RU2346688C2

RU2346688C2 - Fat content control

Info

Publication number: RU2346688C2
Application number: RU2005117608/14A
Authority: RU
Inventors: Патрик Д. ФУРНЕЙ (US); Патрик Д. ФУРНЕЙ; Волкмар ГУЭНЗЛЕР-ПУКАЛЛ (US); Волкмар ГУЭНЗЛЕР-ПУКАЛЛ; Стифен Джей КЛАУС (US); Стифен Джей КЛАУС; Ал Вай ЛИН (US); Ал Вай ЛИН; Томас Б. НЕФФ (US); Томас Б. Нефф; Тодд В. СИЛЕЙ (US); Тодд В. СИЛЕЙ
Original assignee: Фиброген, Инк.
Priority date: 2002-12-06
Filing date: 2003-12-05
Publication date: 2009-02-20
Also published as: RU2008133870A; RU2397766C2; RU2005117608A

Abstract

FIELD: medicine; endocrinology.

SUBSTANCE: fat content control in the organism is ensured by stabilisation of alpha subunit of hypoxia induced factor protein (HIFα). To stabilise HIFα, effective amount of compound, inhibiting HIF hydroxylase activity, is introduced.

EFFECT: reduced lipogenesis and lipopexia ensured with fat metabolism control.

23 cl, 11 dwg, 13 ex

Description

В настоящей заявка заявлен приоритет предварительной патентной заявки США с порядковым номером 60/431351, поданной 6 декабря 2002 года; предварительной патентной заявки США с порядковым номером 60/476331, поданной 6 июня 2003 года; и предварительной патентной заявки США с порядковым номером 60/476726, поданной 6 июня 2003 года, каждая из которых приводится здесь в виде ссылки во всей своей полноте.This application claims the priority of a provisional US patent application serial number 60/431351, filed December 6, 2002; US Provisional Patent Application Serial Number 60/476331 filed June 6, 2003; and U.S. Patent Application Serial Number 60/476726, filed June 6, 2003, each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к гомеостазу и метаболизму жира и регулированию веса тела.The present invention relates to homeostasis and fat metabolism and regulation of body weight.

Предпосылки создания изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION

Ожирение, обычно определяемое в виде показателя массы тела (BMI) с величиной, равной 30 или выше, представляет собой основную проблему здоровья, особенно в индустриально развитых странах. Подсчитано, что в настоящее время ожирению подвержено 250 миллионов человек среди взрослого населения, и ожидается, что это количество существенно возрастет, как только подростки с чрезмерным весом достигнут возраста взрослых людей, страдающих ожирением. Как отмечалось выше, ожирение связывают со многими опасными для здоровья явлениями, включающими повышенный риск развития диабета и болезни сердца. Было показано, в частности, что абдоминальное ожирение, распространение избыточной жировой ткани в абдоминальной области, коррелируются с диабетом, заболеванием сердца, например, метаболическим синдромом. Избыточное содержание жира коррелируется с повышенной возможностью сердечного приступа, инсульта или другого типа сердечно-сосудистого заболевания; высоким давлением крови, высоким содержанием холестерина, диабетом; раком, включая постклимактерический рак молочной железы и рак матки, толстой кишки и почки; артритом, желчно-каменными заболеваниями, апноэ во сне и появлением астмы у взрослых людей. Существует, таким образом, необходимость в данной области в эффективном средстве для регулирования метаболизма жира и осуществимых способах для достижения снижения веса тела и сведения к минимуму опасности развития или прогрессирования сопутствующих состояний.Obesity, usually defined as a body mass index (BMI) of 30 or greater, is a major health problem, especially in industrialized countries. It is estimated that 250 million adults are currently obese, and this number is expected to increase significantly once overweight adolescents reach the age of obese adults. As noted above, obesity is associated with many health hazards, including an increased risk of diabetes and heart disease. It was shown, in particular, that abdominal obesity, the spread of excess adipose tissue in the abdominal region, is correlated with diabetes, heart disease, for example, metabolic syndrome. Excessive fat is correlated with an increased chance of a heart attack, stroke, or other type of cardiovascular disease; high blood pressure, high cholesterol, diabetes; cancer, including postmenopausal breast cancer and cancer of the uterus, colon and kidney; arthritis, gallstone disease, sleep apnea and asthma in adults. Thus, there is a need in the art for an effective means for regulating fat metabolism and feasible methods for achieving a reduction in body weight and minimizing the risk of developing or progressing related conditions.

Ввиду многочисленных опасных состояний, связанных с измененным или нарушенным метаболизмом жира и гомеостазом жира, увеличением частоты ожирения и нерегулируемого увеличения веса, существует необходимость в способах регулирования метаболизма жира. Кроме того, в данной области существует необходимость в способах регулирования веса тела путем регулирования продуцирования, утилизации и накопления жира. Кроме того, в данной области существует необходимость в способах и соединениях для лечения ожирения.In view of the many dangerous conditions associated with altered or impaired fat metabolism and fat homeostasis, an increase in the frequency of obesity and unregulated weight gain, there is a need for methods of regulating fat metabolism. In addition, in this area there is a need for methods of regulating body weight by regulating the production, utilization and accumulation of fat. In addition, there is a need in the art for methods and compounds for treating obesity.

Краткое описание изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к способам и соединениям для регулирования метаболизма жира в организме человека, достижения гомеостаза жира, регулирования веса тела, снижения жировых накоплений и индуцирования потери веса у субъекта. Представлены также способы и соединения для лечения или профилактики ожирения, включая ожирение, стимулированное диетой, ожирение, связанное с диабетом, и т.д.The present invention relates to methods and compounds for regulating fat metabolism in the human body, achieving fat homeostasis, regulating body weight, reducing fat accumulation, and inducing weight loss in a subject. Also provided are methods and compounds for treating or preventing obesity, including diet-induced obesity, diabetes-related obesity, etc.

В различных вариантах осуществления настоящего изобретения, субъектом является клетка, ткань или орган. В других вариантах настоящего изобретения субъектом является животное, предпочтительно, млекопитающее, более предпочтительно, человек. Когда субъектом является клетка, в изобретении конкретно рассматривают тот факт, что клетка может быть изолированной клеткой, либо прокариотической или эукариотической клеткой. В случае, когда субъектом является ткань, изобретение конкретно рассматривает и эндогенные ткани, и ткани in vitro, например, ткани, выращенные в культуре. В предпочтительных вариантах, субъектом является животное, в частности, животное млекопитающего вида, включая крысу, кролика, корову, овцу, свинью, мышь, лошадь и вид примата. В наиболее предпочтительном варианте, субъектом является человек.In various embodiments of the present invention, the subject is a cell, tissue or organ. In other embodiments of the present invention, the subject is an animal, preferably a mammal, more preferably a human. When the subject is a cell, the invention specifically addresses the fact that the cell may be an isolated cell, or a prokaryotic or eukaryotic cell. In the case where the subject is tissue, the invention specifically contemplates both endogenous tissues and in vitro tissues, for example, tissues grown in culture. In preferred embodiments, the subject is an animal, in particular an animal of a mammalian species, including rat, rabbit, cow, sheep, pig, mouse, horse and primate species. In a most preferred embodiment, the subject is a human.

В настоящем изобретении представлены способы регулирования метаболизма жира у субъекта. В одном из аспектов изобретения, способы настоящего изобретения включают регулирование метаболизма жира у субъекта путем стабилизирования HIFα у субъекта, регулируя таким образом метаболизм жира у субъекта. В различных аспектах изобретения, HIFα представляет собой HIF-1α, HIF-2α или HIF-3α. В предпочтительном аспекте настоящего изобретения, стабилизирование субъединицы HIFα включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое ингибирует HIF гидроксилазную активность, таким образом стабилизируя HIFα.The present invention provides methods for regulating fat metabolism in a subject. In one aspect of the invention, the methods of the present invention include regulating fat metabolism in a subject by stabilizing HIFα in a subject, thereby regulating fat metabolism in a subject. In various aspects of the invention, HIFα is HIF-1α, HIF-2α or HIF-3α. In a preferred aspect of the present invention, stabilizing the HIFα subunit comprises administering to the subject an effective amount of a compound that inhibits HIF hydroxylase activity, thereby stabilizing HIFα.

Стабилизацию HIFα можно осуществлять любым из способов, доступных специалисту в данной области, и эта стабилизация может включать использование любого агента, который взаимодействует с HIFα, связывает HIFα, или модифицирует HIFα, или может включать использование факторов, которые взаимодействуют с HIFα, включая, например, ферменты, для которых HIFα является субстратом. В конкретных аспектах, в настоящем изобретении представлено создание конститутивно устойчивого варианта HIFα, например, устойчивых HIF мутеинов и т.д., или полинуклеотида, кодирующего такой вариант. В другом аспекте, в настоящем изобретении рассматривают тот факт, что стабилизирование HIFα включает введение агента, который стабилизирует HIFα. Агент может состоять из полинуклеотидов; полипептидов; антител; других белков; углеводов; жиров; липидов и органических и неорганических веществ, например, небольших молекул и т.д. В предпочтительном варианте, в настоящем изобретении представлено стабилизирование HIFα, например, у субъекта путем введения субъекту агента, который стабилизирует HIFα, где агент представляет собой соединение, например, низкомолекулярное соединение и т.д., которое стабилизирует HIFα.Stabilization of HIFα can be accomplished by any of the methods available to a person skilled in the art, and this stabilization may include the use of any agent that interacts with HIFα, binds HIFα, or modifies HIFα, or may include the use of factors that interact with HIFα, including, for example, enzymes for which HIFα is a substrate. In specific aspects, the present invention provides the creation of a constitutively stable variant of HIFα, for example, resistant HIF muteins, etc., or a polynucleotide encoding such an option. In another aspect, the present invention contemplates the fact that stabilizing HIFα involves administering an agent that stabilizes HIFα. An agent may consist of polynucleotides; polypeptides; antibodies; other proteins; carbohydrates; fats; lipids and organic and inorganic substances, for example, small molecules, etc. In a preferred embodiment, the present invention provides stabilization of HIFα, for example, in a subject by administering to the subject an agent that stabilizes HIFα, where the agent is a compound, for example, a low molecular weight compound, etc. that stabilizes HIFα.

В настоящем изобретении, кроме того, представлены способы регулирования метаболизма жира у субъекта путем введения субъекту эффективного количества соединения настоящего изобретения, таким образом, регулируя метаболизм жира у субъекта. В одном из аспектов изобретения, соединение настоящего изобретения представляет собой соединение, которое ингибирует HIF гидроксилазную активность. В предпочтительном аспекте изобретения, соединение настоящего изобретения представляет собой соединение, которое ингибирует HIF пролилгидроксилазную активность. В другом предпочтительном аспекте настоящего изобретения, HIF гидроксилазу выбирают из группы, состоящей из EGLN1, EGLN2 и EGLN3.The present invention also provides methods for regulating fat metabolism in a subject by administering to the subject an effective amount of a compound of the present invention, thereby regulating fat metabolism in the subject. In one aspect of the invention, a compound of the present invention is a compound that inhibits HIF hydroxylase activity. In a preferred aspect of the invention, the compound of the present invention is a compound that inhibits HIF prolyl hydroxylase activity. In another preferred aspect of the present invention, HIF hydroxylase is selected from the group consisting of EGLN1, EGLN2, and EGLN3.

В настоящем изобретении, кроме того, представлены способы регулирования процесса метаболизма жира у субъекта путем стабилизирования HIFα у субъекта или путем введения субъекту эффективного количества соединения настоящего изобретения, тем самым регулируя процесс метаболизма жира у субъекта. В различных вариантах настоящего изобретения, процесс метаболизма жира выбирают из группы, состоящей, например, из поглощения жира, транспорта жира, накопления жира, процессинга жира, утилизации жира и синтеза жира.The present invention also provides methods for controlling the process of fat metabolism in a subject by stabilizing HIFα in a subject or by administering to the subject an effective amount of a compound of the present invention, thereby controlling the process of fat metabolism in a subject. In various embodiments of the present invention, the fat metabolism process is selected from the group consisting, for example, of fat absorption, fat transport, fat accumulation, fat processing, fat utilization, and fat synthesis.

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения, представлены способы изменения экспрессии регуляторного фактора жира у субъекта путем стабилизирования HIFα у субъекта или путем введения субъекту эффективного количества соединения настоящего изобретения, тем самым изменяя экспрессию регуляторного фактора жира у субъекта.In specific embodiments of the present invention, methods are provided for altering the expression of a regulatory fat factor in a subject by stabilizing HIFα in the subject or by administering to the subject an effective amount of a compound of the present invention, thereby altering the expression of the regulatory fat factor in the subject.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, представлен способ увеличения экспрессии регуляторного фактора жира у субъекта путем стабилизирования HIFα у субъекта или путем введения субъекту эффективного количества соединения настоящего изобретения, тем самым увеличивая экспрессию регуляторного фактора жира у субъекта. В других вариантах осуществления настоящего изобретения, регуляторный фактор жира выбирают из группы, состоящей из лептина, аполипопротеина A-IV, цитозольной ацил-СоА-тиоэстеразы-1, связующего белка инсулиноподобного фактора роста (IGFBP)-1, карнитин-ацетилтрансферазы и PAI-1. В конкретном аспекте настоящего изобретения, увеличение экспрессии регуляторного фактора жира у субъекта представляет собой непрерывное увеличение.In one embodiment, the invention provides a method of increasing expression of a regulatory fat factor in a subject by stabilizing HIFα in the subject or by administering to the subject an effective amount of a compound of the present invention, thereby increasing expression of the regulatory fat factor in the subject. In other embodiments, the regulatory fat factor is selected from the group consisting of leptin, apolipoprotein A-IV, cytosolic acyl CoA thioesterase-1, binding protein of insulin-like growth factor (IGFBP) -1, carnitine acetyltransferase and PAI-1 . In a specific aspect of the present invention, an increase in expression of a regulatory fat factor in a subject is a continuous increase.

Представлены, кроме того, способы изменения экспрессии адипогенных факторов. В одном из вариантов осуществления изобретения, настоящее изобретение включает способы увеличения экспрессии DEC1/Stra 13 у субъекта, включающие стабилизирование HIFα у субъекта или введение субъекту эффективного количества соединения настоящего изобретения, тем самым уменьшая экспрессию DEC1/Stra 13 у субъекта. В другом варианте осуществления изобретения, представлены способы снижения экспрессии пролифератором пероксисомы активированного рецептора (PPAR)-γ у субъекта, спосо6, включающий стабилизирование HIFα у субъекта или введение субъекту соединения настоящего изобретения, тем самым уменьшая экспрессию (PPAR)-γ у субъекта.Also presented are methods for altering the expression of adipogenic factors. In one embodiment, the present invention includes methods of increasing the expression of DEC1 / Stra 13 in a subject, comprising stabilizing HIFα in the subject or administering to the subject an effective amount of a compound of the present invention, thereby reducing the expression of DEC1 / Stra 13 in the subject. In another embodiment, methods are provided for reducing expression of an activated receptor peroxisome (PPAR) -γ peroxisome proliferator in a subject, method 6 comprising stabilizing HIFα in the subject or administering to the subject a compound of the present invention, thereby reducing expression (PPAR) -γ in the subject.

В настоящем изобретении представлены способы достижения гомеостаза жира у субъекта. В одном из аспектов, способы настоящего изобретения включают достижение гомеостаза жира у субъекта, путем стабилизирования HIFα у субъекта, тем самым достигая гомеостаза жира у субъекта. В другом аспекте, способы настоящего изобретения представляют достижение гомеостаза жира у субъекта путем введения субъекту эффективного количества соединения настоящего изобретения, тем самым достигая гомеостаза жира у субъекта.The present invention provides methods for achieving fat homeostasis in a subject. In one aspect, the methods of the present invention include achieving fat homeostasis in a subject by stabilizing HIFα in a subject, thereby achieving fat homeostasis in a subject. In another aspect, the methods of the present invention represent achieving a fat homeostasis in a subject by administering to the subject an effective amount of a compound of the present invention, thereby achieving fat homeostasis in the subject.

В настоящем изобретении представлены способы регулирования веса тела у субъекта. В одном из аспектов, способы настоящего изобретения включают регулирование веса тела у субъекта путем стабилизирования HIFα у субъекта, тем самым регулируя вес тела у субъекта. В другом аспекте, способы настоящего изобретения включают регулирование веса тела у субъекта путем введения субъекту эффективного количества соединения настоящего изобретения, тем самым регулируя вес тела у субъекта.The present invention provides methods for controlling body weight in a subject. In one aspect, the methods of the present invention include regulating body weight in a subject by stabilizing HIFα in a subject, thereby adjusting body weight in a subject. In another aspect, the methods of the present invention include controlling the body weight of a subject by administering to the subject an effective amount of a compound of the present invention, thereby adjusting the body weight of the subject.

В настоящем изобретении представлены способы снижения содержания жира в организме у субъекта. В одном из аспектов, способы настоящего изобретения включают снижение содержания жира в организме у субъекта путем стабилизирования HIFα у субъекта, тем самым достигая снижения содержания жира в организме у субъекта. В другом аспекте, способы настоящего изобретения включают снижение содержания жира в организме у субъекта путем введения субъекту эффективного количества соединения настоящего изобретения, тем самым снижая содержание жира в организме у субъекта. В различных аспектах настоящего изобретения, жир в организме у субъекта представляет собой накопленный или отложенный жир, и снижение его содержания представляет собой снижение содержания накопленного жира (т.е. жировых накоплений). В других аспектах настоящего изобретения, применяют способы профилактики накопления или отложения жира, например, профилактики увеличения количества накопленного жира. В других аспектах настоящего изобретения, жир в организме у субъекта представляет собой висцеральный жир или абдоминальный жир.The present invention provides methods for reducing body fat in a subject. In one aspect, the methods of the present invention include reducing body fat in a subject by stabilizing HIFα in the subject, thereby achieving a reduction in body fat in the subject. In another aspect, the methods of the present invention include reducing body fat in a subject by administering to the subject an effective amount of a compound of the present invention, thereby reducing body fat in the subject. In various aspects of the present invention, body fat in a subject is accumulated or stored fat, and a decrease in its content is a decrease in stored fat (i.e., fat accumulation). In other aspects of the present invention, methods are used to prevent the accumulation or deposition of fat, for example, to prevent an increase in the amount of stored fat. In other aspects of the present invention, the body fat in a subject is visceral fat or abdominal fat.

В настоящем изобретении представлены способы индуцирования потери веса у субъекта. В одном из аспектов, способы настоящего изобретения включают индуцирование потери веса у субъекта путем стабилизирования HIFα у субъекта, тем самым индуцируя потерю веса. В другом аспекте, способы настоящего изобретения содержат индуцирование потери веса у субъекта путем введения субъекту эффективного количества соединения настоящего изобретения, тем самым индуцируя потерю веса. В предпочтительном аспекте изобретения, соединение настоящего изобретения представляет собой соединение, которое ингибирует HIF гидроксилазную активность. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, представлены способы индуцирования потери веса у субъекта без сопутствующей потери веса мышц. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения, потеря веса является зависимой от дозы.The present invention provides methods for inducing weight loss in a subject. In one aspect, the methods of the present invention include inducing weight loss in a subject by stabilizing HIFα in a subject, thereby inducing weight loss. In another aspect, the methods of the present invention comprise inducing weight loss in a subject by administering to the subject an effective amount of a compound of the present invention, thereby inducing weight loss. In a preferred aspect of the invention, the compound of the present invention is a compound that inhibits HIF hydroxylase activity. In one embodiment of the present invention, methods for inducing weight loss in a subject without concomitant muscle weight loss are provided. In specific embodiments of the present invention, weight loss is dose dependent.

В настоящем изобретении представлены способы лечения или профилактики ожирения у субъекта. В одном из аспектов, способы настоящего изобретения включают лечение или профилактику ожирения у субъекта путем стабилизирования HIFα у субъекта, тем самым осуществляя лечение или профилактику ожирения. В другом аспекте, способы настоящего изобретения включают лечение или профилактику ожирения у субъекта путем введения субъекту эффективного количества соединения настоящего изобретения, тем самым осуществляя лечение или профилактику ожирения. В конкретных аспектах настоящего изобретения предполагается, что ожирение является ожирением, индуцируемым диетой. В других аспектах настоящего изобретения, ожирение ассоциируют с диабетом, например, ожирение как фактор риска развития диабета, или ожирение, которое развивается вместе с прогрессированием заболевания или является результатом прогрессирования заболевания.The present invention provides methods for treating or preventing obesity in a subject. In one aspect, the methods of the present invention include treating or preventing obesity in a subject by stabilizing HIFα in the subject, thereby treating or preventing obesity. In another aspect, the methods of the present invention include treating or preventing obesity in a subject by administering to the subject an effective amount of a compound of the present invention, thereby treating or preventing obesity. In specific aspects of the present invention, it is contemplated that obesity is diet induced obesity. In other aspects of the present invention, obesity is associated with diabetes, for example, obesity as a risk factor for diabetes, or obesity, which develops along with the progression of the disease or results from the progression of the disease.

В настоящем изобретении представлены способы снижения потребления кислорода у субъекта. В одном из аспектов, способы настоящего изобретения включают снижение потребления кислорода у субъекта путем стабилизирования HIFα у субъекта, тем самым снижая потребление кислорода у субъекта. В другом аспекте, способы настоящего изобретения включают снижение потребления кислорода у субъекта путем введения субъекту эффективного количества соединения настоящего изобретения, тем самым снижая потребление кислорода у субъекта. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения, способами изобретения снижают потребность кислорода у субъекта. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения, субъект представляет собой клетку, ткань, орган, систему, содержащую множество органов, или целый организм, включая животное, предпочтительно, млекопитающее, наиболее предпочтительно, человека. Кроме того, способы настоящего изобретения можно использовать, например, для снижения потребности в кислороде и увеличения метаболической эффективности у клеток, выращенных в культуре.The present invention provides methods for reducing oxygen consumption in a subject. In one aspect, the methods of the present invention include reducing oxygen consumption in a subject by stabilizing HIFα in a subject, thereby reducing oxygen consumption in a subject. In another aspect, the methods of the present invention include reducing oxygen consumption in a subject by administering to the subject an effective amount of a compound of the present invention, thereby reducing oxygen consumption in the subject. In specific embodiments of the present invention, methods of the invention reduce oxygen demand in a subject. In various embodiments of the present invention, the subject is a cell, tissue, organ, system containing many organs, or the whole organism, including an animal, preferably a mammal, most preferably a human. In addition, the methods of the present invention can be used, for example, to reduce oxygen demand and increase metabolic efficiency in cells grown in culture.

В одном из вариантов осуществления изобретения, представлены способы генерирования энергии у субъекта в условиях низкого содержания кислорода. В другом варианте осуществления изобретения, представлены способы, индуцирования метаболического сдвига в потреблении кислорода, например, снижения потребления кислорода. Конкретно представлены способы сведения к минимуму потребления кислорода, которые требуются для достижения и поддержания меняющихся уровней напряжения. Эти способы могут быть, в частности, полезными в случаях их применения при повышенных уровнях напряжения, например, атлетических занятиях, физическом напряжении, например, под водой, на большой высоте, в условиях сильного стресса, например, в условиях на поле сражения и т.д.In one embodiment of the invention, methods are provided for generating energy in a subject under conditions of low oxygen content. In another embodiment of the invention, methods are provided for inducing a metabolic shift in oxygen consumption, for example, reducing oxygen consumption. Specifically presented are methods of minimizing oxygen consumption that are required to achieve and maintain varying voltage levels. These methods can be, in particular, useful in cases of their application at elevated levels of stress, for example, athletic training, physical stress, for example, under water, at high altitude, under severe stress, for example, in conditions on the battlefield, etc. d.

В указанных выше способах конкретно представлено использование соединения настоящего изобретения. В определенных аспектах изобретения, соединение настоящего изобретения выбирают из группы, состоящей из соединений А, В, С, D, Е, F, G и Н. В одном из аспектов изобретения, соединение представляет собой миметик 2-оксоглутарат-диоксигеназы. В другом аспекте изобретения, миметик 2-оксоглутарат-диоксигеназы представляет собой замещенный гетероциклический карбоксамид. В настоящем изобретении конкретно представлены варианты, в которых замещенный гетероциклический карбоксамид выбирают из группы, состоящей из хинолинов, изохинолинов, фенантролинов, пиридинов, пиримидинов, β-карболинов и т.д.The above methods specifically describe the use of a compound of the present invention. In certain aspects of the invention, the compound of the present invention is selected from the group consisting of compounds A, B, C, D, E, F, G, and H. In one aspect of the invention, the compound is a 2-oxoglutarate-dioxygenase mimetic. In another aspect of the invention, the 2-oxoglutarate-dioxygenase mimetic is a substituted heterocyclic carboxamide. The present invention specifically provides embodiments in which a substituted heterocyclic carboxamide is selected from the group consisting of quinolines, isoquinolines, phenanthrolins, pyridines, pyrimidines, β-carbolines, etc.

В различных вариантах осуществления настоящего изобретения, представлены композиции, или лекарственные препараты, или фармацевтические композиции, включающие соединения настоящего изобретения, и способы производства и использования таких композиций, или лекарственных препаратов, или фармацевтических композиций.In various embodiments of the present invention, compositions or medicaments or pharmaceutical compositions are provided comprising the compounds of the present invention and methods for the manufacture and use of such compositions, or medicaments, or pharmaceutical compositions.

В одном из вариантов осуществления изобретения, представлены способы лечения или профилактики состояния, связанного с ухудшенным гомеостазом жира у субъекта исследования, страдающего таким состоянием, способы, включающие стабилизирование HIFα у субъекта или введение субъекту эффективного количества соединения настоящего изобретения, тем самым осуществляя лечение или профилактику развития указанного состояния у субъекта исследования. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения, состояние, связанное с ухудшенным гомеостазом жира, представляет собой ожирение, включающее ожирение, индуцированное диетой; генетически индуцированное ожирение; ожирение, которое является результатом определенных терапевтических лечений или развивается в связи с определенными терапевтическими лечениями, например, терапии на основе инсулина и т.д., гиперлипидемии, гиполипидемии, холестеринемии или атеросклероза.In one embodiment, methods of treating or preventing a condition associated with impaired homeostasis of fat in a subject suffering from such a condition are provided, methods comprising stabilizing HIFα in a subject or administering to the subject an effective amount of a compound of the present invention, thereby treating or preventing development the specified condition in the subject of the study. In various embodiments of the present invention, a condition associated with impaired fat homeostasis is obesity, including diet induced obesity; genetically induced obesity; obesity, which is the result of certain therapeutic treatments or develops in connection with certain therapeutic treatments, for example, insulin-based therapies, etc., hyperlipidemia, hypolipidemia, cholesterolemia or atherosclerosis.

В одном из вариантов осуществления изобретения, представлены способы лечения или профилактики состояния, связанного с ухудшенным метаболизмом жира у субъекта, страдающего таким состоянием, способы, включающие стабилизирование HIFα у субъекта или введение субъекту эффективного количества соединения настоящего изобретения, тем самым осуществляя лечение или профилактику развития указанного состояния у субъекта. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения, состояние, связанное с ухудшенным гомеостазом жира, представляет собой ожирение, включающее ожирение, индуцированное диетой; генетически индуцированное ожирение; ожирение, которое является результатом определенных терапевтических лечений или развивается в связи с определенными терапевтическими лечениями, например, терапии на основе инсулина и т.д., гиперлипидемии, гиполипидемии, холестеринемии, атеросклероза и т.д.In one embodiment, methods for treating or preventing a condition associated with impaired fat metabolism in a subject suffering from such a condition are provided, methods comprising stabilizing HIFα in a subject or administering to a subject an effective amount of a compound of the present invention, thereby treating or preventing the development of said conditions in the subject. In various embodiments of the present invention, a condition associated with impaired fat homeostasis is obesity, including diet induced obesity; genetically induced obesity; obesity, which is the result of certain therapeutic treatments or develops in connection with certain therapeutic treatments, for example, insulin-based therapies, etc., hyperlipidemia, hypolipidemia, cholesterolemia, atherosclerosis, etc.

Эти и другие варианты осуществления настоящего изобретения будут легко понятны специалистам в данной области в свете раскрываемого здесь ниже описания изобретения.These and other embodiments of the present invention will be readily apparent to those skilled in the art in light of the description of the invention disclosed herein below.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

На Фигурах 1А, 1В и 1C показаны уровни лептина в клеточной культурной среде человека после обработки различными соединениями настоящего изобретения. Линии клеток, показанные на чертежах, представляют собой преадипоциты, адипоциты, фибробласты крайней плоти человека (HFF), микрососудистые эндотелиальные клетки человека (НМЕС-1), эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC), клетки гепатоклеточной карционмы человека (Нер 3В), фетальные эпителиальные клетки печени, трансформированные аденовирусом, (293А) и эпителиальные клетки карционмы шейки матки (HeLa).Figures 1A, 1B, and 1C show leptin levels in a human cell culture medium after treatment with various compounds of the present invention. The cell lines shown in the drawings are preadipocytes, adipocytes, human foreskin fibroblasts (HFF), human microvascular endothelial cells (HMEC-1), human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), human hepatocellular carcinoma cells (Hep 3B), fetal adenovirus-transformed liver epithelial cells (293A) and cervical carcinoma epithelial cells (HeLa).

На Фигурах 2А и 2В показано увеличение экспрессии генов, кодирующих белки, которые принимают участие в метаболизме жира, и распределение генов в печени животных, подвергнутых лечению соединением настоящего изобретения. На Фиг.2А показана экспрессия различных генов, которые принимают участие в метаболизме жира, включая аполипопротеин A-IV, ацил-СоА-тиоэстеразу, карнитин-ацетилтрансферазу и связующий белок инсулиноподобного фактора роста (IGFBP)-1. На Фиг.2В показана экспрессия гена плазминогенного активаторного ингибитора (PAI)-1.Figures 2A and 2B show an increase in the expression of genes encoding proteins that are involved in fat metabolism and the distribution of genes in the liver of animals treated with a compound of the present invention. 2A shows the expression of various genes that are involved in fat metabolism, including apolipoprotein A-IV, acyl CoA thioesterase, carnitine acetyltransferase, and insulin-like growth factor binding protein (IGFBP) -1. Figure 2B shows the expression of the plasminogen activator inhibitor (PAI) -1 gene.

