RU2425647C1 - Method and transplant for treatment of liver failure - Google Patents
Method and transplant for treatment of liver failure Download PDFInfo
- Publication number
- RU2425647C1 RU2425647C1 RU2010110065/14A RU2010110065A RU2425647C1 RU 2425647 C1 RU2425647 C1 RU 2425647C1 RU 2010110065/14 A RU2010110065/14 A RU 2010110065/14A RU 2010110065 A RU2010110065 A RU 2010110065A RU 2425647 C1 RU2425647 C1 RU 2425647C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- liver
- bone marrow
- matrix
- allogeneic
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретения относятся к медицине, трансплантологии, а именно к клеточной трансплантологии, и могут быть использованы при коррекции и лечении печеночной недостаточности. Предлагаемые способ и трансплантат могут быть использованы в специализированных отделениях, занимающихся лечением и коррекцией печеночной недостаточности.The invention relates to medicine, transplantology, namely to cell transplantology, and can be used in the correction and treatment of liver failure. The proposed method and transplant can be used in specialized departments involved in the treatment and correction of liver failure.
Известен способ лечения печеночной недостаточности, основанный на использовании суспензии изолированных ксеногенных гепатоцитов в экстрокорпоральной системе «вспомогательная печень», через которую перфузируется кровь реципиента с пораженной печенью (Шумаков В.И. и соавторы. Очерки по физиологическим проблемам трансплантологии и применения искусственных органов. // Тула. - Репрорникс. - 1998. - с.343-362).There is a method of treating liver failure, based on the use of a suspension of isolated xenogenic hepatocytes in the extracorporeal system "auxiliary liver" through which the blood of the recipient with the affected liver is perfused (Shumakov V.I. et al. Essays on the physiological problems of transplantology and the use of artificial organs. // Tula. - Reporniks. - 1998. - p. 343-362).
Изолированные гепатоциты в таких системах, будучи ксеногенными, способны в организме больного лишь кратковременно осуществлять детоксикационные и синтетические функции. В то же время способность суспензии изолированных гепатоцитов выделять регуляторные пептиды, стимулирующие процессы регенерации в пораженной печени реципиента, пролонгирована до 0,5-8 часов (Шумаков В.И. и др. Лечение тяжелой печеночной недостаточности перфузией крови больного через взвесь криоконсервированных гепатоцитов. // Хирургия. - 1990. - №2. - С.113-116).Isolated hepatocytes in such systems, being xenogenic, are capable of only briefly performing detoxification and synthetic functions in the patient’s body. At the same time, the ability of a suspension of isolated hepatocytes to secrete regulatory peptides that stimulate regeneration processes in the affected liver of the recipient is prolonged to 0.5-8 hours (Shumakov V.I. et al. Treatment of severe hepatic insufficiency by perfusion of the patient’s blood through a suspension of cryopreserved hepatocytes. / / Surgery. - 1990. - No. 2. - S.113-116).
Известен другой способ лечения печеночной недостаточности, в котором использовались микрофрагменты ткани печени, что позволило пролонгировать метаболическую активность гепатоцитов, содержащихся в микрофрагментах до 24-34 и даже до 48 часов (Соловьев В.В., Онищенко Н.А., Акатов B.C., Лежнев Э.И. Функциональная активность гепатоцитов в фрагментах печени in vitro: зависимость от размеров фрагментов и длительности их культивирования. // Бюлл. Экспер. Биол. и Мед., - 1997, - №10, - с.406-408). Увеличение сроков метаболической активности гепатоцитов в составе микрофрагментов происходит за счет сохранения в них межклеточных контактов и естественного межклеточного матрикса, а так же из-за сохранения пространственной структуры ткани печени, в результате чего оптимизируются условия функционирования всех типов клеток, в том числе и гепатоцитов.There is another method for the treatment of liver failure, which used microfragments of liver tissue, which allowed to prolong the metabolic activity of hepatocytes contained in microfragments up to 24-34 and even up to 48 hours (Soloviev V.V., Onishchenko N.A., Akatov BC, Lezhnev EI Functional activity of hepatocytes in liver fragments in vitro: dependence on the size of the fragments and the duration of their cultivation // Bull. Expert. Biol. And Med., - 1997, No. 10, - p. 40-408). The increase in the metabolic activity of hepatocytes in microfragments occurs due to the preservation of intercellular contacts and the natural intercellular matrix in them, as well as due to the preservation of the spatial structure of the liver tissue, as a result of which the functioning conditions of all types of cells, including hepatocytes, are optimized.
Также известен способ лечения печеночной недостаточности, предполагающий для пролонгирования сроков выживания изолированных гепатоцитов в перфузионных биореакторах использовать изолированные гепатоциты с микроносителями (используют, например, цитодекс-3 при соотношении 1,6 г микроносителя на 1×109 клеток), которые предварительно покрывают коллагеном (Dimetriou A.A., Rozga J., Podesta L. Early clinical experience with a hybrid bioartificial liver // Scan. J. gastroenterol. - 1995. - 30. - Suppl. 208. - p.111-117; Chen S., Eguchi S, Watanabe Hepatic support strategies // Transplant. Proc. - 1996. - 28, №4. - р.2036-2038).A method for treating liver failure is also known, which involves prolonging the survival of isolated hepatocytes in perfusion bioreactors using isolated hepatocytes with microcarriers (for example, cytodex-3 is used at a ratio of 1.6 g of microcarrier per 1 × 10 9 cells), which are preliminarily coated with collagen ( Dimetriou AA, Rozga J., Podesta L. Early clinical experience with a hybrid bioartificial liver // Scan. J. gastroenterol. - 1995 .-- 30. - Suppl. 208. - p. 111-117; Chen S., Eguchi S , Watanabe Hepatic support strategies // Transplant. Proc. - 1996. - 28, No. 4. - p. 2036-2038).
В качестве прототипа нами выбран известный способ лечения печеночной недостаточности, в котором использовались изолированные гепатоциты для вспомогательной поддержки печени и, соответственно, восполнения дезинтоксикационной и биорегуляторной функции поврежденной печени (Van de Kerkhove M.P., Hoekstra R., Chamuleau R.A., van Gulik T.M. Clinical application of bioartificial liver support systems. // Ann. Surg. - 2004. - Vol.240. - P.216-230).As a prototype, we chose a well-known method of treating liver failure, in which isolated hepatocytes were used to support the liver and, accordingly, supplement the detoxification and bioregulatory function of the damaged liver (Van de Kerkhove MP, Hoekstra R., Chamuleau RA, van Gulik TM Clinical application of bioartificial liver support systems. // Ann. Surg. - 2004. - Vol. 240. - P.216-230).
К недостаткам использования известных способов, в том числе и прототипа, предпологающих использование экстракорпорального биореактора с микрофрагментами ткани печени или изолированными гепатоцитами относятся:The disadvantages of using known methods, including the prototype, suggesting the use of an extracorporeal bioreactor with microfragments of liver tissue or isolated hepatocytes include:
- необходимость использования специальных измельчителей для получения фрагментов заданного размера, повышающих опасность инфицирования донорского материала;- the need to use special grinders to obtain fragments of a given size, increasing the risk of infection of donor material;
- необходимость использования перфузионных систем и включения в перфузионный контур дополнительных технических узлов для оксигенации и детоксикации крови (плазмы), поступающих к микрофрагментам ткани печени, что повышает экономическую себестоимость метода;- the need to use perfusion systems and the inclusion in the perfusion circuit of additional technical units for oxygenation and detoxification of blood (plasma) coming to microfragments of the liver tissue, which increases the economic cost of the method;
- необходимость использования в биореакторах микрофрагментов в смеси с частицами пористого биосовместимого носителя для предотвращения слипания микрофрагментов и обеспечения эффективного массопереноса;- the need to use microfragments in bioreactors mixed with particles of a porous biocompatible carrier to prevent microfragments from sticking together and to ensure effective mass transfer;
- использование частиц пористого носителя не создает условий для предотвращения отсроченной гибели гепатоцитов в микрофрагментах, т.к. при увеличении сроков культивирования микрофрагментов из-за низкой скорости пролиферации гепатоцитов начинает формироваться монослой из быстро прикрепляющихся и пролиферирующих стромальных клеток, окутывающих местные ткани печени и затрудняющих их функционирование;- the use of particles of a porous carrier does not create conditions for preventing the delayed death of hepatocytes in microfragments, because with an increase in the duration of cultivation of microfragments due to the low proliferation rate of hepatocytes, a monolayer begins to form from quickly adhering and proliferating stromal cells enveloping local liver tissues and hindering their functioning;
- необходимость использования ксеногенного материала, что повышает угрозу переноса опасных инфекций и служит фактором избыточной активации иммунной системы реципиента с сокращением срока функционирования этого материала;- the need to use xenogenic material, which increases the risk of transmission of dangerous infections and serves as a factor in excessive activation of the recipient's immune system with a reduction in the life of this material;
- раннее прекращение (через 1-2 дня) метаболических и регуляторных функций гепатоцитов;- early termination (after 1-2 days) of the metabolic and regulatory functions of hepatocytes;
- необходимость регулярно осуществлять сеансы подключения перфузионных систем «биоискусственная печень».- the need to regularly carry out sessions connecting perfusion systems "bio-artificial liver."
