RU2380378C2

RU2380378C2 - Antibody or fragment thereof with hiv-neutralising activity

Info

Publication number: RU2380378C2
Application number: RU2007140570/13A
Authority: RU
Inventors: Морган БОМСЕЛЬ (FR); Морган Бомсель; Даниела ТУДОР (FR); Даниела ТУДОР
Original assignee: Институт Насьональ Де Ла Сант Эт Де Ла Решерш Медикаль (Инсэрм)
Priority date: 2005-05-02
Filing date: 2005-05-02
Publication date: 2010-01-27
Also published as: RU2007140570A

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: there is described anti-HIV monoclonal antibody that identifies a peptide with a sequence SEQ ID NO 7, or analogue thereof where the region specifying complementarity 3 (CDR3) of variable region of H-(heavy) chain, contains SEQ ID NO 1, or functional analogue thereof. There is described variable region of H-chain specifying SEQ ID NO 7, or its analogue where CDR 3 contains SEQ ID NO 1, or functional analogue thereof. There is presented nucleic acid molecule coding the described antibody. There is offered expression vector containing specified nucleic acid. There is offered host-cell transformed by specified nucleic acid molecule or offered vector. There is disclosed anti-HIV pharmaceutical composition containing the effective amount of described antibody or specified nucleic acid molecule, offered vector or host-cell. There is offered method for passive immunotherapy of an individual susceptible to HIV infection that involves introduction to said individual of described antibody or functional fragment thereof in therapeutically effective amount. There is also offered method for detection in vitro of HIV strains in a sample that involves the stage of bringing the sample in contact to described antibody or functional fragment thereof.

EFFECT: invention allows neutralising HIV infection, reducing infection through mucous membranes and performing passive immunotherapy.

18 cl, 8 dwg, 1 tbl, 6 ex

Description

Настоящее изобретение относится к антителу или фрагменту антитела, обладающим нейтрализующей активностью в отношении вируса иммунодефицита человека, и пригодным для лечения и/или профилактики ВИЧ-инфекции. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей вышеуказанные антитела, диагностической композиции и к способу проведения пассивной иммунотерапии.The present invention relates to an antibody or antibody fragment having neutralizing activity against human immunodeficiency virus, and is suitable for the treatment and / or prevention of HIV infection. The invention also relates to a pharmaceutical composition containing the aforementioned antibodies, a diagnostic composition and a method for conducting passive immunotherapy.

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) относится к семейству Lentivirus ретровирусов животных и является возбудителем болезни Синдром Приобретенного Иммунодефицита (СПИД). До настоящего времени были идентифицированы и изучены на молекулярном уровне два близкородственных типа ВИЧ - тип 1 (ВИЧ-1) и тип 2 (ВИЧ-2).The Human Immunodeficiency Virus (HIV) belongs to the Lentivirus family of animal retroviruses and is the causative agent of Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). So far, two closely related types of HIV have been identified and studied at the molecular level - type 1 (HIV-1) and type 2 (HIV-2).

Введение противовирусных агентов против ВИЧ, таких как ингибиторы обратной транскриптазы, позволяет во многом улучшить состояние пациента, зараженного ВИЧ. Однако, в большинстве случаев, терапевтическая эффективность лечения СПИДа такими лекарственными средствами является частичной или временной, и, кроме того, эти лекарственные средства подавляют рост кроветворных клеток или проявляют токсичность в их отношении, и таким образом подавляют восстановление иммунной системы, ставшей недостаточной.Administration of anti-HIV antiviral agents, such as reverse transcriptase inhibitors, can greatly improve the condition of a patient infected with HIV. However, in most cases, the therapeutic effectiveness of treating AIDS with such drugs is partial or temporary, and in addition, these drugs inhibit the growth of hematopoietic cells or exhibit toxicity in relation to them, and thus inhibit the restoration of the immune system, which has become insufficient.

Таким образом, общепризнанно, что программы профилактики СПИДа и терапия антиретровирусными лекарственными средствами (VALDISERRI, 2003, Nat. Med, 9:881) должны сочетаться с эффективными бактерицидными веществами и вакцинами. Но создание и испытание таких вакцин оказалось сложным (LETVIN и др. 2002, Annu. Rev. Immunol., 20:73; McMICHAEL & HANKE, 2003, Nat. Med., 9:874).Thus, it is widely recognized that AIDS prevention programs and antiretroviral drug therapy (VALDISERRI, 2003, Nat. Med, 9: 881) must be combined with effective bactericidal agents and vaccines. But the development and testing of such vaccines has proven difficult (LETVIN et al. 2002, Annu. Rev. Immunol., 20:73; McMICHAEL & HANKE, 2003, Nat. Med., 9: 874).

Поверхности слизистых оболочек являются основным местом проникновения ВИЧ-1 (NICOLSI и др. 1994, J. Acquir. Immun. Defic. Syndr., 7:296). Передача ВИЧ-1 через слизистые оболочки может происходить при попадании на них зараженных ВИЧ-1 жидкостей, таких как сперма, молозиво, грудное молоко и цервикально-вагинальная жидкость (CHERMANN, 1998, Am. J. Reprod. Immunol., 40:183; MILMAN & SCHARMA, 1994, AIDS, 10:1305).The surfaces of the mucous membranes are the main site of entry of HIV-1 (NICOLSI et al. 1994, J. Acquir. Immun. Defic. Syndr., 7: 296). HIV-1 transmission through mucous membranes can occur when HIV-1-infected fluids, such as sperm, colostrum, breast milk and cervical-vaginal fluid, enter them (CHERMANN, 1998, Am. J. Reprod. Immunol., 40: 183; MILMAN & SCHARMA, 1994, AIDS, 10: 1305).

Из-за взаимодействия ВИЧ с поверхностью слизистых оболочек компонент вакцины, разработанной против ВИЧ, должен заставлять иммунную систему слизистой оболочки препятствовать ранним стадиям передачи вируса через слизистую оболочку и потенциальным рецепторам.Due to the interaction of HIV with the surface of the mucous membranes, a component of the vaccine developed against HIV should cause the mucosal immune system to inhibit the early stages of the transmission of the virus through the mucous membrane and potential receptors.

Было установлено, что антитела, нейтрализующие вирус СПИДа, могут, очевидно, играть важную роль в защите.It has been found that antibodies that neutralize the AIDS virus can obviously play an important role in protection.

Однако хотя было возможно получить нейтрализующие антитела против роста конкретных штаммов вируса в лаборатории, в получении антител, которые могли бы нейтрализовать широкий ряд штаммов с достаточной эффективностью in vivo, пока не удалось достичь такого же успеха.However, although it was possible to obtain neutralizing antibodies against the growth of specific strains of the virus in the laboratory, in obtaining antibodies that could neutralize a wide range of strains with sufficient efficacy in vivo, it was not yet possible to achieve the same success.

Поэтому существует необходимость создания антител, которые способны нейтрализовать инфекцию ВИЧ и, в частности, инфекцию ВИЧ-1.Therefore, there is a need to create antibodies that are able to neutralize HIV infection and, in particular, HIV-1 infection.

Существует необходимость создания антител, которые позволяют предотвратить и/или уменьшить инфицирование ВИЧ через поверхность слизистых оболочек.There is a need to create antibodies that can prevent and / or reduce HIV infection through the surface of the mucous membranes.

Также существует необходимость создания антител для изготовления лекарственных препаратов, предназначенных для применения при пассивной иммунотерапии.There is also a need to create antibodies for the manufacture of drugs intended for use in passive immunotherapy.

Существует необходимость создания антител, которые могут использоваться для диагностических целей.There is a need to create antibodies that can be used for diagnostic purposes.

Целью настоящего изобретения является удовлетворение вышеупомянутых потребностей полностью или частично.The aim of the present invention is to satisfy the above needs in whole or in part.

Изобретатели получили эффективное моноклональное антитело, которое позволяет удовлетворить вышеупомянутые неудовлетворенные потребности. В частности, изобретатели идентифицировали Fab (Fragment antigen binding - антигенсвязывающий фрагмент) нового секреторного IgA (S-IgA) антитела, имеющий конкретную область, определяющую комплементарность, 3 (CDR3 - complementarity determining region) вариабельной области его Н-цепи, причем указанное антитело распознает конкретный пептид из белка gp41 вируса ВИЧ-1. Новое идентифицированное антитело также обладает способностью подавлять трансцитоз ВИЧ-1 и блокировать инфицирование CD4+ Т клеток.The inventors have obtained an effective monoclonal antibody that can satisfy the aforementioned unmet needs. In particular, the inventors have identified the Fab (Fragment antigen binding fragment) of a new secretory IgA (S-IgA) antibody having a specific complementarity determining region, 3 (CDR3 - complementarity determining region) of the variable region of its H chain, and this antibody recognizes a specific peptide from the gp41 protein of the HIV-1 virus. The newly identified antibody also has the ability to inhibit HIV-1 transcytosis and block infection of CD4 + T cells.

Поэтому, согласно одному из его первых аспектов, настоящее изобретение относится к моноклональному антителу или фрагменту антитела, распознающему пептид, имеющий последовательность, представленную на SEQ ID NO 7, или его аналог, причем область, определяющая комплементарность, 3 (CDR3) вариабельной области его Н-цепи содержит пептидную последовательность, представленную на SEQ ID NO 1, или ее функциональный аналог.Therefore, according to one of its first aspects, the present invention relates to a monoclonal antibody or antibody fragment recognizing a peptide having the sequence shown in SEQ ID NO 7 or its analogue, wherein the complementarity determining region is 3 (CDR3) of the variable region of its H the chain contains the peptide sequence shown in SEQ ID NO 1, or a functional analogue thereof.

Термин «фрагмент антитела», как его используют здесь, обозначает антитело, которое имеет N-концевую и/или С-концевую делецию, но где оставшаяся последовательность остатков аминокислот идентична соответствующим позициям встречающейся в природе последовательности, и биологические свойства которой сохраняются или не подвергаются отрицательному влиянию. Этот фрагмент антитела может включать дополнительные модификации, такие как инсерция, делеция и/или замена остатков аминокислот и/или слияние с другими пептидами или белками с образованием химерного белка. Термин «фрагмент антитела» также может означать различные части антитела, то есть константные, вариабельные, тяжелые и легкие цепи.The term "antibody fragment", as used here, means an antibody that has an N-terminal and / or C-terminal deletion, but where the remaining sequence of amino acid residues is identical to the corresponding positions of the naturally occurring sequence, and the biological properties of which are retained or are not negative influence. This antibody fragment may include further modifications, such as insertion, deletion and / or replacement of amino acid residues and / or fusion with other peptides or proteins to form a chimeric protein. The term “antibody fragment” can also mean different parts of an antibody, that is, constant, variable, heavy and light chains.

В том значении, с которым оно употребляется в настоящем изобретении, выражение «функциональный аналог» в отношении пептида следует понимать как обозначающее пептид, который имеет гомологию или идентичность аминокислотной последовательности с другой аминокислотной последовательностью и который имеет подобные или сохраняющиеся биологические свойства по сравнению с указанной другой пептидной последовательностью. Как правило, пептиды-аналоги содержат консервативные замены (и/или инсерции и/или делеции) аминокислот по сравнению с последовательностью, встречающейся в природе.In the sense with which it is used in the present invention, the expression "functional analogue" in relation to a peptide should be understood to mean a peptide that has the homology or identity of an amino acid sequence with a different amino acid sequence and which has similar or persistent biological properties compared to another peptide sequence. Typically, peptides analogues contain conservative substitutions (and / or insertions and / or deletions) of amino acids compared to a sequence found in nature.

Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к вариабельной области Н-цепи, распознающей пептидную последовательность, представленную на SEQ ID NO 7, или ее аналог, где CDR3 указанной вариабельной области Н-цепи содержит пептидную последовательность, представленную на SEQ ID NO 1, или ее функциональный аналог.According to another aspect, the present invention relates to a variable region of an H chain recognizing the peptide sequence shown in SEQ ID NO 7, or an analogue thereof, where CDR3 of said variable region of an H chain containing a peptide sequence shown in SEQ ID NO 1, or functional analogue.

Согласно другому аспекту, антитела по настоящему изобретению или их фрагменты способны нейтрализовать ВИЧ.According to another aspect, the antibodies of the present invention or fragments thereof are capable of neutralizing HIV.