На Фигурах 3А, 3В и 3С показаны изменения экспрессии генов, кодирующих факторы, которые принимают участие в ответной реакции клеток на жирные кислоты и триглицериды. На Фиг.3А показаны изменения экспрессии DEC1/Stra 13 в течение времени после обработки соединением изобретения. На Фиг.3В показано увеличение экспрессии DEC1/Stra 13 в нескольких тканях после обработки. На Фиг.3С показано уменьшение экспрессии пролифератором пероксисомы активированного рецептора (PPAR)-γ после обработки соединениями изобретения.Figures 3A, 3B, and 3C show changes in the expression of genes encoding factors that are involved in the response of cells to fatty acids and triglycerides. 3A shows changes in the expression of DEC1 / Stra 13 over time after treatment with a compound of the invention. Figure 3B shows an increase in the expression of DEC1 / Stra 13 in several tissues after treatment. FIG. 3C shows a decrease in expression of the activated receptor peroxisome (PPAR) -γ peroxisome proliferator after treatment with the compounds of the invention.

На Фигурах 4А и 4В показаны изменения веса тела и веса органов у животных, подвергнутых лечению различными дозами соединения настоящего изобретения. На Фиг.4А показано зависимое от дозы замедление увеличения веса тела у животных, подвергнутых лечению соединением изобретения. На фигуре 4В показано, что потеря веса у животных не обусловлена потерей веса мышц и/или жизненных органов, как, например, сердца.Figures 4A and 4B show changes in body weight and organ weight in animals treated with various doses of a compound of the present invention. FIG. 4A shows a dose-dependent inhibition of weight gain in animals treated with a compound of the invention. Figure 4B shows that weight loss in animals is not due to weight loss of muscles and / or vital organs, such as, for example, the heart.

На Фиг.5 показано зависимое от дозы уменьшение содержания висцерального жира у животных, подвергнутых лечению соединением изобретения.Figure 5 shows a dose-dependent reduction in visceral fat in animals treated with a compound of the invention.

На Фигурах 6А, 6В и 6С показано уменьшение увеличения веса тела и веса абдоминальной жировой ткани у модели животного с ожирением, индуцированным диетой, при лечении соединением изобретения.Figures 6A, 6B and 6C show a decrease in the increase in body weight and the weight of abdominal adipose tissue in an animal model with obesity induced by diet in the treatment of a compound of the invention.

На Фигуре 7 показано снижение уровней содержания триглицеридов в сыворотке у модели животного с диабетом при лечении соединением изобретения.Figure 7 shows a decrease in serum triglyceride levels in an animal model with diabetes in the treatment of a compound of the invention.

На Фигурах 8А и 8В показана зависимая от дозы стабилизация HIF-1α в клетках, обработанных соединениями изобретения.Figures 8A and 8B show dose-dependent stabilization of HIF-1α in cells treated with the compounds of the invention.

На Фигурах 9А и 9В показано индуцирование транспортера-1 глюкозы (GluT-1) и альдолазы в клетках, обработанных соединениями изобретения.Figures 9A and 9B show the induction of glucose transporter-1 (GluT-1) and aldolase in cells treated with the compounds of the invention.

На Фигурах 10А, 10В и 10С показано увеличение экспрессии генов, принимающих участие в регулировании содержания глюкозы в почке, печени и легком, соответственно, у животных, подвергнутых лечению с использованием соединения изобретения.Figures 10A, 10B, and 10C show an increase in the expression of genes involved in the regulation of glucose in the kidney, liver, and lung, respectively, in animals treated with the compound of the invention.

На Фиг.11 показана ответная реакция на дозу потребления кислорода в клетках аденокарциномы шейки матки (HeLa) и в клетках трансформированной фетальной почки (293А), подвергнутых обработке соединением изобретения.11 shows a response to a dose of oxygen consumption in cervical adenocarcinoma (HeLa) cells and in transformed fetal kidney (293A) cells treated with a compound of the invention.

Описание изобретенияDescription of the invention

Прежде, чем будут описаны композиции и способы настоящего изобретения, следует понять, что изобретение не ограничивается отдельными методологиями, протоколами, клеточными линиями, анализами и описанными реагентами, так как эти параметры могут изменяться. Следует также понять, что терминология, используемая здесь, предназначается для описания конкретных вариантов применения настоящего изобретения, и никоим образом не предназначается для ограничения объема настоящего изобретения, которое определено в прилагаемой Формуле изобретения.Before the compositions and methods of the present invention are described, it should be understood that the invention is not limited to the individual methodologies, protocols, cell lines, assays, and reagents described, as these parameters may vary. You should also understand that the terminology used here is intended to describe specific applications of the present invention, and in no way is intended to limit the scope of the present invention, which is defined in the attached claims.

Следует отметить, что используемые здесь и в прилагаемой Формуле изобретения формы единственного числа включают ссылки на множество, кроме тех случаев, если противоположное в контексте четко не оговорено. Таким образом, например, ссылка на "фрагмент" включает множество таких фрагментов, ссылка на "соединение" представляет собой ссылку на одно или большее количество соединений и его эквиваленты, которые описаны здесь и которые известны специалистам в данной области, и так далее.It should be noted that the singular forms used here and in the attached claims include references to the plural, unless the contrary is clearly stated in the context. Thus, for example, a reference to a “fragment” includes many such fragments, a reference to a “connection” is a reference to one or more compounds and its equivalents that are described herein and which are known to those skilled in the art, and so on.

Кроме тех случаев, когда противоположное не оговорено, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют те же самые значения, которые обычно понимаются специалистом в данной области, к которой изобретение относится. Хотя любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны здесь, можно использовать на практике или для тестирования настоящего изобретения, в настоящем случае описываются предпочтительные способы, устройства и материалы. Все приведенные здесь публикации упомянуты здесь в виде ссылки во всей их полноте с целью описания и раскрытия методологий, реагентов и оборудования, представленных в публикациях, которые можно использовать в связи с изобретением. Здесь нет ничего, что могло бы быть истолковано как признание того, что изобретение лишено права предвосхищать такое раскрытие изобретения благодаря предыдущему изобретению.Except where otherwise stated, all technical and scientific terms used herein have the same meanings as are commonly understood by one skilled in the art to which the invention relates. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in practice or for testing the present invention, preferred methods, devices and materials are described in the present case. All publications cited herein are hereby incorporated by reference in their entireties for the purpose of describing and disclosing the methodologies, reagents, and equipment presented in publications that can be used in connection with the invention. There is nothing here that could be construed as an admission that the invention is deprived of the right to anticipate such disclosure of the invention due to the previous invention.

При практическом применении настоящего изобретения будут использоваться, если не указаны иные, традиционные способы химии, биохимии, молекулярной биологии, клеточной биологии, генетики, иммунологии и фармакологии, в пределах существующих областей наук. Такие технологии описаны подробно в литературе. Смотри, например, Gennaro, A.R., публикация (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-е изд. Mack Publishing Co.; Hardman, J.G., Limbird, L.E. и Gilman, A.G., публикации (2001) The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10-е изд., McGraw-Hill Co.; Colowick, S. и соав., публикации. Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.; Weir, D.M. и Blackwell, C.C., публикации (1986) Handbook of Experimental Immunology, тома I-IV, Blackwell Scientific Publications; Maniatis, Т. и соав., публикации (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Лабораторный справочник), 2-е издание, тома I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. и соав., публикации (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4-e издание, John Wiley & Sons; Ream и соав., публикации (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course (Интенсивный лабораторный курс), Academic Press; Newton, C.R. и Graham, А., публикации (1997) PCR (Introduction to Biotechniques Serie), 2-е изд. Springer Verlag.In the practical application of the present invention will be used, unless otherwise indicated, traditional methods of chemistry, biochemistry, molecular biology, cell biology, genetics, immunology and pharmacology, within the existing fields of science. Such technologies are described in detail in the literature. See, for example, Gennaro, A.R., Remington's Pharmaceutical Sciences (1990), 18th ed. Mack Publishing Co .; Hardman, J.G., Limbird, L.E. and Gilman, A.G., Publications (2001) of The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill Co .; Colowick, S. et al., Publications. Methods In Enzymology, Academic Press, Inc .; Weir, D.M. and Blackwell, C. C., publications (1986) Handbook of Experimental Immunology, volumes I-IV, Blackwell Scientific Publications; Maniatis, T. et al., Publications (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Volumes I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al., 1999 (Short Protocols in Molecular Biology, 4th Edition, John Wiley &Sons; Ream et al. (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press; Newton, C.R. and Graham, A., Publications (1997) PCR (Introduction to Biotechniques Serie), 2nd ed. Springer Verlag.

ОпределенияDefinitions

Термины "регулирование содержания жира" и "регулирование метаболизма жира", как они использованы здесь, относятся к процессам, посредством которых клетка, ткань, орган, система органов или организм в целом достигают и/или поддерживают гомеостаз жира путем изменения, например, усиления или ослабления специфических процессов метаболизма жира. Метаболизм жира охватывают процессы, посредством которых синтезируются, транспортируются, поглощаются, процессируются, утилизируются или накапливаются жиры, такие как триглицериды, жирные кислоты, холестерин, липиды и фосфолипиды. Специфические аспекты метаболизма и регулирования содержания жира включают экспрессию липопротеинов или ферментов, которые облегчают транспорт и перемещение жира в крови и сохранение или секрецию жира клеткой; изменение экспрессии и/или активности ферментов, вовлеченных в утилизацию или образование жира, включающих, например, липолитические и липогененные ферменты, такие как ацилтрансферазы, оксидазы, липоксигеназы и т.д.; и изменение распределения жира в пределах организма, например, в окружающих тканях, жировой ткани и т.д.; или в пределах культуральных жидкостей, включающих, например, внутритканевые (т.е. внеклеточные) и внутриклеточные текучие среды, кровь, мочу и им подобные текучие среды.The terms "regulation of fat content" and "regulation of fat metabolism", as used here, refer to processes by which a cell, tissue, organ, organ system or organism as a whole achieves and / or supports fat homeostasis by changing, for example, enhancing or weakening specific processes of fat metabolism. Fat metabolism encompasses the processes by which fats such as triglycerides, fatty acids, cholesterol, lipids and phospholipids are synthesized, transported, absorbed, processed, utilized or accumulated. Specific aspects of metabolism and regulation of fat content include the expression of lipoproteins or enzymes that facilitate the transport and movement of fat in the blood and the storage or secretion of fat by the cell; a change in the expression and / or activity of enzymes involved in the utilization or formation of fat, including, for example, lipolytic and lipogenic enzymes, such as acyltransferases, oxidases, lipoxygenases, etc .; and changing the distribution of fat within the body, for example, in surrounding tissues, adipose tissue, etc .; or within culture fluids, including, for example, interstitial (i.e. extracellular) and intracellular fluids, blood, urine, and the like fluids.

Термины "метаболическое состояние" и "метаболическое нарушение" используют взамен друг друга, и они относятся к любому нарушению, связанному с или обострившемуся за счет измененного регулирования содержания жира. Такие нарушения включают, но не ограничиваются ими, атеросклероз, болезнь сердца и ожирение.The terms “metabolic state” and “metabolic disorder” are used in place of each other, and they refer to any disorder associated with or exacerbated by an altered regulation of fat content. Such disorders include, but are not limited to, atherosclerosis, heart disease, and obesity.

Термин "ожирение" относится к избыточному содержанию жира в организме. Ожирение можно оценивать с помощью любого показателя, принятого и используемого специалистами в данной области. Обычно, принятым показателем ожирения является индекс массы тела (BMI), который является показателем веса тела в килограммах по отношению к квадрату высоты в метрах. Обычно для взрослого человека старше 20 лет, величина BMI между около 18,5 и 24,9 считается нормальной, в то время, как величина BMI между около 25,0 и 29,9 рассматривается как избыточный вес, величина BMI, равная или превышающая 30,0, рассматривается как ожирение, а величина BMI, равная или превышающая 40, рассматривается как болезненное ожирение. (Смотри, например, Gallagher и соав. (2000) Am J Clin Nutr 72:694-701.) Эти диапазоны BMI основаны на влиянии веса тела на повышенную опасность заболевания. Некоторые обычные состояния, связанные с избыточным весом и ожирением, включают сердечно-сосудистое заболевание, высокое давление крови, остеоартрит, рак и сахарный диабет. Хотя BMI коррелируется с жиром тела, отношение между ВМ и фактическим жиром тела отличается в зависимости от возраста и пола. Например, женщины с большей вероятностью имеют более высокое процентное содержание телесного жира, чем мужчины при том же самом значении BMI.The term "obesity" refers to excess fat in the body. Obesity can be assessed using any indicator adopted and used by specialists in this field. Typically, the accepted indicator of obesity is the body mass index (BMI), which is an indicator of body weight in kilograms relative to the square of the height in meters. Typically, for an adult over 20, a BMI between about 18.5 and 24.9 is considered normal, while a BMI between about 25.0 and 29.9 is considered overweight, a BMI equal to or greater than 30 , 0, is considered obesity, and a BMI value equal to or greater than 40 is considered morbid obesity. (See, for example, Gallagher et al. (2000) Am J Clin Nutr 72: 694-701.) These BMI ranges are based on the effect of body weight on the increased risk of disease. Some common conditions associated with overweight and obesity include cardiovascular disease, high blood pressure, osteoarthritis, cancer, and diabetes. Although BMI correlates with body fat, the relationship between BM and actual body fat is different depending on age and gender. For example, women are more likely to have a higher percentage of body fat than men with the same BMI value.

Другим показателем ожирения является процентное содержание телесного жира. Приемлемы различные способы для косвенной оценки содержания телесного жира, включая измерение морщинистости кожи, гидроденситометрию, биоэлектрический анализ импеданса (BIA), двухэнергетическую рентгеноспектральную абсорбциометрию, измерение общего содержания калия, и анализ активации нейтронов in vivo. Гидроденситометрия, или гидростатическое взвешивание (HW), определяет общий объем тела путем измерения различий между весом объекта исследования в воде и на воздухе. Аналогично, плетисмография методом вытеснения воздуха (АР) определяет общий объем тела путем измерения уменьшения объема камеры за счет введения объекта исследования в камеру с фиксированным объемом воздуха. Общая плотность тела и состав тела оценивают затем, используя общепринятые уравнения прогноза. С помощью BIA оценивают сопротивление тела, или импеданс, используя падение напряжения, создаваемое слабым электрическим током, проходящим межу электродами. Уровень импеданса, показатель воды и состава электролита тела используют затем для оценки содержания ткани без жира и объема воды в теле, используя усовершенствованные уравнения регрессии. Принимая в расчет гидратационную часть ткани без жира, используют дополнительные уравнения регрессии для оценки массы тела без жира и массы жира. Величина процентного содержания телесного жира у женщин обычно должна составлять около 17-27 процентов, хотя величина вплоть до около 31 процента считается приемлемой. У мужчин величина процентного содержания телесного жира обычно должна составлять около 10-20 процентов, хотя величина вплоть до около 25 процентов считается приемлемой.Another indicator of obesity is the percentage of body fat. Various methods are acceptable for indirectly evaluating body fat, including skin wrinkling, hydrodensitometry, bioelectric impedance analysis (BIA), dual-energy X-ray absorption spectrometry, measurement of total potassium, and in vivo neutron activation analysis. Hydrodensitometry, or hydrostatic weighing (HW), determines the total body volume by measuring the differences between the weight of the test object in water and in air. Similarly, plethysmography by the method of air displacement (AR) determines the total body volume by measuring the decrease in chamber volume by introducing the object of study into the chamber with a fixed air volume. The total body density and body composition are then estimated using generally accepted prediction equations. Using the BIA, the resistance of the body, or impedance, is estimated using the voltage drop created by the weak electric current passing between the electrodes. The impedance level, water index and body electrolyte composition are then used to estimate the tissue content without fat and the body water volume using advanced regression equations. Taking into account the hydration part of the tissue without fat, additional regression equations are used to estimate body weight without fat and fat mass. The percentage of body fat in women should usually be about 17-27 percent, although a value up to about 31 percent is considered acceptable. In men, the percentage of body fat should usually be about 10-20 percent, although a value of up to about 25 percent is considered acceptable.

Термин "HIFα" относится к альфа субъединице индуцируемого гипоксией факторного белка. HIFα может быть любым белком человека или другого млекопитающего, или его фрагментом, включая человеческие HIF-1α (Genbank, регистрационный № Q16665), HIF-2α (Genbank, регистрационный № AAB41495) и HIF-3α (Genbank, регистрационный № AAD22668); мышиные HIF-1α (Genbank, регистрационный № Q61221), HIF-2α (Genbank, регистрационный № ВАА20130 и ААВ41496) и HIF-3α (Genbank, регистрационный № ААС72734); крысиные HIF-1α (Genbank, регистрационный № САА70701), HIF-2α (Genbank, регистрационный № САВ96612) и HIF-3α (Genbank, регистрационный № САВ96611) и коровьи HIF-1α (Genbank, регистрационный № ВАА78675). HIFα может быть также любым белком немлекопитающего или его фрагментом, включая HIF-1α лягушки (Xenopus laevi) (Genbank, регистрационный № САВ96628), HIF-1α дрозофилы (Drosophila melanogaster) (Genbank, регистрационный № JC4851) и HIF-1α цыпленка (Genbank, регистрационный № ВАА34234). Можно также получать генные последовательности HIFα за счет рутинных технологий клонирования, например, используя всю или часть генной последовательности HIFα, описанной выше, в качестве зонда для обнаружения и определения последовательности гена HIFα в другом виде.The term "HIFα" refers to the alpha subunit of a hypoxia-induced factor protein. HIFα can be any human or other mammalian protein, or a fragment thereof, including human HIF-1α (Genbank, Registration No. Q16665), HIF-2α (Genbank, Registration No. AAB41495) and HIF-3α (Genbank, Registration No. AAD22668); mouse HIF-1α (Genbank, registration No. Q61221), HIF-2α (Genbank, registration No. BAA20130 and AAV41496) and HIF-3α (Genbank, registration No. AAC72734); rat HIF-1α (Genbank, registration No. CAA70701), HIF-2α (Genbank, registration No. SAV96612) and HIF-3α (Genbank, registration No. SAV96611) and cow HIF-1α (Genbank, registration No. BAA78675). HIFα can also be any non-mammalian protein or fragment thereof, including frog HIF-1α (Xenopus laevi) (Genbank, registration no. САВ96628), Drosophila HIF-1α (Drosophila melanogaster) (Genbank, JC4851 registration number) and chicken HIF-1α (Genbank registration number VAA34234). It is also possible to obtain HIFα gene sequences through routine cloning techniques, for example, using all or part of the HIFα gene sequence described above as a probe for detecting and determining the HIFα gene sequence in a different form.

Фрагменты HIFα включают области, устанавливаемые HIF-1α человека от аминокислоты 401 до 603 (Huang и соав., см. выше), от аминокислоты 531 до 575 (Jiang и соав. (1997) J Biol Chem 272:19253-19260), от аминокислоты 556 до 575 (Tanimoto и соав., см. выше), от аминокислоты 557 до 571 (Srinivas и соав. (1999) Biochem Biophys Res Coinmun 260:557-561) и от аминокислоты 556 до 575 (Ivan и соав. (2001) Science 292:464-468). Кроме того, фрагмент HIFα включает любой фрагмент, содержащий, по меньшей мере, один случай присутствия мотива LXXLAP, например, как это имеет место в нативной последовательности HIFα на участке L₃₉₇TLLAP и L₅₅₉EMLAP. Кроме того, фрагмент HIFα включает любой фрагмент, сохраняющий, по меньшей мере, одну функциональную или структуральную характеристику HIFα. Например, пептид HIF, используемый в опыте по скрининговому анализу, описанному в Примере 9, может включать последовательность DLDLEMLAPYIPMDDDFQL (SEQ ID N0:1).HIFα fragments include regions established by human HIF-1α from amino acids 401 to 603 (Huang et al., Supra), from amino acids 531 to 575 (Jiang et al. (1997) J Biol Chem 272: 19253-19260), amino acids 556 to 575 (Tanimoto et al., supra), amino acids 557 to 571 (Srinivas et al. (1999) Biochem Biophys Res Coinmun 260: 557-561) and amino acids 556 to 575 (Ivan et al. ( 2001) Science 292: 464-468). In addition, the HIFα fragment includes any fragment containing at least one case of the presence of the LXXLAP motif, for example, as is the case in the native HIFα sequence at the L ₃₉₇ TLLAP and L ₅₅₉ EMLAP sequences. In addition, the HIFα fragment includes any fragment that retains at least one functional or structural characteristic of HIFα. For example, the HIF peptide used in the screening assay described in Example 9 may include the sequence DLDLEMLAPYIPMDDDFQL (SEQ ID N0: 1).

Термин "гидроксилаза HIF" относится к любому ферменту, который способен гидроксилировать остаток аминокислоты в белке HIF, конкретно в субъединице HIFα. Предпочтительно, остаток аминокислоты представляет собой остаток пролина и/или остаток аспарагина.The term “HIF hydroxylase” refers to any enzyme that is capable of hydroxylating an amino acid residue in a HIF protein, specifically in a HIFα subunit. Preferably, the amino acid residue is a proline residue and / or an asparagine residue.

Термин "аспарагинилгидроксилаза HIF" относится к любому ферменту, который способен гидроксилировать остаток аспарагина в белке HIF. Предпочтительно, остаток аспарагина, гидроксилированный аспарагинилгидроксилазой HIF, включает, например, N₈₀₃ остаток HIF-1α или гомологичный остаток аспарагина в другой изоформе HIFα. Аспарагинилгидроксилаза HIF включает фактор, ингибирующий HIF (FIH), аспарагинилгидроксилазу, ответственную за регулирование трансактивации HIFα (Genbank, регистрационный № AAL27308; Mahon и соав. (2001) Genes Dev 15:2675-2686; Lando и соав. (2002) Science 295:858-861 и Lando и соав. (2002) Genes Dev 16:1466-1471. Также смотри Elkins и соав. (2002) J Biol Chem C200644200).The term “asparaginyl hydroxylase HIF” refers to any enzyme that is capable of hydroxylating an asparagine residue in a HIF protein. Preferably, the asparagine residue hydroxylated with asparaginyl hydroxylase HIF includes, for example, N ₈₀₃ HIF-1α residue or a homologous asparagine residue in another HIFα isoform. Asparaginyl hydroxylase HIF includes HIF inhibitory factor (FIH), asparaginyl hydroxylase, responsible for the regulation of HIFα transactivation (Genbank, Registration No AAL27308; Mahon et al. (2001) Genes Dev 15: 2675-2686; Lando et al. (2002) Science 295: 858-861 and Lando et al. (2002) Genes Dev 16: 1466-1471. Also see Elkins et al. (2002) J Biol Chem C200644200).

Термины "пролилгидроксилаза HIF" и "HIF PH" относятся к любому ферменту, который способен гидроксилировать остаток пролина в белке HIF. Предпочтительно, остаток пролина, гидроксилированный пролилгидроксилазой HIF, включает пролин, находящийся в пределах мотива LXXLAP, например, как это имеет место в нативной последовательности HIF-1α человека, соответствующей L₃₉₇ TLLAP и L₅₅₉EMLAP. HIF PH включает элементы семейства гена Egl-Nine (EGLN), описанного Taylor (2001, Gene 275:125-132) и охарактеризованного Aravind и Koonin (2001, Genome Biol 2:RESEARCH0007), Epstein и соав. (2001, Cell 107:43-54) и Bruick и McKnight (2001, Science 294:1337-1340). Примеры ферментов пролилгидроксилазы HIF включают человеческий SM-20 (EGLN1) (Genbank, регистрационный № AAG33965; Dupuy и соав. (2000) Genomics 69:348-54), изоформу 1 EGLN2 (Genbank, регистрационный № CAC42510; Taylor, см. выше), изоформу 2 EGLN2 (Genbank, регистрационный № NP_060025) и EGLN3 (Genbank, регистрационный № САС42511; Taylor, см. выше); мышиные EGLN1 (Genbank, регистрационный № САС42515), EGLN2 (Genbank, регистрационный № САС42511) и EGLN3 (SM-20) (Genbank, регистрационный № САС42517) и крысиный SM-20 (Genbank, регистрационный № ААА19321). Кроме того, пролилгидроксилаза HIF может включать генный продукт EGL-9 вида Caenorhabditis elegans (Genbank, регистрационный № AAD56365) и CG1114 вида Drosophila melanogaster (Genbank, регистрационный № AAF52050). Пролилгидроксилаза HIF включает также любой активный фрагмент вышеуказанных полноразмерных белков.The terms "prolyl hydroxylase HIF" and "HIF PH" refer to any enzyme that is capable of hydroxylating a proline residue in a HIF protein. Preferably, the proline residue hydroxylated with prolyl hydroxylase HIF includes a proline that is within the LXXLAP motif, for example, as is the case in the native human HIF-1α sequence corresponding to L ₃₉₇ TLLAP and L ₅₅₉ EMLAP. HIF PH includes elements of the Egl-Nine (EGLN) gene family described by Taylor (2001, Gene 275: 125-132) and characterized by Aravind and Koonin (2001, Genome Biol 2: RESEARCH0007), Epstein et al. (2001, Cell 107: 43-54) and Bruick and McKnight (2001, Science 294: 1337-1340). Examples of HIF prolyl hydroxylase enzymes include human SM-20 (EGLN1) (Genbank, Registration No. AAG33965; Dupuy et al. (2000) Genomics 69: 348-54), EGLN2 isoform 1 (Genbank, Registration No. CAC42510; Taylor, see above) , isoform 2 EGLN2 (Genbank, registration number NP_060025) and EGLN3 (Genbank, registration number CAC42511; Taylor, see above); mouse EGLN1 (Genbank, registration number CAC42515), EGLN2 (Genbank, registration number CAC42511) and EGLN3 (SM-20) (Genbank, registration number CAC42517) and rat SM-20 (Genbank, registration number AAA19321). In addition, HIF prolyl hydroxylase may include the gene product EGL-9 of the species Caenorhabditis elegans (Genbank, registration No. AAD56365) and CG1114 of the species Drosophila melanogaster (Genbank, registration No. AAF52050). Prolyl hydroxylase HIF also includes any active fragment of the aforementioned full-sized proteins.

Термин "образец" может относиться к любому материалу, полученному либо прямо, либо косвенно из субъекта. Образцы можно получить или извлечь, например, из жидкостей, секреций, тканей, клеток тела, или из клеток культуры, включающих, но не ограничивающихся ими, слюну, кровь, мочу, сыворотку, плазму, стекловидное тело, синовиальную жидкость, спинномозговую жидкость, околоплодные воды и ткань органов (например, биопсируемую ткань); из хромосом, органелл, или других мембран, выделенных из клетки; из геномных ДНК, кДНК, РНК, мРНК и пр.; и из просветленных клеток или тканей, или блотов, или отпечатков таких клеток, или тканей. Образцы можно извлечь из любого источника, такого как, например, объекта исследования в виде человека, или млекопитающего, не являющегося человеком, и т.д. Подвергаются также изучению образцы, извлеченные из любой модели животного, подверженного заболеванию. Образцы могут находиться в растворе или же могут, например, фиксироваться или связываться с субстратом. Образец может относиться к любому материалу, пригодному для испытания с целью выявления присутствия транскриптов или белков, связанных с регулированием метаболизма; или для измерения уровней содержания жира и глюкозы. Способы для получения таких образцов общеизвестны в данной области.The term “sample” may refer to any material obtained either directly or indirectly from a subject. Samples can be obtained or extracted, for example, from fluids, secretions, tissues, body cells, or from culture cells, including, but not limited to, saliva, blood, urine, serum, plasma, vitreous, synovial fluid, cerebrospinal fluid, amniotic fluid water and organ tissue (e.g., biopsy tissue); from chromosomes, organelles, or other membranes isolated from a cell; from genomic DNA, cDNA, RNA, mRNA, etc .; and from enlightened cells or tissues, or blots, or imprints of such cells, or tissues. Samples can be taken from any source, such as, for example, an object of research in the form of a human, or a non-human mammal, etc. Samples recovered from any animal model susceptible to disease are also examined. Samples may be in solution, or may, for example, be fixed or bound to a substrate. A sample may refer to any material suitable for testing to detect the presence of transcripts or proteins associated with metabolic regulation; or to measure fat and glucose levels. Methods for obtaining such samples are well known in the art.

Термин "субъект" может относиться к выделенным клеткам, либо прокариотическим, либо эукариотическим, или ткани, выращенной в культуре; или, предпочтительно, субъект относится к животным, конкретно, к видам млекопитающего, включая крысу, кролика, корову, овцу, свинью, мышь, лошадь., и примата, конкретно человека.The term “subject” may refer to isolated cells, either prokaryotic or eukaryotic, or tissue grown in culture; or, preferably, the subject relates to animals, specifically to mammalian species, including rat, rabbit, cow, sheep, pig, mouse, horse., and primate, specifically human.

