RU2396342C1 - Method of producing three-dimensional matrices for tissue-like structures from animal cells - Google Patents
Method of producing three-dimensional matrices for tissue-like structures from animal cells Download PDFInfo
- Publication number
- RU2396342C1 RU2396342C1 RU2008151474/13A RU2008151474A RU2396342C1 RU 2396342 C1 RU2396342 C1 RU 2396342C1 RU 2008151474/13 A RU2008151474/13 A RU 2008151474/13A RU 2008151474 A RU2008151474 A RU 2008151474A RU 2396342 C1 RU2396342 C1 RU 2396342C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- microspheres
- cells
- substrate
- histones
- histone
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 60
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 title abstract description 7
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims abstract description 177
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 147
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 57
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims abstract description 30
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 7
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 claims description 195
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 claims description 95
- 230000007480 spreading Effects 0.000 claims description 28
- 238000003892 spreading Methods 0.000 claims description 28
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 25
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 22
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 14
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 12
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 10
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 claims description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 7
- 244000309466 calf Species 0.000 claims description 6
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 4
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims 1
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 claims 1
- LEONUFNNVUYDNQ-UHFFFAOYSA-N vanadium atom Chemical compound [V] LEONUFNNVUYDNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 259
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 50
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 27
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 25
- 230000008569 process Effects 0.000 description 22
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 19
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 19
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 18
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 17
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 17
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 16
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 15
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 15
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 102100039869 Histone H2B type F-S Human genes 0.000 description 13
- 101001035372 Homo sapiens Histone H2B type F-S Proteins 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 12
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 12
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 11
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 11
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 10
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 9
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 8
- 101710103773 Histone H2B Proteins 0.000 description 7
- 102100021639 Histone H2B type 1-K Human genes 0.000 description 7
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 6
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 6
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 5
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 5
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 5
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 5
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 5
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 5
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 4
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 4
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000017286 Histone H2A Human genes 0.000 description 3
- 108050005231 Histone H2A Proteins 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 3
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 3
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 230000004956 cell adhesive effect Effects 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 210000001650 focal adhesion Anatomy 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 2
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- DASMEZATWQCXPC-UHFFFAOYSA-N dimethyl octanediimidate;hydrochloride Chemical compound Cl.COC(=N)CCCCCCC(=N)OC DASMEZATWQCXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000012876 topography Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical group CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100339431 Arabidopsis thaliana HMGB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100036597 Basement membrane-specific heparan sulfate proteoglycan core protein Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 108700010013 HMGB1 Proteins 0.000 description 1
- 101150021904 HMGB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 102100037907 High mobility group protein B1 Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000446313 Lamella Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010008964 Non-Histone Chromosomal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006570 Non-Histone Chromosomal Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 229940123573 Protein synthesis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 102000019997 adhesion receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010013985 adhesion receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002365 anti-tubercular Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 210000002199 attachment cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012867 bioactive agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- -1 cationic amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 108091006090 chromatin-associated proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009668 clonal growth Effects 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 239000008199 coating composition Substances 0.000 description 1
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002385 cottonseed oil Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N disodium;3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane Chemical compound [Na+].[Na+].O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYSNRPHRLRVCSW-UHFFFAOYSA-N dodecasodium;tetraborate Chemical class [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-].[O-]B([O-])[O-].[O-]B([O-])[O-].[O-]B([O-])[O-] FYSNRPHRLRVCSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- PSLIMVZEAPALCD-UHFFFAOYSA-N ethanol;ethoxyethane Chemical compound CCO.CCOCC PSLIMVZEAPALCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 102000022382 heparin binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091012216 heparin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003350 isoniazid Drugs 0.000 description 1
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N isoniazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000000110 microvilli Anatomy 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000001114 myogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000000059 patterning Methods 0.000 description 1
- 108010049224 perlecan Proteins 0.000 description 1
- 238000000206 photolithography Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000026447 protein localization Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 239000000007 protein synthesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 1
- 108700038288 rhodamine-phalloidin Proteins 0.000 description 1
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, в частности к биомедицине, которая включает принципы и методы клеточной биологии и клеточной инженерии, т.е. культивирование клеток на субстратах, модифицированных микроструктурами, содержащими полимерные микросферы и природные катионные белки, а именно гистоны из ткани тимуса телят, и такие субстраты могут быть использованы для культивирования зависимых от прикрепления клеток для получения трехмерных тканеподобных структур.The invention relates to medicine, in particular to biomedicine, which includes the principles and methods of cell biology and cell engineering, i.e. culturing cells on substrates modified with microstructures containing polymer microspheres and natural cationic proteins, namely histones from calf thymus tissue, and such substrates can be used for culturing attachment-dependent cells to obtain three-dimensional tissue-like structures.
Создание тканеподобных клеточных структур необходимо для восстановления целостности тканей и органов человека путем их имплантации в зону повреждения. При использовании разных модифицирующих субстратов биологически активных молекул создают матрицы, на которых получают сложные клеточные композиции, специфичные для каждой конкретной ткани. Наряду с этим пространственная структура матрицы имеет большое значение для правильной укладки нанесенных на нее клеток, входящих в формируемую ткань. Покрытие субстрата микросферами с иммобилизованными на их поверхности гистонами может способствовать этому процессу.The creation of tissue-like cell structures is necessary to restore the integrity of human tissues and organs by implanting them in the damage zone. When using different modifying substrates of biologically active molecules, matrices are created on which complex cell compositions specific for each specific tissue are obtained. Along with this, the spatial structure of the matrix is of great importance for the proper placement of the cells deposited on it that enter the tissue being formed. Coating the substrate with microspheres with histones immobilized on their surface can contribute to this process.
Для пояснения свойства белков, в частности гистонов, используемых в изобретении, заявитель считает целесообразным дать их характеристику в приложении к данному описанию (Приложение).To explain the properties of proteins, in particular the histones used in the invention, the applicant considers it appropriate to give their characteristics in the appendix to this description (Appendix).
В настоящее время разработаны специальные технологии для конструирования поверхности субстрата с определенной микроконфигурацией (1). Такие поверхности используются, например, при сокультивировании клеток для целей тканевой инженерии (2).At present, special technologies have been developed for constructing the surface of a substrate with a certain microconfiguration (1). Such surfaces are used, for example, in the co-cultivation of cells for tissue engineering purposes (2).
Для конструирования культуральной поверхности с определенной микроконфигурацией используют технику фотолитографии с целью создания желаемой топографии поверхности, содержащей адгезивные и неадгезивные области для клеток (3, 4). Показано, что на такой поверхности субстрата скорость пролиферации и выживание клеток коррелируют с доступностью, количеством и распределением адгезивных островков, а не с фактической адгезивной областью. Для применения данного способа необходима специальная подготовка субстрата.To construct a culture surface with a specific microconfiguration, a photolithography technique is used to create the desired surface topography containing adhesive and non-adhesive areas for cells (3, 4). It was shown that on such a surface of the substrate, the proliferation rate and cell survival correlate with the availability, quantity and distribution of adhesive islands, and not with the actual adhesive region. For the application of this method requires special preparation of the substrate.
Наряду с топографической модификацией поверхности широко используют различные полимерные материалы и составы для покрытия поверхности субстрата с целью иммобилизации белков и пептидов, которые способствуют высокоспецифическому взаимодействию клеток с лигандом на носителе.Along with topographic surface modification, various polymeric materials and compositions are widely used to coat the surface of the substrate in order to immobilize proteins and peptides that promote highly specific interaction of cells with the ligand on the carrier.
Известен состав (5) для покрытия, включающий водорастворимый полимер, химически связанный с адгезивным для клеток пептидом, который предназначен для покрытия поверхности культурального сосуда или носителей для культивирования животных клеток в суспензии в бессывороточной среде. Однако он не обеспечивает получения надежной структуры.Known composition (5) for coating, including a water-soluble polymer chemically bonded to an adhesive for cells peptide, which is intended to cover the surface of a culture vessel or media for culturing animal cells in suspension in serum-free medium. However, it does not provide a reliable structure.
Известен состав (6), содержащий адгезивные для клеток белки, ковалентно связанные с поверхностью субстрата для клеточного культивирования с целью улучшения клеточного прикрепления и стабилизации клеточного роста. Однако такой состав дорогостоящий.Known composition (6), containing adhesive for cells, proteins, covalently linked to the surface of the substrate for cell cultivation in order to improve cell attachment and stabilization of cell growth. However, such a composition is expensive.
Известен состав (7) для покрытия субстратов ростовыми факторами для стимуляции роста эукариотических клеток. Однако данный состав не позволяет получить стабильный белковый слой.Known composition (7) for coating substrates with growth factors to stimulate the growth of eukaryotic cells. However, this composition does not allow to obtain a stable protein layer.
Известен состав (8) для покрытия, содержащий поли-L-лизин в солевом растворе для покрытия поверхности таких субстратов, как пластик, стекло или микропористые волокна. Данный способ, как и способ (7), не позволяет получить стабильный белковый слой, что является необходимым условием для создания тканеподобных структур.Known composition (8) for coating, containing poly-L-lysine in saline to cover the surface of such substrates, such as plastic, glass or microporous fibers. This method, like method (7), does not allow to obtain a stable protein layer, which is a necessary condition for creating tissue-like structures.
Известен способ покрытия культуральной поверхности положительно заряженными белками (9), который является наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению и выбран в качестве прототипа. В известном способе на поверхность культурального сосуда наносят суммарный гистон из ткани тимуса телят (Sigma IIA). На такой культуральной поверхности субстрата, содержащей адсорбированные белки, клетки клонируют в среде с минимальным количеством сыворотки.A known method of coating a cultural surface with positively charged proteins (9), which is the closest in technical essence to the proposed invention and is selected as a prototype. In the known method, the total histone from calf thymus tissue (Sigma IIA) is applied to the surface of the culture vessel. On such a culture surface of a substrate containing adsorbed proteins, cells are cloned in a medium with a minimum amount of serum.
Недостатками известного способа являются ненадежность структуры и нестабильность белкового слоя, что не позволяет эффективно и надежно создавать тканеподобную структуру. Указанные недостатки обусловлены тем, что использование субстрата с адсорбированным белковым слоем не обеспечивает стерического соответствия адгезивных белков и адгезионных рецепторов на поверхности клетки и имеется вероятность открепления от субстрата адсорбированных пистонов и их переход в культуральную среду и интернализации гистона клетками, прикрепленными к субстрату.The disadvantages of this method are the unreliability of the structure and the instability of the protein layer, which does not allow you to effectively and reliably create a tissue-like structure. These drawbacks are due to the fact that the use of a substrate with an adsorbed protein layer does not ensure steric correspondence between adhesive proteins and adhesive receptors on the cell surface and there is a possibility of adsorbed pistons being detached from the substrate and transferred to the culture medium and histone internalized by cells attached to the substrate.
Предлагаемое изобретение лишено указанных недостатков благодаря осуществлению топографической модификации поверхности при нанесении на нее биосовместимых полимерных микросфер из кристаллизованного декстрана диаметром не более 1,0 мкм с иммобилизованными на их поверхности адгезивными для клеток положительно заряженными гистонами.The present invention is devoid of these drawbacks due to the implementation of topographic surface modification when applying biocompatible polymer microspheres from crystallized dextran with a diameter of not more than 1.0 μm with positively charged histones immobilized on their surfaces immobilized on their surface.
Техническим результатом предлагаемого изобретения являются повышение надежности структуры и стабильности белкового слоя трехмерной матрицы, упрощение и удешевление способа ее получения на поверхности субстрата, используемого в дальнейшем в качестве основы для получения тканеподобных клеточных структур, за счет адсорбции биосовместимых полимерных микросфер из кристаллизованного декстрана диаметром не более 1,0 мкм, с иммобилизованными на их поверхности гистонами, на поверхности субстрата, что обеспечивает эффективное прикрепление клеток к микросферам и имеет ряд преимуществ, которые обусловлены, в основном, тем, что:The technical result of the invention is to increase the reliability of the structure and stability of the protein layer of a three-dimensional matrix, simplify and reduce the cost of its production on the surface of the substrate, which is further used as the basis for obtaining tissue-like cell structures due to the adsorption of biocompatible polymer microspheres from crystallized dextran with a diameter of not more than 1 , 0 μm, with histones immobilized on their surface, on the surface of the substrate, which ensures effective attachment cells to microspheres and has a number of advantages, which are mainly due to the fact that:
- физическая адсорбция микросфер - менее сложный процесс, чем химическая модификация поверхности;- physical adsorption of microspheres is a less complex process than chemical surface modification;
- получение микросфер с модифицированной поверхностью дешевле и может иметь промышленный масштаб по сравнению с химическим присоединением белков к поверхности;- obtaining microspheres with a modified surface is cheaper and can have an industrial scale in comparison with the chemical attachment of proteins to the surface;
- требуется небольшое количество микросфер для покрытия достаточно большой поверхности субстрата по сравнению с традиционными сферическими микроносителями, диаметр которых от 100 до 250 мкм.- a small amount of microspheres is required to cover a sufficiently large surface of the substrate in comparison with traditional spherical microcarriers, the diameter of which is from 100 to 250 microns.
- предотвращается переход чужеродного белка из субстрата в культуральную среду, что исключает возможность ингибирования роста клеток.- prevents the transfer of a foreign protein from the substrate into the culture medium, which eliminates the possibility of inhibiting cell growth.
- микросферы могут быть использованы для топографической модификации поверхности субстрата с целью создания трехмерных матриц, которые с нанесенными на них клетками являются основой для формирования тканеподобных клеточных структур, а также могут быть использованы для сокультивировании клеток для целей тканевой инженерии и в качестве моделей in vitro для масштабного скрининга лекарственных средств и биологически активных веществ.- microspheres can be used for topographic modification of the surface of the substrate in order to create three-dimensional matrices, which with the cells applied to them are the basis for the formation of tissue-like cell structures, and can also be used for co-cultivation of cells for tissue engineering and as in vitro models for large-scale screening of drugs and biologically active substances.
Технический результат достигается тем, что известном способе клонирования клеток, который включает известные и общие с заявленным новым способом признаки, используют иммобилизацию гистонов из ткани тимуса телят на поверхности субстрата, адсорбцию гистонов на поверхности субстрата, удаление неадсорбированного белка, оценку способности прикрепления, распластывания, морфологического состояния и скорости роста клеток при культивировании на модифицированной гистонами поверхности субстрата, в предлагаемом способе поверхность субстрата топографически модифицируют микросферами, покрытыми гистонами, причем используемые гистоны предварительно ковалентно связывают с поверхностью биосовместимых полимерных микросфер из кристаллизованного декстрана диаметром не более 1,0 мкм, причем перед ковалентным связыванием гистонов проводят активацию микросфер, которую осуществляют добавлением к водной суспензии микросфер сшивающего агента, в качестве которого используют бромциан при концентрации не более 0,42 моль/л, при температуре не более 4°С и времени инкубации не более 2 мин, затем активированные микросферы осаждают при центрифугировании и осадок промывают дистиллированной водой и повторно центрифугируют, после чего проводят повторное суспензирование микросфер в растворе гистона при весовом соотношении белка и микросфер, равном 1:100, а реакцию ковалентного связывания осуществляют при рН 7,5-8,0, температуре не более 4°С, времени инкубации не более 2 ч, затем микросферы с ковалентно связанными гистонами осаждают центрифугированием, после чего микросферы, содержащие от 160 до 200 мкг белка на 1,0 г, наносят на поверхность субстрата в количестве от 0,5 до 1,0 мг на 1,0 см2 и высушивают при комнатной температуре, затем промывают буферным раствором рН 7,5 для удаления не связанного с субстратом материала, а полученный слой микросфер на поверхности субстрата с нанесенными на него клетками используют в качестве основы для получения тканеподобных клеточных структур. Помимо этого требуемое количество иммобилизованного белка определяют аминокислотным анализом. При этом за оптимальное количество иммобилизованного гистона принимают 180 мкг белка на 1,0 г микросфер. Для иммобилизации выбирают комбинации различных типов гистонов и их ковалентные конъюгаты. В частности, выбирают суммарный гистон, коровые гистоны и их ковалентные конъюгаты. При этом клетки культивируют в бессывороточной среде с ростовыми добавками.The technical result is achieved by the fact that the known method of cloning cells, which includes known and common features of the claimed new method, use the immobilization of histones from calf thymus tissue on the surface of the substrate, adsorption of histones on the surface of the substrate, removal of non-adsorbed protein, assessment of the ability of attachment, spreading, morphological the state and growth rate of cells during cultivation on a histone-modified surface of the substrate, in the proposed method, the surface of the substrate topographically modified with histone-coated microspheres, the histones used are pre-covalently bonded to the surface of biocompatible polymer microspheres from crystallized dextran with a diameter of not more than 1.0 μm, and before the covalent binding of histones, microspheres are activated by adding a cross-linking agent to the aqueous suspension as which use bromine cyanide at a concentration of not more than 0.42 mol / l, at a temperature of not more than 4 ° C and an incubation time of not more than 2 minutes, Then the activated microspheres are precipitated by centrifugation and the precipitate is washed with distilled water and centrifuged again, after which microspheres are re-suspended in a histone solution at a weight ratio of protein to microspheres of 1: 100, and the covalent binding reaction is carried out at pH 7.5-8.0 , temperature no more than 4 ° С, incubation time no more than 2 hours, then microspheres with covalently bound histones are precipitated by centrifugation, after which microspheres containing 160 to 200 μg of protein per 1.0 g are applied to the surface be the substrate in an amount of from 0.5 to 1.0 mg per 1.0 cm 2 and dried at room temperature, then washed with a buffer solution of pH 7.5 to remove non-bound with the substrate material, and the resulting layer of microspheres on the surface of the substrate with applied cells are used on it as a basis for obtaining tissue-like cell structures. In addition, the required amount of immobilized protein is determined by amino acid analysis. Moreover, 180 μg of protein per 1.0 g of microspheres is taken as the optimal amount of immobilized histone. For immobilization, combinations of various types of histones and their covalent conjugates are selected. In particular, the total histone, core histones and their covalent conjugates are selected. In this case, the cells are cultured in serum-free medium with growth additives.