Известно устройство для лечения печеночной недостаточности методом экстракорпорального подключения изолированных гепатоцитов (Dimetriou А.А., Rozga J., Podesta L. Early clinical experience with a hybrid bioartificial liver // Scan. J. gastroenterol. - 1995. - 30. - Suppl. 208. - p.111-117). Также известно устройство, предназначенное для лечения печеночной недостаточности, позволяющее увеличивать сроки жизнеспособности изолированных гепатоцитов (Шумаков В.И. и соавторы. Очерки по физиологическим проблемам трансплантологии и применения искусственных органов // Тула. - Репрорникс. - 1998. - с.343-362).A device for the treatment of liver failure by the method of extracorporeal connection of isolated hepatocytes (Dimetriou A.A., Rozga J., Podesta L. Early clinical experience with a hybrid bioartificial liver // Scan. J. gastroenterol. - 1995. - 30. - Suppl. 208.- p. 111-117). Also known is a device intended for the treatment of liver failure, which allows to increase the viability of isolated hepatocytes (Shumakov V.I. et al. Essays on the physiological problems of transplantology and the use of artificial organs // Tula. - Reprorniks. - 1998. - p.343-362 )
В качестве прототипа предлагаемого трансплантата для лечения печеночной недостаточности нами выбран интракорпоральный трансплантат (биомодуль) «вспомогательная печень» (Uyama S., Kaufman P., Kneser U., Vacanti J., Rodriges X. Hepatocyte transplantation using biodegradable matrices in ascorbic acid-deficient rats: comparsion with heterotropically transplanted liver grafts // Transplantation. - 2001. - Vol.7. - P.1-7).As a prototype of the proposed transplant for the treatment of liver failure, we selected the intracorporeal transplant (biomodule) “auxiliary liver” (Uyama S., Kaufman P., Kneser U., Vacanti J., Rodriges X. Hepatocyte transplantation using biodegradable matrices in ascorbic acid-deficient rats: comparsion with heterotropically transplanted liver grafts // Transplantation. - 2001. - Vol.7. - P.1-7).
К недостаткам использования известных устройств, в том числе и прототипа, предпологающих использование биомодулей с изолированными гепатоцитами относятся:The disadvantages of using known devices, including the prototype, suggesting the use of biomodules with isolated hepatocytes include:
- выраженная воспалительная реакция на трансплантат;- a pronounced inflammatory reaction to the graft;
- гибель большого количества изолированных гепатоцитов;- death of a large number of isolated hepatocytes;
- низкая плотность прикрепления клеток печени;- low density of attachment of liver cells;
- дороговизна матрикса-носителя.- the high cost of the matrix carrier.
Задачей изобретения является разработка способа, повышающего эффективность коррекции и лечения печеночной недостаточности за счет пролонгирования сроков выживания изолированных гепатоцитов и выполнения ими функциональной и органоспецифической активности путем трансплантации долгосрочно функционирующего интракорпорального трансплантата типа «вспомогательная печень».The objective of the invention is to develop a method that improves the correction and treatment of liver failure by prolonging the survival time of isolated hepatocytes and performing functional and organ-specific activity by transplanting a long-functioning intracorporeal auxiliary liver transplant.
Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретений, заключается в коррекции и лечении печеночной недостаточности путем обеспечения изолированными гепатоцитами детоксикационной функции, пролонгирования сроков их выживания с активизацией пролиферации за счет совместного интракорпорального введения с прогениторными клетками костного мозга, создания каркаса для размещения в пространстве ассоциаций образующихся клеток, создания условий для прорастания в этот каркас сосудов, диффузии питательных веществ, кислорода и факторов тканевой дифференцировки из крови сосудов брыжейки и сосудов, проросших в каркас, к иммобилизированным печеночным клеткам и клеткам костного мозга; а также в профилактике осложнений, связанных с тромбообразованием и клеточной инфильтрацией в месте трансплантации трансплантата с клеточным материалом.The technical result achieved by the implementation of the invention consists in the correction and treatment of liver failure by providing detoxification function with isolated hepatocytes, prolonging their survival with the activation of proliferation due to joint intracorporeal administration with bone marrow progenitor cells, creating a framework for placement of the formed cells in the space of associations creating conditions for the growth of vessels in this framework, the diffusion of nutrients, oxygen and fa tori tissue differentiation of blood vessels and the mesenteric vessels, germinated in frame, to the immobilized cells and hepatic cells to bone marrow; as well as in the prevention of complications associated with thrombosis and cell infiltration at the site of transplantation of the graft with cellular material.
Достоинствами предложенных способа и трансплантата для лечения печеночной недостаточности, позволяющих, по существу, создать интракорпоральную систему «вспомогательная печень» для длительного поддержания в функциональном состоянии изолированных гепатоцитов являются:The advantages of the proposed method and transplant for the treatment of liver failure, allowing, in essence, to create an intracorporeal system "auxiliary liver" for long-term maintenance in a functional state of isolated hepatocytes are:
- отсутствие необходимости применения сложных перфузионных систем;- lack of need for complex perfusion systems;
- создание с помощью 3-мерного матрикса культуральных условий для пролиферации клеток и формирования «тканеподобной» структуры;- creating, using a 3-dimensional matrix, culture conditions for cell proliferation and the formation of a “tissue-like” structure;
- создание адекватных условий для диффузии оксигенированной межтканевой жидкости и прорастания сосудов через матрикс, что пролонгирует адекватные условия жизнеобеспечения посаженных клеток;- the creation of adequate conditions for the diffusion of oxygenated interstitial fluid and the germination of vessels through the matrix, which prolongs the adequate living conditions of planted cells;
- использование аллогеных клеток позволяют этой системе оказывать в организме длительное биорегуляторное воздействие.- the use of allogeneic cells allows this system to have a long bioregulatory effect in the body.
В предлагаемых изобретениях не используются ткани и/или клеточный материал эмбрионов человека. Использован клеточный материал взрослых доноров.The proposed inventions do not use tissue and / or cellular material of human embryos. Used cellular material of adult donors.
Сокультивирование клеток печени и костного мозга перед трансплантацией позволяет дополнительно повышать функциональную активность гепатоцитов за счет выделения факторов роста и цитокинов, выделяемых клетками костного мозга и создает условия для дифференцировки клеток костного мозга в эндотелиоциты для формирования сосудов и их прорастания в матрикс. Это способствует более быстрой интеграции трансплантата в систему кровообращения после трансплантации и поддержания метаболизма и жизнедеятельности клеток за счет доставки по вновь образованным и проросшим сосудам кислорода; создание адекватных условий для диффузии оксигенированной межтканевой жидкости, что пролонгирует адекватные условия жизнеобеспечения посаженных клеток.Co-cultivation of liver and bone marrow cells before transplantation allows to further increase the functional activity of hepatocytes due to the isolation of growth factors and cytokines secreted by bone marrow cells and creates conditions for the differentiation of bone marrow cells into endotheliocytes for the formation of blood vessels and their germination into the matrix. This contributes to a more rapid integration of the transplant into the circulatory system after transplantation and maintaining the metabolism and vital functions of cells due to the delivery of oxygen through newly formed and sprouted vessels; creating adequate conditions for the diffusion of oxygenated interstitial fluid, which prolongs the adequate living conditions of planted cells.
Использование антикоагулянтов, антиагрегантов и иммуносупресантов сразу после трансплантации тормозит клеточную реакцию на трансплантат как инородное тело и препятствует тромбообразованию в месте трансплантации и отторжению.The use of anticoagulants, antiplatelet agents and immunosuppressants immediately after transplantation inhibits the cellular response to the transplant as a foreign body and prevents thrombosis at the site of transplantation and rejection.
Сущность изобретений заключается в следующем.The invention consists in the following.
Для лечения печеночной недостаточности используют изолированные клетки печени. Осуществляют забор аллогенных прогениторных клеток костного мозга у донора, затем осуществляют забор аллогенных клеток печени у донора. Выполняют посадку клеток печени и клеток костного мозга на трехмерный биосовместимый биодеградируемый пористый матрикс. Размеры пор матрикса варьируют от 2 до 500 мкм. Суммарная пористость матрикса составляет 50-97%. Суммарная концентрация клеток печени и костного мозга составляет 2×106-15×106 клеток на 1 см3 матрикса. При этом соотношение клеток костного мозга к клеткам печени от 1:1 до 1:4. Причем общий объем матрикса не менее 0,05 см3. Наименьший линейный размер матрикса должен быть не менее 0,2 мм. Трансплантацию матрикса с клетками печени и костного мозга производят в брыжейку тонкой кишки.Isolated liver cells are used to treat liver failure. Allogeneic progenitor bone marrow cells are sampled from the donor, then allogeneic liver cells from the donor are sampled. Liver cells and bone marrow cells are planted on a three-dimensional biocompatible biodegradable porous matrix. Matrix pore sizes vary from 2 to 500 microns. The total porosity of the matrix is 50-97%. The total concentration of liver and bone marrow cells is 2 × 10 6 -15 × 10 6 cells per 1 cm 3 of the matrix. The ratio of bone marrow cells to liver cells from 1: 1 to 1: 4. Moreover, the total volume of the matrix is not less than 0.05 cm 3 . The smallest linear matrix size should be at least 0.2 mm. Matrix transplantation with liver and bone marrow cells is performed into the mesentery of the small intestine.
В частном случае после посадки клеток печени и костного мозга на матрикс перед трансплантацией осуществляют сокультивирование аллогенных клеток печени и клеток костного мозга, например, в течение 2-3 суток.In a particular case, after transplantation of liver and bone marrow cells onto the matrix, before transplantation, allogeneic liver and bone marrow cells are co-cultured, for example, for 2-3 days.
