RU2418065C1

RU2418065C1 - Method of mast cell identification in hystological preparation

Info

Publication number: RU2418065C1
Application number: RU2009145573/10A
Authority: RU
Inventors: Михаил Геннадьевич Шурыгин (RU); Михаил Геннадьевич Шурыгин; Ирина Александровна Шурыгина (RU); Ирина Александровна Шурыгина; Олег Витославович Каня (RU); Олег Витославович Каня
Priority date: 2009-12-08
Filing date: 2009-12-08
Publication date: 2011-05-10

Abstract

FIELD: medicine. ^ SUBSTANCE: tissue sample must be fixed and placed in paraffin, cuts are made, deparaffinated, washed in tris-buffer, incubated with reagent and processed with developing agent. Difference of method lies in the following: as reagent used are antibodies to VEGFR1 in dilution 1:50, duration of incubation with reagent in wet chamber at temperature 25C constitutes 60 minutes. ^ EFFECT: method makes it possible to stain mast cells on histological preparation in a differentiated way. ^ 5 dwg, 1 ex

Description

Предлагаемое изобретение относится к области медицины и биологии.The present invention relates to the field of medicine and biology.

Известно, что тучные клетки являются регуляторами местного гомеостаза соединительной ткани. Функция этих клеток заключается в поддержании структурного, биохимического и функционального постоянства микроокружения.Mast cells are known to regulate local connective tissue homeostasis. The function of these cells is to maintain the structural, biochemical and functional constancy of the microenvironment.

Известны различные способы идентификации тучных клеток в ткани, основанные на метахроматичном окрашивании содержащихся в них гранул гистологическими красителями, такими как гематоксилин-эозин, толуидиновый синий. Так, известен способ селективной окраски тучных клеток 1% раствором толуидинового синего в 0,5 М HCl при pH 0,5 [Enerback L., Miller H.R.P., Mayrohfer G. Methods for the identification and characterization of mast cells by light microscopy. In Mast Cell Differentiation and Heterogeneity / Ed. Befus A.D., Bienenstock J., Denburg J.A. - New York: Raven Press, 1986. - P.405-417].There are various methods for identifying mast cells in tissue based on metachromatic staining of granules contained in them with histological dyes such as hematoxylin-eosin, toluidine blue. Thus, a method is known for the selective staining of mast cells with a 1% solution of toluidine blue in 0.5 M HCl at pH 0.5 [Enerback L., Miller H.R. P., Mayrohfer G. Methods for the identification and characterization of mast cells by light microscopy. In Mast Cell Differentiation and Heterogeneity / Ed. Befus A.D., Bienenstock J., Denburg J.A. - New York: Raven Press, 1986. - P.405-417].

К недостаткам данного способа следует отнести окрашивание не только тучных клеток, но и других клеток, содержащихся в гистологическом препарате, что существенно затрудняет их идентификацию.The disadvantages of this method include staining not only mast cells, but also other cells contained in the histological preparation, which significantly complicates their identification.

Также известен способ идентификации тучных клеток в тканях путем иммуногистохимического окрашивания, направленного на выявление биологически активных веществ, содержащихся в гранулах тучных клеток, - серотонина, гистамина и мелатонина [Хайкин М.Б., Дмитриенко С.В., Осадчук М.А. Клинические и морфофункциональные особенности течения воспалительных заболеваний пародонта у больных с гастродуоденальными язвами // Вестник СамГУ. Естественно-научная серия. - 2006. - Т.46, №6/2. - С.153-158].Also known is a method for identifying mast cells in tissues by immunohistochemical staining, aimed at identifying biologically active substances contained in the granules of mast cells, serotonin, histamine and melatonin [Khaikin MB, Dmitrienko SV, Osadchuk MA Clinical and morphological and functional features of the course of inflammatory periodontal diseases in patients with gastroduodenal ulcers // Bulletin of SamSU. Natural Science Series. - 2006. - T.46, No. 6/2. - S.153-158].

Недостатком известного способа является необходимость применения не менее трех панелей окрашивания, так как каждое из исследуемых биологически активных веществ - серотонин, гистамин и мелатонин - окрашивают отдельным набором реагентов.The disadvantage of this method is the need to use at least three staining panels, since each of the studied biologically active substances - serotonin, histamine and melatonin - stained with a separate set of reagents.

Известен также метод выявления тучных клеток, основанный на сочетании иммуногистохимического окрашивания на серотонин и исследования полутонких срезов методом трансмиссионной электронной микроскопии [Фомина Н.К. Действие ионизирующего излучения и пептидного биорегулятора эпиталона на кинетику роста и функциональную морфологию саркомы М-1 / Автореф. дис. … канд. биол. наук, 03.00.01. - Радиобиология. - Обнинск, 2007. - 17 с.].Also known is a method for detecting mast cells, based on a combination of immunohistochemical staining for serotonin and the study of semi-thin sections by transmission electron microscopy [Fomina N.K. The effect of ionizing radiation and the peptide bioregulator of epithalon on the kinetics of growth and functional morphology of sarcoma M-1 / Abstract. dis. ... cand. biol. Sciences, 03.00.01. - Radiobiology. - Obninsk, 2007. - 17 p.].

Недостатком известного способа является трудоемкость и длительность исследования, а также низкая доступность оборудования для проведения электронно-микроскопического исследования в лабораториях лечебно-профилактических учреждений.The disadvantage of this method is the complexity and duration of the study, as well as the low availability of equipment for conducting electron microscopic studies in the laboratories of medical institutions.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ идентификации тучных клеток путем окрашивания гранулярного гепарин-протеинового комплекса тучных клеток 5-НТ антисывороткой [Michaloudi H.C., Papadopoulos G.C. Mast cells in the sheep, hedgehog and rat forebrain // J. Anat - 1999. - Vol.195. - P.577-586].Closest to the technical nature of the proposed is a method for identifying mast cells by staining the granular heparin-protein complex of mast cells with 5-HT antiserum [Michaloudi H.C., Papadopoulos G.C. Mast cells in the sheep, hedgehog and rat forebrain // J. Anat - 1999. - Vol. 195. - P.577-586].

Известный способ осуществляют следующим образом. Образцы исследуемой ткани фиксируют и заливают в парафин. Из парафиновых блоков готовят срезы толщиной 6 мкм, которые депарафинируют, отмывают в течение 1 часа в 0.05 М Трис-буфере, после чего преинкубируют 60 минут в 10% нормальной козьей сыворотке, а затем инкубируют с реагентом. В качестве реагента используют 5-НТ антисыворотку в разведении 1:1500. Инкубацию с реагентом проводят при 4°C в течение 48 часов. После инкубации применяют авидин-биотиновый метод связывания вторичных антител, затем для выявления пероксидазного сигнала обрабатывают в растворе, содержащем 7.5 мг/1.4 мл 3,3' диаминобензидинтетрахлорид с 0.01% H₂O₂ в Трис-буфере в течение 5-10 минут. Затем срезы дегидратируют и помещают под покровные стекла с этеланом.The known method is as follows. Samples of the test tissue are fixed and embedded in paraffin. Sections of a thickness of 6 μm are prepared from paraffin blocks, which are dewaxed, washed for 1 hour in 0.05 M Tris buffer, after which they are preincubated for 60 minutes in 10% normal goat serum and then incubated with the reagent. As a reagent, a 5-HT antiserum is used at a dilution of 1: 1500. Incubation with the reagent is carried out at 4 ° C for 48 hours. After incubation, the avidin-biotin method of binding of secondary antibodies is used, then, to detect the peroxidase signal, it is treated in a solution containing 7.5 mg / 1.4 ml of 3.3 'diaminobenzidine tetrachloride with 0.01% H ₂ O ₂ in Tris buffer for 5-10 minutes. Then the sections are dehydrated and placed under coverslips with Ethelan.

К недостаткам известного способа следует отнести то, что он может быть использован только для идентификации тучных клеток в тканях животных (овца, крыса, еж). Известный способ не может быть использован для выявления тучных клеток в тканях человека, так как в этом случае наблюдают отсутствие окрашивания тучных клеток человека. К недостаткам известного способа следует также отнести и длительность процедуры окрашивания - более 2 суток.The disadvantages of this method include the fact that it can only be used to identify mast cells in animal tissues (sheep, rat, hedgehog). The known method cannot be used to detect mast cells in human tissues, since in this case there is a lack of staining of human mast cells. The disadvantages of this method should also include the duration of the staining procedure - more than 2 days.

Задачей заявляемого изобретения является разработка способа идентификации тучных клеток на гистологических препаратах.The task of the invention is the development of a method for identifying mast cells on histological preparations.

Техническим результатом предлагаемого способа является снижение трудоемкости и сокращение сроков изготовления препарата, а также обеспечение возможности специфического окрашивания тучных клеток человека и лабораторных животных (крысы, кролика) на гистологических препаратах.The technical result of the proposed method is to reduce the complexity and terms of preparation of the drug, as well as providing the possibility of specific staining of mast cells in humans and laboratory animals (rats, rabbits) on histological preparations.

Технический результат достигается тем, что способ идентификации тучных клеток на гистологическом препарате включает фиксацию и помещение в парафин образца ткани, изготовление срезов, их депарафинизацию, отмывание в Трис-буфере, инкубирование с реагентом и обработку проявляющим агентом.The technical result is achieved in that a method for identifying mast cells on a histological preparation includes fixing and placing a tissue sample in paraffin, making sections, dewaxing them, washing in Tris buffer, incubating with a reagent and processing with a developing agent.

Отличительные приемы заявляемого способа заключаются в том, что в качестве реагента используют антитела к VEGFR1 в разведении 1:50, после чего препарат инкубируют во влажной камере при температуре 25°C в течение 60 минут.Distinctive techniques of the proposed method are that antibodies against VEGFR1 are used as a reagent at a dilution of 1:50, after which the preparation is incubated in a humid chamber at a temperature of 25 ° C for 60 minutes.

Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию изобретения «новизна».A comparative analysis of the proposed technical solution with the prototype allows us to conclude that the claimed technical solution meets the criteria of the invention of "novelty."

Заявляемый способ обеспечивает достижение усматриваемого заявителем технического результата, а именно - обеспечение возможности дифференцированного окрашивания тучных клеток человека и лабораторных животных на гистологических препаратах при снижении трудоемкости и сокращении сроков изготовления препарата.The inventive method ensures the achievement of the technical result perceived by the applicant, namely, providing the possibility of differentiated staining of human mast cells and laboratory animals on histological preparations while reducing the complexity and reducing the time of manufacture of the drug.

Авторами установлено, используемые в заявляемом способе первичные антитела связываются с веществами, синтезируемыми тучными клетками, и не связываются с веществами, продуцируемыми другими клетками организма млекопитающего, которые по морфологическим характеристикам сходны с тучными клетками.The authors found that the primary antibodies used in the claimed method bind to substances synthesized by mast cells, and do not bind to substances produced by other cells of the mammalian body, which are similar to mast cells in morphological characteristics.

Применение при иммуногистохимическом окрашивании гистологических препаратов в качестве первичных антител антител к VEGFR1 позволило авторам заявляемого способа добиться хорошего дифференцированного окрашивания тучных клеток в таких тканях, как соединительная, мышечная и другие.The use of immunohistochemical staining of histological preparations as antibodies of VEGFR1 as primary antibodies allowed the authors of the proposed method to achieve good differentiated staining of mast cells in tissues such as connective, muscle and others.

Преимуществом предлагаемого способа является также то, что вся процедура окрашивания занимает 5 часов, что существенно меньше по сравнению с прототипом (2 суток).The advantage of the proposed method is that the entire staining procedure takes 5 hours, which is significantly less compared to the prototype (2 days).

Преимуществом предлагаемого способа является также и то, что он позволяет окрашивать тучные клетки в тканях как лабораторных животных (крыса, кролик), так и человека.An advantage of the proposed method is also that it allows staining of mast cells in the tissues of both laboratory animals (rat, rabbit) and human.

Изложенное позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию «изобретательский уровень».The above allows us to conclude that the technical solution meets the criterion of "inventive step".

Способ, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в медицине и биологии. Возможность его осуществления подтверждена описанными в заявке приемами и средствами.The method comprising the claimed invention is intended for use in medicine and biology. The possibility of its implementation is confirmed by the methods and means described in the application.

Вышеизложенное дает основание считать, что заявляемое техническое решение соответствует критерию изобретения «промышленная применимость».The above gives reason to believe that the claimed technical solution meets the criteria of the invention of "industrial applicability".

Осуществление заявляемого способа поясняется примером конкретного выполнения. Приведенный ниже пример служит для иллюстрации, но не ограничивает данное изобретение.The implementation of the proposed method is illustrated by an example of a specific implementation. The following example is intended to illustrate but not limit the invention.

ПримерExample

Образцы ткани (человека, крысы или кролика) фиксировали 10% раствором нейтрального формалина и заливали в парафиновые блоки по общепринятой методике [Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. - Л.: Медицина, 1969. - С.13-15, 52-59]. Готовили гистологические срезы толщиной 5 мкм и монтировали их на стекла, покрытые поли-L-лизином. Препараты депарафинировали в толуоле - 5 минут, а затем последовательно в спиртах 100°, 96°, 90°, 70° и 50° по 1 минуте. После чего препараты выдерживали в дистиллированной воде 10 минут, затем помещали в цитратный буфер (pH=6.0) и проводили обработку в микроволновой печи мощностью 800 Вт, которую нагревали при 100%-ной мощности 8 минут, затем при 60%-ной мощности 10 минут. Потом препараты охлаждали до 25°C в нитратном буфере и промывали дистиллированной водой 2 раза по 5 минут. На каждый препарат наносили по 50 мкл 3% H₂O₂, выдерживали 5 минут. Отмывали Трис-буфером (pH=7.6) 2 раза по 5 минут. Затем наносили 50 мкл 0.4% раствора казеина, инкубировали 5 минут, отмывали Трис-буфером (pH=7.6) 2 раза по 5 минут. После чего на каждый препарат наносили первичные антитела, в качестве которых использовали антитела анти-VEGFRl, в рабочем разведении 1:50. Инкубировали препараты во влажной камере при температуре 25°C в течение 60 минут, потом отмывали Трис-буфером (pH=7.6) 2 раза по 5 минут. Затем на препараты наносили по 50 мкл раствора, содержащего 10% сыворотку в Трис-буфере (pH=7.6), инкубировали во влажной камере при температуре 25°C 30 минут, отмывали Трис-буфером (pH=7.6) 2 раза по 5 минут. Затем наносили вторичные антитела, меченные пероксидазой, по 50 мкл, инкубировали во влажной камере при температуре 25°C 30 минут, отмывали Трис-буфером (pH=7.6) 2 раза по 5 минут. После чего добавляли по 50 мкл субстратной смеси, содержащей 50 мкл 1.74% 3'3'-диаминобензидина в 1 мл 0.05% H₂O₂, выдерживали 5 минут, отмывали водой. Срезы докрашивали 0.02% раствором гематоксилина 3 минуты. Отмывали водой. Дегидратировали последовательно в спиртах 70°, 90°, 96°, 100° по 1 минуте, затем в толуоле 5 минут. Помещали в заключающую среду под покровные стекла. Микроскопировали в световом микроскопе.Tissue samples (human, rat or rabbit) were fixed with a 10% solution of neutral formalin and poured into paraffin blocks according to the generally accepted method [G. Merkulov Course of histopathological technology. - L .: Medicine, 1969. - S.13-15, 52-59]. Histological sections were prepared with a thickness of 5 μm and mounted on glass coated with poly-L-lysine. The preparations were dewaxed in toluene for 5 minutes, and then sequentially in alcohols 100 °, 96 °, 90 °, 70 ° and 50 ° for 1 minute. After which the preparations were kept in distilled water for 10 minutes, then they were placed in a citrate buffer (pH = 6.0) and the treatment was carried out in a microwave oven with a power of 800 W, which was heated at 100% power for 8 minutes, then at 60% power for 10 minutes . Then the preparations were cooled to 25 ° C in nitrate buffer and washed with distilled water 2 times for 5 minutes. 50 μl of 3% H ₂ O _{2 was} applied to each preparation, and kept for 5 minutes. Washed with Tris buffer (pH = 7.6) 2 times for 5 minutes. Then, 50 μl of a 0.4% casein solution was applied, incubated for 5 minutes, washed with Tris buffer (pH = 7.6) 2 times for 5 minutes. After that, primary antibodies were applied to each preparation, using anti-VEGFRl antibodies as a working dilution of 1:50. The preparations were incubated in a humid chamber at a temperature of 25 ° C for 60 minutes, then they were washed with Tris buffer (pH = 7.6) 2 times for 5 minutes. Then, 50 μl of a solution containing 10% serum in Tris buffer (pH = 7.6) was applied to the preparations, incubated in a humid chamber at a temperature of 25 ° C for 30 minutes, and washed with Tris buffer (pH = 7.6) 2 times for 5 minutes. Then, secondary antibodies labeled with peroxidase were applied, 50 μl each, incubated in a humid chamber at 25 ° C for 30 minutes, and washed with Tris buffer (pH = 7.6) 2 times for 5 minutes. Then 50 μl of a substrate mixture containing 50 μl of 1.74% 3'3'-diaminobenzidine in 1 ml of 0.05% H ₂ O _{2 was} added, kept for 5 minutes, washed with water. Sections were stained with 0.02% hematoxylin solution for 3 minutes. Washed with water. Dehydrated sequentially in alcohols 70 °, 90 °, 96 °, 100 ° for 1 minute, then in toluene for 5 minutes. Placed in a closing medium under coverslips. Microscopic in a light microscope.

