средств на клетки НМС-1.1. Не наблюдают суммарного действия лекарственных средств при комбинировании ИФНα с AMN107 или РКС412. Остается невыясненным, имеют ли комбинации РКС412 и других (направленного действия) лекарственных средств клинически значимое действие для пациентов с АСМ или ТКС.

Таким образом, до настоящего времени подтверждено, что только несколько агентов обладают антипролиферативным действием на неопластические тучные клетки in vivo у пациентов с СМ, причем ни одно из этих лекарственных средств не вызывает длительной полной ремиссии у пациентов с АСМ или ТКЛ. В связи с этим информация о том, что РКС412 является наиболее мощным новым ингибитором роста неопластических тучных клеток человека, несущих D816V-мутантный вариант KIT, представляет особый интерес.

Таким образом, было установлено, что РКС412 и AMN107 являются новыми перспективными лекарственными средствами, нацеливающими KIT дикого типа и мутантные варианты KIT при СМ. Несмотря на то, что каждое из двух лекарственных средств может проявлять четкий фармакологический профиль с единым действием на мутантные варианты KIT, наиболее эффективный и перспективный подход в будущем может заключаться в комбинировании обоих лекарственных средств друг с другом или с клинически апробированным лекарственным средством 2CdA для лечения пациентов с АСМ или ТКЛ.

Пример 2: комбинация дасатиниба и РКС412

У большинства пациентов с системным мастоцитозом (СМ), в том числе агрессивным CM (ACM) и тучноклеточным лейкозом (ТКЛ), неопластические клетки проявляют D816V-мутантный вариант KIT. Мутантный вариант KIT-D816V проявляет конститутивную активность тирозинкиназы (ТК) и вовлечен в злокачественный рост клеток. В связи с этим предпринимают шаги для поиска KIT-D816V-нацеливаемых лекарственных средств. В настоящем изобретении установлено, что ТК-ингибитор дасатиниб (BMS-354825) прерывает ТК-активность дикого типа (дт) KIT и KIT-D816V в клетках Ba/F3 с доксициклин-индуцируемой KIT-экспрессией. Кроме того, установлено, что дасатиниб ингибирует KIT D816V-индуцируемое формирование кластера и жизнеспособность клеток Ba/F3, а также рост клеток НМС-1.1 (KIT-D816V-отрицательных) и НМС-1.2 (KIT-D816V-положительных). Действие дасатиниба является доза-зависимым, причем величины IC₅₀ в 100-1000 раз выше в тех клетках, которые несут KIT-D816V, по сравнению с клетками, утратившими KIT-D816V. Установлено, что ингибирующее действие дасатиниба в клетках НМС-1 ассоциировано с апоптозом и снижает экспрессию CD2 и CD63. Кроме того, установлено, что дасатиниб взаимодействует с РКС412, AMN107, иматинибом и 2CdA, приводя к подавлению роста. Установлено, что в клетках НМС-1.1 все взаимодействия лекарственных средств проявляют эффект синергизма. И, напротив, в клетках НМС-1.2 синергетический эффект проявляют только комбинации «дасатиниб + РКС412» и «дасатиниб + 2CdA». Таким образом, эти лекарственные комбинации могут представлять основу для перспективного подхода к лечению агрессивного СМ или ТКЛ.

Введение

Рецепторные тирозинкиназы, например, рецептора фактора роста, полученного из тромбоцитов (platelet derived growth factor receptor - PDGFR), или рецептора фактора стволовых клеток (stem cell factor receptor - SCFR, KIT), часто бывают разрегулированными и проявляют конститутивную тирозинкиназную (ТК) активность у пациентов с гематопоэтическими неоплазмами.^1-5 В связи с этим данные молекулы являются привлекательными мишенями для медикаментозной терапии. В самом деле, за несколько последних лет разработано несколько принципов лечения, основанных на новых лекарственных средствах, нацеленных на принципиально важные ТК в неопластических миелоидных клетках.^1-5

Системный мастоцитоз (СМ) является неоплазмой, которой свойственны усиленный рост и накопление неопластических тучных клеток в одном или нескольких органах. Были описаны и безболезненный, и агрессивный варианты СМ.^6-9 У пациентов с агрессивным CM (ACM) и у пациентов с лейкозным вариантом СМ, т.е. тучноклеточным лейкозом (ТКЛ), ответ на обычные лекарственные средства недостаточный и прогноз угрожающий.^6-12 В связи с эти был предпринят ряд попыток выявления новых терапевтических мишеней в неопластических тучных клетках и разработки принципов соответствующего лечения.^9-12