В предлагаемом изобретении для топографической модификации поверхности культуральных сосудов используют биосовместимые полимерные микросферы, приготовленные из кристаллизованного декстрана диаметром не более 1,0 мкм, и положительно заряженные белки, выбранные из группы, содержащей гистоны H1, Н2А, Н2В, Н3, Н4, комбинации различных типов гистонов, перекрестно сшитые конъюгаты различных типов гистонов.In the present invention, for topographic modification of the surface of culture vessels, biocompatible polymer microspheres prepared from crystallized dextran with a diameter of not more than 1.0 μm and positively charged proteins selected from the group consisting of histones H1, H2A, H2B, H3, H4, combinations of various types are used histones, cross-linked conjugates of various types of histones.
Заявленный способ был апробирован в лабораторных условиях на базе Санкт-Петербургского государственного университета и Института цитологии РАН СПб. Результаты проведенных исследований поясняются следующими примерами (более подробные пояснения лабораторных испытаний с описанием прилагаемых фигур приведены в приложении к данному описанию):The claimed method was tested in laboratory conditions on the basis of St. Petersburg State University and the Institute of Cytology RAS RAS St. Petersburg. The results of the studies are illustrated by the following examples (more detailed explanations of laboratory tests with a description of the attached figures are given in the appendix to this description):
Пример 1.Example 1
Получение гистонов и микросфер из кристаллизованного декстрана диаметром не более 1,0 мкм и химическое связывание гистонов с микросферами осуществляют следующим образом. Препараты суммарного гистона сернокислого из ткани тимуса телят получают известным способом (10). Препараты коровых гистонов, содержащие в своем составе гистоны Н2А, Н2В, Н3, Н4, получают из суммарного гистона (11). Препараты отдельных фракций гистонов получают при хроматографическом разделении препарата коровых гистонов (11).The preparation of histones and microspheres from crystallized dextran with a diameter of not more than 1.0 μm and the chemical binding of histones to microspheres is as follows. Preparations of total histone sulfate from calf thymus tissue are obtained in a known manner (10). Cortical histone preparations containing histones Н2А, Н2В, Н3, Н4 in their composition are obtained from the total histone (11). Preparations of individual histone fractions are obtained by chromatographic separation of the core histone preparation (11).
Электрофоретический анализ препаратов гистонов проводят в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) по методу Томаса и Коррнберга (12). Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ДСН при высоком значении рН системы позволяет фракционировать белки в зависимости от их молекулярной массы. В присутствии ДСН фракции гистонов могут быть разделены в порядке их возрастающей подвижности: H1, Н3, Н2В, Н2А, Н4. Растворимые ковалентные конъюгаты суммарного и коровых гистонов получают при использовании метода перекрестного связывания (13). Получение растворимых ковалентных конъюгатов суммарного гистона осуществляют следующим образом.Electrophoretic analysis of histone preparations is carried out in a polyacrylamide gel (PAGE) in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS) according to the method of Thomas and Korrnberg (12). Polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of SDS at a high pH of the system allows the fractionation of proteins depending on their molecular weight. In the presence of SDS, histone fractions can be separated in order of increasing mobility: H1, H3, H2B, H2A, H4. Soluble covalent conjugates of total and core histones are obtained using the cross-linking method (13). Obtaining soluble covalent conjugates of total histone is as follows.
Суммарный гистон конъюгируют при использовании метода перекрестного связывания. Образец суммарного гистона в количестве 20 мг растворяют в фосфатно-солевом буферном растворе рН 7,5 до конечной концентрации 2 мг/мл и диализуют против 0,2 М натрия тетраборнокислого, подкисленного до рН 9,0 концентрированной соляной кислотой. Диализ проводят в течение 18 ч при температуре 4°С. Реакцию конъюгирования проводят при использовании в качестве сшивающего агента диметилсуберимидат гидрохлорида до конечной концентрации 5 мг/мл и реакцию проводят в течение 30 мин при температуре 23°С при перемешивании раствора на магнитной мешалке. Реакцию останавливают добавлением равного объема 1,0 М моноэтаноламина, рН 8,0. Раствор инкубируют в течение 2 ч при температуре 23°С, подвергают диализу против дистиллированной воды, как описано выше, замораживают и высушивают сублимацией.The total histone is conjugated using the cross-linking method. A sample of total histone in an amount of 20 mg was dissolved in phosphate-buffered saline pH 7.5 to a final concentration of 2 mg / ml and dialyzed against 0.2 M sodium tetraborate, acidified to pH 9.0 with concentrated hydrochloric acid. Dialysis is carried out for 18 hours at a temperature of 4 ° C. The conjugation reaction is carried out using dimethylsuberimidate hydrochloride as a crosslinking agent to a final concentration of 5 mg / ml and the reaction is carried out for 30 minutes at a temperature of 23 ° C. while stirring the solution on a magnetic stirrer. The reaction is stopped by the addition of an equal volume of 1.0 M monoethanolamine, pH 8.0. The solution was incubated for 2 hours at 23 ° C, dialyzed against distilled water as described above, frozen and freeze-dried.
Перекрестно сшитые конъюгаты суммарного гистона анализируют электрофорезом в ДСН - 15% ПААГ, рН 8,8.Cross-linked conjugates of the total histone are analyzed by SDS electrophoresis - 15% SDS page, pH 8.8.
Электрофоретический анализ перекрестно сшитых конъюгатов суммарного гистона показывает, что ковалентные конъюгаты суммарного гистона содержат в своем составе димеры и олигомеры гистонов.Electrophoretic analysis of cross-linked total histone conjugates shows that covalent total histone conjugates contain histone dimers and oligomers.
Традиционные сферические микроносители, полученные на основе полистирола, сефадекса, полиакриламида, коллагена и желатина, используются для размножения адгезивных клеток в суспензии и в качестве компонента структурной матрицы для прикрепления клеток в монослойной культуре. К таким сферическим микроносителям, в частности, относятся перекрестно сшитые декстрановые гранулы, покрытые коллагеном (Cytodex 3; Pharmacia, Uppsala, Sweden) диаметром от 100 до 250 мкм (14). Рост клеток на их поверхности происходит так же, как в монослое, который модифицирован только радиусом кривизны сферических поверхностей различного диаметра. Микроносители на основе перекрестно сшитого декстрана имеют крупные поры и подвержены сжатию, что затрудняет сбор продуктов, которые секретируются в культуральную среду (15).Conventional spherical microcarriers based on polystyrene, Sephadex, polyacrylamide, collagen and gelatin are used to propagate adhesive cells in suspension and as a component of the structural matrix for cell attachment in a monolayer culture. Such spherical microcarriers, in particular, include cross-linked dextran granules coated with collagen (Cytodex 3; Pharmacia, Uppsala, Sweden) with diameters from 100 to 250 μm (14). The growth of cells on their surface occurs in the same way as in a monolayer, which is modified only by the radius of curvature of spherical surfaces of various diameters. Microcarriers based on cross-linked dextran have large pores and are subject to compression, which complicates the collection of products that are secreted into the culture medium (15).
Кроме того, ковалентная сшивка цепей декстрана в значительной мере изменяет структуру и химическую стабильность микроносителей. Поэтому перекрестно сшитые биодеградируемые микроносители при их распаде образуют продукты, токсичные для жизнедеятельности клеток. Сферические микроносители, площадь поверхности которых значительно превышает размер распластанной клетки, не обеспечивают стерического соответствия для взаимодействия адгезивных для клеток белков с адгезионными клеточными рецепторами. Получение микросфер на основе кристаллического декстрана осуществляют по способу Шредера (16). Этот способ основан на кристаллизации полисахаридов в эмульсионной среде под действием осадителя - ацетона. Для получения микросфер 500 мг декстрана с молекулярной массой 500000 и 500 мг декстрана с молекулярной массой 10000 растворяют в 0.5 мл воды и добавляют 5 мл эмульсионной среды (хлопковое масло). Эмульсию обрабатывают ультразвуком при мощности 50 Вт в течение 30 сек. Затем гомогенную суспензию по порциям вносят в ацетон (300 мл), содержащий 0.1% Твин-80, при перемешивании на магнитной мешалке. Полученные микросферы промывают ацетоном (3×50 мл) и дистиллированной водой (4×50 мл) при центрифугировании и высушивают при комнатной температуре.In addition, covalent crosslinking of dextran chains significantly changes the structure and chemical stability of microcarriers. Therefore, cross-linked biodegradable microcarriers during their decay form products that are toxic to the vital functions of cells. Spherical microcarriers, whose surface area is significantly larger than the size of the spread cell, do not provide steric correspondence for the interaction of cell-adhesive proteins with adhesive cell receptors. The preparation of microspheres based on crystalline dextran is carried out according to the Schröder method (16). This method is based on the crystallization of polysaccharides in an emulsion medium under the action of a precipitant, acetone. To obtain microspheres, 500 mg of dextran with a molecular weight of 500,000 and 500 mg of dextran with a molecular weight of 10,000 are dissolved in 0.5 ml of water and 5 ml of emulsion medium (cottonseed oil) is added. The emulsion is treated with ultrasound at a power of 50 W for 30 seconds. Then, a homogeneous suspension is added in portions to acetone (300 ml) containing 0.1% Tween-80, with stirring on a magnetic stirrer. The resulting microspheres are washed with acetone (3 × 50 ml) and distilled water (4 × 50 ml) by centrifugation and dried at room temperature.
Образцы микросфер из кристаллизованного декстрана анализируют с использованием электронной микроскопии при их нанесении на поверхность стекла.Samples of microspheres from crystallized dextran are analyzed using electron microscopy when applied to a glass surface.
Для этого стандартные образцы стекла обрабатывают смесью этанол-эфир (в равных объемах) в течение 1 ч и выдерживают при 500°С в течение 1 ч.To do this, standard glass samples are treated with ethanol-ether mixture (in equal volumes) for 1 hour and kept at 500 ° C for 1 hour.
Поверхность стекла покрывают водной суспензией микросфер и высушивают при комнатной температуре.The glass surface is covered with an aqueous suspension of microspheres and dried at room temperature.
Результаты электронной микроскопии представлены на фиг.1-3. Показано, что микросферы имеют средний диаметр 1,0 мкм и формируют однородный слой на поверхности стекла. Слой микросфер на поверхности стекла устойчив к действию культуральной среды при длительном хранении.The results of electron microscopy are presented in figures 1-3. It was shown that microspheres have an average diameter of 1.0 μm and form a uniform layer on the glass surface. The layer of microspheres on the glass surface is resistant to the action of the culture medium during long-term storage.
В предпочтительном варианте осуществления предлагаемого изобретения топографическую модификацию поверхности культуральных сосудов проводят полимерными микросферами из кристаллизованного декстрана диаметром 1,0 мкм, ковалентно связанными с суммарным гистоном.In a preferred embodiment of the invention, topographic modification of the surface of the culture vessels is carried out with polymer microspheres of crystallized dextran with a diameter of 1.0 μm, covalently linked to the total histone.
Ковалетное связывание суммарного гистона с микросферами осуществляют следующим образом.The covalent binding of total histone to microspheres is as follows.
Образец микросфер из кристаллизованного декстрана в количестве 100 мг промывают ацетоном и осаждают центрифугированием. После центрифугирования микросферы суспензируют в 1.0 мл дистиллированной воды и помещают в ледяную баню. Перед иммобилизацией гистона на поверхности микросфер проводят предварительную активацию микросфер сшивающим агентом, в качестве которого выбирают бромциан. Активацию проводят в присутствии триэтиламина для связывания выделяющейся в ходе активации бромисто-водородной кислоты. Для этого к суспензии микросфер добавляют 50 мг бромциана до конечной концентрации 0,42 моль/л и 0.1 мл триэтиламина до конечной концентрации 0,64 моль/л при интенсивном перемешивании и выдерживают в течение двух минут. Активированные микросферы промывают ацетоном шесть раз (6×12 мл) и два раза дистиллированной водой (2×12 мл) при центрифугировании. После последнего центрифугирования к активированным микросферам добавляют 1.0 мл 0,1% раствора суммарного гистона в фосфатно-солевом буфере рН 7,5. Полученную вторичную суспензию микросфер при весовом соотношении белка и микросфер, равном 1:100, инкубируют при 4°С в течение 2 ч для связывания гистоновых белков с активированными микросферами. Микросферы со связанным белком осаждают из суспензии при повторном центрифугировании и промывают дистиллированной водой шесть раз (6×12 мл), замораживают и высушивают сублимацией.A sample of 100 mg crystallized dextran microspheres is washed with acetone and precipitated by centrifugation. After centrifugation, the microspheres are suspended in 1.0 ml of distilled water and placed in an ice bath. Before immobilization of the histone on the surface of the microspheres, the microspheres are preliminarily activated with a cross-linking agent, which is selected as bromine cyan. Activation is carried out in the presence of triethylamine to bind the hydrobromic acid released during activation. To do this, add 50 mg of bromine cyan to a suspension of microspheres to a final concentration of 0.42 mol / L and 0.1 ml of triethylamine to a final concentration of 0.64 mol / L with vigorous stirring and incubated for two minutes. The activated microspheres are washed with acetone six times (6 × 12 ml) and twice with distilled water (2 × 12 ml) by centrifugation. After the last centrifugation, 1.0 ml of a 0.1% solution of total histone in phosphate-saline buffer pH 7.5 is added to the activated microspheres. The resulting secondary suspension of microspheres at a weight ratio of protein to microspheres of 1: 100 is incubated at 4 ° C for 2 hours to bind histone proteins to activated microspheres. Microspheres with bound protein are precipitated from the suspension by repeated centrifugation and washed with distilled water six times (6 × 12 ml), frozen and freeze-dried.
Ковалентное связывание обусловлено реакцией между ε-аминогруппой лизиновых остатков гистонов и активными группами в цепях полисахаридов.Covalent binding is due to the reaction between the ε-amino group of the lysine residues of histones and active groups in the chains of polysaccharides.
Определение количества белка, связанного с микросферами, осуществляют с помощью аминокислотного анализа (17). Декстрановые микросферы (50 мг), ковалентно связанные с суммарным гистоном, высушивают до постоянного веса при 50°С. В качестве стандарта используют препарат суммарного гистона (10 мг). Оба образца гидролизуют 6 н. хлористо-водородной кислотой в герметических пробирках в течение 24 ч при 110°С. После высушивания образцов до постоянного веса проводят аминокислотный анализ и рассчитывают количество белка.The determination of the amount of protein bound to microspheres is carried out using amino acid analysis (17). Dextran microspheres (50 mg) covalently bound to the total histone are dried to constant weight at 50 ° C. The total histone preparation (10 mg) is used as a standard. Both samples hydrolyze 6 N. hydrochloric acid in sealed tubes for 24 hours at 110 ° C. After drying the samples to constant weight, an amino acid analysis is performed and the amount of protein is calculated.
Количество белка оценивают на основании данных по содержанию в гидролизатах устойчивых к гидролизу аминокислот, таких как аспарагиновая кислота, глицин, глутаминовая кислота.The amount of protein is estimated based on the content of hydrolysates of hydrolysis-resistant amino acids, such as aspartic acid, glycine, glutamic acid.