Согласно другому аспекту, настоящее изобретение также относится к последовательности нуклеиновых кислот, кодирующей антитело по настоящему изобретению или его фрагмент, а также к вектору и клетке-хозяину, содержащему указанную последовательность нуклеиновых кислот.According to another aspect, the present invention also relates to a nucleic acid sequence encoding an antibody of the present invention or a fragment thereof, as well as to a vector and a host cell containing said nucleic acid sequence.

Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного агента эффективное количество агента, выбранного из антитела по изобретению или его фрагмента, последовательности нуклеиновых кислот по изобретению, вектора по изобретению или клетки-хозяина по изобретению, и содержащей подходящий носитель.According to another aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising, as an active agent, an effective amount of an agent selected from an antibody of the invention or a fragment thereof, a nucleic acid sequence of the invention, a vector of the invention or a host cell of the invention, and containing a suitable carrier.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к диагностической композиции и способу определения in vitro штамма ВИЧ в образце.According to another aspect, the present invention relates to a diagnostic composition and method for determining in vitro an HIV strain in a sample.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение также относится к способу осуществления пассивной иммунотерапии пациента, подверженного инфекции ВИЧ, предусматривающему прием терапевтически эффективного количества по меньшей мере антитела по настоящему изобретению или его фрагмента.According to another aspect, the present invention also relates to a method for the passive immunotherapy of a patient susceptible to HIV infection, comprising administering a therapeutically effective amount of at least the antibody of the present invention or a fragment thereof.

АНТИТЕЛАANTIBODIES

Антитело согласно настоящему изобретению обозначает целый иммуноглобулин или его фрагмент, и в частности, его антиген-связывающий участок.An antibody according to the present invention denotes an entire immunoglobulin or fragment thereof, and in particular, its antigen-binding site.

Иммуноглобулин - это тетрамерная молекула, состоящая из двух идентичных пар полипептидных цепей, причем каждая пара имеет одну «легкую» (L - light) (около 25 кДа) и одну «тяжелую» (Н - heavy) цепь (около 50-70 кДа). Амино-концевой участок каждой цепи содержит вариабельную область (V - variable), содержащую примерно от 100 до 110 и более остатков аминокислот, в первую очередь ответственную за распознавание антигена. Карбокси-концевой участок каждой цепи определяет константную область (С - constant), ответственную за эффекторную функцию. Легкие цепи человека классифицируют как λ и к легкие цепи. Константные области тяжелых цепей классифицируют как µ, δ, γ, α и ε, и они определяют изотипы антител, такие как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE соответственно. Вариабельные области каждой легкой/тяжелой пары цепей образуют сайт связывания антитела, таким образом, интактный иммуноглобулин обычно имеет по меньшей мере два сайга связывания.Immunoglobulin is a tetrameric molecule consisting of two identical pairs of polypeptide chains, each pair having one “light” (L - light) (about 25 kDa) and one “heavy” (H - heavy) chain (about 50-70 kDa) . The amino-terminal portion of each chain contains a variable region (V - variable) containing from about 100 to 110 or more amino acid residues, primarily responsible for antigen recognition. The carboxy-terminal portion of each chain defines a constant region (C - constant), which is responsible for effector function. Human light chains are classified as λ and k light chains. The constant regions of the heavy chains are classified as µ, δ, γ, α, and ε, and they define antibody isotypes such as IgM, IgD, IgG, IgA, and IgE, respectively. The variable regions of each light / heavy pair of chains form an antibody binding site, so an intact immunoglobulin usually has at least two binding sites.

В конкретном воплощении изобретения моноклональное антитело по изобретению или его фрагмент может представлять собой IgA, в частности, секреторный IgA (S-IgA).In a specific embodiment of the invention, the monoclonal antibody of the invention or a fragment thereof may be IgA, in particular, secretory IgA (S-IgA).

Согласно другому воплощению моноклональное антитело по изобретению или его фрагмент может представлять собой антитело человека.According to another embodiment, the monoclonal antibody of the invention or a fragment thereof may be a human antibody.

Цепи иммуноглобулина демонстрируют одинаковую общую структуру сравнительно консервативных каркасных областей (FR - framework region), соединенных свободными гипервариабельными областями, также называемыми областями, определяющими комплементарность, или CDR. Области CDR двух цепей каждой пары выровнены при помощи каркасных областей, что делает возможным связывание специфического эпитопа (антиген-связывающая область антитела). Как легкая, так и тяжелая цепи содержат, от N-конца к С-концу, домены FR1, CDR1, FR2, CRD2, FR3, CDR3 и HFR4.Immunoglobulin chains exhibit the same general structure of relatively conservative framework regions (FRs), connected by free hypervariable regions, also called complementarity determining regions, or CDRs. The CDR regions of the two chains of each pair are aligned using framework regions, which makes possible the binding of a specific epitope (antigen-binding region of the antibody). Both light and heavy chains contain, from the N-terminus to the C-terminus, domains FR1, CDR1, FR2, CRD2, FR3, CDR3 and HFR4.

Антитело по изобретению, в частности, содержит в качестве CDR3 вариабельной области Н-цепи пептидную последовательность, представленную на SEQ ID NO 1, или ее функциональный аналог. Эта последовательность состоит из остатков 21 аминокислоты и содержит в середине остаток ароматической гидрофобной кислоты, такой как триптофан или фенилаланин (W или F) (10-ый аминокислотный остаток, начиная с N-конца, обозначенный как W в однобуквенном аминокислотном коде в SEQ ID NO 1).The antibody of the invention, in particular, contains, as CDR3 of the H region variable region, the peptide sequence shown in SEQ ID NO 1 or a functional analogue thereof. This sequence consists of 21 amino acid residues and contains in the middle an aromatic hydrophobic acid residue such as tryptophan or phenylalanine (W or F) (the 10th amino acid residue starting at the N-terminus, designated W in the single-letter amino acid code in SEQ ID NO one).

Не связываясь какой-либо конкретной теорией, исследователи предполагают, что этот остаток ароматической аминокислоты может играть решающую роль в узнавании антигена, то есть пептида Р1, идентифицируемого по пептидной последовательности, представленной на SEQ ID NO 7. Поэтому предполагают, что функциональный аналог последовательности CDR3 по изобретению должен иметь длину последовательности, составляющую по меньшей мере около 15 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере около 18 аминокислот, и более предпочтительно около 20-21 аминокислот, и должен содержать в середине последовательности остаток ароматической аминокислоты, такой как триптофан или фенилаланин или их аналоги.Without being bound by any particular theory, the researchers suggest that this aromatic amino acid residue may play a decisive role in recognizing the antigen, i.e., peptide P1, identified by the peptide sequence shown in SEQ ID NO 7. Therefore, it is suggested that the functional analogue of the CDR3 sequence is the invention should have a sequence length of at least about 15 amino acids, preferably at least about 18 amino acids, and more preferably about 20-21 amino acids, and olzhen contain sequences in the middle of an aromatic amino acid residue such as phenylalanine or tryptophan or their analogs.

Согласно другому воплощению изобретения вариабельная область Н-цепи моноклонального антитела по настоящему изобретению или его фрагмента, кроме того, содержит по меньшей мере одну CDR, выбранную из CDR1 и CDR2, имеющих соответственно пептидную последовательность, представленную на SEQ ID NO 2 или SEQ ID NO 3, или их функциональных аналогов.According to another embodiment of the invention, the H region variable region of the monoclonal antibody of the present invention or a fragment thereof further comprises at least one CDR selected from CDR1 and CDR2 having respectively the peptide sequence shown on SEQ ID NO 2 or SEQ ID NO 3 , or their functional counterparts.

Согласно конкретному воплощению изобретения вариабельная область Н-цепи моноклонального антитела по настоящему изобретению или его фрагмента, кроме того, содержит в качестве CDR областей CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие соответственно пептидную последовательность, представленную на SEQ ID NO 2 и SEQ ID NO 3 и SEQ ID NO 1.According to a specific embodiment of the invention, the H region variable region of the monoclonal antibody of the present invention or a fragment thereof further comprises CDR1, CDR2 and CDR3 regions as CDRs, having respectively the peptide sequence shown in SEQ ID NO 2 and SEQ ID NO 3 and SEQ ID NO 1.

В другом воплощении изобретение относится к вариабельной области Н-цепи, как определено выше.In another embodiment, the invention relates to the variable region of the H chain, as defined above.

Вариабельная область Н-цепи по настоящему изобретению может распоззнавать пептид, называемый Р1 и имеющий пептидную последовательность, представленную на SEQ ID NO 7, или ее аналог.The variable region of the H chain of the present invention can recognize a peptide called P1 and having the peptide sequence shown in SEQ ID NO 7 or its analogue.

Пептид Р1 соответствует аминокислотной последовательности, присутствующей в белке gp41 оболочки вируса ВИЧ, который выставлен на поверхности вирусной частицы до ее взаимодействия с клеткой-мишенью. У штамма ВИЧ-1 эта последовательность простирается от аминокислоты 650 до аминокислоты 685 белка gp41.Peptide P1 corresponds to the amino acid sequence present in the gp41 protein of the envelope of the HIV virus, which is exposed on the surface of the viral particle before it interacts with the target cell. In HIV-1 strain, this sequence extends from amino acid 650 to amino acid 685 of the gp41 protein.

В растворе этот пептид может переходить структурированное олигомерное состояние, зависящее от концентрации, а именно, димерное или тетрамерное состояние (ALFSEN & BOMSEL, 2002, J. Biol. Chem., 277: 25649).In a solution, this peptide can undergo a structured oligomeric state depending on the concentration, namely a dimeric or tetrameric state (ALFSEN & BOMSEL, 2002, J. Biol. Chem., 277: 25649).

Следовательно, антитело или вариабельная область Н-цепи по настоящему изобретению или их фрагмент могут распознавать пептид Р1 в мономерной или олигомерной форме.Therefore, the antibody or H region variable region of the present invention or a fragment thereof can recognize the P1 peptide in monomeric or oligomeric form.

Пептидная последовательность Р1 (последовательность SEQ ID NO 7) содержит различные последовательности эпитопов, распознаваемые различными антителами, известными в предшествующем уровне техники. Такими эпитопами являются эпитоп ELDKWA, распознаваемый моноклональным антителом IgG 2F5 и эпитоп NWFDIT, распознаваемый моноклональным антителом IgG 4E10.The peptide sequence P1 (sequence SEQ ID NO 7) contains different sequences of epitopes recognized by various antibodies known in the prior art. Such epitopes are the ELDKWA epitope recognized by the IgG 2F5 monoclonal antibody and the NWFDIT epitope recognized by the IgG 4E10 monoclonal antibody.

В воплощении настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению или фрагмент антитела не распознают эпитопы, известные как 2F5 и 4E10.In an embodiment of the present invention, the antibody of the present invention or antibody fragment does not recognize epitopes known as 2F5 and 4E10.

В другом воплощении настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению или его фрагмент могут также содержать вариабельную область L-цепи, содержащую по меньшей мере одну область, определяющую комплементарность, выбранную из CDR1, CDR2 и CDR3, имеющих пептидную последовательность, представленную на SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 и SEQ ID NO 6 соответственно, или их функциональных аналогов.In another embodiment of the present invention, the antibody of the present invention or a fragment thereof may also comprise an L chain variable region comprising at least one complementarity determining region selected from CDR1, CDR2 and CDR3 having the peptide sequence shown in SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 and SEQ ID NO 6, respectively, or their functional analogues.

Таким образом, согласно другому воплощению настоящее изобретение относится к вариабельной области L-цепи, содержащей по меньшей мере один участок CDR, выбранный из CDR1, CDR2 и CDR3, имеющих соответственно пептидную последовательность, представленную на SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 и SEQ ID NO 6, или их функциональных аналогов.Thus, according to another embodiment, the present invention relates to a variable region of an L chain containing at least one CDR region selected from CDR1, CDR2 and CDR3 having respectively the peptide sequence shown in SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 and SEQ ID NO 6, or their functional analogs.

Согласно другому воплощению вариабельная область L-цепи по изобретению включает в качестве CDR областей CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие соответственно пептидную последовательность, представленную на SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 и/или SEQ ID NO 6.According to another embodiment, the L chain variable region of the invention includes, as CDRs, CDR1, CDR2, and CDR3 regions having, respectively, a peptide sequence shown in SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 and / or SEQ ID NO 6.

Согласно другому воплощению моноклональное антитело по настоящему изобретению или его фрагмент содержат вариабельную область Н-цепи и вариабельную область L-цепи, имеющие соответственно аминокислотную последовательность, представленную на SEQ ID NO 8 и SEQ ID NO 9.According to another embodiment, the monoclonal antibody of the present invention or a fragment thereof comprises an H chain variable region and an L chain variable region having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 8 and SEQ ID NO 9, respectively.