ИзобретениеInvention

Настоящее изобретение представляет способы и соединения для регулирования метаболизма жира и достижения гомеостаза жира, а также для лечения и профилактики, а также сведения к минимуму риска развития состояний, связанных с измененным или ухудшенным гомеостазом и метаболизмом жира. Такие состояния включают, но не ограничиваются ими, ожирение и т.д. Представлены также способы и соединения для регулирования уровней содержания накопленного жира; для поддержания или уменьшения веса тела и для регулирования процессинга, поглощения, транспорта, накопления, синтеза, утилизации и распределения жира. В изобретении конкретно представлены способы лечения или профилактики ожирения, например, профилактики или уменьшения увеличения веса и/или индуцирования потери в содержании жира. В одном из аспектов изобретения, это осуществляют путем фармакологического индуцирования метаболического сдвига в направлении использования жира и/или жирных кислот в качестве основного источника энергии для клеток.The present invention provides methods and compounds for regulating fat metabolism and achieving fat homeostasis, as well as for treating and preventing, as well as minimizing, the risk of developing conditions associated with altered or worsened homeostasis and fat metabolism. Such conditions include, but are not limited to, obesity, etc. Methods and compounds for controlling levels of stored fat are also provided; to maintain or reduce body weight and to regulate the processing, absorption, transport, accumulation, synthesis, utilization and distribution of fat. The invention specifically provides methods of treating or preventing obesity, for example, preventing or reducing weight gain and / or inducing loss in fat content. In one aspect of the invention, this is accomplished by pharmacologically inducing a metabolic shift towards the use of fat and / or fatty acids as the main energy source for cells.

Изобретение связано с открытием того, что стабилизация альфа субъединицы индуцируемого гипоксией фактора (HIFα) ведет к снижению отложения жира и что стабилизация HIFα регулирует метаболизм жира. Кроме того, в изобретении представлены способы и соединения, которые снижают образование жировой ткани и отложение жира и эффективно регулируют процессы метаболизма жира, например, транспорт, поглощение, процессинг, утилизацию, накопление жира и т.д.The invention relates to the discovery that stabilization of the alpha subunit of hypoxia-induced factor (HIFα) leads to a decrease in fat deposition and that stabilization of HIFα regulates fat metabolism. In addition, the invention provides methods and compounds that reduce the formation of adipose tissue and fat deposition and effectively regulate the processes of fat metabolism, for example, transport, absorption, processing, utilization, accumulation of fat, etc.

Индуцируемый гипоксией фактор (HIF) принимает участие в ответной реакции клеток, тканей и органов на снижение содержания кислорода, т.е. на гипоксию. Как известно, воздействие гипоксии, например, на большой высоте, вызывает потерю аппетита и потерю веса (Смотри, например, Fushiki и соав. (1992) Can J Physiol Pharmacol 70:1522-1524; Gunga и соав. (2003) Eur J Appl Physiol 88:497-505 и Tschop и Morrison (2001) В: Гипоксия: От генов до ухода за больными (Hypoxia: From genes to the bedside) (RC Roach и соав. Публикации), Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, NY.). HIFα представляет собой субъединицу, деградированную в нормоксических, т.е. нормальных кислородных условиях, и стабилизированную в гипоксических, т.е. в условиях низкого содержания кислорода. При стабилизации, HIFα объединяется с HIFα, продуцируя ряд последующих эффектов. Недавно было установлено, что гидроксилирование конкретных остатков на субъединице HIFα делает HIFα мишенью для деградации, предотвращая таким образом формирование стабильного комплекса HIF в нормальных кислородных условиях, и было установлено, что гидроксилирование является следствием активности определенных ферментов гидроксилазы HIF. (Смотри, например, Ivan и соав. (2001) Science 292:464-468; Jaakkola и соав. (2001) Science 292:468-472; Epstein и соав. (2001) Cell 107:43-54 и Bruick и McKnight (2001) Science 294:1337-1340.) Эти гидроксилазные ферменты HIF принадлежат к семейству ферментов 2-оксоглутарат-диоксигеназы. Эти ферменты являются кислород-зависимыми и, в условиях низкого содержания кислорода (т.е. в гипоксических условиях), гидроксилирование остатков HIFα ингибируется. Терапевтическая стабилизация HIFα и стабилизация HIFα посредством ингибирования гидроксилирования HIFα ранее уже были описаны. (Смотри, например, международную публикацию заявки за номером WO 03/049686, введенную здесь в виде ссылки во всей полноте.)Hypoxia-induced factor (HIF) is involved in the response of cells, tissues and organs to a decrease in oxygen content, i.e. for hypoxia. The effects of hypoxia, for example, at high altitude, are known to cause loss of appetite and weight loss (See, for example, Fushiki et al. (1992) Can J Physiol Pharmacol 70: 1522-1524; Gunga et al. (2003) Eur J Appl Physiol 88: 497-505 and Tschop and Morrison (2001) B: Hypoxia: From genes to patient care (Hypoxia: From genes to the bedside) (RC Roach et al. Publications), Kluwer Academic / Plenum Publishers, New York, NY.). HIFα is a subunit degraded in normoxic, i.e. normal oxygen conditions, and stabilized under hypoxic conditions, i.e. in conditions of low oxygen content. Upon stabilization, HIFα combines with HIFα, producing a series of subsequent effects. Recently, it was found that the hydroxylation of specific residues on the HIFα subunit makes HIFα a target for degradation, thereby preventing the formation of a stable HIF complex under normal oxygen conditions, and it has been established that hydroxylation is a consequence of the activity of certain HIF hydroxylase enzymes. (See, for example, Ivan et al. (2001) Science 292: 464-468; Jaakkola et al. (2001) Science 292: 468-472; Epstein et al. (2001) Cell 107: 43-54 and Bruick and McKnight (2001) Science 294: 1337-1340.) These HIF hydroxylase enzymes belong to the 2-oxoglutarate-dioxygenase enzyme family. These enzymes are oxygen-dependent and, under conditions of low oxygen content (i.e., under hypoxic conditions), the hydroxylation of HIFα residues is inhibited. Therapeutic stabilization of HIFα and stabilization of HIFα by inhibiting HIFα hydroxylation have already been described. (See, for example, the international publication of application number WO 03/049686, incorporated herein by reference in its entirety.)

СпособыWays

В одном из аспектов, в настоящем изобретении представлены способы уменьшения формирования жировой ткани и отложения жира, приведения в активное состояние жировых накоплений, регулирования метаболизма жира и достижения гомеостаза жира путем стабилизирования HIFα у субъекта. В другом аспекте настоящего изобретения, способы включают уменьшение формирования жировой ткани и отложения жира, приведение в активное состояние жировых накоплений, регулирование метаболизма жира и достижение гомеостаза жира путем ингибирования гидроксилирования HIFα у субъекта. В предпочтительном аспекте изобретения, способы настоящего изобретения включают уменьшение формирования жировой ткани и отложения жира, приведение в активное состояние жировых накоплений, регулирование метаболизма жира и достижение гомеостаза жира путем ингибирования активности по меньшей мере одного фермента гидроксилазы HIF у субъекта. В наиболее предпочтительном аспекте изобретения, способы изобретения включают уменьшение формирования жировой ткани и отложения жира, приведение в активное состояние жировых накоплений, регулирование метаболизма жира и достижение гомеостаза жира путем ингибирования активности фермента пролилгидроксилазы HIF.In one aspect, the present invention provides methods for reducing adipose tissue formation and fat deposition, activating fat accumulations, regulating fat metabolism, and achieving fat homeostasis by stabilizing HIFα in a subject. In another aspect of the present invention, methods include reducing adipose tissue formation and fat deposition, activating fat accumulation, regulating fat metabolism, and achieving fat homeostasis by inhibiting HIFα hydroxylation in a subject. In a preferred aspect of the invention, the methods of the present invention include reducing adipose tissue formation and fat deposition, activating fat accumulation, regulating fat metabolism, and achieving fat homeostasis by inhibiting the activity of at least one HIF hydroxylase enzyme in a subject. In a most preferred aspect of the invention, the methods of the invention include reducing adipose tissue formation and fat deposition, activating fat accumulations, regulating fat metabolism and achieving fat homeostasis by inhibiting the activity of the HIF prolyl hydroxylase enzyme.

Стабилизацию HIFα можно осуществлять посредством любого из способов, доступных и известных специалистам в данной области, и она может включать использование любого агента, который взаимодействует, связывается или модифицирует HIFα или факторы, которые взаимодействуют с HIFα, включая, например, ферменты, для которых HIFα является субстратом. В конкретных аспектах настоящего изобретения рассматривают создание конститутивно устойчивого варианта HIFα, например, стабильных мутеинов HIF и пр., или полинуклеотидное кодирование такого варианта. (Смотри, например, патент США за номером 6562799 и 6124131 и патент США за номером 6432927.) В других аспектах изобретения предполагается, что стабилизирование HIFα включает введение агента, который стабилизирует HIFα. Агент может состоять из полинуклеотидов, например, антисмысловых последовательностей (смотри, например, международную публикацию за номером WO 03/045440); полипептидов; антител; других белков; углеводов; жиров; липидов и органических и неорганических веществ, например, небольших молекул и пр. В предпочтительном варианте осуществления изобретения предполагается стабилизирование HIFα, например, у субъекта, путем введения субъекту агента, который стабилизирует HIFα, где агент представляет собой соединение, например, низкомолекулярное соединение, и пр., которое стабилизирует HIFα.Stabilization of HIFα can be accomplished by any of the methods available and known to specialists in this field, and it can include the use of any agent that interacts, binds or modifies HIFα or factors that interact with HIFα, including, for example, enzymes for which HIFα is substrate. In specific aspects of the present invention, the creation of a constitutively stable variant of HIFα, for example, stable HIF muteins, etc., or polynucleotide coding of such an embodiment is contemplated. (See, for example, US Pat. Nos. 6,562,799 and 6,124,131 and US Pat. Nos. 6,432,927.) In other aspects of the invention, it is contemplated that stabilization of HIFα involves the administration of an agent that stabilizes HIFα. An agent may consist of polynucleotides, for example, antisense sequences (see, for example, international publication number WO 03/045440); polypeptides; antibodies; other proteins; carbohydrates; fats; lipids and organic and inorganic substances, for example, small molecules, etc. In a preferred embodiment of the invention, it is contemplated to stabilize HIFα, for example, in a subject, by administering to the subject an agent that stabilizes HIFα, where the agent is a compound, for example, a low molecular weight compound, etc. ., which stabilizes HIFα.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения, способы изобретения включают стабилизирование HIFα путем ингибирования активности, по меньшей мере, одного фермента, выбранного из семейства 2-оксоглутарат-диоксигеназы. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, фермент представляет собой фермент гидроксилазы HIF, например, EGLN-1, EGLN-2, EGLN-3, FIH и пр. (Смотри, например, Taylor (2001) Gene 275:125-132; Epstein и соав. (2001) см. выше; Bruick и McKnight (2001) см. выше; Mahon и соав., см. выше и Lando и соав., см. выше.) Однако, конкретно предполагается, что фермент может быть любым ферментом, выбранным из семейства ферментов 2-оксоглутарат-диоксигеназы, включая, например, проколлаген-лизилгидроксилазу (LH)-1, -2 и -3; проколлаген-пролил-3-гидроксилазу, проколлаген-пролил-4-гидроксилазу α(I) и α(II), Тимин-7-гидроксилазу, аспартил-(аспарагинил-) β-гидроксилазу, ε-N-триметиллизин-гидроксилазу и γ-бутиробетаин-гидроксилазу и т.д. (Смотри, например, Majamaa и соав. (1985) Biochem J 229:127-133; Myllyharju и Kivirikko (1997) EMBO J 16:1173-1180; Thornburg и соав. (1993) 32:14023-14033 и Jia и соав. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:7227-7231.)In other embodiments of the present invention, methods of the invention include stabilizing HIFα by inhibiting the activity of at least one enzyme selected from the 2-oxoglutarate-dioxygenase family. In a preferred embodiment of the present invention, the enzyme is an HIF hydroxylase enzyme, for example, EGLN-1, EGLN-2, EGLN-3, FIH, etc. (See, for example, Taylor (2001) Gene 275: 125-132; Epstein and et al. (2001) see above; Bruick and McKnight (2001) see above; Mahon et al., supra and Lando et al., supra.) However, it is specifically intended that the enzyme can be any enzyme, selected from the 2-oxoglutarate-dioxygenase enzyme family, including, for example, procollagen-lysylhydroxylase (LH) -1, -2 and -3; procollagen-prolyl-3-hydroxylase, procollagen-prolyl-4-hydroxylase α (I) and α (II), thymine-7-hydroxylase, aspartyl- (asparaginyl-) β-hydroxylase, ε-N-trimethyllysine hydroxylase and γ -butyrobetaine hydroxylase, etc. (See, for example, Majamaa et al. (1985) Biochem J 229: 127-133; Myllyharju and Kivirikko (1997) EMBO J 16: 1173-1180; Thornburg et al. (1993) 32: 14023-14033 and Jia et al. . (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 7227-7231.)

В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения, способы изобретения содержат уменьшение формирования жировой ткани и отложения жира, приведение в активное состояние жировых накоплений, регулирование метаболизма жира и достижение гомеостаза жира путем ингибирования гидроксилирования определенных остатков HIFα, например, остатков пролина, остатков аспарагина и пр. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, остатки представляют собой остатки пролина. В специфических вариантах осуществления изобретения, остатки могут быть остатком Р₅₆₄ в HIF-1α или гомологичным пролином в другой изоформе HIFα, или остатком P₄₀₂ в HIF-1α или гомологичным пролином в другой изоформе HIFα и т.д. В других вариантах осуществления изобретения, способы настоящего изобретения могут содержать ингибирование гидроксилирования остатков аспарагина в HIFα, например, остатка N₈₀₃ в HIFα или гомологичного остатка аспарагина в другой изоформе HIFα.In certain embodiments of the present invention, methods of the invention comprise reducing adipose tissue formation and fat deposition, activating fat accumulation, regulating fat metabolism and achieving fat homeostasis by inhibiting the hydroxylation of certain HIFα residues, for example, proline residues, asparagine residues, etc. In a preferred embodiment, the residues are proline residues. In specific embodiments of the invention, the residues may be residue P ₅₆₄ in HIF-1α or a homologous proline in another HIFα isoform, or residue P ₄₀₂ in HIF-1α or a homologous proline in another HIFα isoform, etc. In other embodiments, the methods of the present invention may comprise inhibiting the hydroxylation of asparagine residues in HIFα, for example, residue N ₈₀₃ in HIFα or a homologous asparagine residue in another HIFα isoform.

СоединенияConnections

В одном из аспектов, в настоящем изобретении представлены способы уменьшения формирования жировой ткани и отложения жира, приведение в активное состояние жировых накоплений, регулирование метаболизма жира и достижение гомеостаза жира путем введения соединения изобретения субъекту. Соединение изобретения представляет собой любое соединение, которое ингибирует или иначе модулирует активность фермента 2-оксоглутарат-диоксигеназы. Ферменты 2-оксоглутарат-диоксигеназы включают, но не ограничиваются ими, ферменты гидроксилазы. Ферменты гидроксилазы гидроксилируют остатки субстрата-мишени и включают, например, пролил, лизил, аспарагинил (аспарагил, аспартил) гидроксилазы и пр. Гидроксилазы характеризуют иногда посредством субстрата-мишени, например, HIF гидроксилаз, проколлаген-гидроксилаз и пр., и/или посредством остатков, являющихся мишенями в субстрате, например, пролилгидроксилазами, лизилгидроксилазами и пр., или посредством и субстрата, и остатка, например, HIF пролилгидроксилазами, проколлаген-пролил гидроксилазами и пр. Репрезентативные ферменты 2-оксоглутарат-диоксигеназы включают, но не ограничиваются ими, HIF гидроксилазы, включающие HIF пролилгидроксилазы, например, EGLN1, EGLN2, и EGLN3, HIF аспарагинилгидроксилазы, например, фактор, ингибирующий HIF (FIH) и пр.; проколлаген-гидроксилазы, например, проколлаген-лизилгидроксилазы, проколлаген-пролилгидроксилазы, например, проколлаген-пролил-3-гидроксилаза, проколлаген-пролил-4-гидроксилаза α(I) и α(II) и т.д.; тимин-7-гидроксилазу; аспартил-(аспарагинил)-β-гидроксилазу; ε-N-триметиллизин-гидроксилазу; γ-бутиробетаин-гидроксилазу и т.д. Хотя ферментативная активность может включать любую активность, связанную с любой 2-оксоглутарат диоксигеназой, конкретно предполагается гидроксилирование остатков аминокислот в субстрате. Хотя гидроксилирование остатков пролина и/или аспарагина в субстрате конкретно присутствует, гидроксилирование других аминокислот также предполагается.In one aspect, the present invention provides methods for reducing adipose tissue formation and fat deposition, activating fat accumulations, regulating fat metabolism, and achieving fat homeostasis by administering a compound of the invention to a subject. A compound of the invention is any compound that inhibits or otherwise modulates the activity of the enzyme 2-oxoglutarate-dioxygenase. Enzymes of 2-oxoglutarate dioxygenase include, but are not limited to, hydroxylase enzymes. The hydroxylase enzymes hydroxylate the residues of the target substrate and include, for example, prolyl, lysyl, asparaginyl (asparagil, aspartyl) hydroxylases, etc. Hydroxylases are sometimes characterized by the target substrate, for example, HIF hydroxylases, procollagen hydroxylases, etc., and / or by residues that are targets in the substrate, for example, prolyl hydroxylases, lysyl hydroxylases, etc., or via both the substrate and the residue, for example, HIF, prolyl hydroxylases, procollagen-shed hydroxylases, etc. Representative enzymes 2-oxoglu arat dioxygenase include, but are not limited to, HIF hydroxylases, including HIF prolyl hydroxylase, e.g., EGLN1, EGLN2, and EGLN3, HIF asparaginyl, e.g., a factor inhibiting HIF (FIH), etc .; procollagen hydroxylase, for example, procollagen-lysyl hydroxylase, procollagen-prolyl hydroxylase, for example, procollagen-prolyl-3-hydroxylase, procollagen-prolyl-4-hydroxylase α (I) and α (II), etc .; thymine 7-hydroxylase; aspartyl- (asparaginyl) -β-hydroxylase; ε-N-trimethyllysine hydroxylase; γ-butyrobetaine hydroxylase, etc. Although the enzymatic activity may include any activity associated with any 2-oxoglutarate dioxygenase, specifically the hydroxylation of amino acid residues in the substrate is contemplated. Although hydroxylation of proline and / or asparagine residues in the substrate is specifically present, hydroxylation of other amino acids is also contemplated.

В конкретных вариантах осуществления изобретения, соединение представляет собой соединение, которое ингибирует гидроксилазную активность. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, соединение изобретения представляет собой соединение, которое ингибирует HIF гидроксилазную активность. В различных вариантах осуществления изобретения, активность обусловлена HIF пролилгидроксилазой, такой как, например, EGLN1, EGLN2, или EGLN3 и т.д. В других вариантах осуществления изобретения, активность обусловлена HIF аспарагинилгидроксилазой, включающей, но не ограничивающейся FIH.In specific embodiments of the invention, the compound is a compound that inhibits hydroxylase activity. In preferred embodiments of the invention, the compound of the invention is a compound that inhibits HIF hydroxylase activity. In various embodiments, the activity is due to HIF prolyl hydroxylase, such as, for example, EGLN1, EGLN2, or EGLN3, etc. In other embodiments, the activity is due to HIF by asparaginyl hydroxylase, including but not limited to FIH.

В одном из аспектов, соединение изобретения, которое проявляет ингибиторную активность в отношении одного или большего количества ферментов 2-оксоглутарат-диоксигеназы, может проявлять также ингибиторную активность в отношении одного или большего количества дополнительных ферментов 2-оксоглутарат-диоксигеназы, например, соединение, которое ингибирует активность HIF гидроксилазы, может дополнительно ингибировать активность коллаген-пролилгидроксилазы, соединение, которое ингибирует активность HIF пролилгидроксилазы, может дополнительно ингибировать активность HIF аспарагинилгидроксилазы и т.д.In one aspect, a compound of the invention that exhibits inhibitory activity against one or more 2-oxoglutarate dioxygenase enzymes can also exhibit inhibitory activity against one or more additional 2-oxoglutarate dioxygenase enzymes, for example, a compound that inhibits HIF hydroxylase activity, can further inhibit collagen-prolyl hydroxylase activity, a compound that inhibits HIF prolyl hydroxylase activity can It is possible to inhibit the activity of HIF asparaginyl hydroxylase, etc.

В одном из аспектов, в настоящем изобретении представлены способы уменьшения формирования жировой ткани и отложения жира, приведение в активное состояние жировых накоплений, регулирование метаболизма жира и достижение гомеостаза жира путем введения соединения изобретения субъекту. Соединение изобретения может быть, например, низкомолекулярным соединением, которое ингибирует HIF гидроксилазную активность. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, соединение изобретения представляет собой соединение, которое ингибирует HIF пролилгидроксилазную активность. Ингибирование может быть прямым или косвенным, может быть конкурентным и неконкурентным и т.д. Ниже, в виде примеров, представлены соединения и способы для идентификации дополнительных соединений настоящего изобретения.In one aspect, the present invention provides methods for reducing adipose tissue formation and fat deposition, activating fat accumulations, regulating fat metabolism, and achieving fat homeostasis by administering a compound of the invention to a subject. The compound of the invention may be, for example, a low molecular weight compound that inhibits HIF hydroxylase activity. In a preferred embodiment, the compound of the invention is a compound that inhibits HIF prolyl hydroxylase activity. Inhibition can be direct or indirect, can be competitive and non-competitive, etc. Compounds and methods for identifying additional compounds of the present invention are presented below as examples.

В одном из аспектов, в настоящем изобретении представлены способы уменьшения формирования жировой ткани и отложения жира, приведение в активное состояние жировых накоплений, модулирование регулирования жира и достижение гомеостаза жира путем введения соединения изобретения субъекту. Соединения настоящего изобретения можно использовать для регулирования веса тела или для облегчения снижения веса тела, например, чрезмерного веса или ожирения у субъекта. Дополнительно, соединения изобретения можно использовать для лечения нарушений или состояний, связанных с метаболизмом жира, включая, но не ограничиваясь ими, атеросклероз, ожирение и пр.In one aspect, the present invention provides methods for reducing adipose tissue formation and fat deposition, activating fat accumulations, modulating fat regulation, and achieving fat homeostasis by administering a compound of the invention to a subject. The compounds of the present invention can be used to control body weight or to facilitate the reduction of body weight, for example, excessive weight or obesity in a subject. Additionally, the compounds of the invention can be used to treat disorders or conditions associated with fat metabolism, including, but not limited to atherosclerosis, obesity, etc.

В одном из аспектов, в настоящем изобретении представлены способы использования соединений для профилактики или лечения нарушений, способы, включающие введение эффективного количества соединения или его фармацевтически приемлемой соли или его пропрепарата либо отдельно, либо в комбинации с фармацевтически приемлемым наполнителем пациенту, нуждающемуся в лечении. В одном из вариантов осуществления изобретения, соединение можно вводить на основании предварительно установленных состояний, например, при трудно контролируемом весе тела или ожирении.In one aspect, the present invention provides methods for using the compounds to prevent or treat disorders, methods comprising administering an effective amount of the compound or a pharmaceutically acceptable salt or preparation thereof, either alone or in combination with a pharmaceutically acceptable excipient, to a patient in need of treatment. In one embodiment of the invention, the compound can be administered based on predefined conditions, for example, with difficult to control body weight or obesity.

Соединения можно вводить в комбинации с разнообразными другими терапевтическими подходами. В одном из вариантов осуществления изобретения, соединение вводят вместе или вместо другого терапевтического агента, имеющего такой же или иной характер действия, например, глюкокортикоида, экзогенного инсулина, например, рекомбинантного инсулина человека, агониста PPARγ, например, тиазолидиндионов, или препарата для подавления аппетита.Compounds can be administered in combination with a variety of other therapeutic approaches. In one embodiment, the compound is administered together or in place of another therapeutic agent having the same or different mode of action, for example, glucocorticoid, exogenous insulin, for example, recombinant human insulin, a PPARγ agonist, for example, thiazolidinediones, or an appetite suppressant.

Экспрессия регуляторных факторов жираExpression of Regulatory Fat Factors

В способах настоящего изобретения представлены средства для изменения экспрессии регуляторных факторов, принимающих участие в метаболизме жира, например, транспорте, поглощении, утилизации, синтезе, процессинге и накоплении жира во всем теле. В одном из аспектов, способы изобретения устраняют дефекты в природном механизме организма в регулировании таких процессов, например, благодаря измененному продуцированию физиологических факторов и/или благодаря ответной реакции на физиологические факторы, такие как лептин, плазминогенный активаторный ингибитор (PAI)-1, инсулин и т.д. В другом аспекте, способы изобретения модулируют, например, повышают или снижают, уровни и/или активность регуляторных факторов, например, транскрипционных регуляторов, принимающих участие в транспорте, поглощении и утилизации жира, таких как DEC1/Stra13, пролифератором пероксисомы ассоциированных рецепторов (PPAR) и т.д.The methods of the present invention provide means for altering the expression of regulatory factors involved in fat metabolism, for example, transport, absorption, utilization, synthesis, processing and accumulation of fat throughout the body. In one aspect, the methods of the invention eliminate defects in the body’s natural mechanism in regulating such processes, for example, due to altered production of physiological factors and / or due to response to physiological factors such as leptin, plasminogen activator inhibitor (PAI) -1, insulin and etc. In another aspect, the methods of the invention modulate, for example, increase or decrease the levels and / or activity of regulatory factors, for example, transcriptional regulators involved in the transport, absorption and utilization of fat, such as DEC1 / Stra13, by a proxisome associated receptor proliferator (PPAR) etc.

Лептин является ключевым регулятором веса тела, оказывая влияние и на потребление пищи, и на расходование энергии. Хотя адипоциты являются главным источником продуцирования лептина, другие ткани, включая плаценту, скелетные мышцы, ткани слизистой оболочки желудка, и эпителиальные ткани молочной железы, также продуцируют лептин. (Смотри, например, Ahima и Flier (2000) Armu Rev Physiol 62:413-437; Fantuzzi и Faggioni (2000) J Leukocyte Biol 68:437-446.) У мышей (ob/ob) с дефицитом лептина наблюдается крайне избыточный вес вследствие хронического чрезмерного поглощения пищи, и введение экзогенного лептина ob/ob мышам продуцирует существенное снижение поглощения пищи и потерю веса (Zhang и соав. (1994) Nature 372:425-431; Pelleymounter и соав. (1995) Science 269:540-543; Halaas и соав. (1995) Science 269:543-546 и Campfield и соав. (1995) Science 269:546-549.) Аналогично, мыши с дефицитом лептинового рецептора (db/db) также имеют избыточный вес. Кроме того, повышающее регулирование активаторного ингибитора (PAI-1), основного гена, индуцируемого стрессом с установленным эффектом противоожирения, может давать пользу при нарушениях, связанных с гомеостазом жира, таких как ожирение и диабет.Leptin is a key regulator of body weight, affecting both food intake and energy expenditure. Although adipocytes are the main source of leptin production, other tissues, including the placenta, skeletal muscle, gastric mucosa, and mammary epithelial tissues, also produce leptin. (See, for example, Ahima and Flier (2000) Armu Rev Physiol 62: 413-437; Fantuzzi and Faggioni (2000) J Leukocyte Biol 68: 437-446.) Mice (ob / ob) with leptin deficiency are extremely overweight due to chronic excessive absorption of food, and administration of exogenous ob / ob leptin to mice produces a significant decrease in food absorption and weight loss (Zhang et al. (1994) Nature 372: 425-431; Pelleymounter et al. (1995) Science 269: 540-543 ; Halaas et al. (1995) Science 269: 543-546 and Campfield et al. (1995) Science 269: 546-549.) Similarly, mice with leptin receptor deficiency (db / db) are also overweight. In addition, up-regulation of an activator inhibitor (PAI-1), a major stress-induced gene with an established anti-obesity effect, can be beneficial in disorders associated with fat homeostasis, such as obesity and diabetes.

Так как способы и соединения настоящего изобретения увеличивают экспрессию лептина, способы и соединения изобретения являются полезными для регулирования метаболизма жира, утилизации энергии и насыщения. Способы изобретения могут быть особенно полезными для предупреждения увеличения веса у субъекта. Кроме того, способы и соединения осуществления настоящего изобретения увеличивают экспрессию плазминогенного активаторного ингибитора (PAI)-1. Таким образом, способы изобретения являются также полезными для регулирования веса у субъекта, в частности, принося пользу при нарушениях, связанных с гомеостазом жира, таких как ожирение и диабет.Since the methods and compounds of the present invention increase leptin expression, the methods and compounds of the invention are useful for regulating fat metabolism, energy recovery, and saturation. The methods of the invention can be particularly useful for preventing weight gain in a subject. In addition, the methods and compounds of the implementation of the present invention increase the expression of plasminogen activator inhibitor (PAI) -1. Thus, the methods of the invention are also useful for regulating weight in a subject, in particular, providing benefits for disorders associated with fat homeostasis, such as obesity and diabetes.

Семейство активированных лигандом транскрипционных факторов, называемых PPARs, регулирует ответную реакцию клеток на жирные кислоты и триглицериды. Известно, что DEC1/Stra13, элемент Drosophila hairy/энхансера из семейства расщепленных траскрипционных репрессоров, подавляет экспрессию, например, PPAR-γ2, транскрипционного фактора, необходимого для дифференциации адипоцитов и связанного с ожирением и диабетом типа 2. (Смотри, например, Yun и соав. (2002) Dev Cell 2:331-341; Giusti и соав. (2003) Diabetes 52:1673-1676 и Muller и соав. (2003) Diabetes 52:1864-1871.) Таким образом, модуляция DEC1/Stra13, и/или PPARs, например, PPAR-γ2, может давать дополнительную пользу за счет регулирования экспрессии адипогенных факторов, включая факторы, которые принимают участие в поглощении жира и клеточном процессинге.A family of ligand-activated transcription factors called PPARs regulates cell responses to fatty acids and triglycerides. It is known that DEC1 / Stra13, an element of the Drosophila hairy / enhancer from the family of split transcriptional repressors, inhibits the expression of, for example, PPAR-γ2, a transcription factor necessary for adipocyte differentiation and associated with obesity and type 2 diabetes. (See, for example, Yun and et al. (2002) Dev Cell 2: 331-341; Giusti et al. (2003) Diabetes 52: 1673-1676 and Muller et al. (2003) Diabetes 52: 1864-1871.) Thus, the modulation is DEC1 / Stra13, and / or PPARs, for example PPAR-γ2, may provide additional benefits by regulating the expression of adipogenic factors, including factors that take s in the absorption of fat and cellular processing.