Например, в анализируемых образцах по данным аминокислотного анализа содержание аспарагиновой кислоты составляет 200 мкг в 10 мг образца суммарного гистона и 0,18 мкг в 50 мг образца декстрановых микросфер. Следовательно, в образце микросфер массой 50 мг содержится 9 мкг суммарного гистона. Отсюда количество ковалентно связанного суммарного гистона с поверхностью микросфер из кристаллизованного декстрана диаметром не более 1,0 мкм составляет 180 мкг белка на 1,0 г микросфер или 5,73 пикомоля на 1,0 см2 поверхности микросфер (расчетная величина).For example, in the analyzed samples according to the amino acid analysis, the content of aspartic acid is 200 μg in 10 mg of the total histone sample and 0.18 μg in 50 mg of the dextran microsphere sample. Therefore, in a sample of microspheres weighing 50 mg contains 9 μg of total histone. Hence, the amount of covalently bound total histone with the surface of microspheres of crystallized dextran with a diameter of not more than 1.0 μm is 180 μg of protein per 1.0 g of microspheres or 5.73 picomole per 1.0 cm 2 of the surface of the microspheres (calculated value).
Расчет количества суммарного гистона, ковалентно связанного с 1,0 см2 поверхности микросфер, проводят следующим образом. Плотность микросфер из кристаллизованного декстрана близка к 1,0 г на 1,0 см3, а их диаметр равен 1,0 мкм (0,0001 см), отсюда количество микросфер в 1,0 см3 составляет 1012 единиц. Площадь сферы выражается формулой: Sсф.=4πR2, отсюда площадь поверхности каждой микросферы равна 314·10-10 см2, а площадь всех микросфер в 1,0 см3 составляет 314·102 см2. Содержание суммарного гистона в 1,0 см3 составляет 180 мкг (180000 нг), а в пересчете на 1,0 см2 эта величина составляет 573 мг (180000: 314·102=573 нг) или 5,73 пикомоля суммарного гистона с молекулярной массой 100 кДа.The calculation of the total histone covalently bonded to 1.0 cm 2 of the surface of the microspheres is carried out as follows. The density of the microspheres from crystallized dextran is close to 1.0 g per 1.0 cm 3 and their diameter is 1.0 μm (0.0001 cm), hence the number of microspheres in 1.0 cm 3 is 10 12 units. The area of the sphere is expressed by the formula: Ssp. = 4πR 2 , hence the surface area of each microsphere is 314 · 10 -10 cm 2 , and the area of all microspheres in 1.0 cm 3 is 314 · 10 2 cm 2 . The total histone content in 1.0 cm 3 is 180 μg (180,000 ng), and in terms of 1.0 cm 2 this value is 573 mg (180,000: 314 · 10 2 = 573 ng) or 5.73 picomole of total histone s molecular weight 100 kDa.
Культивирование клеток проводят на топографически модифицированной микросферами, ковалентно связанными с гистонами, поверхности культуральных сосудов. Используют 6-луночные культуральные сосуды фирмы Corning Costar. Каталоговый №3506. Для этого на поверхность культурального сосуда диаметром 35 мм наносят 10-20-кратный избыток микросфер, что составляет от 1,5 до 2,0 мг на 1,0 см2 водной суспензии микросфер, содержащих микросферы из кристаллизованного декстрана диаметром около 1,0 мкм, ковалентно связанные с суммарным гистоном.Cell cultivation is carried out on topographically modified microspheres covalently linked to histones on the surface of culture vessels. 6-well culture vessels from Corning Costar are used. Catalog number 3506. For this, a 10-20-fold excess of microspheres is applied to the surface of a culture vessel with a diameter of 35 mm, which is from 1.5 to 2.0 mg per 1.0 cm 2 of an aqueous suspension of microspheres containing microspheres from crystallized dextran with a diameter of about 1.0 μm covalently linked to total histone.
По расчету объемное количество микросфер, необходимое для формирования слоя толщиной 1,0 мкм на поверхности субстрата площадью 10 см2, составляет 10-3 см3. Учитывая, что объем шара (идеальной микросферы) составляет 52% от объема описываемого куба, а плотность микросфер близка к 1,0 г на 1,0 см3, тогда объем величиной 10-3 см3 будет вмещать 520 мкг микросфер или 52 мкг на 1,0 см2.According to the calculation, the volumetric amount of microspheres required to form a layer with a thickness of 1.0 μm on the surface of a substrate with an area of 10 cm 2 is 10 −3 cm 3 . Given that the volume of the ball (ideal microsphere) is 52% of the volume of the described cube, and the density of the microspheres is close to 1.0 g per 1.0 cm 3 , then a volume of 10 -3 cm 3 will accommodate 520 μg microspheres or 52 μg per 1.0 cm 2 .
Культуральные сосуды выдерживают в ламинарном боксе в течение ночи для полного высушивания субстрата и затем промывают фосфатно-солевым буфером рН 7,5 для удаления не связанного с субстратом материала и повторно высушивают, как описано выше. На поверхности субстрата формируется однородный слой микросфер, который имеет повышенную устойчивость к действию культуральной среды.The culture vessels are kept in a laminar box overnight to completely dry the substrate and then washed with phosphate-buffered saline pH 7.5 to remove non-substrate material and re-dried as described above. A homogeneous layer of microspheres is formed on the surface of the substrate, which has increased resistance to the action of the culture medium.
Пример 2.Example 2
В этом варианте осуществления предлагаемого изобретения для топографической модификации поверхности культуральных сосудов используют перекрестно сшитые конъюгаты суммарного гистона, ковалентно связанные с полимерными микросферами из кристаллизованного декстрана диаметром не более 1,0 мкм. Получение микросфер из кристаллизованного декстрана диаметром не более 1,0 мкм осуществляют, как в примере 1. Получение перекрестно сшитых конъюгатов суммарного гистона проводят на поверхности микросфер и осуществляют следующим образом. К образцу микросфер в количестве 10 мг с первично ковалентно связанным суммарным гистоном добавляют 2,5 мг диметилсуберимидат гидрохлорида в качестве сшивающего агента. Реакцию ковалентного связывания проводят в течение 30 мин при 23°С при перемешивании суспензии на магнитной мешалке. Реакцию ковалентного связывания инициируют доведением рН суспензии до 9,1 при добавлении 0,2 мл насыщенного раствора натрия тетраборнокислого. Реакцию ковалентного связывания останавливают добавлением равного объема 1,0 М моноэтаноламина, рН 8,0. Суспензию инкубируют в течение 2 ч при температуре 23°С и затем подвергают диализу против дистиллированной воды в течение 18 ч, замораживают и высушивают сублимацией.In this embodiment of the invention, for topographic modification of the surface of the culture vessels, cross-linked total histone conjugates covalently bonded to polymer microspheres of crystallized dextran with a diameter of not more than 1.0 μm are used. Obtaining microspheres from crystallized dextran with a diameter of not more than 1.0 μm is carried out, as in example 1. Obtaining cross-linked conjugates of total histone is carried out on the surface of the microspheres and is as follows. To a sample of microspheres in an amount of 10 mg with a primarily covalently bound total histone was added 2.5 mg of dimethylsuberimidate hydrochloride as a crosslinking agent. The covalent binding reaction is carried out for 30 min at 23 ° C while stirring the suspension on a magnetic stirrer. The covalent binding reaction is initiated by adjusting the pH of the suspension to 9.1 with the addition of 0.2 ml of a saturated sodium tetraborate solution. The covalent binding reaction is stopped by the addition of an equal volume of 1.0 M monoethanolamine, pH 8.0. The suspension is incubated for 2 hours at 23 ° C. and then dialyzed against distilled water for 18 hours, frozen and freeze-dried.
Ковалентное связывание обусловлено реакцией между ε-аминогруппами лизиновых остатков в молекулах первично связанных с микросферами гистонов и вторично добавленных гистонов к суспензии микросфер.Covalent binding is due to the reaction between the ε-amino groups of lysine residues in the molecules of histones and second-added histones that are primarily associated with the microspheres of the suspension of microspheres.
Количество белка, ковалентно связанного с микросферами, определяют, как описано в примере 1. Количество ковалентно связанных перекрестно сшитых конъюгатов суммарного гистона с поверхностью микросфер из кристаллизованного декстрана диаметром не более 1,0 мкм составляет 200 мкг белка на 1,0 г микросфер.The amount of protein covalently bound to microspheres is determined as described in Example 1. The amount of covalently linked cross-linked conjugates of total histone with the surface of microspheres of crystallized dextran with a diameter of not more than 1.0 μm is 200 μg of protein per 1.0 g of microspheres.
Топографическую модификацию поверхности культуральных сосудов полимерными микросферами из кристаллизованного декстрана диаметром не более 1,0 мкм, ковалентно связанными с перекрестно сшитыми конъюгатами суммарного гистона, осуществляют, как описано в примере 1.Topographic modification of the surface of the culture vessels with polymer microspheres from crystallized dextran with a diameter of not more than 1.0 μm, covalently linked to cross-linked conjugates of the total histone, is carried out as described in example 1.
Пример 3.Example 3
В этой серии экспериментов оценивают способность клеток распластываться на субстратах, покрытых разными типами гистонов. Для этого проводят анализ изменения структуры актинового цитоскелета и формы клеток, распластанных на субстратах, покрытых гистонами разных типов. Используют постоянную линию клеток почки эмбриона человека (НЕК 293) и постоянную линию клеток эмбриональных фибробластов мыши (3T3/BALB clone A31), полученные из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии. Российская академия наук, Санкт-Петербург). Клетки культивируют на среде Дальбекко (ДМЕМ, Биолот) с добавлением 10%-ной эмбриональной бычьей сыворотки крови (Биолот).In this series of experiments, the ability of cells to spread on substrates coated with different types of histones is evaluated. For this, an analysis of the changes in the structure of the actin cytoskeleton and the shape of cells spread on substrates coated with different types of histones is performed. A constant human embryonic kidney cell line (HEK 293) and a constant mouse embryonic fibroblast cell line (3T3 / BALB clone A31) obtained from the Russian collection of cell cultures (Institute of Cytology. Russian Academy of Sciences, St. Petersburg) are used. Cells are cultured on Dalbecco's medium (DMEM, Biolot) with the addition of 10% fetal bovine serum (Biolot).
Анализируют следующие типы гистоновых белков: H1, H2B, Н3, Н2А+Н4, суммарный гистон, коровые гистоны, перекрестно сшитые конъюгаты суммарного гистона, перекрестно сшитые конъюгаты коровых гистонов.The following types of histone proteins are analyzed: H1, H2B, H3, H2A + H4, total histone, core histones, cross-linked total histone conjugates, cross-linked core histone conjugates.
Окрашивание актинового цитоскелета проводят следующим образом. На силиконизированное стекло (Reppel-Silane, Pharmacia) наносят раствор белка (гистоновые белки растворяют в дистиллированной воде до концентрации 20 мкг/мл) и инкубируют в течение 18 ч при 4°С. После чего инкубируют в течение 1 ч при 37°С в 2% растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА) в фосфатно-солевом буфере рН 7,5 (ФСБ) для того, чтобы исключить неспецифическое связывание клеток с субстратом. На субстрат наносят клетки (100 мкл, 105 клеток в 1,0 мл) и инкубируют в течение 1 ч в СO2-инкубаторе. Прикрепившиеся клетки фиксируют в течение 10 мин 4%-ным раствором формальдегида в ФСБ, инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре с 0,1%-ным раствором Тритона Х-100 в ФСБ и затем окрашивают родамином-фаллоидином в течение 10 мин при 37°С. Препараты в пропилгалате анализируют с помощью микроскопа Opton ICM (Zeiss).Staining of the actin cytoskeleton is carried out as follows. A protein solution is applied to siliconized glass (Reppel-Silane, Pharmacia) (histone proteins are dissolved in distilled water to a concentration of 20 μg / ml) and incubated for 18 hours at 4 ° C. Then incubated for 1 h at 37 ° C in a 2% solution of bovine serum albumin (BSA) in phosphate-buffered saline pH 7.5 (PBS) in order to exclude nonspecific binding of cells to the substrate. Cells (100 μl, 10 5 cells in 1.0 ml) are applied to the substrate and incubated for 1 h in a CO 2 incubator. Attached cells are fixed for 10 min with a 4% solution of formaldehyde in FSB, incubated for 10 min at room temperature with a 0.1% solution of Triton X-100 in FSB and then stained with rhodamine-phalloidin for 10 min at 37 ° C. The propylgalate preparations were analyzed using an Opton ICM microscope (Zeiss).
Клетки демонстрируют различную структуру цитоскелета после распластывания на субстратах, покрытых разными типами гистонов, которые изображены на фиг.4а-ж; фиг.5а-д; фиг.6а-г.Cells show a different cytoskeleton structure after spreading on substrates coated with different types of histones, which are depicted in figa-g; figa-e; figa-g.
Через 4 ч инкубации клетки линии НЕК 293 прикрепляются к субстрату, но не распластываются. Под флуоресцентным микроскопом видно диффузное окрашивание актина. Через 20 ч инкубации степень распластывания клеток зависит от типа гистонового белка, покрывающего подложку (фиг.4а-ж). Все изучаемые гистоновые белки можно разделить на три группы по способности клеток распластываться на субстратах, покрытых гистонами разных типов.After 4 hours of incubation, HEK 293 cells attach to the substrate, but do not flatten. Under a fluorescence microscope, diffuse staining of actin is visible. After 20 hours of incubation, the degree of spreading of the cells depends on the type of histone protein covering the substrate (figa-g). All studied histone proteins can be divided into three groups according to the ability of cells to spread on substrates coated with different types of histones.
Первая группа. Эту группу представляет гистон H1. Показано, что распластывание клеток на субстрате, покрытом гистоном H1, очень слабое, клетки практически не вытянутые, актиновые олигомеры без какой-либо регулярной структуры. Эти результаты демонстрируют, что гистон H1 не является подходящим субстратом для культивирования клеток НЕК 293 и 3T3/BALB.The first group. This group is histone H1. It was shown that the spreading of cells on a substrate coated with histone H1 is very weak, the cells are practically not elongated, actin oligomers without any regular structure. These results demonstrate that histone H1 is not a suitable substrate for culturing HEK 293 and 3T3 / BALB cells.
Вторая группа. Эта группу составляют суммарный гистон, коровые гистоны и гистон Н2А. Показано, что распластывание клеток лучше, чем в первой группе. Клетки поляризованы, актин концентрируется на концах вытянутых клеток, однако формирования структур, содержащих актин, не наблюдается. Суммарный гистон, коровые гистоны и гистон Н2А, составляющие эту группу, могут быть лучшими субстратами для культивирования клеток линии НЕК 293 и 3T3/BALB. Отсутствие организованной структуры цитоскелета может подавлять пролиферацию клеток. Из данных литературы известно, что формирование стресс-фибрилл является важным фактором для стимуляции пролиферации.The second group. This group consists of the total histone, core histones and histone H2A. It has been shown that cell spreading is better than in the first group. The cells are polarized, actin is concentrated at the ends of elongated cells, however, the formation of structures containing actin is not observed. The total histone, core histones, and histone H2A constituting this group may be the best substrates for culturing HEK 293 and 3T3 / BALB cells. The lack of an organized cytoskeleton structure can inhibit cell proliferation. From literature data it is known that the formation of stress fibrils is an important factor for stimulating proliferation.
Третья группа. Эту группу составляют перекрестно сшитые конъюгаты суммарного гистона и гистон Н2В. Клетки НЕК 293 и 3T3/BALB хорошо распластаны на этих субстратах, сильно поляризованы, имеют широкую ламеллу на ведущем крае и много микроворсинок и филлоподий, ориентированных в разных направлениях. Длинные выросты отдельных клеток имеют тенденцию контактировать с другими клетками, распластанными на субстрате. Наблюдается формирование фибриллярных актиновых структур. Эти результаты позволяют предполагать, что перекрестно сшитые конъюгаты суммарного гистона и гистон Н2В, которые составляют эту группу, являются наилучшими субстратами для культивирования клеток НЕК 293 и 3T3/BALB. Хорошо известно, что гистоны отличаются по общему содержанию гидрофобных и гидрофильных групп. Наибольшее количество гидрофильных групп имеет гистон Н2В (18). Вполне вероятно, что именно гистон Н2В, содержащийся в суммарном гистоне, отвечает за взаимодействие клеток с суммарным гистоном и стимулирует пролиферацию.The third group. This group consists of cross-linked conjugates of total histone and histone H2B. HEK 293 and 3T3 / BALB cells are well spread on these substrates, strongly polarized, have a wide lamella on the leading edge and many microvilli and phylopodia oriented in different directions. Long outgrowths of individual cells tend to come into contact with other cells spread out on the substrate. The formation of fibrillar actin structures is observed. These results suggest that the cross-linked conjugates of total histone and histone H2B, which make up this group, are the best substrates for culturing HEK 293 and 3T3 / BALB cells. It is well known that histones differ in the total content of hydrophobic and hydrophilic groups. The greatest number of hydrophilic groups is histone H2B (18). It is likely that it is H2B histone contained in the total histone that is responsible for the interaction of cells with the total histone and stimulates proliferation.