Согласно одному воплощению антитело по настоящему изобретению представляет собой Fab-фрагмент, идентифицированный как клон 43 в экспериментальной части и содержащий вариабельную область Н-цепи и вариабельную область L-цепи, имеющие соответственно последовательности аминокислот, представленные на SEQ ID NO 8 и SEQ ID NO 9.According to one embodiment, the antibody of the present invention is a Fab fragment identified as clone 43 in the experimental part and containing the variable region of the H chain and the variable region of the L chain, respectively having the amino acid sequences shown in SEQ ID NO 8 and SEQ ID NO 9 .

Согласно другому воплощению антитело по настоящему изобретению может быть рекомбинантным анти-ВИЧ антителом или его фрагментом, содержащим вариабельную область Н-цепи по настоящему изобретению.According to another embodiment, the antibody of the present invention may be a recombinant anti-HIV antibody or a fragment thereof comprising an H chain variable region of the present invention.

Согласно другому воплощению изобретения рекомбинантное антитело по настоящему изобретению может дополнительно содержать вариабельную область L-цепи по настоящему изобретению.According to another embodiment of the invention, the recombinant antibody of the present invention may further comprise an L chain variable region of the present invention.

Следовательно, CDR3 вариабельной области Н-цепи по настоящему изобретению или целиком вариабельная область Н-цепи могут использоваться для создания химерного или рекомбинантного антитела, имеющего каркасную область, отличную от изотипа IgA, такую как, например, каркасная область изотипа IgG. Такая конструкция может быть получена с помощью любых инструментов молекулярной биологии, известных в предшествующем уровне техники, например, как описано в издании «Молекулярное клонирование - Лабораторный справочник» (второе издание), Sambrook и др., 1989, Coldspring Harbor Laborotory, Coldspring Harbor Press, N.Y. (Sambrook). Химерное или рекомбинантное антитело может быть целым антителом или его фрагментом.Therefore, the CDR3 of the H chain variable region of the present invention or the entire H chain variable region can be used to create a chimeric or recombinant antibody having a framework region other than the IgA isotype, such as, for example, the IgG isotype framework region. Such a construction can be obtained using any molecular biology tools known in the prior art, for example, as described in Molecular Cloning - Laboratory Reference (Second Edition), Sambrook et al., 1989, Coldspring Harbor Laborotory, Coldspring Harbor Press NY (Sambrook). A chimeric or recombinant antibody may be a whole antibody or fragment thereof.

Соответственно функциональный аналог CDR по настоящему изобретению вариабельной области Н-цепи или вариабельной области L-цепи, будучи вставленным вместо оригинальной последовательности в антитело по настоящему изобретению, приводит к сохранению его способности или не оказывает отрицательного влияния на его способность распознавать пептид с последовательностью согласно SEQ ID NO 7 или его функциональные аналоги, и сохраняет способность нейтрализовать ВИЧ и/или ингибировать инфицирование ВИЧ.Accordingly, the functional analogue of the CDR of the present invention of the variable region of the H chain or variable region of the L chain, being inserted instead of the original sequence into the antibody of the present invention, retains its ability or does not adversely affect its ability to recognize a peptide with a sequence according to SEQ ID NO 7 or its functional analogues, and retains the ability to neutralize HIV and / or inhibit HIV infection.

Настоящее изобретение также относится к антителам, содержащим Fab-фрагмент, являющийся производным человеческого антитела согласно данному изобретению, и Fc-домен, выделенный из другого субтипа Ig, такого как IgG, или подобного ему.The present invention also relates to antibodies containing a Fab fragment derived from a human antibody of the invention and an Fc domain isolated from another Ig subtype, such as IgG, or the like.

Следовательно, согласно одному из воплощений настоящее изобретение также относится к антигенсвязывающему элементу антитела согласно настоящему изобретению или к его фрагменту, содержащему вариабельную область Н-цепи, как определено выше. Этот антигенсвязывающий участок может необязательно содержать вариабельную область L-цепи, как определено выше.Therefore, according to one embodiment, the present invention also relates to an antigen-binding element of an antibody according to the present invention or to a fragment thereof comprising an H chain variable region as defined above. This antigen binding site may optionally comprise a variable region of the L chain as defined above.

Антигенсвязывающие участки могут быть получены с помощью любой известной техники рекомбинирования ДНК или путем ферментативного или химического расщепления интактных антител. Антигенсвязывающие участки могут включать в частности. Fab (моновалентный фрагмент, состоящий из VL, VH, CL и СН1 доменов), F(ab')₂ (бивалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидными мостиками в шарнирной области), Fv-домен (фрагмент, состоящий из VL и VH-доменов одного плеча антитела), Fd (фрагмент, состоящий из VH и СН1-доменов), dAb-домен (состоящий из VH-домена), scFv (участок, состоящий из антитела, в котором VL и VH-домены спарены с образованием моновалентной молекулы посредством синтетического линкера), химерное антитело, димеры фрагментов антител, и фрагменты областей, определяющих комплементарность, (CDR).Antigen binding sites can be obtained using any known DNA recombination technique or by enzymatic or chemical cleavage of intact antibodies. Antigen binding sites may include in particular. Fab (monovalent fragment consisting of VL, VH, CL and CH1 domains), F (ab ') ₂ (bivalent fragment containing two Fab fragments connected by disulfide bridges in the hinge region), Fv domain (fragment consisting of VL and VH domains of one arm of an antibody), Fd (fragment consisting of VH and CH1 domains), dAb domain (consisting of VH domain), scFv (region consisting of antibody in which VL and VH domains are paired with the formation of a monovalent molecule by means of a synthetic linker), a chimeric antibody, dimers of antibody fragments, and fragments of complement regions ntarnost, (CDR).

Способность антитела по настоящему изобретению или его фрагмента нейтрализовать ВИЧ можно оценить с помощью анализа ингибирования трансцитоза и с помощью анализа блокирования инфицирования CD4+T клеток, как будет описано ниже и проиллюстрировано примерами.The ability of an antibody of the present invention or a fragment thereof to neutralize HIV can be assessed using a transcytosis inhibition assay and a CD4 + T cell blocking assay, as will be described below and illustrated by examples.

НЕЙТРАЛИЗУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ АНТИТЕЛANTIBODY NEUTRALIZING ACTIVITY

Нейтрализующая активность антител по настоящему изобретению или их фрагментов против ВИЧ может быть оценена по игибированию трансцитоза ВИЧ через эпителиальные клетки и/или ингибированию инфицирования клеток CD4+T ВИЧ.The neutralizing activity of the antibodies of the present invention or fragments thereof against HIV can be assessed by the inhibition of HIV transcytosis through epithelial cells and / or inhibition of infection of HIV CD4 + T cells.

Согласно изобретению нейтрализуемый ВИЧ представляет собой, в частности, штамм ВИЧ-1.According to the invention, neutralizable HIV is, in particular, a strain of HIV-1.

Оценка способности моноклонального антитела по настоящему изобретению ингибировать трансцитоз ВИЧ через клетки может быть проведена на любой поляризованной клетке. В одном воплощении изобретения поляризованная клетка может быть эпителиальной клеткой, такой как, например, линия интестинальных клеток НТ-29 или линия эндометриальных клеток НЕС-1 или клетки из биопсии слизистой оболочки человека (Bomsel и др.. Immunity, 1998, 3:277). Как правило, клеточные линии выращивают в виде плотного поляризованного монослоя на проницаемой фильтровальной подложке (имеющей, например, размер пор 0,45 мкм), образующей границу между двумя независимыми камерами, верхняя из которых омывает верхнюю поверхность эпителиального монослоя, а нижняя омывает базолатеральную поверхность, или биопсии устанавливают с использованием камер.Assessment of the ability of the monoclonal antibody of the present invention to inhibit HIV transcytosis through cells can be performed on any polarized cell. In one embodiment of the invention, the polarized cell may be an epithelial cell, such as, for example, the NT-29 intestinal cell line or the HEC-1 endometrial cell line or cells from a biopsy of a human mucosa (Bomsel et al. Immunity, 1998, 3: 277) . As a rule, cell lines are grown in the form of a dense polarized monolayer on a permeable filter substrate (having, for example, a pore size of 0.45 μm), forming the boundary between two independent chambers, the upper of which washes the upper surface of the epithelial monolayer, and the lower is washed by the basolateral surface, or biopsies are established using cameras.

Трансцитоз может быть инициирован при контакте с инфицированными ВИЧ-клетками, например, инфицированными ВИЧ-мононуклеарами периферической крови (РВМС - peripheral blood mononuclearcells) в апикальной камере.Transcytosis can be initiated by contact with HIV-infected cells, for example, HIV-infected peripheral blood mononuclear cells (RVMS - peripheral blood mononuclearcells) in the apical chamber.

Тестируемые антитела могут помещать в апикальную камеру до или после введения инфицированных ВИЧ клеток или их могут проинкубировать с вирусом ВИЧ-1 или с ВИЧ-1 инфицированными клетками.Test antibodies can be placed in the apical chamber before or after administration of HIV-infected cells, or they can be incubated with HIV-1 virus or with HIV-1 infected cells.

Тестируемые антитела по изобретению могут использовать в различной концентрации, например, от примерно 0,01 нг/мл до примерно 10 нг/мл, в частности от примерно 0,1 и до примерно 5 нг/мл или более предпочтительно от примерно 0,5 до 1 нг/мл.Test antibodies of the invention can be used in various concentrations, for example, from about 0.01 ng / ml to about 10 ng / ml, in particular from about 0.1 to about 5 ng / ml, or more preferably from about 0.5 to 1 ng / ml.

Оценку трансцитоза вируса и возможности его ингибирования могут осуществлять, определяя нуклеиновую кислоту или белок вируса ВИЧ в базолатеральной среде любыми известными способами, такими как PCR (Polymerase Chain Reaction - полимеразная цепная реакция), RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction - полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой) или ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay - твердофазный иммуноферментный анализ).Evaluation of viral transcytosis and the possibility of its inhibition can be carried out by determining the nucleic acid or the HIV virus protein in the basolateral medium by any known methods, such as PCR (Polymerase Chain Reaction - polymerase chain reaction), RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction - polymerase chain reaction reverse transcriptase) or ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay - enzyme-linked immunosorbent assay).

В одном воплощении для оценки трансцитоза вируса ВИЧ могут использовать пептид р24, который могут определять с помощью анализа ELISA с использованием, например, набора, поставляемого PASTEUR-SANOFI (FRANCE).In one embodiment, p24 peptide can be used to evaluate HIV transcytosis, which can be determined by ELISA using, for example, the kit supplied by PASTEUR-SANOFI (FRANCE).

В конкретном воплощении при добавлении к примерно 10⁶ инфицированных ВИЧ-1 мононуклеаров периферической крови в концентрации от около 0,5 нг/мл до около 5 нг/мл и инкубации в течение около 1 ч при температуре около 17°С или около 4°С перед добавлением инфицированных клеток в апикальную камеру, моноклональные антитела или их фрагменты по настоящему изобретению могут ингибировать трансцитоз вируса, инициированный внесением 10⁶ ВИЧ-1 позитивных мононуклеаров периферической крови в апикальную камеру по меньшей мере примерно на 50%, в частности по меньшей мере примерно на 75% и в более частном случае по меньшей мере примерно на 95% по сравнению с трансцитозом вируса, происходящим в отсутствие антител.In a specific embodiment, when peripheral blood mononuclear cells are added to about 10 ⁶ HIV-1 infected mononuclear cells at a concentration of from about 0.5 ng / ml to about 5 ng / ml and incubated for about 1 hour at a temperature of about 17 ° C or about 4 ° C before adding infected cells to the apical chamber, the monoclonal antibodies or fragments of the present invention can inhibit virus transcytosis, initiated by the introduction of 10 ⁶ HIV-1 positive peripheral blood mononuclear cells into the apical chamber by at least about 50%, in particular by at least about 75% and in the more particular case at least about 95% compared with transcytosis of the virus that occurs in the absence of antibodies.