Так как способы и соединения настоящего изобретения модулируют уровни факторов, включая DEC1/Stra13 и пролифератором пероксисомы ассоциированные рецепторы (PPAR), принимающие участие в ответной реакции клеток на уровни содержания жира, способы и соединения настоящего изобретения являются полезными для регулирования экспрессии генов, принимающие участие в ответной реакции клеток на жир, в частности, при поглощении и процессинге клетками жирных кислот и триглицеридов.Since the methods and compounds of the present invention modulate factor levels, including DEC1 / Stra13 and the Peroxisome Proliferator Associated Receptors (PPARs) involved in the response of cells to fat levels, the methods and compounds of the present invention are useful for regulating gene expression involved in the response of cells to fat, in particular during the absorption and processing of fatty acids and triglycerides by cells.

В настоящем изобретении представлены способы для координированного регулирования генов, чьи продукты принимают участие в метаболизме жира. Такие гены включают, но не ограничиваются ими, гены, имеющие отношение к поглощению и транспорту пищевого жира, синтезу и транспорту жира de novo, и процессингу (разложению) жира, утилизации жира и т.д., включая, например, глицерол-3-фосфат-ацетилтрансферазу (GPAT), длинноцепочечную жирную ацил-СоА-синтазу, карнитин-ацетилтрансферазу и т.д. Терапевтическое повышающее регулирование ферментов метаболизма жира и факторов насыщения будет эффективно снижать накопление жира, уменьшать вес тела и тем самым продуцировать полезный эффект у пациентов с метаболическими нарушениями, например, диабетом. Еще в одном варианте осуществления изобретения, в способах изобретения представлено координированное регулирование генов, чьи продукты включаются в транспорт жира. Такие гены включают, но не ограничиваются ими, аполипопротеин (Аро) А-IV.The present invention provides methods for coordinated regulation of genes whose products are involved in fat metabolism. Such genes include, but are not limited to, genes related to the absorption and transport of edible fat, the synthesis and transport of de novo fat, and the processing (decomposition) of fat, utilization of fat, etc., including, for example, glycerol-3- phosphate acetyltransferase (GPAT), long chain fatty acyl CoA synthase, carnitine acetyltransferase, etc. The therapeutic upregulation of fat metabolism enzymes and saturation factors will effectively reduce fat accumulation, reduce body weight, and thereby produce a beneficial effect in patients with metabolic disorders, such as diabetes. In yet another embodiment, the methods of the invention provide coordinated regulation of genes whose products are included in fat transport. Such genes include, but are not limited to, apolipoprotein (Apo) A-IV.

Например, СоА-тиоэстеразы (СТЕ) и карнитин-ацетилтрансферазы (CAT) регулируют уровни содержания ацил-СоА в клетках. (Van der Liej и соав. (2000) Mol Genet Metab 71:139-153; Huhtinen и соав. (2002) J Biol Chem 277:3424-3432). Длинноцепочечные ацил-СоА эфиры используют в синтезе и β-окислении триглицерида. Кроме того, длинноцепочечные ацил-СоА эфиры могут стимулировать активность пролифератором пероксисомы активированного рецептора (PPAR)-α, тем самым оказывая влияние на транскрипцию гена. ApoA-IV представляет собой компонент хиломикронов и частиц липопротеина высокой плотности (HDL), и, когда он находится в состоянии сверхэкспрессии, то ускоряет отток холестерина из холестерин-нагруженных клеток (Cohen и соав. (1997) J Clin Invest 99:1906-1916.) Сверхэкспрессия ApoA-IV защищает также от атеросклероза (Duverger и соав. (1996) Science 273:966-968. Смотри также, например, Ordovas и соав. (1989) J Biol Chem 264:16339-16342; Otha и соав. (1985) J Clin Invest 76:1252-1260 и Verges (1995) Diabetes Metab 21:99-105.) Таким образом, повышенная экспрессия генов, принимающих участие в регулировании жира, например, СТЕ-1, и ApoA-IV, как демонстрируется в настоящем изобретении с использованием соединений и способов изобретения, может обеспечивать как прямое, так и косвенное регулирование метаболизма и транспорта жира.For example, CoA thioesterases (CTE) and carnitine acetyltransferases (CAT) regulate the levels of acyl CoA in cells. (Van der Liej et al. (2000) Mol Genet Metab 71: 139-153; Huhtinen et al. (2002) J Biol Chem 277: 3424-3432). Long chain acyl-CoA esters are used in the synthesis and β-oxidation of triglyceride. In addition, long-chain acyl-CoA esters can stimulate the activity of an activated receptor peroxisome proliferator (PPAR) -α proliferator, thereby influencing gene transcription. ApoA-IV is a component of chylomicrons and particles of high density lipoprotein (HDL), and when it is overexpressed, it accelerates the outflow of cholesterol from cholesterol-loaded cells (Cohen et al. (1997) J Clin Invest 99: 1906-1916 .) Overexpression of ApoA-IV also protects against atherosclerosis (Duverger et al. (1996) Science 273: 966-968. See also, for example, Ordovas et al. (1989) J Biol Chem 264: 16339-16342; Otha et al. (1985) J Clin Invest 76: 1252-1260 and Verges (1995) Diabetes Metab 21: 99-105.) Thus, increased expression of genes involved in the regulation of fat, for example, CTE-1, and ApoA-IV, as daemon Trier herein using compounds and methods of the invention may provide both direct and indirect regulation of fat metabolism and transport.

Поэтому, соединения и способы настоящего изобретения модулируют уровни факторов, принимающих участие в метаболизме жира, и являются полезными для регулирования метаболизма жира у субъекта. В одном из аспектов изобретения, способы изобретения регулируют экспрессию белков, принимающих участие в продуцировании и/или утилизации триглицерида. Терапевтическое повышающее регулирование ферментов метаболизма жира будет эффективно снижать накопление жира, уменьшать вес тела и тем самым продуцировать полезный эффект у пациентов с метаболическими нарушениями, например, ожирением. Кроме того, способы и соединения настоящего изобретения модулируют уровни факторов, таких как аполипопротеины, принимающих участие в транспорте жира. Поэтому способы изобретения могут использоваться для регулирования процессинга и транспорта жирных кислот и триглицеридов между клетками, включая клетки мышц, печени, сердца и жировые клетки. Изменение процессов транспорта направляет, кроме того, использование жира, благоприятствуя утилизации жира по сравнению с накоплением.Therefore, the compounds and methods of the present invention modulate levels of factors involved in fat metabolism, and are useful for regulating fat metabolism in a subject. In one aspect of the invention, the methods of the invention regulate the expression of proteins involved in the production and / or utilization of triglyceride. The therapeutic upregulation of fat metabolism enzymes will effectively reduce fat accumulation, reduce body weight, and thereby produce a beneficial effect in patients with metabolic disorders, for example, obesity. In addition, the methods and compounds of the present invention modulate levels of factors, such as apolipoproteins, involved in fat transport. Therefore, the methods of the invention can be used to control the processing and transport of fatty acids and triglycerides between cells, including muscle, liver, heart and fat cells. Changing transport processes also directs the use of fat, favoring the utilization of fat compared to accumulation.

В изобретении конкретно представлено селективное конструирование пропрепаратов так, чтобы они активировались при поглощении конкретными органами. Например, так как печень продуцирует многие белки, принимающие участие в гомеостазе жира, изобретение рассматривает способы настоящего изобретения, селективно нацеленные на печень. Селективной повышающей регуляции генов, например, ApoA-IV, в печени можно достигать, используя соединения, которые превращаются из неактивной в активную форму с помощью специфических ферментов печени. Например, карбоновую кислоту в активном соединении можно заменить соответствующим спиртом. Активность алкоголь-дегидрогеназы (ADH) в печени может превращать такое соединение в активную форму. Так как в других органах отсутствует активность ADH, соединение можно селективно активировать только в печени. Аналогично, соединения, используемые в способе настоящего изобретения, можно нацеливать на другие органы, например, на жировую ткань, почку, скелетные мышцы, сердце и т.д.The invention specifically provides for the selective construction of formulations so that they are activated upon absorption by specific organs. For example, since the liver produces many of the proteins involved in fat homeostasis, the invention contemplates methods of the present invention that selectively target the liver. Selective upregulation of genes, for example, ApoA-IV, in the liver can be achieved using compounds that are converted from an inactive to an active form using specific liver enzymes. For example, the carboxylic acid in the active compound can be replaced with the corresponding alcohol. Alcohol-dehydrogenase (ADH) activity in the liver can convert such a compound into an active form. Since ADH activity is absent in other organs, the compound can be selectively activated only in the liver. Similarly, the compounds used in the method of the present invention can be targeted to other organs, for example, adipose tissue, kidney, skeletal muscle, heart, etc.

Метаболический сдвиг в продуцировании энергииMetabolic shift in energy production

Организм получает энергию при утилизации жирных кислот и углеводов. И глюкоза, и жирные кислоты могут использоваться в качестве энергии немедленно при поглощении, но их количества, которые потребляются сверх текущей энергетической потребности, аккумулируются для последующего использования. Так как только ограниченное количество глюкозы может накапливаться в виде гликогена, большая часть потребляемой глюкозы превращается в жирные кислоты и аккумулируется в жировой ткани. Таким образом, жировая ткань содержит большую часть энергетического резерва для организма. Кроме того, жировая ткань служит не только в качестве источника аккумулирования энергии, но она выполняет также множество эндокринных и терморегуляторных функций и принимает участие в регуляции метаболизма глюкозы.The body receives energy through the utilization of fatty acids and carbohydrates. Both glucose and fatty acids can be used as energy immediately upon absorption, but amounts that are consumed in excess of current energy needs are accumulated for later use. Since only a limited amount of glucose can accumulate as glycogen, most of the glucose consumed is converted to fatty acids and accumulated in adipose tissue. Thus, adipose tissue contains most of the energy reserve for the body. In addition, adipose tissue not only serves as a source of energy storage, but it also performs many endocrine and thermoregulatory functions and takes part in the regulation of glucose metabolism.

Как обсуждалось выше, печень также принимает участие в метаболизме жира и глюкозы, выполняя важную и центральную роль в поддержании соответствующих уровней содержания в крови этих жизненных питательных веществ. Хотя глюкоза является основным топливом для нейронов и эритроцитов, большинство других тканей зависит от содержания жирных кислот для обеспечения своих основных энергетических потребностей. При восстановлении нормальных уровней содержания глюкозы в крови, печень разрушает гликоген, а жировая ткань разрушает триглицериды, чтобы обеспечить кровь глюкозой и жирными кислотами, соответственно. Инсулин является важным регулятором этого метаболического равновесия, стимулируя поглощение глюкозы в жире и мышцах, синтез гликогена и липогенез. Низкие уровни содержания инсулина снижают поглощение глюкозы в инсулин-чувствительных тканях, ускоряют глюконеогенез и гликогенолиз в печени, снижают синтез гликогена и ускоряют мобилизацию накопленных жирных кислот из жировой ткани.As discussed above, the liver also participates in the metabolism of fat and glucose, playing an important and central role in maintaining appropriate levels of these vital nutrients in the blood. Although glucose is the main fuel for neurons and red blood cells, most other tissues depend on the content of fatty acids for their basic energy needs. When normal levels of blood glucose are restored, the liver destroys glycogen and adipose tissue destroys triglycerides to provide blood with glucose and fatty acids, respectively. Insulin is an important regulator of this metabolic equilibrium, stimulating the absorption of glucose in fat and muscle, glycogen synthesis and lipogenesis. Low levels of insulin reduce glucose uptake in insulin-sensitive tissues, accelerate gluconeogenesis and glycogenolysis in the liver, reduce glycogen synthesis and accelerate the mobilization of accumulated fatty acids from adipose tissue.

Было бы желательно сдвинуть продуцирование энергии организма так, чтобы привести в действие ход метаболизма, требующий жир в качестве источника энергии. В условиях низких уровней содержания глюкозы в крови или ухудшенного регулирования глюкозы, например, диабета, использование жира в качестве источника энергии может обеспечить альтернативное топливо для большинства тканей, делая таким образом потенциально ограниченные количества глюкозы доступными для органов, которым она требуется. Кроме того, повышенная утилизация жира в качестве источника энергии может приводить к снижению накопленного жира, тем самым индуцируя потерю веса, например, у пациента с ожирением, или предупреждать развитие и прогрессирование ожирения, связанного с такими состояниями, как диабет. Настоящее изобретение предлагает способы и соединения для увеличения утилизации жира путем регулирования метаболизма жира, например, за счет повышенной экспрессии регуляторных факторов жира и т.д., снижая жировые накопления и предупреждая дополнительное отложение жира (см., например, Примеры 3, 5 и 6 ниже). Поэтому, в одном из аспектов изобретения, в способах и соединениях настоящего изобретения представлен метаболический сдвиг, увеличивающий утилизацию жира тела в качестве источника энергии, т.е. метаболический сдвиг в отношении использования жира в качестве источника энергии, т.е. продуцирование энергии из жира.It would be desirable to shift the body's energy production so as to activate the metabolic pathway, requiring fat as an energy source. In conditions of low levels of blood glucose or poor regulation of glucose, such as diabetes, the use of fat as an energy source can provide an alternative fuel for most tissues, thus making potentially limited amounts of glucose available to organs that require it. In addition, increased utilization of fat as an energy source can lead to a decrease in stored fat, thereby inducing weight loss, for example, in an obese patient, or to prevent the development and progression of obesity associated with conditions such as diabetes. The present invention provides methods and compounds for increasing fat utilization by regulating fat metabolism, for example, by increasing the expression of regulatory factors of fat, etc., reducing fat accumulation and preventing additional fat deposition (see, for example, Examples 3, 5 and 6 below). Therefore, in one aspect of the invention, the methods and compounds of the present invention provide a metabolic shift that increases utilization of body fat as an energy source, i.e. metabolic shift in the use of fat as an energy source, i.e. the production of energy from fat.

Регулирование липогенных ферментов (см., например. Пример 3) протекает вместе с регулированием транспорта глюкозы, гликолизом и гликонеогенезом по причинам, обсуждавшимся выше. Например, кормление животных, при предварительном голодании, пищей с высоким содержанием углеводов и низким содержанием жира приводит к увеличению ферментов, которые включаются в биосинтез и гликолиз жирных кислот и триацилглицеринов, а также к увеличению поглощения глюкозы с помощью транспортеров глюкозы (смотри, например, Sul и Wang (1998) Annu Rev Nutr 18:331-351). Таким образом, в конкретных вариантах осуществления изобретения, в способах настоящего изобретения представлено координированное регулирование генов, чьи продукты вовлекаются в поглощение и утилизацию глюкозы. Такие гены включают, но не ограничиваются ими, гликолитические ферменты, включая фосфофруктокиназу, енолазу, лактатдегидрогеназу, альдолазу и гексокиназы; и траспортеры глюкозы (GluT). Увеличение гликолиза приводит к повышенному поглощению и утилизации глюкозы, которые могут ассоциироваться со снижением уровней содержания глюкозы в крови. Так как способы настоящего изобретения можно одновременно применять для усиления экспрессии регуляторных факторов жира и увеличения способности организма использовать жир в качестве источника энергии, настоящее изобретение, таким образом, представляет защитный механизм для одновременного достижения и/или сохранения гомеостаза глюкозы и жира. Способы и соединения настоящего изобретения являются, таким образом, особенно применимыми для лечения или профилактики таких состояний, как, например, диабет, при которых измененное или ухудшенное регулирование глюкозы и жира - такое, которое подтверждается повышенными уровнями содержания глюкозы и ожирением или тенденцией к ожирению - может быть причинно обусловлено.The regulation of lipogenic enzymes (see, for example, Example 3) proceeds along with the regulation of glucose transport, glycolysis and glyconeogenesis for the reasons discussed above. For example, feeding animals during pre-starvation with foods high in carbohydrates and low in fat leads to an increase in enzymes that are included in the biosynthesis and glycolysis of fatty acids and triacylglycerols, as well as to an increase in glucose uptake by glucose transporters (see, for example, Sul and Wang (1998) Annu Rev Nutr 18: 331-351). Thus, in specific embodiments of the invention, the methods of the present invention provide coordinated regulation of genes whose products are involved in the absorption and utilization of glucose. Such genes include, but are not limited to, glycolytic enzymes, including phosphofructokinase, enolase, lactate dehydrogenase, aldolase, and hexokinase; and glucose transporters (GluT). An increase in glycolysis leads to increased absorption and utilization of glucose, which may be associated with a decrease in blood glucose levels. Since the methods of the present invention can be simultaneously used to enhance the expression of regulatory factors of fat and increase the body's ability to use fat as an energy source, the present invention thus provides a protective mechanism for simultaneously achieving and / or maintaining glucose and fat homeostasis. The methods and compounds of the present invention are thus particularly useful for the treatment or prophylaxis of conditions such as, for example, diabetes, in which altered or impaired regulation of glucose and fat - such as is confirmed by elevated glucose levels and obesity or a tendency to obesity - may be causally determined.

Кроме того, сдвиг к увеличенному гликолизу, анаэробному процессу и повышенной утилизации жирных кислот может эффективно снижать общее потребление кислорода (см., например, Пример 12). Метаболический сдвиг в использовании энергии и сопровождающееся снижение веса согласуются с сообщениями о том, что гипоксия, связанная с большой высотой, индуцирует потерю веса, конкретно проявляющуюся в виде уменьшения жира в организме. (См., например, Fushiki и соав., см. выше; Gunga и соав., см. выше и Tschop и Morrison, см. выше) Этот подход можно использовать, например, для сохранения или увеличения способности организма генерировать энергию. Это может быть желательным, например, в условиях с низким содержанием кислорода, или в условиях, в которых является желательным повышение способности организма поддерживать и/или увеличивать физическое напряжение, и т.д. Поэтому, в одном из аспектов, в настоящем изобретении представлены способы и соединения для индуцирования метаболического сдвига в потреблении кислорода, т.е. продуцирования зависимого от дозы снижения потребления кислорода в клетках без какого-либо воздействия на жизнеспособность клеток. В настоящем изобретении предполагается, что сдвиг к анаэробному продуцированию энергии, менее эффективному процессу, чем аэробное дыхание, будет увеличивать потребность организма в возврате к жиру в качестве источника энергии, таким образом, оказывая влияние на дополнительный метаболический сдвиг, например, по направлению к жиру как основному источнику энергии.In addition, a shift to increased glycolysis, anaerobic process and increased utilization of fatty acids can effectively reduce the overall oxygen consumption (see, for example, Example 12). A metabolic shift in energy use and the accompanying weight loss are consistent with reports that hypoxia associated with high altitude induces weight loss, specifically resulting in a decrease in body fat. (See, for example, Fushiki et al., Supra; Gunga et al., Supra and Tschop and Morrison, supra) This approach can be used, for example, to maintain or increase the body's ability to generate energy. This may be desirable, for example, in conditions with a low oxygen content, or in conditions in which it is desirable to increase the body's ability to maintain and / or increase physical stress, etc. Therefore, in one aspect, the present invention provides methods and compounds for inducing a metabolic shift in oxygen consumption, i.e. producing a dose-dependent reduction in oxygen consumption in cells without any effect on cell viability. The present invention assumes that a shift to anaerobic energy production, a less efficient process than aerobic respiration, will increase the body's need to return to fat as an energy source, thereby affecting an additional metabolic shift, for example, towards fat as main source of energy.

В одном из вариантов осуществления изобретения, представлен способ индуцирования снижения аэробного метаболизма и сопутствующего повышения анаэробного метаболизма у субъекта, спосо6, включающий: (а) изменение экспрессии гликолитического фактора и (b) изменение координированного способа действия регуляторного фактора жира. В различных вариантах осуществления изобретения, гликолитический фактор выбирают из группы, состоящей из PFK-P, PFK-L, енолазы-1, GluT-1, лактатдегидрогеназы, альдолазы-1, гексокиназы-1, IGFBP-1 и IGF, а регуляторные факторы жира выбирают из группы, состоящей из лептина, аполипопротеина А-IV, цитозольной ацил-СоА-тиоэстеразы-1, связующего белка инсулиноподобного фактора роста (IGFBP)-1, карнитин-ацетилтрансферазы, PAI-1, DEC1/Stra13 и PPAR-γ.In one embodiment of the invention, there is provided a method for inducing a decrease in aerobic metabolism and a concomitant increase in anaerobic metabolism in a subject, method 6 comprising: (a) changing the expression of a glycolytic factor and (b) changing the coordinated mode of action of the regulatory fat factor. In various embodiments, the glycolytic factor is selected from the group consisting of PFK-P, PFK-L, enolase-1, GluT-1, lactate dehydrogenase, aldolase-1, hexokinase-1, IGFBP-1 and IGF, and regulatory fat factors selected from the group consisting of leptin, apolipoprotein A-IV, cytosolic acyl CoA thioesterase-1, binding protein of insulin-like growth factor (IGFBP) -1, carnitine acetyltransferase, PAI-1, DEC1 / Stra13 and PPAR-γ.

В настоящем изобретении конкретно представлен координированный терапевтический подход, посредством которого введением одного из соединений настоящего изобретения одновременно достигается координированное повышающее регулирование, по меньшей мере, одного из регуляторных факторов жира и, по меньшей мере, одного из регуляторных факторов глюкозы.The present invention specifically provides a coordinated therapeutic approach by which the administration of one of the compounds of the present invention simultaneously achieves a coordinated up-regulation of at least one of the regulatory factors of fat and at least one of the regulatory factors of glucose.

В то время, как настоящее изобретение никоим образом не ограничивается процессом, приведенным в качестве примера и описанным ниже, предполагается, что повышенная утилизация жира в качестве источника энергии, как это подтверждено, например, уменьшением содержания телесного жира (смотри, например, Примеры 5 и 6 и т.д.) и кратковременным увеличением содержания триглицеридов (смотри, например. Пример 13), эффективно снижает общую эффективность энергии, заставляя субъект сжигать больше калорий для продуцирования энергии, и таким образом индуцируя потерю веса. Длительное снижение уровней содержания триглицеридов (смотри, например, Пример 8) представляет собой подтверждение этой теории, демонстрируя, что основной эффект способов настоящего изобретения при регулировании метаболических процессов жира заключается в том, чтобы приводить в действие организм для достижения и поддержания гомеостаза жира.While the present invention is in no way limited to the process given as an example and described below, it is assumed that increased utilization of fat as an energy source, as confirmed, for example, by a decrease in body fat (see, for example, Examples 5 and 6, etc.) and a short-term increase in triglycerides (see, for example. Example 13), effectively reduces the overall energy efficiency, forcing the subject to burn more calories to produce energy, and thus induce i will lose weight. A prolonged decrease in triglyceride levels (see, for example, Example 8) confirms this theory, demonstrating that the main effect of the methods of the present invention in regulating the metabolic processes of fat is to activate the body to achieve and maintain fat homeostasis.

Поэтому, в одном из аспектов, представлен способ снижения эффективности энергии у субъекта, чтобы тем самым индуцировать потерю веса, включающий стабилизирование HIFα у субъекта.Therefore, in one aspect, a method of reducing energy efficiency in a subject is provided, thereby inducing weight loss, including stabilizing HIFα in the subject.

Терапевтические способыTherapeutic methods

В настоящем изобретении представлены способы и соединения для лечения метаболических нарушений, связанных с метаболизмом и гомеостазом жира. Кроме того, в изобретении представлены способы лечения пациента, у которого наблюдается высокая вероятность развития метаболического нарушения, например, пациентов с высоким риском развития атеросклероза, диабета и т.д., используя соединения, описанные здесь. Факторы риска развития атеросклероза и диабета включают, например, гиперлипидемию и абдоминальное ожирение.The present invention provides methods and compounds for treating metabolic disorders associated with fat metabolism and homeostasis. In addition, the invention provides methods of treating a patient who has a high likelihood of developing a metabolic disorder, for example, patients with a high risk of developing atherosclerosis, diabetes, etc., using the compounds described herein. Risk factors for developing atherosclerosis and diabetes include, for example, hyperlipidemia and abdominal obesity.

Метаболическое состояние субъекта физиологически контролируют с помощью факторов, которые дают ответную реакцию на уровни ключевых метаболитов в плазме и изменяют экспрессию группы генов, которые соответствующим образом управляют утилизацией и накоплением питательных веществ. Например, при метаболическом гомеостазе жировой ткани требуется баланс между поглощением и накоплением глюкозы и триглицерида и высвобождением жирной кислоты. В настоящем изобретении представлены способы и соединения для регулирования метаболического состояния субъекта, где субъект может быть клеткой, выращенной в культуре, или животным, предпочтительно, когда животное является млекопитающим и, более предпочтительно, когда млекопитающее является человеком.The metabolic state of the subject is physiologically controlled using factors that respond to plasma key metabolite levels and alter the expression of a group of genes that appropriately control the utilization and accumulation of nutrients. For example, metabolic adipose tissue homeostasis requires a balance between the absorption and accumulation of glucose and triglyceride and the release of fatty acid. The present invention provides methods and compounds for regulating the metabolic state of a subject, where the subject may be a cell grown in culture or an animal, preferably when the animal is a mammal and, more preferably, when the mammal is a human.

Измененный или ухудшенный метаболизм жира, или избыток или отсутствие накопления жира, может приводить, в случае избытка накопления жира, к ожирению, включая абдоминальное ожирение, ухудшающему фактору для диабета; в случае истощения или незначительного накопления жира, к нарушенным иммунным функциям и другим метаболическим отклонениям.An altered or impaired fat metabolism, or an excess or lack of fat accumulation, can lead, in the case of excess fat accumulation, to obesity, including abdominal obesity, a worsening factor for diabetes; in case of depletion or slight accumulation of fat, to impaired immune functions and other metabolic abnormalities.

Ожирение, особенно абдоминальное или центральное ожирение, является вполне обычным для пациентов с диабетом типа 2. Адипоциты являются основным органом-мишенью для инсулина; адипоциты также секретируют ряд биологических продуктов, таких как лептин, фактор-α некроза опухоли и свободные жирные кислоты, которые модулируют секрецию и действие инсулина. Таким образом, избыточная жировая ткань может способствовать резистентности к инсулину. Например, мутации потеря функции в гене, который кодирует лептин, ассоциируются с предрасположенностью к диабету у грызунов (Chen и соав. (1996) Cell 84:491-495).Obesity, especially abdominal or central obesity, is quite common in patients with type 2 diabetes. Adipocytes are the main target organ for insulin; adipocytes also secrete a number of biological products, such as leptin, tumor necrosis factor-α, and free fatty acids, which modulate the secretion and action of insulin. Thus, excess adipose tissue can contribute to insulin resistance. For example, mutations in loss of function in a gene that encodes leptin are associated with a predisposition to diabetes in rodents (Chen et al. (1996) Cell 84: 491-495).

Оказалось, что несколько других белков, которые связаны с регулированием жира, выполняют также полезную роль при диабете и сосудистом заболевании. Например, ApoA-IV обладает антиатерогенными свойствами; и мыши, у которых отсутствует PAI-1, в меньшей степени способны контролировать вес тела, увеличивая вес быстрее на диете с высоким содержанием жира, чем мыши дикого типа (см., например, Cohen и соав. (1997) J Clin Invest 99:1906-1916; Verges (1995) Diabetes Metab 21:99-105; Ostos и соав. (2000) Atherosclerosis 153:209-217 и Morange и соав. (2000) Arterioscler Thromb Vase Biol 20:1150-1154). Кроме того, экспрессия PAI-1 усиливается за счет прокахектического цитокина TNF-α и за счет антидиабетических соединений тиазолидиндионного типа (Cigolini и соав. (1999) Atherosclerosis 143:81-90 и lhara и соав. (2001) FASEB J 15:1233-1235). Кроме того, экспрессия белков, таких как связующий белок инсулиноподобного фактора роста (IGFBP)-1, приводит к повышенной чувствительности к инсулину и способствует уменьшению массы телесного жира.It turned out that several other proteins that are associated with the regulation of fat, also play a useful role in diabetes and vascular disease. For example, ApoA-IV has anti-atherogenic properties; and mice lacking PAI-1 are less able to control body weight by increasing weight faster on a high fat diet than wild-type mice (see, e.g., Cohen et al. (1997) J Clin Invest 99: 1906-1916; Verges (1995) Diabetes Metab 21: 99-105; Ostos et al. (2000) Atherosclerosis 153: 209-217 and Morange et al. (2000) Arterioscler Thromb Vase Biol 20: 1150-1154). In addition, the expression of PAI-1 is enhanced by the procahectic cytokine TNF-α and by the antidiabetic compounds of the thiazolidinedione type (Cigolini et al. (1999) Atherosclerosis 143: 81-90 and lhara et al. (2001) FASEB J 15: 1233- 1235). In addition, the expression of proteins, such as the insulin-like growth factor binding protein (IGFBP) -1, leads to increased insulin sensitivity and helps to reduce body fat mass.

Ожирение можно связывать также с повышенной активностью симпатической нервной системы, повышенными уровнями в плазме вазоконстрикторного эндотелина-1 и ухудшенной инсулин-индуцируемой эндотелий-зависимой вазодилатацией. Кроме того, адипоциты могут секретировать вазогенные пептиды, такой как ангиотензиноген. Диабет типа 2, висцеральное ожирение, артериальная гипертензия и липидные нарушения могут принадлежать синдрому, вызванному пониженной чувствительностью к инсулину с компенсаторной гиперинсулинемией, которая создает значительную коронарную опасность (Muller-Wieland и соав. (1998) Basic Res Cardiol 93:131-134).Obesity can also be associated with increased activity of the sympathetic nervous system, increased plasma levels of vasoconstrictor endothelin-1, and worsened insulin-induced endothelium-dependent vasodilation. In addition, adipocytes can secrete vasogenic peptides, such as angiotensinogen. Type 2 diabetes, visceral obesity, arterial hypertension, and lipid abnormalities may belong to a syndrome caused by decreased insulin sensitivity with compensatory hyperinsulinemia, which poses a significant coronary risk (Muller-Wieland et al. (1998) Basic Res Cardiol 93: 131-134).