Известно, что клетки уже через 30 мин инкубации на субстрате начинают вырабатывать собственный внеклеточный матрикс и использовать эти белки для прикрепления и распластывания. Поэтому в отдельной серии экспериментов исследуют прикрепление и распластывание клеток на субстратах, покрытых гистонами в присутствии ингибитора синтеза белка циклогексимида. Клетки НЕК 293, распластанные на субстратах, покрытых гистонами различных типов, в присутствии циклогексимида, представлены на фиг.5а-д. Как и в уже описанных экспериментах, клетки, распластанные на перекрестно сшитых конъюгатах суммарного гистона и на гистоне Н2В, демонстрируют наибольшее распластывание и наилучшую структуру актинового цитоскелета. Клетки на этих субстратах демонстрируют мобильный фенотип и формируют ламеллоподии. В присутствии циклогексемида клетки используют для прикрепления и распластывания только гистоновую подложку, а не собственный внеклеточный матрикс. Таким образом, результаты вышеописанных экспериментов показывают, что клетки могут использовать для прикрепления, распластывания и роста субстраты, покрытые гистонами.It is known that cells after 30 minutes of incubation on the substrate begin to produce their own extracellular matrix and use these proteins for attachment and spreading. Therefore, in a separate series of experiments, the attachment and spreading of cells on substrates coated with histones in the presence of a cycloheximide protein synthesis inhibitor is investigated. HEK 293 cells spread on substrates coated with various types of histones in the presence of cycloheximide are shown in FIGS. 5a-e. As in the experiments already described, the cells spread on the cross-linked conjugates of the total histone and on the histone H2B show the greatest spreading and the best structure of the actin cytoskeleton. Cells on these substrates exhibit a mobile phenotype and form lamellopodia. In the presence of cyclohexemide, cells use only the histone substrate for attachment and spreading, and not their own extracellular matrix. Thus, the results of the above experiments show that cells can use histone coated substrates for attachment, spreading and growth.
Пример 4.Example 4
В этой серии экспериментов оценивают прикрепление и распластывание адгезивных клеток на топографически модифицированной микросферами, ковалентно связанными с гистонами, поверхности культуральных сосудов. Используют 6-луночные культуральные сосуды фирмы Corning Costar.In this series of experiments, the attachment and spreading of adhesive cells on topographically modified microspheres covalently linked to histones on the surface of culture vessels is evaluated. 6-well culture vessels from Corning Costar are used.
Для этого поверхность 6-луночных культуральных сосудов топографически модифицируют полимерными микросферами из кристаллизованного декстрана диаметром не более 1,0 мкм, ковалентно связанными с положительно заряженными гистонами.For this, the surface of 6-well culture vessels is topographically modified with polymer microspheres from crystallized dextran with a diameter of not more than 1.0 μm, covalently bound to positively charged histones.
В этих экспериментах исследуют следующие типы субстратов.In these experiments, the following types of substrates are examined.
Субстрат 1. Поверхность культуральных сосудов покрывают микросферами, ковалентно связанными с суммарным гистоном.
Субстрат 2. Поверхность культуральных сосудов покрывают микросферами, ковалентно связанными с перекрестно сшитыми конъюгатами суммарного гистона.
Субстрат 3. Поверхность культуральных сосудов покрывают микросферами, ковалентно связанными с коровыми гистонами.Substrate 3. The surface of the culture vessels is covered with microspheres covalently linked to core histones.
Субстрат 4. Поверхность культуральных сосудов покрывают микросферами, ковалентно связанными с перекрестно сшитыми конъюгатами коровых гистонов.
В качестве контроля используют не покрытую микросферами поверхность культуральных сосудов.As a control, the surface of the culture vessels not covered by microspheres is used.
Используют следующие культуры клеток.The following cell cultures are used.
(а) Постоянная линия клеток почки эмбриона человека (НЕК 293).(a) Permanent cell line of the kidney of a human embryo (HEK 293).
Клеточная линия НЕК 293 обычно поддерживается в среде ДМЕМ (среда ИГЛА в модификации Дальбекко), которая содержит 10% эмбриональную бычью сыворотку.The HEK 293 cell line is usually maintained in DMEM (Igla medium modified by Dalbeko), which contains 10% fetal bovine serum.
В каждую лунку 6-луночных культуральных сосудов, содержащую ДМЕМ и эмбриональную бычью сыворотку, вносят клетки НЕК 293. Клетки культивируют в СО2-инкубаторе при 37°С в течение 10-14 сут. Клетки снимают с помощью трипсина и оценивают количество клеток.HEK 293 cells are introduced into each well of 6-well culture vessels containing DMEM and fetal bovine serum. Cells are cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C for 10-14 days. Cells are removed using trypsin and the number of cells is estimated.
В каждую лунку 6-луночных культуральных сосудов вносят 5×105 клеток НЕК 293 и выдерживают 4.5 ч в бессывороточной среде и 24 ч при добавлении 10% эмбриональной бычьей сыворотки крови при 37°С в СО2-инкубаторе. После инкубации клетки фиксируют с помощью метанола и окрашивают кристаллическим фиолетовым.5 × 10 5 HEK 293 cells are introduced into each well of 6-well culture vessels and incubated for 4.5 hours in serum-free medium and 24 hours with the addition of 10% fetal bovine serum at 37 ° C in a CO 2 incubator. After incubation, the cells are fixed with methanol and stained with crystal violet.
Прикрепление и распластывание клеток анализируют под инвертированным микроскопом (ув. 10×10). Число клеток НЕК 293, прикрепившихся к субстрату, покрытому микросферами, ковалентно связанными с комбинациями различных типов гистонов, одинаково во всех вариантах опытов и в контроле. Клетки прикрепляются к микросферам через 4.5 ч. Не обнаруживается заметных различий в степени прикрепления клеток к исследуемым различным субстратам (субстраты 1-4). Распластывание клеток на субстрате начинается после 4 ч инкубации. После 24 ч инкубации в присутствии сыворотки клетки хорошо распластываются.Attachment and spreading of cells is analyzed under an inverted microscope (magn. 10 × 10). The number of HEK 293 cells attached to a substrate coated with microspheres covalently linked to combinations of different types of histones is the same in all experimental variants and in the control. Cells attach to the microspheres after 4.5 hours. No noticeable differences in the degree of cell attachment to the various substrates under study were found (substrates 1-4). Cell spreading on the substrate begins after 4 hours of incubation. After 24 hours of incubation in the presence of serum, the cells expand well.
Морфологический анализ окрашенных распластанных клеток с помощью инвертированного микроскопа показывает, что характер распластывания клеток на поверхности субстрата, покрытой микросферами из кристаллизованного декстрана диаметром не более 1,0 мкм, ковалентно связанных с гистонами, отличается от распластывания клеток на контрольной поверхности субстрата и имеет свои особенности.Morphological analysis of stained spread out cells using an inverted microscope shows that the pattern of spreading of cells on the surface of a substrate coated with crystallized dextran microspheres with a diameter of not more than 1.0 μm covalently associated with histones differs from spreading of cells on a control surface of the substrate and has its own characteristics.
На однородном слое микросфер, где микросферы расположены на оптимальном расстоянии друг от друга, клетки в процессе прикрепления к нескольким микросферам подвергаются функциональному растяжению с формированием длинных отростков, которые соединяют клетки друг с другом, формируя трехмерные сетеобразные клеточные структуры (фиг.7а-г).On a homogeneous layer of microspheres, where the microspheres are located at an optimal distance from each other, the cells, during attachment to several microspheres, undergo functional stretching with the formation of long processes that connect the cells to each other, forming three-dimensional network-like cell structures (Figs. 7a-d).
Распределение микросфер на поверхности субстрата принимают за оптимальное в том случае, если максимальное расстояние между микросферами не превышает размер распластанной клетки.The distribution of microspheres on the surface of the substrate is taken as optimal if the maximum distance between the microspheres does not exceed the size of the spread cell.
На монослое микросфер клетки в процессе прикрепления взаимодействуют с большим количеством микросфер и хорошо распластываются, но без формирования длинных отростков. Клетки контактируют между собой и объединяются в плотные слои, образуя сетеобразные клеточные структуры.On a monolayer of microspheres, cells in the process of attachment interact with a large number of microspheres and are well flattened, but without the formation of long processes. Cells are in contact with each other and are combined into dense layers, forming network-like cellular structures.
На контрольной поверхности субстрата клетки в процессе распластывания также образуют большие кластеры и сеть, однако единичных распластанных клеток наблюдается гораздо больше.On the control surface of the substrate, the cells also form large clusters and a network during spreading, but there are much more single spread cells.
(б) Постоянная линия клеток эмбриональных фибробластов мыши (BALB/3T3 clone A31).(b) Permanent mouse embryonic fibroblast cell line (BALB / 3T3 clone A31).
В этой серии экспериментов используются те же субстраты, что и в разделе (а).In this series of experiments, the same substrates are used as in section (a).
Наблюдается одинаковое число прикрепившихся клеток 3Т3 BALB к субстрату во всех вариантах экспериментов. Наибольшее количество клеток прикрепляется к микросферам через 4.5 ч (фиг.8а-в). Распластывание 3Т3 BALB клеток на субстратах начинается после 4.5 ч и происходит лучше, чем в случае НЕК 293 клеток. После 24 ч инкубации в присутствии сыворотки крови клетки хорошо распластываются. Клетки в процессе прикрепления к нескольким микросферам, расположенным на оптимальных расстояниях друг от друга, формируют длинные отростки, которые соединяют клетки друг с другом, образуя трехмерные сетеобразные клеточные структуры. Распластывание на микросферах лучше, чем в контроле.The same number of 3T3 BALB cells adhered to the substrate was observed in all experimental variants. The largest number of cells attaches to the microspheres after 4.5 hours (figa-b). The spreading of 3T3 BALB cells on substrates begins after 4.5 h and occurs better than in the case of HEK 293 cells. After 24 hours of incubation in the presence of blood serum, the cells are well flattened. Cells in the process of attachment to several microspheres located at optimal distances from each other form long processes that connect the cells to each other, forming three-dimensional network-like cellular structures. Flattening on microspheres is better than in control.
Пример 5.Example 5
В этой серии экспериментов оценивают морфологическое состояние клеток после длительного культивирования на топографически модифицированной микросферами, ковалентно связанными с суммарным гистоном, поверхности культуральных сосудов.In this series of experiments, the morphological state of the cells is assessed after prolonged cultivation on topographically modified microspheres covalently linked to the total histone on the surface of the culture vessels.
В этой серии экспериментов используют 6-луночные культуральные сосуды, топографически модифицированные микросферами из кристаллизованного декстрана диаметром не более 1,0 мкм, ковалентно связанными с суммарным гистоном. В опытах используют клеточную линию НЕК 293 почки эмбриона человека.In this series of experiments, 6-well culture vessels using topographically modified microspheres from crystallized dextran with a diameter of not more than 1.0 μm covalently linked to the total histone are used. In the experiments, the HEK 293 kidney cell line of a human embryo was used.
Культивирование клеток осуществляют, как описано в примере 4. Клетки культивируют как в среде с сывороткой, так и в бессывороточной среде.The cultivation of cells is carried out as described in example 4. Cells are cultured both in medium with serum, and in serum-free medium.
Для оценки состояния клеток НЕК 293 в течение 6 сут культивирования клетки фиксируют метанолом и окрашивают кристаллическим фиолетовым. Проводят анализ препаратов, полученных через 1 и 6 сут культивирования в среде с 10% эмбриональной бычьей сывороткой (вариант 1) и в бессывороточной среде с ростовыми добавками (вариант 2). После 1 сут культивирования наблюдают хорошее распластывание клеток на исследуемых субстратах и образование контактов между соседними клетками (фиг.9а-д). Между распластанными клетками наблюдают много свободных микросфер без клеток. Через 6 сут культивирования число распластанных клеток значительно увеличивается в обоих вариантах. Они растут в виде колоний, образуют большие кластеры и объединяются в плотный слой клеток, образуя сетеобразные клеточные структуры. На этой стадии культивирования наблюдается очень мало свободных микросфер. Рост культуры сопровождается образованием монослойности клеток в кластерах. Существенных различий между клетками, культивируемыми в среде с сывороткой и в бессывороточной среде, не наблюдают. На контрольных поверхностях клетки также образуют большие кластеры и сеть, однако единичных распластанных клеток наблюдается гораздо больше, чем в опытных вариантах.To assess the state of HEK 293 cells for 6 days of cultivation, the cells are fixed with methanol and stained with crystal violet. An analysis is made of the preparations obtained after 1 and 6 days of cultivation in a medium with 10% fetal bovine serum (option 1) and in a serum-free medium with growth additives (option 2). After 1 day of cultivation, good spreading of the cells on the test substrates and the formation of contacts between adjacent cells are observed (Fig. 9a-d). Between flattened cells, many free cell-free microspheres are observed. After 6 days of cultivation, the number of spread cells significantly increases in both variants. They grow in the form of colonies, form large clusters and combine into a dense layer of cells, forming network-like cell structures. At this stage of cultivation, very few free microspheres are observed. The growth of the culture is accompanied by the formation of monolayer cells in clusters. Significant differences between cells cultured in serum and serum-free medium are not observed. On the control surfaces, the cells also form large clusters and a network, however, there are much more single spread cells than in the experimental variants.
Пример 6.Example 6
В этой серии экспериментов оценивают скорости роста адгезивных клеток на топографически модифицированной микросферами, ковалентно связанными с гистонами, поверхности культуральных сосудов.In this series of experiments, the growth rates of adhesive cells on topographically modified microspheres covalently linked to histones on the surface of culture vessels are evaluated.
Для этого 6-луночные культуральные сосуды покрывают микросферами, ковалентно связанными с суммарным гистоном.For this, 6-well culture vessels are coated with microspheres covalently bound to the total histone.
Как показано в примере 4, на такой поверхности субстрата клетки хорошо прикрепляются и распластываются.As shown in example 4, on such a surface of the substrate, the cells attach well and spread out.
В этом исследовании используют две клеточные линии: постоянная линия клеток почки эмбриона человека (НЕК 293) и постоянная линия эмбриональных фибробластов мыши (3T3/BALB clone A31). В этой серии экспериментов культивирование клеток проводят как в среде, содержащей сыворотку, так и в среде, не содержащей сыворотку.Two cell lines are used in this study: the constant cell line of the kidney of a human embryo (HEK 293) and the constant line of mouse embryonic fibroblasts (3T3 / BALB clone A31). In this series of experiments, cell cultivation is carried out both in serum-containing medium and in serum-free medium.
Культивирование клеток обычно осуществляют в среде, содержащей сыворотку. Сыворотка содержит в своем составе различные компоненты, которые позволяют клеткам адгезировать и расти на поверхности субстрата. Однако необходимо отметить, что сыворотка содержит в своем составе смесь многочисленных субстанций с физиологической активностью, которые высвобождаются из клеток крови и эндотелиальных клеток сосудов. Поэтому анализ и использование продуктов культивируемых клеток в среде, содержащей сыворотку, требуют использования определенных методов их очистки. Поэтому создание бессывороточного способа культивирования адгезивных клеток человека и животных является необходимым.The cultivation of cells is usually carried out in a medium containing serum. Serum contains various components that allow cells to adhere and grow on the surface of the substrate. However, it should be noted that serum contains a mixture of numerous substances with physiological activity that are released from blood cells and vascular endothelial cells. Therefore, the analysis and use of the products of cultured cells in a medium containing serum require the use of certain methods for their purification. Therefore, the creation of a serum-free method for the cultivation of adhesive cells in humans and animals is necessary.
А. Постоянная линия клеток почки эмбриона человека (НЕК 293).A. Permanent human embryonic kidney cell line (HEK 293).
(а) Культивирование клеток в среде с сывороткой или в бессывороточной среде.(a) Culturing cells in serum or serum free medium.
Клетки высевают на поверхность культуральных сосудов, покрытую микросферами, ковалентно связанными с суммарным гистоном, и культивируют в среде с сывороткой или в бессывороточной среде с ростовыми добавками.Cells are seeded onto the surface of culture vessels coated with microspheres covalently bound to the total histone and cultured in serum-free or serum-free medium with growth additives.