В другом воплощении антитела по настоящему изобретению или их фрагменты могут добавлять в апикальную камеру до введения инфицированных ВИЧ-1 мононуклеаров периферической крови. В этом воплощении происходит ингибирование трансцитоза вируса по меньшей мере примерно на 50% по сравнению с трансцитозом вируса, происходящим в отсутствие антител.In another embodiment, the antibodies of the present invention or fragments thereof can be added to the apical chamber prior to administration of HIV-1 infected peripheral blood mononuclear cells. In this embodiment, at least about 50% inhibition of viral transcytosis occurs compared to viral transcytosis occurring in the absence of antibodies.

В качестве примера. Fab и Fd-фрагменты клона 43, которые также являются объектом настоящего изобретения, могут ингибировать трансцитоз ВИЧ соответственно примерно по меньшей мере на 70% и примерно на 80%.As an example. Fab and Fd fragments of clone 43, which are also an object of the present invention, can inhibit HIV transcytosis by at least about 70% and about 80%, respectively.

В частном воплощении изобретения Fab и Fd-фрагменты клона 43, которые также являются объектами настоящего изобретения, также способны специфически связываться с белком gp41, экспрессированным на поверхности инфицированных ВИЧ-1 (JRCSF клон R5) мононуклеаров периферической крови, как показывает анализ с помощью проточной цитометрии, проведенный традиционным способом, известным из предшествующего уровня техники.In a particular embodiment of the invention, Fab and Fd fragments of clone 43, which are also objects of the present invention, are also able to specifically bind to the gp41 protein expressed on the surface of HIV-1 (JRCSF clone R5) peripheral blood mononuclear cells, as shown by flow cytometry analysis carried out in the traditional way known from the prior art.

В другом воплощении изобретения моноклональные антитела по настоящему изобретению или их фрагменты могут проявлять способность ингибировать инфицирование CD4+T клеток ВИЧ-1.In another embodiment of the invention, the monoclonal antibodies of the present invention or fragments thereof may exhibit the ability to inhibit the infection of CD4 + T cells of HIV-1.

В частном воплощении после инкубации вируса в концентрации 1 нг/мл в течение около 30 мин при температуре около 37°С с антителом по настоящему изобретению или его фрагментом, инфицирование CD4+T клеток может быть ингибировано по меньшей мере примерно на 75% и, в частности, по меньшей мере примерно на 95% по сравнению с инфекцией ВИЧ CD4+T клеток, происходящей без антител или в присутствии неспецифического антитела, не распознающего вирус.In a private embodiment, after incubating the virus at a concentration of 1 ng / ml for about 30 minutes at a temperature of about 37 ° C with the antibody of the present invention or a fragment thereof, infection of CD4 + T cells can be inhibited by at least about 75% and, in in particular, at least about 95% compared with HIV infection of CD4 + T cells occurring without antibodies or in the presence of a non-specific antibody that does not recognize the virus.

В качестве примера, Fab-фрагмент клона 43, который также является объектом настоящего изобретения, может ингибировать инфицирование CD4+T клеток ВИЧ по меньшей мере на 95%.As an example, the Fab fragment of clone 43, which is also an object of the present invention, can inhibit infection of CD4 + T cells of HIV by at least 95%.

НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ. ВЕКТОРЫ И КЛЕТКИ-ХОЗЯЕВАNUCLEIC ACIDS. VECTORS AND HOST-CELLS

Антитело по настоящему изобретению идентифицируют путем скрининга фаг-дисплейной библиотеки Fab-фрагмента IgA, полученной как описано в экспериментальной части.The antibody of the present invention is identified by screening a phage display library of a Fab fragment of IgA, obtained as described in the experimental part.

Способы получения и работы с комбинаторной библиотекой подробно описаны в литературе и входят в общие знания специалиста в данной области.Methods of obtaining and working with a combinatorial library are described in detail in the literature and are included in the general knowledge of a specialist in this field.

Комбинаторную фаг-дисплейную библиотеку Fab подвергали скринингу на пептид Р1, имеющий последовательность, представленную на SEQ ID NO 7 с помощью итерактивного пэннинга на антиген, фиксированный на твердой подложке (такой как пластины для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA)), способом, известным как микропэннинг, описанным у Azzay & Highsmith (Clinical Biochemistry, 2002, 35: 425-445).The Fab combinatorial phage display library was screened for P1 peptide having the sequence shown in SEQ ID NO 7 by iterative panning for an antigen fixed on a solid support (such as ELISA plates) using a method known as micropanning described by Azzay & Highsmith (Clinical Biochemistry, 2002, 35: 425-445).

Начальная концентрация может составлять, например, около 125 микромоль, при которой пептид Р1 переходит в димерное/тетрамерное олигомерное состояние.The initial concentration may be, for example, about 125 micromoles, in which the peptide P1 becomes a dimeric / tetrameric oligomeric state.

Определение взаимодействия между антигеном, а именно Р1 и антигенсвязывающим доменом, находящимся на внешней стороне бактериофага могут проводить любым способом, используемым в данной области. Например, может быть использован способ ELISA, где пептид Р1 наносят на гнезда пластины и затем вносят фаги из библиотеки.The determination of the interaction between the antigen, namely P1 and the antigen binding domain, located on the outside of the bacteriophage can be carried out by any method used in this field. For example, an ELISA method can be used where the P1 peptide is applied to the plate sockets and then phages from the library are introduced.

Гены, кодирующие участок связывания антигена, которые являются уникальными для каждого фага, могут выделять из нуклеиновой кислоты выбранного фага, секвенировать и использовать для конструирования генов полной молекулы антитела или его аналога, такого как Fab, F(ab')₂ или scFv-фрагменты, как описано выше.Genes encoding an antigen binding site that are unique to each phage can be isolated from the nucleic acid of a selected phage, sequenced and used to construct genes for a complete antibody molecule or its analogue, such as Fab, F (ab ') ₂ or scFv fragments, as described above.

Последовательность генов, кодирующих участок связывания антигена, выделенную из выбранного фага, могут секвенировать любым способом, известным специалисту в данной области техники.The sequence of genes encoding the antigen binding site isolated from the selected phage can be sequenced by any method known to a person skilled in the art.

Например, секвенирование могут осуществлять с использованием автоматического секвенатора ДНК с набором реактивов (Applied Biosystems), содержащим флуоресцентно меченные дидезоксинуклеотиды, выступающие в качестве терминаторов, для циклической реакции Taq секвенирования. Могут получать препарат двуцепочечной ДНК, например, из бактерии, и секвенирование могут выполнять с использованием набора праймеров, которые специфически гибридизуются с вектором, используемым для клонирования цепей Н и L фрагмента Fab, в направлении 3'-5' и 5'-3' каждой цепи Fab-фрагмента. Например, при использовании вектора pComb3X, могут использовать праймеры, имеющие последовательности, представленные в Таблице II.For example, sequencing can be performed using an automated DNA sequencer with a set of reagents (Applied Biosystems) containing fluorescently labeled dideoxynucleotides acting as terminators for the cyclic Taq sequencing reaction. A double-stranded DNA preparation can be obtained, for example, from a bacterium, and sequencing can be performed using a set of primers that specifically hybridize with the vector used to clone the H and L chains of the Fab fragment in the 3'-5 'and 5'-3' directions of each chain Fab fragment. For example, when using the pComb3X vector, primers having the sequences shown in Table II can be used.

Таким образом, согласно другому воплощению настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновых кислот, таким как ДНК и РНК, и подобным им, которые кодируют последовательности аминокислот вариабельных областей тяжелых и легких цепей по настоящему изобретению, где эти последовательности представлены соответственно на SEQ ID NO 8 и SEQ ID NO 9.Thus, according to another embodiment, the present invention also relates to nucleic acid molecules, such as DNA and RNA, and the like, which encode the amino acid sequences of the variable regions of the heavy and light chains of the present invention, where these sequences are shown respectively in SEQ ID NO 8 and SEQ ID NO 9.

В частности, последовательности аминокислот по настоящему изобретению для вариабельной области Н-цепи могут представлять собой последовательность, представленную на SEQ ID NO 10, а для вариабельной области L-цепи могут представлять собой последовательность, представленную на SEQ ID NO 11.In particular, the amino acid sequences of the present invention for the variable region of the H chain can be the sequence shown in SEQ ID NO 10, and for the variable region of the L chain can be the sequence shown in SEQ ID NO 11.

Конечно, вследствие вырожденности генетического кода, предусматриваются также вариации в последовательности нуклеиновых кислот вариабельных областей тяжелых и легких цепей, соответственно, показанных на SEQ ID NO 10 и SEQ ID NO 11, которые в результате будут давать последовательности нуклеиновых кислот, способные обеспечивать продукцию антител или их функциональных аналогов, содержащих последовательность нуклеиновых кислот вариабельной области тяжелой цепи, представленную на SEQ ID NO 8, и последовательность нуклеиновых кислот вариабельной области легкой цепи, представленную на SEQ ID NO 9.Of course, due to the degeneracy of the genetic code, variations are also provided in the nucleic acid sequence of the variable regions of the heavy and light chains, respectively, shown in SEQ ID NO 10 and SEQ ID NO 11, which will result in nucleic acid sequences capable of producing antibodies or their functional analogues containing the nucleic acid sequence of the variable region of the heavy chain shown in SEQ ID NO 8, and the nucleic acid sequence of the variable region the light chain shown in SEQ ID NO 9.

Согласно одному воплощению настоящее изобретение также относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело по настоящему изобретению или его фрагмент. Этой нуклеиновой кислотой может быть РНК, кДНК или тому подобное. Последовательность нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может быть слитой с другими последовательностями нуклеиновых кислот с получением химерного белка с помощью любой методики, известной в молекулярной биологии. Например, последовательность нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может быть слитой с нуклеиновой кислотой, кодирующей His-Tag HA-Tag участка, которая может использоваться впоследствии, например, для того, чтобы способствовать очистке антител по настоящему изобретению.According to one embodiment, the present invention also relates to a nucleic acid sequence encoding an antibody of the present invention or a fragment thereof. This nucleic acid may be RNA, cDNA, or the like. The nucleic acid sequence of the present invention can be fused to other nucleic acid sequences to produce a chimeric protein using any technique known in molecular biology. For example, the nucleic acid sequence of the present invention can be fused to a nucleic acid encoding a His-Tag HA-Tag region, which can be used subsequently, for example, to facilitate purification of the antibodies of the present invention.

Согласно другому воплощению настоящее изобретение также относится к экспрессионному вектору, содержащему последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую моноклональное антитело в соответствии с изобретением, или его фрагмент.According to another embodiment, the present invention also relates to an expression vector comprising a nucleic acid sequence encoding a monoclonal antibody of the invention, or a fragment thereof.

Такой экспрессионный вектор может использоваться для экспрессии моноклонального антитела по настоящему изобретению или его фрагмента в различных типах клеток. Такой вектор может представлять собой плазмидный или вирусный вектор. Такой вектор может иметь способность к автономной репликации в клетке-хозяине, или может быть интегрирован в геном клетки-хозяина.Such an expression vector can be used to express the monoclonal antibody of the present invention or a fragment thereof in various types of cells. Such a vector may be a plasmid or viral vector. Such a vector may have the ability to autonomously replicate in the host cell, or may be integrated into the genome of the host cell.

В качестве примера экспрессионных векторов, которые могут являться подходящими для осуществления изобретения, можно упомянуть векторы pComb3X и рА8К88.As an example of expression vectors that may be suitable for carrying out the invention, the pComb3X and pA8K88 vectors can be mentioned.

Настоящее изобретение также предусматривает экспрессию антитела по настоящему изобретению или его фрагмента с помощью различных клеток-хозяев, таких как бактерии, клетки млекопитающих (СНО или HEK293), клетки насекомых (такие как Sf9-клетки), или клетки растений (табак, томаты).The present invention also provides for the expression of an antibody of the present invention or a fragment thereof using various host cells, such as bacteria, mammalian cells (CHO or HEK293), insect cells (such as Sf9 cells), or plant cells (tobacco, tomatoes).