Соответственно, способы настоящего изобретения можно применять, чтобы фармакологически стабилизировать HIFα и тем самым продуцировать подавление аппетита и последующую потерю веса, ассоциируемую со стимулами гипоксической окружающей среды. В настоящем изобретении демонстрируют, что способы, описанные здесь, приводят к селективному уменьшению телесного жира, которое макроскопически наблюдается в виде исчезновения абдоминальной жировой ткани и уменьшения относительного веса органов, у животных моделей. Эти эффекты наблюдаются у генетически нормальных животных, демонстрируя, что способы изобретения способны соответствующим образом обеспечивать повышающую регуляцию всех факторов, которые необходимы для эффективного уменьшения массы телесного жира.Accordingly, the methods of the present invention can be used to pharmacologically stabilize HIFα and thereby produce appetite suppression and subsequent weight loss associated with hypoxic environment stimuli. The present invention demonstrates that the methods described here lead to a selective reduction in body fat, which is macroscopically observed as the disappearance of abdominal adipose tissue and a decrease in the relative weight of organs in animal models. These effects are observed in genetically normal animals, demonstrating that the methods of the invention are capable of appropriately providing up-regulation of all factors that are necessary to effectively reduce body fat.

Так способы изобретения эффективно модулируют многочисленные аспекты регулирования жира, включая транспорт, поглощение, процессинг, утилизацию и накопление жира, способы изобретения являются полезными для лечения или профилактики нарушений, связанных с регулированием жира. Такие нарушения включают, но не ограничиваются ими, ожирение, атеросклероз и т.д. Так как известно, что избыток жира и липидов способствуют появлению опасностей, связанных с развитием диабета, лечение существующими в настоящее время способами может оказывать благоприятное влияние на уменьшение вероятности, частоты или серьезности диабета. Кроме того, известно, что высокие уровни содержания в сыворотке свободных жирных кислот или липидов повышают резистентность к инсулину, что в дальнейшем обостряет патофизиологию диабета.Since the methods of the invention effectively modulate numerous aspects of fat regulation, including transport, absorption, processing, utilization and accumulation of fat, the methods of the invention are useful for treating or preventing disorders related to fat regulation. Such disorders include, but are not limited to, obesity, atherosclerosis, etc. Since excess fat and lipids are known to contribute to the dangers associated with the development of diabetes, treatment with current methods can have a beneficial effect on reducing the likelihood, frequency or severity of diabetes. In addition, it is known that high serum levels of free fatty acids or lipids increase insulin resistance, which further exacerbates the pathophysiology of diabetes.

Соединения и способы настоящего изобретения можно использовать для регулирования веса тела, индуцируя потерю или снижение массы тела без сопутствующей потери массы мышц. Конкретно, способы настоящего изобретения можно использовать для снижения уровней содержания и отложения висцерального жира. Также, способами изобретения потенциально снижают адипогенез и регулируют накопление жира, эффективно контролируя таким образом увеличение веса. Такие способы являются полезными для лечения нарушений в метаболизме жира или для облегчения поддержания соответствующего веса тела. Кроме того, способы и соединения изобретения являются эффективными при уменьшении увеличения веса даже в процессе избыточного калорийного поглощения. Таким образом, фармакологическое регулирование стабилизации HIF создает новый терапевтический подход для лечения или профилактики осложнений, заболеваний и патологий, связанных с регулированием жира, например, ожирения. Путем увеличения анти-липогенных факторов, таких как лептин, PAI-1, ApoA-IV и IGFBP, стабилизация HIF создает терапевтические преимущества для лечения ожирения и связанных с ним осложнений.The compounds and methods of the present invention can be used to control body weight by inducing loss or reduction of body weight without concomitant loss of muscle mass. Specifically, the methods of the present invention can be used to reduce visceral fat levels and deposits. Also, the methods of the invention potentially reduce adipogenesis and regulate the accumulation of fat, thus effectively controlling weight gain. Such methods are useful for treating disorders in fat metabolism or to facilitate maintaining an appropriate body weight. In addition, the methods and compounds of the invention are effective in reducing weight gain, even in the process of excessive caloric absorption. Thus, pharmacological regulation of HIF stabilization creates a new therapeutic approach for the treatment or prevention of complications, diseases and pathologies associated with the regulation of fat, for example, obesity. By increasing anti-lipogenic factors such as leptin, PAI-1, ApoA-IV, and IGFBP, stabilizing HIF provides therapeutic benefits for treating obesity and its associated complications.

Фармацевтические композиции и пути их введенияPharmaceutical compositions and routes of administration

Композиции настоящего изобретения можно вводить непосредственно или в виде фармацевтических композиций, содержащих наполнители, которые хорошо известны в данной области. Способы лечения настоящего изобретения могут включать введение эффективного количества соединения настоящего изобретения субъекту с метаболическими нарушениями или с риском появления метаболических нарушений; в частности, нарушения, связанного с регулированием жира, например, атеросклероза, ожирения, диабета и т.д. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, субъект представляет собой млекопитающее, и в наиболее предпочтительном варианте, субъект представляет собой человека.The compositions of the present invention can be administered directly or in the form of pharmaceutical compositions containing excipients that are well known in the art. Methods of treating the present invention may include administering an effective amount of a compound of the present invention to a subject with metabolic disorders or at risk of metabolic disorders; in particular, disorders associated with the regulation of fat, for example, atherosclerosis, obesity, diabetes, etc. In a preferred embodiment, the subject is a mammal, and in the most preferred embodiment, the subject is a human.

Эффективное количество, например, дозу, соединения или лекарственного средства можно легко определять с помощью рутинного экспериментирования, которое может обеспечить эффективный и удобный путь введения и соответствующую композицию. Различные композиции и системы доставки лекарств являются доступными в данной области (Смотри, например, Gennaro, публикация. (2000) Remington's Pharmaceutical Sciences, см. выше и Hardman, Limbird и Gilman, публикации (2001) Фармокологическая основа терапевтики (The Pharmacological Basis of Therapeutic) см. выше.)An effective amount, for example, a dose, compound or drug, can be easily determined by routine experimentation, which can provide an effective and convenient route of administration and an appropriate composition. Various compositions and drug delivery systems are available in the art (See, for example, Gennaro, publication. (2000) Remington's Pharmaceutical Sciences, supra and Hardman, Limbird and Gilman, publications (2001) The Pharmacological Basis of Therapeutic ) see above.)

Пригодные пути введения могут, например, включать оральное, ректальное, местное, носовое, легочное, глазное, кишечное и парентеральное введение. Первичные пути парентерального введения включают внутривенное, внутримышечное и подкожное введение. Вторичные пути введения включают внутрибрюшинное, внутриартериальное, внутрисуставное, внутрисердечное, интрацистернальное, интрадермальное, интралезиональное, внутриглазное, интраплевральное, внутриоболочечное, внутриматочное и интравентрикулярное введение. Показания для лечения, вместе с физическими, химическими и биологическими свойствами лекарственного средства, диктуют тип композиции и путь введения, который будет применяться, а также какая, точечная или системная, доставка будет предпочтительной.Suitable routes of administration may, for example, include oral, rectal, topical, nasal, pulmonary, ophthalmic, intestinal and parenteral administration. Primary parenteral routes include intravenous, intramuscular and subcutaneous administration. Secondary routes of administration include intraperitoneal, intraarterial, intraarticular, intracardiac, intracisternal, intradermal, intralesial, intraocular, intrapleural, intrathecal, intrauterine and intraventricular administration. Indications for treatment, together with the physical, chemical and biological properties of the drug, dictate the type of composition and route of administration that will be used, as well as which, point or systemic, delivery will be preferred.

Фармацевтические формы дозировок соединения настоящего изобретения можно создавать в форме немедленного высвобождения, контролированного высвобождения, замедленного высвобождения, или системы с направленной доставкой лекарственного средства. Обычно используемые формы дозировок включают, например, растворы и суспензии, (микро-) эмульсии, мази, гели и пластыри, липосомы, таблетки, драже, капсулы в твердой или мягкой оболочке, суппозитории, овули, имплантаты, аморфные или кристаллические порошки, аэрозоли и лиофилизованные композиции. В зависимости от используемого пути введения, могут потребоваться специальные устройства для применения или введения лекарственного препарата, такие как, например, шприцы и иглы, ингаляторы, насосы, емкости для инъекций (injection pen), аппликаторы или специальные колбы. Фармацевтические формы дозировок часто состоят из лекарственного средства, наполнителя(лей) и контейнера/закрытой системы. Один или несколько наполнителей, к тому же относящихся к неактивным ингредиентам, можно добавлять к соединению настоящего изобретения для улучшения или облегчения производства, стабильности, введения и безопасности лекарственного средства, и эти наполнители могут обеспечить необходимое условие для достижения желаемого уровня высвобождения лекарственного средства. Поэтому, тип наполнителя(лей), который добавляют к лекарственному средству, может зависеть от различных факторов, таких как, например, физические и химические свойства лекарственного средства, пути введения и способа производства. Фармацевтически приемлемые наполнители являются доступными в данной области и включают те соединения, которые приведены в различных фармакопеях. (Смотри, например, фармакопею США (USP), Японскую фармакопею (IP), Европейскую фармакопею (ЕР) и Британскую фармакопею (ВР); the U.S. Food and Drug Administration (www.fda.gov) Center for Drug Evaluation and Research (CEDR) публикации, например, Inactive Ingredient Guide (1996); Ash and Ash, публикации (2002) Handbook of Pharmaceutical Additives, Synapse Information Resources, Inc., Endicott NY и т.д.).Pharmaceutical dosage forms of a compound of the present invention can be formulated in the form of immediate release, controlled release, sustained release, or a drug delivery system. Commonly used dosage forms include, for example, solutions and suspensions, (micro) emulsions, ointments, gels and plasters, liposomes, tablets, dragees, hard or soft capsules, suppositories, ovules, implants, amorphous or crystalline powders, aerosols and lyophilized compositions. Depending on the route of administration used, special devices may be needed for administering or administering the drug, such as, for example, syringes and needles, inhalers, pumps, injection containers, applicators or special flasks. Pharmaceutical dosage forms often consist of a drug, excipient (s) and container / closed system. One or more excipients, also related to inactive ingredients, can be added to the compound of the present invention to improve or facilitate the production, stability, administration and safety of the drug, and these excipients can provide the necessary condition to achieve the desired level of drug release. Therefore, the type of excipient (s) that is added to the drug may depend on various factors, such as, for example, the physical and chemical properties of the drug, route of administration and mode of production. Pharmaceutically acceptable excipients are available in the art and include those listed in various pharmacopeias. (See, for example, the US Pharmacopoeia (USP), Japanese Pharmacopoeia (IP), European Pharmacopoeia (EP) and British Pharmacopoeia (BP); the US Food and Drug Administration (www.fda.gov) Center for Drug Evaluation and Research (CEDR ) publications, e.g., Inactive Ingredient Guide (1996); Ash and Ash, publications (2002) Handbook of Pharmaceutical Additives, Synapse Information Resources, Inc., Endicott NY, etc.).

Фармацевтические формы дозировок соединения настоящего изобретения можно изготавливать с помощью любого из способов, хорошо известных в данной области, таких как, например, обычного смешивания, рассева, растворения, плавления, гранулирования, производства драже, таблетирования, суспендирования, экструзии, распылительной сушки, растирания в порошок, эмульгирования, (нано-/микро-) капсулирования, покрытия оболочкой, или процессов лиофилизации. Как отмечалось выше, композиции настоящего изобретения могут включать один или большее количество физиологически приемлемых неактивных ингредиентов, которые облегчают процессинг активных соединений в препаратах для фармацевтического применения.Pharmaceutical dosage forms of the compounds of the present invention can be prepared using any of the methods well known in the art, such as, for example, conventional mixing, sieving, dissolving, melting, granulating, dragee-forming, tabletting, suspension, extrusion, spray drying, grinding powder, emulsification, (nano / micro) encapsulation, coating, or lyophilization processes. As noted above, the compositions of the present invention may include one or more physiologically acceptable inactive ingredients that facilitate the processing of active compounds in pharmaceutical preparations.

Соответствующая композиция зависит от желаемого пути введения. Для внутривенной инъекции, например, композицию можно изготавливать в виде водного раствора, если необходимо, с использованием физиологически совместимых буферных растворов, включая, например, фосфаты, гистидин или цитрат для регулирования рН композиции, и тонизирующий агент, такой как, например, хлорид натрия или декстроза. Для введения через слизистую оболочку или носового введения могут быть предпочтительными полутвердые, жидкие композиции, или пластыри, возможно содержащие усилители проницаемости. Такие усилители проницаемости обычно известны в данной области. Для орального введения, соединения можно готовить в виде жидких или твердых форм дозировок и в виде растворимых композиций или композиций с контролированным/замедленным высвобождением. Пригодные формы дозирования для орального приема объектом исследования включают таблетки, пилюли, драже, капсулы в твердой и мягкой оболочке, жидкости, гели, сиропы, взвеси, суспензии и эмульсии. Соединения можно также готовить в виде ректальных композиций, таких как суппозитории или удерживающие клизмы, например, содержащие обычную суппозиторную основу, такую как масло какао или другие глицериды.The appropriate composition depends on the desired route of administration. For intravenous injection, for example, the composition can be formulated as an aqueous solution, if necessary, using physiologically compatible buffer solutions, including, for example, phosphates, histidine or citrate to adjust the pH of the composition, and a tonicating agent, such as, for example, sodium chloride or dextrose. For administration through the mucous membrane or nasal administration, semi-solid, liquid compositions, or patches, possibly containing permeation enhancers, may be preferred. Such permeability enhancers are commonly known in the art. For oral administration, the compounds can be prepared in liquid or solid dosage forms and in the form of soluble or sustained / controlled release compositions. Suitable dosage forms for oral administration by the subject of study include tablets, pills, dragees, hard and soft capsules, liquids, gels, syrups, suspensions, suspensions and emulsions. The compounds can also be formulated as rectal compositions, such as suppositories or retention enemas, for example, containing a conventional suppository base such as cocoa butter or other glycerides.

Твердые оральные формы дозировок можно получать с использованием наполнителей, которые могут включать заполнители, дезинтегранты, связующие агенты (сухие или мокрые), замедлители растворения, смазывающие агенты, глиданты, антиадгезирующие добавки, катионообменные смолы, смачивающие агенты, антиоксиданты, консерванты, окрашивающие агенты и ароматизаторы. Эти наполнители могут быть синтетическими или из природных источников. Примеры таких наполнителей включают производные целлюлозы, лимонную кислоту, дикальций фосфат, желатин, карбонат магния, магний/натрий лаурилсульфат, маннитол, полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон, силикаты, диоксид кремния, бензоат натрия, сорбит, крахмалы, стеариновую кислоту или ее соль, сахара (т.е. декстрозу, сахарозу, лактозу и т.д.), тальк, трагакантовый клей, растительные масла (гидрированные) и воска. Этанол и вода могут служить в качестве гранулирующих добавок. В некоторых случаях, может быть желательным, например, покрытие таблеток пленкой, маскирующей вкус, пленкой, защищающей от воздействия желудочной кислоты, или пленкой для обеспечения замедленного высвобождения. Природные и синтетические полимеры в комбинации с окрашивающими агентами, сахарами и органическими растворителями или водой, часто используют для покрытия таблеток, что приводит к получению драже. Если капсула является предпочтительной по сравнению с таблеткой, то порошок лекарственного средства, суспензия или его раствор можно ввести в капсулу с твердой или мягкой оболочкой.Solid oral dosage forms can be prepared using excipients, which may include fillers, disintegrants, binders (dry or wet), dissolution retardants, lubricants, glidants, anti-adhesive additives, cation exchange resins, wetting agents, antioxidants, preservatives, coloring agents and flavoring agents . These fillers may be synthetic or from natural sources. Examples of such excipients include cellulose derivatives, citric acid, dicalcium phosphate, gelatin, magnesium carbonate, magnesium / sodium lauryl sulfate, mannitol, polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone, silicates, silica, sodium benzoate, sorbitol, starches, stearic acid or its sugar, ( ie dextrose, sucrose, lactose, etc.), talc, tragacanth glue, vegetable oils (hydrogenated) and waxes. Ethanol and water can serve as granulating additives. In some cases, it may be desirable, for example, to coat the tablets with a taste masking film, a stomach acid protecting film, or a film to provide a sustained release. Natural and synthetic polymers in combination with coloring agents, sugars, and organic solvents or water are often used to coat tablets, resulting in dragees. If the capsule is preferred over the tablet, the drug powder, suspension or solution can be introduced into the capsule with a hard or soft shell.

В одном из вариантов осуществления изобретения, соединения настоящего изобретения можно вводить местно, например, через пластырь на коже, с помощью полутвердой или жидкой композиции, например, геля, (микро-) эмульсии, мази, раствора, (нано-/микро-) суспензии или пены. Проникновение лекарственного средства в кожу и нижележащие ткани можно регулировать, например, используя усилители степени проникновения; соответствующего выбора и комбинации липофильных, гидрофильных и амфифильных наполнителей, включая воду, органические растворители, воска, масла, синтетические и природные полимеры, поверхностно-активные вещества, эмульгаторы; путем регулирования рН; и использования комплексообразующих агентов. Для регулирования проникновения в кожу соединения настоящего изобретения, можно использовать другие приемы, такие как ионофорез. Трансдермальное или местное введение может быть предпочтительным, например, в ситуациях, в которых является желательной местная доставка с минимальным систематическим временем воздействия.In one embodiment, the compounds of the present invention can be administered topically, for example, through a patch on the skin, using a semi-solid or liquid composition, for example, a gel, (micro) emulsion, ointment, solution, (nano / micro) suspension or foam. The penetration of the drug into the skin and underlying tissues can be controlled, for example, using penetration enhancers; the appropriate choice and combination of lipophilic, hydrophilic and amphiphilic fillers, including water, organic solvents, waxes, oils, synthetic and natural polymers, surfactants, emulsifiers; by adjusting the pH; and the use of complexing agents. Other methods, such as iontophoresis, can be used to control the penetration into the skin of a compound of the present invention. Transdermal or topical administration may be preferred, for example, in situations in which local delivery with minimal systematic exposure time is desired.

Для введения лекарственного средства путем ингаляции, или путем введения в нос, соединения для использования согласно настоящему изобретению обычно вводят в форме раствора, суспензии, эмульсии или полутвердого аэрозоля из герметизированных баллончиков, или распылителя, обычно с использованием газа-вытеснителя, например, галогенизированных углеводородов, полученных из метана и этана, диоксида углерода, или любого другого пригодного газа. Для местных аэрозолей, полезными являются углеводороды, подобные бутану, изобутану и пентану. В случае герметизированного аэрозоля, соответствующее дозирующее устройство можно регулировать путем обеспечения клапана для доставки дозированного количества. Можно изготавливать капсулы и картриджи, например, из желатина, для использования в ингаляторе или аппарате для вдувания. Эти продукты обычно содержат порошкообразную смесь соединения изобретения и пригодную порошкообразную основу, такую как лактоза или крахмал.For administration of the drug by inhalation, or by administration into the nose, the compounds for use in accordance with the present invention are usually administered in the form of a solution, suspension, emulsion or semi-solid aerosol from pressurized cartridges or a nebulizer, usually using a propellant, for example, halogenated hydrocarbons, derived from methane and ethane, carbon dioxide, or any other suitable gas. For local aerosols, hydrocarbons like butane, isobutane and pentane are useful. In the case of a pressurized aerosol, an appropriate metering device can be adjusted by providing a valve to deliver a metered amount. Capsules and cartridges can be made, for example, from gelatin, for use in an inhaler or blower. These products typically contain a powdery mixture of a compound of the invention and a suitable powdery base, such as lactose or starch.

Композиции, приготовленные для парентерального введения путем инъекции, являются обычно стерильными и могут содержаться в формах для стандартного дозирования, например, ампулах, шприцах, емкостях для инъекций или в контейнерах с большим количеством доз, причем последние обычно содержат консервант. Композиции могут быть в виде суспензий, растворов или эмульсий в масле или в связующем на водной основе и могут содержать агенты композиции, такие как буферные растворы, тонизирующие агенты, загущающие агенты, поверхностно-активные вещества, суспендирующие и диспергирующие агенты, антиоксиданты, биосовместимые полимеры, хелатирующие агенты и консерванты. В зависимости от участка инъекции, наполнитель может содержать воду, синтетическое или растительное масло, и/или органические сорастворители. В конкретных примерах, таких как лиофилизованный продукт или концентрат, парентеральную композицию можно заново составлять или разбавлять до введения. Базовые композиции, обеспечивающие контролированное или замедленное высвобождение соединения настоящего изобретения, могут включать суспензии для инъекции, состоящие из нано/микро частиц или нано/микро или немикронизованных кристаллов. Полимеры, такие как полимолочная кислота, полигликолевая кислота или их сополимеры, могут служить в качестве матриц контролированного/замедленного высвобождения, в дополнение к другим, хорошо известным в данной области соединениям. Другие базовые системы доставки могут быть представлены в форме имплантатов и насосов, для которых требуются разрезы.Compositions prepared for parenteral administration by injection are usually sterile and may be contained in unit dosage forms, for example, ampoules, syringes, injection containers or in large dose containers, the latter usually containing a preservative. The compositions may be in the form of suspensions, solutions or emulsions in oil or in a water-based binder and may contain composition agents such as buffers, tonicity agents, thickening agents, surfactants, suspending and dispersing agents, antioxidants, biocompatible polymers, chelating agents and preservatives. Depending on the injection site, the filler may contain water, synthetic or vegetable oil, and / or organic cosolvents. In specific examples, such as a lyophilized product or concentrate, the parenteral composition may be reconstituted or diluted prior to administration. Basic compositions for controlled or sustained release of a compound of the present invention may include injection suspensions consisting of nano / micro particles or nano / micro or non-micronized crystals. Polymers, such as polylactic acid, polyglycolic acid or their copolymers, can serve as controlled / sustained release matrices, in addition to other compounds well known in the art. Other basic delivery systems can be presented in the form of implants and pumps that require incisions.

Пригодные носители для внутривенной инъекции соединений настоящего изобретения хорошо известны в данной области и включают растворы на водной основе, содержащие основания, такие как, например, гидроксид натрия, для образования ионизируемых соединений, сахарозу или хлорид натрия в качестве тонизирующего агента, например, буферного раствора, содержащего фосфат или гистидин. Можно добавлять сорастворители, такие как, например, полиэтиленгликоли. Эти системы на водной основе являются эффективными при разбавлении соединений настоящего изобретения и обеспечивают низкую токсичность при систематическом введении. Соотношение компонентов системы раствора можно значительно изменять, без изменения растворимости и характеристик токсичности. Кроме того, можно изменять природу компонентов. Например, можно использовать низкотоксичные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты или полоксамеры, так же как можно добавлять такие соединения, как полиэтиленгликоль или другие сорастворители, биосовместимые полимеры, такие как поливинилпирролидон, а другие сахара и полиолы можно заменять на декстрозу.Suitable carriers for intravenous injection of the compounds of the present invention are well known in the art and include aqueous solutions containing bases such as, for example, sodium hydroxide to form ionizable compounds, sucrose or sodium chloride as a tonicity agent, for example, a buffering solution, containing phosphate or histidine. Co-solvents, such as, for example, polyethylene glycols, can be added. These water-based systems are effective in diluting the compounds of the present invention and provide low toxicity with systematic administration. The ratio of the components of the solution system can be significantly changed without changing the solubility and toxicity characteristics. In addition, you can change the nature of the components. For example, low toxicity surfactants such as polysorbates or poloxamers can be used, as well as compounds such as polyethylene glycol or other cosolvents, biocompatible polymers such as polyvinylpyrrolidone can be added, and other sugars and polyols can be replaced with dextrose.

Для композиции, пригодной для способов лечения, представленных в настоящем изобретении, терапевтически эффективную дозу можно рассчитать предварительно, используя множество методов, хорошо известных в данной области. Первоначальные дозы, используемые при исследованиях на животных, могут базироваться на эффективных концентрациях, установленных при анализах клеточных культур. Диапазоны дозирования, соответствующие субъектам в виде человека, можно определять, например, используя данные, полученные из исследований на животных и анализов клеточных культур.For a composition suitable for the treatment methods of the present invention, the therapeutically effective dose can be calculated in advance using a variety of methods well known in the art. The initial doses used in animal studies can be based on the effective concentrations established in the analyzes of cell cultures. Dosage ranges corresponding to human subjects can be determined, for example, using data obtained from animal studies and cell culture analyzes.

Эффективное количество или терапевтически эффективное количество или доза агента, например, соединения по настоящему изобретению, относится к количеству соединения или агента, которое приводит к улучшению симптомов или пролонгированию выживания у субъекта. Токсичность и терапевтическую эффективность таких молекул можно определять с помощью стандартных фармацевтических процедур на культурах клеток или на экспериментальных животных, например, путем определения величины LD₅₀ (летальной дозы у 50% популяции) и ED₅₀ (терапевтически эффективной дозы у 50% популяции). Дозовое соотношение токсичности к терапевтической эффективности представляет собой терапевтический индекс, который можно выражать в виде отношения LD₅₀/ED₅₀. Агенты, которые показывают высокие терапевтические индексы, являются предпочтительными.An effective amount or a therapeutically effective amount or dose of an agent, for example, a compound of the present invention, refers to an amount of a compound or agent that leads to an improvement in symptoms or prolongation of survival in a subject. The toxicity and therapeutic efficacy of such molecules can be determined using standard pharmaceutical procedures on cell cultures or experimental animals, for example, by determining the values of LD ₅₀ (lethal dose in 50% of the population) and ED ₅₀ (therapeutically effective dose in 50% of the population). The dose ratio of toxicity to therapeutic efficacy is the therapeutic index, which can be expressed as the ratio of LD ₅₀ / ED ₅₀ . Agents that exhibit high therapeutic indices are preferred.

Эффективное количество или терапевтически эффективное количество представляет собой количество соединения или фармацевтической композиции, которое будет вызывать биологический или медицинский ответ ткани, системы, животного или человека, которые находятся в поле зрения исследователя, ветеринара, медицинского врача или другого клинициста, например, будет регулировать метаболизм жира, снижать содержание жира в организме, регулировать вес тела, обеспечивать лечение или профилактику нарушения, например, ожирения и т.д.An effective amount or a therapeutically effective amount is an amount of a compound or pharmaceutical composition that will elicit a biological or medical response from a tissue, system, animal or human that is in the field of view of a researcher, veterinarian, medical doctor or other clinician, for example, will regulate fat metabolism , reduce body fat, regulate body weight, provide treatment or prevention of disorders, such as obesity, etc.

Дозировки препаратов, предпочтительно, находятся в пределах диапазона обычных концентраций, который включает ED₅₀ с малой токсичностью или с отсутствием токсичности. Дозировки препаратов могут изменяться в пределах этого диапазона в зависимости от применяемой формы дозирования и/или используемого пути введения. Точный состав, путь введения, дозировка и интервал дозирования должны выбираться в соответствии со способами, известными в данной области, и в соответствии с конкретным состоянием субъекта.Dosages of the preparations are preferably within the range of conventional concentrations, which includes an ED ₅₀ with little or no toxicity. Dosages of drugs may vary within this range depending on the dosage form used and / or the route of administration used. The exact composition, route of administration, dosage and dosage interval should be selected in accordance with methods known in the art and in accordance with the particular condition of the subject.

Дозируемое количество и интервал дозирования можно регулировать индивидуально для обеспечения уровней активного остатка в плазме, которые будут достаточными для достижения желаемых эффектов, например, для регулирования метаболизма жира, снижения веса тела, уменьшения накопления жира и т.д., т.е. для создания минимальной эффективной концентрации (МЕС). Величина МЕС будет изменяться для каждого соединения, но ее можно рассчитать, используя, например, данные in vitro и данные экспериментов на животных. Дозирующие количества, необходимые для достижения МЕС, будут зависеть от индивидуальных характеристик и путей введения препаратов. В случаях местного введения или селективного поглощения, эффективная местная концентрация лекарственного препарата может быть не связана с концентрацией его в плазме.The dosage amount and dosage interval can be individually adjusted to provide plasma levels of active residue that are sufficient to achieve the desired effects, for example, to regulate fat metabolism, reduce body weight, reduce fat accumulation, etc., i.e. to create a minimum effective concentration (MES). The MEC value will vary for each compound, but it can be calculated using, for example, in vitro data and animal experiment data. The dosage amounts necessary to achieve MES will depend on the individual characteristics and route of administration of the drugs. In cases of local administration or selective absorption, the effective local concentration of the drug may not be related to its plasma concentration.

Вводимое количество агента или композиции может зависеть от множества факторов, включающих пол, возраст и вес субъекта, который подвергается лечению, серьезность поражения болезнью, способ введения и заключение лечащего врача.The amount of agent or composition administered may depend on many factors, including the sex, age and weight of the subject being treated, the severity of the disease, the route of administration and the opinion of the attending physician.

Композиции настоящего изобретения, если желательно, можно содержать в упаковке или в раздаточном устройстве, которое имеет в своем составе одну или большее количество форм стандартного дозирования активного ингредиента. В такой упаковке или раздаточном устройстве, могут, например, использовать металлическую или пластиковую фольгу, такую, как в облатке, или стеклянные и каучуковые пробки, такие как в пузырьках. К упаковкам или раздаточным устройствам можно прикладывать инструкции по введению лекарственных препаратов. Можно также приготовить композиции, содержащие соединение настоящего изобретения, рецептированное вместе с фармацевтически приемлемым носителем, и поместить их в соответствующий контейнер с наклейкой, содержащей предписание для лечения медицински показанного состояния.The compositions of the present invention, if desired, can be contained in a package or in a dispenser that incorporates one or more unit dosage forms of the active ingredient. In such a package or dispenser, for example, metal or plastic foil, such as in a wafer, or glass and rubber caps, such as in vials, may be used. Packages or dispensers may include instructions for administering drugs. You can also prepare compositions containing the compound of the present invention, formulated with a pharmaceutically acceptable carrier, and place them in an appropriate container with a sticker containing a prescription for the treatment of a medically indicated condition.