Суспензию клеток (3×105 клеток на лунку диаметром 35 мм) высевают на указанные субстраты на 4 ч в бессывороточной среде ДМЕМ (среда ИГЛА в модификации Дальбекко). В течение этого времени большая часть клеток прикрепляется к субстрату. Затем бессывороточная среда заменяется либо средой с 10% эмбриональной бычьей сывороткой, либо бессывороточной средой с ростовыми добавками (трансферрин 10 мкг/мл, инсулин 25 мкг/мл, гидрокортизон 0,5 мкг/мл и ретиноидная кислота 0,1 мкг/мл).A cell suspension (3 × 10 5 cells per well with a diameter of 35 mm) is plated on these substrates for 4 hours in serum-free DMEM (IgLA medium modified by Dalbecco). During this time, most of the cells attach to the substrate. Then, the serum-free medium is replaced by either medium with 10% fetal bovine serum or serum-free medium with growth additives (
Клетки культивируют в этих средах в течение 6 сут при 37°С и 5% СО2. Индекс пролиферации клеток определяют через 1, 3 и 6 сут. Каждый вариант повторяют по 3 раза. Таким образом, индекс пролиферации определяют в следующих вариантах:Cells were cultured in these media for 6 days at 37 ° C and 5% CO 2 . The cell proliferation index is determined after 1, 3 and 6 days. Each option is repeated 3 times. Thus, the proliferation index is determined in the following options:
- культивирование клеток на поверхности субстрата в среде с 10% эмбриональной бычьей сывороткой (контроль);- culturing cells on the surface of the substrate in an environment with 10% fetal bovine serum (control);
- культивирование клеток на поверхности субстрата, покрытой микросферами, ковалентно связанными с суммарным гистоном в среде с 10% эмбриональной бычьей сывороткой;- culturing cells on the surface of a substrate coated with microspheres covalently bound to the total histone in an environment with 10% fetal bovine serum;
- культивирование клеток на поверхности субстрата, покрытой микросферами, ковалентно связанными с суммарным гистоном, в бессывороточной среде с ростовыми добавками.- culturing cells on the surface of a substrate coated with microspheres covalently bound to the total histone in a serum-free medium with growth additives.
Морфологический анализ клеток на разных стадиях культивирования в указанных условиях проводят при микроскопировании фиксированных и окрашенных кристаллическим фиолетовым препаратов. Полученные результаты свидетельствуют, что при культивировании в течение 6 сут клетки хорошо распластываются и пролиферируют как на поверхности, покрытой микросферами, ковалентно связанными с суммарными гистонами, так и на поверхности в контроле. Наиболее интенсивный рост наблюдается через 3-6 сут культивирования (фиг.10). На всех исследованных сроках число клеток на тестируемых субстратах ниже, чем на контрольном субстрате, но индекс пролиферации практически одинаков. Наблюдаемое меньшее количество клеток на опытных субстратах объясняется более сильным взаимодействием их с данным субстратом и в связи с этим недостаточной эффективностью действия, обычно применяемого для снятия клеток реагента (Трипсин/ЭДТА). Эти эксперименты показывают, что скорость роста клеток одинакова как в среде с 10% эмбриональной бычьей сывороткой, так и в бессывороточной среде с ростовыми добавками.Morphological analysis of cells at different stages of cultivation under these conditions is carried out by microscopy of fixed and stained with crystal violet preparations. The results obtained indicate that during cultivation for 6 days, the cells are well-flattened and proliferate both on the surface coated with microspheres covalently bound to the total histones, and on the surface in the control. The most intense growth is observed after 3-6 days of cultivation (figure 10). In all the studied periods, the number of cells on the tested substrates is lower than on the control substrate, but the proliferation index is almost the same. The observed smaller number of cells on the experimental substrates is explained by their stronger interaction with this substrate and, in connection with this, the insufficient effectiveness of the action usually used to remove reagent cells (Trypsin / EDTA). These experiments show that the cell growth rate is the same both in medium with 10% fetal bovine serum and in serum-free medium with growth additives.
(б) Культивирование в среде с сывороткой.(b) Cultivation in a medium with serum.
В этих экспериментах исследуют следующие типы субстратов:In these experiments, the following types of substrates are examined:
- культивирование клеток на поверхности субстрата (контроль);- culturing cells on the surface of the substrate (control);
- культивирование клеток на поверхности субстрата, покрытой микросферами, ковалентно связанными с суммарным гистоном;- culturing cells on the surface of a substrate coated with microspheres covalently linked to the total histone;
- культивирование клеток на поверхности субстрата, покрытой микросферами, ковалентно связанными с перекрестно сшитыми конъюгатами суммарного гистона.- culturing cells on the surface of a substrate coated with microspheres covalently linked to cross-linked conjugates of total histone.
Суспензию клеток (3,0×105 клеток на лунку диаметром 35 мм) высевают на указанные субстраты на 4 ч в бессывороточной среде ДМЕМ. Затем бессывороточная среда заменяется средой с 10% эмбриональной бычьей сывороткой. Клетки культивируют в этой среде в течение 11 сут при 37°С и 5% СО2. Индекс пролиферации определяют через 2, 4, 7, 11 суток после высева клеток на указанные поверхности. Каждый вариант повторяют по 3 раза. Прижизненный морфологический анализ клеток на разных стадиях культивирования в указанных условиях проводят под инвертированным микроскопом (ув. 10×10). Результаты анализа состояния клеток в течение 11 сут демонстрируют, что клетки распластываются как на микросферах, ковалентно связанных с суммарным гистоном, так и с перекрестно сшитыми конъюгатами суммарного гистона. Клетки пролиферируют с почти одинаковой скоростью в течение первых 7 сут культивирования (фиг.11). С 7 до 11 сут индекс пролиферации контрольных клеток не изменяется, то есть кривая роста выходит на плато, наступает стадия насыщения. Напротив, клетки на микросферах, ковалентно связанных с суммарным гистоном, только начинают входить в стадию насыщения. Наиболее интенсивный рост клеток от 4 до 11 сут наблюдается при культивировании их на микросферах, ковалентно связанных с перекрестно сшитыми конъюгатами суммарного гистона. Более длинная лаг-фаза в течение первых 4 суток связана с относительно низкой посевной концентрацией клеток и необходимостью кондиционирования субстрата белками внеклеточного матрикса. Эти эксперименты демонстрируют, что микросферы, ковалентно связанные с суммарным гистоном или с перекрестно сшитыми конъюгатами суммарного гистона, обеспечивают интенсивный рост клеток НЕК 293 в культуре.A cell suspension (3.0 × 10 5 cells per well with a diameter of 35 mm) is plated on these substrates for 4 hours in serum-free DMEM. The serum-free medium is then replaced with 10% fetal bovine serum. Cells were cultured in this medium for 11 days at 37 ° C and 5% CO 2 . The proliferation index is determined after 2, 4, 7, 11 days after seeding of cells on these surfaces. Each option is repeated 3 times. Intravital morphological analysis of cells at different stages of cultivation under the indicated conditions is carried out under an inverted microscope (UV. 10 × 10). The results of the analysis of the state of the cells for 11 days demonstrate that the cells are flattened both on microspheres covalently linked to the total histone and to cross-linked conjugates of the total histone. Cells proliferate at almost the same rate during the first 7 days of cultivation (Fig. 11). From 7 to 11 days, the proliferation index of control cells does not change, that is, the growth curve reaches a plateau, the stage of saturation begins. In contrast, cells on microspheres covalently linked to the total histone are just beginning to enter the saturation stage. The most intensive cell growth from 4 to 11 days is observed when they are cultured on microspheres covalently linked to cross-linked conjugates of total histone. The longer lag phase during the first 4 days is associated with a relatively low inoculum concentration of cells and the need for conditioning the substrate with extracellular matrix proteins. These experiments demonstrate that microspheres covalently bonded to total histone or to cross-linked total histone conjugates provide for intensive growth of HEK 293 cells in culture.
Б. Постоянная линия эмбриональных фибробластов мыши (3T3/BALB clone A31).B. Permanent line of mouse embryonic fibroblasts (3T3 / BALB clone A31).
В этих экспериментах исследуют пролиферацию клеток при их культивировании на субстратах, покрытых микросферами, ковалентно связанными с суммарным гистоном или с перекрестно сшитыми конъюгатами суммарного гистона.In these experiments, cell proliferation is studied when they are cultured on substrates coated with microspheres covalently bound to total histone or to cross-linked total histone conjugates.
Суспензию клеток (3×105 клеток на лунку диаметром 35 мм) высевают на указанные субстраты на 4 ч в бессывороточной среде ДМЕМ. В течение этого времени большая часть клеток прикрепляется к субстрату. Затем бессывороточную среду заменяют средой с 10% эмбриональной бычьей сывороткой. Количество клеток оценивают на 2 и 3 сут культивирования. В течение этого времени наблюдается очень интенсивная пролиферация, и через 3 сут образуется полный монослой клеток. Рост клеток на микросферах, ковалентно связанных с суммарным гистоном, интенсивнее (индекс пролиферации через двое суток - 5), чем на микросферах, ковалентно связанных с перекрестно сшитыми конъюгатами суммарного гистона (индекс пролиферации через 2 сут - 3). Окончательное количество клеток через 3 суток было в 7 раз выше первоначально посеянного.A cell suspension (3 × 10 5 cells per well with a diameter of 35 mm) is plated on these substrates for 4 hours in serum-free DMEM. During this time, most of the cells attach to the substrate. Then serum-free medium is replaced with medium with 10% fetal bovine serum. The number of cells is estimated at 2 and 3 days of cultivation. During this time, very intensive proliferation is observed, and after 3 days a complete monolayer of cells is formed. Cell growth on microspheres covalently linked to total histone is more intense (proliferation index after two days — 5) than on microspheres covalently linked to cross-linked total histone conjugates (proliferation index after 3 days — 3). The final number of cells after 3 days was 7 times higher than the originally seeded.
Данное изобретение может быть использовано при создании заменителей ткани для имплантации и при сокультивировании клеток для целей тканевой инженерии, а также в качестве моделей in vitro для масштабного скрининга лекарственных средств и биологически активных веществ.This invention can be used to create tissue substitutes for implantation and in the co-cultivation of cells for tissue engineering, as well as in vitro models for large-scale screening of drugs and biologically active substances.
Список используемой литературы.Bibliography.
1. Nakanishi J, Takarada T, Yamaguchi К., Maeda M. 2008. Recent advances in cell micropatterning techniques for bioanalytical and biomedical sciences. Anal Sci. 24:67-72.1. Nakanishi J, Takarada T, Yamaguchi K., Maeda M. 2008. Recent advances in cell micropatterning techniques for bioanalytical and biomedical sciences. Anal Sci. 24: 67-72.
2. Khademhosseini A, Suh KY, Yang JM, Eng G, Yeh J, Levenberg S, Langer R. 2004. Layer-by-layer deposition of hyaluronic acid and poly-L-lysine for patterned cell co-cultures. Biomaterials. 25: 3583-92.2. Khademhosseini A, Suh KY, Yang JM, Eng G, Yeh J, Levenberg S, Langer R. 2004. Layer-by-layer deposition of hyaluronic acid and poly-L-lysine for patterned cell co-cultures. Biomaterials. 25: 3583-92.
3. К.Y.Suh, J.Seong, A.Khademhosseini, P.E.Laibinis and R.Langer. 2004. A simple soft lithographic route to fabrication of poly(ethylene glycol) microstroctures for protein and cell patterning. Biomaterials. 25: 557-563.3. K. Y. Suh, J. Seong, A. Khademhosseini, P. E. Laibinis and R. Langer. 2004. A simple soft lithographic route to fabrication of poly (ethylene glycol) microstroctures for protein and cell patterning. Biomaterials. 25: 557-563.
4. Chen CS, Mrksich M, Huang S, Whitesides GM, Ingber DE. 1997. Geometric control of cell life and death. Science. 276(5317): 1425-8.4. Chen CS, Mrksich M, Huang S, Whitesides GM, Ingber DE. 1997. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317): 1425-8.
5. Katsuen S., Ohshima К, Kawamura S, Yamamoto R., Nishino T. 1997. Coating composition for culturing animal cells and method for culturing of the cells in serum-free condition. U.S. Patent 5,643,561.5. Katsuen S., Ohshima K, Kawamura S, Yamamoto R., Nishino T. 1997. Coating composition for culturing animal cells and method for culturing of the cells in serum-free condition. U.S. Patent 5,643,561.
6. Clapper DL, Hu WS, 1996. Cell culture support containing a cell adhesion factor and a positively-charged molecule. U.S. Patent 5, 512,474.6. Clapper DL, Hu WS, 1996. Cell culture support containing a cell adhesion factor and a positively-charged molecule.
7. Cima LG, Merrill EW, Kuhl PR. 2000. Cell growth substrates with tethered cell growth effector molecules. U.S. Patent 6,045, 818.7. Cima LG, Merrill EW, Kuhl PR. 2000. Cell growth substrates with tethered cell growth effector molecules. U.S. Patent 6.045, 818.
8. Swiderek MS, Mannuzza FJ, Ilsley SR, Myles A. 1999. Preparation of a cell culture substrate coated with poly-D-lysine. U.S. Patent 5,932,473.8. Swiderek MS, Mannuzza FJ, Ilsley SR, Myles A. 1999. Preparation of a cell culture substrate coated with poly-D-lysine. U.S. Patent 5,932,473.
9. McKeehan WL, Ham RG. 1976. Stimulation of clonal growth of normal fibroblasts with substrata coated with basic polymers. J Cell Biol. 71(3):727-734 (прототип).9. McKeehan WL, Ham RG. 1976. Stimulation of clonal growth of normal fibroblasts with substrata coated with basic polymers. J Cell Biol. 71 (3): 727-734 (prototype).
10. Горюхина О.А., Миглиниец М.П., Криева М.А. 1981. Способ получения суммарного гистона из животного сырья. Патент на изобретение №843915. Российская Федерация.10. Goryukhina O.A., Miglinets M.P., Krieva M.A. 1981. A method of obtaining total histone from animal raw materials. Patent for invention No. 843915. The Russian Federation.
11. Горюхина О.А., Мюльберг А.А., Криева М.А., Тишкина Т.Е. 1989. Способ очистки препарата гистона Н4 из ткани тимуса телят.Патент на изобретение №1319352. Российская Федерация.11. Goryukhina O.A., Mulberg A.A., Krieva M.A., Tishkina T.E. 1989. A method for purifying a histone H4 preparation from calf thymus tissue. Patent for invention No. 1319352. The Russian Federation.
12. Thomas JO, Kornberg RD. 1975. An octamer of histones in chromatin and free in solution. Proc Natl Acad Sci USA. 72(7):2626-2630.12. Thomas JO, Kornberg RD. 1975. An octamer of histones in chromatin and free in solution. Proc Natl Acad Sci USA. 72 (7): 2626-2630.
13. Горюхина О.А. 2001. Комплекс природных катионных белков и способ его получения. Патент на изобретение №2176517. Российская Федерация.13. Goryukhina O.A. 2001. A complex of natural cationic proteins and a method for its preparation. Patent for invention No. 2176517. The Russian Federation.
14. Bardouille С, Lehmann J, Heimann P, Jockusch H. 2001. Growth and differentiation of permanent and secondary mouse myogenic cell lines on microcarriers. Appi Microbiol Biotechnol. 55: 556-62.14. Bardouille C, Lehmann J, Heimann P, Jockusch H. 2001. Growth and differentiation of permanent and secondary mouse myogenic cell lines on microcarriers. Appi Microbiol Biotechnol. 55: 556-62.
15. Bulter M. 1987. Growth limitations in microcarder cultures. Adv.Biochem.Eng.Biotech. 4:57-84.15. Bulter M. 1987. Growth limitations in microcarder cultures. Adv. Biochem.Eng. Biotech. 4: 57-84.
16. Schröder U. 1985. Crystallized carbohydrate spheres for slow release and targeting. Methods Enzymol. 112:116-128.16. Schröder U. 1985. Crystallized carbohydrate spheres for slow release and targeting. Methods Enzymol. 112: 116-128.
17. Lundblad R.L. 1995. Techniques in protein modification. CRC Press.17. Lundblad R.L. 1995. Techniques in protein modification. CRC Press.
18. Добрецов Г.Е., Горюхина О.А., Борщевская Т.А. 1969. Состояние полярных групп и агрегация гистонов в водных растворах. Биохимия. 34:806-809.18. Dobretsov G.E., Goryukhina O.A., Borschevskaya T.A. 1969. State of polar groups and aggregation of histones in aqueous solutions. Biochemistry. 34: 806-809.
Приложениеapplication
К описанию заявки на изобретение «Способ получения тканеподобных структур из клеток животного происхождения для использования их при создании заменителей ткани» (заявитель Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный университет)The description of the application for the invention “A method for producing tissue-like structures from cells of animal origin for use in the creation of tissue substitutes” (applicant Federal State Educational Institution of Higher Professional Education St. Petersburg State University)
Известно, что гистоны - это катионные (основные) белки, которые содержатся в клеточных ядрах всех тканей животных и растений. В клеточном ядре гистоны в значительной степени ответственны за компактизацию ДНК. Гистоны легко образуют комплексы с негистоновыми белками ядра и цитоплазмы, а также между собой.It is known that histones are cationic (basic) proteins that are found in the cell nuclei of all tissues of animals and plants. In the cell nucleus, histones are largely responsible for DNA compaction. Histones easily form complexes with non-histone proteins of the nucleus and cytoplasm, as well as between themselves.
