RU2369874C2 - Method of multiocular sclerosis diagnostics - Google Patents
Method of multiocular sclerosis diagnostics Download PDFInfo
- Publication number
- RU2369874C2 RU2369874C2 RU2005105699/15A RU2005105699A RU2369874C2 RU 2369874 C2 RU2369874 C2 RU 2369874C2 RU 2005105699/15 A RU2005105699/15 A RU 2005105699/15A RU 2005105699 A RU2005105699 A RU 2005105699A RU 2369874 C2 RU2369874 C2 RU 2369874C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- glc
- antibodies
- antibodies against
- antibody
- glcnac
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 73
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 title abstract 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 28
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 23
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 14
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 146
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 54
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 51
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 49
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 48
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims description 33
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 claims description 32
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 claims description 32
- OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N N-acetyl-D-galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N 0.000 claims description 19
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims description 19
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 claims description 18
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N aldehydo-L-rhamnose Chemical compound C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N 0.000 claims description 13
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 claims description 13
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 12
- CDOJPCSDOXYJJF-CBTAGEKQSA-N N,N'-diacetylchitobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC(=O)C)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CDOJPCSDOXYJJF-CBTAGEKQSA-N 0.000 claims description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 9
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 claims description 9
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 9
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 claims description 7
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 claims description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 6
- 108010072051 Glatiramer Acetate Proteins 0.000 claims description 5
- FHEAIOHRHQGZPC-KIWGSFCNSA-N acetic acid;(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid;(2s)-2-aminopentanedioic acid;(2s)-2-aminopropanoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound CC(O)=O.C[C@H](N)C(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 FHEAIOHRHQGZPC-KIWGSFCNSA-N 0.000 claims description 4
- 229960003776 glatiramer acetate Drugs 0.000 claims description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 4
- 238000012800 visualization Methods 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-DVKNGEFBSA-N alpha-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-DVKNGEFBSA-N 0.000 claims 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 118
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 208000007718 Stable Angina Diseases 0.000 description 22
- 208000007814 Unstable Angina Diseases 0.000 description 19
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 17
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 15
- 206010002388 Angina unstable Diseases 0.000 description 12
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 12
- 201000004332 intermediate coronary syndrome Diseases 0.000 description 12
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 12
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 11
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 11
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 11
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 10
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- FHIVAFMUCKRCQO-UHFFFAOYSA-N diazinon Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC(C)=NC(C(C)C)=N1 FHIVAFMUCKRCQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 9
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 9
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 206010003211 Arteriosclerosis coronary artery Diseases 0.000 description 6
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 6
- 238000003491 array Methods 0.000 description 6
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 6
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 6
- 208000026758 coronary atherosclerosis Diseases 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 6
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 5
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 5
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 208000004476 Acute Coronary Syndrome Diseases 0.000 description 4
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 4
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 4
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 4
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical group O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 4
- 102000036675 Myoglobin Human genes 0.000 description 4
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 4
- 102000004903 Troponin Human genes 0.000 description 4
- 108090001027 Troponin Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactopyranuronic acid Natural products OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1O AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091006004 biotinylated proteins Proteins 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000002586 coronary angiography Methods 0.000 description 4
- 238000003066 decision tree Methods 0.000 description 4
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 4
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 3
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 230000009266 disease activity Effects 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 3
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- 206010008479 Chest Pain Diseases 0.000 description 2
- 206010071068 Clinically isolated syndrome Diseases 0.000 description 2
- 108010005716 Interferon beta-1a Proteins 0.000 description 2
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 2
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 2
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 2
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000003210 demyelinating effect Effects 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- -1 glucose oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 2
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- FGRBYDKOBBBPOI-UHFFFAOYSA-N 10,10-dioxo-2-[4-(N-phenylanilino)phenyl]thioxanthen-9-one Chemical compound O=C1c2ccccc2S(=O)(=O)c2ccc(cc12)-c1ccc(cc1)N(c1ccccc1)c1ccccc1 FGRBYDKOBBBPOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003343 Antiphospholipid Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010005714 Interferon beta-1b Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 101000716700 Mesobuthus martensii Toxin BmKT Proteins 0.000 description 1
- 208000019695 Migraine disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- QIGJYVCQYDKYDW-SDOYDPJRSA-N alpha-D-galactosyl-(1->3)-D-galactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](CO)OC(O)[C@@H]1O QIGJYVCQYDKYDW-SDOYDPJRSA-N 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 208000037979 autoimmune inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 229940003504 avonex Drugs 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-CSHPIKHBSA-N beta-cellotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-CSHPIKHBSA-N 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229940038717 copaxone Drugs 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- PIDANAQULIKBQS-RNUIGHNZSA-N meprednisone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1C[C@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)CC2=O PIDANAQULIKBQS-RNUIGHNZSA-N 0.000 description 1
- 229960001810 meprednisone Drugs 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 206010027599 migraine Diseases 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000003007 myelin sheath Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 210000001328 optic nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 229940038850 rebif Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 208000002670 vitamin B12 deficiency Diseases 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Данное изобретение в общем относится к способу диагностики рассеянного склероза и, более конкретно, к способу диагностики рассеянного склероза путем измерения уровней антител к гликанам в биологическом образце.The present invention generally relates to a method for diagnosing multiple sclerosis and, more specifically, to a method for diagnosing multiple sclerosis by measuring levels of anti-glycan antibodies in a biological sample.
Уровень техники изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION
Рассеянный склероз (РС) представляет собой хроническое аутоиммунное воспалительное заболевание центральной нервной системы. Оно является обычной причиной постоянной нетрудоспособности молодых взрослых людей. У пациентов, страдающих от РС, иммунная система разрушает миелиновую оболочку аксонов в головном и спинном мозге, вызывая различные неврологические патологии. В наиболее распространенной форме РС, рецидивирующей с ремиссиями, за эпизодами острого ухудшения функции нервной системы (обострения, атаки) следуют периоды частичного или полного восстановления (ремиссии), во время которых заболевание не прогрессирует (стабильное состояние). Имеются сообщения, что девяносто процентов пациентов с РС вначале характеризовались клинически изолированным синдромом вследствие воспалительного демиелинизирующего повреждения зрительного нерва, ствола головного мозга или спинного мозга. Примерно тридцать процентов из таких пациентов с клинически изолированным синдромом прогрессируют до клинически определенного РС в течение 12 месяцев после проявления синдрома. Последующее прогрессирование может существенно изменяться от пациента к пациенту. Прогрессирование может варьировать от доброкачественного течения до классического рецидивирующего с ремиссиями, хронического прогрессирующего или редкого молниеносного течения.Multiple sclerosis (MS) is a chronic autoimmune inflammatory disease of the central nervous system. It is a common cause of permanent disability of young adults. In patients suffering from MS, the immune system destroys the axial myelin sheath in the brain and spinal cord, causing various neurological pathologies. In the most common form of MS recurring with remissions, episodes of acute deterioration of the nervous system function (exacerbation, attack) are followed by periods of partial or complete recovery (remission) during which the disease does not progress (stable state). There are reports that ninety percent of patients with MS initially had a clinically isolated syndrome due to inflammatory demyelinating damage to the optic nerve, brain stem, or spinal cord. About thirty percent of these patients with clinically isolated syndrome progress to clinically defined MS within 12 months of the onset of the syndrome. Subsequent progression can vary significantly from patient to patient. Progression can range from a benign course to a classic recurrent with remissions, a chronic progressive or rare fulminant course.
Способ диагностики РС, который облегчает раннее выявление клинически определенного РС, был бы ценен для лечения заболевания и для консультирования пациента. Например, пациентам, у которых рано поставлен диагноз клинически определенного РС, можно предложить изменяющие ход заболевания схемы лечения, которые, по современным данным, являются благоприятными при раннем РС.A method for diagnosing MS that facilitates the early detection of clinically specific MS would be valuable for treating the disease and for advising the patient. For example, patients who are diagnosed with a clinically defined MS early can be offered treatment-modifying regimens that, according to current data, are favorable for early MS.
Современные способы оценки и мониторинга РС основаны на оценке и классификации функционирования организма пациентов при атаках и возрастающей во время атак недееспособности. Одна из оценок, используемая для характеристики РС, представляет собой обычно применяемую расширенную шкалу статуса недееспособности (EDSS). Однако EDSS основана на субъективной оценке функционирования организма пациента.Modern methods for assessing and monitoring MS are based on the assessment and classification of the functioning of the patient’s body during attacks and incapacity increasing during attacks. One estimate used to characterize MS is the commonly used Extended Disability Status Scale (EDSS). However, EDSS is based on a subjective assessment of a patient’s functioning.
Способы диагностики также могут охватывать мониторинг очагов повреждения головного мозга путем визуализации методом ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) или тестирования цереброспинальной жидкости (CSF) на предмет олигоклональных полос (OCB). ЯМР представляет собой физический метод оценки очагов повреждения головного мозга и дорог для рутинного применения. Более того, корреляция между результатами ЯМР и активностью заболевания слабая. Цереброспинальная пункция является неприятной инвазивной процедурой, которая не подходит для рутинного применения. Кроме того, в обоих способах оценивается повреждение только после того, как оно произошло; ни один из способов не может предсказать начало атаки. Дальнейшим недостатком при тестировании на предмет OCB в CSF и проведении ЯМР в качестве пути диагностики РС является то, что отрицательные OCB или ЯМР не исключают наличия РС.Diagnostic methods can also include monitoring foci of brain damage by imaging by nuclear magnetic resonance (NMR) or testing cerebrospinal fluid (CSF) for oligoclonal bands (OCB). NMR is a physical method for assessing foci of brain damage and roads for routine use. Moreover, the correlation between the results of NMR and disease activity is weak. Cerebrospinal puncture is an unpleasant invasive procedure that is not suitable for routine use. In addition, in both methods, damage is evaluated only after it has occurred; none of the methods can predict the onset of an attack. A further drawback when testing for OCB in CSF and performing NMR as a way to diagnose MS is that negative OCB or NMR does not exclude the presence of MS.
Имеется потребность в способе, который использует объективно оцениваемые маркеры для диагностики РС и для предсказания начала атак у пациентов, страдающих от РС.There is a need for a method that uses objectively evaluated markers to diagnose MS and to predict the onset of attacks in patients suffering from MS.
Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
Изобретение частично основано на том открытии, что пациенты с РС характеризуются повышенными уровнями аутоантител IgG, IgA, IgM, которые связываются с гликановыми структурами Glc(α), или Glc(α 1-4) Glc(α), или Glc(α 1-4) Glc(β), по сравнению с сывороточными уровнями данных антител у здоровых субъектов. Кроме того, те же аутоантитела, специфичные в отношении данных гликановых структур, повышаются во время состояния обострения по сравнению с уровнем, наблюдаемым у пациентов при ремиссии и здоровых субъектов. Сильная корреляция также наблюдалась между уровнями антитела IgM против Glc(α) у пациентов женского пола с клиническим диагнозом РС (рецидивирующий с ремиссиями) и коэффициентом EDSS данных женщин. Высокая корреляция указывает на то, что уровень IgM против α-глюкозы в сыворотке может функционировать в качестве клинического заместительного конечного маркера активности заболевания, с его помощью можно вести мониторинг эффективности лекарственного соединения в клинических испытаниях.The invention is based in part on the discovery that patients with MS are characterized by elevated levels of IgG, IgA, IgM autoantibodies that bind to the glycan structures Glc (α), or Glc (α 1-4) Glc (α), or Glc (α 1- 4) Glc (β), compared with serum levels of these antibodies in healthy subjects. In addition, the same autoantibodies specific for these glycan structures increase during an exacerbation state compared with the level observed in patients with remission and healthy subjects. A strong correlation was also observed between anti-Glc (α) IgM antibody levels in female patients with a clinical diagnosis of MS (recurrent with remissions) and EDSS data of women. A high correlation indicates that the level of serum IgM anti-α-glucose can function as a clinical substitute end marker for disease activity, and it can be used to monitor the effectiveness of a drug compound in clinical trials.
Мониторинг уровня данных антител в крови субъектов, подозреваемых в наличии РС, облегчает быструю и эффективную по стоимости раннюю диагностику пациентов с РС и раннее предписание изменяющих ход заболевания лекарственных средств, и раннее выявление атак, что обеспечивает ранее профилактическое лечение.Monitoring the level of these antibodies in the blood of subjects suspected of having MS facilitates the quick and cost-effective early diagnosis of patients with MS and the early prescription of drugs that change the course of the disease, and the early detection of attacks, which provides earlier preventive treatment.
Дополнительным преимуществом изобретения является то, что присутствие у пациентов РС может определяться на ранней стадии заболевания, когда его симптомы могут напоминать многие другие подобные РС заболевания. Ранний диагноз позволяет врачам лечить РС ранее по ходу заболевания, что, таким образом, минимизирует или предотвращает повреждение, вызванное разрушением миелина и недееспособность, связанную с данным повреждением. Кроме того, описанные здесь способы позволяют врачам регулярно следить за пациентами с РС для оценки тяжести заболевания, вести мониторинг хода лечения и изменять лечение при появлении признаков начала атаки. Например, повышение уровня биомаркеров, указывающих на атаку РС, может гарантировать введение пациенту метилпреднизона, который представляет собой основное противовоспалительное средство, обычно вводимое при атаках.An additional advantage of the invention is that the presence of MS in patients can be determined at an early stage of the disease, when its symptoms can resemble many other similar MS diseases. An early diagnosis allows doctors to treat MS earlier in the course of the disease, which thus minimizes or prevents damage caused by the destruction of myelin and the incapacity associated with this damage. In addition, the methods described herein allow doctors to regularly monitor patients with MS to assess the severity of the disease, monitor treatment progress, and change treatment when signs of an attack begin. For example, an increase in the level of biomarkers that indicate an MS attack can guarantee the patient is given methylprednisone, which is the main anti-inflammatory drug commonly used in attacks.
Описанные здесь способы также могут использоваться для выбора лучшей лекарственной терапии конкретного пациента. Например, пациент может начать курс лечения с конкретного лекарственного средства, и изменение уровней маркера может являться индикатором эффективности лекарственного средства. Возвращение уровней маркера к состоянию, наблюдавшемуся при заболевании, указывает на то, что данное лекарственное средство теряет эффективность, и его следует заместить вторым лекарственным средством через небольшой период времени. Альтернативно, врач дождется следующих атак для определения того, эффективно ли данное лекарственное средство для конкретных пациентов.The methods described herein can also be used to select the best drug therapy for a particular patient. For example, a patient may start a course of treatment with a specific drug, and a change in marker levels may be an indicator of the effectiveness of the drug. The return of marker levels to the condition observed during the disease indicates that this drug is losing its effectiveness and should be replaced with a second drug after a short period of time. Alternatively, the doctor will wait for the following attacks to determine if the drug is effective for specific patients.
Описанные здесь биомаркеры могут, кроме того, действовать в качестве заместительных конечных маркеров для оценки ответа пациента на тестируемое лекарственное средство рентабельным способом. Заместительная конечная точка, основанная на серологическом тесте, облегчает эффективное тестирование новых потенциальных лекарственных средств против РС.The biomarkers described herein may also act as substitution end markers to evaluate a patient's response to a test drug in a cost-effective manner. A serological test replacement endpoint facilitates the effective testing of potential new anti-MS drugs.
В одном из аспектов изобретение относится к способу диагностики у субъекта рассеянного склероза. Способ включает в себя получение тестируемого образца от субъекта и выявление в тестируемом образце, по меньшей мере, одного биомаркера, который представляет собой антитело, специфично связывающееся с гликановой структурой. Антитело может представлять собой, например, антитело против Glc(α), антитело против Glc(α 1-4), антитело против Glc(α 1-4) Glc(α), антитело против Glc(α 1-4) Glc(β), антитело против Glc(β), антитело против Gal(β); антитело против Glc(β 1-4) Glc(β 1-4) Glc(β), антитело против GlcNAc(β 1-4) GlcNAc(β), антитело против L-Araf(α), антитело против L-Rha(α), антитело против Gal(β 1-3)[GlcNAc(β 1-6)] GalNAc(α), антитело против Gal(β 1-4) GlcNAc(α), антитело против Gal(β 1-3) GalNAc(α), антитело против Gal(β 1-3) GlcNAc(β), антитело против GlcA(β) или антитело против GlcA(β), или антитело против Xyl(α). Уровень антитела или антител в тестируемом образце сравнивают с контрольным образцом, который получен от одного или нескольких субъектов, у которых выявлены симптомы рассеянного склероза, или у которых выявлены симптомы рассеянного склероза с известным статусом рассеянного склероза, или от субъекта или субъектов, у которых не выявлены симптомы рассеянного склероза. Статус РС может включать в себя, например, обострения, атаки, ремиссии и стабильные стадии заболевания.In one aspect, the invention relates to a method for diagnosing multiple sclerosis in a subject. The method includes obtaining a test sample from a subject and detecting in the test sample at least one biomarker, which is an antibody that specifically binds to a glycan structure. An antibody may be, for example, an anti-Glc (α) antibody, an anti-Glc (α 1-4) antibody, an anti-Glc (α 1-4) Glc (α) antibody, an anti-Glc (α 1-4) Glc (β) antibody ), anti-Glc (β) antibody, anti-Gal (β) antibody; anti-Glc antibody (β 1-4) Glc (β 1-4) Glc (β), anti-GlcNAc antibody (β 1-4) GlcNAc (β), anti-L-Araf (α) antibody, anti-L-Rha ( α), anti-Gal (β 1-3) antibody [GlcNAc (β 1-6)] GalNAc (α), anti-Gal (β 1-4) GlcNAc (α), anti-Gal (β 1-3) GalNAc (α) an anti-Gal antibody (β 1-3) GlcNAc (β), an anti-GlcA antibody (β) or an anti-GlcA antibody (β), or an anti-Xyl antibody (α). The level of antibody or antibodies in the test sample is compared with a control sample obtained from one or more subjects who have symptoms of multiple sclerosis, or who have symptoms of multiple sclerosis with a known status of multiple sclerosis, or from a subject or subjects that are not detected symptoms of multiple sclerosis. MS status may include, for example, exacerbations, attacks, remissions, and stable stages of the disease.
В различных осуществлениях выявляют, по меньшей мере, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 данных антител. В некоторых осуществлениях антитело, тестируемое в образце, представляет собой антитело против Glc(α), антитело против Glc(α 1-4) Glc(α) или оба антитела против Glc(α) и против Glc(α 1-4) Glc(α).In various embodiments, at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, or 18 of these antibodies are detected. In some embodiments, the antibody tested in the sample is an anti-Glc (α) antibody, an anti-Glc (α 1-4) Glc (α) antibody, or both anti-Glc (α) and anti-Glc (α 1-4) Glc ( α).
В некоторых осуществлениях контрольный образец, по существу, состоит из группы образцов от одного или нескольких субъектов, у которых не выявлены симптомы рассеянного склероза. Наличие РС в контрольном образце может определяться с использованием способов, известных в данной области, например, оценки с помощью расширенной шкалы статуса недееспособности (EDSS) или оценки путем визуализации методом ядерно-магнитного резонанса (ЯМР), или оценки двумя данными способами.In some implementations, the control sample essentially consists of a group of samples from one or more subjects who have not revealed symptoms of multiple sclerosis. The presence of MS in a control sample can be determined using methods known in the art, for example, assessment using the Extended Disability Status Scale (EDSS) or assessment by imaging by nuclear magnetic resonance (NMR), or assessment using two of these methods.
Тестируемый образец может, например, представлять собой биологическую жидкость. Примеры биологических жидкостей охватывают, например, цельную кровь, сыворотку, плазму, спинномозговую жидкость, мочу или слюну.The test sample may, for example, be a biological fluid. Examples of body fluids include, for example, whole blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, urine or saliva.
Субъект может являться женщиной или мужчиной.The subject may be a woman or a man.
Выявляемое антитело может, например, относиться к типу антител IgM или к типу антител IgA, или к типу антител IgG.A detectable antibody may, for example, be of the IgM type of antibody or the type of IgA antibody, or the type of IgG antibody.
В некоторых осуществлениях тип выявляемого рассеянного склероза представляет собой ранний рассеянный склероз.In some implementations, the type of detectable multiple sclerosis is early multiple sclerosis.
Также изобретение относится к способу диагностики обострения рассеянного склероза у субъекта. Способ включает получение тестируемого образца от субъекта и выявление в тестируемом образце антитела типа IgM против Glc(α) и/или антитела типа IgM против Glc(α 1-4) Glc(α). Уровни антитела в тестируемом образце сравнивают с таковыми в контрольном образце, который получают от одного или нескольких субъектов с известным статусом рассеянного склероза.The invention also relates to a method for diagnosing an exacerbation of multiple sclerosis in a subject. The method includes obtaining a test sample from a subject and detecting an anti-Glc (α) type IgM antibody and / or an anti-Glc (α 1-4) Glc (α) type IgM antibody in the test sample. Antibody levels in the test sample are compared with those in the control sample obtained from one or more subjects with known multiple sclerosis status.
В некоторых осуществлениях контрольный образец состоит, по существу, из группы образцов от одного или нескольких субъектов, у которых не выявлены симптомы обострения рассеянного склероза, и статус рассеянного склероза у которых соответствует ремиссии. У субъекта диагностируют обострение рассеянного склероза, если в тестируемом образце присутствует больше антитела против Glc(α) или антитела против Glc(α 1-4) Glc(α), чем в контрольном образце. В других осуществлениях контрольный образец состоит, по существу, из группы образцов от одного или нескольких субъектов, у которых выявлены симптомы обострения рассеянного склероза, причем у субъекта диагностируют обострение рассеянного склероза, если в тестируемом образце и в контрольном образце присутствуют сходные количества антитела типа IgM против Glc(α) и/или антитела типа IgM против Glc(α 1-4) Glc(α).In some implementations, the control sample consists essentially of a group of samples from one or more subjects who have not revealed symptoms of exacerbation of multiple sclerosis, and the status of multiple sclerosis in which corresponds to remission. An exacerbation of multiple sclerosis is diagnosed in a subject if there is more anti-Glc (α) antibody or anti-Glc (α 1-4) Glc (α) antibody in the test sample than in the control sample. In other implementations, the control sample consists essentially of a group of samples from one or more subjects who have symptoms of exacerbation of multiple sclerosis, the subject being diagnosed with exacerbation of multiple sclerosis if similar amounts of anti-IgM antibodies are present in the test sample and in the control sample Glc (α) and / or IgM type antibodies against Glc (α 1-4) Glc (α).
Тестируемый образец может, например, представлять собой биологическую жидкость. Примеры биологических жидкостей охватывают, например, цельную кровь, сыворотку, плазму, спинномозговую жидкость, мочу или слюну.The test sample may, for example, be a biological fluid. Examples of body fluids include, for example, whole blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, urine or saliva.
Субъект может являться женщиной или мужчиной.The subject may be a woman or a man.
Выявляемое антитело может, например, относиться к типу антител IgM, или к типу антител IgA, или к типу антител IgG.The detected antibody may, for example, be of the type of IgM antibodies, or of the type of IgA antibodies, or of the type of IgG antibodies.
В некоторых осуществлениях диагностика представляет собой раннюю диагностику обострения рассеянного склероза.In some implementations, the diagnosis is an early diagnosis of exacerbation of multiple sclerosis.
В некоторых осуществлениях субъекта лечили терапевтическим средством против РС, например интерфероном бета или глатирамера ацетатом, вводимым подкожно.In some embodiments, the subject has been treated with a therapeutic agent against MS, for example, interferon beta or glatiramer acetate, administered subcutaneously.
Также изобретение относится к способу оценки у субъекта тяжести заболевания рассеянным склерозом. Способ включает в себя получение тестируемого образца от субъекта и определение того, содержит ли тестируемый образец антитело типа IgM против Glc(α) и/или антитело типа IgM против Glc(α 1-4) Glc(α). Количество антитела в тестируемом образце сравнивают с количеством антитела в контрольном образце, который получают от одного или нескольких субъектов, тяжесть рассеянного склероза у которых известна.The invention also relates to a method for assessing a subject's severity of a disease of multiple sclerosis. The method includes obtaining a test sample from a subject and determining whether the test sample contains an anti-Glc (α) IgM type antibody and / or an anti-Glc (α 1-4) Glc (α) type IgM antibody. The amount of antibody in the test sample is compared with the amount of antibody in the control sample, which is obtained from one or more subjects whose severity of multiple sclerosis is known.
В некоторых осуществлениях контрольный образец состоит, по существу, из группы образцов от одного или нескольких субъектов, тяжесть заболевания рассеянным склерозом у которых определена с помощью расширенной шкалы статуса недееспособности (EDSS), изменений коэффициента EDSS или оценки путем визуализации методом ядерно-магнитного резонанса (ЯМР).In some implementations, the control sample consists essentially of a group of samples from one or more subjects, the severity of the disease of multiple sclerosis in which is determined using the extended disability status scale (EDSS), changes in the EDSS coefficient or assessment by visualization by nuclear magnetic resonance (NMR) )
Тестируемый образец, например, может представлять собой биологическую жидкость. Примеры биологических жидкостей охватывают, например, цельную кровь, сыворотку, плазму, спинномозговую жидкость, мочу или слюну.The test sample, for example, may be a biological fluid. Examples of body fluids include, for example, whole blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, urine or saliva.
Если требуется, способ может далее охватывать выбор терапевтического средства для лечения рассеянного склероза путем выбора терапевтического средства и режима дозировки на основании относительных уровней антитела или антител в тестируемом образце и контрольном образце.If desired, the method may further encompass the selection of a therapeutic agent for treating multiple sclerosis by selecting a therapeutic agent and a dosage regimen based on the relative levels of antibody or antibodies in the test sample and control.
В некоторых осуществлениях более высокие уровни антител в тестируемом образце относительно контрольного образца указывают на выбор терапевтического средства и режима дозировки, что представляет собой подкожное введение интерферона бета (BETAFERON®, AVONEX®, REBIF®) или подкожное введение глатирамера-ацетата (COPAXONE®).In some embodiments, higher antibody levels in the test sample relative to the control sample indicate the choice of therapeutic agent and dosage regimen, which is subcutaneous administration of interferon beta (BETAFERON®, AVONEX®, REBIF®) or subcutaneous administration of glatiramer acetate (COPAXONE®).
Субъект может являться женщиной или мужчиной.The subject may be a woman or a man.
Также изобретение относится к набору для диагностики симптомов, связанных с рассеянным склерозом. Данный набор включает в себя первый реагент, который специфично выявляет антитело против Glc(α), второй реагент, который специфично выявляет антитело против Glc(α 1-4) Glc(α), и инструкции по применению набора. Набор необязательно включает в себя реагент, который специфично выявляет антитело типа IgM.The invention also relates to a kit for diagnosing symptoms associated with multiple sclerosis. This kit includes a first reagent that specifically detects an anti-Glc (α) antibody, a second reagent that specifically detects an anti-Glc (α 1-4) Glc (α) antibody, and instructions for using the kit. The kit optionally includes a reagent that specifically detects an IgM type antibody.
Также изобретение относится к субстратам, которые включают в себя реагенты, которые специфично выявляют описанные здесь антитела, например антитело против Glc(α), антитело против Glc(α 1-4), антитело против Glc(α 1-4) Glc(α), антитело против Glc(α 1-4) Glc(β), антитело против Glc(β), антитело против Gal(β); антитело против Glc(β 1-4) Glc(β 1-4) Glc(β), антитело против GlcNAc(β 1-4) GlcNAc(β), антитело против L-Araf(α), антитело против L-Rha(α), антитело против Gal(β 1-3)[GlcNAc(β 1-6)] GalNAc(α), антитело против Gal(β 1-4) GlcNAc(α), антитело против Gal(β 1-3) GalNAc(α), антитело против Gal(β 1-3) GlcNAc(β), антитело против GlcA(β), или антитело против GlcA(β) или антитело против Xyl(α). Субстрат может, например, представлять собой плоскость.The invention also relates to substrates, which include reagents that specifically detect the antibodies described herein, for example, an antibody against Glc (α), an antibody against Glc (α 1-4), an antibody against Glc (α 1-4) Glc (α) , anti-Glc antibody (α 1-4) Glc (β), anti-Glc antibody (β), anti-Gal (β) antibody; anti-Glc antibody (β 1-4) Glc (β 1-4) Glc (β), anti-GlcNAc antibody (β 1-4) GlcNAc (β), anti-L-Araf (α) antibody, anti-L-Rha ( α), anti-Gal (β 1-3) antibody [GlcNAc (β 1-6)] GalNAc (α), anti-Gal (β 1-4) GlcNAc (α), anti-Gal (β 1-3) GalNAc (α), an antibody against Gal (β 1-3) GlcNAc (β), an antibody against GlcA (β), or an antibody against GlcA (β) or an antibody against Xyl (α). The substrate may, for example, be a plane.
В следующем аспекте изобретение относится к способу выбора терапевтического средства для лечения рассеянного склероза. Способ включает в себя получение тестируемого образца от субъекта, которому поставлен диагноз рассеянного склероза или который имеет риск возникновения данного заболевания, определение, содержит ли тестируемый образец антитело против Glc(α). Уровни антитела в тестируемом образце сравнивают с уровнями антитела в контрольном образце, который, по существу, состоит из образцов одного или нескольких субъектов, тяжесть рассеянного склероза у которых известна. Терапевтическое средство и режим дозировки выбирают на основе относительных уровней антитела в образце субъекта и контрольном образце.In a further aspect, the invention relates to a method for selecting a therapeutic agent for the treatment of multiple sclerosis. The method includes obtaining a test sample from a subject who is diagnosed with multiple sclerosis or who is at risk for the disease, determining whether the test sample contains an anti-Glc (α) antibody. Antibody levels in a test sample are compared with antibody levels in a control sample, which essentially consists of samples of one or more subjects whose severity of multiple sclerosis is known. The therapeutic agent and dosage regimen are selected based on the relative levels of the antibody in the sample of the subject and the control sample.
В некоторых вариантах осуществления способ далее включает определение того, содержит ли тестируемый образец антитело против Glc(α 1-4) Glc(α), и сравнение уровней антитела против Glc(α 1-4) Glc(α) в тестируемом образце с уровнями данного антитела в контрольном образце, который, по существу, состоит из образцов одного или нескольких субъектов, тяжесть рассеянного склероза которых известна.In some embodiments, the method further includes determining whether the test sample contains an anti-Glc (α 1-4) Glc (α) antibody, and comparing the levels of anti-Glc (α 1-4) Glc (α) antibody in the test sample with levels of a given antibodies in a control sample, which essentially consists of samples of one or more subjects whose severity of multiple sclerosis is known.
В некоторых вариантах осуществления контрольный образец состоит, по существу, из группы образцов от одного или нескольких субъектов, статус которых представляет собой отсутствие рассеянного склероза или стабильный рассеянный склероз.In some embodiments, the control sample consists essentially of a group of samples from one or more subjects whose status is the absence of multiple sclerosis or stable multiple sclerosis.
Кроме определенных иначе случаев все используемые здесь технические и научные термины имеют то значение, которое обычно понимают под ними рядовые специалисты в области, к которой относится данное изобретение. Хотя при воплощении или тестировании настоящего изобретения могут использоваться способы и материалы, сходные или эквивалентные описанным здесь, ниже описаны подходящие способы и материалы. Все публикации, заявки на выдачу патента, патенты и другие указанные здесь ссылки включены сюда полностью в качестве ссылки. В случае конфликта настоящая спецификация, включая определения, будет служить для контроля. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не подразумеваются как ограничивающие.Except as otherwise specified, all the technical and scientific terms used here have the meaning that is usually understood by ordinary specialists in the field to which this invention relates. Although methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in implementing or testing the present invention, suitable methods and materials are described below. All publications, patent applications, patents, and other references cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety. In the event of a conflict, this specification, including definitions, will serve as a control. In addition, the materials, methods, and examples are illustrative only and are not meant as limiting.
Другие свойства и преимущества изобретения будут понятны из последующего подробного описания и формулы изобретения.Other features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description and claims.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
На фиг.1 показано дерево решений для определения того, что пациент, у которого подозревается наличие РС, действительно имеет РС.Figure 1 shows a decision tree to determine that a patient who is suspected of having MS really has MS.
На фиг.2 показано дерево решений для выбора лекарственного средства и дозы для пациента с РС на основе уровней антител против Glc(α 1-4) Glc(α) или против Glc(α).Figure 2 shows a decision tree for selecting a drug and dose for a patient with MS based on levels of antibodies against Glc (α 1-4) Glc (α) or against Glc (α).
На фиг.3 показано дерево решений для предсказания и ранней диагностики атак у пациентов с РС.Figure 3 shows the decision tree for predicting and early diagnosis of attacks in patients with MS.
Фиг.4 представляет собой таблицу, в которой показан относительный уровень флуоресценции от связывания различных антител против гликанов у пациентов с MS, а также у нормальных субъектов. Структуры гликанов представлены на верхней строке таблицы согласно синтаксису LINEARCODE® (линейный код).Figure 4 is a table showing the relative fluorescence level from the binding of various anti-glycan antibodies in patients with MS, as well as in normal subjects. The glycan structures are shown on the top line of the table according to the LINEARCODE® syntax (linear code).
На фиг.5 показано среднее значение и медиана сигнала антигликановых антител против различных гликанов из сывороток, полученных от пациентов с РС, по сравнению с сыворотками нормальных контрольных субъектов. Структуры гликанов представлены согласно синтаксису LINEARCODES®.Figure 5 shows the average value and median signal of antiglycan antibodies against various glycans from sera obtained from patients with MS compared with sera from normal control subjects. Glycan structures are represented according to the LINEARCODES® syntax.
Фиг.6 представляет собой график, на котором показаны различия между средним сигналом от пациентов с РС и здоровыми субъектами, планки представляют собой стандартное отклонение. Структуры гликанов представлены согласно синтаксису LINEARCODES®.6 is a graph showing the differences between the average signal from patients with MS and healthy subjects, the bars represent the standard deviation. Glycan structures are represented according to the LINEARCODES® syntax.
Фиг.7A представляет собой график, на котором показан средний сигнал от связывания IgM против Glc(α), (гликан #11) и против Glc(α 1-4) Glc(α) (гликан #12) в группе с РС и группе здоровых субъектов.Figa is a graph showing the average signal from IgM binding against Glc (α), (glycan # 11) and against Glc (α 1-4) Glc (α) (glycan # 12) in the group with PC and group healthy subjects.
Фиг.7B представляет собой график, на котором показан средний сигнал от связывания IgM против Glc(α) (гликан #11) и против Glc(α 1-4) Glc(α) (гликан #12) в группе пациентов с РС при атаке, пациентов со стабильным РС, и в группе здоровых субъектов.Fig. 7B is a graph showing the average signal from IgM binding against Glc (α) (glycan # 11) and against Glc (α 1-4) Glc (α) (glycan # 12) in the group of patients with MS in attack , patients with stable MS, and in the group of healthy subjects.
Фиг.8 представляет собой график, на котором показана корреляция между относительным уровнем флуоресценции от адгезии антител IgM против альфа-глюкозы в образцах позитивных в плане анти-Glc(α) пациентов с РС (левая часть) и негативных в плане анти-Glc(α) пациентов с РС (правая часть), и значениями их EDSS.Fig. 8 is a graph showing the correlation between the relative fluorescence level of adhesion of anti-alpha glucose IgM antibodies in samples of anti-Glc (α) positive patients with MS (left side) and anti-Glc (α) negative ) patients with MS (right side), and their EDSS values.
Фиг.9 представляет собой график, на котором показана временная стабильность сигнала от связывания антител IgM, IgG и IgA против гликанов в течение 13 недель у 7 здоровых субъектов.Fig. 9 is a graph showing the temporal stability of a signal from binding of anti-glycan IgM, IgG and IgA antibodies for 13 weeks in 7 healthy subjects.
На фиг.10A-10E показан гликановый массив; химическая структура, специфичность лектинового взаимодействия и воспроизводимость. На фиг.10A показан п-аминофенил-P-сахарид, ковалентно связанный на своем восстанавливающем конце с твердой поверхностью через линкер.10A-10E show a glycan array; chemical structure, specificity of lectin interaction and reproducibility. 10A shows a p- aminophenyl- P- saccharide covalently bonded at its reducing end to a solid surface via a linker.
На фиг.10B показана воспроизводимость от серии к серии связывания биотинилированного WGA с гликановым массивом. Три отдельных серии массивов анализировали одновременно с биотинилированным WGA.10B shows the reproducibility from series to series of binding of biotinylated WGA to a glycan array. Three separate series of arrays were analyzed simultaneously with biotinylated WGA.
На фиг.10C показан конкурентный анализ с ConA в отношении связанной Man(α). Возрастающие концентрации растворимой маннозы или Gal(β 1-4) Glc инкубировали с биотинилированным ConA (1,5 мкг/мл) в течение 1 ч и выявляли стрептавидином, конъюгированным с европием.10C shows a competitive assay with ConA for bound Man (α). Increasing concentrations of soluble mannose or Gal (β 1-4) Glc were incubated with biotinylated ConA (1.5 μg / ml) for 1 h and detected with streptavidin conjugated with europium.
На фиг.10D показана специфичность связывания лектина с различными аномерами. Связывание ConA с отрицательным контролем глицерином (19), Man(α) (26) и Man(β) (27). Связывание GSI с Gal(α) (1), Gal(β) (2), GalNAc (α) (7) и GalNac(β) (8).10D shows the specificity of the binding of lectin to various anomers. Binding of ConA to the negative control glycerol (19), Man (α) (26) and Man (β) (27). The binding of GSI to Gal (α) (1), Gal (β) (2), GalNAc (α) (7) and GalNac (β) (8).
На фиг.10E показана воспроизводимость от планшета к планшету гликанового массива. Пять идентичных планшетов, представляющих GlcNac(β), тестировали с биотинилированным WGA.10E shows reproducibility from tablet to tablet of a glycan array. Five identical plates representing GlcNac (β) were tested with biotinylated WGA.
На фиг.11 показан профиль связывания гликанов в популяции здоровых людей. Антитело против углеводов, связанное с выбранными гликанами (см. таблицу 5 для структур гликанов) в образцах сыворотки от 72 субъектов, измерено с использованием биотинилированного белка А. Каждая точка представляет собой среднее двух экспериментов, где каждый проведен в четырех параллелях. Прямоугольник включает в себя сигналы 50% популяции. Толстые и тонкие линии в прямоугольнике представляют собой средние значения и медианы, соответственно. Граница прямоугольника, ближайшая к нулю, означает 25-тый процентиль, граница прямоугольника, дальнейшая от нуля, означает 75-тый процентиль. Планки выше и ниже прямоугольника означают 90-тый и 10-тый процентили. Уровень измеренного неспецифического сигнала определяли эмпирически; гликаны, уровень антител против которых, как было обнаружено, был относительно низким и сильно варьировал от эксперимента к эксперименту, были предназначены для определения фонового уровня (не показано). Среднее значение сигнала для данных гликанов рассчитывали и вычитали из сигнала, полученного для каждого образца сыворотки и конкретного гликана. Среднее значение фона составляло 3Ч105 RFU. TBST представляет собой Tris-солевой буфер с Tween-20 (см. экспериментальный протокол).11 shows a glycan binding profile in a healthy population. An anti-carbohydrate antibody bound to selected glycans (see table 5 for glycan structures) in serum samples from 72 subjects was measured using biotinylated protein A. Each point is the average of two experiments where each was performed in four parallels. The rectangle includes the signals of 50% of the population. The thick and thin lines in the rectangle represent the mean and median, respectively. The border of the rectangle closest to zero means the 25th percentile, the border of the rectangle further from zero means the 75th percentile. The bars above and below the rectangle indicate the 90th and 10th percentiles. The level of the measured nonspecific signal was determined empirically; glycans, the level of antibodies against which was found to be relatively low and varied greatly from experiment to experiment, were designed to determine the background level (not shown). The average signal value for these glycans was calculated and subtracted from the signal obtained for each serum sample and specific glycan. The average background value was 3 × 105 RFU. TBST is a Tris-saline buffer with Tween-20 (see experimental protocol).
На фиг.12 показаны сигналы от индивидуальных сывороток, полученные против серии гликанов. Связывание антител против гликанов, измеренное в относительных единицах флуоресценции (RFU), преобразовывали с использованием способа, подобного уравниванию гистограмм, в котором используется монотонное нелинейное картирование. Таким способом значения RFU преобразовывали в интервал от 0 (голубой) и 255 (красный). Данные объединяли в кластеры с использованием алгоритма симулированной нормализации.12 shows signals from individual sera obtained against a series of glycans. Anti-glycan antibody binding, measured in relative fluorescence units (RFUs), was converted using a method similar to histogram equalization using monotonous non-linear mapping. In this way, the RFU values were converted to between 0 (blue) and 255 (red). Data was clustered using a simulated normalization algorithm.
На фиг.13A-13C показан профиль связывания аффинно очищенных (A) антитела против L-Rha(α) (B) антител против GIcNAc(α) и GIcNAc(β 1-4) GlcNAc(β) и (C) антител против Glc(β 1-4) Glc(β 1-4) Glc(β) и GlcNAc(β 1-4) GlcNAc(β) с массивом, содержащим 33 гликана. Структуры гликанов описаны в таблице 5. Количество связанных антител измеряли с использованием биотинилированного антитела козы против человеческих IgG.On figa-13C shows the binding profile of affinity purified (A) antibodies against L-Rha (α) (B) antibodies against GIcNAc (α) and GIcNAc (β 1-4) GlcNAc (β) and (C) antibodies against Glc (β 1-4) Glc (β 1-4) Glc (β) and GlcNAc (β 1-4) GlcNAc (β) with an array containing 33 glycans. The glycan structures are described in Table 5. The number of bound antibodies was measured using a biotinylated goat anti-human IgG antibody.
На фиг.14A и 14B показана специфичность антитела против Glc(β 1-4) Glc(β 1-4) Glc (β). (A) Конкурентное ингибирование связывания антитела против Glc(β 1-4) Glc(β 1-4) Glc(β). Ингибирование связывания аффинно очищенного антитела против Glc(β 1-4) Glc(β 1-4) Glc(β) с п-аминофенил-β-Glc(β 1-4) Glc(β 1-4) Glc(β), иммобилизованным на поверхности лунки, как функция концентрации Glc(β 1-4) Glc(β 1-4) Glc или Gal(β 1-4) Glc. Количество связанного антитела измеряли с использованием биотинилированного антитела козы против человеческих IgG. (B) Связывание антител против Glc(β 1-4) Glc(β 1-4) Glc(β) (A) и против L-Rha(α) (B) с распознающими их сахарами после инкубации с кристаллической или аморфной целлюлозой. Количество связанного антитела измеряли с использованием биотинилированного антитела козы против человеческих IgG.On figa and 14B shows the specificity of the antibodies against Glc (β 1-4) Glc (β 1-4) Glc (β). (A) Competitive inhibition of antibody binding against Glc (β 1-4) Glc (β 1-4) Glc (β). Inhibition of binding of an affinity purified anti-Glc (β 1-4) Glc (β 1-4) Glc (β) antibody to p- aminophenyl-β-Glc (β 1-4) Glc (β 1-4) Glc (β), immobilized on the surface of the well as a function of the concentration of Glc (β 1-4) Glc (β 1-4) Glc or Gal (β 1-4) Glc. The amount of bound antibody was measured using a biotinylated goat anti-human IgG antibody. (B) Binding of antibodies against Glc (β 1-4) Glc (β 1-4) Glc (β) (A) and against L-Rha (α) (B) with sugar recognizing them after incubation with crystalline or amorphous cellulose. The amount of bound antibody was measured using a biotinylated goat anti-human IgG antibody.
Фиг.15A-15C являются графическим представлением связывания изотипов IgG, IgA и IgM здоровых субъектов с указанными гликанами.15A-15C are a graphical representation of the binding of IgG, IgA and IgM isotypes of healthy subjects to these glycans.
Фиг.16A является представлением в виде матрицы гликанов, использованных для оценки сывороток пациентов с атеросклерозом, страдающих нестабильной или стабильной стенокардией. Гликаны, против которых были получены значимо различные в разных группах пациентов уровни антител, отмечены закрашенными квадратами. Гликаны перечислены в таблице 4.Figa is a representation in the form of a matrix of glycans used to evaluate the sera of patients with atherosclerosis suffering from unstable or stable angina pectoris. Glycans against which significantly different antibody levels were obtained in different groups of patients are indicated by filled squares. Glycans are listed in table 4.
Фиг.16B является графическим представлением, на котором показаны уровни антител против гликанов #2 и #29 в трех группах пациентов: стабильной, нестабильной и без атеросклероза. Прямоугольник включает в себя сигналы 50% популяции. Толстые и тонкие линии в прямоугольнике представляют собой средние значения и медианы, соответственно. Граница прямоугольника, ближайшая к нулю, означает 25-тый процентиль, граница прямоугольника, дальнейшая от нуля, означает 75-тый процентиль. Планки выше и ниже прямоугольника означают 90-тый и 10-тый процентили.Figv is a graphical representation showing the levels of antibodies against
Фиг.17 представляет собой гистограмму, на которой показано число образцов в трех группах пациентов, позитивных в плане антител IgA против гликана #2 или гликана #29.17 is a histogram showing the number of samples in three patient groups that are positive for IgA antibodies against
Фиг.18A представляет собой гистограмму, в которой показано распределение уровней антител против против гликанов #2 и #15 в трех группах пациентов. Прямоугольник включает в себя сигналы 50% популяции. Толстые и тонкие линии в прямоугольнике представляют собой средние значения и медианы, соответственно. Граница прямоугольника, ближайшая к нулю, означает 25-тый процентиль, граница прямоугольника, дальнейшая от нуля, означает 75-тый процентиль. Планки выше и ниже прямоугольника означают 90-тый и 10-тый процентили.Fig. 18A is a bar graph showing the distribution of
Фиг.18B представляет собой гистограмму, на которой показано число образцов в трех группах пациентов, позитивных в плане антител IgA против гликана #2 или гликана #15.Figv is a histogram showing the number of samples in three groups of patients that are positive in terms of IgA antibodies against
Фиг.19 является графическим представлением специфичности и чувствительности, основанных на уровнях антител IgA против гликана #2, гликана #15, гликана #17, и гликана #49. A - Атеросклероз; S - Стабильные; US - Нестабильные; NA - Отсутствие атеросклероза.Fig. 19 is a graphical representation of specificity and sensitivity based on levels of IgA antibodies against
Фиг.20 представляет собой гистограмму, на которой показан профиль связывания клеток CD4+ из одного субъекта с различными гликанами. Структуры гликанов представлены согласно синтаксису LINEARCODES®.FIG. 20 is a histogram showing the binding profile of CD4 + cells from one subject to different glycans. Glycan structures are represented according to the LINEARCODES® syntax.
Фиг.21A представляет собой график, на котором показана средняя относительная флуоресценция клеток CD4+ для каждого из семи субъектов. Структуры гликанов представлены согласно синтаксису LINEARCODES®.Figa is a graph showing the average relative fluorescence of CD4 + cells for each of the seven subjects. Glycan structures are represented according to the LINEARCODES® syntax.
На фиг.21B показаны сигналы от индивидуальных сывороток против серии гликанов. Связывание антитела против гликанов, измеренное в единицах относительной флуоресценции (RFU), преобразовывали с использованием способа, подобного уравниванию гистограмм, в котором используется монотонное нелинейное картирование. Таким способом значения RFU преобразовывали в интервал от 0 (голубой) и 255 (красный). Данные объединяли в кластеры с использованием алгоритма симулированной нормализации.21B shows signals from individual sera against a series of glycans. Anti-glycan antibody binding, measured in relative fluorescence units (RFUs), was converted using a method similar to histogram equalization using monotonic non-linear mapping. In this way, the RFU values were converted to between 0 (blue) and 255 (red). Data was clustered using a simulated normalization algorithm.
Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Предоставленные здесь способы обеспечивают раннюю диагностику начального и рецидивирующего рассеянного склероза с использованием объективно оцениваемого уровня биомаркеров. Настоящее дерево решений для диагностики пациента с РС описано на фиг.1. Пациент с острым ухудшением функции нервной системы вначале должен диагностироваться как пациент с определенным РС перед назначением ему лечения воздействующими на заболевание лекарственными средствами. Врач должен определить, имеет ли данный пациент симптомы, подобные РС (такие как ранний инсульт, волчанка, дефицит витамина B-12, антифосфолипидный синдром, тяжелая мигрень) или же он действительно имеет РС. Пациент должен перенести второе острое ухудшение функции нервной системы (атаку) до того, как ему будет поставлен диагноз РС, и он сможет начать длительное лечение терапевтическим средством против РС, таким как интерферон бета и глатирамера-ацетат.The methods provided herein provide an early diagnosis of initial and recurrent multiple sclerosis using an objectively assessed level of biomarkers. The present decision tree for diagnosing a patient with MS is described in FIG. A patient with acute deterioration of the function of the nervous system must first be diagnosed as a patient with a certain MS before treatment with drugs that affect the disease. The doctor must determine if the patient has symptoms similar to MS (such as an early stroke, lupus, vitamin B-12 deficiency, antiphospholipid syndrome, severe migraine) or does he really have MS. The patient must undergo a second acute deterioration in the function of the nervous system (attack) before he is diagnosed with MS, and he can begin long-term treatment with a therapeutic agent for MS, such as interferon beta and glatiramer acetate.
В настоящее время врачи используют ЯМР для определения наличия очагов повреждения головного мозга и/или тестирование цереброспинальной жидкости (CSF) на предмет олигоклональных полос (OCB). Если ЯМР дает четкий результат касательно наличия очагов повреждения головного мозга, или в CSF присутствуют OCB, врач может начать лечение немедленно для предотвращения бессимптомных очагов повреждения головного мозга. Окончательная диагностика РС в настоящее время происходит только после второй атаки. Если ЯМР не дает ясного результата или в CSF пациентов нет OCB, РС не диагностируется, и лечение откладывается до второй атаки.Doctors currently use NMR to detect the presence of foci of brain damage and / or cerebrospinal fluid (CSF) testing for oligoclonal bands (OCB). If NMR gives a clear result regarding the presence of foci of brain damage, or OCB is present in the CSF, the doctor can start treatment immediately to prevent asymptomatic foci of brain damage. The final diagnosis of MS currently occurs only after the second attack. If NMR does not give a clear result or there is no OCB in the CSF of patients, MS is not diagnosed, and treatment is delayed until the second attack.
Описанный здесь способ может осуществляться путем получения крови от пациента с острым ухудшением функции нервной системы, который заподозрен в наличии РС. По данному способу можно определить наличие РС путем измерения уровней IgM против Glc(α) и Glc(α 1-4) Glc(α). Если уровень, по меньшей мере, одного из данных антител значительно превышает средний уровень данных антител в сыворотке здоровых субъектов, пациенту ставится диагноз РС без необходимости ожидания второй атаки. Кроме того, быстрая диагностика позволяет незамедлительно начать лечение.The method described here can be carried out by obtaining blood from a patient with acute impairment of nervous system function, which is suspected of having MS. By this method, the presence of MS can be determined by measuring IgM levels against Glc (α) and Glc (α 1-4) Glc (α). If the level of at least one of these antibodies significantly exceeds the average level of these antibodies in the serum of healthy subjects, the patient is diagnosed with MS without having to wait for a second attack. In addition, a quick diagnosis allows you to immediately begin treatment.
Терапией выбора при лечении РС является интерферон β (например, ИФН β-1a и ИФН β-1b). Современная оценка эффективности и требуемой дозы лекарственного средства основана на длительном мониторинге различных клинических коэффициентов. В настоящее время коэффициент EDSS и его изменение в течение времени (например, сравнение различий EDSS каждые 3-6 месяцев) является главным клиническим параметром для управления заболеванием. Важным компонентом оценки является уровень усталости и депрессии, испытываемый пациентом. Усталость и/или депрессия могут являться симптомами РС, как аутоиммунного заболевания, или побочным эффектом применения интерферона бета. Определение причины усталости важно для управления лечением. Например, если усталость является результатом побочного действия интерферона, врач решит снизить дозу или даже заменить его на другое лекарственное средство. Однако если усталость развивается вследствие симптомов РС, врач должен решить увеличить дозировку лекарственного средства (см. фиг.2).The treatment of choice in treating MS is interferon β (e.g., IFN β-1a and IFN β-1b). A modern assessment of the effectiveness and the required dose of the drug is based on long-term monitoring of various clinical ratios. Currently, the EDSS coefficient and its change over time (for example, comparing EDSS differences every 3-6 months) is the main clinical parameter for disease management. An important component of the assessment is the level of fatigue and depression experienced by the patient. Fatigue and / or depression can be symptoms of MS, as an autoimmune disease, or a side effect of interferon beta. Determining the cause of fatigue is important for managing treatment. For example, if fatigue is a result of the side effect of interferon, the doctor will decide to reduce the dose or even replace it with another drug. However, if fatigue develops due to symptoms of MS, the doctor must decide to increase the dosage of the drug (see figure 2).
Скрининг крови пациента и определение уровня описанных здесь биомаркеров, например, антител IgM против Glc(α) и против Glc(α 1-4) Glc(α) обеспечивает здесь точный мониторинг терапии. Значимое снижение уровня антител указывает на то, что пациент благоприятно реагирует на введенное лекарственное средство.Screening a patient’s blood and determining the level of biomarkers described herein, for example, anti-Glc (α) and anti-Glc (α 1-4) Glc (α) IgM antibodies, provides accurate monitoring of therapy here. A significant decrease in antibody levels indicates that the patient is responding favorably to the drug administered.
Раннее выявление атакEarly Attack Detection
В настоящее время нет способа предсказать начало атак у пациентов с РС. ЯМР и клиническая оценка пациентов может лишь выявить повреждение, которое уже произошло. Периодическое измерение уровня нескольких антител против гликанов (например, IgM против Glc(α) или IgM против Glc(α 1-4) Glc(α)) в крови пациентов описанным здесь способом позволяет врачам определить наступающие атаки, основываясь на повышении уровня данных антител. Уровень данных антител значимо выше в крови пациентов в ситуациях атак РС по сравнению с их уровнем у пациентов в стабильном состоянии (см. фиг.7). После выявления повышения уровня этих антител врач может начать агрессивное лечение стероидами для снижения воспаления и предотвращения повреждения миелина (см. фиг.3).There is currently no way to predict the onset of attacks in patients with MS. NMR and clinical evaluation of patients can only reveal damage that has already occurred. Periodically measuring the level of several antibodies against glycans (e.g., IgM against Glc (α) or IgM against Glc (α 1-4) Glc (α)) in the blood of patients as described here allows doctors to determine upcoming attacks based on an increase in the level of these antibodies. The level of these antibodies is significantly higher in the blood of patients in situations of MS attacks compared with their level in patients in a stable state (see Fig. 7). After detecting an increase in the level of these antibodies, the doctor may initiate aggressive steroid treatment to reduce inflammation and prevent damage to myelin (see figure 3).
Также здесь предоставляются способы выявления и оценки субъектов с атеросклерозом при риске стабильной и нестабильной стенокардии с использованием биомаркеров-антител, специфичных в отношении гликанов, а также применение иммобилизованных гликанов для выявления интересующих клеток.It also provides methods for identifying and evaluating subjects with atherosclerosis at the risk of stable and unstable angina using biomarkers-antibodies specific for glycans, as well as the use of immobilized glycans to identify cells of interest.
Различные структуры гликанов обсуждаются в данном применении. Гликаны представлены в сжатой форме представления номенклатуры углеводов Международного союза теоретической и прикладной химии (IUPAC) или согласно синтаксису LINEARCODE®; принципы для синтаксиса линейного кода см. (Banin E. Neuberger Y. Altshuler Y. Halevi A. Inbar O. Dotan N. and Dukler A. (2002) A Noval Liner Code Nomenclature for complex Carbohydrates. Trends in Glycoscience andGlycotechnology Vol.14 № 77 pp.127-137). Перевод представления LINEARCODE в представление IUPAC находится в таблице 1. Все гликановые структуры, которые обсуждаются в данном описании, кроме указанных иначе, связаны через линкер с твердой фазой с указанием аномера α или β, как описано на фиг.10A.Various glycan structures are discussed in this application. Glycans are presented in a concise form representing the carbohydrate nomenclature of the International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) or according to the LINEARCODE® syntax; principles for linear code syntax see (Banin E. Neuberger Y. Altshuler Y. Halevi A. Inbar O. Dotan N. and Dukler A. (2002) A Noval Liner Code Nomenclature for complex Carbohydrates. Trends in Glycoscience and Glycotechnology Vol. 14 No. 77 pp. 127-137). The translation of the LINEARCODE representation into the IUPAC representation is in table 1. All glycan structures that are discussed in this description, except otherwise indicated, are connected via a solid phase linker with the anomer α or β indicated as described in FIG. 10A.
Изобретение будет проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами.The invention will be illustrated by the following non-limiting examples.
Пример 1Example 1
Сравнение антигликановых антител в сыворотках пациентов с рассеянным склерозом (РС) и нормальной популяцииComparison of antiglycan antibodies in the sera of patients with multiple sclerosis (MS) and the normal population
Профиль антигликановых антител (Ig) получали с использованием массивов GlycoChip (Glycominds, Ltd., Лод, Израиль, кат. № 9100). Массивы конструировали с использованием процедур, описанных в WO00/49412. Сравнивали профили антител против гликанов 40 пациентов с рассеянным склерозом и 40 равнозначных по полу и возрасту нормальных доноров крови.An antiglycan antibody (Ig) profile was obtained using GlycoChip arrays (Glycominds, Ltd., Lod, Israel, Cat. No. 9100). Arrays were constructed using the procedures described in WO00 / 49412. Anti-glycan antibody profiles were compared for 40 patients with multiple sclerosis and 40 normal blood donors of equal sex and age.
Все образцы сыворотки тестировали с использованием планшетов GlycoChip (Glycominds Ltd., Лод, Израиль, кат. № 9100), которые представляют собой массив моно- и олигосахаридов, ковалентно присоединенных к 384-луночному планшету для микротитрования сниженного объема. Моно- и олигосахариды, представленные в массиве, перечислены на фиг.4. Перевод синтаксиса LinearCode, использованного для описания структуры гликанов, в номенклатуру IUPAC, может быть найден в таблице 1.All serum samples were tested using GlycoChip plates (Glycominds Ltd., Lod, Israel, Cat. No. 9100), which are an array of mono- and oligosaccharides covalently attached to a 384-well reduced volume microtiter plate. The mono- and oligosaccharides represented in the array are listed in FIG. 4. A translation of the LinearCode syntax used to describe the structure of glycans into the IUPAC nomenclature can be found in Table 1.
Сыворотки здоровых добровольцев и пациентов с РС, которые подписали формы информированного согласия, собирали в вакуумированные покрытые силиконом, содержащие гель пробирки (Estar Technologies, кат. № 616603GLV). Сыворотки отделяли от клеток крови и хранили замороженными при -25°C до использования. Их анализировали в двух отдельных экспериментах, каждый из которых повторяли дважды в разные дни.The sera of healthy volunteers and MS patients who signed informed consent forms were collected in vacuum-coated silicone-containing gel tubes (Estar Technologies, Cat. No. 616603GLV). Serum was separated from blood cells and stored frozen at -25 ° C until use. They were analyzed in two separate experiments, each of which was repeated twice on different days.
Сыворотки от добровольцев разбавляли (1:20) TBST, распределенным в планшете GlycoChip® с использованием робота Tecan Genesis Workstation 200 (10 мкл/лунку), и инкубировали 30 мин при 25°C. Для каждого гликана и образца сыворотки в планшете делали 4 повтора.Serum from volunteers was diluted (1:20) with TBST dispensed in a GlycoChip® plate using a Tecan Genesis Workstation 200 (10 μl / well) and incubated for 30 min at 25 ° C. For each glycan and serum sample, 4 repeats were made in the plate.
Планшеты промывали 250 мкл/лунку буфера с высоким содержанием солей (0,15 M KNa, pH 7,2, NaCl 2 M, MgSО4 0,085 M, 0,05% Tween 20) в автоматическом устройстве для промывки планшетов (Tecan, PowerWasher™). 10 мкл/лунку биотинилированного белка A (ICN 62-265), 1 мкг/мл в TBST, раскапывали вручную и инкубировали планшеты в течение 30 мин при 25°C. Планшет промывали опять буфером с высоким содержанием солей.The plates were washed with 250 μl / well of high salt buffer (0.15 M KNa, pH 7.2, NaCl 2 M, MgSO 4 0.085 M, 0.05% Tween 20) in an automatic plate washer (Tecan, PowerWasher ™ ) 10 μl / well of biotinylated protein A (ICN 62-265), 1 μg / ml in TBST, was manually digested and the plates were incubated for 30 min at 25 ° C. The tablet was washed again with a high salt buffer.
Конъюгированный со стрептавидином европий, Wallac, AD0062 (1 мкл/мл, 10 мкл/лунку) добавляли вручную с последующей инкубацией в течение 30 мин при 25°C в темноте. Промывку планшетов буфером с высоким содержанием солей повторяли. Усиливающий буфер Delfia™ (Wallac, 730232, 10 мкл/лунку) добавляли в лунки, и планшеты инкубировали, по меньшей мере, в течение 30 мин в темноте. Флуоресценцию лунок считывали посредством Victor 1420 (Wallac) с использованием разрешенных по времени настроек флуоресценции с испусканием при 612 нм и возбуждением при 340 нм.Conjugated with streptavidin europium, Wallac, AD0062 (1 μl / ml, 10 μl / well) was added manually, followed by incubation for 30 min at 25 ° C in the dark. Washing the plates with a high salt buffer was repeated. Delfia ™ amplification buffer (Wallac, 730232, 10 μl / well) was added to the wells, and the plates were incubated for at least 30 minutes in the dark. Well fluorescence was read by Victor 1420 (Wallac) using time-resolved fluorescence settings with emission at 612 nm and excitation at 340 nm.
Профили всех тестируемых пациентов приведены на фиг.4. Верхние 40 линий (MS) описывают уровень антител против углеводов в образцах РС, а нижние 40 линий (NC) описывают уровень антител против углеводов в образцах из нормальной контрольной популяции. Представленные значения являются абсолютными значениями без вычитания фона. Поскольку детекцию связанных антител проводили биотинилированным белком A, который связывается с IgG, IgA и IgM, сигнал представляет собой общее связывание антител всех субтипов IgG, IgA и IgM.The profiles of all tested patients are shown in figure 4. The top 40 lines (MS) describe the level of anti-carbohydrate antibodies in the PC samples, and the bottom 40 lines (NC) describe the level of anti-carbohydrate antibodies in the samples from the normal control population. The values shown are absolute values without background subtraction. Since the detection of bound antibodies was carried out with biotinylated protein A, which binds to IgG, IgA, and IgM, the signal represents the total binding of antibodies of all subtypes of IgG, IgA, and IgM.
Сравнение между средними значениями и медианами уровня антител против углеводов при РС и в нормальной популяции выявило значимые различия между образцами от пациентов с РС и образцами от нормальной популяции, см. фиг.5. Одним из примеров большой разницы, наблюдаемой между двумя группами, является средний сигнал от гликана Ga4Gb. t-тест показал, что данное различие является весьма значимым статистически (α=0,05; p<0,001). Другим примером является Ab3(GNb6)ANa (α=0,05; p<0,001). Имеются значимые различия между медианами сигналов от РС и нормальной популяции, имеющих отношение к антителам к следующим гликанам: Glc(α), Glc(α 1-4) Glc(α), Glc(α 1-4) Glc(β), Glc(β), Gal(β), Glc(β 1-4) Glc(β 1-4) Glc(β), GlcNAc(β 1-4) GlcNAc(β), L-Araf(α), L-Rha(α), Gal(β 1-3) [GlcNAc(β 1-6)] GalNAc(α), Gal(β 1-4) GlcNAc(α), Gal(β 1-3) GalNAc(α), Gal(β 1-3) GlcNAc(β), GlcA(β), GlcA(β), Xyl(α). Сигнал от связанных антител в группе РС выше сигнала в нормальной контрольной группе.A comparison between the average values and medians of the level of antibodies against carbohydrates in MS and in the normal population revealed significant differences between samples from patients with MS and samples from the normal population, see Fig. 5. One example of the large difference observed between the two groups is the average signal from the glycan Ga4Gb. The t-test showed that this difference is very significant statistically (α = 0.05; p <0.001). Another example is Ab3 (GNb6) ANa (α = 0.05; p <0.001). There are significant differences between the medians of the signals from MS and the normal population related to antibodies to the following glycans: Glc (α), Glc (α 1-4) Glc (α), Glc (α 1-4) Glc (β), Glc (β), Gal (β), Glc (β 1-4) Glc (β 1-4) Glc (β), GlcNAc (β 1-4) GlcNAc (β), L-Araf (α), L-Rha (α), Gal (β 1-3) [GlcNAc (β 1-6)] GalNAc (α), Gal (β 1-4) GlcNAc (α), Gal (β 1-3) GalNAc (α), Gal (β 1-3) GlcNAc (β), GlcA (β), GlcA (β), Xyl (α). The signal from coupled antibodies in the PC group is higher than the signal in the normal control group.
На фиг.6 представлена разница между средними значениями связывания антигликановых антител в указанных популяциях.Figure 6 presents the difference between the average values of binding of antiglycan antibodies in these populations.
Пример 2Example 2
Различия в уровне антител IgM против Glc(α), против Glc(α1-4) Glc(α) в сыворотке пациентов с РС при атаке, пациентов со стабильным РС и здоровой популяцииDifferences in the level of IgM antibodies against Glc (α), against Glc (α1-4) Glc (α) in the serum of patients with MS during an attack, patients with stable MS and a healthy population
Массив гликанов использовали для поиска биомаркеров в репертуаре сывороточных антител человека, связывающих гликаны, которые различаются между здоровой популяцией и пациентами с рассеянным склерозом (РС), и между пациентами с РС при обострении и на стадии ремиссии. Данный пример демонстрирует, что два антитела IgM, против Glc(α) и Glc(α 1-4) Glc(α), как было обнаружено, характеризуются значимо более высоким уровнем у пациентов с РС, чем у здоровых людей (чувствительность и специфичность 60% и 93%, соответственно), и у пациентов с РС на стадии обострения, относительно пациентов на стадии ремиссии (чувствительность и специфичность 89% и 71%, соответственно). Также предоставляется профиль антигликановых антител для здоровой популяции, включая пределы вариации в течение интервала длиной 13 недель.An array of glycans was used to search for biomarkers in the repertoire of human serum antibodies that bind glycans, which differ between a healthy population and patients with multiple sclerosis (MS), and between patients with MS during exacerbation and in remission. This example demonstrates that two IgM antibodies, against Glc (α) and Glc (α 1-4) Glc (α), were found to have a significantly higher level in patients with MS than in healthy people (sensitivity and
Временная стабильность профиля антигликановых антител в течение 13 недель у очевидно здоровых субъектов была высокой. Низкий уровень антител IgM против Glc(α) и антител против Glc(α1-4) Glc(α) в нормальной популяции и их высокий уровень у пациентов с РС, и высокая временная стабильность антигликановых антител указывает на то, что данные IgM против Glc(α) и антител против Glc(α 1-4) Glc(α) могут служить в качестве биомаркера для ранней диагностики, раннего предписания лекарственных средств, мониторинга эффектов лекарственных средств и раннего выявления атак.The temporal stability of the antiglycan antibody profile for 13 weeks in apparently healthy subjects was high. The low level of IgM antibodies against Glc (α) and antibodies against Glc (α1-4) Glc (α) in the normal population and their high level in patients with MS, and the high temporal stability of antiglycan antibodies indicate that IgM data against Glc ( α) and antibodies against Glc (α 1-4) Glc (α) can serve as a biomarker for early diagnosis, early prescription of drugs, monitoring the effects of drugs and early detection of attacks.
Все образцы сыворотки тестировали с использованием GlycoChip® (Glycominds Ltd., Лод, Израиль). Гликаны были ковалентно связаны с поверхностью пластика через линкер, как описано ранее (WO02/064556). Список, описывающий тестируемые моно- и олигосахариды, предоставлен в таблице 1.All serum samples were tested using GlycoChip® (Glycominds Ltd., Lod, Israel). Glycans were covalently linked to the surface of the plastic via a linker as previously described (WO02 / 064556). A list describing the mono- and oligosaccharides tested is provided in Table 1.
Образцы крови были получены от очевидно здоровых доноров крови по протоколу информированного согласия, одобренному комитетами Helsinki Human Studies Ethical медицинских центров Belinson Medical Center в Тель-Авиве, Израиль, и Carmel Medical Center в Хайфе, Израиль. Образцы крови собирали от пациентов с РС, направленных в клинику рассеянного склероза в Carmel Medical Center, Хайфа, Израиль. Образцы крови собирали в вакуумированные покрытые силиконом, содержащие гель пробирки (Estar Technologies). После сворачивания крови сыворотку отделяли центрифугированием и собирали. Образцы хранили замороженными при -25°C до применения.Blood samples were obtained from apparently healthy blood donors using an informed consent protocol approved by the committees of the Helsinki Human Studies Ethical Medical Centers at the Belinson Medical Center in Tel Aviv, Israel, and the Carmel Medical Center in Haifa, Israel. Blood samples were collected from MS patients referred to the Multiple Sclerosis Clinic at Carmel Medical Center, Haifa, Israel. Blood samples were collected in vacuum-coated silicone-containing gel tubes (Estar Technologies). After blood clotting, serum was separated by centrifugation and collected. Samples were stored frozen at -25 ° C until use.
Объем всех растворов, добавленных в массив гликаном, составлял 10 мкл/лунку. Сыворотки разбавляли (1:20; насыщающая концентрация) в 0,15 M Tris-HCl, pH 7,2, 0,085 M MgSO4, 0,05% Tween 20 (TBST), содержащем 1% BSA (Sigma), раскапывали в планшеты массива гликанов с использованием автоматической системы Tecan Genesis Workstation 200 и инкубировали в течение 60 мин при 37°C. Затем планшеты промывали 250 мкл/лунку фосфатно-солевого буфера с 0,05% Tween 20 (PBST, Sigma) в автоматическом устройстве для промывки (Tecan, PowerWasher). В этот момент добавляли следующие реагенты, разведенные в TBST 1% BSA, с использованием автомата для раскапывания Multidrop 384 (Thermo Labsystems) и инкубировали в течение 60 мин при 37°C: для определения IgG, IgA и IgM - соответствующее подклассу специфическое биотинилированное антитело козы против человеческого Ig (Jackson, Пенсильвания, США) в концентрации 2,8 мкг/мл, 3 мкг/мл, и 0,9 мкг/мл, соответственно; для определения общих Ig - биотинилированный белок A (1 мкг/мл, ICN Biomedicals). После промывки PBST конъюгированный со стрептавидином европий, (0,1 мкг/мл), разведенный TBST с 1% BSA добавляли в каждую лунку с последующей инкубацией в течение 30 мин при 37°C в темноте и промывкой PBST. Усиливающий буфер Delfia™ добавляли в лунки, и планшеты инкубировали в течение 30-45 мин в темноте. Флуоресценцию лунок считывали посредством Victor 1420 (Wallac) с использованием разрешенных по времени настроек флуоресценции с 340/612 нм (возбуждение/испускание).The volume of all solutions added to the glycan array was 10 μl / well. Serum was diluted (1:20; saturating concentration) in 0.15 M Tris-HCl, pH 7.2, 0.085 M MgSO 4 , 0.05% Tween 20 (TBST) containing 1% BSA (Sigma), was digested into tablets glycan array using a
Различия в уровне антител IgM против Glc(α) и Glc(α 1-4) Glc(α) в сыворотке у пациентов с РС при атаке, стабильных пациентов РС и в здоровой популяцииDifferences in the level of IgM antibodies against Glc (α) and Glc (α 1-4) Glc (α) in serum in patients with MS during an attack, stable patients with MS and in a healthy population
Образцы сыворотки от пациентов с РС, вызванных в амбулаторную клинику для регулярной проверки, после того как они подписали формы информированного согласия. Группа пациентов на 80% состояла из женщин, что примерно отражало гендерное соотношение в общей популяции РС. Согласно опубликованным данным (Ritchie et al., J. Clin. Lab. Anal. 12:363-70,1998), значимо более высокий уровень антител IgM (но не IgG или IgA) наблюдали в сыворотках здоровых женщин и женщин с РС по сравнению с сыворотками мужчин (не показано). Поэтому анализ ограничивали только субпопуляциями женщин с РС и здоровых женщин. Сыворотки от пациентов с РС вначале подвергали скринингу на 54 гликанах (таблица 1) на наличие антигликановых антител IgG, IgM и IgA с целью идентификации маркеров, которые могут подтвердить диагноз РС у пациентов с единичным острым демилиенизирующим событием, и маркеры, которые будут отличаться у пациентов со стадией обострения и ремиссии заболевания. Эксперимент повторяли дважды с использованием пяти из 54 гликанов, различия антител против которых обнаруживали на начальном раунде.Serum samples from patients with MS called to an outpatient clinic for regular testing after they have signed the informed consent forms. The 80% group of patients consisted of women, which approximately reflected the gender ratio in the general MS population. According to published data (Ritchie et al., J. Clin. Lab. Anal. 12: 363-70,1998), a significantly higher level of IgM antibodies (but not IgG or IgA) was observed in the sera of healthy women and women with MS compared with male sera (not shown). Therefore, the analysis was limited only to subpopulations of women with MS and healthy women. The sera from patients with MS were first screened for 54 glycans (Table 1) for the presence of IgG, IgM and IgA antiglycan antibodies to identify markers that could confirm the diagnosis of MS in patients with a single acute demyelinating event, and markers that would differ in patients with the stage of exacerbation and remission of the disease. The experiment was repeated twice using five of the 54 glycans, the differences of antibodies against which were found in the initial round.
Воспроизводимую и статистически значимую разницу в уровне антител IgM против Glc(α) и против Glc (α1-4) Glc(α) обнаруживали между здоровой группой и группой с РС (фиг.7A), но значимые различия в уровнях IgG или IgA обнаруживали в данных исследованиях (не показано). В сыворотках обеих групп пациентов с РС уровни IgM против Glc(α) и против Glc(α1-4) Glc(α) были значимо выше, чем в здоровой популяции. Произвольно установленный оптимальный уровень отсечения (сигнал 97% процентиля “здоровой” популяции) использовали для идентификации позитивных образцов выше и негативных образцов ниже уровня отсечения. Таким образом, сигналы связывания антитела против Glc(α) привели к правильному определению 19 из 42 образцов с РС (чувствительность 45%) и 42 из 44 образцов сыворотки от очевидно здоровых людей (специфичность 96%). Измерение связывания антител против мальтозы привело к верному определению 48% сывороток РС и 95% сывороток от очевидно здоровых людей. Определение позитивного образца как образца, сигнал которого находится выше уровня отсечения в анализах на антитела против Glc(α) или Glc(α 1-4) Glc(α), улучшает чувствительность до 60% и сохраняет специфичность, равную 93% (таблица 2). Дифференциальное распределение антител против Glc(α) и антител Glc(α 1-4) Glc(α) у пациентов во время стадий обострения и ремиссии заболевания характеризовалось значимо более высоким уровнем в первой группе (фиг.7B). Не было обнаружено различия между необработанными пациентами или пациентами, обработанными интерфероном β (не показано). С использованием в качестве отсечения 80%-го процентиля “стабильной” популяции с РС определяли, что сигналы связывания антител против Glc(α) приводили к правильной идентификации 15 из 18 образцов “атаки” (чувствительность 83%), 19 из 24 “стабильных” образцов (специфичность 79% по отношению к стабильному состоянию как бессимптомному) и 42 из 44 “здоровых” образцов (специфичность 95%). Измерение связывания антител против мальтозы привело к верному определению 72% сывороток, относящихся к атаке, 79% “стабильных” сывороток и 97% “здоровых сывороток”. Определение позитивного образца как образца, сигнал которого находится выше уровня отсечения в анализах на антитела против Glc(α) или мальтозы, приводит к чувствительности, равной 89%, and и специфичности, равной 71% и 95% относительно “стабильных” или “здоровых” образцов, соответственно (таблица 3). Высокая специфичность и чувствительность антител IgM против Glc(α) и против Glc(α 1-4) Glc(α) делает их эффективным инструментом для ранней диагностики и определения пациентов с РС. Тот факт, что уровень данных антител в ситуации атаки РС намного выше, чем в стабильной ситуации, делает их инструментом для раннего определения и предсказания атак у пациентов с рецидивирующим РС с ремиссиями.A reproducible and statistically significant difference in the level of IgM antibodies against Glc (α) and against Glc (α1-4) Glc (α) was found between the healthy group and the group with MS (Fig. 7A), but significant differences in IgG or IgA levels were found in research data (not shown). In the sera of both groups of patients with MS, the IgM levels against Glc (α) and against Glc (α1-4) Glc (α) were significantly higher than in a healthy population. An arbitrarily set optimal cutoff level (signal of 97% percentile of the “healthy” population) was used to identify positive samples above and negative samples below the cutoff level. Thus, anti-Glc (α) antibody binding signals led to the correct determination of 19 of 42 samples with MS (
Высокая степень корреляции между уровнем в сыворотке антитела IgM против Glc(α) у женщин, клинически диагностированных пациенток с РС (рецидивирующим с ремиссиями), которые были определены как позитивные в смысле наличия антитела IgM против Glc(α) (как описано выше), и наблюдаемым коэффициентом EDSS данных женщин (расширенная шкала статуса недееспособности), см. фиг.8, левый сектор. Не имелось корреляции между EDSS и уровнями антител IgM против Glc(α) в сыворотке у женщин, клинически диагностированных пациенток с РС (рецидивирующим с ремиссиями), которые были определены как негативные в смысле наличия антитела IgM против Glc(α), см. фиг.8, левый сектор. Высокая корреляция указывает на то, что уровень IgM против Glc(α) в сыворотке может действовать в качестве заместительного молекулярного биомаркера для оценки активности заболевания.A high degree of correlation between serum levels of anti-Glc (α) IgM antibodies in women, clinically diagnosed patients with MS (recurring with remissions) who were identified as positive in the sense of having an anti-Glc (α) IgM antibody (as described above), and the observed EDSS coefficient for these women (extended disability status scale), see Fig. 8, left sector. There was no correlation between EDSS and serum IgM anti-Glc (α) antibody levels in women, clinically diagnosed patients with MS (recurring with remissions) who were identified as negative in the sense of having an anti-Glc (α) IgM antibody, see FIG. 8, the left sector. A high correlation indicates that serum IgM anti-Glc (α) levels may act as a molecular replacement biomarker for assessing disease activity.
Временные колебания уровня антигликановых антителTemporary fluctuations in the level of antiglycan antibodies
При рассмотрении какого-либо биологического параметра для применения в качестве заместительного биомаркера очевидной предпосылкой является то, что данный биомаркер не варьирует во времени в нормальной популяции. Поэтому проводили мониторинг уровня в сыворотке антител IgG, IgA и IgM против L-Rha(α), против GlcNAc(α) и против Glc(β 1-4) Glc(β 1-4) Glc(β) (β-целлотриозы) у семи здоровых добровольцев в течение 13 недель (фиг.9). В общем, было обнаружено, что концентрации антител в сыворотке варьировали между различными субъектами, но являлись довольно стабильными в течение времени. Например, сыворотки #9161 и #9162 характеризовались очень высоким и стабильным во времени уровнем антител IgA против GlcNAc(α) и Glc(β 1-4) Glc(β 1-4) Glc(β), соответственно, но относительно нормальным уровнем IgA против L-Rha(β) и антител IgG и IgM. Когда происходят изменения уровня антитела, они часто постепенны и продолжаются в течение нескольких недель (например, сыворотка #9162; IgA против Glc(β 1-4) Glc(β 1-4) Glc(β)), но также могут быть внезапными, например, сыворотка #9172; IgM против L-Rha(α), уровень которого внезапно увеличился между четвертой и пятой неделями и затем опять медленно вернулся к своему фоновому уровню.When considering a biological parameter for use as a replacement biomarker, the obvious premise is that this biomarker does not vary in time in a normal population. Therefore, serum levels of antibodies IgG, IgA and IgM were monitored against L-Rha (α), against GlcNAc (α) and against Glc (β 1-4) Glc (β 1-4) Glc (β) (β-cellotriose) in seven healthy volunteers for 13 weeks (Fig.9). In general, it was found that serum antibody concentrations varied between different subjects, but were fairly stable over time. For example, sera # 9161 and # 9162 had a very high and stable over time IgA antibody level against GlcNAc (α) and Glc (β 1-4) Glc (β 1-4) Glc (β), respectively, but relatively normal IgA level against L-Rha (β) and IgG and IgM antibodies. When changes in antibody levels occur, they are often gradual and last for several weeks (for example,
Пример 4Example 4
Профиль антигликановых антител (AGAP) в нормальной человеческой популяцииAntiglycan Antibody Profile (AGAP) in a Normal Human Population
Определяли связывание общих Ig (детектированных белком А) сывороток 72 субъектов с 34 моно- и олигосахаридами (фиг.11 и таблица 5) и связывание IgG, IgA и IgM 200 сывороток с шестью моно- и олигосахаридами (фиг.15A-C). Наиболее сильный сигнал фиксировали для антител против GlcNAc(α) и L-Rha(α), в то время как наблюдались более низкие уровни антител против связанных в β4-положении глюкозы олигосахаридов, GlcNAc(β), GlcNAс(β 1-4) GlcNAс(β), Gal(α) и Gal(α 1-3) Gal(β 1-4) GlcNAc(β). Это хорошо согласовывалось с ранее опубликованными данными, в которых показано распределение антигликановых антител в коммерчески доступной объединенной человеческой сыворотке (WО02/064556). AGAP подклассов IgG и IgA был сходным с AGAP общих Ig, при этом уровень IgM был более низким и более однородным среди различных гликанов. Антигликановые антитела данной популяции имели тенденцию принимать логнормальное распределение, см. фиг.15A-15C. Было очевидным, что между субъектами в оцененной популяции существует значительная вариация уровня антигликановых антител, факт, который указывает на существование индивидуальных AGAP, но ограничивает поиск маркеров антигликановыми антителами, присутствующими в малых количествах.The binding of total Ig (detected by protein A) sera of 72 subjects with 34 mono- and oligosaccharides (Fig. 11 and Table 5) and the binding of IgG, IgA and
Гликаны, иммобилизованные на аффинных гранулах, также были использованы для очистки антител к β4-связанным олигосахаридам глюкозы и L-Rha(α). Профиль их связывания и специфичность описаны на фиг.13, 14A и 14B.Glycans immobilized on affinity granules have also been used to purify antibodies to β4-linked glucose oligosaccharides and L-Rha (α). Their binding profile and specificity are described in FIGS. 13, 14A and 14B.
ПРИМЕР 5EXAMPLE 5
Применение антигликановых антител для различения пациентов с высоким риском атеросклероза и уязвимыми бляшками от пациентов с низким риском атеросклероза со стабильными бляшкамиThe use of antiglycan antibodies to distinguish patients with a high risk of atherosclerosis and vulnerable plaques from patients with a low risk of atherosclerosis with stable plaques
Уровень антигликановых антител в сыворотке пациентов с атеросклерозом с уязвимыми бляшками сравнивали с уровнем гликановых антител в сыворотке пациентов с атеросклерозом со стабильными бляшками, а также с данным уровнем у субъектов без атеросклероза.The level of antiglycan antibodies in the serum of patients with atherosclerosis with vulnerable plaques was compared with the level of glycan antibodies in the serum of patients with atherosclerosis with stable plaques, as well as with this level in subjects without atherosclerosis.
Атеросклероз представляет собой основную причину заболеваемости и смертности в развитых странах. Это системное нарушение стенок кровеносных сосудов, которое ведет к развитию атеросклеротических бляшек на стенках кровеносных сосудов. Некоторые из данных бляшек позже становятся уязвимыми к разрушению, что вызывает кровяные сгустки, вызывающие сердечные приступы или инсульт.Atherosclerosis is the leading cause of morbidity and mortality in developed countries. This is a systemic violation of the walls of blood vessels, which leads to the development of atherosclerotic plaques on the walls of blood vessels. Some of these plaques later become vulnerable to destruction, which causes blood clots, causing heart attacks or stroke.
Основными компонентами атеросклеротических бляшек являются протеогликаны, липиды, мышечные клетки и лейкоциты (T-клетки и макрофаги). Кроме того, атеросклероз понимается как аутоиммунное заболевание, где одной из причин его развития является перекрестная реактивность между антителами против бактериальных антигенов и антигенов стенок кровеносных сосудов.The main components of atherosclerotic plaques are proteoglycans, lipids, muscle cells and white blood cells (T cells and macrophages). In addition, atherosclerosis is understood as an autoimmune disease, where one of the reasons for its development is the cross-reactivity between antibodies against bacterial antigens and antigens of blood vessel walls.
Важным моментом развития атеросклероза является преобразование стабильных бляшек (СБ), которые ассоциированы с низким риском, в воспаленные уязвимые бляшки (УБ), которые ассоциированы с высоким риском. Различение СБ и УБ клинически проблематично, поскольку окончательное отличие может быть выявлено только путем посмертной аутопсии.An important point in the development of atherosclerosis is the conversion of stable plaques (SB), which are associated with low risk, into inflamed vulnerable plaques (UB), which are associated with high risk. The distinction between SB and UB is clinically problematic, since the final difference can only be detected by post-mortem autopsy.
Образцы сыворотки были поставлены д-ром Jacob George из кардиологического отделения Тель-Авивского Медицинского центра, Израиль. Все пациенты были мужчинами без диабета с возрастным интервалом от 30 до 69 лет. Тестировали 39 образцов сыворотки от пациентов следующих типов.Serum samples were supplied by Dr. Jacob George of the Cardiology Unit, Tel Aviv Medical Center, Israel. All patients were non-diabetic men with an age range of 30 to 69 years. Tested 39 serum samples from the following types of patients.
Нестабильная стенокардия - 13 пациентов с атеросклерозом, характеризовавшиеся острым коронарным синдромом (инфаркты миокарда с зубцом Q или без зубца Q). Все их синдромы, как считали, развивались вследствие разрушения уязвимых бляшек. Представители группы нестабильной стенокардии включали в себя пациентов с острым коронарным синдромом при выявленных болях в грудной клетке и изменениях ЭКГ или повышении сердечных маркеров. Они жаловались на недавнее начало (<3 суток) стенокардии и подвергались непрерывному телеметрическому мониторингу электрокардиограммы (ЭКГ) во время обследования. По меньшей мере, один приступ стенокардии покоя или приступ, длившийся более 20 мин, отмечался у них в течение последних 48 часов вместе с повышением уровня креатинкиназы, уровня миоглобина или уровня тропонина. Представители данной группы претерпевали коронарную ангиографию (катетеризацию), при которой было показано наличие коронарного атеросклероза. Unstable angina pectoris - 13 patients with atherosclerosis characterized by acute coronary syndrome (myocardial infarction with Q wave or without Q wave). All of their syndromes were thought to develop as a result of the destruction of vulnerable plaques. Representatives of the unstable angina group included patients with acute coronary syndrome with detected chest pain and ECG changes or increased cardiac markers. They complained about the recent onset (<3 days) of angina pectoris and underwent continuous telemetric monitoring of the electrocardiogram (ECG) during the examination. At least one episode of resting angina pectoris or an attack lasting more than 20 minutes was observed in them during the last 48 hours along with an increase in creatine kinase, myoglobin or troponin. Representatives of this group underwent coronary angiography (catheterization), in which the presence of coronary atherosclerosis was shown.
Стабильная стенокардия - 13 пациентов с атеросклерозом характеризовались стабильной стенокардией. Представители группы стабильной стенокардии претерпевали коронарную ангиографию (катетеризацию), при которой было показано наличие коронарного атеросклероза. Не было выявлено изменений ЭКГ, и уровень креатинкиназы, миоглобина и тропонина не повышался. Stable angina pectoris - 13 patients with atherosclerosis were characterized by stable angina pectoris. Representatives of the stable angina pectoris group underwent coronary angiography (catheterization), in which the presence of coronary atherosclerosis was shown. No ECG changes were detected, and creatine kinase, myoglobin, and troponin levels did not increase.
Отсутствие бляшек - 13 пациентов с нормальными коронарными артериями. Представители группы “без бляшек” при катетеризации не характеризовались признаками коронарного атеросклероза. The absence of plaques - 13 patients with normal coronary arteries. Representatives of the “no plaque” group during catheterization were not characterized by signs of coronary atherosclerosis.
Профиль антигликановых антител получали с использованием массивов GlycoChip™ (Glycominds, Ltd., Лод, Израиль, кат. № 9100), сконструированных с использованием процедур, описанных в WO00/49412. Все образцы сыворотки тестировали с использованием планшетов GlycoChip™ (Glycominds Ltd., Лод, Израиль, кат. № 9100), которые содержали массив ковалентно присоединенных моно- и олигосахаридов в 384-луночном планшете для микротитрования сниженного объема. Список моно- и олигосахаридов, представленных в массиве, а также их серийные номера, приведен в таблице 4.An antiglycan antibody profile was obtained using GlycoChip ™ arrays (Glycominds, Ltd., Lod, Israel, Cat. No. 9100) constructed using the procedures described in WO00 / 49412. All serum samples were tested using GlycoChip ™ plates (Glycominds Ltd., Lod, Israel, Cat. No. 9100), which contained an array of covalently attached mono- and oligosaccharides in a 384-well reduced volume microtiter plate. The list of mono- and oligosaccharides represented in the array, as well as their serial numbers, are shown in table 4.
Сыворотки разбавляли (1:20) в TBST, раскапывали в планшет GlycoChip™ с использованием робота Tecan Genesis Workstation 200 (10 мкл/лунку) и инкубировали 30 мин при 25°С. Каждый гликан и образец сыворотки на планшете тестировали 8 раз.Sera were diluted (1:20) in TBST, digested into a GlycoChip ™ plate using a Tecan Genesis Workstation 200 (10 μl / well) and incubated for 30 min at 25 ° C. Each glycan and serum sample on the plate were tested 8 times.
Планшеты промывали 250 мкл/лунку буфера с высоким содержанием солей (0,15 M KNa, pH 7,2, NaCl 2 M, MgSО4 0,085 M, 0,05% Tween 20) в автоматическом устройстве для промывки планшетов (Tecan, PowerWasher™). 10 мкл/лунку биотинилированного антитела против человеческих IgG, IgM или IgA (Jackson, Пенсильвания, США), 1 мкг/мл в TBST, раскапывали вручную и инкубировали планшеты в течение 30 мин при 25°C. Планшет промывали опять буфером с высоким содержанием солей.The plates were washed with 250 μl / well of high salt buffer (0.15 M KNa, pH 7.2, NaCl 2 M, MgSO 4 0.085 M, 0.05% Tween 20) in an automatic plate washer (Tecan, PowerWasher ™ ) 10 μl / well of biotinylated anti-human IgG, IgM or IgA antibody (Jackson, PA, USA), 1 μg / ml in TBST, was manually digested and the plates were incubated for 30 min at 25 ° C. The tablet was washed again with a high salt buffer.
Конъюгированный со стрептавидином европий, Wallac, AD0062 (1 мкл/мл, 10 мкл/лунку) добавляли вручную с последующей инкубацией в течение 30 мин при 25°C в темноте. Промывку планшетов буфером с высоким содержанием солей повторяли. Усиливающий буфер Delfia™ (Wallac, 730232, 10 мкл/лунку) добавляли в лунки, и планшеты инкубировали, по меньшей мере, в течение 30 мин в темноте. Флуоресценцию лунок считывали посредством Victor 1420 (Wallac) с использованием разрешенных по времени настроек флуоресценции с испусканием при 612 нм и возбуждением при 340 нм.Conjugated with streptavidin europium, Wallac, AD0062 (1 μl / ml, 10 μl / well) was added manually, followed by incubation for 30 min at 25 ° C in the dark. Washing the plates with a high salt buffer was repeated. Delfia ™ amplification buffer (Wallac, 730232, 10 μl / well) was added to the wells, and the plates were incubated for at least 30 minutes in the dark. Well fluorescence was read by Victor 1420 (Wallac) using time-resolved fluorescence settings with emission at 612 nm and excitation at 340 nm.
Сигнал связывания гликанов, полученный от группы “без бляшек”, использовали для расчета уровня отсечения для каждого гликана, выше которых пациентов считали позитивными. Данные уровни отсечения определяли как средний сигнал группы “без бляшек” плюс одно или два стандартных отклонения. Согласно данному определению выявляли некоторое число гликанов, имеющих некоторую степень силы разделения между группами пациентов (см. ниже). “Разделение”, основанное на конкретном гликане, определяли как, по меньшей мере, 50% (7/13) позитивных образцов в группах “нестабильной стенокардии” или “стабильной стенокардии”, и 2 или менее позитивных образца в группе “без бляшек”.The glycan binding signal obtained from the “no plaque” group was used to calculate the cutoff level for each glycan, above which patients were considered positive. These cutoff levels were determined as the average signal of the “no plaque” group plus one or two standard deviations. According to this definition, a certain number of glycans having a certain degree of separation power between groups of patients was revealed (see below). “Separation” based on a specific glycan was defined as at least 50% (7/13) of positive samples in the “unstable angina” or “stable angina” groups, and 2 or less positive samples in the “no plaque” group.
Фиг.16A представляет собой матричное представление гликанов, использованных для оценки сывороток пациентов, страдающих от нестабильной или стабильной стенокардии; структуры гликанов описаны в таблице 4. Гликаны, значимо различающиеся уровни антител, против которых были измерены в разных группах пациентов, обозначены закрашенными квадратами. На уровне отсечения, представляющем собой среднее плюс два стандартных отклонения, “разделение” достигалось при связывании IgA с двумя различными гликанами. Одно из антител IgG было разделяющим, но ни одно среди антител IgM не оказалось таковым.Figa is a matrix representation of the glycans used to evaluate the sera of patients suffering from unstable or stable angina pectoris; glycan structures are described in Table 4. Glycans, significantly different antibody levels, against which were measured in different groups of patients, are indicated by filled squares. At the cut-off level, which is the mean plus two standard deviations, “separation” was achieved by binding of IgA to two different glycans. One of the IgG antibodies was separating, but none of the IgM antibodies was found to be.
Отдельные гликаны, которые обеспечивали лучшее разделение, представлены ниже:The individual glycans that provided the best separation are presented below:
Некоторые гликаны, которые не были определены как “разделяющие”, тем не менее, обеспечивали некоторую степень разделения. При использовании их комбинаций разделение может улучшаться по сравнению с таковой для отдельных гликанов. Данные гликаны представлены ниже.Some glycans that were not defined as “separating,” however, provided some degree of separation. When using their combinations, the separation can be improved compared with that for individual glycans. These glycans are presented below.
Линейный кодLine code
Фиг.16B является графическим представлением, на котором показаны уровни антител против гликанов #2 и #29 в трех группах пациентов. Прямоугольник включает в себя сигналы 50% популяции. Толстые и тонкие линии в прямоугольнике представляют собой средние значения и медианы, соответственно. Граница прямоугольника, ближайшая к нулю, означает 25-тый процентиль, граница прямоугольника, дальнейшая от нуля, означает 75-тый процентиль. Планки выше и ниже прямоугольника означают 90-тый и 10-тый процентили.Figv is a graphical representation showing the levels of antibodies against
Фиг.17 представляет собой гистограмму, на которой показано число образцов в трех группах пациентов, позитивных в плане антител IgA против гликана #2 или гликана #29.17 is a histogram showing the number of samples in three patient groups that are positive for IgA antibodies against
Фиг.18A представляет собой гистограмму, в которой показано распределение уровней антител против гликанов #2 и #15 в трех группах пациентов. Прямоугольник включает в себя сигналы 50% популяции. Толстые и тонкие линии в прямоугольнике представляют собой средние значения и медианы, соответственно. Граница прямоугольника, ближайшая к нулю, означает 25-тый процентиль, граница прямоугольника, дальнейшая от нуля, означает 75-тый процентиль. Планки выше и ниже прямоугольника означают 90-тый и 10-тый процентили.Fig. 18A is a bar graph showing the distribution of
Фиг.18B представляет собой гистограмму, на которой показано число образцов в трех группах пациентов, позитивных в плане антител IgA против гликана #2 или гликана #15. На уровне отсечения, равном среднему, плюс одно стандартное отклонение, “разделение” достигалось при связывании IgA с 6 различными гликанами. Уровень антител IgG и IgM не отличался в данных трех группах.Figv is a histogram showing the number of samples in three groups of patients that are positive in terms of IgA antibodies against
Разделение, полученное с использованием комбинаций, показано ниже (Aa использовали, поскольку число позитивных образцов в группе “стабильной стенокардии” было ниже, чем при применении Ab, с улучшением таким образом разделения по сравнению с группой “нестабильной стенокардии”):The separation obtained using the combinations is shown below (Aa was used because the number of positive samples in the stable angina group was lower than with Ab, thus improving the separation compared to the unstable angina group):
Линейный кодLine code
Специфичность и чувствительность теста по детекции “нестабильной стенокардии” с использованием Aa и GNb4GNb составляли, таким образом, 62% (8/13) и 88% (23/26), соответственно.The specificity and sensitivity of the test for the detection of “unstable angina pectoris” using Aa and GNb4GNb were thus 62% (8/13) and 88% (23/26), respectively.
Комбинация трех гликанов Aa, GNb4GNb и Fb сделала возможной определение специфичности, равной 75% (9/13), также для группы “стабильной стенокардии”. Это проистекает из того факта, что Fb распознает большей частью “стабильную стенокардию”. Специфичность и чувствительность комбинированного анализа суммировали на фиг.19.The combination of the three glycans Aa, GNb4GNb and Fb made it possible to determine the specificity of 75% (9/13), also for the “stable angina” group. This stems from the fact that Fb recognizes for the most part “stable angina pectoris”. The specificity and sensitivity of the combined analysis were summarized in Fig. 19.
Данные результаты демонстрируют, что комбинация гликанов (Gal(α), GlcNAc(β 1-4) GlcNAc(β) и Fu(β) может применяться для успешного различения групп стабильной и нестабильной стенокардии со специфичностью, равной 62%, и чувствительностью, равной 88%. Данные результаты показывают, что, возможно разработать биомаркер, основанный на связывании гликанов антителами IgA, которые различает пациентов с нестабильной и стабильной стенокардией.These results demonstrate that the combination of glycans (Gal (α), GlcNAc (β 1-4) GlcNAc (β) and Fu (β) can be used to successfully distinguish between stable and unstable angina groups with a specificity of 62% and a sensitivity of 88%. These results show that it is possible to develop a biomarker based on glycan binding to IgA antibodies that distinguishes between patients with unstable and stable angina pectoris.
Пример 6Example 6
Применение антигликановых антител для различения пациентов с высоким риском атеросклероза, с уязвимыми бляшками и пациентов с низким риском атеросклероза со стабильными бляшкамиThe use of antiglycan antibodies to distinguish patients with a high risk of atherosclerosis, with vulnerable plaques and patients with a low risk of atherosclerosis with stable plaques
Уровни антигликановых антител в сыворотках пациентов с атеросклерозом с уязвимыми бляшками сравнивали с уровнем антител против гликанов в сыворотке пациентов с атеросклерозом со стабильными бляшками, а также субъектов без атеросклероза.The levels of antiglycan antibodies in the sera of patients with atherosclerosis with vulnerable plaques were compared with the levels of antibodies against glycans in the serum of patients with atherosclerosis with stable plaques, as well as subjects without atherosclerosis.
Атеросклероз представляет собой основную причину заболеваемости и смертности в развитых странах. Это системное нарушение стенок кровеносных сосудов, которое ведет к развитию атеросклеротических бляшек на стенках кровеносных сосудов. Некоторые из данных бляшек позже становятся уязвимыми к разрушению, что вызывает кровяные сгустки, вызывающие сердечные приступы или инсульт.Atherosclerosis is the leading cause of morbidity and mortality in developed countries. This is a systemic violation of the walls of blood vessels, which leads to the development of atherosclerotic plaques on the walls of blood vessels. Some of these plaques later become vulnerable to destruction, which causes blood clots, causing heart attacks or stroke.
Основными компонентами атеросклеротических бляшек являются протеогликаны, липиды, мышечные клетки и лейкоциты (T-клетки и макрофаги). Кроме того, атеросклероз понимается как аутоиммунное заболевание, где одной из причин его развития является перекрестная реактивность между антителами против бактериальных антигенов и антигенов стенок кровеносных сосудов.The main components of atherosclerotic plaques are proteoglycans, lipids, muscle cells and white blood cells (T cells and macrophages). In addition, atherosclerosis is understood as an autoimmune disease, where one of the reasons for its development is the cross-reactivity between antibodies against bacterial antigens and antigens of blood vessel walls.
Важным моментом развития атеросклероза является преобразование стабильных бляшек (СБ), которые ассоциированы с низким риском, в воспаленные уязвимые бляшки (УБ), которые ассоциированы с высоким риском. Различение СБ и УБ клинически проблематично, поскольку окончательное отличие может быть выявлено только путем посмертной аутопсии.An important point in the development of atherosclerosis is the conversion of stable plaques (SB), which are associated with low risk, into inflamed vulnerable plaques (UB), which are associated with high risk. The distinction between SB and UB is clinically problematic, since the final difference can only be detected by post-mortem autopsy.
Образцы сыворотки были поставлены д-ром Jacob George из кардиологического отделения Тель-Авивского Медицинского центра, Израиль. Все пациенты были мужчинами без диабета с возрастным интервалом от 30 до 69 лет. Тестировали 72 образцов сыворотки от пациентов следующих типов.Serum samples were supplied by Dr. Jacob George of the Cardiology Unit, Tel Aviv Medical Center, Israel. All patients were non-diabetic men with an age range of 30 to 69 years. Tested 72 serum samples from the following types of patients.
Нестабильная стенокардия - 24 пациентов с атеросклерозом, характеризовавшиеся острым коронарным синдромом (инфаркты миокарда с зубцом Q или без зубца Q). Все их синдромы, как считали, развивались вследствие разрушения уязвимых бляшек. Представители группы нестабильной стенокардии включали в себя пациентов с острым коронарным синдромом при выявленных болях в грудной клетке и изменениях ЭКГ или повышении сердечных маркеров. Они жаловались на недавнее начало (<3 суток) стенокардии и подвергались непрерывному телеметрическому мониторингу электрокардиограммы (ЭКГ) во время обследования. По меньшей мере, один приступ стенокардии покоя или приступ, длившийся более 20 мин, отмечался у них в течение последних 48 часов вместе с повышением уровня креатинкиназы, уровня миоглобина или уровня тропонина. Представители данной группы претерпевали коронарную ангиографию (катетеризацию), при которой было показано наличие коронарного атеросклероза. Unstable angina pectoris - 24 patients with atherosclerosis characterized by acute coronary syndrome (myocardial infarction with Q wave or without Q wave). All of their syndromes were thought to develop as a result of the destruction of vulnerable plaques. Representatives of the unstable angina group included patients with acute coronary syndrome with detected chest pain and ECG changes or increased cardiac markers. They complained about the recent onset (<3 days) of angina pectoris and underwent continuous telemetric monitoring of the electrocardiogram (ECG) during the examination. At least one episode of resting angina pectoris or an attack lasting more than 20 minutes was observed in them during the last 48 hours along with an increase in creatine kinase, myoglobin or troponin. Representatives of this group underwent coronary angiography (catheterization), in which the presence of coronary atherosclerosis was shown.
Стабильная стенокардия - 24 пациентов с атеросклерозом характеризовались стабильной стенокардией. Представители группы стабильной стенокардии претерпевали коронарную ангиографию (катетеризацию), при которой было показано наличие коронарного атеросклероза. Не было выявлено изменений ЭКГ, и уровень креатинкиназы, миоглобина и тропонина не повышался. Stable angina pectoris - 24 patients with atherosclerosis were characterized by stable angina pectoris. Representatives of the stable angina pectoris group underwent coronary angiography (catheterization), in which the presence of coronary atherosclerosis was shown. No ECG changes were detected, and creatine kinase, myoglobin, and troponin levels did not increase.
Отсутствие бляшек - 24 пациентов с нормальными коронарными артериями. Представители группы “без бляшек” при катетеризации не характеризовались признаками коронарного атеросклероза. The absence of plaques - 24 patients with normal coronary arteries. Representatives of the “no plaque” group during catheterization were not characterized by signs of coronary atherosclerosis.
Профиль антигликановых антител получали с использованием массивов GlycoChip™ (Glycominds, Ltd., Лод, Израиль, кат. № 9100), сконструированных с использованием процедур, описанных в WO00/49412. Все образцы сыворотки тестировали с использованием планшетов GlycoChip™ (Glycominds Ltd., Лод, Израиль, кат. № 9100), которые содержали массив ковалентно присоединенных моно- и олигосахаридов в 384-луночном планшете для микротитрования сниженного объема. Список моно- и олигосахаридов, представленных в массиве, а также их серийные номера, приведен в таблице 4.An antiglycan antibody profile was obtained using GlycoChip ™ arrays (Glycominds, Ltd., Lod, Israel, Cat. No. 9100) constructed using the procedures described in WO00 / 49412. All serum samples were tested using GlycoChip ™ plates (Glycominds Ltd., Lod, Israel, Cat. No. 9100), which contained an array of covalently attached mono- and oligosaccharides in a 384-well reduced volume microtiter plate. The list of mono- and oligosaccharides represented in the array, as well as their serial numbers, are shown in table 4.
Сыворотки разбавляли (1:20) в TBST, раскапывали в планшет GlycoChip™ с использованием робота Tecan Genesis Workstation 200 (10 мкл/лунку) и инкубировали 30 мин при 25°С. Каждый гликан и образец сыворотки на планшете тестировали 8 раз.Sera were diluted (1:20) in TBST, digested into a GlycoChip ™ plate using a Tecan Genesis Workstation 200 (10 μl / well) and incubated for 30 min at 25 ° C. Each glycan and serum sample on the plate were tested 8 times.
Планшеты промывали 250 мкл/лунку буфера с высоким содержанием солей (0,15 M KNa, pH 7,2, NaCl 2 M, MgSО4 0,085 M, 0,05% Tween 20) в автоматическом устройстве для промывки планшетов (Tecan, PowerWasher™). 10 мкл/лунку биотинилированного антитела козы против человеческих IgA (Jackson, Пенсильвания, США), 1 мкг/мл в TBST, раскапывали вручную и инкубировали планшеты в течение 30 мин при 25°C. Планшет промывали опять буфером с высоким содержанием солей.The plates were washed with 250 μl / well of high salt buffer (0.15 M KNa, pH 7.2, NaCl 2 M, MgSO 4 0.085 M, 0.05% Tween 20) in an automatic plate washer (Tecan, PowerWasher ™ ) 10 μl / well of a biotinylated goat anti-human IgA antibody (Jackson, PA, USA), 1 μg / ml in TBST, was manually digested and the plates were incubated for 30 min at 25 ° C. The tablet was washed again with a high salt buffer.
Конъюгированный со стрептавидином европий, Wallac, AD0062 (1 мкл/мл, 10 мкл/лунку) добавляли вручную с последующей инкубацией в течение 30 мин при 25°C в темноте. Промывку планшетов буфером с высоким содержанием солей повторяли. Усиливающий буфер Delfia™ (Wallac, 730232, 10 мкл/лунку) добавляли в лунки, и планшеты инкубировали, по меньшей мере, в течение 30 мин в темноте. Флуоресценцию лунок считывали посредством Victor 1420 (Wallac) с использованием разрешенных по времени настроек флуоресценции с испусканием при 612 нм и возбуждением при 340 нм.Conjugated with streptavidin europium, Wallac, AD0062 (1 μl / ml, 10 μl / well) was added manually, followed by incubation for 30 min at 25 ° C in the dark. Washing the plates with a high salt buffer was repeated. Delfia ™ amplification buffer (Wallac, 730232, 10 μl / well) was added to the wells, and the plates were incubated for at least 30 minutes in the dark. Well fluorescence was read by Victor 1420 (Wallac) using time-resolved fluorescence settings with emission at 612 nm and excitation at 340 nm.
Уровень отсечения рассчитывали от 80-го процентиля нормальной популяции. Согласно данному определению выявляли некоторое число гликанов, имеющих некоторую степень силы разделения между группами пациентов (см. ниже). “Разделение”, основанное на конкретном гликане, определяли как, по меньшей мере, 50% (12/24) позитивных образцов в группах “нестабильной стенокардии” или “стабильной стенокардии”, и 5 или менее позитивных образцов в группе “без бляшек”.The cutoff level was calculated from the 80th percentile of the normal population. According to this definition, a certain number of glycans having a certain degree of separation power between groups of patients was revealed (see below). “Separation” based on a specific glycan was defined as at least 50% (12/24) of positive samples in the “unstable angina” or “stable angina” groups, and 5 or less positive samples in the “no plaque” group.
Линейный кодLine code
Данные результаты демонстрируют, что комбинация гликанов Glc(α 1-4) Glc(α), Glc, GalNAc(β), GalNAc(α), GlcNAc(β 1-4) GlcNAc(β) и ксилозы (α) может использоваться для успешного различения групп стабильной и нестабильной стенокардии. Данные результаты демонстрируют, что возможно разработать биомаркер, основанный на связывании гликанов антителами IgA, который различает пациентов со стабильной и нестабильной стенокардией.These results demonstrate that the combination of glycans Glc (α 1-4) Glc (α), Glc, GalNAc (β), GalNAc (α), GlcNAc (β 1-4) GlcNAc (β) and xylose (α) can be used for successfully distinguishing between groups of stable and unstable angina. These results demonstrate that it is possible to develop a biomarker based on the binding of glycans to IgA antibodies, which distinguishes patients with stable and unstable angina pectoris.
Пример 7Example 7
Связывание CD4+ клеток с множеством гликанов, иммобилизованных на твердом субстратеBinding of CD4 + cells to multiple glycans immobilized on a solid substrate
Связывание оценивали на CD4+ клетках от 7 здоровых субъектов с 47 различными гликановыми фрагментами, иммобилизованными на микромассиве.Binding was evaluated on CD4 + cells from 7 healthy subjects with 47 different glycan fragments immobilized on a microarray.
Материалы и методыMaterials and methods
20 мл свежей крови от каждого из 7 субъектов отбирали с использованием пробирок EDTA-Vacutainer на 10 мл. Образцы периферических клеток центрифугировали (230хg, 900 об/мин, 10 минут при комнатной температуре). Затем отделяли плазму и верхние 2 мл клеточной фракции переносили в пробирку объемом 15 мл. Для обогащения CD4+ клеток в пробирки добавляли 100 мкл реагента RosetteSep и инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре. Образцы затем разбавляли в два раза в PBS/2% FCS, на суспензию клеток наслаивали 5 мл Ficoll с использованием стеклянной пастеровской пипетки.20 ml of fresh blood from each of the 7 subjects was collected using 10 ml EDTA-Vacutainer tubes. Samples of peripheral cells were centrifuged (230xg, 900 rpm, 10 minutes at room temperature). Then the plasma was separated and the upper 2 ml of the cell fraction was transferred into a 15 ml tube. To enrich CD4 + cells, 100 μl of RosetteSep reagent was added to the tubes and incubated for 20 minutes at room temperature. The samples were then diluted twice in PBS / 2% FCS, 5 ml Ficoll was layered onto the cell suspension using a glass Pasteur pipette.
Пробирки центрифугировали в течение 30 минут при комнатной температуре при 2400 об/мин (~700хg) с выключенным тормозом центрифуги. После центрифугирования пробирки осторожно удаляли из центрифуги. Верхний слой осторожно отбирали стерильной пипеткой, оставляя слой лимфоцитов нераспределенным на поверхности раздела. С использованием стерильной пипетки фракцию лейкоцитов переносили в чистую пробирку, и пробирку полностью заполняли PBS/2% FCS. Клетки отмывали опять дважды центрифугированием в течение 10 минут, 230хg (1000 об/мин) и ресуспендировали в PBS/2% FCS. После центрифугирований клетки ресуспендировали в 500 мкл RPMI 1640/2% FCS.The tubes were centrifuged for 30 minutes at room temperature at 2400 rpm (~ 700xg) with the centrifuge brake turned off. After centrifugation, the tubes were carefully removed from the centrifuge. The top layer was carefully selected with a sterile pipette, leaving the layer of lymphocytes unallocated at the interface. Using a sterile pipette, the leukocyte fraction was transferred to a clean tube and the tube was completely filled with PBS / 2% FCS. Cells were washed again twice by centrifugation for 10 minutes, 230xg (1000 rpm) and resuspended in PBS / 2% FCS. After centrifugation, the cells were resuspended in 500 μl of RPMI 1640/2% FCS.
Клетки разводили в растворе Тюрка 1:10 и подсчитывали. После подсчета клетки разводили до плотности 5х106 клеток/мл в RPMI 1640/2% FCS, затем переносили в 24-луночный планшет 1 мл/лунку. Клеточные суспензии инкубировали в течение ночи при 95%-ной влажности, 37°C, в инкубаторе с 5% CO2.Cells were diluted in Turk solution 1:10 and counted. After counting, the cells were diluted to a density of 5x10 6 cells / ml in RPMI 1640/2% FCS, then transferred to a 24-
Для определения выходов разделения клеток путем FACS 250000 клеток суспендировали в 1 мл буфера для FACS и затем центрифугировали 10 минут при 2000 об/мин при 4°C. Надосадочную жидкость декантировали. Клетки ресуспендировали в 50 мкл буфера для FACS и метили 5 мкл антитела против CD4. Клетки инкубировали в течение 30 минут на льду, закрывали от света. Добавляли 1 мл ледяного буфера для FACS и центрифугировали в течение 10 минут 2000 об/мин, 4°C. Затем клетки ресуспендировали в 300 мкл буфера для FACS, хранили на льду и подсчитывали в приборе FACS.To determine the cell separation yields by FACS, 250,000 cells were suspended in 1 ml of FACS buffer and then centrifuged for 10 minutes at 2000 rpm at 4 ° C. The supernatant was decanted. Cells were resuspended in 50 μl FACS buffer and 5 μl anti-CD4 antibody was labeled. Cells were incubated for 30 minutes on ice, covered from light. Added 1 ml of ice-cold FACS buffer and centrifuged for 10 minutes at 2000 rpm, 4 ° C. Cells were then resuspended in 300 μl FACS buffer, stored on ice and counted in a FACS instrument.
Чипы GlycoChip помещали на держатели стекол в пластиковые сосуды с увлажненной бумагой внутри них для сохранения влажности. Суспензии клеток помещали в количестве 1,2 мкл/лунку GlycoChip, затем инкубировали в инкубаторе с 5% CО2 (95% влажность, 37°C) в течение часа. После инкубации стекла аккуратно помещали вниз верхней стороной в камеру для центрифугирования, погруженную в PBS. Чипы GlycoChip центрифугировали в течение двух минут при 700 об/мин (минимальное ускорение g, ~50хg). Стекла осматривали под микроскопом и фиксировали PBS/3,7% формальдегиде при комнатной температуре, по меньшей мере, в течение 30 минут. Стекла затем аккуратно промывали 3 раза в DDW и высушивали на воздухе.GlycoChip chips were placed on glass holders in plastic containers with moistened paper inside them to preserve moisture. Cell suspensions were placed in an amount of 1.2 μl / well of GlycoChip, then incubated in an incubator with 5% CO 2 (95% humidity, 37 ° C) for one hour. After incubation, the glasses were carefully placed downside down in a centrifugation chamber immersed in PBS. GlycoChip chips were centrifuged for two minutes at 700 rpm (minimum acceleration g, ~ 50xg). The glasses were examined under a microscope and PBS / 3.7% formaldehyde was fixed at room temperature for at least 30 minutes. The glasses were then gently washed 3 times in DDW and dried in air.
Получали раствор пропидия иодида в PBS и распределяли по 1,2 мкл/лунку. Чипы GlycoChip инкубировали в условиях влажности в течение 15 минут, затем аккуратно ополаскивали 3 раза путем погружения в DDW. Стекла сушили на воздухе в темноте и сканировали с настройками на пропидия иодид, представляющими собой возбуждение при 535 нм и испускание при 655 нм на сканере для массивов. Изображение анализировали и определяли плотность клеток.A solution of propidium iodide in PBS was obtained and dispensed at 1.2 μl / well. GlycoChip chips were incubated under humidity for 15 minutes, then gently rinsed 3 times by immersion in DDW. The glasses were dried in air in the dark and scanned with the settings for propidium iodide, representing excitation at 535 nm and emission at 655 nm on a scanner for arrays. The image was analyzed and cell density was determined.
Результатыresults
Гликаны и контроли, использованные для исследования связывания, показаны на фиг.20 ниже. Структуру описывали согласно синтаксису LinearCode, см. таблицу 1 для перевода.Glycans and controls used for binding assays are shown in FIG. 20 below. The structure was described according to LinearCode syntax, see table 1 for translation.
Гистограмма, на которой показан профиль связывания CD4+ клеток от одного субъекта, показана на фиг.20. Показано связывание в DLU/мм2 для каждого из гликанов или контролей. Связывание CD4+ клеток от семи субъектов с гликанами или контролями показано на фиг.21A. На фиг.21A показана средняя относительная флуоресценция для CD4+ клеток от каждого из семи субъектов.A histogram showing the binding profile of CD4 + cells from one subject is shown in FIG. The binding in DLU / mm 2 for each of the glycans or controls is shown. The binding of CD4 + cells from seven subjects to glycans or controls is shown in figa. On figa shows the average relative fluorescence for CD4 + cells from each of the seven subjects.
Данные результаты демонстрируют, что связывание CD4+ клеток варьирует среди различных гликанов. Наиболее сильное связывание наблюдали со следующими гликанами, в порядке их относительного сродства: CD4+ клетки связывают следующие гликаны, представленные в LinearCode; NNa3Ab4(Fa3)GNb>Mb4Gb>GNb4GNb>Ma3Ma>Ab6Ab. Также выявляли связывание CD4+ клеток с гликанами с концевыми остатками маннозы или остатками сиалированного углевода Льюиса X. Вариацию связывания CD4+ с конкретными гликанами также выявляли среди различных субъектов.These results demonstrate that CD4 + cell binding varies among different glycans. The strongest binding was observed with the following glycans, in order of their relative affinity: CD4 + cells bind the following glycans presented in LinearCode; NNa3Ab4 (Fa3) GNb> Mb4Gb> GNb4GNb> Ma3Ma> Ab6Ab. Binding of CD4 + cells to glycans with terminal residues of mannose or sialylated Lewis X carbohydrate residues was also detected. Variations in binding of CD4 + to specific glycans were also detected among various subjects.
Другие осуществленияOther implementations
Следует понимать, что хотя данное изобретение приведено в связи с его конкретным описанием, вышеупомянутое описание предназначено для иллюстрации, а не для ограничения объема изобретения, которое определено объемом прилагаемой формулой изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации лежат в объеме последующей формулы изобретения.It should be understood that although the invention is provided in connection with its specific description, the above description is intended to illustrate and not to limit the scope of the invention, which is defined by the scope of the attached claims. Other aspects, advantages, and modifications are within the scope of the following claims.
Claims (37)
получают тестируемый образец крови, сыворотки или плазмы от субъекта;
выявляют в указанном тестируемом образце по меньшей мере одно антитело против Glc(α1-4) Glc(α);
и сравнивают уровень содержания указанного антитела в указанном тестируемом образце с таковым в контрольном образце крови, сыворотки или плазмы, где указанный контрольный образец выбран из группы, состоящей из образцов, полученных от одного или нескольких субъектов, у которых выявлены симптомы рассеянного склероза, и имеющих выявленный статус рассеянного склероза, а также от одного или нескольких субъектов, у которых не выявлены симптомы рассеянного склероза.1. A method for diagnosing multiple sclerosis in a subject, characterized in that
receive a test sample of blood, serum or plasma from the subject;
at least one anti-Glc (α1-4) Glc (α) antibody is detected in said test sample;
and comparing the level of the content of the indicated antibodies in the specified test sample with that in the control sample of blood, serum or plasma, where the specified control sample is selected from the group consisting of samples obtained from one or more subjects who have symptoms of multiple sclerosis, and having identified the status of multiple sclerosis, as well as from one or more subjects who have not revealed symptoms of multiple sclerosis.
получают тестируемый образец крови, сыворотки или плазмы от субъекта;
выявляют в указанном тестируемом образце антитело IgM против Glc(α1-4) Glc(α); сравнивают уровень содержания указанного антитела в указанном тестируемом образце с таковым в контрольном образце крови, сыворотки или плазмы от субъекта, чей статус рассеянного склероза является стабильным; и идентифицируют тех субъектов, у которых уровень антител является эквивалентным или повышенным в сравнении с уровнем антител у субъектов в 80% процентиле контрольной популяции;
при этом идентифицированным субъектам ставится диагноз атаки рассеянного склероза.19. A method for diagnosing an attack of multiple sclerosis in a subject, characterized in that
receive a test sample of blood, serum or plasma from the subject;
detect an IgM antibody against Glc (α1-4) Glc (α) in said test sample; compare the level of the content of the specified antibodies in the specified test sample with that in the control sample of blood, serum or plasma from a subject whose status of multiple sclerosis is stable; and identify those subjects in which the level of antibodies is equivalent or increased compared with the level of antibodies in subjects in 80% percentile of the control population;
in this case, the identified subjects are diagnosed with an attack of multiple sclerosis.
получают тестируемый образец крови, сыворотки или плазмы от субъекта;
определяют, содержит ли указанный тестируемый образец антитело типа IgM против Glc(α1-4) Glc(α); и сравнивают уровень содержания указанного, по меньшей мере, одного антитела в указанном тестируемом образце с таковым в контрольном образце крови, сыворотки или плазмы, причем контрольный образец получен от одного или нескольких субъектов, чей статус рассеянного склероза представляет собой ремиссию, стабильное состояние или атаку.27. A method for assessing the severity of a disease of multiple sclerosis in a subject, characterized in that
receive a test sample of blood, serum or plasma from the subject;
determining whether said test sample contains an anti-Glc (α1-4) Glc (α) type IgM antibody; and comparing the level of said at least one antibody in said test sample with that in a control sample of blood, serum or plasma, the control sample being obtained from one or more subjects whose multiple sclerosis status is remission, stable condition or attack.
выявляют в указанном тестируемом образце антитело типа IgM против Glc(α1-4) Glc(α) и антитело типа IgM против Glc(α); и
сравнивают уровень содержания указанных антител в указанном тестируемом образце с таковым в указанном контрольном образце.29. The method according to item 27, wherein
an anti-Glc (α1-4) Glc (α) type IgM antibody and an anti-Glc (α) type IgM antibody are detected in said test sample; and
compare the level of the content of these antibodies in the specified test sample with that in the specified control sample.
первый гликановый реагент, который специфично выявляет антитело против Glc(α1-4) Glc(α);
второй гликановый реагент, который специфично выявляет второе антитело, выбранное из группы, состоящей из антитела против Glc(α), антитела против Glc(α1-4) Glc(α), антитела против Glc(α1-4) Glc(β), антитела против Glc(β), антитела против Gal(β); антитела против Glc(β1-4) Glc(β1-4) Glc(β), антитела против GlcNAc(β1-4) GlcNAc(β), антитела против L-Araf(α), антитела против L-Rha(α), антитела против Gal(β1-3)[GlcNAc(β1-6)] GalNAc(α), антитела против Gal(β1-4) GlcNAc(α), антитела против Gal(β1-3) GalNAc(α), антитела против Gal(β1-3) GlcNAc(β), антитела против GlcA(β) или антитела против GlcA(β) и антитела против Xyl(α); и указания для применения указанного набора.35. A kit for diagnosing symptoms associated with multiple sclerosis, containing
a first glycan reagent that specifically detects an antibody against Glc (α1-4) Glc (α);
a second glycan reagent that specifically detects a second antibody selected from the group consisting of antibodies against Glc (α), antibodies against Glc (α1-4) Glc (α), antibodies against Glc (α1-4) Glc (β), antibodies against Glc (β), antibodies against Gal (β); antibodies against Glc (β1-4) Glc (β1-4) Glc (β), antibodies against GlcNAc (β1-4) GlcNAc (β), antibodies against L-Araf (α), antibodies against L-Rha (α), antibodies against Gal (β1-3) [GlcNAc (β1-6)] GalNAc (α), antibodies against Gal (β1-4) GlcNAc (α), antibodies against Gal (β1-3) GalNAc (α), antibodies against Gal (β1-3) GlcNAc (β), anti-GlcA (β) antibodies or anti-GlcA (β) antibodies and anti-Xyl (α) antibodies; and instructions for applying the specified set.
получают тестируемый образец крови, сыворотки или плазмы от субъекта;
выявляют в указанном тестируемом образце антитело IgM против Glc(α); сравнивают уровень содержания указанного антитела в указанном тестируемом образце с таковым в контрольном образце крови, сыворотки или плазмы от субъекта, чей статус рассеянного склероза является стабильным; и идентифицируют тех субъектов, у которых уровень антител является эквивалентным или повышенным в сравнении с уровнем антител у субъектов в 80% процентиле контрольной популяции; при этом идентифицированным субъектам ставится диагноз атаки рассеянного склероза. 37. A method for diagnosing an attack of multiple sclerosis in a subject, characterized in that
receive a test sample of blood, serum or plasma from the subject;
anti-Glc (α) IgM antibody is detected in said test sample; compare the level of the content of the specified antibodies in the specified test sample with that in the control sample of blood, serum or plasma from a subject whose status of multiple sclerosis is stable; and identify those subjects in which the level of antibodies is equivalent or increased compared with the level of antibodies in subjects in 80% percentile of the control population; in this case, the identified subjects are diagnosed with attack of multiple sclerosis.
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US40091402P | 2002-08-02 | 2002-08-02 | |
| US60/400,914 | 2002-08-02 | ||
| US44707603P | 2003-02-13 | 2003-02-13 | |
| US60/447,076 | 2003-02-13 | ||
| US60/462,984 | 2003-04-15 | ||
| US47323103P | 2003-05-23 | 2003-05-23 | |
| US60/473,231 | 2003-05-23 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2005105699A RU2005105699A (en) | 2005-09-20 |
| RU2369874C2 true RU2369874C2 (en) | 2009-10-10 |
Family
ID=35848898
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005105699/15A RU2369874C2 (en) | 2002-08-02 | 2003-08-04 | Method of multiocular sclerosis diagnostics |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2369874C2 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2601298C2 (en) * | 2011-05-30 | 2016-10-27 | Клиникум Рехтс Дер Изар Дер Технишен Универзитет Мюнхен | Means and methods for diagnosing and treating multiple sclerosis |
| RU2626832C1 (en) * | 2016-03-02 | 2017-08-02 | Татьяна Петровна Оспельникова | Method for neutralising antibodies determination in blood serum of patients with multiple sclerosis, treated with interferon-beta drugs |
| RU2736275C1 (en) * | 2017-07-07 | 2020-11-13 | Дойчес Кребсфоршунгсцентрум | Improved rep protein for use in diagnostic analyzes |
-
2003
- 2003-08-04 RU RU2005105699/15A patent/RU2369874C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PANINI IS at al. Proceeding of the 10 th international congress of immunology, 1998, p.1234-1244. BOZZARO S at al., Monoclonal antibodies against dictiostelium plasma membranes their binding to simple sugars. Cell differentiation, 1985, v.17, p.83-94. MATSUDA T at al., Antibody response to haptenic sugar antigen immunodominancy of protein-bound lactose formed by amino-carbonyl reaction, Molecular Immunology, 1987, v.24, p.421-426. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2601298C2 (en) * | 2011-05-30 | 2016-10-27 | Клиникум Рехтс Дер Изар Дер Технишен Универзитет Мюнхен | Means and methods for diagnosing and treating multiple sclerosis |
| RU2626832C1 (en) * | 2016-03-02 | 2017-08-02 | Татьяна Петровна Оспельникова | Method for neutralising antibodies determination in blood serum of patients with multiple sclerosis, treated with interferon-beta drugs |
| RU2736275C1 (en) * | 2017-07-07 | 2020-11-13 | Дойчес Кребсфоршунгсцентрум | Improved rep protein for use in diagnostic analyzes |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2005105699A (en) | 2005-09-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20100081160A1 (en) | Method for Diagnosing Multiple Sclerosis | |
| US7906291B2 (en) | Method for diagnosing multiple sclerosis | |
| KR101678703B1 (en) | Galectin-3 immunoassay | |
| JP2010510528A (en) | Biomarkers for autoimmune diseases | |
| JP4927093B2 (en) | Detection of soluble adiponectin receptor peptides and use in diagnosis and therapy | |
| US20150233947A1 (en) | Body Fluid BIN1 as a Marker of Cardiac Health | |
| CN101460852A (en) | The use of MRP 8/14 levels for discrimination of individualsat risk of acute coronary syndromes | |
| RU2369874C2 (en) | Method of multiocular sclerosis diagnostics | |
| US20040241763A1 (en) | Method for diagnosing multiple sclerosis | |
| US20200209242A1 (en) | Cancer diagnosis using ki-67 | |
| JP5275211B2 (en) | Determination method using interstitial pneumonia marker |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140805 |