Соединения и способы их скринингаCompounds and methods for screening them

Соединение настоящего изобретения представляет собой соединение, которое ингибирует активность гидроксилазы, где конкретно активность гидроксилазы является активностью фермента 2-оксоглутарат-диоксигеназы. Более предпочтительно, активность гидроксилазы является активностью фермента HIF гидроксилазы. И наиболее предпочтительно, активность гидроксилазы является активностью фермента HIF пролилгидроксилазы.The compound of the present invention is a compound that inhibits the activity of hydroxylase, where specifically the activity of hydroxylase is the activity of the enzyme 2-oxoglutarate-dioxygenase. More preferably, the hydroxylase activity is the activity of the HIF hydroxylase enzyme. And most preferably, the activity of hydroxylase is the activity of the enzyme HIF prolyl hydroxylase.

Способ настоящего изобретения представляет собой спосо6, который зависит от стабилизации HIFα для достижения конкретного результата у субъекта. Предпочтительно, способы настоящего изобретения осуществляют путем введения соединения настоящего изобретения для стабилизации HIFα и для достижения конкретного результата у субъекта. Более предпочтительно, способы настоящего изобретения осуществляют путем введения соединения настоящего изобретения.The method of the present invention is method 6, which depends on the stabilization of HIFα to achieve a specific result in a subject. Preferably, the methods of the present invention are carried out by administering a compound of the present invention to stabilize HIFα and to achieve a specific result in a subject. More preferably, the methods of the present invention are carried out by administering a compound of the present invention.

Соединения настоящего изобретения приводятся в виде примеров для использования в способах настоящего изобретения, которые относятся к стабилизации HIFα. В частности, в настоящем изобретении представлены соединения и способы для скрининга и идентификации дополнительных соединений, которые ингибируют HIF гидроксилазную активность и/или HIFα гидроксилирование, стабилизацию HIFα и т.д. Соединения настоящего изобретения включают такие соединения, которые ингибируют гидроксилазную активность, предпочтительно такую гидроксилазную активность, которая представляет собой активность фермента 2-оксоглутарат-диоксигеназы и, более предпочтительно, такую гидроксилазную активность, которая представляет собой активность HIF гидроксилазы. HIF гидроксилаза может гидроксилировать любую аминокислоту, включая, например, остаток пролина или остаток аспаргина, и.т.д., в HIF белке, предпочтительно, в субъединице HIFα. В особенно предпочтительном варианте настоящего изобретения, гидроксилазная активность представляет собой активность HIF пролилгидроксилазы и/или HIF аспарагинилгидроксилазы.The compounds of the present invention are provided as examples for use in the methods of the present invention that relate to the stabilization of HIFα. In particular, the present invention provides compounds and methods for screening and identifying additional compounds that inhibit HIF hydroxylase activity and / or HIFα hydroxylation, stabilization of HIFα, etc. The compounds of the present invention include those compounds that inhibit hydroxylase activity, preferably such hydroxylase activity as the activity of the 2-oxoglutarate dioxygenase enzyme and, more preferably, such hydroxylase activity as the HIF hydroxylase activity. HIF hydroxylase can hydroxylate any amino acid, including, for example, a proline residue or an aspargin residue, etc., in a HIF protein, preferably in a HIFα subunit. In a particularly preferred embodiment of the present invention, the hydroxylase activity is the activity of HIF prolyl hydroxylase and / or HIF of asparaginyl hydroxylase.

Ингибиторы активности 2-оксоглутарат-диоксигеназы известны в данной области. Например, были идентифицированы несколько низкомолекулярных ингибиторов проколлаген-пролил-4-гидроксилазы. (Смотри, например, Majamaa и соав. (1984) Eur J Biochem 138:239-245; Majamaa и соав. (1985) Biochem J 229:127-133; Kivirikko и Myllyharju (1998) Matrix Biol 16:357-368; Bickel и соав. (1998) Hepatology 28:404-411; Friedman и соав. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97:4736-4741 и Franklin и соав. (2001) Biochem J 353:333-338; все введенные здесь в виде ссылки во всей полноте.). Были также идентифицированы низкомолекулярные ингибиторы HIF гидроксилаз. (Смотри, например, международные публикации WO 02/074981, WO 03/049686 и WO 03/080566, все введенные здесь в виде ссылки во всей полноте.) В настоящем изобретении конкретно представлено использование этих и других соединений, которые можно идентифицировать, используя способы, известные в данной области.Inhibitors of 2-oxoglutarate-dioxygenase activity are known in the art. For example, several low molecular weight procollagen-prolyl-4-hydroxylase inhibitors have been identified. (See, for example, Majamaa et al. (1984) Eur J Biochem 138: 239-245; Majamaa et al. (1985) Biochem J 229: 127-133; Kivirikko and Myllyharju (1998) Matrix Biol 16: 357-368; Bickel et al. (1998) Hepatology 28: 404-411; Friedman et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97: 4736-4741 and Franklin et al. (2001) Biochem J 353: 333-338; all entered here by reference in its entirety.). Low molecular weight HIF hydroxylase inhibitors have also been identified. (See, for example, international publications WO 02/074981, WO 03/049686 and WO 03/080566, all incorporated herein by reference in their entirety.) The present invention specifically provides the use of these and other compounds that can be identified using methods known in the art.

Для всех ферментов в семействе 2-оксоглутарат-диоксигеназы требуются кислород, соединения Fe²⁺, 2-оксоглутарат и аскорбиновая кислота для их гидроксилазной активности. (Смотри, например, Majamaa и соав. (1985) Biochem J 229:127-133; Myllyharju и Kivirikko (1997) EMBO J 16:1173-1180; Thornburg и соав. (1993) 32:14023-14033 и Jia и соав. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:7227-7231.) Поэтому, соединения настоящего изобретения включают, но не ограничиваются ими, соединения, хелатирующие железо, миметики 2-оксаглутарата и модифицированные аминокислоты, например, пролиновые или аспарагиновые аналоги.All enzymes in the 2-oxoglutarate-dioxygenase family require oxygen, Fe ²⁺ compounds, 2-oxoglutarate and ascorbic acid for their hydroxylase activity. (See, for example, Majamaa et al. (1985) Biochem J 229: 127-133; Myllyharju and Kivirikko (1997) EMBO J 16: 1173-1180; Thornburg et al. (1993) 32: 14023-14033 and Jia et al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 7227-7231.) Therefore, the compounds of the present invention include, but are not limited to, iron chelating compounds, 2-oxaglutarate mimetics, and modified amino acids, for example, proline or aspartic analogs.

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения представлено использование структурных миметиков 2-оксоглутарата. Такие соединения могут ингибировать фермент 2-оксоглутарат-диоксигеназы, выступающий в качестве мишени, конкурентно по отношению к 2-оксоглутарату и неконкурентно по отношению к железу. (Majamaa и соавт. (1984) см. выше и Majamaa и соавт. (1985) см. выше). Конкретно рассматриваются описанные соединения, например у Majamaa и соавт. см. выше; Kivirikko и Myllyharju (1998) Matrix Biol 16:357-368; Bickel и соав. (1998) Hepatology 28:404-411; Friedman и соав. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97:4736-4741; Franklin (1991) Biochem Soc Trans 19:812-815; Franklin и соав. (2001) Biochem J 353:333-338 и международная публикация за номером WO 03/049686, все введенные здесь в виде ссылки во всей их полноте.In specific embodiments, the implementation of the present invention provides the use of structural mimetics of 2-oxoglutarate. Such compounds can inhibit the 2-oxoglutarate-dioxygenase enzyme acting as a target competitively with 2-oxoglutarate and non-competitively with iron. (Majamaa et al. (1984) see above and Majamaa et al. (1985) see above). The compounds described are specifically considered, for example by Majamaa et al. see above; Kivirikko and Myllyharju (1998) Matrix Biol 16: 357-368; Bickel et al. (1998) Hepatology 28: 404-411; Friedman et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97: 4736-4741; Franklin (1991) Biochem Soc Trans 19: 812-815; Franklin et al. (2001) Biochem J 353: 333-338 and international publication number WO 03/049686, all incorporated herein by reference in their entirety.

Примеры соединений включают фенантролины, включающие, но не ограничивающиеся ими, такие соединения, которые описаны в Патентах США 5916898 и 6200974 и международной публикации WO 99/21860; гетероциклические карбонилглицины, включающие, но не ограничивающиеся ими, замещенные хинолин-2-карбоксамиды и их эфиры, которые описаны, например, в Патентах США 5719164 и 5726305; замещенные изохинолин-3-карбоксамиды и их эфиры, которые описаны, например, в Патенте США 6093730; 3-метоксипиридин карбонилглицины и их эфиры, которые описаны, например, в Европейской патентной заявке ЕР 0650961 и патенте США 5658933; 3-гидроксипиридин карбонилглицины и их эфиры, которые описаны, например, в патентах США 5620995 и 6020350; 5-сульфонамидокарбонил пиридинкарбоксилаты и их эфиры, которые описаны, например, в патентах США 5607954, 5610172 и 5620996. Все соединения, приведенные в этих патентах, в частности, все те соединения, которые приведены в пунктах Формулы изобретения, касающихся соединений, и в конечных продуктах рабочих примеров, вводятся в настоящую заявку в виде ссылки.Examples of compounds include phenanthroline, including, but not limited to, such compounds as are described in US Patents 5916898 and 6200974 and international publication WO 99/21860; heterocyclic carbonylglycines, including, but not limited to, substituted quinoline-2-carboxamides and their esters, which are described, for example, in US Patents 5719164 and 5726305; substituted isoquinoline-3-carboxamides and their esters, as described, for example, in US Pat. No. 6,093,730; 3-methoxypyridine carbonylglycines and their esters, which are described, for example, in European patent application EP 0650961 and US patent 5658933; 3-hydroxypyridine carbonylglycines and their esters, which are described, for example, in US patents 5620995 and 6020350; 5-sulfonamidocarbonyl pyridinecarboxylates and their esters, which are described, for example, in US patents 5607954, 5610172 and 5620996. All compounds described in these patents, in particular, all those compounds that are given in the claims regarding the compounds and in the final the products of working examples are incorporated into this application by reference.

Поэтому, предпочтительные соединения настоящего изобретения включают, например, гетероциклические карбоксамиды. Конкретно, предпочтительные гетероциклические карбоксамиды включают, например, изохинолины, хинолины, пиридины, циннолины, карболины и т.д. Кроме того, структурные классы предпочтительных соединений включают антрахиноны, азафлуорены, азафенантролины, бензимидазолы, бензофураны, бензопираны, бензотиофены, катехолы, хроманоны, α-дикетоны, фураны, N-гидроксамиды, N-гидроксимочевины, имидазолы, индазолы, индолы, изотиадиазолы, изотиазолы, изоксадиазолы, изоксазолы, α-кето-кислоты, α-кето-амиды, α-кето-эфиры, α-кето-имины, оксадиазолы, оксалиламиды, оксазолы, оксазолины, пурины, пираны, пиразины, пиразолы, пиразолины, пиридазины, пиридины, хиназолины, фенантролины, тетразолы, тиадиазолы, тиазолы, тиазолины, тиофены и триазолы.Therefore, preferred compounds of the present invention include, for example, heterocyclic carboxamides. Specifically, preferred heterocyclic carboxamides include, for example, isoquinolines, quinolines, pyridines, cinnolines, carbolines, etc. In addition, structural classes of preferred compounds include anthraquinones, azafluorenes, azaphenanthroline, benzimidazoles, benzofurans, benzopyranes, benzothiophenes, catechols, chromanones, α-diketones, furans, N-hydroxamides, N-hydroxyureas, imidazoles, indazoles, indoles, isotopes, isoxadiazoles, isoxazoles, α-keto acids, α-keto amides, α-keto esters, α-keto-imines, oxadiazoles, oxalamides, oxazoles, oxazolines, purines, pyranes, pyrazines, pyrazoles, pyrazolines, pyridazines, pyridines, quinazolines, phenanthrolins, tetrazoles, thiadiazo s, thiazoles, thiazolines, thiophene and triazole.

Для демонстрации способов настоящего изобретения, описанных здесь, в качестве примеров используют соединения:[(7-Хлор-3-гидрокси-хинолин-2-карбонил)-амино]-уксусную кислоту (соединение А), [(1-Хлор-4-гидрокси-изохинолин-3-карбонил)-амино]-уксусную кислоту (соединение В), [(4-Гидрокси-7-фенокси-изохинолин-3-карбонил)-амино]-уксусную кислоту (соединение С), 4-Оксо-1,4-дигидро-[1,10]фенантролин-3-карбоновую кислоту (соединение D), [1-Хлор-4-гидрокси-7-метокси-изохинолин-3-карбонил)-амино]-уксусную кислоту (соединение Е), [(3-Гидрокси-6-изопропокси-хинолин-2-карбонил)амино]-уксусную кислоту (соединение F), [(3-Гидрокси-пиридин-2-карбонил)-амино]-уксусную кислоту (соединение G) и Метиловый эфир [(7-бензилокси-1-хлор-4-гидрокси-изохинолин-3-карбонил)-амино]-уксусной кислоты (соединение Н).To demonstrate the methods of the present invention described herein, the following compounds are used as examples: [(7-Chloro-3-hydroxy-quinoline-2-carbonyl) amino] -acetic acid (compound A), [(1-Chloro-4- hydroxy-isoquinoline-3-carbonyl) amino] -acetic acid (compound B), [(4-Hydroxy-7-phenoxy-isoquinoline-3-carbonyl) amino] -acetic acid (compound C), 4-oxo 1,4-dihydro- [1,10] phenanthroline-3-carboxylic acid (compound D), [1-Chloro-4-hydroxy-7-methoxy-isoquinoline-3-carbonyl) amino] -acetic acid (compound E ), [(3-Hydroxy-6-isopropoxy-quinoline-2-carbonyl) mino] -acetic acid (compound F), [(3-Hydroxy-pyridin-2-carbonyl) amino] -acetic acid (compound G) and methyl ether [(7-benzyloxy-1-chloro-4-hydroxy-isoquinoline -3-carbonyl) amino] acetic acid (compound H).

Для идентификации соединений настоящего изобретения, т.е. соединений, которые ингибируют гидроксилазную активность, можно использовать различные методы анализа и способы скрининга, включая те, которые описаны ниже. Эти соединения являются пригодными для использования в способах настоящего изобретения. Кроме того, соединения, пригодные для использования в способах настоящего изобретения, т.е. соединения, которые стабилизируют субъединицу HIFα, могут идентифицировать специалисты в данной области, используя доступную методологию анализа и скрининга.To identify the compounds of the present invention, i.e. For compounds that inhibit hydroxylase activity, various assay methods and screening methods can be used, including those described below. These compounds are suitable for use in the methods of the present invention. In addition, compounds suitable for use in the methods of the present invention, i.e. Compounds that stabilize the HIFα subunit can be identified by those skilled in the art using the available assay and screening methodology.

Для обнаруживаемых сигналов, связанных с расходом реакционного субстрата или образованием продукта реакции, обычно будет предусматриваться анализ. Продукты обнаружения могут включать, например, флуоресцентные метки, радиоактивные изотопы, конъюгаты фермента и другие обнаруживаемые метки, хорошо известные в данной области. Могут быть получены количественные или качественные результаты. Выделение продукта реакции можно облегчить за счет использования метки, такой как биотиновая или гистидиновая метка, которая позволяет очищать продукт от других компонентов реакции путем осаждения или афинной хроматографии.For detectable signals associated with the consumption of the reaction substrate or the formation of the reaction product, analysis will usually be provided. Detection products may include, for example, fluorescence tags, radioactive isotopes, enzyme conjugates, and other detectable tags well known in the art. Quantitative or qualitative results can be obtained. Isolation of the reaction product can be facilitated by the use of a label, such as a biotin or histidine label, which allows purification of the product from other components of the reaction by precipitation or affinity chromatography.

Анализы на гидроксилазную активность являются стандартными в данной области. Такие анализы могут непосредственно или косвенно определять гидроксилазную активность. Например, анализ может определять содержание гидроксилированных остатков, например, пролина, аспарагина и т.д., присутствие в ферментном субстрате, например, белка, выступающего в качестве мишени, синтетического пептидного миметика, или его фрагмента (См., например, Palmerini и соавт. (1985) J Chromatogr 339:285-292). Уменьшение содержания гидроксилированного остатка, например, пролина или аспарагина, в присутствии соединения настоящего изобретения является показателем того, что указанное соединение ингибирует гидроксилазную активность. Альтернативно, анализы могут оценивать другие продукты реакции гидроксилирования, например, образование сукцината из 2-оксоглутарата (См., например, Cunliffe и соав. (1986) Biochem J 240:617-619) Kaule и Gunzler (1990; Anal Biochem 184:291-297) описывают в качестве примера процедуру, с помощью которой оценивают образование сукцината из 2-оксоглутарата.Assays for hydroxylase activity are standard in the art. Such assays can directly or indirectly determine hydroxylase activity. For example, the analysis can determine the content of hydroxylated residues, for example, proline, asparagine, etc., the presence in the enzyme substrate, for example, of a protein acting as a target, a synthetic peptide mimetic, or its fragment (See, for example, Palmerini et al. . (1985) J Chromatogr 339: 285-292). A decrease in the content of a hydroxylated residue, for example, proline or asparagine, in the presence of a compound of the present invention is an indication that said compound inhibits hydroxylase activity. Alternatively, assays may evaluate other hydroxylation reaction products, for example, succinate formation from 2-oxoglutarate (See, e.g., Cunliffe et al. (1986) Biochem J 240: 617-619) Kaule and Gunzler (1990; Anal Biochem 184: 291 -297) describe by way of example a procedure by which the formation of succinate from 2-oxoglutarate is evaluated.

Процедуры, подобные описанным выше, можно использовать для идентификации соединений, которые модулируют HIF гидроксилазную активность. Пример такой процедуры описывают в Примере 8 (приведенном ниже). Белок, выступающий в качестве мишени, может включать HIFα или ее фрагмент, например, HIF (556-575); например, субстрат, который выступает в качестве примера для использования в анализе, описанном в Примере 9, представляет собой DLDLEMLAPYIPMDDDFQL (SEQ ID NO:1). Фермент может включать, например, HIF пролилгидроксилазу (см., например, поступление в Генбанк за номером AAG33965 и т.д.) или HIF аспарагинилгидроксилазу (см., например, Genbank, регистрационный № AAL27308 и т.д.), полученные из любого источника. Фермент может также присутствовать в неочищенном клеточном лизате или в частично очищенной форме. Например, процедуры, с помощью которых измеряют HIF гидроксилазную активность, непосредственно описаны у Ivan и соавт. (2001, Science 292:464-468 и 2002, Proc Natl Acad Sci USA 99:13459-13464) и Hirsila и соав. (2003, J Biol Chem 278:30772-30780); дополнительные способы описаны в Международной заявке WO 03/049686. Измерение и сравнение активности фермента в отсутствие и в присутствии соединения настоящего изобретения будут идентифицировать соединения, которые ингибируют гидроксилирование HIFα.Procedures similar to those described above can be used to identify compounds that modulate HIF hydroxylase activity. An example of such a procedure is described in Example 8 (below). A protein acting as a target may include HIFα or a fragment thereof, for example, HIF (556-575); for example, the substrate, which serves as an example for use in the analysis described in Example 9, is DLDLEMLAPYIPMDDDFQL (SEQ ID NO: 1). The enzyme may include, for example, HIF prolyl hydroxylase (see, for example, admission to Genbank under the number AAG33965, etc.) or HIF asparaginyl hydroxylase (see, for example, Genbank, registration number AAL27308, etc.) obtained from any source. The enzyme may also be present in a crude cell lysate or in a partially purified form. For example, the procedures by which HIF hydroxylase activity is measured are directly described by Ivan et al. (2001, Science 292: 464-468 and 2002, Proc Natl Acad Sci USA 99: 13459-13464) and Hirsila et al. (2003, J Biol Chem 278: 30772-30780); additional methods are described in International application WO 03/049686. Measurement and comparison of enzyme activity in the absence and in the presence of a compound of the present invention will identify compounds that inhibit HIFα hydroxylation.

Анализы стабилизации HIFα и/или HIF активации могут включать прямое измерение HIFα в образце (Смотри, например, Пример 8, ниже), косвенное измерение HIFα, например, с помощью измерения уменьшения содержания HIFα, связанного с белком Hippel Lindau (смотри, например. Международную заявку WO 00/69908), или активацию HIF ответных генов, выступающих в качестве мишени или конструктов репортеров (см., например, патент США 5942434). Измерение и сравнение уровней HIF и/или HIF ответных белков, выступающих в качестве мишени, в отсутствие и в присутствии соединения настоящего изобретения будет идентифицировать соединения, которые стабилизируют HIFα и/или активируют HIF.Assays for stabilizing HIFα and / or HIF activation may include direct measurement of HIFα in the sample (see, for example, Example 8 below), indirect measurement of HIFα, for example, by measuring the decrease in HIFα associated with the Hippel Lindau protein (see, for example. International WO 00/69908), or the activation of HIF response genes acting as targets or constructs of reporters (see, for example, US patent 5942434). Measuring and comparing the levels of HIF and / or HIF of target proteins in the absence and presence of a compound of the present invention will identify compounds that stabilize HIFα and / or activate HIF.

Представления об этих и других вариантах осуществления настоящего изобретения будут легко возникать у специалистов в данной области, имея в виду приведенное здесь описание.Understanding of these and other embodiments of the present invention will readily come to those skilled in the art, bearing in mind the description herein.

ПримерыExamples

Далее изобретение будет рассматриваться со ссылкой на следующие примеры, которые представляют собой лишь характерные образцы изобретения. Эти примеры приводятся единственно для иллюстрации заявленного изобретения. Настоящее изобретение не ограничивается в объеме вариантами, приведенными в качестве примеров, которые предназначаются в качестве иллюстраций лишь единичных аспектов изобретения. Любые способы, которые являются функционально эквивалентными, находятся в пределах объема изобретения. Различные модификации изобретения в дополнение к модификациям, описанным здесь, будут очевидны специалистам в данной области на основе вышеприведенного описания и сопровождающих чертежей. Предполагается, что такие модификации находятся в пределах объема прилагаемой Формулы изобретения.Further, the invention will be considered with reference to the following examples, which are only representative examples of the invention. These examples are provided solely to illustrate the claimed invention. The present invention is not limited in scope by the options given as examples, which are intended to illustrate only a few aspects of the invention. Any methods that are functionally equivalent are within the scope of the invention. Various modifications of the invention in addition to the modifications described herein will be apparent to those skilled in the art based on the above description and the accompanying drawings. Such modifications are intended to be within the scope of the appended claims.

Пример 1: Материалы для тестаExample 1: Test Materials

В основном, соединения настоящего изобретения синтезировали с помощью стандартных химических методов, известных специалистам в данной области. Соединения подвергали анализу на чистоту с помощью жидкостной хроматографии высокого давления и хранили при комнатной температуре защищенными от света. В процессе разработки рецептуры для различных применений, соединения подвергали микронизации в суспензии при скорости либо 500 об/мин в течение 25 минут, либо при скорости 750 об/мин в течение 10 минут, используя планетарную микромельницу PULVERISETTE 7 (Fritsch GMBH, Germany) для создания частиц однородного размера.Basically, the compounds of the present invention were synthesized using standard chemical methods known to those skilled in the art. Compounds were subjected to purity analysis using high pressure liquid chromatography and stored at room temperature, protected from light. During formulation development for various applications, the compounds were micronized in suspension at either 500 rpm for 25 minutes or 750 rpm for 10 minutes using the PULVERISETTE 7 planetary micromill (Fritsch GMBH, Germany) to create particles of uniform size.

Суспензии микронизованного соединения для орального введения через желудочный зонд готовили непосредственно перед использованием. Соединение суспендировали в водном растворе, содержащем 0,5% натрий карбоксиметилцеллюлозы (CMC; Spectrum Chemical, Gardena CA), 0,1% полисорбата 80 (Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg NJ), и постоянно перемешивали, используя магнитную мешалку или ротационный шейкер, во время введения дозы. Концентрацию суспензий рассчитывали для достижения намеченного уровня дозы в данном объеме. В альтернативных процедурах, соединение взвешивали и помещали в желатиновые капсулы с соответствующим размером для орального введения, в то время как контрольные животные получали пустые капсулы такого же размера; или же соединение растворяли в 100 мМ растворе гистидина (Mallinckrodt Baker) и давали по желанию (ad libikum) вместо воды.Suspensions of a micronized compound for oral administration through a gastric tube were prepared immediately before use. The compound was suspended in an aqueous solution containing 0.5% sodium carboxymethyl cellulose (CMC; Spectrum Chemical, Gardena CA), 0.1% polysorbate 80 (Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg NJ), and was constantly stirred using a magnetic stirrer or rotary shaker during dose administration. The concentration of suspensions was calculated to achieve the intended dose level in this volume. In alternative procedures, the compound was weighed and placed in appropriate size gelatin capsules for oral administration, while control animals received empty capsules of the same size; or the compound was dissolved in a 100 mM histidine solution (Mallinckrodt Baker) and given as desired (ad libikum) instead of water.

Для введения путем инъекции, соединение вначале смешивали с эквимолярным количеством гидроксида натрия, или в водном растворе 10% глюкозы (Spectrum) или в растворе 25 мМ гистидина вместе с хлоридом натрия для получения изотонического раствора (Mallinckrodt Baker).For administration by injection, the compound was first mixed with an equimolar amount of sodium hydroxide, either in an aqueous solution of 10% glucose (Spectrum) or in a solution of 25 mM histidine together with sodium chloride to obtain an isotonic solution (Mallinckrodt Baker).

Пример 2: Повышенная экспрессия лептина in vitro в выбранных типах клетокExample 2: Increased in vitro expression of leptin in selected cell types

Влияние способов и соединений изобретения на регулирование содержания жира и, конкретно, на экспрессию факторов, связанных с метаболизмом жира и чувством насыщения, исследовали следующим образом. Клетки HeLa (эпителиальной карциномы шейки матки) человека, 293 А (эпителия фетальной почки, трансформированного аденовирусом; Qbiogene, Carlsbad CA), НерЗВ (гепатоцеллюлярной карциномы), HFF (фибробласта крайней плоти), НМЕС-1 (микрососудистые эндотелиальные клетки), HUVEC (эндотелиальные клетки пупочной вены) и клетки адипоцита раздельно высевали в 24-луночные чашки для культур из расчета 100000 клеток на чашку и выращивали в течение одного дня при 37°С, в атмосфере 20% O₂, 5% СО₂ в следующей среде: клетки HeLa, 293A и НерЗВ в DMEM, содержащем 1% FBS и 1% пеницилин-стрептомицина; НМЕС-1 и HUVEC в среде для эндотелиального роста (EGM-2; Cambrex, Walkersville MD), клетки HFF в DMEM, содержащем 10% FBS и 1% пеницилин-стрептомицина, и клетки адипоцита в среде Adipocyte (Zen-Bio, Research Triangle Park NC). Среду затем заменяли свежей средой, подобной вышеописанной, за исключением того, что уровни содержания сыворотки в культурах HeLa, 293A, НерЗВ и HFF снижали до 0,5% FBS. В клетки добавляли наполнитель (0,5% DMSO) в качестве контрольного соединения, а также соединение В, и клетки инкубировали в течение дополнительных 3 дней. Затем собирали бесклеточные надосадочные жидкости и подсчитывали уровни содержания лептина, используя иммуноанализ QUATNTTKINE (R&D Systems, Inc., Minneapolis MN) согласно предписаниям производителя.The influence of the methods and compounds of the invention on the regulation of fat content and, specifically, on the expression of factors associated with fat metabolism and a feeling of fullness, was investigated as follows. Human HeLa (cervical epithelial carcinoma) cells, 293 A (epithelium of a fetal kidney transformed by adenovirus; Qbiogene, Carlsbad CA), HEPZV (hepatocellular carcinoma), HFF (foreskin fibroblast), HMES-1 (microvascular, endothelial cells) umbilical vein endothelial cells) and adipocyte cells were separately plated in 24-well culture dishes at the rate of 100,000 cells per dish and grown for one day at 37 ° C, in an atmosphere of 20% O ₂ , 5% CO ₂ in the following medium: cells HeLa, 293A and Nerzv in DMEM containing 1% FBS and 1% penicillin-streptomycin ; HMEC-1 and HUVEC in endothelial growth medium (EGM-2; Cambrex, Walkersville MD), HFF cells in DMEM containing 10% FBS and 1% penicillin-streptomycin, and adipocyte cells in Adipocyte medium (Zen-Bio, Research Triangle Park NC). The medium was then replaced with fresh medium similar to the one described above, except that the serum levels in HeLa, 293A, HepB and HFF cultures were reduced to 0.5% FBS. Filler (0.5% DMSO) was added to the cells as a control compound, as well as Compound B, and the cells were incubated for an additional 3 days. Cell-free supernatants were then collected and leptin levels were calculated using the QUATNTTKINE immunoassay (R&D Systems, Inc., Minneapolis MN) according to the manufacturer's instructions.

Как показано на Фиг.1А, повышенную экспрессию лептина наблюдали в адипоцитах, но не в других типах клеток, после обработки соединением настоящего изобретения.As shown in FIG. 1A, increased leptin expression was observed in adipocytes, but not in other types of cells, after treatment with the compound of the present invention.

В отдельном эксперименте, преадипоциты помещали в 24-луночные планшеты, из расчета 45000 клеток на лунку, и выращивали в течение 3 дней в преадипоцитной среде (Zen-Bio). Среду затем изменяли на дифференциационную среду (Zen-Bio) и клетки обрабатывали либо наполнителем, в качестве контрольного соединения (0,5% DMSO), либо соединением В в количестве 25 или 50 мкМ вплоть до 12 дней. Половину культуральной среды заменяли каждые 3 дня, а надосадочные жидкости культур, не содержащие клеток, генерировали и анализировали для определения уровней содержания секреции лептина, используя иммуноанализ QUANTIKINE (R&D System) согласно предписаниям производителя.In a separate experiment, preadipocytes were placed in 24-well plates, at the rate of 45,000 cells per well, and grown for 3 days in a pre-adipocyte medium (Zen-Bio). The medium was then changed to a differentiation medium (Zen-Bio) and the cells were treated either with vehicle, as a control compound (0.5% DMSO), or with compound B in an amount of 25 or 50 μM for up to 12 days. Half of the culture medium was replaced every 3 days, and cell-free culture supernatants were generated and analyzed to determine leptin secretion levels using the QUANTIKINE immunoassay (R&D System) according to the manufacturer's instructions.

Как показано на Фиг.1В, обработка преадипоцитов соединением В продуцировала зависимое от дозы увеличение секреции лептина по сравнению с клетками, обработанными контрольным наполнителем, и уровни содержания лептина продолжали повышаться в течение всего 12-дневного периода.As shown in FIG. 1B, treatment of preadipocytes with compound B produced a dose-dependent increase in leptin secretion compared to cells treated with control vehicle, and leptin levels continued to increase over the entire 12-day period.

В аналогичном эксперименте, адипоциты высевали в 24-луночные планшеты, из расчета 100000 клеток на лунку, в адипоцитной среде (Zen-Bio) и обрабатывали либо наполнителем, в качестве контрольного соединения, соединением А, соединением Е, либо соединением F в количестве 25 мкМ, либо соединением В в количестве 25 или 50 мкМ. Половину культуральной среды заменяли каждые 3 дня, а надосадочные жидкости культур, не содержащие клеток, генерировали и анализировали для определения уровней содержания секреции лептина, используя иммуноанализ QUANTIKINE (R&D System) согласно предписаниям производителя.In a similar experiment, adipocytes were plated in 24-well plates, at a rate of 100,000 cells per well, in an adipocyte medium (Zen-Bio) and treated either with vehicle, as a control compound, compound A, compound E, or compound F in an amount of 25 μM or compound B in an amount of 25 or 50 μM. Half of the culture medium was replaced every 3 days, and cell-free culture supernatants were generated and analyzed to determine leptin secretion levels using the QUANTIKINE immunoassay (R&D System) according to the manufacturer's instructions.

Как показано на Фиг.1C, обработка адипоцитов соединениями изобретения продуцировала увеличение секреции лептина по сравнению с клетками, обработанными контрольным наполнителем, и уровни содержания лептина продолжали повышаться в течение всего 12-дневного периода.As shown in FIG. 1C, adipocyte treatment with the compounds of the invention produced an increase in leptin secretion compared to cells treated with control vehicle, and leptin levels continued to increase over the entire 12-day period.

Лептин представляет собой регуляторный фактор, принимающий участие в регулировании и метаболизме жира - транспорте, накоплении, процессинге, утилизации и т.д. - и в подавлении аппетита и т.д. Способность соединений и способов настоящего изобретения регулировать экспрессию лептина дает основание использовать соединения и способы изобретения для регулирования метаболизма жира и, применительно к конкретным субъектам, для уменьшения или профилактики увеличения веса, или даже для индуцирования потери веса.Leptin is a regulatory factor that takes part in the regulation and metabolism of fat - transport, accumulation, processing, utilization, etc. - and in suppressing appetite, etc. The ability of the compounds and methods of the present invention to regulate the expression of leptin gives reason to use the compounds and methods of the invention to regulate fat metabolism and, in relation to specific subjects, to reduce or prevent weight gain, or even to induce weight loss.

Пример 3: Повышенная экспрессия факторов, принимающих участие в регулировании содержания жираExample 3: Increased expression of factors involved in the regulation of fat content

Способность соединений и способов настоящего изобретения регулировать метаболизм жира, в частности, повышать экспрессию факторов, принимающих участие в транспорте, утилизации и накоплении жира, анализировали следующим образом. Для установления характера индукции гена с течением времени, от фирмы Simonsen, Inc. были получены двадцать четыре самца мышей Swiss Webster (весом 30-32 грамма) и подвергнуты оральному кормлению через желудочный зонд раствором из расчета 4 мл/кг либо 0,5% раствором карбоксиметилцеллюлозы (CMC; Sigma-Aldrich, St. Louis МО) (0 мг/кг), либо 1,25% раствором соединения В (25 мг/мл в 0,5% CMC) (100 мг/кг). На 4, 8, 16, 24, 48 или 72 часы после конечной дозы, животных анестезировали изофлураном. Мышей затем умерщвляли и образцы ткани почки, печени, мозга, легкого и сердца выделяли и хранили в растворе RNALATER (Ambion) при температуре -80°С.The ability of the compounds and methods of the present invention to regulate fat metabolism, in particular, to increase the expression of factors involved in the transport, utilization and accumulation of fat, was analyzed as follows. To establish the nature of gene induction over time, from Simonsen, Inc. Twenty-four male Swiss Webster mice (weighing 30-32 grams) were obtained and were orally fed through a gastric tube with a solution of 4 ml / kg or 0.5% carboxymethyl cellulose solution (CMC; Sigma-Aldrich, St. Louis MO) (0 mg / kg), or a 1.25% solution of compound B (25 mg / ml in 0.5% CMC) (100 mg / kg). At 4, 8, 16, 24, 48, or 72 hours after the final dose, animals were anesthetized with isoflurane. The mice were then sacrificed and tissue samples from the kidney, liver, brain, lung, and heart were isolated and stored in RNALATER (Ambion) solution at a temperature of -80 ° C.

Выделение РНК проводили, используя следующий протокол. Часть каждого органа, соответствующую 50 мг, нарезали в форме кубиков, добавляли 875 мкл буферного раствора RLT (набор KNEASY; Qiagen Inc., Valencia CA), и кусочки гомогенизировали в течение около 20 секунд, используя ротор-статорный гомогенизатор POLYTRON (Kinematica, Inc., Cincinnati ОН). Гомогенат микроцентрифугировали в течение 3 минут для гранулирования нерастворимого материала, надосадочную жидкость переносили в новую пробирку и выделяли РНК, используя набор RNEASY (Qiagen), согласно предписаниям производителя. РНК элюировали в 80 мкл воды и подвергали количественному анализу, используя реагент RIBOGREEN (Молекулярные пробы, Eugene OR). Геномную ДНК затем удаляли из РНК, используя набор DNA-FREE (Ambion Inc., Austin TX), согласно предписаниям производителя. Оптическую плотность измеряли при 260 и 280 нм для определения чистоты и концентрации РНК.RNA isolation was performed using the following protocol. A 50 mg portion of each organ was cut into cubes, 875 μl of RLT buffer solution (KNEASY kit; Qiagen Inc., Valencia CA) was added, and the pieces were homogenized for about 20 seconds using a POLYTRON rotor-stator homogenizer (Kinematica, Inc ., Cincinnati OH). The homogenate was microcentrifuged for 3 minutes to granulate insoluble material, the supernatant was transferred to a new tube and RNA was isolated using the RNEASY kit (Qiagen) according to the manufacturer's instructions. RNA was eluted in 80 μl of water and quantified using RIBOGREEN reagent (Molecular Samples, Eugene OR). Genomic DNA was then removed from RNA using the DNA-FREE kit (Ambion Inc., Austin TX) according to the manufacturer's instructions. The optical density was measured at 260 and 280 nm to determine the purity and concentration of RNA.

Альтернативно, образцы ткани нарезали в форме кубиков и гомогенизировали в реагенте TRIZOL (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad CA), используя ротор-статорный гомогенизатор POLYTRON (Kinematica). Гомогенаты доводили до комнатной температуры, добавляли 0,2 объема хлороформа, и образцы энергично перемешивали. Смеси инкубировали при комнатной температуре в течение нескольких минут и затем центрифугировали при скорости 12000 g в течение 15 минут при 4°С. Водную фазу собирали и добавляли 0,5 объема изопропанола. Образцы перемешивали, инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут и центрифугировали в течение 10 минут при скорости 12000 g при 4°С. Надосадочную жидкость удаляли и гранулированный материал промывали раствором 75% EtOH и центрифугировали при скорости 7500 g в течение 5 мин при температуре 4°С. Геномную ДНК затем удаляли из РНК, используя набор DNA-FREE (Ambion Inc., Austin TX) согласно предписаниям производителя. Оптическую плотность измеряли при 260 и 280 нм для определения чистоты и концентрации РНК.Alternatively, tissue samples were cut into cubes and homogenized in TRIZOL reagent (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad CA) using a POLYTRON rotor-stator homogenizer (Kinematica). The homogenates were brought to room temperature, 0.2 volumes of chloroform were added, and the samples were vigorously mixed. The mixture was incubated at room temperature for several minutes and then centrifuged at a speed of 12000 g for 15 minutes at 4 ° C. The aqueous phase was collected and 0.5 volumes of isopropanol was added. The samples were mixed, incubated at room temperature for 10 minutes and centrifuged for 10 minutes at a speed of 12000 g at 4 ° C. The supernatant was removed and the granular material was washed with a solution of 75% EtOH and centrifuged at a speed of 7500 g for 5 min at 4 ° C. Genomic DNA was then removed from RNA using the DNA-FREE kit (Ambion Inc., Austin TX) according to the manufacturer's instructions. The optical density was measured at 260 and 280 nm to determine the purity and concentration of RNA.

РНК осаждали в 0,3 М растворе ацетата натрия (рН 5,2), 50 нг/мл гликогена и 2,5 объемах этанола в течение одного часа при 20°С. Образцы центрифугировали и гранулированный материал промывали холодным 80% этанолом, высушивали и повторно суспендировали в воде. Двухцепочечную кДНК синтезировали, используя первый цепочечный праймер T7-(dT)24 (Affymetrix, Inc., Santa Clara CA) и систему SUPERSCRIPT CHOICE (Invitrogen) согласно предписаниям производителя. Конечную кДНК экстрагировали равным объемом смеси 25:24:1 фенола:хлороформа:изоамилового спирта, используя инсерт PHASE LOCK GEL (Brinkman, Inc., Westbury NY). Жидкую фазу собирали и кДНК осаждали, используя 0,5 объема 7,5 М раствора ацетата аммония и 2,5 объема этанола. Альтернативно, кДНК очищали, используя модуль для очистки образцов GENECHIP (Affymetrix) согласно предписаниям производителя.RNA was precipitated in a 0.3 M solution of sodium acetate (pH 5.2), 50 ng / ml glycogen and 2.5 volumes of ethanol for one hour at 20 ° C. Samples were centrifuged and the granular material was washed with cold 80% ethanol, dried and resuspended in water. Double-stranded cDNA was synthesized using the first T7- (dT) 24 chain primer (Affymetrix, Inc., Santa Clara CA) and the SUPERSCRIPT CHOICE system (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. The final cDNA was extracted with an equal volume of a 25: 24: 1 phenol: chloroform: isoamyl alcohol mixture using PHASE LOCK GEL insert (Brinkman, Inc., Westbury NY). The liquid phase was collected and cDNA was precipitated using 0.5 volumes of a 7.5 M solution of ammonium acetate and 2.5 volumes of ethanol. Alternatively, cDNA was purified using a GENECHIP sample purification module (Affymetrix) according to the manufacturer's instructions.

Биотин-меченую кРНК синтезировали из кДНК в реакции трансляции in vitro (IVT), используя набор для мечения транскрипта BIOARRAY HIGHYIELD RNA (Enzo Diagnostics, Inc., Farmingdale NY) согласно предписаниям производителя. Конечный меченый продукт очищали и фрагментировали, используя модуль для очистки образцов GENECHIP (Affymetrix) согласно предписаниям производителя.Biotin-labeled cRNA was synthesized from cDNA in an in vitro translation reaction (IVT) using the BIOARRAY HIGHYIELD RNA transcript labeling kit (Enzo Diagnostics, Inc., Farmingdale NY) according to the manufacturer's instructions. The final labeled product was purified and fragmented using a GENECHIP sample purification module (Affymetrix) according to the manufacturer's instructions.

Гибридизационный коктейль готовили путем доведения 5 мкг зонда до 100 мкл в смеси 1 х гибридизационный буферный раствор (100 мМ MES, 1 М [Na⁺], 20 мМ EDTA, 0,01% Tween 20), 100 мкг/мл ДНК спермы сельди, 500 мкг/мл ацетилированного BSA, 0,03 нМ контрольное oligo B2 (Affymetrix), и в 1 х контрольной пробе GENECHIP на эукариотическую гибридизацию (Affymetrix). Коктейль последовательно инкубировали при 99°С в течение 5 минут и 45°С в течение 5 минут и затем центрифугировали в течение 5 минут. Массу мышиного генома U74AV2 (MG-U74Av2; Affymetrix) доводили до комнатной температуры и затем подвергали предварительной гибридизации 1 х гибридизационным буферным раствором при 45°С в течение 10 минут с вращением. Буферный раствор заменяли затем 80 мкл гибридизационного коктейля и массу подвергали гибридизации в течение 16 часов при 45°С со скоростью вращения 60 об/мин в одну и другую сторону. После гибридизации, массы промывали один раз, используя 6 х SSPE, 0,1% Tween 20 и затем промывали и окрашивали, используя R-фикоэритрин-конъюгированный стрептавидин (Молекулярные пробы, Eugene OR), биотинилированное овечье анти-стрептавидиновое антитело (Векторные лаборатории, Burlingame CA), и оборудование GENECHIP Fluidics Station 400 согласно micro_lvl протокола предписания изготовителя (Affymetrix). Массы анализировали, используя сканер GENEARRAY (Affymetrix) и программное обеспечение Microarray Suite (Affymetrix).A hybridization cocktail was prepared by bringing 5 μg of the probe to 100 μl in a mixture of 1 x hybridization buffer solution (100 mm MES, 1 M [Na ⁺ ], 20 mm EDTA, 0.01% Tween 20), 100 μg / ml herring sperm DNA, 500 μg / ml acetylated BSA, 0.03 nM control oligo B2 (Affymetrix), and 1 x GENECHIP control sample for eukaryotic hybridization (Affymetrix). The cocktail was sequentially incubated at 99 ° C for 5 minutes and 45 ° C for 5 minutes and then centrifuged for 5 minutes. The mass of the mouse U74AV2 genome (MG-U74Av2; Affymetrix) was brought to room temperature and then pre-hybridized with 1 x hybridization buffer solution at 45 ° C for 10 minutes with rotation. The buffer solution was then replaced with 80 μl of hybridization cocktail and the mass was subjected to hybridization for 16 hours at 45 ° C with a rotation speed of 60 rpm in one direction and the other. After hybridization, the stocks were washed once using 6 x SSPE, 0.1% Tween 20 and then washed and stained using R-phycoerythrin-conjugated streptavidin (Molecular Samples, Eugene OR), biotinylated sheep anti-streptavidin antibody (Vector Labs, Burlingame CA), and GENECHIP Fluidics Station 400 equipment according to the micro_lvl manufacturer's prescription protocol (Affymetrix). Masses were analyzed using a GENEARRAY scanner (Affymetrix) and Microarray Suite software (Affymetrix).

Масса мышиного генома U74AV2 (Affymetrix) представляет все последовательности (~6000) в конструкции 74 UniGene в базе данных мышей (Национальный центр биотехнологической информации, Bethesda MD), которые были функционально охарактеризованы, и, приблизительно, 6000 неаннотированных кластеров с меткой экспрессированной последовательности (EST).The U74AV2 mouse genome mass (Affymetrix) represents all sequences (~ 6000) in the 74 UniGene construct in the mouse database (National Center for Biotechnology Information, Bethesda MD) that were functionally characterized, and approximately 6,000 unannotated clusters with an expressed sequence tag (EST) )

Как показано на Фиг.2А, экспрессия генов, кодирующих белки, принимающих участие в метаболизме и транспорте жира, увеличивается в печени координированным образом после обработки соединением изобретения. Характеристики транскрипта, представленные на Фиг.2А, включают (1) аполипопротеин А-IV, (2) цитозольную ацил-СоА-тиоэстеразу-1, (3) связующий белок инсулиноподобного фактора роста (IGFBP)-1 и (4) карнитин-ацетилтрансферазу. В ходе представленного проведения испытания, уровни содержания мРНК для этих белков сначала возрастали, затем возвращались до контролируемых уровней после 24 часов. На Фиг.2В показана специфическая экспрессия во время испытания для PAI-1, который проявил аналогичную, хотя и более раннюю индукцию экспрессии после обработки соединениями настоящего изобретения.As shown in FIG. 2A, the expression of genes encoding proteins involved in the metabolism and transport of fat increases in the liver in a coordinated manner after treatment with a compound of the invention. The transcript characteristics shown in FIG. 2A include (1) apolipoprotein A-IV, (2) cytosolic acyl CoA thioesterase-1, (3) insulin-like growth factor binding protein (IGFBP) -1, and (4) carnitine acetyltransferase . During the presented test, the mRNA levels for these proteins first increased, then returned to controlled levels after 24 hours. Figure 2B shows the specific expression during the test for PAI-1, which showed a similar, albeit earlier, induction of expression after treatment with the compounds of the present invention.

Эти данные показывают, что способы и соединения настоящего изобретения регулируют метаболизм жира путем повышения экспрессии in vivo факторов, связанных с накоплением, поглощением, транспортом, синтезом, процессингом и утилизацией жира прямо (например, ApoA-IV, карнитин-тиоэстеразы, карнитин-ацетилтрансферазы, PAIs и т.д.) или косвенно (например, IGFBP-1 и т.д.). Способы и соединения настоящего изобретения можно применять терапевтически для лечения или профилактики состояний, связанных с высоким содержанием холестерина, например, атеросклероза и т.д., и ухудшенным метаболизмом жира.These data show that the methods and compounds of the present invention regulate fat metabolism by enhancing in vivo expression of factors related to the accumulation, absorption, transport, synthesis, processing and utilization of fat directly (e.g., ApoA-IV, carnitine thioesterase, carnitine acetyltransferase, PAIs, etc.) or indirectly (e.g., IGFBP-1, etc.). The methods and compounds of the present invention can be used therapeutically to treat or prevent conditions associated with high cholesterol, such as atherosclerosis, etc., and impaired fat metabolism.

Пример 4: Измененная экспрессия регуляторных факторов, принимающих участие в адипоцитной дифференциацииExample 4: Altered expression of regulatory factors involved in adipocytic differentiation

Для дальнейшего исследования влияния способов и соединений настоящего изобретения на экспрессию генов, связанных с метаболизмом и адипогенезом жира, в экспериментах, которые выполняли, как описано в Примере 3 выше, анализировали специфические адипогенные факторы. Как показано на Фиг.3А, экспрессия DEC1/Stra13 вначале повышалась в печени животных, которых лечили соединением В, а затем постепенно возвращалась к исходному уровню через 72 часа после дозирования лекарственных препаратов. Известно, что DEC1/Stra13 подавляет экспрессию ядерного рецептора гормона PPAR-γ2, которая необходима для дифференциации адипоцитов. (Смотри, например, Yun и соав., см. выше; Giusti и соав., см. выше и Muller и соав., см. выше.) Таким образом, когда экспрессия DEC1/Stra13 возрастает, следует ожидать, что экспрессия PPAR-γ будет уменьшаться, снижая ответную реакцию клеток на жирные кислоты и, в частности, задерживая дифференциацию адипоцитов и генерирование жировой ткани.To further study the effect of the methods and compounds of the present invention on the expression of genes associated with fat metabolism and adipogenesis, in experiments that were performed as described in Example 3 above, specific adipogenic factors were analyzed. As shown in FIG. 3A, DEC1 / Stra13 expression was initially increased in the liver of animals treated with Compound B, and then gradually returned to baseline 72 hours after dosing of the drugs. It is known that DEC1 / Stra13 inhibits the expression of the nuclear receptor hormone PPAR-γ2, which is necessary for the differentiation of adipocytes. (See, for example, Yun et al., Supra; Giusti et al., Supra and Muller et al., Supra.) Thus, when the expression of DEC1 / Stra13 increases, it is expected that the expression of PPAR- γ will decrease, reducing the response of cells to fatty acids and, in particular, delaying the differentiation of adipocytes and the generation of adipose tissue.

Для дальнейшего исследования влияния способов и соединений настоящего изобретения на экспрессию адипогенных факторов, двенадцать самцов мышей Swiss Webster (весом 30-32 грамма), полученные от Simonsen, Inc., подвергали оральному кормлению через желудочный зонд один раз в сутки в течение 4 дней раствором из расчета 4 мл/кг либо 0,5% раствором CMC (0 мг/кг/сутки), 25 мг/мл соединения D в 0,5% CMC (100 мг/кг/сутки), либо 7,5 мг/мл и 25 мг/мл соединения В в 0,5% растворе CMC (30 и 100 мг/кг/сутки, соответственно). Через четыре часа после конечной дозы, животных анестезировали, умерщвляли и приблизительно 150 мг жировой ткани, сердца, почки печени, легкого и мышц выделяли и хранили в растворе KNALATER (Ambion) при температуре -20°С. Выделение РНК и анализ экспрессии гена выполняли, как описано выше в Примере 3.To further study the effect of the methods and compounds of the present invention on the expression of adipogenic factors, twelve Swiss Webster male mice (weighing 30-32 grams) obtained from Simonsen, Inc. were subjected to oral feeding through a gastric tube once a day for 4 days with a solution of calculating 4 ml / kg or 0.5% CMC solution (0 mg / kg / day), 25 mg / ml of compound D in 0.5% CMC (100 mg / kg / day), or 7.5 mg / ml and 25 mg / ml of compound B in a 0.5% CMC solution (30 and 100 mg / kg / day, respectively). Four hours after the final dose, the animals were anesthetized, sacrificed, and approximately 150 mg of adipose tissue, heart, kidney, liver, lung and muscles were isolated and stored in KNALATER (Ambion) solution at a temperature of -20 ° C. RNA isolation and gene expression analysis was performed as described above in Example 3.

Как показано на Фиг.3В, введение либо соединения D, либо соединения В приводило к увеличению экспрессии DEC1/Stra13 в нескольких тканях, включая жировую ткань, почку, печень и мышцы. Соединение В также повышало экспрессию DEC1/Stra13 в легком и сердце (Фиг.3В). Кроме того, повышенная экспрессия была все еще очевидна спустя 4 дня после обработки. Также, введение либо соединения D, либо соединения В, как описано выше, приводило к снижению экспрессии PPAR-γ2, например, в ткани сердца (Фиг.3С).As shown in FIG. 3B, the administration of either compound D or compound B resulted in increased expression of DEC1 / Stra13 in several tissues, including adipose tissue, kidney, liver, and muscle. Compound B also increased the expression of DEC1 / Stra13 in the lung and heart (Fig. 3B). In addition, increased expression was still apparent 4 days after treatment. Also, the administration of either compound D or compound B, as described above, led to a decrease in the expression of PPAR-γ2, for example, in heart tissue (Fig. 3C).

Эти данные показывают, что способы и соединения настоящего изобретения регулируют метаболизм жира путем изменения экспрессии факторов, принимающих участие в ответной реакции клеток на жир, включая синтез, утилизацию, транспорт и накопление триглицеридов. В частности, способы и соединения настоящего изобретения можно использовать для модулирования дифференциации адипоцитов и уменьшения накопления жира.These data show that the methods and compounds of the present invention regulate fat metabolism by altering the expression of factors involved in the response of cells to fat, including the synthesis, utilization, transport and accumulation of triglycerides. In particular, the methods and compounds of the present invention can be used to modulate adipocyte differentiation and reduce fat accumulation.

Пример 5: Регулирование in vivo веса тела и содержания жираExample 5: Regulation of in vivo body weight and fat content

Влияние соединений и способов настоящего изобретения на регулирование веса тела и содержание жира, например, посредством воздействия на накопления жира, исследовали следующим образом. Пятидесяти самцам крыс Sprague Dawley (6-7-недельного возраста), полученным от Simonsen. Inc., вводили дозы продуктов, содержащих 0,5% раствор CMC (Sigma-Aldrich) или соединения В, соответствующие 20, 60, 100 или 200 мг/кг веса тела, путем орального введения через желудочный зонд один раз в сутки в течение 14 последующих дней. Животных подвергали контролю в отношении изменений веса тела и признаков очевидной токсичности и смертности. На 15 день, после голодания в течение ночи при наличии воды при желании, животных анестезировали изофлураном, вскрывали брюшную полость и собирали кровь из полой нижней вены. Один образец цельной крови, приблизительно 1 мл, собирали в пробирки, содержащие EDTA для гематологического анализа, а второй образец, приблизительно 1 мл, собирали в пробирку без какого-либо антикоагулянта для химического анализа сыворотки. Анализы образцов крови проводили с использованием IDEXX (West Sacramento, CA). После отбора образцов крови, рассекали диафрагму животного и животных умерщвляли. Макроскопические наблюдения фиксировали для каждого животного, и для биохимической и/или гистологической оценки извлекали печень, почки, сердце, селезенку, легкие, желудок, малую кишку и большую кишку.The effect of the compounds and methods of the present invention on the regulation of body weight and fat content, for example, by affecting the accumulation of fat, was investigated as follows. Fifty male Sprague Dawley rats (6-7 weeks old) obtained from Simonsen. Inc., doses of products containing 0.5% CMC solution (Sigma-Aldrich) or compound B, corresponding to 20, 60, 100 or 200 mg / kg of body weight, were administered by oral administration through a gastric tube once a day for 14 subsequent days. Animals were monitored for changes in body weight and signs of apparent toxicity and mortality. On day 15, after fasting overnight in the presence of water, if desired, the animals were anesthetized with isoflurane, the abdominal cavity was opened and blood was collected from the vena cava inferior. One whole blood sample, approximately 1 ml, was collected in tubes containing EDTA for hematological analysis, and a second sample, approximately 1 ml, was collected in a tube without any anticoagulant for chemical analysis of serum. Blood samples were analyzed using IDEXX (West Sacramento, CA). After blood sampling, the diaphragm of the animal was dissected and the animals were sacrificed. Macroscopic observations were recorded for each animal, and the liver, kidneys, heart, spleen, lungs, stomach, small intestine, and large intestine were removed for biochemical and / or histological evaluation.

Как показано на Фиг 4А, у животных, которых подвергали лечению соединениями настоящего изобретения, проявлялось зависимое от дозы замедление увеличения веса тела. Исследования животных показали, что не наблюдалось общего замедления в росте, так как абсолютный вес большинства органов у животных, подвергавшихся лечению, не отличался значительно от веса соответствующих органов у контрольных животных, которых не подвергали лечению. Например, абсолютный вес сердца у животных, подвергавшихся лечению соединением настоящего изобретения, был, в основном, таким же, как абсолютный вес сердца у контрольных животных, которые не подвергали лечению (Фиг.4В). Однако, относительный вес органа, выраженный в виде доли общего веса тела, значительно отличался у животных, подвергавшихся лечению, по сравнению с весом органа у контрольных животных, не подвергавшихся лечению соединением настоящего изобретения. Например, относительный вес сердца у животных, подвергавшихся лечению соединением настоящего изобретения, по сравнению с относительным весом сердца у контрольных животных, был значительно выше (р=0,036, однофакторный тест ANOVA/Tukey').As shown in FIG. 4A, in animals that were treated with the compounds of the present invention, a dose-dependent inhibition of weight gain was manifested. Animal studies showed that there was no general growth retardation, since the absolute weight of most organs in the treated animals did not differ significantly from the weight of the corresponding organs in the control animals that were not treated. For example, the absolute heart weight in animals treated with the compound of the present invention was basically the same as the absolute heart weight in control animals that were not treated (Fig. 4B). However, the relative organ weight, expressed as a fraction of the total body weight, was significantly different in the treated animals compared to the organ weight in the control animals not treated with the compound of the present invention. For example, the relative heart weight in animals treated with the compound of the present invention was significantly higher than the relative heart weight in control animals (p = 0.036, ANOVA / Tukey 'univariate test).

Так как абсолютный вес органа уменьшался незначительно, не наблюдалось процесса общего замедления роста у животных, подвергавшихся лечению; однако, так как относительный вес органа значительно увеличивался, наблюдалась селективная потеря другой ткани. Как показано на Фиг.5, у животных, которых подвергали лечению соединением изобретения, проявлялось зависимое от дозы уменьшение висцерального (абдоминального) жира. Стрелкой на верхнем чертеже показано присутствие висцеральной жировой ткани у животных, подвергавшихся лечению низкими дозами соединения изобретения, тогда как на нижнем чертеже показано полное отсутствие жировой ткани у животных, подвергавшихся лечению более высокими дозами соединения изобретения.Since the absolute weight of the organ decreased slightly, there was no process of general growth retardation in animals treated; however, as the relative weight of the organ increased significantly, selective loss of other tissue was observed. As shown in FIG. 5, in animals that were treated with a compound of the invention, a dose-dependent decrease in visceral (abdominal) fat was manifested. The arrow in the upper drawing shows the presence of visceral adipose tissue in animals treated with low doses of a compound of the invention, while the lower drawing shows the complete absence of adipose tissue in animals treated with higher doses of a compound of the invention.

Эти результаты указывают на то, что соединения и способы настоящего изобретения можно использовать для регулирования веса тела. В частности, способы и соединения настоящего изобретения можно применять для профилактики или снижения увеличения веса без сопутствующей потери массы мускулов. Соединения и способы настоящего изобретения можно применять для модулирования регулирования содержания жира, например, путем уменьшения накопления абдоминального и висцерального жира.These results indicate that the compounds and methods of the present invention can be used to control body weight. In particular, the methods and compounds of the present invention can be used to prevent or reduce weight gain without concomitant loss of muscle mass. The compounds and methods of the present invention can be used to modulate the regulation of fat content, for example, by reducing the accumulation of abdominal and visceral fat.