Всего известно пять классов гистонов, которые различаются между собой по содержанию в их молекуле основных аминокислот - лизина и аргинина (H1, H2A, Н2В, Н3 и Н4). Гистоны гетерогенны и по молекулярному весу. Наибольшую молекулярную массу имеет гистон H1 - 21500 Да, следующие по величине гистоны Н3, H2A, Н2В, Н4 - 15320, 14000, 13774, 11280 Да соответственно (1).In total, five classes of histones are known, which differ in the content in their molecule of the main amino acids - lysine and arginine (H1, H2A, H2B, H3 and H4). Histones are heterogeneous in molecular weight. The largest molecular weight is histone H1 - 21500 Da, the next largest histones are Н3, H2A, Н2В, Н4 - 15320, 14000, 13774, 11280 Da, respectively (1).
Общей характерной чертой эукариотических клеток является поступление определенного белка в специфический компартмент клетки. Однако имеются наблюдения, что некоторые белки встречаются также в иных компартментах клетки и могут выходить во внеклеточное пространство помимо их традиционных мест локализации, т.е. встречаются многокомпартментные изоформы белков (2-3).A common characteristic of eukaryotic cells is the entry of a particular protein into a specific cell compartment. However, there are observations that some proteins are also found in other cell compartments and can enter the extracellular space in addition to their traditional localization sites, i.e. multicompartmental isoforms of proteins are found (2-3).
Одним из примеров многокомпартментной локализации белков является наличие ядерных белков, таких как гистоновые и негистоновые хромосомальные белки с высокой электрофоретической подвижностью HMG (high mobility group) во внеклеточном пространстве (4-7). Благодаря возможности выхода гистонов в межклеточную среду они могут проявлять биологическую активность, вызывая различные биохимические и функциональные изменения в клетках.One example of multi-compartment protein localization is the presence of nuclear proteins, such as histone and nonhistone chromosomal proteins with high electrophoretic mobility HMG (high mobility group) in the extracellular space (4-7). Due to the possibility of histones entering the intercellular medium, they can exhibit biological activity, causing various biochemical and functional changes in the cells.
Экзогенные гистоны известны как антимикробные и антивирусные агенты (8, 9).Exogenous histones are known as antimicrobial and antiviral agents (8, 9).
Кроме того, экзогенные гистоны известны как биоактивные агенты, которые за счет их высокого положительного заряда способны увеличивать проницаемость биологических мембран и проникать через них (10-13).In addition, exogenous histones are known as bioactive agents, which due to their high positive charge are able to increase the permeability of biological membranes and penetrate through them (10-13).
Поэтому экзогенные гистоны привлекают внимание в плане практической реализации полезных свойств гистонов в биотехнологии, в частности, по двум направлениям:Therefore, exogenous histones attract attention in terms of the practical implementation of the beneficial properties of histones in biotechnology, in particular, in two directions:
- с точки зрения реализации полезных свойств гистонов в биомедицине [так, например, в патенте RU №2045278 описано потенцирующее влияние суммарного гистона на противотуберкулезное действие изониазида при лечении экспериментального туберкулеза животных (14); в патентах US 6,884,423; US 4,818,763 и US 5,182,257 описано использование гистона H1 и димеров гистонов Н2А:Н2В в терапевтических целях (9, 15, 16)];- from the point of view of the realization of the beneficial properties of histones in biomedicine [for example, in patent RU No. 2045278, the potentiating effect of total histone on the anti-tuberculosis effect of isoniazid in the treatment of experimental animal tuberculosis is described (14); in US patents 6,884,423; US 4,818,763 and US 5,182,257 describe the use of histone H1 and histone dimers H2A: H2B for therapeutic purposes (9, 15, 16)];
- с точки зрения использования природных полимеров, содержащих в своем составе большое количество основных групп в технологии культивирования и клонирования клеток, представляется особенно перспективным с точки зрения его широкой практической реализации.- from the point of view of using natural polymers containing a large number of major groups in the technology of culturing and cloning cells, it seems especially promising from the point of view of its wide practical implementation.
Культура тканей - метод или процесс размножения и/или поддержания метаболизма тканей или отдельных клеток, полученных из организма в искусственной питательной среде. Для пролиферации большинства типов нетрансформированных клеток необходимо их предварительное прикрепление к поверхности твердого субстрата.Tissue culture - a method or process of propagation and / or maintenance of the metabolism of tissues or individual cells obtained from the body in an artificial nutrient medium. For the proliferation of most types of non-transformed cells, their preliminary attachment to the surface of a solid substrate is necessary.
Природа субстрата определяется в основном типом используемых клеток и характером проводимых исследований. Почти повсеместное распространение получил в настоящее время полистирол, специально обработанный так, чтобы увеличить смачиваемость и придать поверхности отрицательный заряд. В особых случаях (культура нейронов, мышечные клетки, некоторые эпителиальные культуры) пластиковая поверхность предварительно покрывается желатином, коллагеном или полилизином для придания ей положительного заряда. Клетки большинства культур, включая первичные, прикрепившись к стеклу или пластиковому субстрату, размножаются до образования монослоя.The nature of the substrate is determined mainly by the type of cells used and the nature of the studies. Polystyrene, specially treated so as to increase wettability and impart a negative charge to the surface, is now almost ubiquitous. In special cases (neuron culture, muscle cells, some epithelial cultures), the plastic surface is pre-coated with gelatin, collagen or polylysine to give it a positive charge. Cells of most cultures, including primary ones, attached to glass or a plastic substrate, multiply to form a monolayer.
Адгезия клеток к поверхности субстрата - многоступенчатый процесс. Взаимодействие зависимых от прикрепления клеток с адгезивной поверхностью включает стадии, которые предшествуют пролиферации: контакт клетки с субстратом, прикрепление клеток к субстрату, образование адгезивных контактов и распластывание клеток.Cell adhesion to the surface of the substrate is a multi-step process. The interaction of attachment-dependent cells with an adhesive surface includes the steps that precede proliferation: contact of the cell with the substrate, attachment of the cells to the substrate, the formation of adhesive contacts and the spreading of the cells.
При культивировании клеток взаимодействие между клетками и субстратом опосредуется белками, которые либо были преиммобилизованы на материале поверхности, либо адсорбированы из культуральной среды или секретированы самими клетками в процессе культивирования.When culturing cells, the interaction between cells and the substrate is mediated by proteins that were either pre-mobilized on the surface material or adsorbed from the culture medium or secreted by the cells themselves during the cultivation process.
Белки внеклеточного матрикса неспецифически адсорбируются на поверхности субстрата, и клетки взаимодействуют с материалом поверхности не прямо, а за счет взаимодействия с адсорбированными белками внеклеточного матрикса, такими как фибронектин, ламинин и коллаген (17).The extracellular matrix proteins are non-specifically adsorbed on the surface of the substrate, and the cells interact with the surface material not directly, but due to the interaction with the adsorbed extracellular matrix proteins, such as fibronectin, laminin and collagen (17).
Приспособление клеток к субстрату проявляется в формировании прочных адгезивных контактов (от 1,0 мкм2 и выше), где происходит молекулярное взаимодействие между адгезионными рецепторами и их белками внеклеточного матрикса (лигандами) с образованием фокальных контактов (18, 19).Adaptation of cells to the substrate is manifested in the formation of strong adhesive contacts (from 1.0 μm 2 and above), where molecular interaction occurs between the adhesive receptors and their extracellular matrix proteins (ligands) with the formation of focal contacts (18, 19).
Контроль клеточной адгезии определяется специфическим взаимодействием между рецепторами клеточной поверхности и их лигандами.Cell adhesion control is determined by the specific interaction between cell surface receptors and their ligands.
Взаимодействие между клеткой и внеклеточным матриксом опосредуется поверхностными рецепторами и протеогликанами, которые взаимодействуют с белками внеклеточного матрикса, такими как коллаген, фибронектин, витронектин и ламинин. Эти белки имеют специфические связывающие домены для соответствующих рецепторов (20, 21).The interaction between the cell and the extracellular matrix is mediated by surface receptors and proteoglycans, which interact with extracellular matrix proteins such as collagen, fibronectin, vitronectin and laminin. These proteins have specific binding domains for the corresponding receptors (20, 21).
Например, у фибронектина имеется домен, который содержит специфическую последовательность из трех аминокислотных остатков (Arg-Gly-Asp) триплет RGD, где R - агинин, G - глицин, D - аспарагиновая кислота, которые узнают интегрины (22-24).For example, fibronectin has a domain that contains a specific sequence of three amino acid residues (Arg-Gly-Asp) of the RGD triplet, where R is arginine, G is glycine, D is aspartic acid, which integrins recognize (22-24).
Другой класс доменов в белках адгезивных для клеток известен как гепарин-связывающий домен (термин получил свое название в силу того, что хроматография, основанная на сродстве к гепарину, используется для очистки белков). Эти домены связываются с протеогликанами клеточной поверхности, содержащими сульфированные гликозаминогликаны, такие как хондроитинсульфат и гепарансульфат (20).Another class of domains in cell-adhesion proteins is known as the heparin binding domain (the term got its name because chromatography based on heparin affinity is used to purify proteins). These domains bind to cell surface proteoglycans containing sulfonated glycosaminoglycans, such as chondroitin sulfate and heparan sulfate (20).
Пептидная последовательность в гепарин-связывающих белках, которая связывается с протеогликанами клеточной поверхности, обогащена катионными остатками основных аминокислот, такими как аргинин, лизин, также содержит гидрофобные аминокислотные остатки: аланин, изолейцин, лейцин, пролин и валин (25-27).The peptide sequence in heparin-binding proteins, which binds to proteoglycans of the cell surface, is enriched in cationic residues of basic amino acids, such as arginine, lysine, also contains hydrophobic amino acid residues: alanine, isoleucine, leucine, proline and valine (25-27).
Белки, содержащие в своем составе гепарин-связывающие домены, также используются для покрытия поверхности субстрата.Proteins containing heparin binding domains are also used to coat the surface of the substrate.
Известно, что гистоны наряду с кластерами катионных аминокислот (поликатионные домены) содержат в своем составе гепарин-связывающие домены (27).It is known that histones along with clusters of cationic amino acids (polycationic domains) contain heparin-binding domains (27).
Клеточная адгезия контролируется не только биохимическими сигналами, как описано выше. На прикрепление клеток к субстрату оказывают влияние и неспецифические факторы. К ним относятся такие факторы, как топография поверхности субстрата (19).Cell adhesion is controlled not only by biochemical signals, as described above. Nonspecific factors also influence the attachment of cells to the substrate. These include factors such as substrate surface topography (19).
Такие субстраты аналогичны трехмерным матрицам, которые более широко известны в литературе как скаффолды (28, 29). Такие матрицы используют в качестве субстратов для тканевой инженерии с целью образования сложных композиций клеток для формирования тканеподобных структур. Клетки прикрепляются, пролиферируют и дифференцируются на таких трехмерных матрицах.Such substrates are similar to three-dimensional matrices, which are more commonly known in the literature as scaffolds (28, 29). Such matrices are used as substrates for tissue engineering in order to form complex compositions of cells to form tissue-like structures. Cells attach, proliferate and differentiate on such three-dimensional matrices.
Одним из вариантов получения биосовместимых нетоксичных для клеток носителей является приготовление микросфер на основе кристаллизованного декстрана (30). За счет кристаллической структуры такие микросферы диаметром не более 1,0 мкм имеют очень маленькие поры и не подвержены сжатию. На фиг.1-3 представлены микросферы из кристаллизованного декстрана по данным электронной микроскопии, получают которые по способу Шредера (30). Для иммобилизации гистонов на поверхности микросфер проводят реакцию ковалентного связывания (примеры 1, 2).One of the options for producing biocompatible nontoxic carriers for cells is the preparation of microspheres based on crystallized dextran (30). Due to the crystal structure, such microspheres with a diameter of not more than 1.0 μm have very small pores and are not subject to compression. Figure 1-3 shows the microspheres of crystallized dextran according to electron microscopy, which are obtained by the Schröder method (30). To immobilize histones on the surface of the microspheres, a covalent binding reaction is carried out (examples 1, 2).
Полученные микросферы используют для топографической модификации субстрата (пример 1). Расчет необходимого количества микросфер для покрытия поверхности субстрата поясняется в примере 1. Распределение микросфер на поверхности субстрата принимают за оптимальное в том случае, если максимальное расстояние между микросферами не превышает размер распластанной клетки. Результаты проведенных сравнительных исследований в отношении способности клеток прикрепляться и распластываться на субстратах, покрытых разными типами гистоновых белков, приведены в примере 3. На фиг.4-6 представлен анализ изменения структуры актинового цитоскелета и формы клеток, распластанных на субстратах, покрытых гистонами разных типов. На фиг.4 демонстрируется организация актинового цитоскелета постоянной линии клеток почки эмбриона человека (НЕК 293), распластанных на субстратах, покрытых разными типами гистоновых белков (×100), где а - суммарный гистон; б - перекрестно сшитые конъюгаты суммарного гистона; в - коровые гистоны; г - гистон Н2В; д - гистон H1; е - гистон Н2А; ж - гистон Н3. На фиг.5 показана организация актинового цитоскелета постоянной линии клеток почки эмбриона человека (НЕК 293), распластанных на субстратах, покрытых разными типами гистоновых белков в присутствии циклогексимида, где а - суммарный гистон; б - перекрестно сшитые конъюгаты суммарного гистона; в - коровые гистоны; г - гистон Н2В; д - гистон H1. Организация актинового цитоскелета постоянной линии клеток эмбриональных фибробластов мыши (3T3/BALB clone A31), распластанных на субстратах, покрытых разными типами гистоновых белков, изображена на фиг.6, где а - суммарный гистон; б - перекрестно сшитые конъюгаты суммарного гистона; в - коровые гистоны; г - гистон H1.The obtained microspheres are used for topographic modification of the substrate (example 1). The calculation of the required number of microspheres to cover the surface of the substrate is illustrated in Example 1. The distribution of microspheres on the surface of the substrate is taken as optimal if the maximum distance between the microspheres does not exceed the size of the spread cell. The results of the comparative studies with respect to the ability of cells to adhere and spread on substrates coated with different types of histone proteins are shown in Example 3. Figure 4-6 presents an analysis of the changes in the structure of the actin cytoskeleton and the shape of cells spread on substrates coated with different types of histones. Figure 4 shows the organization of the actin cytoskeleton of a constant line of human embryonic kidney cells (HEK 293), spread on substrates coated with different types of histone proteins (× 100), where a is the total histone; b - cross-linked conjugates of total histone; c - core histones; g - histone H2B; d - histone H1; e - histone H2A; f - histone H3. Figure 5 shows the organization of the actin cytoskeleton of a constant line of human embryonic kidney cells (HEK 293), spread on substrates coated with different types of histone proteins in the presence of cycloheximide, where a is the total histone; b - cross-linked conjugates of total histone; c - core histones; g - histone H2B; d - histone H1. The organization of the actin cytoskeleton of a constant cell line of mouse embryonic fibroblasts (3T3 / BALB clone A31), spread on substrates coated with different types of histone proteins, is shown in Fig.6, where a is the total histone; b - cross-linked conjugates of total histone; c - core histones; g - histone H1.
Показано, что гистон Н2В, суммарный гистон, коровые гистоны, перекрестно сшитые конъюгаты суммарного гистона и перекрестно сшитые конъюгаты коровых гистонов являются лучшими субстратами для культивирования клеток.It was shown that histone H2B, total histone, core histones, cross-linked total histone conjugates and cross-linked core histone conjugates are the best substrates for cell cultivation.
Топографически модифицированную микросферами, ковалентно связанными с суммарным гистоном, поверхность субстрата используют для анализа процессов прикрепления, распластывания и скорости роста адгезивных клеток животного происхождения. В качестве субстрата используют поверхность 6-луночных культуральных сосудов фирмы Corning Costar. Клетки животного происхождения культивируют на такой топографически модифицированной однородным слоем микросфер, ковалентно связанных с суммарным гистоном, поверхности в среде с сыворотокой или в бессывороточной среде с ростовыми добавками. На топографически модифицированную однородным слоем микросфер, ковалентно связанных с суммарным гистоном, поверхность субстрата наносят клетки с плотностью от 3×104 до 5×104 на 1,0 см2.Topographically modified with microspheres covalently linked to the total histone, the surface of the substrate is used to analyze the processes of attachment, spreading, and growth rate of adhesive cells of animal origin. The surface of the 6-well culture vessels of Corning Costar was used as a substrate. Cells of animal origin are cultured on such a topographically modified homogeneous layer of microspheres covalently linked to the total histone surface in a medium with serum or in serum-free medium with growth additives. Cells with a density of 3 × 10 4 to 5 × 10 4 per 1.0 cm 2 are applied onto a topographically modified homogeneous layer of microspheres covalently bound to the total histone.