У большинства пациентов с СМ, ACM или ТКЛ выявляют KIT мутацию D816V.^13-17 Эта мутация ассоциирована с лиганд-зависимым фосфорилированием KIT и автономным ростом клеток.^17,18 Основываясь на этом наблюдении, D816V-мутированный вариант KIT оценивают в качестве основной мишени для терапии.^9-12,19 В связи с этим предпринимают ряд усилий для идентификации ТК-ингибиторов, которые прерывают фосфорилирование KIT-D816V и рост неопластических тучных клеток.^9-12,19-24 Ранее было описано, что иматиниб (STI571), мощный ингибитор BCR/ABL, прерывает рост неопластических тучных клеток, проявляющих дикого типа (дт) KIT или реже встречающийся Р522С-мутированный вариант KIT.^20-23 Кроме того, установлено, что это лекарственное средство блокирует рост неопластических клеток у пациентов с хроническим эозинофильным лейкозом с гибридным геном FIP1L1/PDGFRA вместе с (или без) одновременно проявляющегося СМ.^24-26Однако иматиниб не ингибирует рост неопластических тучных клеток, несущих KIT D816V.^20-22 Ранее разными авторами было установлено, что РКС412 ²⁷прерывает ТК-активность KIT-D816V, и таким образом снижает рост неопластических тучных клеток.^28-30 Также было установлено, что новый ТК-ингибитор AMN107³¹ прерывает рост неопластических клеток, проявляющих KIT-D816V при относительно высоких концентрациях лекарственных средств.^30-32 Однако большинство из этих соединений не дает длительной полной ремиссии у пациентов с АСМ или ТКЛ, по меньшей мере, при использовании по отдельности. Кроме того, согласно указанному выше, некоторые из этих лекарственных средств действуют на тучные клетки, проявляющие дт KIT, но не ингибируют роста тучных клеток, несущих KIT-D816V. Поэтому важно в дальнейшем вести поиск новых KIT-нацеливающих ТК-ингибиторов и изучать взаимодействие лекарственных эффектов. Ранее было показано, что РКС412 и AMN107 проявляют совместное ингибирующее рост действие на клетки НМС-1.³⁰ Однако, хотя эта комбинация лекарственных средств вызывает синергетический эффект, направленный на подавление клеток НМС-1, утративших KIT-D816V, синергизма не наблюдают на клетках НМС-1.2, экспрессирующих KIT-D816V.³⁰ Другие комбинации лекарственных средств также не вызывают синергетического действия по подавлению тучных клеток, проявляющих KIT-D816V.³⁰

Дасатиниб (BMS-354825) является новым ингибитором src-киназ и нескольких ТК-ингибиторов, включая KIT.^33,34 Также было установлено, что дасатиниб ингибирует фосфорилирование KIT-D816V и рост неопластических тучных клеток.^34,35 В настоящем исследовании установлено, что дасатиниб блокирует несколько KIT-D816V-зависимых связанных с заболеванием функций в неопластических клетках, в том числе выживание и формирование кластера, а также экспрессию CD2 и CD63. Кроме того, в настоящем изобретении установлено, что дасатиниб проявляет синергическое действие вместе с РКС412 и 2CdA, вызывая подавление роста клеток НМС-1.2. Наиболее интересная информация заключается в том, что это первая комбинация ТК-ингибиторов, для которой установлено синергическое действие на тучные клетки, несущие KIT-D816V. Представленные данные также означают, что дасатиниб (один или в комбинации с другими лекарственными средствами) может быть перспективным агентом для лечения пациентов с АСМ или ТКЛ.

Материалы и методы

Реагенты

Дасатиниб (BMS-354825)33 приобретают в фирме Bristol-Myers Squibb (Ною-Брунсвик. Нью-Джерси), а иматиниб (STI571), AMN107³¹ и РКС412²⁷ - в фирме Novartis Pharma AG (Базель, Швейцария). Исходные растворы дасатиниба, AMN107 и РКС412 приготовляют растворением в диметилсульфоксиде (ДМСО) (фирма Merck, Дармштадт, Германия). Рекомбинантный человеческий (рч) фактор стволовых клеток (ФСК) приобретают в фирме Strathmann Biotech (Ганновер, Германия), среду RPMI 1640 и фетальную сыворотку теленка (ФСТ) - в фирме РАА laboratories (Pasching, Австрия), L-глутамин и среду Дульбеко в модификации Исков (Iscove's modified Dulbecco's medium - IMDM) - в фирме Gibco Life Technologies (Gaithersburg, Мэриленд), ³H-тимидин - в фирме Amersham (Buckinghamshire, Великобритания), 2-хлор-дезоксиаденозин (кладрибин = 2CdA) - в фирме Sigma (Сэнт-Луис, Миссури) и рч интерлейкин-4 (ИЛ-4) - в фирме Peprotech (Rocky Hill, Нью-Джерси). ФЭ-меченые моноклональные антитела (мАт) RPA-2.10 (CD2), WM15 (CD13), YB5.B8 (CD117) HN6B6.2 (CD164), а также МОРС-21 (mIgGI) и G155-178 (mIgG2a) приобретают в фирме Becton Dickinson (San Jose, Калифорния), ФЭ-конъюгированные мАт CLB-gran12 (CD63) - в фирме Immunotech (Марсель, Франция). ФЭ-меченое моноклональное антитело VIM5 (CD87) было любезно предоставлено доктором Otto Majdic (Институт иммунологии. Медицинский университет Вены, Австрия).

Клетки НМС-1, экспрессирующие или утратившие KIT D816V

Линия тучных клеток человека НМС-136, полученная от пациента с ТКЛ, была любезно предоставлена доктором J.Н.Butterfield (клиника Mayo Clinic, Рочестер, Миннесота). Используют два субклона клеток НМС-1, называемых НМС-1.1, которые несут KIT-мутацию V560G, но не КIT-мутацию D816V,²⁰ и второй субклон, НМС-1.2, несущий обе мутации в KIT, а именно V560G и D816V. 20 клеток НМС-1 выращивают в среде IMDM, обогащенной 10% ФСТ, L-глутамином, альфа-тиоглицерином (фирма Sigma) и антибиотиками при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Клетки оттаивают из исходного раствора каждые 4-8 недель и еженедельно пересевают. Клетки НМС-1 периодически проверяют i) на присутствие метахроматических гранул, ii) экспрессию KIT и iii) снижение модулирующего эффекта ИЛ-4 (100 Ед/мл, 48 ч) на KIT-экспрессию.³⁷

Клетки Ba/F3 с индуцибельной экспрессией дт KIT или KIT D816V

Генерация клеток Ba/F3 с доксициклин-индуцируемой экспрессией дт с-KIT (Ton.Kit.дт) или c-KIT D816V была описана ранее.^30,38 Вкратце, клетки Ba/F3, экспрессирующие обратный тет-трансактиватор^39,40, подвергают совместной трансфекции вектором pTRE2 (фирма Clontech, Palo Alto, Калифорния), содержащим кДНК KIT D816V (или кДНК дт KIT, оба типа кДНК любезно предоставлены доктором J.В.Longley, Колумбийский университет, Нью-Йорк, США) и pTK-Hyg (фирма Clontech) с помощью электропорации. Стабильно трансфецированные клетки выбирают по росту на среде с гигромицином и клонируют путем ограничения разведения. В настоящем исследовании субклон Ton.Kit.D816V.2738 используют во всех опытах. Экспрессия KIT-D816V может быть индуцирована в этих клетках (в течение 12 ч) обработкой доксициклином (1 мкг/мл).³⁸

Выделение первичных неопластических клеток

Клетки первичного костного мозга получают от одного пациента с KIT D816V-положительным АСМ и ассоциированным острым миелолейкозом (ОМЛ) и от другого пациента с нормальным костным мозгом. Образцы аспирата костного мозга собирают в шприцы, содержащие гепарин без консерванта. Клетки наслаивают на Ficoll для выделения мононуклеарных клеток (МНК). Выживаемость клеток составляет >90% в обоих случаях. Установлено, что у пациента с АСМ-ОМЛ выделенные МНК составляют >90% бластных клеток. Оба пациента дают письменное согласие перед пункцией костного мозга или отбором крови. Настоящее исследование было одобрено наблюдательным советом Института и выполнено в соответствии с хельсинской декларацией.

Клетки НМС-1 (10⁶/мл) и клетки Ton.Kit.D816V.27 (10⁶/мл), содержащие либо дт KIT (Ton.Kit.дт). либо KIT D816V (Ton.Kit.D816V.27), инкубируют с дасатинибом (1 пкМ, 1 нМ, 10 нМ, 100 нМ, 1 мкМ), РКС412 (1 мкМ), AMN107 (1 мкМ), иматинибом (1 мкМ) или в контрольной среде при 37°С в течение 4 ч. Перед экспозицией подавляющими рост лекарственными средствами клетки Ton.Kit.дт и клетки Ton.Kit.D816V.27 инкубируют с доксициклином (1 мкг/мл) при 37°С в течение 24 ч для индукции экспрессии KIT. В случае клеток дт Ton.Kit-дт KIT-фосфорилирование индуцируют внесением рч ФСК (100 нг/мл). Иммунопреципитация (ИП) и вестерн-блоттинг проводят согласно ранее описанному.^30,40 Вкратце, клетки промывают при 4°С и ресуспендируют в буфере RIPA (1 мл буфера на 10⁸ клеток), содержащем 50 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 1% нонидет Р40 (NP-40), 0,25% дезоксихолевую кислоту, 0,1% натрий додецилсульфат (НДС), 1 мМ этилен-диамин-тетрауксусная кислота (EDTA), 1 мМ NaF, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид и 1 мМ 1 мМ Na₃VO₄. После инкубирования в буфере RIPA, обогащенном коктейлем ингибитора протеиназы (фирма Roche), в течение 30 мин при 4°С лизаты центрифугируют. Для ИП лизаты 10⁷ клеток инкубируют с анти-KIT антителом 1С1 (любезно предоставленным доктором H.-J.Bühring, Университет Тюбингена, Германия) 43 и белком G Sepharose-бусинами (фирма Amersham) в ИП-буфере (50 мМ Tris-Cl, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 100 мМ NaF и 1% NP-40) при 4°С в течение ночи. Затем бусины трижды промывают в ИП-буфере. Лизаты и иммунопреципитаты разделяют электрофорезом в условиях восстановления 7,5% НДС-полиакриламидным гелем и переносят на мембрану из нитроцеллюлозы (Protran, фирма Schleicher & Schuell, Keene, Ныо-Хэмпшир) в буфере, содержащем 25 мМ Tris, 192 мМ глицин и 20% метанол при 4°С. Мембраны блокируют в течение 1 ч в 5% блокирующем реагенте (фирма Roche) и затем инкубируют с анти-KIT антителом 1С1 или с анти-фосфо-протеином мАт 4G10 (фирма Upstate Biotechnology, Лейк-Плесид, Нью-Йорк) при 4°С в течение ночи. Реакционноспособность антител становится видимой благодаря овечьему антителу к мышиному IgG и реактиву Lumingen PS-3 detection (оба препарата фирмы Amersham), с пленкой CL-Xposure (фирма Pierce Biotechnology, Рокфорд, Иллинойс).

Оценка действия лекарственного средства на рост и функцию клеток Ton.Kit.D816V.27

Клетки Ton.Kit.D816V.27 инкубируют совместно с доксициклином (1 мкг/мл) и разными концентрациями дасатиниба или AMN107 при 37°С в течение 24-48 ч. Выживаемость клеток определяют вытеснением трипанового синего. Формирование кластера исследуют с помощью инвертированного микроскопа. Предшествующие исследования показали, что экспрессия KIT-D816V в Ton.Kit.D816V.27 ассоциирована со значительным формированием кластера, и что РКС412, но не иматиниб, снижают регуляцию формирования кластера в клетках Ton.Kit.D816V.27.³⁸ В настоящем исследовании анализируют действие дасатиниба (1 пкМ-1 мкМ) и AMN107 на формирование кластера клеток Ton.Kit.D816V.27. Для контроля также исследуют действие РКС412 и иматиниба. Формирование кластера определяют с помощью световой микроскопии (подсчитывают и выражают числом кластеров на поле зрения при большом увеличении - counted as cluster per high power field = HPF) и выражают в виде процента от контроля (= доксициклин без других лекарственных средств = 100%). Все эксперименты проводят в трех повторах.

Измерение потребления ³H-тимидина

Для определения ингибирования роста лекарственными средствами клетки НМС-1 инкубируют с разными концентрациями дасатиниба (100 фМ - 10 мкМ), РКС412 (100 пкМ - 10 мкМ), AMN107 (1 нМ - 100 мкМ) или иматиниба (3 нМ - 300 мкМ) в 96-луночных планшетках для культивирования (ТРР, Trasadingen, Швейцария) при 37°С в течение 48 ч. При исследовании длительности курсов лечения клетки НМС-1 обрабатывают дасатинибом (НМС-1.1: 10 нМ, НМС-1.2: 1 мкМ) в течение 12, 24, 36 или 48 ч. В отдельных экспериментах клетки НМС-1 инкубируют с различными концентрациями 2CdA (0,005-10 мкг/мл). Первичные клетки (клетки костного мозга пациентов больных АСМ-ОМЛ и контрольные клетки костного мозга) культивируют в контрольной среде, с дасатинибом (100 пкМ - 10 мкМ), РКС412 (100 пкМ - 10 мкМ), AMN107 (100 пкМ - 10 мкМ) или иматинибом (100 пкМ - 10 мкМ) в течение 48 ч. После инкубирования вносят 1 мкКи ³H-тимидина (37°С, 12 ч). Затем клетки собирают фильтрацией на мембране (фирма Packard Bioscience, Мэриден, Коннектикут) в сборщике клеток Filtermate 196 (фирма Packard Bioscience). Фильтры высушивают на воздухе и определяют связанную радиоактивность в β-счетчике (прибор Top-Count NXT, фирма Packard Bioscience). Для определения возможного аддитивного или синергетического действия лекарственных средств на рост клеток клетки НМС-1 (оба субклона) обрабатывают различными концентрациями лекарственных средств (дасатинибом, РКС412, AMN107, иматинибом, 2CdA) при фиксированном соотношении концентраций лекарственных средств. Взаимодействия лекарственных средств (аддитивное, синергическое) определяют вычислением индекса комбинации (CI), используя программное обеспечение для вычислений (программа Calcusyn, фирма Biosoft, Фергюсон, Монтана).⁴⁴ Величина CI, равная 1, означает аддитивный эффект, величина CI меньше 1 означает синергизм лекарственных средств. Все эксперименты проводят в трех повторах.

Оценка апоптоза по морфологическим признакам и с помощью электронной микроскопии

Действие ТК-ингибиторов на апоптоз анализируют морфологически, жидкостной цитометрией и электронной микроскопией. В типичных экспериментах клетки НМС-1 инкубируют с различными концентрациями дасатиниба (1 пкМ - 1 мкМ) или в контрольной среде в 6-луночных культуральных планшетах (ТРР) в IMDM, 10% ФСТ при 37°С в течение 24 ч. Процент апоптических клеток подсчитывают в препаратах, приготовленных путем центрифугирования и окрашенных по Райт-Гимзе. Апоптоз определяют по общепризнанным цитоморфологическим критериям.⁴⁵ Для подтверждения апоптоза в клетках НМС-1 проводят анализ с применением электронной микроскопии по методике, описанной ранее^46,47 используя клетки НМС-1 (оба субклона), обработанные дасатинибом (1 пкМ, 1 нМ, 10 нМ, 100 нМ, 1 мкМ), РКС412 (1 мкМ) или контрольной средой в течение 24 ч. После инкубирования клетки отмывают и фиксируют в 2% параформальдегиде, 2,5% глутаральдегиде и 0,025% CaCl₂, буферизованных в буфере 0,1 моль/л натрия какодилата (pH 7,4), в течение 1 ч. Затем клетки отмывают, суспендируют в 2% агаре и центрифугируют. Пеллеты затем фиксируют 1,3% OsO₄ (буферизованном в 0,66 моль/л коллидине) и окрашивают «совместно» в буфере 2% уранил ацетат и натрий малеат (pH 4,4) в течение 2 ч. Затем пеллеты промывают, обезвоживают в серии разведений спирта и погружают в EPON 812. Ультратонкие срезы нарезают и помещают на золотые сеточки. Срезы контрастируют в уранилацетате и цитрате свинца, затем просматривают с помощью трансмиссивного электронного микроскопа JEOL 1200 EX II (фирма JEOL, Токио, Япония).

Оценка апоптоза методом Tunel

Для подтверждения апоптоза в клетках НМС-1, обработанных дасатинибом (1 пкМ, 1 нМ, 10 нМ, 100 нМ, 1 мкМ) или РКС412 (100 нМ, 1 мкМ), используют ранее описанный метод Tunel (Terminal transferase-mediated dUTP-fluorescene Nick End-Labeling - Tunel; фирма Roche Diagnostics, Мангейм, Германия), руководствуясь инструкциями производителя. Вкратце, клетки помещают на препараты, приготовленные путем центрифугирования, фиксируют 4% параформальдегидом в ФСБ при pH 7,4 и комнатной температуре в течение 60 мин, отмывают и затем пропитывают 0,1% Triton Х-100 и 0,1% цитрате натрия. После этого клетки отмывают и инкубируют в реакционном растворе терминальной трансферазы, содержащем CoCl₂, теринальную дезокси-нуклеотидилтрансферазу и флуоресцеин-меченый дезоксиУТФ, в течение 60 мин при 37°С. Затем клетки отмывают и анализируют с помощью флуоресцентного микроскопа Nikon Eclipse E 800 (Токио, Япония).

Оценка экспрессии связанных с активацией поверхностных антигенов на клетках НМС-1

Экспрессию клеточных поверхностных антигенов на клетках НМС-1 (обоих субклонов) определяют жидкостной цитометрией после культивирования в контрольной среде или среде с добавкой ТК-ингибиторов (дасатиниба, 1 пкМ - 5 мкМ, РКС412, 1 мкМ) при 37°С в течение 24 ч. После инкубирования с лекарственными средствами клетки отмывают и исследуют монохроматической жидкостной цитометрией, используя ФЭ-конъюгированные антитела против нескольких антигенов дифференциации тучных клеток, включая детерминанты, известные как ошибочно (селективно) экспрессируемые на неопластических тучных клетках.^48-51 Анализируемыми маркерами являются CD2, CD13, CD63, CD87, CD117 и CD164. Для осуществления жидкостной цитометрии по описанной методике используют прибор FACScan (фирма Becton Dickinson).^30,37,51

Статистический анализ

Результаты

Действие дасатиниба на ТК-активность KIT-D816V

Оценка методами ИП и вестерн-блоттинга показывает, что дасатиниб (1 нМ - 1 мкМ) снижает фосфорилирование KIT в клетках НМС-1.1 (проявляющих KIT-V560G, но не KIT D816V) (фиг.11А). В клетках НМС-1.2, несущих обе мутации (KIT-V560G и KIT-D816V), дасатиниб снижает фосфорилирование KIT в дозе 1 мкМ, но не прерывает фосфорилирования KIT при более низких концентрациях (фиг.11Б). Затем было исследовано действие дасатиниба на клетки Ba/F3, экспрессирующие либо дт KIT (Ton.Kit.дт), либо KIT D816V (Ton.Kit.D816V.27), после обработки доксициклином. В клетках Ton.Kit-дт предположительно KIT фосфорилируется в присутствии ФСК, несмотря на то, что было установлено, что KIT конститутивно фосфорилируется в клетках Ton.Kit.D816V.27. На фиг.11В показано, что дасатиниб (10 нМ - 1 мкМ) снижает ФСК-индуцированное фосфорилирование KIT в клетках Ton.Kit.дт. Напротив, в клетках Ton.Kit.D816V-27 (экспрессирующих KIT-D816V после обработки доксициклином) дасатиниб снижает фосфорилирование KIT в концентрации 0,1 и 1 мкМ, но не снижает KIT-фосфорилирования при более низких концентрациях (фиг.11Г).

Действие ТК-ингибиторов на потребление ³H-тимидина в клетках НМС-1

При изучении длительности курса лечения максимальное подавляющее действие дасатиниба на рост клеток НМС-1.1 и НМС-1.2 исследуют через 36-48 ч. Фиг.12А показывает зависимое от времени действие дасатиниба (10 нМ для клеток НМС-1.1, 1 мкМ для клеток НМС-1.2) на рост этих клеток. На фиг.12Б показано, что дасатиниб противодействуют потреблению ³H-тимидина клетками НМС-1.1 и НМС-1.2 доза-зависимым образом. Интересно, что величины IC₅₀ дасатиниба в клетках НМС-1.2 (200-500 нМ) выше по сравнению с величинами IC₅₀, установленными для клеток НМС-1.1 (1 нМ) (фиг.12 В, фиг.17). Тем не менее установлено, что дасатиниб подавляет рост клеток НМС-1.2 намного эффективнее при мольном сопоставлении с иматинибом (при параллельном анализе). Табл.2 показывает суммарные данные по величинам IC₅₀, полученным по действию ТК-ингибиторов на клетки НМС-1.1 и НМС-1.2. Результаты, полученные по действию иматиниба, AMN107 и РКС412, подтверждают ранее полученные результаты.³⁰

Таблица 2
Влияние лекарственных средств направленного действия (IC₅₀) на потребление ³H-тимидина клетками НМС-1
	НМС-1.1	НМС-1.2
Дасатиниб	0,1 нМ - 3 нМ	200 нМ - 500 нМ
Иматиниб	10 нМ - 30 нМ	10 мкМ - 30 мкМ
РКС412	50 нМ - 250 нМ	50 нМ - 250 нМ
AMN107	3 нМ - 10 нМ	1 мкМ - 5 мкМ
2CdA	100 нг/мл - 300 нг/мл	10 нг/мл - 20 нг/мл

Влияние ТК-ингибиторов на рост клеток Ba/F3. экспрессируюших дтК1Т или KIT D816V (Ton.KIT.D816V.27)

Установлено, что дасатиниб прерывает ФСК-зависимый рост обработанных доксициклином (KIT-экспрессирующих) клеток Ton.Kit.дт доза-зависимым образом (IC₅₀: 1 нМ - 10 нМ) (фиг.12В). Также было установлено, что в клетках Ton.Kit.D816V.27 дасатиниб ингибирует рост и жизнеспособность клеток (фиг.12Г). Дасатиниб не прерывает роста клеток Ton.Kit-дт в отсутствие доксициклина, т.е. в отсутствие KIT (фиг.12В). Сходным образом дасатиниб не вызывает значительного подавления роста клеток Ton.Kit.D816V.27 в отсутствие KIT D816V

(-доксициклин) (фиг.12Г). Кроме того, в дальнейших контрольных экспериментах доксициклин (1 мкг/мл) не вызывает подавления роста клеток Ba/F3, не подвергшихся трансфекции (не показано).

Воздействие дасатиниба и AMN107 на KIT-D816V-зависимое формирование кластера в клетках Ton.Kit.D816V.27

Ранее было установлено, что KIT-D186V индуцирует не только дифференциацию тучных клеток, но также формирование кластера клеток Ba/F3, что представляется особенно важным наблюдением, поскольку формирование кластеров тучных клеток является первым и важным симптоматическим признаком системного мастоцитоза.³⁸ Также было описано, что РКС412 понижает регуляцию доксициклин/KIT-D816V-индуцированного формирования кластеров в клетках Ton.Kit.D816V.27.³⁸ В предыдущем исследовании было установлено, что дасатиниб (100 нМ - 1 мкМ) и, в меньшей степени, AMN107 (200 нМ - 1 мкМ), прерывает КПЧЭ816У-зависимое формирование кластера клеток Ba/F3 доза-зависимым образом (фиг.12Д и 12Е).

Дасатиниб прерывает рост первичных неопластических клеток у пациента с KIN D816V-положительным СМ с ассоциированным ОМЛ

Для подтверждения антипролиферативного лекарственного действия дасатиниба при СМ исследуют первичные неопластические клетки у пациентов с KIT D816V-положительным АСМ, ассоциированным с ОМЛ. Установлено, что у такого пациента дасатиниб (IC₅₀: 0,3-1,0 нМ) и РКС412 (IC₅₀: 10-30 нМ) ингибирует самопроизвольный рост (потребление ³H-тимидина) лейкозных клеток доза-зависимым образом. AMN107 также подавляет рост (100-300 нМ), хотя иматиниб (IC₅₀>1,0 мкМ) не прерывает роста неопластических клеток этого пациента (фиг.13). В контрольном образце, т.е. в нормальных клетках костного мозга, ни дасатиниб, ни другие исследовавшиеся ингибиторы, не влияют на потребление ³H-тимидина (не показано).

Дасатиниб индуцирует апоптоз в клетках НМС-1

Для объяснения механизма, лежащего в основе подавления дасатинибом роста, исследуют морфологические и биохимические признаки апоптоза в клетках НМС-1 после обработки лекарственным средством, С помощью световой микроскопии установлено, что дасатиниб индуцирует апоптоз (т.е. увеличивает число апоптических клеток) в обоих субклонах клеток НМС-1 (фиг.14А и 14Б). При использовании РКС412 в качестве контроля также было установлено, что РКС412 индуцирует апоптоз в обоих субклонах клеток НМС-1, а иматиниб индуцирует апоптоз в клетках НМС-1.1, но не влияет на клетки НМС-1.2 (данные не представлены). Действие дасатиниба, проявляющееся в индукции апоптоза в клетках НМС-1, подтверждено электронной микроскопией. Таким образом, дасатиниб индуцирует апоптоз и в клетках НМС-1.1, и в клетках НМС-1.2 в концентрации 1 мкМ (фиг.14 В). Апоптоз-индуцирующее действие дасатиниба в клетках НМС-1 также показано методом Tunel (фиг.14Г и 14Д). В настоящем исследовании установлено, что дасатиниб индуцирует апоптоз в клетках НМС-1.1 в концентрации 1-1000 нМ, а в клетках НМС-1.2 в концентрации 100-1000 нМ. Параллельно исследуют РКС412 (1 мкМ) в качестве контроля, который также индуцирует апоптоз в обеих клеточных линиях (фиг.14Г и 14Д). Иматиниб (1 мкМ), напротив, индуцирует апоптоз только в клетках НМС-1.1, но не влияет на клетки НМС-1.2 (данные не представлены), что подтверждает ранее опубликованные результаты.³⁰

Дасатиниб снижает регуляцию экспрессии связанных с активацией поверхностных антигенов на клетках НМС-1

Некоторые клеточные поверхностные антигены, например CD2 или CD63, типично экспрессируются (или сверхэкспрессируются) на неопластических тучных клетках при СМ.^48-50 Интересно, что некоторые из этих молекул могут быть экспрессированы на неопластических тучных клетках KIT D816V-зависимым образом или/и экспрессируются на ранней стадии развития тучных клеток человека.⁵¹ В связи с этим было проведено исследование с целью установить, влияет ли дасатиниб на экспрессию данных поверхностных антигенов на клетки НМС-1. Установлено, что не подвергшиеся стимуляции клетки НМС-1.1 экспрессируют CD13, CD63, CD87, CD117 и CD164, а клетки НМС-1.2 экспрессируют CD2, CD13, CD63, CD87, CD117 и CD164, что подтверждает предшествующие данные.^30,38,50 Инкубирование клеток НМС-1.1 с дасатинибом приводит к значительному снижению экспрессии CD13, CD63, CD87 и CD117 (p<0,05) (фиг.15В). В клетках НМС-1.2 дасатиниб существенно снижает экспрессию CD2, CD63 и CD87 (p<0,05), но не приводит к существенному снижению экспрессии CD13, CD117 или CD164 (фиг.15Г). Действие дасатиниба по снижению экспрессии показано по результатам исследований методом жидкостной цитометрии на примере CD63 на фиг.15Д (НМС-1.1) и фиг.15Г (НМС-1.2).

Дасатиниб в сочетании с другими ТК-ингибиторами и с 2CdA приводит к подавлению роста клеток НМС-1

По включению ³H-тимидина установлено, что дасатиниб взаимодействует с РКС412, AMN107, иматинибом и 2CdA, вызывая подавление роста клеток НМС-1 (табл.3, фиг.16). На клетках НМС-1.1 было установлено, что все взаимодействия лекарственных средств являются синергетическими (фиг.16А и 16Б). Напротив, в клетках НМС-1.2 очевидный синергизм проявляется только при использовании комбинаций «дасатиниб и РКС412» и «дасатиниб + 2CdA» (фиг.16В и 16Г), причем другие комбинации лекарственных средств проявляют скорее аддитивный, а не синергетический эффект на рост клеток (табл.3). В табл.3 показано совместное воздействие лекарственных средств на рост клеток НМС-1.2 (верхняя часть таблицы со светло-серым фоном) и НМС-1.1 (нижняя часть таблицы с темно-серым фоном), которое устанавливают измерением потребления ³H-тимидина. Совместное действие лекарственных средств выражают количественно с помощью вычислительной компьютерной программы.

Взаимодействие лекарственных средств: +, синергизм, ±, аддитивное взаимодействие, -, антагонизм.

н.и. - не исследовали

Обсуждение

У пациентов с СМ фактор-независимый автономный рост и накопление тучных клеток отличаются свойствами, общими для всех вариантов заболевания. Соматическая KIT-мутация D816V является СМ-связанным нарушением, которое расценивается в качестве ответственного за конститутивное активирование KIT и автономный рост клеток.^13-17 В связи с этим ранее были предприняты попытки идентификации фармакологических соединений, которые подавляют ТК-активность KIT-D816V, и соответственно рост/накопление неопластических клеток.^9-12 В настоящем изобретении было описано, что новый ТК-ингибитор дасатиниб блокирует ТК-активность KIT-D816V и нескольких KIT D816V-зависимых связанных с заболеванием функций в неопластических клетках. Кроме того, установлено, что дасатиниб в сочетании с РКС412 приводит к синергетическому эффекту, который также наблюдается с другими лекарственными средствами направленного действия и традиционными лекарственными средствами и выражается в подавлении роста неопластических тучных клеток.

Дасатиниб, также обозначаемый «BMS-354825», является новым ТК-ингибитором, который вызывает выраженный эффект на некоторые ТК, в том числе BCR/ABL и KIT, а также проявляет существенную активность против нескольких src-киназ.^33-35 Основываясь на «ТК-нацеливающей» активности, свойственной дасатинибу, это лекарственное средство ранее рассматривалось в качестве антинеопластического агента, способного подавлять рост неопластических клеток в различных миелоидных неоплазмах.^33-35 В настоящем исследовании установлено, что дасатиниб пресекает ТК-активность СМ-связанного онкобелка KIT-D816V и ингибирует in vitro рост тучных клеток человека, несущих данную KIT-мутацию, что подтверждают предшествующие публикации.^34-35 Кроме того, установлено, что дасатиниб пресекает формирование KIT-D816V-зависимого кластера в клетках Ba/F3, а также экспрессию CD2 и CD63 в клетках НМС-1.2. Таким образом, дасатиниб блокирует некоторые связанные с СМ и KIT-D816V-зависимые функции в неопластических тучных клетках. Было сделано интересное наблюдение, касающееся подавления роста, заключающееся в том, что действие дасатиниба на дт KIT или KIT G560V является более выраженным по сравнению с действием на KIT D816V. Сходное наблюдение было сделано ранее при использовании AMN107 и иматиниба.³⁰ Однако, хотя KIT-мутация D816V обеспечивает почти абсолютную устойчивость против иматиниба, два других ТК-ингибитора, а именно AMN107 и дасатиниб, сохраняют существенную активность против KIT D816V, с пониженными величинами IC₅₀, полученными для дасатиниба, при сопоставлении с AMN107 на молярной основе, что может быть объяснено различными взаимодействиями лекарственного средства-мишени или тем фактом, что дасатиниб не только пресекает KIT ТК-активность, но также несколько других возможных мишеней, например src-киназ. Интересное наблюдение заключается в том, что подавление роста дасатинибом клеток НМС-1.2 происходит при фармакологических концентрациях, подтверждая предшествующие публикации.^34,35