После экспрессии антитело по настоящему изобретению могут выделять и очищать с помощью любой известной в данной области методики. Например, антитело может экспрессироваться с His-Tag или HA-Tag, и впоследствии его могут очищать на никелевой колонке или с использованием специфического антитела, как это обычно выполняют в уровне техники.After expression, the antibody of the present invention can be isolated and purified using any technique known in the art. For example, an antibody can be expressed with His-Tag or HA-Tag, and subsequently it can be purified on a nickel column or using a specific antibody, as is usually done in the prior art.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, трансформированной последовательностью нуклеиновых кислот, кодирующей моноклональное антитело в соответствии с изобретением или его фрагмент. Клетка-хозяин может быть получена согласно любой известной технике трансформации, например электропорацией, с помощью кальциево-фосфатной техники, липофекцией, инфицированием, например, рекомбинантным вирусом. Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, трансформированной последовательностью нуклеиновых кислот, кодирующей моноклональное антитело в соответствии с изобретением или его фрагмент, с помощью электропорации в случае бактерий или с помощью липофекции в случае клеток млекопитающего (СНО - Chinese hamster ovary - (клетки) яичника китайского хомячка).Thus, the present invention also relates to a host cell transformed with a nucleic acid sequence encoding a monoclonal antibody of the invention or a fragment thereof. A host cell can be obtained according to any known transformation technique, for example, electroporation, using a calcium phosphate technique, lipofection, infection, for example, a recombinant virus. The present invention also relates to a host cell transformed with a nucleic acid sequence encoding a monoclonal antibody of the invention or a fragment thereof, by electroporation in the case of bacteria or by lipofection in the case of mammalian cells (CHO - Chinese hamster ovary - (ovary cells) Chinese hamster).

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯPHARMACEUTICAL COMPOSITION

Согласно одному воплощению настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного агента эффективное количество по меньшей мере одного агента, выбранного из антитела по изобретению или его фрагмента, в частности клона 43, вариабельной области Н-цепи по изобретению, рекомбинантного анти-ВИЧ антитела по изобретению или его фрагмента, нуклеиновой кислоты согласно изобретению, экспрессионного вектора по изобретению или клетки-хозяина по изобретению, и содержащей подходящий носитель.According to one embodiment, the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising, as an active agent, an effective amount of at least one agent selected from an antibody of the invention or a fragment thereof, in particular clone 43, an H chain variable region of the invention, a recombinant anti-HIV antibody according to the invention or its fragment, a nucleic acid according to the invention, an expression vector according to the invention or a host cell according to the invention, and containing a suitable carrier.

Согласно другому воплощению вышеописанный активный агент может использоваться для изготовления лекарственного средства, предназначенного для применения при профилактике и/или лечении ВИЧ-инфекции, и, в частности, ВИЧ-1 инфекции.According to another embodiment, the above-described active agent can be used for the manufacture of a medicament for use in the prophylaxis and / or treatment of HIV infection, and in particular HIV-1 infection.

Термин «эффективное количество» означает минимальное количество, необходимое для наблюдения ожидаемого эффекта, то есть нейтрализации ВИЧ и/или профилактики инфицирования ВИЧ. Терапевтически или профилактически эффективное количество антитела по изобретению или его фрагмента может быть определено для конкретного пациента как количество антител, необходимое пациенту для достижения терапевтического или профилактического эффекта (то есть уменьшения или предотвращения инфицирования), при снижении до минимума побочных эффектов. Эффективное количество могут измерять по уменьшению количества антигенов ВИЧ в сыворотке у индивидуума.The term "effective amount" means the minimum amount necessary to observe the expected effect, that is, neutralize HIV and / or prevent HIV infection. A therapeutically or prophylactically effective amount of an antibody of the invention or a fragment thereof can be defined for a particular patient as the amount of antibody necessary for the patient to achieve a therapeutic or prophylactic effect (i.e., reduce or prevent infection) while minimizing side effects. An effective amount can be measured by decreasing serum HIV antigens in an individual.

Служащий в качестве примера и неограничивающий диапазон терапевтически или профилактически эффективного количества антитела по изобретению или его фрагмента находится в пределах примерно от 0,1 до 100 мг/кг, более предпочтительно от 0,5 до 50 мг/кг, еще более предпочтительно от 1 до 20 мг/кг и еще более предпочтительно от 1 до 10 мг/кг.An exemplary and non-limiting range of a therapeutically or prophylactically effective amount of an antibody of the invention or fragment thereof is in the range of about 0.1 to 100 mg / kg, more preferably 0.5 to 50 mg / kg, even more preferably 1 to 20 mg / kg, and even more preferably 1 to 10 mg / kg.

Согласно другому воплощению моноклональное антитело по изобретению или его фрагмент, или фармацевтическую композицию по изобретению могут применять для пассивной иммунотерапии, путем введения индивидууму, восприимчивому к инфицированию или имеющему предполагаемый контакт с ВИЧ, терапевтически эффективного количества по меньшей мере антитела по изобретению или его фрагментов, или фармацевтической композиции по изобретению. Пассивную иммунотерапию по изобретению могут проводить у пациентов, демонстрирующих СПИД или другие вызванные ВИЧ-инфекцией состояния, или индивидуумов, имеющих риск ВИЧ-инфекции.According to another embodiment, a monoclonal antibody of the invention, or a fragment thereof, or a pharmaceutical composition of the invention can be used for passive immunotherapy by administering to a person susceptible to infection or having suspected HIV exposure, a therapeutically effective amount of at least the antibody of the invention or fragments thereof, or pharmaceutical compositions of the invention. Passive immunotherapy according to the invention can be carried out in patients showing AIDS or other conditions caused by HIV infection, or individuals at risk of HIV infection.

Согласно одному воплощению пассивную иммунотерапию по изобретению могут также проводить в профилактических целях, то есть до предполагаемого контакта с ВИЧ.According to one embodiment, passive immunotherapy according to the invention can also be carried out for prophylactic purposes, that is, before the alleged contact with HIV.

Фармацевтическую композицию по изобретению могут вводить перорально, парентерально (внутривенно или интранозально или подобным образом), локально, ректально, вагинально или подобными способами.The pharmaceutical composition of the invention may be administered orally, parenterally (intravenously or intranasally or the like), topically, rectally, vaginally or the like.

Таким образом, фармацевтическая композиция по изобретению может быть приготовлена в разных галеновых формах, таких как стерильные растворы для инъекций и впрыскиваний, дисперсии и суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы, суппозитории или крема.Thus, the pharmaceutical composition according to the invention can be prepared in various galenic forms, such as sterile injectable and injectable solutions, dispersions and suspensions, tablets, pills, powders, liposomes, suppositories or creams.

Подходящий носитель, используемый при изготовлении фармацевтической композиции по настоящему изобретению, следует подбирать в соответствии с тем, какую галенову форму требуется изготовить. Такие подходящие носители включают, но не ограничиваются, следующие вещества: воду, физиологический раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор, декстрозу, глицерин или подобные вещества, а также комбинации указанных веществ. В фармацевтическую композицию по изобретению могут также входить фармацевтически приемлемые соединения, такие как смачивающие и эмульгирующие агенты, предохранители и буферы.A suitable carrier used in the manufacture of the pharmaceutical composition of the present invention should be selected in accordance with which galenical form to be manufactured. Such suitable carriers include, but are not limited to, the following substances: water, saline, phosphate buffered saline, dextrose, glycerin or the like, and combinations thereof. Pharmaceutically acceptable compounds, such as wetting and emulsifying agents, preservatives and buffers, may also be included in the pharmaceutical composition of the invention.

Фармацевтическая композиция по изобретению может также содержать, в дополнение к активным агентам по изобретению, по меньшей мере один другой анти-ВИЧ агент, такой как антиретровирусные лекарства. Согласно другому воплощению такие дополнительные антиретровирусные лекарства могут вводить в комбинации с фармацевтической композицией по настоящему изобретению одновременно, раздельно или последовательно во времени.The pharmaceutical composition of the invention may also contain, in addition to the active agents of the invention, at least one other anti-HIV agent, such as antiretroviral drugs. According to another embodiment, such additional antiretroviral drugs can be administered in combination with the pharmaceutical composition of the present invention simultaneously, separately or sequentially in time.

В другом воплощении антитело по изобретению или его фрагмент могут быть меченными с терапевтической целью, в этом случае метящий агент может быть конъюгированным лекарственным средством или токсином, таким как радиоизотоп или радионуклид (¹³¹I, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In и подобные), коклюшный токсин, таксол, цитохалазин В, доксорубикон и тому подобное.In another embodiment, an antibody of the invention or a fragment thereof can be labeled for therapeutic purposes, in which case the labeling agent can be a conjugated drug or toxin such as a radioisotope or radionuclide ( ¹³¹ I, ⁹⁹ Tc, ¹¹¹ In and the like), pertussis toxin, taxol, cytochalazine B, doxorubicon and the like.

ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И ПРИМЕНЕНИЕDIAGNOSTIC COMPOSITION AND APPLICATION

Моноклональное антитело по изобретению или его фрагмент могут также использоваться в качестве диагностического агента в способе определения in vitro штаммов ВИЧ, в частности штаммов ВИЧ-1 в образце.The monoclonal antibody of the invention or a fragment thereof can also be used as a diagnostic agent in the method for determining in vitro strains of HIV, in particular strains of HIV-1 in a sample.

В одном воплощении способ по изобретению включает по меньшей мере следующие стадии:In one embodiment, the method of the invention comprises at least the following steps:

a) приведения образца в контакт по меньшей мере с антителом по изобретению или его фрагментом в условиях, подходящих для образования комплекса между указанным антителом или его фрагментом с белком ВИЧ, содержащим пептид, имеющий последовательность, представленную на SEQ ID NO 3, или его функциональный аналог, иa) bringing the sample into contact with at least the antibody of the invention or a fragment thereof under conditions suitable for complexing the antibody or fragment thereof with an HIV protein containing a peptide having the sequence shown in SEQ ID NO 3 or a functional analogue thereof , and

b) детекции наличия указанного комплекса.b) detecting the presence of said complex.

Детекцию комплекса могут осуществлять с помощью любого иммунологического анализа, известного в области техники.Detection of the complex can be carried out using any immunological analysis known in the art.

Такие анализы включают, но не ограничиваются указанным, радиоиммунологический анализ, вестерн-блоттинг, иммунофлюоресцентный анализ, иммуноферментный анализ (такой как ELISA), хемилюминесцентный анализ, иммуногистохимический анализ и подобные методы.Such assays include, but are not limited to, radioimmunoassay, western blotting, immunofluorescence analysis, enzyme immunoassay (such as ELISA), chemiluminescent analysis, immunohistochemical analysis and similar methods.

Дополнительно, для того чтобы облегчить детекцию, антитело по изобретению или его фрагмент могут быть маркированы с помощью детектируемого маркера. В качестве примера маркирующих агентов можно упомянуть флуоресцентные соединения, такие как флуоресцеин или родамин; ферменты, такие как пероксидаза хрена, бета-галактозидаза или люцифераза; биотин, позволяющий проводить определение посредством непрямого измерения связывания авидина или стрептавидина; или радиоактивно меченные аминокислоты, содержащие, например, радиоизотоп или радионуклид ³H, ¹⁴C или ¹²⁵I.Additionally, in order to facilitate detection, the antibody of the invention or a fragment thereof can be labeled with a detectable marker. As an example of marking agents, mention may be made of fluorescent compounds such as fluorescein or rhodamine; enzymes such as horseradish peroxidase, beta-galactosidase or luciferase; biotin, allowing determination by indirect measurement of avidin or streptavidin binding; or radioactively labeled amino acids containing, for example, a radioisotope or radionuclide ³ H, ¹⁴ C or ¹²⁵ I.

Согласно другому воплощению настоящее изобретение также относится к диагностической композиции, содержащей антитело по изобретению или его фрагмент.According to another embodiment, the present invention also relates to a diagnostic composition comprising an antibody of the invention or a fragment thereof.

Для лучшего понимания изобретения далее приведены следующие примеры.For a better understanding of the invention, the following examples are given.

Представленные примеры служат для иллюстрации изобретения и не призваны ограничивать объем изобретения никаким образом.The presented examples serve to illustrate the invention and are not intended to limit the scope of the invention in any way.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВDESCRIPTION OF GRAPHIC MATERIALS

Фиг.1: Показан иммуноблот производного белка gp41 вируса ВИЧ-1, приведенный в контакт с содержащими анти-ВИЧ-1 IgA цервикально-вагинальными выделениями устойчиво серонегативных в отношении IgG индивидуумов группы высокого риска (Highly Exposed Persistently IgG Seronegative - HEPS). В качестве позитивного контроля выполнили иммуноблот gp41-пептида с сывороткой, полученной от ВИЧ серопозитивных индивидуумов. В качестве негативного контроля осуществили тот же самый эксперимент с сывороткой, полученной от ВИЧ серонегативных индивидуумов.Figure 1: Shows the immunoblot of a derivative of the gp41 protein of the HIV-1 virus brought into contact with anti-HIV-1 IgA containing cervical-vaginal secretions of persistently high-risk IgG Seronegative (HEPS) individuals. As a positive control, an immunoblot of gp41 peptide was performed with serum obtained from HIV seropositive individuals. As a negative control, the same experiment was performed with serum obtained from HIV seronegative individuals.