В частном случае сразу после трансплантации назначают антикоагулянты в профилактической дозе. Доза составляет: гепарин 2500 ME каждые 12 часов в течение 7-10 дней под контролем свертывающей системы крови и антиагреганты в профилактической дозе, напимер трентал из расчета 45 мг/м2 поверхности тела каждые 12 часов в течение 30-90 дней.In the particular case, immediately after transplantation, anticoagulants are prescribed in a prophylactic dose. The dose is: heparin 2500 ME every 12 hours for 7-10 days under the control of the blood coagulation system and antiplatelet agents in a preventive dose, for example, trental at the rate of 45 mg / m 2 of the body surface every 12 hours for 30-90 days.
В частном случае сразу после трансплантации назначают иммуносупресанты в профилактической дозе. Доза составляет: хорионический гонадотропин 500-5000 ME 1 раз в сутки в течение 30-90 дней.In a particular case, immediately after transplantation, immunosuppressants are prescribed in a prophylactic dose. The dose is: chorionic gonadotropin 500-5000 ME 1 time per day for 30-90 days.
Предлагаемый трансплантат для лечения печеночной недостаточности включает трехмерный биосовместимый биодеградируемый пористый матрикс и посаженные на него аллогенные клетки костного мозга и аллогенные клетки печени. Общий объем матрикса не менее 0,05 см3, а наименьший линейный размер - не менее 0,2 мм. Размеры пор матрикса 2-500 мкм, суммарная пористость 50-97%. Концентрация клеток печени и костного мозга 2×106-15×106 клеток на 1 см3 матрикса и соотношение клеток костного мозга к клеткам печени от 1:1 до 1:4.The proposed transplant for the treatment of liver failure includes a three-dimensional biocompatible biodegradable porous matrix and allogeneic bone marrow cells and allogeneic liver cells placed on it. The total volume of the matrix is not less than 0.05 cm 3 and the smallest linear size is not less than 0.2 mm. The pore size of the matrix is 2-500 microns, the total porosity is 50-97%. The concentration of liver and bone marrow cells is 2 × 10 6 -15 × 10 6 cells per 1 cm 3 of the matrix and the ratio of bone marrow cells to liver cells is from 1: 1 to 1: 4.
Предлагаемые способ и трансплантат позволяют пролонгированно корригировать острую или хроническую печеночную недостаточность за счет прологнирования функционирования изолированных гепатоцитов. Применение иммуносупресантов позволяет исключить осложнения, связанные с реакцией отторжения. Предлагаемая группа изобретений позволяет также:The proposed method and transplant allow prolonged correction of acute or chronic liver failure due to prolining the functioning of isolated hepatocytes. The use of immunosuppressants eliminates complications associated with the rejection reaction. The proposed group of inventions also allows:
1. Создавать условия для прикрепления изолированных клеток печени и клеток костного мозга к биосовместимому матриксу, активизирует их пролиферацию, которая поддерживается диффузией в матрикс питательных веществ, кислорода и факторов тканевой дифференцировки из крови и плазмы, притекающей к матриксу из сосудов брыжейки.1. To create conditions for the attachment of isolated liver cells and bone marrow cells to a biocompatible matrix, activates their proliferation, which is supported by diffusion into the matrix of nutrients, oxygen and tissue differentiation factors from the blood and plasma flowing to the matrix from the mesenteric vessels.
2. Создать каркас на основе биосовместимых биодеградируемых и пористых матриксов, имитирующий пространственную структуру для прикрепления клеток донорской печени и прогениторных клеток костного мозга, а также условия для прорастания в этот каркас сосудов, питающих прикрепленные клетки.2. Create a framework based on biocompatible biodegradable and porous matrices that imitates the spatial structure for attachment of donor liver cells and bone marrow progenitor cells, as well as the conditions for the growth of vessels supplying attached cells into this framework.
3. Создать условия, препятствующие клеточной инфильтрации трансплантата и поддерживающие его клетки в жизнеспособном состоянии за счет использования антикоагулянтов и антиагрегантов.3. To create conditions that impede cell infiltration of the transplant and maintain its cells in a viable state through the use of anticoagulants and antiplatelet agents.
4. Создать условия, препятствующие отторжению трансплантата и поддерживающие его клетки в жизнеспособном состоянии за счет использования иммуносупресантов.4. To create conditions that prevent transplant rejection and maintain its cells in a viable state through the use of immunosuppressants.
Способ осуществляют следующим образом и включает в себя несколько последовательных этапов:The method is as follows and includes several sequential steps:
1). Выделение аллогенных прогениторных клеток костного мозга.one). Isolation of allogeneic bone marrow progenitor cells.
Выделение прогениторных клеток костного мозга у донора осуществляют по традиционной методике (Шумаков В.И., Онищенко НА., Крашенинников М.Е., и др. Костный мозг как источник получения мезенхимальных клеток для восстановления терапии поврежденных органов. // Вестник трансплантации и иск. органов. 2002, 4, с.3-6; Шумаков В.И., Онищенко Н.А. и соавт. Биологические резервы клеток костного мозга и коррекция органных дисфункций. // Москва, Лавр. 2009. - с.61-67). Пунктируют подвздошную кость донора и забирают костный мозг в объеме 40-150 мл в стерильную емкость с раствором Хенкса, содержащим 200 мкг/мл гентамицина; 10,0 мкг/мл инсулина; 0,25 мкМ дексамезатона; 250 ед/мл гепарина. Суспензию клеток центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин, осадок клеток ресуспендируют в лизирующем растворе (114 мМ NH4Cl; 7,5 мМ KHCO3; 100 мкМ EDTA), в соотношении 1:4 от исходного объема аспирата, в течение 5-10 мин и центрифугируют 3 мин при 1500 об/мин при комнатной температуре. Гемолизированный суспернатант полностью удаляют отсасыванием. Добиваются полного лизиса эритроцитов, для чего процедуру лизирования проводят трижды с последующим отмыванием клеток центрифугированием. Клеточный осадок, свободный от эритроидных и тромбоцитарных форм ресуспендируют в ростовой среде.Isolation of bone marrow progenitor cells from a donor is carried out according to a traditional technique (Shumakov V.I., Onishchenko N.A., Krasheninnikov M.E., et al. Bone marrow as a source of mesenchymal cells for restoration of therapy of damaged organs. // Transplant Bulletin and lawsuit organs. 2002, 4, pp. 3-6; Shumakov V.I., Onishchenko N.A. et al. Biological reserves of bone marrow cells and correction of organ dysfunctions // Moscow, Laurel. 2009. - p. 61- 67). The donor ileum is punctured and the bone marrow is taken in a volume of 40-150 ml in a sterile container with a Hanks solution containing 200 μg / ml gentamicin; 10.0 μg / ml insulin; 0.25 μM dexamezatone; 250 units / ml of heparin. The cell suspension is centrifuged for 5 min at 1500 rpm, the cell pellet is resuspended in a lysis solution (114 mm NH 4 Cl; 7.5 mm KHCO 3 ; 100 μm EDTA), in a ratio of 1: 4 from the initial volume of aspirate, for 5- 10 min and centrifuged for 3 min at 1500 rpm at room temperature. The hemolyzed suspension is completely removed by suction. A complete lysis of red blood cells is achieved, for which the lysis procedure is carried out three times with subsequent washing of the cells by centrifugation. The cell pellet free of erythroid and platelet forms is resuspended in the growth medium.
2). Выделение аллогенных клеток печени.2). Isolation of allogeneic liver cells.
Производят резекцию 2-4×2-4×1-2 см ткани печени у донора для получения клеток печени. Выделение аллогенных клеток печени осуществляют по традиционной методике (Fontaine M, Schloo В, Jenkins R, Uyama S, Hansen L, Vacanti J.P. Human hepatocyte isolation and transplantation into an athymic rat, using prevascularized cell polymer constructs. // Pediatr. Surg. - 1995. - vol.30(1). - P.56-60; Hang H, Shi X, Gu G, Wu Y, Ding Y. A simple isolation and cryopreservation method for adult human hepatocytes // Int J Artif Organs. 2009 Oct; 32(10). - P.720-7; Lehec S.C, Hughes RD, Mitry R.R, Graver M.A, Verma A, Wade J.J, Dhawan A. Experience of microbiological screening of human hepatocytes for clinical transplantation. // Cell Transplant. 2009; 18(8). - P.941-947; Seglen O. Preparation of isolated rat liver cells. // Methods. Cell. Biol. 1976, - vol.13. - P.29-83).A resection of 2-4 × 2-4 × 1-2 cm of liver tissue from a donor is performed to obtain liver cells. Isolation of allogeneic liver cells is carried out according to the traditional method (Fontaine M, Schloo B, Jenkins R, Uyama S, Hansen L, Vacanti JP Human hepatocyte isolation and transplantation into an athymic rat, using prevascularized cell polymer constructs. // Pediatr. Surg. - 1995 . - vol.30 (1). - P.56-60; Hang H, Shi X, Gu G, Wu Y, Ding Y. A simple isolation and cryopreservation method for adult human hepatocytes // Int J Artif Organs. 2009 Oct ; 32 (10) .- P.720-7; Lehec SC, Hughes RD, Mitry RR, Graver MA, Verma A, Wade JJ, Dhawan A. Experience of microbiological screening of human hepatocytes for clinical transplantation. // Cell Transplant. 2009; 18 (8). - P.941-947; Seglen O. Preparation of isolated rat liver cells. // Methods. Cell. Biol. 1976, - vol.13. - P.29-83).