Результаты окрашивания представлены на фиг.1-5, где тучные клетки 1 четко выявляются как в соединительной ткани крысы (фиг.1), так и в мышечной ткани человека (фиг.2), благодаря специфическому окрашиванию. При этом на полученных гистологических препаратах тучные клетки 1 выглядят как заполненные гранулами клетки с неровной поверхностью. Часть клеток 2 в мышечной ткани крысы дегранулирует (фиг.3).Staining results are shown in FIGS. 1-5, where mast cells 1 are clearly detected both in rat connective tissue (FIG. 1) and in human muscle tissue (FIG. 2), due to specific staining. Moreover, on the obtained histological preparations, mast cells 1 look like cells filled with granules with an uneven surface. Part of the cells 2 in the muscle tissue of the rat degranulate (figure 3).

Всего данным способом окрашено 75 препаратов. При этом авторами предлагаемого способа не отмечено специфического окрашивания других клеток со сходной морфологией. Авторы отмечают воспроизводимость предлагаемого способа - при окрашивании серийных срезов в разных партиях достигнуты идентичные результаты окрашивания. В сравнении со стандартным методом окрашивания гематоксилин-эозином достигнуто достоверно более четкое окрашивание тучных клеток. Так, на фиг.4 и фиг.5 представлены препараты соединительной ткани крысы: препарат, окрашенный стандартным способом, - фиг.4; препарат, окрашенный предлагаемым способом, - фиг.5.In total, 75 preparations were stained with this method. Moreover, the authors of the proposed method did not indicate specific staining of other cells with similar morphology. The authors note the reproducibility of the proposed method - when staining serial sections in different batches, identical staining results were achieved. Compared with the standard hematoxylin-eosin staining method, significantly more distinct mast cell staining was achieved. So, in figure 4 and figure 5 presents the preparations of connective tissue of the rat: the drug, stained in a standard way, - figure 4; the drug is colored by the proposed method, - figure 5.

Таким образом, предлагаемый иммуногистохимический способ идентификации тучных клеток позволяет четко и дифференцированно окрашивать тучные клетки на гистологическом препарате. Данный способ может быть использован в медицине и биологии.Thus, the proposed immunohistochemical method for the identification of mast cells allows you to clearly and differentially stain mast cells on a histological preparation. This method can be used in medicine and biology.

Claims

A method for identifying mast cells on a histological specimen, including fixing and placing a tissue sample in paraffin, making sections, dewaxing, washing in Tris buffer, incubation with a reagent and treatment with a developing agent, characterized in that antibodies against VEGFR1 are used as a reagent in dilution 1:50, and incubation with the reagent is carried out in a humid chamber at a temperature of 25 ° C for 60 minutes