Фиг.2: Представлено схематичное изображение плазмиды pComb3X, где вариабельная и константная области тяжелой и легкой цепей фрагмента Fab IgA фаговой библиотеки вставлены соответственно между сайтами рестрикции ферментов Sac 1 и Xba, и между Xho 1 и Spe 1.Figure 2: A schematic representation of the plasmid pComb3X is presented, where the variable and constant regions of the heavy and light chains of the Fab fragment of the IgA phage library are inserted respectively between the restriction sites of the Sac 1 and Xba enzymes, and between Xho 1 and Spe 1.

Фиг.3: Показано ингибирование трансцитоза ВИЧ-1 через эндометриальные НЕС-1-клетки клеточных линий выбранными клонами Fab IgA. Негативный контроль получен в результате эксперимента с неспецифичными Fab клонами, которые не распознают Р1 в анализе ELISA. Позитивный контроль выполняют при помощи 2F5 антитела IgA.Figure 3: Inhibition of HIV-1 transcytosis through endometrial HEC-1 cell lines of selected IgA Fab clones is shown. A negative control was obtained by experimenting with non-specific Fab clones that did not recognize P1 in the ELISA assay. Positive control is performed using 2F5 IgA antibodies.

Фиг.4: Показано ингибирование инфицирования вирусом ВИЧ-1 Lai2 клеток HeLa CD4+CXCR4+LTR LacZ, преинкубированных с выбранными Fab-фрагментами с концентрацией 1 нг/мл в течение 30 мин при температуре 37°С перед инкубацией с клетками в течение 1 часа при температуре 37°С. Негативный контроль (стандарт) получали без использования Fab-фрагментов или с использованием неспецифичных Fab клонов, которые не распознают Р1 в анализе ELISA. Позитивный контроль выполняют при помощи 2F5 антитела IgA.Figure 4: Inhibition of HIV-1 Lai2 infection by HeLa CD4 + CXCR4 + LTR LacZ cells preincubated with selected Fab fragments with a concentration of 1 ng / ml for 30 min at 37 ° C before incubation with cells for 1 hour is shown at a temperature of 37 ° C. A negative control (standard) was obtained without using Fab fragments or using non-specific Fab clones that do not recognize P1 in the ELISA assay. Positive control is performed using 2F5 IgA antibodies.

Фиг.5: Показана аминокислотная последовательность области, определяющей комплементарность, 3 (CDR3) (SEQ ID NO 1), а также CDR1 и CDR2 (SEQ ID NO 2 и SEQ ID NO 3) вариабельной области Н-цепи антитела по изобретению. Также показаны аминокислотные последовательности областей, определяющих комплементарность, CDR1, CDR2 и CDR3, вариабельной области L-цепи антитела по настоящему изобретению, представленные на SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 и SEQ ID NO 6. Также показана аминокислотная последовательность SEQ ID NO 7 пептида PI, соответствующая аминокислотной последовательности между положениями 649 и 684 в белке gp41 вируса ВИЧ-1.Figure 5: Shows the amino acid sequence of the complementarity determining region 3 (CDR3) (SEQ ID NO 1), as well as CDR1 and CDR2 (SEQ ID NO 2 and SEQ ID NO 3) of the H chain variable region of the antibody of the invention. The amino acid sequences of the complementarity determining regions, CDR1, CDR2 and CDR3, the variable regions of the L chain of the antibody of the present invention shown in SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 and SEQ ID NO 6 are also shown. The amino acid sequence of SEQ ID NO 7 is also shown. PI peptide corresponding to the amino acid sequence between positions 649 and 684 in the gp41 protein of HIV-1 virus.

Фиг.6А и 6В: Показана аминокислотная последовательность и последовательность нуклеиновых кислот вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO 8 и SEQ ID NO 10) и вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO 9 и SEQ ID NO 11) клона Fab 43.6A and 6B: The amino acid sequence and nucleic acid sequence of the variable region of the heavy chain (SEQ ID NO 8 and SEQ ID NO 10) and the variable region of the light chain (SEQ ID NO 9 and SEQ ID NO 11) of Fab clone 43 are shown.

Фиг.7: Представлены аминокислотные последовательности участка FR и области, определяющей комплементарность, (CDR) легкой и тяжелой цепей Fab IgA клона 43, полученные при использовании программы IMGT, доступной в сети Интернет (и разработанной M.P.Lefranc, France). IMGT/V-QUEST software (http://imgt.cines.fr).Fig. 7: Amino acid sequences of the FR region and the complementarity determining region (CDR) of Fab and IgA clone 43 light and heavy chains obtained using IMGT software available on the Internet (and developed by M.P. Lefranc, France) are presented. IMGT / V-QUEST software (http://imgt.cines.fr).

Таблица I: Представлены последовательности праймеров, используемых для синтеза ДНК, полученной от HEPS индивидуумов.Table I: Presents the sequence of primers used for the synthesis of DNA obtained from HEPS individuals.

Таблица II: Представлены последовательности праймеров, используемых для идентификации и секвенирования Fab IgA из фаг-дисплейной библиотеки.Table II: Presents the sequence of primers used for identification and sequencing of Fab IgA from the phage display library.

Пример 1Example 1

Идентификация анти-ВИЧ-1 IgA в цервикально-вагинальных выделениях устойчиво серонегативных в отношении IgG индивидуумов группы высокого риска (Highly Exposed Persistently IgG Seronegative - HEPS).Identification of anti-HIV-1 IgA in cervical-vaginal secretions of persistently seronegative IgG individuals at high risk (Highly Exposed Persistently IgG Seronegative - HEPS).

Цервикальные выделения, взятые у 56 HEPS индивидуумов из Камбоджи, тестировали на наличие секреторного IgA к гликопротеину оболочки ВИЧ. Выделения собирали после двухдневного полового воздержания с использованием 3 мл стерильного забуференного физиологического раствора с фосфатом. Образцы центрифугировали, замораживали и хранили при температуре -80°С. Загрязнение образцов спермой измеряли при помощи анализа для определения семенной жидкости (SENA; HUMANGEN FERTILITY DIAGNOSTICS, Charlottesville, VA), согласно инструкции производителя, но оптимизировав процесс увеличением времени инкубации и использованием O-фенилендиамин дигидрохлорида в качестве субстрата. Загрязненные образцы отбраковывали.Cervical secretions taken from 56 HEPS individuals from Cambodia were tested for the presence of secretory IgA to HIV membrane glycoprotein. Discharge was collected after two days of sexual abstinence using 3 ml of sterile buffered saline with phosphate. Samples were centrifuged, frozen and stored at -80 ° C. Sperm contamination of the samples was measured using a seminal fluid assay (SENA; HUMANGEN FERTILITY DIAGNOSTICS, Charlottesville, VA), according to the manufacturer's instructions, but optimizing the process by increasing the incubation time and using O-phenylenediamine dihydrochloride as a substrate. Contaminated samples were rejected.

Присутствие IgA антител, специфичных к ВИЧ, определяли при помощи вестерн-блоттинга с использованием коммерчески доступного набора (New Lav Blotl, Sanofi-Pasteur, France) и с последовательностью действий согласно инструкции производителя. Среди тестируемых образцов, 22 имели высокий уровень содержания секреторного IgA (S-IgA) против белка оболочки ВИЧ gp41 (Фиг.1).The presence of HIV-specific IgA antibodies was determined by western blotting using a commercially available kit (New Lav Blotl, Sanofi-Pasteur, France) and with the sequence of actions according to the manufacturer's instructions. Among the tested samples, 22 had a high level of secretory IgA (S-IgA) against the HIV gp41 sheath protein (Figure 1).

Пример 2Example 2

Составление комбинаторной фаг-дисплейной библиотеки, выражающей Fob-фрагмент IgA.Compilation of a combinatorial phage display library expressing the Fob fragment of IgA.

Для конструирования комбинаторной фаг-дисплейной библиотеки, экспрессирующей Fab-фрагмент IgA использовали В клетки слизистой оболочки, взятые у 22 HEPS индивидуумов из примера 1.To construct a combinatorial phage display library expressing the Fab fragment of IgA, B cells of the mucosa were taken from 22 HEPS individuals from Example 1.

Тотальную РНК получали из обогащенной популяции В-клеток цервикально-вагинальных выделений 22 HEPS пациентов с использованием стандартных методик. Тотальную РНК (60 мкг) очищали от цервикальных В-клеток на единственной быстрой стадии выделения РНК с помощью гуанидин изотиацианата/фенолхлороформа (Chomczynski & Sacchi, Anal. Biochem., 1987, 162: 156-9). Эту тотальную РНК трансформировали в комплементарную ДНК (кДНК) с использованием полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (RT-PCR). Полученную библиотеку ДНК амплифицировали с использованием специфических праймеров к Fab-фрагменту IgA слизистой оболочки, представленных в таблице I.Total RNA was obtained from an enriched population of b-cells of cervical-vaginal secretions of 22 HEPS patients using standard techniques. Total RNA (60 μg) was purified from cervical B cells in a single rapid RNA isolation step with guanidine isothiocyanate / phenol chloroform (Chomczynski & Sacchi, Anal. Biochem., 1987, 162: 156-9). This total RNA was transformed into complementary DNA (cDNA) using reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). The resulting DNA library was amplified using specific primers for the mucosal IgA Fab fragment shown in Table I.

Легкую цепь (L) амплифицированной ДНК затем подвергали рестрикции Sac I и Xba 1, а тяжелую цепь (Н) - Xho 1 и Spe 1 и продукты рестрикции вставляли в вектор pComb3X (Barbas и др., Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88:7978-82), подвергнутый рестрикции тем же ферментом. Подвергнутый рестрикции вектор и подвергнутый рестрикции продукт RT-PCR лигировали с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (4 вставки плюс 1 вектор плюс Т4ДНК-лигаза, в течение ночи при температуре 14°С) (Фиг.2). Полученные рекомбинантные плазмиды затем использовали для трансформации бактерии E.coli (pilus+, муж) TG1 посредством электропорации.The light chain (L) of the amplified DNA was then subjected to restriction by Sac I and Xba 1, and the heavy chain (H) by Xho 1 and Spe 1 and restriction products were inserted into the pComb3X vector (Barbas et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88 : 7978-82), subjected to restriction by the same enzyme. The restriction vector and restriction product RT-PCR were ligated using T4 phage DNA ligase (4 inserts plus 1 vector plus T4DNA ligase overnight at 14 ° C) (Figure 2). The resulting recombinant plasmids were then used to transform E. coli bacteria (pilus +, male) TG1 by electroporation.

Библиотеку антитела кДНК в культуре после трансформации бактерии затем экспрессировали в бактериофаге путем суперинфекции при помощи фага-помощника VCS-M13 (10¹² бляшкообразующих единиц) (Stratagen, La Jolla, CA).The culture cDNA antibody library after transformation of the bacterium was then expressed in the bacteriophage by superinfection using the helper phage VCS-M13 (10 ¹² plaque-forming units) (Stratagen, La Jolla, CA).

Препарат фага затем собирали. Фаги осаждали, добавляя 20% (мас./объем) полиэтиленгликоля 8000 и 2,5 М р-ра NaCl с последующей инкубацией на льду в течение одного часа. После центрифугирования бляшки фагов ресуспендировали в забуференном физиологическом растворе с фосфатом и микроцентрифугировали в течение нескольких минут с получением дербиса бляшек.The phage preparation was then collected. The phages were besieged by adding 20% (wt./volume) of polyethylene glycol 8000 and 2.5 M solution of NaCl, followed by incubation on ice for one hour. After centrifugation, the phage plaques were resuspended in phosphate buffered saline and microcentrifuged for several minutes to obtain plaque derbis.

Рестрикционный анализ отдельных клонов показал, что приблизительно 35% фагов содержали Fab-фрагмент IgA и что титр библиотеки, как правило, был близок к 10⁷ бляшкообразующих единиц/мл и она содержала 10⁷ различных клонов.Restriction analysis of individual clones showed that approximately 35% of the phages contained a Fab fragment of IgA and that the library titer was typically close to 10 ⁷ plaque forming units / ml and it contained 10 ⁷ different clones.

Пример 3Example 3

Скрининг библиотеки фага Fab-фрагмента белка IgA на пептид Р1 (последовательность №7)Screening a phage library of a Fab fragment of an IgA protein for P1 peptide (sequence No. 7)

Фаг-дисплейную библиотеку Fab-фрагмента IgA подвергают скринингу посредством микропэннинга, при котором концентрация антигена была варьирующим условием в каждом цикле. Антиген, используемый для скрининга, представлял собой пептид P1 (Alfsen & Bomsel, 2002, J. Biol. Chem., 277: 25649-59; получен от Eurogentec, Бельгия). Начальное количество пептида Р1 составляло 20 мкг, количество делили на 2 в каждом цикле и в конечном итоге количество составляло 2,5 мкг в четвертом цикле.The phage display library of the IgA Fab fragment is screened by micropanning, in which the antigen concentration was a variable condition in each cycle. The antigen used for screening was the P1 peptide (Alfsen & Bomsel, 2002, J. Biol. Chem., 277: 25649-59; obtained from Eurogentec, Belgium). The initial amount of P1 peptide was 20 μg, the amount was divided by 2 in each cycle, and ultimately the amount was 2.5 μg in the fourth cycle.

Гнезда пластин 96 (Exiqon peptide Immobilirez, 10202-111-10) покрывали 125 микромоль пептида Р1, что представляет собой концентрацию, при которой он находится в димерной форме, после чего блокировали бычьим сывороточным альбумином (BSA - bovine serum albumin) в течение 2 часов при температуре 37°С. Концентрированные фаги, полученные из библиотеки, затем наносили на лунки в количестве 10¹²-10¹³ бляшкообразующих единиц в течение 2 часов при температуре 37°С. Несвязанные фаги удаляли интенсивным промыванием: на первом и втором цикле селекции промывали 10 раз забуференным физиологическим раствором с фосфатом, содержащим 0,1% Tween-20, затем в течение 10 мин забуференным физиологическим раствором с фосфатом для удаления детергента. На последующих циклах селекции промывание проводили 20 раз забуференным физиологическим раствором с фосфатом, содержащим 0,1% Tween-20, затем 20 раз забуференным физиологическим раствором с фосфатом. Специфическое элюирование фагов, несущих эпитопы поверхностного Fab-фрагмента, связывающего Р1, проводили путем обработки 0,1 М раствора глицин-HCl, с рН, поддерживаемым на уровне 2,2, в течение 10 мин. Элюат немедленно нейтрализовали и использовали для инфицирования 2 мл свежих бактериальных культур Е. coli TG1 (OD₆₀₀=1). Бактерии инкубировали при 30°С в течение 30 минут, объем культуры увеличивали и культуру инкубировали при 37°С в шейкере в течение 1 часа и после этого добавляли 1012 бляшкообразующих единиц/мл VCS-M13 фага-помощника для получения рекомбинантного фага. Элюированные фаги амплифицировались между каждым циклом пэннинга.Plate 96 nests (Exiqon peptide Immobilirez, 10202-111-10) were coated with 125 micromoles of P1 peptide, which is the concentration at which it is in dimeric form, and then blocked with bovine serum albumin (BSA - bovine serum albumin) for 2 hours at a temperature of 37 ° C. Concentrated phages obtained from the library were then applied to the wells in an amount of 10 ¹² -10 ¹³ plaque-forming units for 2 hours at 37 ° C. Unbound phages were removed by intensive washing: in the first and second rounds of selection, they were washed 10 times with buffered saline with phosphate containing 0.1% Tween-20, then for 10 min with buffered saline with phosphate to remove detergent. In subsequent selection cycles, washing was carried out 20 times with buffered saline with phosphate containing 0.1% Tween-20, then 20 times with buffered saline with phosphate. Specific elution of phages carrying epitopes of the surface Fab fragment binding to P1 was carried out by treating a 0.1 M glycine-HCl solution with a pH maintained at 2.2 for 10 minutes. The eluate was immediately neutralized and used for infection with 2 ml of fresh bacterial cultures of E. coli TG1 (OD ₆₀₀ = 1). Bacteria were incubated at 30 ° C for 30 minutes, the culture volume was increased and the culture was incubated at 37 ° C in a shaker for 1 hour, and then 1012 plaque-forming units / ml of VCS-M13 helper phage were added to obtain a recombinant phage. Eluted phages amplified between each panning cycle.

После пэннинга отдельные клоны из четырех циклов выращивали и присутствие Fab-фрагмента определяли с помощью полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров, представленных в таблице II, которые гибридизуются с вектором в 3'-5' направлении и 5'-3' направлении тяжелой и легкой цепи Fab-фрагмента. Клоны, содержащие Fab-фрагмент белка IgA, переводили в растворимый Fab-фрагмент путем трансформации ими штамма Е. coli, не несущего амбер-супрессор, и определяли последовательность вариабельных областей тяжелой (Н) и легкой (L) цепи с использованием программного обеспечения IMGT/V-Quest (Фиг.7).After panning, individual clones from four cycles were grown and the presence of the Fab fragment was determined by polymerase chain reaction using specific primers shown in table II, which hybridize with the vector in the 3'-5 'direction and 5'-3' direction of heavy and light chain Fab fragment. Clones containing the Fab fragment of the IgA protein were converted to a soluble Fab fragment by transforming them with an E. coli strain that did not carry an amber suppressor, and the sequence of the variable regions of the heavy (H) and light (L) chains was determined using the IMGT / software V-Quest (Fig. 7).

Секвенирование генов иммуноглобулина.Sequencing of immunoglobulin genes.

Секвенирование проводили с использованием автоматического секвенатора ДНК с набором реактивов, содержащих флуоресцентно меченные дидезоксинуклеотиды, выступающие в качестве терминаторов, для циклической реакции Taq секвенирования (Applied Biosystems). Двунитевую ДНК получали из бактерий и проводили секвенирование с использованием набора праймеров (см. таблица II), которые специфически связываются с вектором pComb3X в направлениях 3'-5' и 5'-3' каждой цепи Fab-фрагменга.Sequencing was performed using an automatic DNA sequencer with a set of reagents containing fluorescently labeled dideoxynucleotides acting as terminators for cyclic Taq sequencing reaction (Applied Biosystems). Double-stranded DNA was obtained from bacteria and sequenced using a set of primers (see table II) that specifically bind to the pComb3X vector in the directions 3'-5 'and 5'-3' of each chain of the Fab fragment.

На фиг.6 показаны результаты секвенирования вариабельных областей Н и L цепей клона 43 (SEQ ID NO 10 и SEQ ID NO 11).6 shows the results of sequencing of the variable regions H and L of the chains of clone 43 (SEQ ID NO 10 and SEQ ID NO 11).

На фиг.7 показана идентификация последовательностей соответствующих аминокислот областей, определяющих комплементарность, с использованием программного обеспечения IMGT.7 shows the identification of the sequences of the corresponding amino acids of the complementarity determining regions using IMGT software.

Вектор, используемый для клонирования, несет амбер-кодон между теговыми последовательностями (His-tag и HA-tag), а фаговый белок pIII обеспечивает возможность как получения антитела, слитого с белком оболочки фага, с использованием супрессорного штамма Е. coli, например TG1, так и получения растворимых антител при экспрессии вектора в несупрессорных штаммах, таких как ТОР10. Принимая во внимание это преимущество, ДНК фага использовали для трансформации ТОР-10 Е. coli (штамм, не имеющий суппрессорного амбер-кодона) для экспрессии растворимого Fab-фрагмента без слитого белка pIII. Экспрессию Fab-фрагмента индуцировали с помощью 1 мМ раствора изопропил b-D-тиогалактопиранозида (IPTG).The vector used for cloning carries an amber codon between tag sequences (His-tag and HA-tag), and phage protein pIII allows both the production of an antibody fused to the phage coat protein using the E. coli suppressor strain, for example TG1, and obtaining soluble antibodies by expression of the vector in non-suppressor strains, such as TOP 10. Given this advantage, phage DNA was used to transform E. coli TOP-10 (a strain lacking a suppressor amber codon) to express a soluble Fab fragment without pIII fusion protein. Fab fragment expression was induced using a 1 mM isopropyl b-D-thiogalactopyranoside (IPTG) solution.

Для крупномасштабной экспрессии моноклонального антитела по настоящему изобретению весь оперон переносили из pComb3X на вектор pASK88 (SkereA., Gene, 1994, 151(1-2): p.131-5; Skerra A., Gene, 1994, 141(1): p.79-84; Skerra А., и др., Biotechnology (NY), 1991. 9(3), р.273-8; Skerra A. & A. Pluckthun, Protein Eng, 1991, 4(8): p.971-9). Fab-фрагмент ДНК моноклонального антитела по настоящему изобретению амплифициовали с помощью специфических праймеров, вносящих сайты рестрищии, необходимые для субклонирования в pASK88 вектор. Продукты амплификации очищали электрофорезом в агарозном геле и разрезали рестрикционными ферментами PstI и NcoI в случае тяжелой цепи и SacI и HihdIII в случае легкой цепи. Фрагмент Fd (VH-CH1) и гены легкой цепи (VL-С1) отдельно друг от друга вставляли и лигировали в pASK88, расщепленный теми же рестрикционными ферментами по стандартным протоколам. Концевые молекулы трансформировали в термокомпетентные бактериальные клетки JM83 (предоставлены Dr. Skerra) и высевали для разделения индивидуальных клонов. Плазмидную ДНК нескольких клонов анализировали с помощью рестрикционного анализа и, в некоторых случаях, с помощью секвенирования двунитевой ДНК с использованием специфических праймеров.For large-scale expression of the monoclonal antibody of the present invention, the entire operon was transferred from pComb3X to pASK88 vector (SkereA., Gene, 1994, 151 (1-2): p.131-5; Skerra A., Gene, 1994, 141 (1): p. 79-84; Skerra A., et al., Biotechnology (NY), 1991. 9 (3), p. 278-8; Skerra A. & A. Pluckthun, Protein Eng, 1991, 4 (8): p. 971-9). The Fab fragment of the monoclonal antibody DNA of the present invention was amplified using specific primers introducing restriction sites necessary for subcloning into the pASK88 vector. Amplification products were purified by agarose gel electrophoresis and cut with restriction enzymes PstI and NcoI in the case of the heavy chain and SacI and HihdIII in the case of the light chain. The Fd fragment (VH-CH1) and light chain genes (VL-C1) were separately inserted and ligated into pASK88 digested with the same restriction enzymes according to standard protocols. The terminal molecules were transformed into thermocompetent JM83 bacterial cells (provided by Dr. Skerra) and plated to separate individual clones. Plasmid DNA of several clones was analyzed by restriction analysis and, in some cases, by sequencing double-stranded DNA using specific primers.

Экспрессионный вектор pASK88 разработали для удобного клонирования вариабельного домена генов иммуноглобулина и для периплазматической серкеции соответствующих Fab-фрагментов бактерией Escherichia coli. Экспрессию в данной плазмиде контролировал тетрациклиновый промотор.The expression vector pASK88 was developed for convenient cloning of the variable domain of immunoglobulin genes and for periplasmic serration of the corresponding Fab fragments with Escherichia coli bacterium. The expression in this plasmid was controlled by the tetracycline promoter.

С использованием этого вектора получили большое количество антител по настоящему изобретению. Препаративную экспрессию проводили в масштабе одного литра с использованием Е. coli (К-12 JM83) в качестве хозяйской клетки для экспрессии. Клетки выращивали до середины логарифмического роста и экспрессию Fab-фрагмента стимулировали 0,2 мг/л ангидротетрациклина в течение 4 час.Using this vector, a large number of antibodies of the present invention were obtained. Preparative expression was performed on a single liter scale using E. coli (K-12 JM83) as the host cell for expression. Cells were grown to mid-log growth, and expression of the Fab fragment was stimulated with 0.2 mg / L anhydrotetracycline for 4 hours.

Очистку моноклональных антител по настоящему изобретению проводили путем взаимодействия с His-tag на вращающихся колонках Ni-NTA (Qiagen). Стерильно фильтрованную периплазматическую фракцию наносили на колонки и для сбора образцов использовали градиент 250-500 мМ имидазола в хроматографическом буфере.The monoclonal antibodies of the present invention were purified by reaction with His-tag on rotating Ni-NTA columns (Qiagen). The sterile filtered periplasmic fraction was applied to the columns, and a gradient of 250-500 mM imidazole in chromatographic buffer was used to collect the samples.

Пример 4Example 4

Твердофазный иммуноферментный анализ, проведенный на растворимых клонах Fab-фрагментов IgA из фаг-дисплейной библиотеки.Enzyme-linked immunosorbent assay carried out on soluble clones of IgA Fab fragments from the phage display library.

Твердофазный иммуноферментный анализ осуществляли на растворимых Fab-фрагментах IgA, полученных из TOP10F' бактерий (система pComb3x) и с растворимыми IgA Fab, полученными из К-12 JM83 бактерий (система pASK88).Enzyme-linked immunosorbent assay was performed on soluble IgA Fab fragments obtained from TOP10F 'bacteria (pComb3x system) and with soluble IgA Fab obtained from K-12 JM83 bacteria (pASK88 system).

Гнезда пластинок (Exiqon peptide Immobilized, 10202-111-10 или NUNC, 439454) покрывали пептидом Р1 (последовательность аминокислот 649-684 белка gp41 вируса ВИЧ-1) и блокировали BSA в течение 2 часов при температуре 37°С. Затем добавляли очищенный IgA в количестве 2 нг/мл и инкубировали 2 часа при температуре 37°С. Детекцию проводили с помощью мышиного анти-На (клон 12СА5, Roche) или анти-His антитела (PentaHis, Qiagen 34660) с последующей обработкой антимышным антителом козы, конъюгированным с пероксидазой хрена (Caltag Laboratories, H1003). Ферментативную реакцию осуществляли при добавлении триметилбензола (3,3',5,5'-тетраметил-бензидин, Kikergaad & Perry Laboratories Inc.) в качестве субстрата и абсорбцию измеряли при 450 нм после добавления 1 М раствора фосфорной кислоты с использованием ELISA ридера. Позитивный контроль представлял собой 2F5 антитела, а негативный контроль представлял собой клон, полученный после пэннинга, который не распознает Р1 в анализе ELISA.Plate nests (Exiqon peptide Immobilized, 10202-111-10 or NUNC, 439454) were coated with peptide P1 (amino acid sequence 649-684 of the HIV-1 virus gp41 protein) and blocked with BSA for 2 hours at 37 ° C. Then added purified IgA in an amount of 2 ng / ml and incubated for 2 hours at a temperature of 37 ° C. Detection was performed using mouse anti-On (clone 12CA5, Roche) or anti-His antibody (PentaHis, Qiagen 34660), followed by treatment with goat anti-mouse antibody conjugated to horseradish peroxidase (Caltag Laboratories, H1003). The enzymatic reaction was carried out by adding trimethylbenzene (3.3 ', 5.5'-tetramethylbenzidine, Kikergaad & Perry Laboratories Inc.) as a substrate, and absorbance was measured at 450 nm after addition of a 1 M phosphoric acid solution using an ELISA reader. The positive control was a 2F5 antibody, and the negative control was a clone obtained after panning that does not recognize P1 in the ELISA assay.

Пример 5Example 5

Подавление трансцитозаTranscytosis suppression

Трансцитоз ВИЧ-1 через эпителиальные клетки и нейтрализацию трансцитоза антителами выполняли на линии интестинальных клеток НЕС-1, которые выращивали в виде плотного, поляризованного монослоя в течение 7 дней на проницаемой фильтровальной подложке (размер пор 0,45 мкм), образующей границу между двумя независимыми камерами, верхняя из которых омывала апискальную (люминальную) поверхность эпителиального монослоя, а нижняя омывала базолатеральную (серозную) поверхность. Мононуклеары периферической крови получали и обрабатывали как описано у Lagaye и др. (J. Virol, 2001, 75:4780). После этого мононуклеары периферической крови активировали фитогемагглютинином (фГа) в течение 48 часов и инокулировали ВИЧ-1 JRCSF клоном R5 или YU2 и использовали на 7-ой день после инфекции. Очищенный S-IgA (5 нг/мл) добавляли в апикальную камеру и инкубировали в течение 10 мин при температуре 37°С. Для инициирования трансцитоза вируса в апикальную камеру добавляли 2,16⁶ ВИЧ-1 позитивных мононуклеаров периферической крови. Контакт между ВИЧ-1 позитивными мононуклеарами периферической крови и монослоем эпителиальных клеток приводит к быстрому прорастанию ВИЧ-1 вирионов, с их последующим трансцитозом из апикального в базолатеральный полюс эпителиальных клеток. Спустя 2 часа ингибирование трансцитоза антителами определяли путем детекции белка р24 вируса ВИЧ в базолатеральной среде способом твердофазного иммуноферментного анализа (Coulter, France или PASTEUR SANOFI, FRANCE). Уровень белка р24 в отсутствии антитела или в присутствии неспецифичного к Р1 Fab-фрагмента или в присутствии контрольного IgA 2F5 измеряли как негативный и позитивный контроль со значениями в 100, 98 и 35% соответственно. Значение негативного контроля принимали за 100% трансцитоз и использовали для представления результатов.HIV-1 transcytosis through epithelial cells and neutralization of transcytosis by antibodies was performed on the NES-1 intestinal cell line, which was grown as a dense, polarized monolayer for 7 days on a permeable filter substrate (pore size 0.45 μm), forming the boundary between two independent cameras, the upper of which washed the apiscal (luminal) surface of the epithelial monolayer, and the lower washed the basolateral (serous) surface. Peripheral blood mononuclear cells were obtained and processed as described by Lagaye et al. (J. Virol, 2001, 75: 4780). After that, peripheral blood mononuclear cells were activated with phytohemagglutinin (pha) for 48 hours and inoculated with HIV-1 JRCSF clone R5 or YU2 and used on the 7th day after infection. Purified S-IgA (5 ng / ml) was added to the apical chamber and incubated for 10 min at 37 ° C. To initiate viral transcytosis, 2.16 ⁶ HIV-1 positive peripheral blood mononuclear cells were added to the apical chamber. Contact between HIV-1 positive peripheral blood mononuclear cells and a monolayer of epithelial cells leads to the rapid germination of HIV-1 virions, with their subsequent transcytosis from the apical to the basolateral pole of epithelial cells. After 2 hours, the inhibition of transcytosis by antibodies was determined by detecting the HIV p24 protein in basolateral medium by enzyme-linked immunosorbent assay (Coulter, France or PASTEUR SANOFI, FRANCE). The level of p24 protein in the absence of an antibody or in the presence of a Fab fragment non-specific for P1 or in the presence of a control IgA 2F5 was measured as a negative and positive control with values of 100, 98 and 35%, respectively. The value of the negative control was taken as 100% transcytosis and used to present the results.

Эксперименты проводили в виде в трех независимых экспериментов. Результаты позволили идентифицировать 3 клона, которые были способны ингибировать трансцитоз вируса ВИЧ более чем на 50%, в том числе, клоны 43 и 44 (Фиг.3).The experiments were performed as three independent experiments. The results allowed us to identify 3 clones that were able to inhibit HIV virus transcytosis by more than 50%, including clones 43 and 44 (Figure 3).

Пример 6Example 6

Подавление инфицирования ВИЧSuppressing HIV infection

ВИЧ-1 Lai2 проинкубировали с выбранными Fab-фрагментами в концентрации 1 нг/мл в течение 30 мин при температуре 37°С перед инкубацией с клетками HeLa CD4+CXCR4+LTR LacZ (Dragic и др., 1992, J. Virol., 66:4794-4802) в течение 1 часа при температуре 37°С. Несвязавшийся вирус удаляли промыванием клеток два раза перед инкубацией в течение 36 часов при температуре 37°С. Клетки анализировали на содержание ВИЧ путем измерения бета-галактозидазной активности в выделенных клетках при помощи CPRG субстрата и колориметрических измерений. Негативный контроль осуществляли без использования Fab-фрагментов или с использованием неспецифичных Fab клонов, которые не распознают Р1 в анализе ELISA.HIV-1 Lai2 was incubated with selected Fab fragments at a concentration of 1 ng / ml for 30 min at 37 ° C before incubation with HeLa CD4 + CXCR4 + LTR LacZ cells (Dragic et al., 1992, J. Virol., 66 : 4794-4802) for 1 hour at a temperature of 37 ° C. Unbound virus was removed by washing the cells twice before incubation for 36 hours at 37 ° C. Cells were analyzed for HIV by measuring beta-galactosidase activity in isolated cells using CPRG substrate and colorimetric measurements. Negative control was carried out without using Fab fragments or using non-specific Fab clones that did not recognize P1 in the ELISA assay.

Результаты, представленные на Фиг.3, представляют собой среднее по меньшей мере двух независимых экспериментов, каждый из которых был выполнен дважды.The results presented in FIG. 3 are the average of at least two independent experiments, each of which was performed twice.

Результаты позволили идентифицировать 5 клонов, способных ингибировать инфицирование CD4+ клеток ВИЧ-1 более чем на 75% или более чем на 95% (Фиг.4). Среди этих клонов два клона были также способны подавлять трансцитоз ВИЧ - это были клоны 43 и 44 (см. пример 4).The results allowed the identification of 5 clones capable of inhibiting CD4 + infection of HIV-1 cells by more than 75% or more than 95% (Figure 4). Among these clones, two clones were also able to suppress HIV transcytosis - these were clones 43 and 44 (see example 4).

Claims

1. Anti-HIV monoclonal antibody or its functional fragment recognizing a peptide having the sequence shown in SEQ ID NO 7 or its analogue, where the complementarity determining region 3 (CDR3) of the variable region of its H- (heavy) chain contains the amino acid sequence presented on SEQ ID NO 1, or its functional analogue.

2. The monoclonal antibody or its functional fragment according to claim 1, characterized in that the variable region of its H chain contains at least one CDR selected from CDR1 and CDR2 having, respectively, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 2 and SEQ ID NO 3, or their functional analogs.

3. The monoclonal antibody or its functional fragment according to claim 1, characterized in that it contains a variable region of the L- (light) chain containing at least one CDR selected from CDR1, CDR2 and CDR3 having, respectively, an amino acid sequence, presented on SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 and SEQ ID NO 6, or functional analogues thereof.

4. The monoclonal antibody or its functional fragment according to claim 1, characterized in that it is an IgA.

5. The monoclonal antibody or its functional fragment according to claim 1, characterized in that it is a human antibody.

6. The monoclonal antibody or its functional fragment according to claim 1, characterized in that the variable region of the heavy chain has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 8, and the variable region of the light chain has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 9.

7. The monoclonal antibody or its functional fragment according to claim 1, characterized in that the neutralizable HIV is a strain of HIV-1.

8. The variable region of the H chain recognizing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 7, or its analogue, where the CDR 3 of the indicated variable region of the H chain contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO 1, or its functional analogue.

9. The variable region of the H chain of claim 8, characterized in that it contains at least one CDR selected from CDR1 and CDR2 having, respectively, the amino acid sequences shown in SEQ ID NO 2 and SEQ ID NO 3, or their functional counterparts.

10. Recombinant anti-HIV antibody or its functional fragment, where it contains the variable region of the H chain of claim 8.

11. The nucleic acid molecule encoding a monoclonal antibody or its functional fragment according to claim 1.

12. The nucleic acid molecule according to claim 11, characterized in that the sequence of the variable region of the heavy chain is presented on SEQ ID NO 10, and the sequence of the variable region of the light chain is presented on SEQ ID NO 11.

13. The expression vector containing the nucleic acid sequence according to item 12.

14. A host cell transformed with a nucleic acid molecule according to claim 11 or 12 or a vector according to claim 13 and intended for expression of the antibody or its functional fragment according to claim 1.

15. Anti-HIV pharmaceutical composition containing as an active agent an effective amount of an agent selected from an antibody or a functional fragment of claim 1, a nucleic acid molecule of claim 11, a vector of claim 13, or a host cell of claim 14 , and a suitable medium.

16. The use of an antibody or its functional fragment according to claim 1, or a nucleic acid molecule according to claim 11, or a vector according to claim 13, or a host cell according to 14 for the manufacture of a medicament for use in prophylaxis and / or treating HIV infection.

17. A method for determining in vitro strains of HIV in a sample, comprising at least a step:
a) bringing the sample into contact with at least the antibody or its functional fragment according to claim 1 under conditions suitable for the formation of a complex between the specified antibody or its functional fragment with an HIV protein containing a peptide having the amino acid sequence shown on SEQ ID NO 7, or its analogue, and
b) detecting the presence of the specified complex.

18. A method for conducting passive immunotherapy of an individual susceptible to HIV infection, comprising administering to said individual a therapeutically effective amount of at least the antibody or its functional fragment according to claim 1.