Выделение аллогенных клеток печени производят из резецированного участка печени путем 3-кратной отмывки кусочка печени от крови и измельчения его на холоду (t=4°С) в чашке Петри, с 3-кратной отмывкой образовавшейся взвеси буферным раствором без кальция [1000 мл дистиллированной воды, 8.3 г NaCl, 0.5 г KCl, 2.38 г HEPES, рН 7,4, 37°С] в течение 7 минут. После этого мелкие кусочки печени инкубируются 3 раза раствором коллагеназы [1000 мл дистиллированной воды, 8.3 г NaCl, 0.5 г KCl, 0.7 г CaCl2, 2.38 г HEPES, 7.5 мг ингибитор трипсина и 500 мг коллагеназы Тип IV-S (>125 CDU/mg), рН 7,3; 37°С] в течение 6-8 минут с последующей заменой ферментного раствора с использованием центрифугирования 500 об/мин в течение 1 минуты при t=37°C. Полученный материал переносят на сито с ячейками 200 мкм и фильтруют промыванием питательной средой William's E с 10% фетальной бычьей сыворотки, после чего суспензию отдельных клеток и небольших агрегатов переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют при 500 об/мин при 4°С в течение 1 минуты. Супернатант удаляют, осадок ресуспендируют в такой же свежей среде и опять центрифугируют. Процедуру повторяют 3 раза. Жизнеспособность клеток оценивают методом окрашивания трипановым синим. Добиваются получения количества клеток в пределах от 3,0×108 до 4,0×10 гепатоцитов на 12-15 г веса ткани печени. Клеточная суспензия должна содержать: гепатоциты, непаренхиматозные клетки печени, которые определяют при световой микроскопии. Разделение парехиматозных и непарехиматозных клеток не выполняют. Взвесь клеток печени концентрируют в 1-2 мл физиологического раствора.Allogeneic liver cells are isolated from the resected liver by 3 times washing a piece of the liver from the blood and grinding it in the cold (t = 4 ° C) in a Petri dish, with 3 times washing the suspension formed with a buffer solution without calcium [1000 ml of distilled water , 8.3 g of NaCl, 0.5 g of KCl, 2.38 g of HEPES, pH 7.4, 37 ° C] for 7 minutes. After that, small pieces of the liver are incubated 3 times with a collagenase solution [1000 ml of distilled water, 8.3 g NaCl, 0.5 g KCl, 0.7 g CaCl 2 , 2.38 g HEPES, 7.5 mg trypsin inhibitor and 500 mg collagenase Type IV-S (> 125 CDU / mg), pH 7.3; 37 ° C] for 6-8 minutes, followed by replacement of the enzyme solution using centrifugation at 500 rpm for 1 minute at t = 37 ° C. The resulting material was transferred to a sieve with 200 μm cells and filtered by washing with William's E nutrient medium with 10% fetal bovine serum, after which a suspension of individual cells and small aggregates was transferred to a centrifuge tube and centrifuged at 500 rpm at 4 ° C for 1 minute . The supernatant is removed, the precipitate is resuspended in the same fresh medium and centrifuged again. The procedure is repeated 3 times. Cell viability is evaluated by trypan blue staining. Achieve obtaining the number of cells in the range from 3.0 × 10 8 to 4.0 × 10 hepatocytes per 12-15 g of liver tissue weight. The cell suspension should contain: hepatocytes, non-parenchymal liver cells, which are determined by light microscopy. Separation of parechimatous and nonparachimatous cells is not performed. A suspension of liver cells is concentrated in 1-2 ml of saline.
3). Посадка (иммобилизация) аллогенных клеток печени и аллогенных клеток костного мозга на носитель.3). Landing (immobilization) of allogeneic liver cells and allogeneic bone marrow cells on a carrier.
Посадку (иммобилизацию) клеточного материала осуществляют по традиционной методике (Mooney D.J., Sano K., Kaufmann P.M., Majahod K., Schloo В., Vacanti J.P., Langer R. Long-term engraftment of hepatocytes transplanted о biodegradable polymer sponges // J. Biomed. Mater. Res, - 1997. - Vol.5. - P.413-420).Planting (immobilization) of cellular material is carried out according to a traditional technique (Mooney DJ, Sano K., Kaufmann PM, Majahod K., Schloo B., Vacanti JP, Langer R. Long-term engraftment of hepatocytes transplanted about biodegradable polymer sponges // J. Biomed. Mater. Res, 1997. Vol.5. P.413-420).
Аллогенные клетки печени и аллогенные прогениторные клетки костного мозга ресуспендировали в ростовой среде [William's E с заменой аргинина на орнитин, с добавлением фетальной бычьей сыворотки, фактора роста гепатоцитов, эпидермального фактора роста, β-субъединицы холерного токсина, дексамезатона, этаноламина, селенита натрия, глюкагона, инсулина, инсулино-подобного фактора роста-1, аскорбиновой кислоты, линолеивой и линоливой жирных кислот] в концентрации 2,0-4,0×106 клеток печени/мл и 2,0-4,0×106 прогениторных клеток костного мозга/мл. Суммарную клеточную суспензию наносили на матрикс в концентрации 2×106-15×106 на 1 см3, на предварительно пропитанный этой средой матрикс.Allogeneic liver cells and allogeneic bone marrow progenitor cells were resuspended in growth medium [William's E with replacement of arginine with ornithine, supplemented with fetal bovine serum, hepatocyte growth factor, epidermal growth factor, cholera toxin β-subunit, dexamezatone, ethanolamine, sodium selenite, glucose , insulin, insulin-like growth factor-1, ascorbic acid, linoleic and linoleic fatty acids] at a concentration of 2.0-4.0 × 10 6 liver cells / ml and 2.0-4.0 × 10 6 progenitor bone cells brain / ml. The total cell suspension was applied to the matrix at a concentration of 2 × 10 6 -15 × 10 6 per 1 cm 3 , to the matrix pre-impregnated with this medium.
В качестве матрикса может быть использован, например, биоматериал, созданный на основе полиоксибутирата (3-оксибутирата) - ЭластоПОБ. Полиоксибутират - гомополимер, синтезируемый различными видами прокариотических клеток. Они являются субстратом эндогенного дыхания и поддерживают жизнеспособность клеток в неоптимальных условиях среды (Севастьянов В.И., Перова Н.В., Довжик И.А., Титушкин И.А., Немец Е.А., Беломестная З.М., Шишацкая Е.И., Волова Т.Г. Медико-биологические свойства полиоксиалканоатов - биодеградируемых бактериальных полимеров. // Перспективные материалы, 2001, №5. - С.46-55; Sevastianov V.I., Perova N.V., Shishatskaya E.I., Kalacheva G.S., Volova T.G., Production of purified polyhydroxyalkanoates (PHAs) for applications in contact with blood. J. Biomater. Sci. Polymer Edn., 2003. V. 14(10). - P.1029-1042; Volova Т., Shishatskaya E., Sevastianov V., Efremov S., Mogilnaya O., Results of biomedical investigations of PHB and PHB/PHV fibers, Biochem. Eng. J., 2003, №3736. - P.1-9).As a matrix, for example, biomaterial created on the basis of polyoxybutyrate (3-hydroxybutyrate) - ElastoPOB can be used. Polyoxybutyrate is a homopolymer synthesized by various types of prokaryotic cells. They are a substrate of endogenous respiration and maintain cell viability in non-optimal environmental conditions (Sevastyanov V.I., Perova N.V., Dovzhik I.A., Titushkin I.A., Nemets E.A., Belomestny Z.M., Shishatskaya EI, Volova TG Medical and biological properties of polyoxyalkanoates - biodegradable bacterial polymers // Promising materials, 2001, No. 5. - P.46-55; Sevastianov VI, Perova NV, Shishatskaya EI, Kalacheva GS, Volova TG, Production of purified polyhydroxyalkanoates (PHAs) for applications in contact with blood. J. Biomater. Sci. Polymer Edn., 2003. V. 14 (10). - P.1029-1042; Volova T., Shishatskaya E. , Sevastianov V., Efremov S., Mogilnaya O., Results of biomedical investigation s of PHB and PHB / PHV fibers, Biochem. Eng. J., 2003, No. 3736. - P.1-9).
ЭластоПОБ в настоящее время разрешен к медицинскому применению. Основным компонентом ЭластоПОБ является биодеградируемый бактериальный сополимер β-оксибутирата и β-оксивалерата (ПОБ-со-ПОВ) с включением оксивалерата 15÷30 мол.% (Mw=295-360 КДа, кристалличность 50-60%), полученный из Института биофизики СО РАН, г.Красноярск. В состав ЭластоПОБ входит также высокомолекулярный гидрофильный пластификатор (ВГП), повышающий гидрофильность и эластичность материала.Elastopob is currently approved for medical use. The main component of Elastopob is a biodegradable bacterial copolymer of β-hydroxybutyrate and β-hydroxyvalerate (PHB-co-POV) with the inclusion of hydroxyvalerate 15 ÷ 30 mol.% (M w = 295-360 KDa, crystallinity 50-60%) obtained from the Institute of Biophysics SB RAS, Krasnoyarsk. The composition of Elastopob also includes a high molecular weight hydrophilic plasticizer (VGP), which increases the hydrophilicity and elasticity of the material.