Результаты проведенных сравнительных исследований по характеристике субстратов, покрытых микросферами, ковалентно связанных с суммарным гистоном, коровыми гистонами и их перекрестно сшитыми ковалентными конъюгатами, в отношении их эффективности для прикрепления и распластывания клеток в присутствии сыворотки или в бессывороточной среде с ростовыми добавками приведены в примерах 4 и 5. На фиг.7 показано прикрепление и распластывание постоянной линии клеток почки эмбриона человека (НЕК 293) на субстрате, покрытом микросферами, ковалентно связанными с различными комбинациями гистоновых белков. Где:The results of comparative studies on the characteristics of substrates coated with microspheres covalently linked to the total histone, core histones and their cross-linked covalent conjugates, with respect to their effectiveness for attaching and spreading cells in the presence of serum or in serum-free medium with growth additives, are shown in examples 4 and 5. Figure 7 shows the attachment and spreading of a constant cell line of the kidney of a human embryo (HEK 293) on a substrate coated with microspheres, covalent associated with various combinations of histone proteins. Where:
(7а) Субстрат покрыт микросферами, ковалентно связанными с суммарным гистоном. На фигуре виден однородный монослой микросфер (маленькие темные точки). Клетки хорошо распластаны, но без длинных отростков. Клетки находятся в контакте между собой и объединены в плотный слой клеток.(7a) The substrate is coated with microspheres covalently linked to the total histone. The figure shows a homogeneous monolayer of microspheres (small dark dots). Cells are well spread, but without long processes. Cells are in contact with each other and combined into a dense layer of cells.
(7б) Субстрат покрыт микросферами, ковалентно связанными с перекрестно сшитыми конъюгатами суммарного гистона. На фигуре можно видеть однородный слой микросфер, расположенных на оптимальных расстояниях друг от друга. Клетки формируют длинные отростки и объединены в хорошо развитую сеть.(7b) The substrate is coated with microspheres covalently linked to cross-linked total histone conjugates. In the figure, you can see a homogeneous layer of microspheres located at optimal distances from each other. Cells form long processes and are combined into a well-developed network.
(7в) Субстрат покрыт микросферами, ковалентно связанными с коровыми гистонами. На фигуре виден однородный монослой микросфер. Клетки хорошо распластаны, но без длинных отростков. Клетки находятся в контакте между собой и объединены в плотный слой клеток.(7c) The substrate is coated with microspheres covalently bound to core histones. The figure shows a homogeneous monolayer of microspheres. Cells are well spread, but without long processes. Cells are in contact with each other and combined into a dense layer of cells.
(7г) Субстрат покрыт микросферами, ковалентно связанными с перекрестно сшитыми конъюгатами коровых гистонов. На фигуре можно видеть однородный слой микросфер, расположенных на оптимальных расстояниях друг от друга. Клетки формируют длинные отростки и объединены в хорошо развитую сеть.(7g) The substrate is coated with microspheres covalently linked to cross-linked conjugates of core histones. In the figure, you can see a homogeneous layer of microspheres located at optimal distances from each other. Cells form long processes and are combined into a well-developed network.
На фиг.8 показано прикрепление и распластывание постоянной линии эмбриональных фибробластов мыши (3T3/BALB clone A31) на субстрате, покрытом микросферами, ковалентно связанными с различными типами гистоновых белков. Где:Fig. 8 shows the attachment and spreading of a constant line of mouse embryonic fibroblasts (3T3 / BALB clone A31) on a substrate coated with microspheres covalently bound to various types of histone proteins. Where:
(8а) Субстрат покрыт микросферами, ковалентно связанными с коровыми гистонами. На фигуре виден однородный монослой микросфер (маленькие темные точки). Клетки хорошо распластаны, но без длинных отростков. Клетки находятся в контакте между собой и объединены в плотный слой клеток.(8a) The substrate is coated with microspheres covalently bound to core histones. The figure shows a homogeneous monolayer of microspheres (small dark dots). Cells are well spread, but without long processes. Cells are in contact with each other and combined into a dense layer of cells.
(8б) Субстрат покрыт микросферами, ковалентно связанными с перекрестно сшитыми конъюгатами суммарного гистона. На фигуре можно видеть однородный слой микросфер, расположенных на оптимальных расстояниях друг от друга. Клетки формируют длинные отростки и объединены в хорошо развитую сеть.(8b) The substrate is coated with microspheres covalently linked to cross-linked total histone conjugates. In the figure, you can see a homogeneous layer of microspheres located at optimal distances from each other. Cells form long processes and are combined into a well-developed network.
(8в) Субстрат покрыт микросферами, ковалентно связанными с суммарным гистоном. На фигуре виден однородный монослой микросфер. Клетки хорошо распластаны, но без длинных отростков. Клетки находятся в контакте между собой и объединены в плотный слой клеток.(8c) The substrate is coated with microspheres covalently bound to the total histone. The figure shows a homogeneous monolayer of microspheres. Cells are well spread, but without long processes. Cells are in contact with each other and combined into a dense layer of cells.
Морфологический анализ окрашенных распластанных клеток с помощью инвертированного микроскопа показывает, что характер распластывания клеток на поверхности субстрата, покрытой микросферами из кристаллизованного декстрана диаметром не более 1,0 мкм, ковалентно связанных с гистонами, отличается от распластывания клеток на контрольной поверхности субстрата и имеет свои особенности.Morphological analysis of stained spread out cells using an inverted microscope shows that the pattern of spreading of cells on the surface of a substrate coated with crystallized dextran microspheres with a diameter of not more than 1.0 μm covalently associated with histones differs from spreading of cells on a control surface of the substrate and has its own characteristics.
На однородном слое микросфер, где микросферы расположены на оптимальном расстоянии друг от друга, клетки в процессе прикрепления к нескольким микросферам подвергаются функциональному растяжению с формированием длинных отростков, которые соединяют клетки друг с другом, формируя трехмерные сетеобразные клеточные структуры.On a homogeneous layer of microspheres, where the microspheres are located at an optimal distance from each other, the cells during attachment to several microspheres undergo functional stretching with the formation of long processes that connect the cells to each other, forming three-dimensional network-like cellular structures.
На монослое микросфер клетки в процессе прикрепления взаимодействуют с большим количеством микросфер и хорошо распластываются, но без формирования длинных отростков. Клетки контактируют между собой и объединяются в плотные слои, образуя сетеобразные клеточные структуры.On a monolayer of microspheres, cells in the process of attachment interact with a large number of microspheres and are well flattened, but without the formation of long processes. Cells are in contact with each other and are combined into dense layers, forming network-like cellular structures.
На контрольной поверхности субстрата клетки в процессе распластывания также образуют большие кластеры и сеть, однако единичных распластанных клеток наблюдается гораздо больше.On the control surface of the substrate, the cells also form large clusters and a network during spreading, but there are much more single spread cells.
В другой серии экспериментов оценивают морфологическое состояние клеток НЕК 293 после длительного культивирования на топографически модифицированной микросферами, ковалентно связанными с суммарным гистоном, поверхности культуральных сосудов. Результаты этих экспериментов приведены в примере 5. На фиг.9 показано состояние постоянной линии клеток почки эмбриона человека (НЕК 293) в процессе длительного культивирования на субстрате, покрытом микросферами, ковалентно связанными с суммарным гистоном. Где:In another series of experiments, the morphological state of HEK 293 cells is evaluated after long-term cultivation on topographically modified microspheres covalently linked to the total histone on the surface of the culture vessels. The results of these experiments are shown in Example 5. FIG. 9 shows the state of a constant line of human embryonic kidney cells (HEK 293) during prolonged cultivation on a substrate coated with microspheres covalently linked to the total histone. Where:
(9а) Клетки после 1-го дня культивирования в среде, содержащей 10% эмбриональную сыворотку телят. На фигуре виден однородный монослой микросфер. Клетки хорошо распластаны и находятся в контакте между собой. Между распластанными клетками наблюдается много свободных микросфер.(9a) Cells after the 1st day of cultivation in a medium containing 10% fetal calf serum. The figure shows a homogeneous monolayer of microspheres. Cells are well spread and in contact with each other. Between the spread cells there are many free microspheres.
(9б) Клетки после 1-го дня культивирования в бессывороточной среде с ростовыми добавками. Клетки хорошо распластаны и находятся в контакте между собой. Между распластанными клетками наблюдается много свободных микросфер.(9b) Cells after the 1st day of cultivation in serum-free medium with growth additives. Cells are well spread and in contact with each other. Between the spread cells there are many free microspheres.
(9в) Клетки после 6-го дня культивирования в среде, содержащей 10% эмбриональную сыворотку телят. На фигуре видно, что число распластанных клеток значительно увеличилось. Клетки растут в виде колоний с образованием кластеров и объединены в хорошо развитую сеть. Свободных микросфер не наблюдается.(9c) Cells after the 6th day of cultivation in a medium containing 10% fetal calf serum. The figure shows that the number of spread cells has increased significantly. Cells grow in the form of colonies with the formation of clusters and are combined into a well-developed network. Free microspheres are not observed.
(9г) Клетки после 6-го дня культивирования в бессывороточной среде с ростовыми добавками. На фигуре видно, что число распластанных клеток значительно увеличилось. Клетки растут в виде колоний с образованием кластеров и объединены в хорошо развитую сеть. Свободных микросфер не наблюдается.(9g) Cells after the 6th day of cultivation in serum-free medium with growth supplements. The figure shows that the number of spread cells has increased significantly. Cells grow in the form of colonies with the formation of clusters and are combined into a well-developed network. Free microspheres are not observed.
(9д) Клетки после 6-го дня культивирования в среде, содержащей 10% эмбриональную сыворотку телят. На фигуре видно, что число распластанных клеток значительно увеличилось. Клетки растут в виде колоний с образованием кластеров и объединены в хорошо развитую сеть. Свободных микросфер не наблюдается.(9e) Cells after the 6th day of cultivation in a medium containing 10% fetal calf serum. The figure shows that the number of spread cells has increased significantly. Cells grow in the form of colonies with the formation of clusters and are combined into a well-developed network. Free microspheres are not observed.
В отдельной серии экспериментов исследуют скорость роста адгезивных клеток на топографически модифицированной микросферами, ковалентно связанными с гистонами, поверхности культуральных сосудов (пример 6). На фиг.10 представлена зависимость роста клеток от времени культивирования клеток на субстрате, покрытом микросферами, ковалентно связанными с суммарным гистоном. Культивирование постоянной линии клеток почки эмбриона человека (НЕК 293) проводят в среде, содержащей сыворотку (среда 1), или в бессывороточной среде с ростовыми добавками (среда 2). Индекс пролиферации отложен против времени инкубации. Индекс пролиферации - это отношение числа пролиферирующих клеток (в тестируемый день культивирования) к общему числу засеянных клеток.In a separate series of experiments, the growth rate of adhesive cells on topographically modified microspheres covalently linked to histones is studied on the surface of culture vessels (Example 6). Figure 10 shows the dependence of cell growth on the time of cell cultivation on a substrate coated with microspheres covalently linked to the total histone. The cultivation of a constant cell line of the kidney of a human embryo (HEK 293) is carried out in a medium containing serum (medium 1), or in a serum-free medium with growth additives (medium 2). The proliferation index is delayed against incubation time. The proliferation index is the ratio of the number of proliferating cells (on the test day of cultivation) to the total number of seeded cells.
На фиг.11 представлена зависимость роста клеток от времени культивирования клеток на субстрате, покрытом микросферами, ковалентно связанными либо с перекрестно сшитыми конъюгатами суммарного гистона (субстрат 1), или с суммарным гистоном (субстрат 2). Культивирование постоянной линии клеток почки эмбриона человека (НЕК 293) проводят в среде, содержащей сыворотку.Figure 11 shows the dependence of cell growth on the time of cell cultivation on a substrate coated with microspheres covalently linked to either cross-linked conjugates of total histone (substrate 1), or with total histone (substrate 2). The cultivation of a constant cell line of the kidney of a human embryo (HEK 293) is carried out in a medium containing serum.
Полученные результаты показали, что при культивировании в течение 6 суток клетки пролиферируют с одинаковой скоростью как на обоих тестируемых субстратах, так и на контрольной поверхности. Скорость роста клеток на тестируемых субстратах одинакова как в среде с сывороткой, так и в бессывороточной среде с ростовыми добавками.The results showed that when cultured for 6 days, the cells proliferate at the same rate both on both test substrates and on the control surface. The cell growth rate on the tested substrates is the same both in the medium with serum and in serum-free medium with growth additives.
На топографически модифицированной микросферами, ковалентно связанными с гистонами, поверхности субстрата формируется трехмерная матрица, которая с нанесенными на нее клетками является основой для формирования тканеподобных клеточных структур при культивировании клеток животного происхождения. На такой поверхности субстрата клетки растут, как в монослойной культуре, но при топографически стерическом соответствии адгезивных для клеток белков и адгезионных рецепторов, которые вступают в прямое электростатическое взаимодействие. Клетки прикрепляются к микросферам диаметром не более 1,0 мкм, площадь поверхности которых соответствует площади поверхности фокальных контактов. Фокальные контакты формируются между адгезивными для клеток гистонами, имеющими в своем составе гепарин-связывающие домены, и протеогликанами клеточной поверхности, которые выступают в качестве рецепторов для гистонов.On the topographically modified microspheres covalently bound to histones, a three-dimensional matrix is formed on the surface of the substrate, which with the cells deposited on it is the basis for the formation of tissue-like cell structures during the cultivation of animal cells. On such a substrate surface, cells grow, as in a monolayer culture, but with topographically steric correspondence of cell adhesion proteins and adhesion receptors, which enter into direct electrostatic interaction. Cells attach to microspheres with a diameter of not more than 1.0 μm, the surface area of which corresponds to the surface area of the focal contacts. Focal contacts are formed between cell-sensitive histones, which incorporate heparin-binding domains, and cell-surface proteoglycans, which act as receptors for histones.
При культивировании клеток на топографически модифицированной микросферами поверхности субстрата характер распластывания клеток имеет свои особенности. Отдельные клетки в процессе прикрепления взаимодействуют с несколькими микросферами, расположенными на оптимальных расстояниях друг от друга, что обеспечивает функциональное растяжение клеток с формированием длинных отростков, за счет которых клетки объединяются друг с другом, образуя трехмерные сетеобразные клеточные структуры. Такие тканеподобные клеточные структуры предназначены для их использования при создании заменителей ткани из клеток животного происхождения.When cells are cultured on a substrate surface topographically modified by microspheres, the nature of cell spreading has its own characteristics. During attachment, individual cells interact with several microspheres located at optimal distances from each other, which ensures functional extension of the cells with the formation of long processes, due to which the cells combine with each other, forming three-dimensional network-like cellular structures. Such tissue-like cell structures are intended for their use in creating tissue substitutes from animal cells.
Прикрепление клеток к топографически модифицированной поверхности культуральных сосудов, как описано в предлагаемом изобретении, может быть либо рецептор-опосредованным, то есть осуществляться за счет факторов прикрепления для клеток, и/или зависимым от заряда.The attachment of cells to the topographically modified surface of the culture vessels, as described in the present invention, can be either receptor-mediated, that is, carried out due to the attachment factors for the cells, and / or depending on the charge.
Все это позволяет рассматривать гистоны как новую группу адгезивных для клеток белков наряду с известными адгезивными для клеток белками, такими как фибронектин, ламинин и коллаген.All this allows us to consider histones as a new group of cell-adhesive proteins, along with well-known cell-adhesive proteins, such as fibronectin, laminin and collagen.
Список используемой литературыBibliography
1. Isenberg I. 1979. Histones. Ann Rev Biochem. 48:159-191.1. Isenberg I. 1979. Histones. Ann Rev Biochem. 48: 159-191.
2. Smalheiser NR. 1996. Proteins in unexpected locations. Mol Biol Cell. 7(7): 1003-1014.2. Smalheiser NR. 1996. Proteins in unexpected locations. Mol Biol Cell. 7 (7): 1003-1014.
3. Jeffery CJ. 2003. Moonlighting proteins: old proteins learning new tricks. Trends Genet. 19(8):415-417.3. Jeffery CJ. 2003. Moonlighting proteins: old proteins learning new tricks. Trends Genet 19 (8): 415-417.
4. Zlatanova JS, Srebreva LN, Banchev ТВ, Tasheva ВТ, Tsanev RG. 1990. Cytoplasmic pool of histone H1 in mammalian cells. J Cell Sci. 96 (Pt 3):461-468.4. Zlatanova JS, Srebreva LN, Banchev TV, Tasheva VT, Tsanev RG. 1990. Cytoplasmic pool of histone H1 in mammalian cells. J Cell Sci. 96 (Pt 3): 461-468.