В большинстве случаев ТК-ингибиторы действуют в качестве ингибиторов роста, блокируя ТК-зависимый рост клеток с последующим апоптозом.^30,35Поэтому в случае дасатиниба можно показать, что подавление роста клеток НМС-1 связано с утратой ТК-активности и сопровождается признаками апоптоза. Апоптоз-индуцирующее действие дасатиниба было показано световой и электронной микроскопией, а также методом Tunel. Согласно высказанному предположению дасатиниб показывает более мощное апоптоз-индуцирующее действие на клетки НМС-1.1 по сравнению с клетками НМС-1.2, что согласуется с ранее опубликованными данными.³⁵

Основной признак и главный критерий согласно ВОЗ при CM - формирование кластеров тучных клеток висцеральных органов.^41,42 Ранее было установлено, что KIT D816V индуцирует не только дифференциацию тучных клеток, но также формирование кластеров клеток Ba/F3.³⁸ Таким образом, формирование кластера тучных клеток может быть первоначальным и наиболее важным этапом патогенеза СМ. В настоящем исследовании установлено, что дасатиниб и AMN107 пресекают KIT D816V-индуцированное формирование кластера клеток Ba/F3. Это наблюдение подтверждает, что настоящее лекарственное средство действует специфически и эффективно.

Некоторые клеточные поверхностные мембранные антигены типично экспрессируются (сверхэкспрессируются) на неопластических тучных клетках.^48-50Также, в отличие от нормальных тучных клеток, неопластические тучные клетки при СМ экспрессируют CD2 и CD25.^48-50 Кроме того, некоторые клеточные поверхностные молекулы, например CD63, сверхэкспрессируются на неопластических тучных клетках, но не на нормальных тучных клетках.⁴⁹ В некоторых случаях (например, касательно CD63), экспрессия молекул CD может быть KIN-D816V-зависимой.³⁸ В связи с этим была поставлена задача установить, может ли быть связано нацеливание KIT D816V дасатинибом со снижением экспрессии этих CD-антигенов. Результаты проведенного исследования показывают, что дасатиниб снижает регуляции экспрессии CD2, CD63 и CD87 в клетках НМС-1.2 (проявляющих KIT D816V), однако не установлено существенного подавления экспрессии CD 13, CD117=KIT или CD164. Напротив, в клетках НМС-1.1 дасатиниб снижает регуляцию экспрессии CD13 и KIT. Одним из объяснений данного расхождения может быть разная чувствительность (IC₅₀) двух субклонов клеток НМС-1 к дасатинибу. Другим объяснением может быть то обстоятельство, что в клетках НМС-1.2 CD13 и KIT вообще не чувствительны к вызываемым лекарственными средствами модуляциям. Это предположение подтверждается тем наблюдением, что CD13 и KIT также экспрессируются на том же уровне после инкубирования с РКС412, хотя величины IC₅₀ этих соединений одинаковы для двух подклонов клеток НМС-1.

Ряд ранее полученных данных подтверждает, что лечение миелоидных неоплазм ТК-ингибиторами в качестве единственного лекарственного средства может быть недостаточным для контроля заболевания на протяжении пролонгированного периода. Это установлено для иматиниба и прогрессирующих форм ХМЛ^51,52 и также могут быть применены для пациентов с АСМ или ХМЛ.²⁹ У многих из этих пациентов установлена лекарственная устойчивость. Для преодоления устойчивости может быть предусмотрен ряд фармакологических стратегий. Одним из целесообразных подходов может быть использование комбинаций лекарственных средств.

В предшествующем исследовании установлено, что РКС412, AMN107 и 2CdA оказывают мощный ассоциативный лекарственный эффект на клетки НМС-1.³⁰ Однако, хотя синергизм наблюдают при использовании большинства комбинаций лекарственных средств в клетках НМС-1.1, утративших KIT D816V, синергизм отсутствует (наблюдают только аддитивный эффект) в результате лекарственных взаимодействий в клетках НМС-1.2, несущих мутацию KIT D816V. В связи с этим важной задачей настоящего изобретения было установить, может ли дасатиниб, обладающий мощным действием на тучные клетки, несущие KIT D816V, применяемый в качестве единственного агента, вызывать синергетические эффекты на данные клетки в комбинации с другими мощными ингибиторами KIT D816V. В результате в настоящем изобретении было установлено, что совместное применение дасатиниба и РКС412, а также дасатиниба и 2CdA, лекарственного средства для лечения АСМ и тучноклеточного лейкоза⁵⁴, ингибирует рост клеток НМС-1.2 синергетическим образом. Данная комбинация является первой комбинацией ТК-ингибиторов, оказывающих синергетический эффект на рост неопластических тучных клеток, несущих мутацию KIT D816V.

Таким образом, установлено, что дасатиниб и РКС412 являются наиболее перспективными лекарственными средствами направленного действия для лечения АСМ и тучноклеточного лейкоза. Исходя из полученных результатов, целесообразно рассмотреть возможность применения комбинаций этих лекарственных средств или комбинаций этих лекарственных средств и 2CdA для улучшения лечения пациентов с АСМ или тучноклеточным лейкозом.

Claims

1. Применение соединения формулы (I)

в комбинации с соединением формулы (II)

или его фармацевтически приемлемыми солями для приготовления фармацевтической композиции для лечения системного мастоцитоза.

2. Применение по п.1 для лечения системного мастоцитоза, ассоциированного с онкогенной мутацией KIT-D816V.

3. Применение по п.1 или 2, в котором системный мастоцитоз устойчив к иматинибу.