Физико-химические, механические и технологические свойства ЭластоПОБ делают этот биополимер весьма привлекательным для разработки временных каркасов для гибридных биоискусственных органов (Севастьянов В.И., Егорова В.А., Немец Е.А., Перова Н.В., Онищенко Н.А. Биодеградируемый биополимерный материал ЭластоПОБ для клеточной трансплантации. // Перспективные материалы, 2004, №3, с.35-41; Севастьянов В.И., Немец Е.А., Волкова Т.Г., Марковцова М.Г. Трехмерные пористые матриксы для трансплантации клеток на основе биодеградируемого бактериального сополимера «Биопластотан». // Перспективные материалы, 2007. №6. С.5-10).The physicochemical, mechanical, and technological properties of Elastopob make this biopolymer very attractive for developing temporary frameworks for hybrid bioartificial organs (Sevastyanov V.I., Egorova V.A., Nemets E.A., Perova N.V., Onishchenko N. A. Biodegradable biopolymer material Elastopob for cell transplantation // Promising materials, 2004, No. 3, p. 35-41; Sevastyanov VI, Nemets EA, Volkova TG, Markovtsova MG Three-dimensional porous matrices for cell transplantation based on biodegradable bacterial copolymer ra "Bioplastotan." // Advanced Materials, 2007. №6. S.5-10).
Используемые матриксы ЭластоПОБ имели следующие размеры и параметры: диаметр пористой губки - 1±2 мм; толщина - 1,2±0,5 мм; масса - 6,0-12,0 мг. Пористость - не менее 95±2%. Размер макропор - 300±100 мкм.The used ElastoPOB matrices had the following sizes and parameters: diameter of the porous sponge - 1 ± 2 mm; thickness - 1.2 ± 0.5 mm; mass - 6.0-12.0 mg. Porosity - not less than 95 ± 2%. The size of the macropores is 300 ± 100 microns.
4). Сокультивирование аллогенных прогениторных клеток костного мозга и аллогенных клеток печени in vitro.four). Co-cultivation of allogeneic progenitor cells of the bone marrow and allogeneic liver cells in vitro.
В частном случае выполняли сокультивирование аллогенных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга по общепринятой методике (Kaufmann P.M., Sano К., Uyama S., Breuer C.K., Organ G.M., Schloo B.L., Kluth D., Vacanti J.P. Evaluation of Methods of Hepatotrophic Stimulation in Rat Heterotopic Hepatocyte Transplantation Using Polymers // J. of Pediatric Surgeru. - 1999. - Vol.34. - P.1118-1123; Uyama S., Kaufmann P.M., Takeda Т., Vacanti J.P. Delivery of whole liver equivalent hepatocyte mass using polymer devices and hepatotrophic stimulation // Transplantation. - 1993. - Vol.55. - P.932-935).In a particular case, allogeneic liver cells and bone marrow progenitor cells were co-cultivated according to the generally accepted methodology (Kaufmann PM, Sano K., Uyama S., Breuer CK, Organ GM, Schloo BL, Kluth D., Vacanti JP Evaluation of Methods of Hepatotrophic Stimulation in Rat Heterotopic Hepatocyte Transplantation Using Polymers // J. of Pediatric Surgeru. - 1999. - Vol. 34. - P.1118-1123; Uyama S., Kaufmann PM, Takeda T., Vacanti JP Delivery of whole liver equivalent hepatocyte mass using polymer devices and hepatotrophic stimulation // Transplantation. - 1993. - Vol.55. - P.932-935).
Это позволяло повысить количество жизнеспособных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга, способных выполнять специфические функции: дезинтоксикационную и синтетическую функциональную активность гепатоцитов, и создавало условия для дифференцировки прогениторных клеток костного мозга в эндотелиоциты для формирования сосудов и их прорастания в матрикс.This made it possible to increase the number of viable liver cells and bone marrow progenitor cells capable of performing specific functions: detoxification and synthetic functional activity of hepatocytes, and created conditions for the differentiation of bone marrow progenitor cells into endotheliocytes for the formation of blood vessels and their germination into the matrix.
Матрикс с клетками помещали в стерильную камеру для инкубации in vitro в ростовой среде [William's E с заменой аргинина на орнитин, с добавлением фетальной бычьей сыворотки, фактора роста гепатоцитов, эпидермального фактора роста, β-субъединицы холерного токсина, дексамезатона, этаноламина, селенита натрия, глюкагона, инсулина, инсулино-подобного фактора роста-I, аскорбиновой кислоты, линолеивой и линоливой жирных кислот] на 2-3 суток.The matrix with cells was placed in a sterile chamber for in vitro incubation in growth medium [William's E with the replacement of arginine with ornithine, with the addition of fetal bovine serum, hepatocyte growth factor, epidermal growth factor, cholera toxin β-subunit, dexamezatone, ethanolamine, sodium selenite, glucagon, insulin, insulin-like growth factor-I, ascorbic acid, linoleic and linoleic fatty acids] for 2-3 days.
5). Трансплантация носителя с иммобилизированными аллогенными клетками печени и прогениторными клетками костного мозга в организм.5). Carrier transplantation with immobilized allogeneic liver cells and bone marrow progenitor cells into the body.
Трансплантацию матриксов с иммобилизированными аллогенными клетками печени и аллогенными прогениторными клетками костного мозга осуществляют пациентам с печеночной недостаточностью в брыжейку тонкой кишки.Matrix transplantation with immobilized allogeneic liver cells and allogeneic bone marrow progenitor cells is performed in patients with hepatic insufficiency in the mesentery of the small intestine.
6). Использование антикоагулянтов и антиагрерантов.6). The use of anticoagulants and antiplatelet agents.
После трансплантации матриксов с иммобилизированными аллогенными клетками печени и аллогенными прогениторными клетками костного мозга пациентам назначают антикоагулянты в профилактической дозе, например: гепарин 5000 ME каждые 12 часов в течение 7-10 дней под контролем свертывающей системы крови и антиагреганты в профилактической дозе, например, трентал из расчета 45 мг/м2 поверхности тела каждые 12 часов в течение 30-90 дней.After transplantation of matrices with immobilized allogeneic liver cells and allogeneic bone marrow progenitor cells, patients are prescribed anticoagulants in a prophylactic dose, for example: heparin 5000 ME every 12 hours for 7-10 days under the control of a blood coagulation system and antiplatelet agents in a prophylactic dose, for example, trental from calculating 45 mg / m 2 body surface every 12 hours for 30-90 days.
7). Использование иммуносупресантов.7). The use of immunosuppressants.
После трансплантации матриксов с иммобилизированными аллогенными клетками печени и алогенными прогениторными клетками костного мозга пациентам назначают иммуносупресанты в профилактической дозе, например: хорионический гонадотропин 500-5000 ME 1 раз в сутки в течение 30-90 дней.After transplantation of matrices with immobilized allogeneic liver cells and halogen progenitor bone marrow cells, immunosuppressants are prescribed to patients in a preventive dose, for example: chorionic gonadotropin 500-5000 ME 1 time per day for 30-90 days.
Предложенный трансплантат для лечения печеночной недостаточности состоит из трехмерного биосовместимого биодеградируемого пористого матрикса и посаженных на него аллогенных прогениторных клеток костного мозга и аллогенных клеток печени.The proposed transplant for the treatment of liver failure consists of a three-dimensional biocompatible biodegradable porous matrix and allogeneic progenitor cells of the bone marrow and allogeneic liver cells planted on it.
Для доказательства возможности достижения заявленных назначений и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.To prove the possibility of achieving the declared appointments and achieving the specified technical result, we present the following data.
Пример осуществления предлагаемого способа с использованием предлагаемого трансплантата в эксперименте.An example implementation of the proposed method using the proposed graft in the experiment.
Моделирование хронической печеночной недостаточности у животных (крысы) осуществляли по признанной и адекватной модели (Фишер А. Физиология и экспериментальная патология печени. // А.Фишер. - Будапешт, 1961, - 230 с.; Колпащикова И.Ф. Влияние трансплантации клеток тимуса, костного мозга и селезенки на восстановительные процессы в патологически измененной печени. // Бюл. эксперим. биол. и мед., - 1979, №10. - С.477-480; Колпащикова И.Ф. Общие и местные изменения в организме при экспериментальном повреждении печени и ее регенерация. // Автореф. докт. дисс. - 1982, Казань. - 41 с.) путем введения 60% раствора CCl4, первое введение 0,5 мл на 100 г массы, последующие по 0,3 мл на 100 г массы тела. Курс введения 6 недель с частотой - 2 введения в неделю.Modeling of chronic liver failure in animals (rats) was carried out according to a recognized and adequate model (Fisher A. Physiology and experimental pathology of the liver. // A. Fisher. - Budapest, 1961, 230 s .; Kolpashchikova I.F. Effect of thymus cell transplantation , bone marrow and spleen on restoration processes in a pathologically altered liver. // Bull. experimental biol. and honey., 1979, No. 10. - P.477-480; Kolpashchikova I.F. General and local changes in the body experimental damage to the liver and its regeneration // Author. Doctoral diss. - 1982, Ka lesson - 41 s.) by introducing a 60% solution of CCl 4 , the first injection of 0.5 ml per 100 g of weight, followed by 0.3 ml per 100 g of body weight. The course of administration is 6 weeks with a frequency of 2 injections per week.