5. Brix K, Summa W, Lottspeich F, Herzog V.1998. Extracellularly occurring histone H1 mediates the binding of thyroglobulin to the cell surface of mouse macrophages. J Clin Invest. 102(2):283-293.5. Brix K, Summa W, Lottspeich F, Herzog V. 1998. Extracellularly occurring histone H1 mediates the binding of thyroglobulin to the cell surface of mouse macrophages. J Clin Invest. 102 (2): 283-293.
6. Henriquez JP, Casar JC, Fuentealba L, Carey DJ, Brandan E. 2002. Extracellular matrix histone H1 binds to perlecan, is present in regenerating skeletal muscle and stimulates myoblast proliferation. J Cell Sci. 115:2041-2051.6. Henriquez JP, Casar JC, Fuentealba L, Carey DJ, Brandan E. 2002. Extracellular matrix histone H1 binds to perlecan, is present in regenerating skeletal muscle and stimulates myoblast proliferation. J Cell Sci. 115: 2041-2051.
7. Müller S, Scaffidi P, Degryse B, Bonaldi T, Ronfani L, Agresti A, Beltrame M, Bianchi ME. 2001. The double life of HMGB1 chromatin protein: architectural factor and extracellular signal. EMBO J. 20(16):4337-4340.7. Müller S, Scaffidi P, Degryse B, Bonaldi T, Ronfani L, Agresti A, Beltrame M, Bianchi ME. 2001. The double life of HMGB1 chromatin protein: architectural factor and extracellular signal. EMBO J. 20 (16): 4337-4340.
8. Ашмарин И.П., Ждан-Пушкина С.М., Кокряков В.И., Самедов А.Ш., Антонова С.Н. 1972. Антибактериальные и антивирусные функции основных белков клетки и перспективы практического их использования. Изв. Акад. Наук СССР. Сер. биол. №4: 502-508.8. Ashmarin I.P., Zhdan-Pushkina S.M., Kokryakov V.I., Samedov A.Sh., Antonova S.N. 1972. Antibacterial and antiviral functions of the main proteins of the cell and the prospects for their practical use. Izv. Acad. Science of the USSR. Ser. biol. No. 4: 502-508.
9. Class R. Zeppezauer M. 2005. Antimicrobial histone H1 compositions, kits, and methods of use thereof. U.S. Patent 6,884,423.9. Class R. Zeppezauer M. 2005. Antimicrobial histone H1 compositions, kits, and methods of use thereof. U.S. Patent 6,884,423.
10. Горюхина О.А. 1999. Способ получения растворимых ковалентных конъюгатов. Патент на изобретение №2127606. Российская Федерация.10. Goryukhina O.A. 1999. A method of obtaining soluble covalent conjugates. Patent for invention No. 2127606. The Russian Federation.
11. Горюхина О.А., Илюк Р.Д., Мищенко И.В. 2000. Сравнительное исследование поступления экзогенного гистона в паренхиму головного мозга крыс. Бюл. экспер. биол. мед. 130(7):63-66.11. Goryukhina O.A., Ilyuk R.D., Mishchenko I.V. 2000. A comparative study of exogenous histone intake in rat brain parenchyma. Bull. expert. biol. honey. 130 (7): 63-66.
12. Мищенко В.А., Горюхина О.А. 1996. Структура, проницаемость гематоэнцефалического барьера и перспективы доставки через него лекарственных средств. Журн. невропатол. и психиатр. 96(4): 116-120.12. Mishchenko V.A., Goryukhina O.A. 1996. Structure, permeability of the blood-brain barrier and prospects for the delivery of drugs through it. Zhurn. neuropathol. and a psychiatrist. 96 (4): 116-120.
13. Горюхина О.А. 2004. Перспективы применения катионных белков для транспорта лекарственных средств в ткань мозга. Нервная система. Выпуск 37:168-175. Изд. С.-Петербургского университета.13. Goryukhina O.A. 2004. Prospects for the use of cationic proteins for the transport of drugs into brain tissue. Nervous system. Issue 37: 168-175. Ed. St. Petersburg University.
14. Ашмарин И.П., Перельман А.Е., Горюхина О.А., Вишневский Б.И., Вавилин Г.И., Габер И.Э. 1995. Средство, потенциирующее противотуберкулезное действие изониазида. Патент на изобретение №2045278. Российская Федерация.14. Ashmarin I.P., Perelman A.E., Goryukhina O.A., Vishnevsky B.I., Vavilin G.I., Gaber I.E. 1995. An agent that potentiates the anti-TB effect of isoniazid. Patent for invention No. 2045278. The Russian Federation.
15. Rusch V., Reichhart R., Zeppezauer M., Jornvall H. 1989. Biologically active substance with hormonal properties, production process thereof and utilization of histones for medical purposes. U.S. Patent 4,818,763.15. Rusch V., Reichhart R., Zeppezauer M., Jornvall H. 1989. Biologically active substance with hormonal properties, production process its and utilization of histones for medical purposes. U.S. Patent 4,818,763.
16. Zeppezauer M., Reichhart R. 1993. Use of pure histones HI and H2A:H2B dimmers in therapeutic methods. U.S. Patent 5,182,257.16. Zeppezauer M., Reichhart R. 1993. Use of pure histones HI and H2A: H2B dimmers in therapeutic methods. U.S. Patent 5,182,257.
17. Kleinman HK, Luckenbill-Edds L, Cannon FW, Sephel GC. 1987. Use of extracellular matrix components for cell culture. Anal Biochem. 166(1):1-13.17. Kleinman HK, Luckenbill-Edds L, Cannon FW, Sephel GC. 1987. Use of extracellular matrix components for cell culture. Anal Biochem. 166 (1): 1-13.
18. Vitte J, Benoliel AM, Pierres A, Bongrand P. 2004. Is there a predictable relationship between surface physical-chemical properties and cell behaviour at the interface? Eur Cell Mater. 7:52-63; discussion 63.18. Vitte J, Benoliel AM, Pierres A, Bongrand P. 2004. Is there a predictable relationship between surface physical-chemical properties and cell behavior at the interface? Eur Cell Mater. 7: 52-63; discussion 63.
19. Pierres A, Benoliel AM, Bongrand P. 2002. Cell fitting to adhesive surfaces: A prerequisite to firm attachment and subsequent events. Eur Cell Mater. 3:31-45.19. Pierres A, Benoliel AM, Bongrand P. 2002. Cell fitting to adhesive surfaces: A prerequisite to firm attachment and subsequent events. Eur Cell Mater. 3: 31-45.
20. Minuth WW, Strehl R, Schumacher K. 2005. Tissue engineering: essentials for daily laboratory work. Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.20. Minuth WW, Strehl R, Schumacher K. 2005. Tissue engineering: essentials for daily laboratory work. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.
21. Hubbell JA. 2000. Matrix effects. In: Priciples of tissue engineering. Lanza RP, Langer R, Vacanti J., editors. Academic Press, pp.237-250.21. Hubbell JA. 2000. Matrix effects. In: Priciples of tissue engineering. Lanza RP, Langer R, Vacanti J., editors. Academic Press, pp. 237-250.
22. Saltzman W.M. 2000. Cell interaction with polymers. In: Priciples of tissue engineering. Lanza RP, Langer R, Vacanti J., editors. Academic Press, pp.221-236.22. Saltzman W.M. 2000. Cell interaction with polymers. In: Priciples of tissue engineering. Lanza RP, Langer R, Vacanti J., editors. Academic Press, pp. 211-236.
23. Olsen BR. 2000. Matrix molecules and their ligands. 2000. In: Priciples of tissue engineering. Lanza RP, Langer R, Vacanti J., editors. Academic Press, pp.57-72.23. Olsen BR. 2000. Matrix molecules and their ligands. 2000. In: Priciples of tissue engineering. Lanza RP, Langer R, Vacanti J., editors. Academic Press, pp. 57-72.
24. Ikada Y. 2006. Tissue engineering: fundamentals and applications. Interface science and technology, 8. Japan Academic Press.24. Ikada Y. 2006. Tissue engineering: fundamentals and applications. Interface science and technology, 8. Japan Academic Press.
25. Massia SP, Hubbell JA. 1992. Immobilized amines and basic ammo acids as mimetic heparin-binding domains for cell surface proteoglycan-mediated adhesion. J Biol Chem. 267: 10133-41.25. Massia SP, Hubbell JA. 1992. Immobilized amines and basic ammo acids as mimetic heparin-binding domains for cell surface proteoglycan-mediated adhesion. J Biol Chem. 267: 10133-41.
26. Dee КС, Puleo DA, Bizios R. 2002. Tissue-biomateral interactions. Wiley-Liss.26. Dee KS, Puleo DA, Bizios R. 2002. Tissue-biomateral interactions. Wiley-Liss.
27. Cardin AD, Weintraub HJ. 1989. Molecular modeling of protein-glycosaminoglycan interactions. Arteriosclerosis. 9: 21-32.27. Cardin AD, Weintraub HJ. 1989. Molecular modeling of protein-glycosaminoglycan interactions. Arteriosclerosis. 9: 21-32.
28. Vunjak-Novakovic G. 2003. The fundamentals of tissue engineering: scaffolds and bioreactor. Tissue engineering of cartilage and bone. (Novartis Foundation Symposium 249). Bock G., Goode J. ed. Wiley. Chicbester. Landon, pp.34-51.28. Vunjak-Novakovic G. 2003. The fundamentals of tissue engineering: scaffolds and bioreactor. Tissue engineering of cartilage and bone. (Novartis Foundation Symposium 249). Bock G., Goode J. ed. Wiley. Chicbester Landon, pp. 34-51.
29. Jaklenec A, Wan E, Murray ME, Mathiowitz E. 2008. Novel scaffolds fabricated from protein-loaded microspheres for tissue engineering. Biomaterials. 29:185-92.29. Jaklenec A, Wan E, Murray ME, Mathiowitz E. 2008. Novel scaffolds fabricated from protein-loaded microspheres for tissue engineering. Biomaterials. 29: 185-92.
30. Schröder U. 1985. Crystallized carbohydrate spheres for slow release and targeting. Methods Enzymol. 112:116-128.30. Schröder U. 1985. Crystallized carbohydrate spheres for slow release and targeting. Methods Enzymol. 112: 116-128.
Claims (6)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008151474/13A RU2396342C1 (en) | 2008-12-25 | 2008-12-25 | Method of producing three-dimensional matrices for tissue-like structures from animal cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008151474/13A RU2396342C1 (en) | 2008-12-25 | 2008-12-25 | Method of producing three-dimensional matrices for tissue-like structures from animal cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2008151474A RU2008151474A (en) | 2010-06-27 |
| RU2396342C1 true RU2396342C1 (en) | 2010-08-10 |
Family
ID=42683337
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008151474/13A RU2396342C1 (en) | 2008-12-25 | 2008-12-25 | Method of producing three-dimensional matrices for tissue-like structures from animal cells |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2396342C1 (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2615179C2 (en) * | 2012-09-06 | 2017-04-04 | Плуристем Лтд. | Devices and methods of cell culturing |
| RU2634032C1 (en) * | 2016-09-29 | 2017-10-23 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Нижегородская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for determining kinetics of polymer scaffold biodegradation in vivo |
| RU2647466C1 (en) * | 2016-12-01 | 2018-03-15 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный университет" (СПбГУ) | Method for obtaining native protein with prolonged action in the composition of polymeric nanospheres and resorbed microspheres for delivery |
| RU2722822C1 (en) * | 2019-06-13 | 2020-06-04 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный университет" (СПбГУ)" | Method of producing polymer nanospheres for targeted delivery to target tissue |
| RU2817116C1 (en) * | 2022-11-17 | 2024-04-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный университет" (СПбГУ) | Method of producing plasmid dna in polymer nanospheres for delivery |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5A (en) * | 1836-08-10 | Thomas Blanchard | Machine for mortising solid wooden shells of ships' tackle-blocks |
-
2008
- 2008-12-25 RU RU2008151474/13A patent/RU2396342C1/en active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5A (en) * | 1836-08-10 | Thomas Blanchard | Machine for mortising solid wooden shells of ships' tackle-blocks |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Mckeehan W.L. ET AL, Stimulation of clonal growth of normal fibroblasts with substrata coated with basic polymers, J Cell Biol., 1976, v.71, n.3, p.727-34. NAKANISHI J. ET AL, Recent advances in cell micropatterning techniques for bioanalytical and biomedical sciences, Anal Sci., 2008, v.24, n.1, p.67-72. SUH K.Y. ET AL, A simple soft lithographic route to fabrication of poly(ethylene glycol) microstructures for protein and cell patterning, Biomaterials, 2004, v.25, n.3, p.557-63. * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2615179C2 (en) * | 2012-09-06 | 2017-04-04 | Плуристем Лтд. | Devices and methods of cell culturing |
| RU2634032C1 (en) * | 2016-09-29 | 2017-10-23 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Нижегородская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for determining kinetics of polymer scaffold biodegradation in vivo |
| RU2647466C1 (en) * | 2016-12-01 | 2018-03-15 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный университет" (СПбГУ) | Method for obtaining native protein with prolonged action in the composition of polymeric nanospheres and resorbed microspheres for delivery |
| EA032507B1 (en) * | 2016-12-01 | 2019-06-28 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный университет" (СПбГУ) | Method for obtaining native protein with prolonged action in the composition of polymeric nanospheres and resorbed microspheres for delivery |
| RU2722822C1 (en) * | 2019-06-13 | 2020-06-04 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный университет" (СПбГУ)" | Method of producing polymer nanospheres for targeted delivery to target tissue |
| RU2817116C1 (en) * | 2022-11-17 | 2024-04-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный университет" (СПбГУ) | Method of producing plasmid dna in polymer nanospheres for delivery |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2008151474A (en) | 2010-06-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sreejalekshmi et al. | Biomimeticity in tissue engineering scaffolds through synthetic peptide modifications—altering chemistry for enhanced biological response | |
| Tachibana et al. | Fabrication of wool keratin sponge scaffolds for long-term cell cultivation | |
| KR101265492B1 (en) | Method for the differentiation of stem cells into vascular endothelial cells and induction of angiogenesis using the same | |
| Masuko et al. | Chitosan–RGDSGGC conjugate as a scaffold material for musculoskeletal tissue engineering | |
| Welzel et al. | Macroporous starPEG-heparin cryogels | |
| Sagnella et al. | Human endothelial cell interaction with biomimetic surfactant polymers containing peptide ligands from the heparin binding domain of fibronectin | |
| Köllmer et al. | Stem cell-derived extracellular matrix enables survival and multilineage differentiation within superporous hydrogels | |
| Yamada et al. | Development of three-dimensional cell culture scaffolds using laminin peptide-conjugated agarose microgels | |
| JP7235350B2 (en) | Three-dimensional fibroblast aggregates using maltose-binding protein linkers and in vitro 3D skin dermis models containing the same | |
| Smith et al. | RGD-grafted thermoreversible polymers to facilitate attachment of BMP-2 responsive C2C12 cells | |
| JP6608281B2 (en) | Method for producing myocardial tissue chip used for screening drug candidate compounds | |
| RU2093191C1 (en) | Biologically active complex for organogenesis | |
| RU2396342C1 (en) | Method of producing three-dimensional matrices for tissue-like structures from animal cells | |
| JP4284412B2 (en) | Cell and liposome immobilization body and immobilization method thereof | |
| Park et al. | Enhancement of the adhesion of fibroblasts by peptide containing an Arg-Gly-Asp sequence with poly (ethylene glycol) into a thermo-reversible hydrogel as a synthetic extracellular matrix | |
| Park et al. | Immobilization of Arg-Gly-Asp (RGD) sequence in a thermosensitive hydrogel for cell delivery using pheochromocytoma cells (PC12) | |
| Dee et al. | Enhanced endothelialization of substrates modified with immobilized bioactive peptides | |
| KR20180129726A (en) | Polymer Scaffolds for Promoting the Cell-cell Adhesion and Method for Cell Culture Using the Same | |
| WO2010110596A2 (en) | Method for differentiation of stem cells into vascular cells and the induction of angiogenesis using the same | |
| Park et al. | Synthesis of Arg–Gly–Asp (RGD) sequence conjugated thermo-reversible gel via the PEG spacer arm as an extracellular matrix for a pheochromocytoma cell (PC12) culture | |
| Li et al. | Enhancement of artificial juxtacrine stimulation of insulin by co‐immobilization with adhesion factors | |
| Zhou et al. | Microspheres for cell culture | |
| JPWO2015025958A1 (en) | Pacemaker tissue piece manufacturing method | |
| KR102261934B1 (en) | A method for producing three-dimensional fibroblast cluster using MBP-FGF2 | |
| Park et al. | Immobilization of Arg-Gly-Asp (RGD) sequence in sugar containing copolymer for culturing of pheochromocytoma (PC12) cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner |