RU2422512C1 - ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)/pAFP11D3 - ПРОДУЦЕНТ ФРАГМЕНТА С 404 ПО 609 АМИНОКИСЛОТУ АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА ЧЕЛОВЕКА - Google Patents
ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)/pAFP11D3 - ПРОДУЦЕНТ ФРАГМЕНТА С 404 ПО 609 АМИНОКИСЛОТУ АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА ЧЕЛОВЕКА Download PDFInfo
- Publication number
- RU2422512C1 RU2422512C1 RU2010105151/10A RU2010105151A RU2422512C1 RU 2422512 C1 RU2422512 C1 RU 2422512C1 RU 2010105151/10 A RU2010105151/10 A RU 2010105151/10A RU 2010105151 A RU2010105151 A RU 2010105151A RU 2422512 C1 RU2422512 C1 RU 2422512C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fetoprotein
- strain
- pafp11d3
- fragment
- escherichia coli
- Prior art date
Links
- 101000827785 Homo sapiens Alpha-fetoprotein Proteins 0.000 title claims abstract description 13
- 101000848653 Homo sapiens Tripartite motif-containing protein 26 Proteins 0.000 title claims abstract description 13
- 102000046101 human AFP Human genes 0.000 title claims abstract description 13
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 title claims abstract 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 title claims description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 69
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 50
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 29
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 22
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 2
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 abstract description 12
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 abstract description 12
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 6
- 238000011109 contamination Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 abstract description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 abstract description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 abstract 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 26
- 101150055123 afp gene Proteins 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 8
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101710136739 Teichoic acid poly(glycerol phosphate) polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N aebsf Chemical compound NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 101150023479 hsdS gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 101150093139 ompT gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к рекомбинантной продукции онкофетальных белков человека, и может быть использовано для получения фрагмента с 404 по 609 аминокислоту альфа-фетопротеина человека. Путем трансформации клеток Escherichia coli штамма BL21(DE3) плазмидной ДНК pAFP11D3 получают штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pAFP11D3 - продуцент фрагмента с 404 по 609 аминокислоту альфа-фетопротеина человека. Изобретение позволяет уменьшить возможность загрязнения вирусами человека при получении рекомбинантным путем указанного фрагмента альфа-фетопротеина, обладающего сродством к рецептору альфа-фетопротеина (АФП) и подвергающегося рецептор-опосредованному эндоцитозу. 1 з.п. ф-лы, 7 ил.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей фрагмент онкофетального белка человека, обладающего сродством к рецептору альфа-фетопротеина (АФП) и подвергающегося рецептор-опосредованному эндоцитозу.
Известны очищенные и выделенные последовательности ДНК, имеющие активность по повышению продуцирования белка, характеризующиеся тем, что последовательности ДНК включает в себя, по меньшей мере, один элемент изогнутой ДНК и, по меньшей мере, один участок связывания ДНК-связывающего белка [RU 2375078, С2, A61K 39/395, 10.12.2009].
Недостатком этого решения является относительно узкая область применения.
Наиболее близким по своей сущности к предложенному является очищенная и выделенная последовательность ДНК, имеющая активность по повышению продуцирования белка, представляющая собой а) последовательность ДНК, характеризующуюся нуклеотидной последовательностью MAR, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 24-27, комплементарной ей последовательностью, ее частью, содержащей, по меньшей мере, 70% нуклеотидов в длину; или b) последовательность ДНК, характеризующуюся тем, что она, по существу, соответствует элементу или фрагменту cLysMAR, включающему, по меньшей мере, одну область, выбранную из В-, K- и F-областей [RU 2375450, С2, C12N 15/11, 10.12.2009].
Недостатком этого решения является относительно узкая область применения, поскольку известная ДНК не обладает свойствами рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей фрагмент альфа-фетопротеина человека, обладающего сродством к рецептору АФП и подвергающегося рецептор-опосредованному эндоцитозу.
Кроме того, продукт, получаемый при реализации известного технического решения, обладает потенциальной возможностью загрязнения вирусами человека.
Требуемый результат заключается в уменьшении возможности загрязнения конечного продукта вирусами человека и расширении области применения за счет создания бактериального штамма-продуцента рекомбинантного фрагмента альфа-фетопротеина человека, что позволяет, в свою очередь, получать свободный от загрязнений вирусами человека целевой белок с высоким уровнем выхода.
Требуемый результат достигается тем, что бактериальный штамм-продуцент отличается тем, что клетки штамма несут плазмиду с геном, кодирующим целевой фрагмент альфа-фетопотеина человека.
Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что в качестве клеток штамма, несущих плазмиду с геном, кодирующим целевой фрагмент альфа-фетопротеина человека, используют клетки штамма BL21 (DE3).
Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что в качестве плазмиды с геном, кодирующим целевой фрагмент альфа-фетопротеина человека, используют плазмиду рЕТ 11 с клонированным в нее геном, кодирующим целевой фрагмент альфа-фетопротеина человека.
Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что ген, кодирующий целевой фрагмент альфа-фетопротеина человека с 404 аминокислоты по 609 аминокислоту, содержит тандем из двух редких кодонов AGG AGG, кодирующих остатки аргининов.
Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что в качестве тандема из двух редких кодонов, кодирующего остатки аргининов, используются изоакцепторные кодоны, кодирующие остатки аргинина.
Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что в качестве тандема изоакцепторных кодонов, кодирующих остатки аргининов, используется тандем CGT CGC.
Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что уровень продукции целевого белка бактериальным штаммом-продуцентом рекомбинантного фрагмента альфа-фетопротеина составляет не менее 100 мг на литр культуры клеток или 100 мг на 1 грамм биомассы клеток.
На чертежах представлены:
на фиг.1 - нуклеотидная последовательность АФП;
на фиг.2 - амплификация фрагментов гена;
на фиг.3 - карта плазмиды;
на фиг.4 - нуклеотидная последовательность конструктора;
на фиг.5 - аминокислотная последовательность полученного продукта;
на фиг.6 - анализ наличия целевого белка;
на фиг.7 - электрофоретический анализ клеточного белка.
Получение бактериального штамма-продуцента рекомбинантного фрагмента альфа-фетопротеина человека (АФП) производилось следующим образом.
Известно, что в первую очередь на уровень экспрессии в бактериальных клетках влияет наличие редких кодонов, расположенных друг за другом. В нуклеотидной последовательности АФП присутствует тандем из двух редких кодонов AGG, кодирующих остатки аргининов - Arg508 и Arg509 (фиг.1).
Было выявлено, что замена таких тандемов аргинина обеспечивает значительное увеличение уровня экспрессии. Был получен фрагмент гена АФП, соответствующего целевому фрагменту (404-609 аминокислотные остатки), при этом была произведена замена указанного тандема AGG AGG на кодоны аргинина CGT CGC, оптимальные для E.coli. Замену проводили амплификацией фрагментов гена, как указано на фиг.2.
Для пцр-амплификации использовали следующие праймеры:
1-5′ CCGTAGCTAGCATGTACATCCAGGAGAGCCAAGC 3′
2-5′ CGCCAACCGTCGCCCATGCTTCAGCAGCTTGG 3′
3-5′ GGCGACGGTTGGCGTATGAAGAAGTGCAGCACTGG 3′
4- ′AAGAATGTCGACTTAGTGATGGTGATGGTGATGGTGCTCT TCAGCAAAGCAGACTT 3′
Пцр-амплификацию проводили в стандартных условиях с термостабильной Tag полимеразой. Для реакции проводили 30 циклов. Использовалась температура 72°С для проведения амплификации, 51°С для отжига праймеров и 95°С для разделения цепей ДНК.
При модификации гена был также уничтожен сайт рестрикции NdeI для удобства последующей работы. Указанные модификации гена не приводили к заменам в аминокислотной последовательности белка. Кроме этого к 3′-концу гена была добавлена последовательность, кодирующая 7 гистидиновых остатков для последующей аффинной очистки белка, и введены сайты рестрикции NheI и SalI для клонирования гена.
Модифицированный ген АФП клонировали в плазмиду рЕТ11с по сайтам рестрикции NheI и SalI для дальнейшей аналитической экспрессии в E.coli.
Процедура клонирования состояла из следующих этапов:
1. Амплифицированный фрагмент гена АФП и плазмиду рЕТ11с (по отдельности) последовательно обрабатывали рестриктазами NheI и SalI.
2. Полученные фрагмент гена АФП и плазмиду рЕТ11с подвергали электрофоретическому разделению в агарозном геле и далее вырезали кусочки геля, содержащие указанные фрагменты ДНК. В этом случае для визуализации полос ДНК использовалось ультрафиолетовое освещение трансиллюминатора с длиной волны 365 нм, т.к. она не вызывает повреждений ДНК.
3. Ген и плазмиду выделяли из геля и подвергали реакции лигирования. Для этого их смешивали в буфере для лигирования в весовом соотношении 1:1, добавляли Т4 ДНК лигазу и инкубировали при комнатной температуре в течение 2±0,5 часов.
4. Проводили трансформацию клеток E.coli штамма МС1061 аликвотой лигированной смеси. Для этого к 20±5 мкл лигированной смеси добавляли 200±30 мкл свежеприготовленных компетентных клеток. После инкубации клетки высевали на агаризованную среду LB с ампициллином в концентрации 100 мкг/мл в чашках Петри и инкубировали 15±2 часов при температуре 37°С.
5. Выросшие колонии клеток проверяли на наличие гена АФП амплификацией со специфическими праймерами к указанному гену.
6. Колонии E.coli, несущие ген целевого белка, выращивали на жидкой питательной среде LB с ампициллином в пробирках в течение 15±2 часов при температуре 37°С при постоянном покачивании в качалке. Полученную биомассу собирали центрифугированием в микропробирках 1.5 мл.
7. Выделяли плазмиду из полученной биомассы методом щелочного лизиса.
8. Подтверждение наличия гена АФП в плазмиде проводили с помощью рестрикционного анализа по сайтам клонирования NheI и SalI. Карта плазмиды представлена на фиг.3.
Для проверки полученного конструкта pAFP11D3 было проведено определение его нуклеотидной последовательности (фиг.4). Было подтверждено наличие внесенных нуклеотидных замен в ген АФП для оптимизации его кодонов, что, как указано выше, не приводит к замене в аминокислотной последовательности. Аминокислотная последовательность полученного продукта представлена на фиг 5.
Экспрессия рекомбинантного белка с химическим индуктором.
Полученную плазмиду, содержащую фрагмент гена АФП, трансформировали в клетки E.coli штамма BL21DE3 (E.coli В F- dcm ompT hsdS(rB- mB-) gal λ(DE3)). Для этого к 200 мкл свежеприготовленных компетентных клеток добавляли 0,5 мкл плазмиды в концентрации 0,2 мкг/ мкл. После инкубации клетки высевали на агаризованную среду LB с ампициллином в концентрации 100 мкг/мл в чашках Петри и инкубировали 15 часов при температуре 37°С.
Выросшие колонии клеток проверяли на наличие фрагмента гена АФП амплификацией со специфическими праймерами к указанному гену.
Колонии E.coli, несущие ген целевого белка, выращивали на жидкой питательной среде LB с ампициллином в пробирках в течение 15±2 часов при температуре 37°С при постоянном покачивании в качалке. Полученную биомассу собирали центрифугированием в микропробирках 1,5 мл.
Выделяли плазмиду из полученной биомассы методом щелочного лизиса.
Подтверждение наличия гена АФП в плазмиде проводили с помощью рестрикционного анализа по сайтам клонирования NheI и SalI.
Проводили аналитическую экспрессию целевого белка с использованием химического индуктора. Для этого колонии E.coli, несущие ген целевого белка, выращивали на жидкой питательной среде LB с ампициллином в пробирках в течение 15±2 часов при температуре 37°С при постоянном покачивании в качалке. Добавляли 0,5 мл в колбы объемом 250 мл, содержащие 50 мл жидкой среды LB с ампициллином. Растили при температуре 37°С при постоянном покачивании до оптической плотности 0.5±0.1 (OD600) (время инкубации составляло от 1.5 до 2.5 часов). Затем добавляли химический индуктор - 0.4 мМ ИПТГ (изопропил-β-D-тиогалактопиранозид) и наращивали далее в течение 3 часов. Биомассу собирали центрифугированием в пластиковых пробирках на 50 мл (центрифуга ОПН-8, 4.000 об/мин 8 минут).
Проводили электрофоретический анализ клеточного белка в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Для этого к аликвоте клеток 10 мг добавляли 40 мкл воды, перемешивали на встряхивателе и добавляли 40 мкл 2х буфера для образцов для белкового денатурирующего электрофореза. Образец прогревали при 95°С в течение 4 минут и наносили на денатурирующий гель с концентрацией акриламида 12%. После проведения электрофоретического разделения гель промывали дистиллированной водой, после чего окрашивали краской, содержащей краситель Кумасси. Избыток краски отмывали раствором, содержащим этанол и уксусную кислоту.
Анализ наличия целевого белка проводили визуально, сравнивая набор клеточных белков в неиндуцированных клетках и клетках, индуцированных ИПТГ (фиг.6). Для определения молекулярной массы полученного целевого белка использовали набор белков с известными молекулярными весами.
Проводили анализ количества целевого белка по отношению к общему клеточному белку. Для этого гель сканировали на сканере Epson 1660 Photo. Полученное изображение обрабатывали с помощью программы Onedscan.
Проводили анализ распределения целевого белка между фракцией растворимых белков и тельцами включения (агрегированной формой белка). Для этого к аликвоте клеток (40 мг) добавляли 200 мкл буфера PBS с 300 mМ NaCl, ингибитором протеаз AEBSF и лизоцимом до конечной концентрации 2.5 мг/ мл. После 10 минут инкубации во льду в суспензию добавляли по 0.2 мкл ДНКазы и РНКазы в концентрации 10 мг/мл и 1 единица/мл, соответственно, и дополнительно инкубировали 30 минут во льду. После этого добавляли 10% Тритон X100 до конечной концентрации 1%. Лизат клеток подвергали центрифугированию в микропробирках 1.5 мл при скорости 13000 об/мин 10 минут при температуре 4°С. Супернатант и осадок разделяли и анализировали белковый состав с помощью акриламидного геля в денатурирующих условиях. Целевой белок практически полностью обнаруживается в осадке, т.е. во фракции нерастворимых белков, также называемых тельцами включения.
Результаты экспрессии (фиг.6) показывают высокий уровень синтеза целевого белка, целевой белок составляет не менее 25% от общего клеточного белка (в среднем составляет 30-35%).
Экспрессия целевого фрагмента АФП в E.coli методом автоиндукции.
Суть подхода состоит в использовании сред роста, позволяющих достичь достаточно высоких плотностей культуры клеток при наращивании. Кроме этого среды роста подбираются таким образом, что при начальном наращивании до высоких плотностей lac-промотор, индуцирующий синтез Т7 полимеразы (а значит и синтез целевого белка), находится в репрессированном состоянии. На поздних же стадиях роста lac-промотор индуцируется под воздействием лактозы, входящей в состав сред.
Плазмиду, содержащую фрагмент гена АФП, трансформировали в клетки E.coli штамма BL21DE3, как описано выше. Выросшие колонии клеток проверяли на наличие фрагмента гена амплификацией со специфическими праймерами.
100-200 колоний E.coli, несущих ген целевого белка, добавляли к 200 мл жидкой питательной среды ТВ с 200 мкг/мл ампициллина и растили в колбах на 1 л в течение 18-24 часов при температуре 37°С при постоянном покачивании в качалке. Указанные условия являются оптимальными для исследуемого штамма по среде роста, температуре и времени инкубации. Оптическая плотность культуры к моменту завершения инкубации составляла не менее 10 о.е. OD600 и, как правило, была около 12 о.е.
Полученную биомассу собирали центрифугированием в центрифужных пробирках на роторе JA14 центрифуга J2-21 Beckman при 7000 об/мин в течение 10 минут.
Проводили электрофоретический анализ клеточного белка в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (фиг.7).
Анализ наличия целевого белка проводили визуально, сравнивая набор клеточных белков в неиндуцированных клетках и клетках после автоиндукции. Для определения молекулярной массы полученного целевого белка использовали набор белков с известными молекулярными весами.
Проводили анализ количества целевого белка по отношению к общему клеточному белку. Выход целевого белка от общего клеточного белка по результатам денситометрии электрофоретического разделения суммарного препарата белков в среднем составляет 30-35%.
Проводили анализ распределения целевого белка между фракцией растворимых белков и тельцами включения (агрегированной формой белка). Целевой белок практически полностью обнаруживается в осадке, т.е. во фракции нерастворимых белков, также называемых тельцами включения.
Система с автоиндукцией позволяет достигать существенно большей оптической плотности клеток, чем экспрессия в среде LB с индуктором. При этом экспрессия начинается достаточно поздно, на поздней логарифмической стадии роста клеток, по-видимому, экспрессия целевого белка начинается при достижении оптической плотности культуры примерно 7.
Характеристика полученного штамма-продуцента.
Конечный продукт представляет собой штамм-продуцент целевого белка, фрагмента АФП, в клетках E.coli, который характеризуется тем, что:
Представлен грамотрицательными палочками, дающими на агаризованной питательной среде с ампициллином слабовыпуклые колонии диаметром (2±0.5)мм серого цвета, гладкие, с ровным краем.
Имеет тельца включения, представляющие собой гибридный белок, имеющий последовательность, соответствующую району предполагаемого целевого фрагмента АФП человека. В оптимальных условиях экспрессии по данным SDS-электрофореза на долю гибридного белка приходится не менее 25% от общего клеточного белка. Продукция целевого белка составляет не менее 170-200 мг с 1 литра культуры или 20-25 мг/1 гр биомассы.
Клетки содержат плазмиду, характеризующуюся соответствующей рестриктной картой, где между сайтами рестрикции NheI и SalI встроена нуклеотидная последовательность, кодирующая целевой гибридный белок. Экспрессия белка регулируется Т7-промотором и может быть индуцирована как с помощью химического индуктора ИПТГ, так и с помощью эффекта автоиндукции.
Таким образом, благодаря проведенному усовершенствованию достигнут требуемый технический результат, поскольку получен бактериальный штамм-продуцент рекомбинантного фрагмента альфа-фетопротеина человека, который практически свободен от загрязнений вирусами человека.
Claims (2)
1. Штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pAFP11D3 - продуцент фрагмента с 404 по 609 аминокислоту альфа-фетопротеина человека, полученный путем трансформации клеток Escherichia coli штамма BL21(DE3) плазмидной ДНК pAFP11D3, которая имеет физическую карту, изображенную на фиг.3, и характеризуется нуклеотидной последовательностью, показанной на фиг.4.
2. Штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pAFP11D3 - продуцент фрагмента с 404 по 609 аминокислоту альфа-фетопротеина человека по п.1, в котором уровень продукции целевого белка составляет не менее 100 мг на литр культуры клеток или 100 мг на 1 грамм биомассы клеток.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010105151/10A RU2422512C1 (ru) | 2010-02-16 | 2010-02-16 | ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)/pAFP11D3 - ПРОДУЦЕНТ ФРАГМЕНТА С 404 ПО 609 АМИНОКИСЛОТУ АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА ЧЕЛОВЕКА |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010105151/10A RU2422512C1 (ru) | 2010-02-16 | 2010-02-16 | ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)/pAFP11D3 - ПРОДУЦЕНТ ФРАГМЕНТА С 404 ПО 609 АМИНОКИСЛОТУ АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА ЧЕЛОВЕКА |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2422512C1 true RU2422512C1 (ru) | 2011-06-27 |
Family
ID=44739172
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010105151/10A RU2422512C1 (ru) | 2010-02-16 | 2010-02-16 | ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)/pAFP11D3 - ПРОДУЦЕНТ ФРАГМЕНТА С 404 ПО 609 АМИНОКИСЛОТУ АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА ЧЕЛОВЕКА |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2422512C1 (ru) |
-
2010
- 2010-02-16 RU RU2010105151/10A patent/RU2422512C1/ru not_active IP Right Cessation
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103981204B (zh) | 一种有活性的金鱼Tgf2转座子重组转座酶蛋白的表达方法 | |
| JP2006068019A (ja) | ｏｓｍＢプロモータで制御される発現プラスミド | |
| EP3138917B1 (en) | Method for the expression of polypeptides using modified nucleic acids | |
| US20210108213A1 (en) | A method for optimizing antibody expression | |
| US20080233614A1 (en) | Production of recombinant collagenases colg and colh in escherichia coli | |
| JP4239412B2 (ja) | トランスグルタミナーゼの製造方法 | |
| CN110204605B (zh) | 转录因子C/EBPα作为ACOX1启动子区的转录因子的应用 | |
| RU2422512C1 (ru) | ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)/pAFP11D3 - ПРОДУЦЕНТ ФРАГМЕНТА С 404 ПО 609 АМИНОКИСЛОТУ АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА ЧЕЛОВЕКА | |
| CN109777807B (zh) | 一种在线粒体中定位表达外源蛋白的方法 | |
| CN111448320B (zh) | 细胞膜穿透肽 | |
| CN107723287A (zh) | 一种增强丝蛋白生产制备的表达系统 | |
| RU2606014C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная ДНК pEFN877, детерминирующая экспрессию гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина на поверхности клеток Escherichia coli, и штамм бактерий Escherichia coli BL21(DE3)pLysS/pEFN877 - продуцент гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина на поверхности клеток | |
| JPH0746994A (ja) | ポリペプチドの製造方法 | |
| KR100890184B1 (ko) | ＳｌｙＤ를 융합파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법 | |
| CN115074361A (zh) | 真菌来源的强启动子及其应用 | |
| CN103864916B (zh) | 人胸腺肽β4三倍体蛋白、编码基因及其分离纯化方法 | |
| JP4820921B2 (ja) | アミノ酸配列、ｄｎａ及び酵母の育成方法 | |
| Liang et al. | Autogenous regulation of the regA gene of bacteriophage T4: derepression of translation. | |
| KR100890183B1 (ko) | 말산탈수소효소를 융합파트너로 이용한 재조합 단백질의제조방법 | |
| KR100890187B1 (ko) | Ｔｓｆ를 융합파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법 | |
| JPWO2004053126A1 (ja) | 低温誘導発現ベクター | |
| CN101298611A (zh) | 衣原体蛋白酶体样活性因子的活性片段及其表达方法 | |
| JP4555920B2 (ja) | ｍＲＮＡの安定制御によるタンパク質大量発現系 | |
| WO2025035093A1 (en) | Cytoplasmic expression of soluble proteins | |
| KR20210148288A (ko) | 생체내 리폴딩된 항체 단편의 클로닝 및 발현 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200217 |