Моделирование острой печеночной недостаточности у животных (собаки) осуществляли путем резекции 45-50% ткани печени, также являющейся признанной и адекватной моделью острой печеночной недостаточности (Demetriou A., Reisher A., Sanchez J. Et al. Transplantation of microcarrier-attached hepatocytes into 90% partially hepatomized rats // Hepatology. - 1988. - Vol.8. - P.1006-1009; Чикотеев С.П., Плеханов А.Н. Печеночная недостаточность. //В кн. Печеночная недостаточность. Иркутск. - 2002. - 260 с.; Michalopoulos G.K. Liver regeneration: Molecular mechanisms of growth control // FASEB J. - 1990. - Vol.104. - P.176; Bowling WM, Kennedy SC, Cai SR, Duncan JR, Gao C, Flye MW Portal branch occlusion safely facilitates in vivo retroviral vector transduction of rat liver. // Hum. Gen. Ther/ - 1996. - vol.7(17). - p.2113-2121).Modeling of acute liver failure in animals (dogs) was carried out by resection of 45-50% of liver tissue, which is also a recognized and adequate model of acute liver failure (Demetriou A., Reisher A., Sanchez J. Et al. Transplantation of microcarrier-attached hepatocytes into 90% partially hepatomized rats // Hepatology. - 1988. - Vol.8. - P.1006-1009; Chikoteev SP, Plekhanov AN Liver failure. // In the book Liver failure. Irkutsk. - 2002 . - 260 p .; Michalopoulos GK Liver regeneration: Molecular mechanisms of growth control // FASEB J. - 1990. - Vol.104. - P.176; Bowling WM, Kennedy SC, Cai SR, Duncan JR, Gao C, Flye MW Portal branch occlusion safely facilitates in vivo retroviral vector tran sduction of rat liver. // Hum. Gen. Ther / - 1996. - vol. 7 (17). - p. 213-2121).
1). Осуществляли по традиционной методике выделение аллогенных прогениторных клеток костного мозга.one). Allogenic progenitor cells of the bone marrow were isolated by a traditional technique.
Получали клеточный аспират из костномозгового канала большеберцовых костей (крысы) или плечевых костей (собаки) путем промывания полости фосфатно-буферным раствором, содержащим 50 ед/мл гепарина и 0,25 мг/л гентамицина с помощью иглы 18G, насаженной на шприц. Суспензию клеток центрифугировали, осадок клеток ресуспендировали в лизирующем растворе при комнатной температуре в течение 3 мин и снова центрифугировали 3-5 мин при 1500 об/мин. Гемолизированный супернатант полностью удаляли отсасыванием, а клеточный осадок, содержащий прогениторные клетки костного мозга ресуспендировали в ростовой среде. Интерфазу с мононуклеарными клетками собирали с поверхности эритроидного осадка и ресуспендировали в лизирующем растворе, в соотношении 1:4, в течение 5-8 мин и центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин при комнатной температуре. Гемолизированный супернатант полностью удаляли. Добивались полного лизиса эритроцитов, для чего процедуру лизирования проводили дважды или трижды с последующим отмыванием клеток центрифугированием. Клеточный осадок, свободный от эритроидных и тромбоцитарных форм, в количестве 60-150×106 клеток объединяли с осадком клеток, полученным из плазмы, и далее ресуспендировали в ростовой среде для стимуляции роста клеток.A cell aspirate was obtained from the medullary canal of the tibia (rat) or the humerus (dog) by washing the cavity with a phosphate-buffered solution containing 50 units / ml of heparin and 0.25 mg / l of gentamicin using an 18G needle attached to a syringe. The cell suspension was centrifuged, the cell pellet was resuspended in a lysis solution at room temperature for 3 minutes, and again centrifuged for 3-5 minutes at 1500 rpm. The hemolyzed supernatant was completely removed by suction, and the cell pellet containing bone marrow progenitor cells was resuspended in growth medium. Interphase with mononuclear cells was collected from the surface of the erythroid sediment and resuspended in a lysis solution, in the ratio 1: 4, for 5-8 minutes and centrifuged for 5 minutes at 1500 rpm at room temperature. The hemolyzed supernatant was completely removed. A complete lysis of erythrocytes was achieved, for which the lysis procedure was carried out twice or thrice, followed by washing the cells by centrifugation. The cell pellet, free of erythroid and platelet forms, in the amount of 60-150 × 10 6 cells was combined with a cell pellet obtained from plasma, and then resuspended in growth medium to stimulate cell growth.
2). Выделение аллогеннных клеток печени осуществляли по традиционной методике.2). Allogeneic liver cells were isolated according to a traditional technique.
Выделение аллогенных клеток печени из резецированного участка печени (4×4×2 см у собак и 1×1×0,5 см у крыс) производилось путем 3-кратной отмывки от крови и измельчения его на холоду (t=4°С), с 3-кратной отмывкой образовавшейся взвеси буферным раствором без кальция в течение 7 минут. После этого мелкие кусочки печени были проинкубированы 3 раза раствором коллагеназы в течение 6-8 минут с последующей заменой ферментного раствора с использованием центрифугирования 500 об/мин в течение 1 минуты при t=37°C. Полученный материал переносился на сито с ячейками 200 мкм и фильтровался промыванием питательной средой William's E с 10% фетальной бычьей сыворотки, после чего суспензию клеток центрифугировали при 500 об/мин при 4°С в течение 1 минуты. Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в такой же свежей среде и опять центрифугировали. Процедуру повторяли 3 раза. Жизнеспособность клеток, колебавшаяся в пределах от 83 до 95% оценивали методом окрашивания трипановым синим. Количество клеток колебалось в пределах от 3,0×108 до 4,0×108 гепатоцитов на 15 г веса ткани печени. Клеточная суспензия содержала: гепатоциты ~95÷98%, и ~5÷2% непарехиматозных клеток печени, которые были определены при световой микроскопии. Разделение парехиматозных и непарехиматозных клеток не выполнялось. Взвесь клеток печени концентрировали в 1-2 мл физ. р-ра.Allogeneic liver cells were isolated from the resected liver region (4 × 4 × 2 cm in dogs and 1 × 1 × 0.5 cm in rats) by washing 3 times from blood and grinding it in the cold (t = 4 ° С), with 3-fold washing of the resulting suspension with a buffer solution without calcium for 7 minutes. After that, small pieces of the liver were incubated 3 times with a collagenase solution for 6-8 minutes, followed by replacement of the enzyme solution using centrifugation at 500 rpm for 1 minute at t = 37 ° C. The resulting material was transferred to a sieve with 200 μm cells and filtered by washing with William's E nutrient medium with 10% fetal bovine serum, after which the cell suspension was centrifuged at 500 rpm at 4 ° C for 1 minute. The supernatant was removed, the pellet was resuspended in the same fresh medium and centrifuged again. The procedure was repeated 3 times. Cell viability, ranging from 83 to 95%, was evaluated by trypan blue staining. The number of cells ranged from 3.0 × 10 8 to 4.0 × 10 8 hepatocytes per 15 g of liver tissue weight. The cell suspension contained: hepatocytes ~ 95 ÷ 98%, and ~ 5 ÷ 2% non-parachimatous liver cells, which were determined by light microscopy. Separation of parechimatous and nonparachimatous cells was not performed. A suspension of liver cells was concentrated in 1-2 ml of physical. solution
3). Посадку (иммобилизацию) аллогенных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга на носитель также осуществляли по традиционной методике.3). Landing (immobilization) of allogeneic liver cells and bone marrow progenitor cells on a carrier was also carried out by a traditional technique.
Аллологенные клетки печени и прогениторные клетки костного мозга ресуспендировали в ростовой среде в концентрации 2,0-4,0×106 клеток печени/мл и 2,0-4,0×106 прогениторных клеток костного мозга/мл. Суммарную клеточную суспензию наносили на матрикс в концентрации 2×106-15×106 на 1 см3 на предварительно пропитанный этой средой матрикс.Allologic liver cells and bone marrow progenitor cells were resuspended in the growth medium at a concentration of 2.0-4.0 × 10 6 liver cells / ml and 2.0-4.0 × 10 6 bone marrow progenitor cells / ml. The total cell suspension was applied to the matrix at a concentration of 2 × 10 6 -15 × 10 6 per 1 cm 3 per matrix pre-impregnated with this medium.
4). В частном случае выполняли сокультивирование аллогенных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга по общепринятой методике.four). In the particular case, co-cultivation of allogeneic liver cells and bone marrow progenitor cells was performed according to the generally accepted method.
Это позволяло повысить количество жизнеспособных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга, способных выполнять специфические функции: дезинтоксикационную и синтетическую функциональную активность гепатоцитов, и создавать условия для дифференцировки прогениторных клеток костного мозга в эндотелиоциты для формирования сосудов и их прорастания в матрикс.This made it possible to increase the number of viable liver cells and bone marrow progenitor cells capable of performing specific functions: detoxification and synthetic functional activity of hepatocytes, and create conditions for the differentiation of bone marrow progenitor cells into endotheliocytes for the formation of blood vessels and their germination into the matrix.
Матрикс с клетками помещали в стерильную камеру для инкубации in vitro в ростовой среде на 2-3 суток.The matrix with cells was placed in a sterile chamber for in vitro incubation in growth medium for 2-3 days.
В качестве матрикса был использован, например, биоматериал, созданный на основе полиоксибутирата (3-оксибутирата) ЭластоПОБ. ЭластоПОБ имеет молекулярный вес 295-360 КДа, синтезирован институтом биофизики СО РАН г.Красноярск, и в настоящее время разрешен к медицинскому применению.As a matrix, for example, a biomaterial created on the basis of polyoxybutyrate (3-hydroxybutyrate) ElastoPOB was used. ElastoPOB has a molecular weight of 295-360 KDa, synthesized by the Institute of Biophysics SB RAS, Krasnoyarsk, and is currently approved for medical use.
Используемые матриксы ЭластоПОБ имели следующие размеры и параметры: диаметр пористой губки - 10±2 мм; толщина - 1,2±0,5 мм; масса - 6,0-12,0 мг. Пористость - не менее 95±2%. Размер макропор - 300±100 мкм.The used ElastoPOB matrices had the following sizes and parameters: diameter of the porous sponge - 10 ± 2 mm; thickness - 1.2 ± 0.5 mm; mass - 6.0-12.0 mg. Porosity - not less than 95 ± 2%. The size of the macropores is 300 ± 100 microns.
5). Трансплантацию матриксов с иммобилизированными аллогенными клетками печени и прогениторными клетками костного мозга в организм животным (собаки) осуществляли на 3-4 сутки после моделирования печеночной недостаточности путем резекции 50% ткани печени.5). Matrices with immobilized allogeneic liver cells and bone marrow progenitor cells transplanted into animals (dogs) were performed 3-4 days after modeling liver failure by resection of 50% of liver tissue.
Перед трансплантацией животных (собаки) наркотизировали: смесью препаратов осуществляли путем внутримышечного введения смеси препаратов: Калипсол (5% 10 мг/кг, Дроперидол (1,5 мг/кг), Атропин (0,1% - 0,02 мг/кг). Димедрол 1% - 0,5 мл. После чего, в операционной осуществляли вводный наркоз путем внутривенного введения 1% Пропофола из расчета 7 мг/кг. Операцию проводили под интубационным наркозом. Поддержание анестезии проводили 1% Пропофолом 0,5 мг/кг/ч и Калипсолом 2 мг/кг. У крыс осуществляли анестезиологическое пособие из расчета на 100 гр массы тела при этом вводили внутримышечно: Калипсол 10% - 2 мл, Ксилазин 2% - 1 мл, Атропин - 0,2 мл.Before transplantation, animals (dogs) were anesthetized: a mixture of drugs was administered by intramuscular injection of a mixture of drugs: Calipsol (5% 10 mg / kg, Droperidol (1.5 mg / kg), Atropine (0.1% - 0.02 mg / kg) Diphenhydramine 1% -0.5 ml After which, in the operating room, anesthetic anesthesia was carried out by intravenous administration of 1% Propofol at a rate of 7 mg / kg. The operation was performed under intubation anesthesia. Maintenance of anesthesia was performed with 1% Propofol 0.5 mg / kg / h and
Суммарный клеточный материал, содержащий аллогенные клетки печени и костного мозга в концентрации 2×106-15×106 на см3, иммобилизированные на матрикс ЭластоПОБ, трансплантировали в брыжейку тонкой кишки животных.The total cellular material containing allogeneic cells of the liver and bone marrow at a concentration of 2 × 10 6 -15 × 10 6 per cm 3 immobilized on the Elastopob matrix was transplanted into the mesentery of the small intestine of animals.
Брюшную полость ушивали послойно наглухо. Для профилактики инфекционных осложнений интраоперационно животным назначали внутривенно водили Офлоксацин - 40 мл; Метронидазол - 30 мл; Дитилин 5% - 20 мг/кг/ч. Проводили контроль показателей биохимии, коагулограммы, общего анализа крови на 1, 3, 9, 14, 18 сутки после операции.The abdominal cavity was sutured in layers tightly. Ofloxacin was administered intravenously to animals for the prevention of infectious complications - 40 ml; Metronidazole - 30 ml;
6). Использование антикоагулянтов и антиагрерантов.6). The use of anticoagulants and antiplatelet agents.
В частном случае для профилактики клеточной инфильтрации трансплантата клетками крови сразу после трансплантации матриксов с иммобилизированными аутологичными клетками печени и аутологичными прогениторными клетками костного мозга ежедневно назначали антикоагулянты в профилактической дозе, например: гепарин 2500 ME каждые 12 часов в течение 7-10 дней под контролем свертывающей системы крови и антиагреганты в прфилактической дозе, например: трентал из расчета 45 мг/м2 поверхности тела каждые 12 часов в течение 30-90 дней.In a particular case, for the prevention of cell transplant infiltration by blood cells immediately after transplantation of matrices with immobilized autologous liver cells and autologous progenitor bone marrow cells, anticoagulants were prescribed daily in a preventive dose, for example: heparin 2500 ME every 12 hours for 7-10 days under the control of the coagulation system blood and antiplatelet agents in a prophylactic dose, for example: trental at the rate of 45 mg / m 2 of the body surface every 12 hours for 30-90 days.
7). Использование иммуносупресантов.7). The use of immunosuppressants.
В частном случае для профилактики отторжения сразу после трансплантации матриксов с иммобилизированными аллогенными клетками печени и алогенными прогениторными клетками костного мозга ежедневно назначали иммуносупресанты в профилактической дозе, например: хорионический гонадотропин 500-5000 ME 1 раз в сутки в течение 30-90 дней.In a particular case, to prevent rejection immediately after transplantation of matrices with immobilized allogeneic liver cells and halogen progenitor bone marrow cells, immunosuppressants were prescribed daily in a preventive dose, for example: chorionic gonadotropin 500-5000 ME 1 time per day for 30-90 days.
Всего нами проведено 20 экспериментов, при этом коррекция острой печеночной недостаточности по предложенному способу была проведена в 3 экспериментах и хронической печеночной недостаточности - в 17 экспериментах.In total, we conducted 20 experiments, while the correction of acute liver failure by the proposed method was carried out in 3 experiments and chronic liver failure in 17 experiments.
На фиг.1 представлена динамика синтетической функции печени (общий белок) при острой печеночной недостаточности. Проведенные исследования показали, что после резекции 50% печени минимальная синтетическая функция печени отмечалась в период первых 3 дней после резекции. По сравнению с исходом показатели общего белка уменьшились в 1,6 раза, что указывает на значительные функциональные нарушения печеночных клеток. После чего отмечается постепенное возвращение этих показателей к исходным к 18 суткам после моделирования печеночной недостаточности. В эксперименте после трансплантации матрикса с посаженными на него аллогенными прогениторными клетками костного мозга и аллогенными клетками печени по предложенному способу, динамика синтетической функции печени была сходной с контрольной группой. Однако с момента трансплантации (3 сутки после моделирования печеночной недостаточности) аллогенных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга, посаженных на матрикс, отмечается более быстрое восстановление до исходных показателей синтетической функции печени. Причем следует отметить, что в контрольной группе на исследуемом сроке (18 дней после операции) этот показатель так и не достиг исходного. Это произошло только к 28-32 суткам после операции.Figure 1 presents the dynamics of the synthetic function of the liver (total protein) in acute liver failure. Studies have shown that after resection of 50% of the liver, the minimum synthetic function of the liver was observed during the first 3 days after resection. Compared to the outcome, the total protein indices decreased 1.6 times, which indicates significant functional disorders of the liver cells. After which there is a gradual return of these indicators to the original by 18 days after modeling liver failure. In the experiment, after transplantation of a matrix with allogeneic progenitor cells of the bone marrow and allogeneic liver cells planted on it according to the proposed method, the dynamics of the synthetic function of the liver was similar to the control group. However, from the moment of transplantation (3 days after modeling of liver failure) of allogeneic liver cells and bone marrow progenitor cells planted on the matrix, a more rapid restoration to the initial indicators of the synthetic function of the liver is noted. Moreover, it should be noted that in the control group at the study period (18 days after surgery), this indicator did not reach the initial one. This happened only to 28-32 days after surgery.
На фиг.2 представлена динамика синтетической функции печени (холестерол) при острой печеночной недостаточности. Проведенные исследования показали, что после резекции 50% печени минимальная синтетическая функция печени отмечалась в период первых 3 дней после резекции. По сравнению с исходом показатели холестерола уменьшились в 1,64 раза, что указывает на значительные функциональные нарушения печеночных клеток. После чего отмечается постепенное возвращение этих показателей к исходным в исследуемой группе к 18 суткам после моделирования печеночной недостаточности, а в контрольной группе на исследуемом сроке (18 дней после операции) этот показатель (холестерол) так и не достиг исходного. Это произошло только к 28-32 суткам после операции.Figure 2 presents the dynamics of the synthetic function of the liver (cholesterol) in acute liver failure. Studies have shown that after resection of 50% of the liver, the minimum synthetic function of the liver was observed during the first 3 days after resection. Compared to the outcome, cholesterol values decreased 1.64 times, which indicates significant functional disorders of the liver cells. After that, a gradual return of these indicators to the initial ones is observed in the study group by 18 days after modeling liver failure, and in the control group at the study period (18 days after surgery) this indicator (cholesterol) did not reach the initial one. This happened only to 28-32 days after surgery.
Из представленных данных следует, что до момента трансплантации аллогенных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга, посаженных на матрикс, динамика показателей, характеризующих синтетическую функцию печени, была сходной в обеих группах (контрольная, эксперимент) однако в исследуемой группе (эксперимент) восстановление синтетической функции печени (по белку и холестеролу) происходило быстрее и эти показатели были более приближены к исходным.From the presented data, it follows that until the transplantation of allogeneic liver cells and progenitor cells of the bone marrow planted on the matrix, the dynamics of indicators characterizing the synthetic function of the liver was similar in both groups (control, experiment), however, in the study group (experiment) restoration of synthetic function liver (for protein and cholesterol) was faster and these indicators were more close to the original.
На фиг.3 представлены группы жизнеспособных аллогенных гепатоцитов (1) спустя 90 дней после их трансплантации в организм экспериментального животного по предложенному способу.Figure 3 presents the group of viable allogeneic hepatocytes (1) 90 days after their transplantation into the body of an experimental animal according to the proposed method.
Окраска: гематоксилин - эозин. Увеличение микроскопа ×400.Coloring: hematoxylin - eosin. Microscope magnification × 400.
На фиг.4 представлены данные гистологического исследования спустя 90 дней после трансплантации аллогенных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга, посаженных на матрикс. В гистологических препаратах животных, которые не получали антикоагулянты и антиагреганты, выявлена выраженная воспалительная реакция (2), фиброзные изменения (3), пролиферация гепатоцитов (4).Figure 4 presents the data of
Окраска: гематоксилин - эозин. Увеличение микроскопа ×200.Coloring: hematoxylin - eosin. Microscope magnification × 200.
На фиг.5 в гистологических препаратах животных, которые не получали антикоагулянты и антиагреганты, и иммуносупресанты спустя 180 дней после трансплантации аллогенных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга, посаженных на матрикс, выявлена выраженная воспалительная, лимфоидная реакция (5).In Fig. 5, histological preparations of animals that did not receive anticoagulants and antiplatelet agents and immunosuppressants 180 days after transplantation of allogeneic liver cells and progenitor bone marrow cells planted on the matrix revealed a pronounced inflammatory, lymphoid reaction (5).
Окраска: гематоксилин - эозин. Увеличение микроскопа ×200.Coloring: hematoxylin - eosin. Microscope magnification × 200.
На фиг.6 у животных, которые получали антикоагулянты и антиагреганты и иммуносупресанты спустя 180 дней после трансплантации, выявлена значительно меньшая клеточная реакция. В препарате встречаются группы жизнеспособных гепатоцитов (6).Figure 6 in animals that received anticoagulants and antiplatelet agents and immunosuppressants 180 days after transplantation, revealed a significantly smaller cellular response. Groups of viable hepatocytes are found in the preparation (6).
Окраска: гематоксилин - эозин. Увеличение микроскопа ×400.Coloring: hematoxylin - eosin. Microscope magnification × 400.
На фиг.7 спустя 180 дней по предложенному способу в препарате выявлен вновь образованный сосуд (7).7, after 180 days according to the proposed method, a newly formed vessel (7) was detected in the preparation.
Окраска PAS. Увеличение микроскопа ×200.Coloring PAS. Microscope magnification × 200.
Во всех случаях был достигнут желаемый результат, а именно была получена и адекватно корригирована печеночная недостаточность. Способ позволяет улучшить результаты лечения печеночной недостаточности путем обеспечения изолированными аллогенными гепатоцитами детоксикационной и биорегуляторной функций, пролонгирования сроков их выживания с активизацией пролиферации за счет совместного интракорпорального введения с аллогенными прогениторными клетками костного мозга, создания каркаса для размещения в пространстве ассоциаций образующихся клеток, создания условий для прорастания в этот каркас сосудов, диффузии питательных веществ, кислорода и факторов тканевой дифференцировки из крови сосудов брыжейки, проросших в каркас, к иммобилизованным печеночным клеткам и клеткам костного мозга; обеспечивает профилактику осложнений, связанных с использованием трансплантата с клетками. Кроме того, длительное использование жизнеспособных аллогенных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга позволяет длительно поддерживать гомеостаз.In all cases, the desired result was achieved, namely, liver failure was obtained and adequately corrected. The method allows to improve the results of treatment of liver failure by providing detoxification and bioregulatory functions by isolated allogeneic hepatocytes, prolonging their survival with activation of proliferation due to joint intracorporeal administration with allogeneic progenitor bone marrow cells, creating a skeleton for placement in the space of associations of formed cells, creating conditions for germination into this vessel frame, diffusion of nutrients, oxygen and tissue factors differentiation from the blood vessels of the mesentery vessels, sprouted into the skeleton, to immobilized liver cells and bone marrow cells; provides prevention of complications associated with the use of a graft with cells. In addition, the prolonged use of viable allogeneic liver cells and bone marrow progenitor cells allows for long-term maintenance of homeostasis.
Таким образом, приведенные данные четко свидетельствуют о том, что коррекция печеночной недостаточности происходит значительно быстрее и адекватнее при применении предлагаемого способа коррекции печеночной недостаточности. Кроме того нами доказано длительное выживание клеток печени и появление вновь образованных сосудов в устройстве спустя 90 и 180 дней после трансплантации животному матрикса с аллогенными клетками печени и аллогенными прогениторными клетками костного мозга.Thus, the above data clearly indicate that the correction of liver failure occurs much faster and more adequately when using the proposed method for the correction of liver failure. In addition, we have proved the long-term survival of liver cells and the appearance of newly formed vessels in the
Учитывая вышеизложенное, экстраполяция результатов проведенных экспериментов в клинику правомерна, предложенный метод и трансплантат, обеспечивая пролонгирование жизнедеятельности изолированных гепатоцитов, могут быть использованы для коррекции печеночной недостаточности.Given the above, extrapolating the results of the experiments to the clinic is legitimate, the proposed method and transplant, providing prolongation of the life of isolated hepatocytes, can be used to correct liver failure.
Claims (6)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010110065/14A RU2425647C1 (en) | 2010-03-18 | 2010-03-18 | Method and transplant for treatment of liver failure |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010110065/14A RU2425647C1 (en) | 2010-03-18 | 2010-03-18 | Method and transplant for treatment of liver failure |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2425647C1 true RU2425647C1 (en) | 2011-08-10 |
Family
ID=44754429
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010110065/14A RU2425647C1 (en) | 2010-03-18 | 2010-03-18 | Method and transplant for treatment of liver failure |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2425647C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2828021C2 (en) * | 2017-06-12 | 2024-10-07 | Те Юниверсити Оф Норт Каролина Эт Чепел Хилл | Cell transplant composition |
-
2010
- 2010-03-18 RU RU2010110065/14A patent/RU2425647C1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ВОЛОВА Т.Г. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. - Красноярск: ИПК СФУ, 2009, с.148, 149, 228, 229, 235-237. TOKAI H. et al. Efficacy and limitation of bone marrow transplantation in the treatment of acute and subacute liver failure in rats. Hepatol Res. 2009 Nov; 39(11):1137-43. Epub 2009 Jul 10 (Abstract). * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2828021C2 (en) * | 2017-06-12 | 2024-10-07 | Те Юниверсити Оф Норт Каролина Эт Чепел Хилл | Cell transplant composition |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yao et al. | Biomimetic injectable HUVEC‐adipocytes/collagen/alginate microsphere co‐cultures for adipose tissue engineering | |
| JP2017195900A (en) | Decellularization and recellularization of organs and tissues | |
| Matsumoto et al. | A GELATIN COATED COLLAGEN-POLYGLYCOLIC ACID (PGA) COMPOSITE MEMBRANE AS A DURAL SUBSTITUTE | |
| RU2539918C1 (en) | Method for preparing tissue-specific matrix for tissue engineering of parenchymal organ | |
| RU2425645C1 (en) | Method and transplant for treatment of liver failure | |
| KR20030043937A (en) | Vascularised tissue graft | |
| RU2586952C1 (en) | Method of treating hepatic failure | |
| RU2425648C1 (en) | Method and transplant for treatment of liver failure | |
| RU2425647C1 (en) | Method and transplant for treatment of liver failure | |
| CN110306289A (en) | A nanofiber electrospun membrane containing axitinib and its preparation method and application | |
| RU2425646C1 (en) | Method and transplant for treatment of liver failure | |
| US10149865B2 (en) | Method for preparing a biological tissue construct and use of autologous cells obtained specifically | |
| RU2618989C1 (en) | Treatment method of live failure | |
| CN111671972B (en) | Tissue engineering scaffold of compound exosome Nidogen-1 and preparation method thereof | |
| JF Patzer et al. | Clinical safety evaluation of excorp medical, inc. Bioartificial liver support system (BLSS) | |
| Sodian et al. | Application of stereolithography for scaffold fabrication for tissue engineering of heart valves | |
| Koball et al. | REMOVAL OF ALBUMIN BOUND TOXINS WITH THE MARSSYSTEM SHOWS PROTECTIVE EFFECTS ON HEPATOCYTES | |
| RU2590859C1 (en) | Method of distant hepatocyte regeneration stimulation | |
| Livingston et al. | Osteogenic activity of human mesenchymal stem cells in vivo on calcium phosphate ceramics | |
| Jockenhoevel et al. | CARDIOVASCULAR TISSUE ENGINEERING: A NEW LAMINAR FLOW CHAMBER FOR: IN VITRO: IMPROVEMENT OF MECHANICAL TISSUE PROPERTIES | |
| Donini et al. | TEMPORARY NEUROLOGICAL IMPROVEMENT AFTER BIOARTIFICIAL LIVER TREATMENT FOR ACUTE ON CHRONIC LIVER FAILURE | |
| Kreß | Development and proof of concept of a biological vascularized cell‐based drug delivery system | |
| Peszynski et al. | REMOVAL OF ALBUMIN BOUND DRUGS IN ALBUMIN DIALYSIS (MARS)-A NEW LIVER SUPPORT SYSTEM | |
| JP2024178803A (en) | Articular cartilage treatment | |
| Jockenhoevel et al. | TISSUE ENGINEERING: EVALUTATION OF DIFFERENT BIODEGRADABLE SCAFFOLDS |