Пример 6: Пониженное увеличение веса тела у модели животного с индуцированным диетой ожирениемExample 6: Reduced Weight Gain in a Diet-Induced Obesity Animal Model

Влияние соединений и способов настоящего изобретения на регулирование содержания жира, например, на поглощение и накопление и т.д., и на регулирование веса тела анализировали следующим образом. У C57BL/6J мышей, которых держали на диете с высоким содержанием жира, развивались сильное ожирение, гипергликемия и гиперинсулинемия, и эти мыши представляют собой модель индуцированного диетой ожирения, диабета типа 2 и пониженной толерантности к глюкозе. Сорок самцов мышей C57BL/6J, полученных из Jackson Laboratory (Bar Harbor ME), разделяли на следующие экспериментальные группы: Группа 1: контрольные животные, которые получают стандартную пищу мышей с наполнителем (n=10); Группа 2: контрольные животные, которые получают пищу мышей с высоким содержанием жира (45% жир от Research Diet) и с наполнителем (n=10); Группа 3: животные, которые получают пищу мышей с высоким содержанием жира и которым вводят 75 мг/кг/сутки соединения Е оральным способом через желудочный зонд (n=10); Группа 4: животные, которые получают пищу мышей с высоким содержанием жира и которым вводят 75 мг/кг/сутки соединения А оральным способом через желудочный зонд (n=10). Режим кормления продолжался в течение 28 суток с измерением веса тела каждую неделю. Животных затем умерщвляли и их органы и жировые ткани собирали и взвешивали.The effect of the compounds and methods of the present invention on the regulation of fat content, for example, on absorption and accumulation, etc., and on the regulation of body weight was analyzed as follows. C57BL / 6J mice that were on a high fat diet developed severe obesity, hyperglycemia, and hyperinsulinemia, and these mice are a model of diet-induced obesity, type 2 diabetes, and reduced glucose tolerance. Forty male C57BL / 6J mice obtained from Jackson Laboratory (Bar Harbor ME) were divided into the following experimental groups: Group 1: control animals that received standard vehicle-fed mice (n = 10); Group 2: control animals that receive food mice with a high fat content (45% fat from Research Diet) and with a filler (n = 10); Group 3: animals that receive food of mice with a high fat content and which are administered 75 mg / kg / day of compound E by oral route through a gastric tube (n = 10); Group 4: animals that receive food of mice with a high fat content and which are administered 75 mg / kg / day of compound A by oral route through a gastric tube (n = 10). The feeding regimen continued for 28 days with the measurement of body weight every week. The animals were then sacrificed and their organs and adipose tissues were collected and weighed.

Как показано на Фиг.6А, животные, которых держали на диете с высоким содержанием жира (группа 2), имели значительно больший вес тела, чем животные, которых кормили стандартной пищей (группа 1) (р<0,05). Однако, у животных, которых держали на диете с высоким содержанием жира, но одновременно вводили соединение Е или соединение А (группа 3 и группа 4, соответственно), проявлялось значительно меньшее увеличение веса (р<0,05). Фактически, несмотря на диету с высоким содержанием жира, животные, которых лечили соединением изобретения, имели, по существу, такой же вес, как и животные, которые находились на нормальной диете (сравните группу 3 и группу 4 с группой 1). Аналогично, как показано на Фиг.6В, животные, которых держали на диете с высоким содержанием жира (группа 2), имели значительное увеличение веса абдоминальной жировой ткани по сравнению как с животными, которых кормили стандартной пищей (группа 1), так и с животными, которых держали на диете с высоким содержанием жира, но также лечили соединением настоящего изобретения (группа 3 и группа 4). Как видно на Фиг.6В, животные, которых держали на диете с высоким содержанием жира и лечили соединением настоящего изобретения, имели, по существу, тот же вес жировой ткани, как и животные, которых держали на нормальной диете. На Фиг.6С показано, что влияние соединений было специфичным по отношению к весу жировой ткани, так как вес других органов, включая почку, печень и сердце, был, по существу, одинаковым во всех экспериментальных группах.As shown in FIG. 6A, animals that were on a high fat diet (group 2) had significantly more body weight than animals fed standard food (group 1) (p <0.05). However, in animals that were kept on a high fat diet but were simultaneously administered Compound E or Compound A (group 3 and group 4, respectively), a significantly smaller weight increase was observed (p <0.05). In fact, despite the high fat diet, the animals treated with the compound of the invention had essentially the same weight as the animals that were on a normal diet (compare group 3 and group 4 with group 1). Similarly, as shown in FIG. 6B, animals that were on a high fat diet (group 2) had a significant increase in the weight of abdominal adipose tissue compared to both animals fed standard food (group 1) and animals that were kept on a high fat diet but were also treated with the compound of the present invention (group 3 and group 4). As seen in FIG. 6B, animals that were kept on a high fat diet and were treated with a compound of the present invention had substantially the same weight of adipose tissue as animals that were kept on a normal diet. On Figs shows that the effect of the compounds was specific in relation to the weight of adipose tissue, since the weight of other organs, including the kidney, liver and heart, was essentially the same in all experimental groups.

Эти результаты указывают на то, что наблюдаемые различия в весе тела между животными, которых держали на диете с высоким содержанием жира с или без введения соединения изобретения, были конкретно обусловлены уменьшением жировых накоплений, а не снижением скорости роста. Кроме того, эти данные показывают, что лечение животных соединениями настоящего изобретения исключает избыточное увеличение веса тела, связанное с потреблением пищи, имеющей высокое содержание жира. Также, анализ уровней экспрессии, полученных для каждой группы, свидетельствует, что соединения изобретения нормализуют экспрессию генов, таких как белка-3, связывающего жирные кислоты, и митохондриального нерасщепляющегося белка 1, которые подвергаются повышающей регуляции у животных Группы 2 (данные не показаны). Таким образом, соединения изобретения являются полезными для терапевтического способа снижения увеличения веса даже в условиях приема неблагоприятной пищи. Кроме того, регулирование увеличения веса с помощью способов и соединений настоящего изобретения подтверждает, что такие соединения являются полезными при терапевтических методах облегчения потери веса у пациентов с ожирением.These results indicate that the observed differences in body weight between animals that were on a high fat diet with or without the administration of a compound of the invention were specifically due to a decrease in fat accumulation, rather than a decrease in growth rate. In addition, these data show that treatment of animals with the compounds of the present invention eliminates excessive weight gain associated with the consumption of foods having a high fat content. Also, analysis of the expression levels obtained for each group indicates that the compounds of the invention normalize the expression of genes, such as protein-3, fatty acid binding, and mitochondrial non-cleavable protein 1, which are upregulated in Group 2 animals (data not shown). Thus, the compounds of the invention are useful for a therapeutic method of reducing weight gain, even in the face of poor food intake. In addition, the regulation of weight gain using the methods and compounds of the present invention confirms that such compounds are useful in therapeutic methods to facilitate weight loss in obese patients.

Пример 7: Потеря веса у мышей с ожирениемExample 7: Weight Loss in Obese Mice

Влияние введения соединений настоящего изобретения на потерю веса у животных изучали следующим образом. C57BL/6J мышей получали из Jackson Laboratory (Bar Harber ME). У C57BL/6J мышей, которых держали на диете с высоким содержанием жира, развивались сильное ожирение, гипергликемия и гиперинсулинемия, и они представляют собой модель ожирения индуцированного диетой диабета типа 2 и пониженной толерантности к глюкозе. Мышей кормили пищей с высоким содержанием жира (45% калорий из жира) в течение 8 недель, после чего у мышей появлялось ожирение. Мышей с ожирением делили на две экспериментальные группы: животные Группы 1 представляли собой контрольную группу мышей с ожирением, а животные Группы 2 представляли собой группу мышей с ожирением, которых подвергали лечению соединением настоящего изобретения. Дополнительная группа мышей соответствующего возраста, не страдающая ожирением, также была включена в исследование. Затем животных подвергали ежедневно воздействию соединения настоящего изобретения или контрольного наполнителя. Вес тела мышей определяли дважды в неделю в течение 21 дня. На 21 сутки животных взвешивали и затем умерщвляли. Абдоминальную жировую ткань, печень, почки и сердце извлекали и взвешивали для анализа.The effect of the administration of the compounds of the present invention on animal weight loss was studied as follows. C57BL / 6J mice were obtained from Jackson Laboratory (Bar Harber ME). C57BL / 6J mice on a high fat diet developed severe obesity, hyperglycemia, and hyperinsulinemia, and they are a model of obesity-induced type 2 diabetes and reduced glucose tolerance. The mice were fed a high fat diet (45% calories from fat) for 8 weeks, after which the mice became obese. Obese mice were divided into two experimental groups: Group 1 animals were a control group of obese mice, and Group 2 animals were a group of obese mice that were treated with a compound of the present invention. An additional group of mice of the corresponding age, not suffering from obesity, was also included in the study. The animals were then exposed daily to a compound of the present invention or a control vehicle. The body weight of the mice was determined twice a week for 21 days. On day 21, animals were weighed and then killed. Abdominal adipose tissue, liver, kidneys, and heart were removed and weighed for analysis.

Потеря веса тела, при введении соединения настоящего изобретения, указывает на то, что соединения настоящего изобретения являются полезными для терапевтического снижения веса тела у пациентов с ожирением.The loss of body weight, with the introduction of the compounds of the present invention, indicates that the compounds of the present invention are useful for therapeutic weight loss in patients with obesity.

Пример 8: Длительное снижение содержания триглицеридов в сывороткеExample 8: Long-Term Serum Triglyceride Reduction

Влияние введения соединения настоящего изобретения на уровни содержания триглицеридов в сыворотке исследовали с использованием модели мыши с диабетом следующим образом. Были получены двадцать самцов db/db мышей (Harlan, Indianapolis, Indiana), которые имели гомозиготную мутацию с потерей функции в лептиновом рецепторе. Мышам давали либо наполнитель (100 мМ гистидина), либо соединение А (0,5 мг/мл в 100 мМ гистидина) в питьевой воде, по желанию, в течение 8-недельного периода. После этого животным не давали пищу в течение ночи, и у них были взяты образцы крови из каудальной полой вены при полной анестезии и помещены в сывороточные пробирки для центрифугирования. Анализы образцов крови проводили с помощью Quility Clinical Labs (Mountain View, CA).The effect of administering a compound of the present invention on serum triglyceride levels was investigated using a mouse model of diabetes as follows. Twenty male db / db mice (Harlan, Indianapolis, Indiana) were obtained that had a homozygous mutation with loss of function at the leptin receptor. Mice were given either vehicle (100 mM histidine) or compound A (0.5 mg / ml in 100 mM histidine) in drinking water, if desired, over an 8-week period. After that, the animals were not given food during the night, and blood samples from the caudal vena cava were taken from them under complete anesthesia and placed in serum tubes for centrifugation. Blood samples were analyzed using Quility Clinical Labs (Mountain View, CA).

Уровни содержания триглицеридов у db/db мышей, по крайней мере, в 1,5-2,0 раза выше по сравнению с уровнями содержания триглицеридов у нормальных мышей и прогрессивно увеличиваются с возрастом. (Смотри, например, Nishina и соавт. (1994) Metabolism 43:549-553 и Tuman и Doisy (1997) Diabetologia 13:7-11). Как показано на Фиг.7, уровни содержания триглицеридов в конце эксперимента составляли приблизительно 120 мг/дл у контрольных db/db мышей. Однако, уровень содержания триглицеридов у животных, которые подвергались лечению соединением настоящего изобретения, составлял приблизительно 85 мг/дл, т.е. был значительно более низким, чем у контрольных мышей. Повышенные уровни содержания триглицеридов ассоциируются с повышенной опасностью сердечно-сосудистого заболевания, и повышенное содержание триглицеридов является компонентом метаболического синдрома. Так как соединения и способы настоящего изобретения эффективно снижают или поддерживают уровни содержания триглицеридов при состояниях, которые обычно ассоциируются с повышенными уровнями содержания триглицеридов, например, диабетом, синдромом X, макрососудистым заболеванием, или другой дислипидемией, способы настоящего изобретения являются полезными для лечения индивидуумов с опасными состояниями или риском появления таких состояний.Triglyceride levels in db / db mice are at least 1.5-2.0 times higher compared to triglycerides in normal mice and progressively increase with age. (See, for example, Nishina et al. (1994) Metabolism 43: 549-553 and Tuman and Doisy (1997) Diabetologia 13: 7-11). As shown in FIG. 7, triglyceride levels at the end of the experiment were approximately 120 mg / dl in control db / db mice. However, the triglyceride level in animals that were treated with the compound of the present invention was approximately 85 mg / dl, i.e. was significantly lower than in control mice. Elevated triglyceride levels are associated with an increased risk of cardiovascular disease, and elevated triglycerides are a component of the metabolic syndrome. Since the compounds and methods of the present invention effectively lower or maintain triglyceride levels in conditions that are usually associated with elevated levels of triglycerides, such as diabetes, Syndrome X, macrovascular disease, or other dyslipidemia, the methods of the present invention are useful for treating individuals with dangerous conditions or the risk of such conditions.

Пример 9: Идентификация соединений, которые стабилизируют HIFα и ингибируют HIF гидроксилазную активностьExample 9: Identification of compounds that stabilize HIFα and inhibit HIF hydroxylase activity

Соединения настоящего изобретения, которые используют в способах настоящего изобретения, стабилизируют HIFα, ингибируют HIF гидроксилазную активность и/или гидроксилирование HIFα и т.д. Таким образом, соединения можно идентифицировать, например, благодаря их активности при стабилизации HIFα. Стабилизацию HIFα с использованием соединений и способов настоящего изобретения исследовали следующим образом. Человеческие клетки, выделенные из тканей эпителия фетальной почки, трансформированного аденовирусом (293А), эпителиальной аденокарциномы (HeLa), гепатоклеточной карциномы шейки матки (НерЗВ), плоскоклеточной карциномы (SCC-25) и фибробласта легкого (HLF) (См., например, American Type Culture Collection, Manassas VA и Qbiogeny, Carlsbad CA), раздельно высевали в 100 мм чашки для культур и выращивали при 37°С, в атмосфере 20% O₂, 5% CO₂ следующим образом: клетки HeLa в среде Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM), 2% фетальной бычьей сыворотки (FB); HLF клетки в DMEM, 10% FBS; 293А клетки в DMEM, 5% FBS и Нер3В клетки в Minimal Essential Medium (MEM), Earle's BBS (Mediatech Inc., Herndon VA), 2 мМ L-глутамина, 0,1 мМ не незаменимых аминоксилот, 1 мМ пирувата натрия, 10% FBS. Когда клеточные слои достигали слияния, среду заменяли OPTI-MEM средой (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad CA) и клеточные слои инкубировали в течение приблизительно 24 часов в атмосфере, состоящей из 20% О₂, 5% CO₂ при 37°С. Затем добавляли соединение настоящего изобретения (соединение В, D, F, G или Н) или наполнитель в качестве контрольного соединения (0,5-1,0% DMSO) к существующей среде и инкубирование продолжали в течение ночи.The compounds of the present invention that are used in the methods of the present invention stabilize HIFα, inhibit HIF hydroxylase activity and / or hydroxylation of HIFα, etc. Thus, the compounds can be identified, for example, due to their activity in the stabilization of HIFα. The stabilization of HIFα using the compounds and methods of the present invention was investigated as follows. Human cells isolated from tissues of the fetal kidney epithelium transformed with adenovirus (293A), epithelial adenocarcinoma (HeLa), hepatocellular cervical carcinoma (NERZV), squamous cell carcinoma (SCC-25), and pulmonary fibroblast (HLF) (See, for example Type Culture Collection, Manassas VA and Qbiogeny, Carlsbad CA), were separately plated in 100 mm culture dishes and grown at 37 ° C, in an atmosphere of 20% O ₂ , 5% CO ₂ as follows: HeLa cells in Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM), 2% fetal bovine serum (FB); HLF cells in DMEM, 10% FBS; 293A cells in DMEM, 5% FBS and Hep3B cells in Minimal Essential Medium (MEM), Earle's BBS (Mediatech Inc., Herndon VA), 2 mM L-glutamine, 0.1 mM non-essential aminoxylates, 1 mM sodium pyruvate, 10 % FBS. When the cell layers reached fusion, the medium was replaced with OPTI-MEM medium (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad CA) and the cell layers were incubated for approximately 24 hours in an atmosphere consisting of 20% O ₂ , 5% CO ₂ at 37 ° C. Then, a compound of the present invention (compound B, D, F, G or H) or an excipient as a control compound (0.5-1.0% DMSO) was added to the existing medium, and incubation was continued overnight.

После инкубирования клетки два раза промывали в холодном фосфатном забуференном солевом растворе (РВ) и затем подвергали лизированию в 1 мл 10 мМ раствора Tris (pH 7,4), 1 мМ EDTA, 150 мМ NaCl, 0,5% IGEPAL (Sigma-Aldrich, St Louis МО), и смеси ингибитора протеазы (Roche Molecular Biochemical) в течение 15 минут на льду. Клеточные лизаты центрифугировали при 3000 × g в течение 5 минут при 4°С и собирали цитозольную фракцию (надосадочную жидкость). Ядра (гранулы) ресуспендировали и подвергали лизированию в 100 мкл 20 мМ HEPES (pH 7,2), 400 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1 мМ дитиотреитола и смеси протеаз (Roche Molecular Biochemical), центрифугировали при 13000 × g в течение 5 минут при 4°С и собирали фракции ядер белка (надосадочную жидкость).After incubation, cells were washed twice in cold phosphate buffered saline (PB) and then lysed in 1 ml of 10 mM Tris solution (pH 7.4), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich , St Louis MO), and a protease inhibitor mixture (Roche Molecular Biochemical) for 15 minutes on ice. Cell lysates were centrifuged at 3000 × g for 5 minutes at 4 ° C and the cytosolic fraction (supernatant) was collected. Nuclei (granules) were resuspended and lysed in 100 μl of 20 mM HEPES (pH 7.2), 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol and a mixture of proteases (Roche Molecular Biochemical), centrifuged at 13000 × g for 5 minutes at 4 ° C and fractions of protein nuclei (supernatant) were collected.

Фракции ядер нормализовали на основе концентрации белка и загружали в 4-12% TG гель и фракционировали в восстановительных условиях. Белки переносили на PVDF мембрану (Invitrogen Corp., Carlsbad CA), где подвергали воздействию тока 500 мА в течение 1,5 часов. Мембрану блокировали в растворе T-TBS, 2% молоке в течение 1 часа при комнатной температуре и инкубировали в течение ночи антителами мышиных анти-человеческих субъединиц HIF-1α (BD Biosciences, Bedford МА), разбавляли 1:250 в растворе T-TBS, 2% молоке. Блот готовили, используя SUPERSIGNAL WEST хемилюминесцентный субстрат (Pierce, Rockford IL). Как показано на Фиг.8А, репрезентативное соединение настоящего изобретения (соединение D) стабилизировало HIFα в различных типах клеток, давая возможность HIFα аккумулироваться внутри клеток.Nuclear fractions were normalized based on protein concentration and loaded onto a 4-12% TG gel and fractionated under reducing conditions. Proteins were transferred onto a PVDF membrane (Invitrogen Corp., Carlsbad CA), where they were exposed to a current of 500 mA for 1.5 hours. The membrane was blocked in a solution of T-TBS, 2% milk for 1 hour at room temperature and incubated overnight with antibodies of the mouse anti-human subunits HIF-1α (BD Biosciences, Bedford MA), diluted 1: 250 in a solution of T-TBS, 2% milk. A blot was prepared using SUPERSIGNAL WEST chemiluminescent substrate (Pierce, Rockford IL). As shown in FIG. 8A, a representative compound of the present invention (compound D) stabilized HIFα in various types of cells, allowing HIFα to accumulate within the cells.

Альтернативно, фракции ядер готовили с использованием набора экстрактов ядер (Active Motif, Carlsbad CA) и анализировали на наличие HIFα с использованием набора TRANSAM HIF-1 ELISA (Active Motif) в соответствии с предписаниями производителя. Как показано на Фиг.8В, эпителиальные клетки (293А) и клетки гепатоцита (Нер3В), обработанные различными соединениями настоящего изобретения (соединениями В, F, Cu Н), оказывали стабилизирующее влияние и аккумуляцию HIFα по сравнению с контрольными клетками, обработанными наполнителем.Alternatively, nuclear fractions were prepared using a set of kernel extracts (Active Motif, Carlsbad CA) and analyzed for HIFα using the TRANSAM HIF-1 ELISA kit (Active Motif) according to the manufacturer's instructions. As shown in FIG. 8B, epithelial cells (293A) and hepatocyte cells (Hep3B) treated with various compounds of the present invention (compounds B, F, Cu H) exerted a stabilizing effect and accumulation of HIFα as compared to control cells treated with vehicle.

Соединения настоящего изобретения, которые используют в способах настоящего изобретения, можно идентифицировать также, благодаря их способности модулировать HIF-специфическую пролилгидроксилазную активность. Модуляцию HIF пролилгидроксилазной активности можно идентифицировать, используя анализ базирующийся на гидроксилировании-сопряженном декарбоксилировании 2-оксо[1-¹⁴C]-глутарата. (См. Hirsila и соавт. (2003) J. Biol. Chem. 278:30772-30780). Реакцию проводят в 1,0 мл реакционного объема, содержащего 10-100 мкл поверхностно-активного вещества, например, Triton-X-100, солюбилизированный клеточный экстракт, полученный из клеток экспрессирующих либо эндогенную HIF пролилгидроксилазу, либо рекомбинантную HIF пролилгидроксилазу; 0,05 мкМ пептида субстрата, например, DLDLEMLAPYIPMDDDFQL (SEQ ID N0:1); 0,005 мМ FeSO₄, 0,16 мМ 2-оксо [1-¹⁴C] глутарата, 2 мкМ аскорбата, 60 мкг каталазы, 0,1 мкМ дитиотреитола и 50 мкМ Трис-HCl буфера, доведенного до рН 7,8 при 25°С. Ферментативную реакцию проводят при 37°С в течение 20 минут. ¹⁴СО₂, продуцируемый в процессе реакции, поглощают суспендированным бумажным фильтром, импрегнированным основанием, в атмосфере над реакционной смесью и подсчитывают в сцинтилляционном счетчике.The compounds of the present invention that are used in the methods of the present invention can also be identified due to their ability to modulate HIF-specific prolyl hydroxylase activity. Modulation HIF prolilgidroksilaznoy activity can be identified using the assay based on dual-hydroxylation decarboxylation of 2-oxo [1- ¹⁴ C] -glutarata. (See Hirsila et al. (2003) J. Biol. Chem. 278: 30772-30780). The reaction is carried out in 1.0 ml of a reaction volume containing 10-100 μl of a surfactant, for example, Triton-X-100, a solubilized cell extract obtained from cells expressing either endogenous HIF prolyl hydroxylase or recombinant HIF prolyl hydroxylase; 0.05 μM substrate peptide, for example, DLDLEMLAPYIPMDDDFQL (SEQ ID N0: 1); 0.005 mM FeSO _4, 0.16 mM 2-oxo [1- ¹⁴ C] glutarate, 2 mM ascorbate, 60 mg of catalase, 0.1 mM dithiothreitol and 50 mM Tris-HCl buffer adjusted to pH 7.8 at 25 ° FROM. The enzymatic reaction is carried out at 37 ° C for 20 minutes. ¹⁴ CO ₂ produced during the reaction is absorbed into a suspended paper filter impregnated with a base in the atmosphere above the reaction mixture and counted in a scintillation counter.

Пример 10: Экспрессия регуляторных факторов, принимающих участие в поглощении и утилизации глюкозыExample 10: Expression of regulatory factors involved in glucose uptake and utilization

Так как соединения и способы настоящего изобретения регулируют метаболизм жира, который тесно связан с регулированием глюкозы, было проанализировано влияние соединений и способов изобретения на поглощение и метаболизм глюкозы. Клетки человека SCC-25 (плоскоклеточная карцинома) или клетки крысы Н9с2 (вентрикулярный кардиомиоцит) выращивали до образования сплошной массы на 100 мм чашках для культуры при 37°С, в среде, состоящей из 10% СО₂ в DMEM с 10% фетальной сыворотки теленка. Клетки затем промывали дважды раствором PBS и инкубировали с наполнителем в качестве контроля, соединением D (10 и 25 мкМ), или соединением С (5, 10 и 20 мкМ) в течение 16 часов. Чашки затем помещали на лед, надосадочную культуральную жидкость удаляли и добавляли лизисный буферный раствор-1 (LB-1: 10 мМ Tris pH 7,4, 1 мМ EDTA, 150 мМ хлорида натрия, 0,5% IGEPAL). Клетки собирали путем соскабливания, инкубировали в течение 15 минут на льду и затем центрифугировали при скорости 3000 × g в течение 5 минут при 4°С. Надосадочную жидкость, которая представляла собой цитозольную фракцию, собирали, и цитозольные белки выделяли при восстановительных условиях, используя SDS-электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE), причем равные количества белка загружали на дорожку.Since the compounds and methods of the present invention regulate fat metabolism, which is closely related to glucose regulation, the effect of the compounds and methods of the invention on glucose uptake and metabolism has been analyzed. Human SCC-25 cells (squamous cell carcinoma) or rat H9c2 cells (ventricular cardiomyocyte) were grown to form a continuous mass on 100 mm culture plates at 37 ° C in a medium consisting of 10% CO ₂ in DMEM with 10% fetal calf serum . Cells were then washed twice with PBS and incubated with vehicle as a control, compound D (10 and 25 μM), or compound C (5, 10 and 20 μM) for 16 hours. The cups were then placed on ice, the supernatant of the culture fluid was removed and lysis buffer solution-1 (LB-1: 10 mM Tris pH 7.4, 1 mM EDTA, 150 mM sodium chloride, 0.5% IGEPAL) was added. Cells were harvested by scraping, incubated for 15 minutes on ice and then centrifuged at a speed of 3000 × g for 5 minutes at 4 ° C. The supernatant, which was a cytosolic fraction, was collected, and cytosolic proteins were isolated under reducing conditions using SDS-PAGE (SDS-PAGE), with equal amounts of protein loaded onto a lane.

SDS-PAGE проводили при напряжении 150 В в течение 2 часов, после чего белки перемещали на PVDF мембрану, где их подвергали воздействию тока 400 мА в течение 1,5 часов при 4°С. Мембрану инкубировали в блокирующем буферном растворе в течение 2 часов или в течение ночи и промывали один раз раствором T-TBS перед добавлением раствора анти-GluT-1 антитела (Alpha Diagnostic), разбавленного до рабочей концентрации в блокирующем буферном растворе. После инкубирования в течение ночи с осторожным помешиванием при 4°С, мембраны промывали 4 раза раствором T-TBS, после чего инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре с раствором конъюгированного вторичного антитела, разбавленного в блокирующем буферном растворе. Мембрану затем промывали четыре раза раствором T-TBS до проявления и визуализации, используя рентгеновскую пленку и ECL SUPERSIGNAL WEST PICO хемилюминесцентный субстрат (Pierce Chemical Co., Rockford IL) согласно предписаниям производителя.SDS-PAGE was performed at a voltage of 150 V for 2 hours, after which the proteins were transferred to a PVDF membrane, where they were exposed to a current of 400 mA for 1.5 hours at 4 ° C. The membrane was incubated in a blocking buffer solution for 2 hours or overnight and washed once with a T-TBS solution before adding an anti-GluT-1 antibody solution (Alpha Diagnostic) diluted to a working concentration in a blocking buffer solution. After overnight incubation with gentle stirring at 4 ° C, the membranes were washed 4 times with a T-TBS solution, and then incubated for one hour at room temperature with a solution of conjugated secondary antibody diluted in blocking buffer solution. The membrane was then washed four times with T-TBS until development and visualization using an X-ray film and ECL SUPERSIGNAL WEST PICO chemiluminescent substrate (Pierce Chemical Co., Rockford IL) according to the manufacturer's instructions.

На Фиг.9А показано, что как соединение D, так и соединение С, повышали уровни содержания белка GluT-1, основного индуцируемого транспортера глюкозы, способствующего поглощению глюкозы, в SCC-25 и Н9с2 клетках, соответственно. Эти результаты показывают, что соединения и способы настоящего изобретения потенциально увеличивают экспрессию белков, принимающих участие в поглощении глюкозы, и таким образом представляют терапевтический подход для увеличения поглощения глюкозы.9A shows that both Compound D and Compound C increased levels of GluT-1 protein, the main inducible glucose transporter that promotes glucose uptake, in SCC-25 and H9c2 cells, respectively. These results show that the compounds and methods of the present invention potentially increase the expression of proteins involved in glucose uptake, and thus represent a therapeutic approach for increasing glucose uptake.

В другом анализе влияния способов и соединений настоящего изобретения на регулирование глюкозы, клетки 293А человека помещали в виде сплошной массы на 35 мм чашки для культуры и культивировали в течение 1 суток при 37°С, в среде, содержащей 10% СО₂ в DMEM, содержащем 5% FBS и 1% пенициллин-стрептомицина. Указанную среду изменяли на среду Opti-Mem и инкубацию продолжали в течение дополнительных 18-24 часов. Затем в среду добавляли либо наполнитель в качестве контроля, либо соединение В, и клетки инкубировали в течение дополнительных 24, 48 или 72 часов. Чашки помещали на лед, надосадочную культуральную жидкость удаляли и добавляли лизисный буферный раствор-1 (LB-1: 10 мМ Tris pH 7,4, 1 мМ EDTA, 150 мМ хлорида натрия, 0,5% IGEPAL). Клеточные лизаты собирали, цитозольные фракции также собирали, и цитозольные белки выделяли, используя SDS-PAGE, как описано выше. После выделения, белки перемещали на PVDF мембрану, где их подвергали воздействию тока 400 мА в течение 1,5 часов при 4°С. Мембрану инкубировали в блокирующем буферном растворе в течение 2 часов или в течение ночи и промывали один раз раствором T-TBS перед добавлением раствора анти-альдолазного антитела, разбавленного до рабочей концентрации в блокирующем буферном растворе. После инкубирования в течение ночи с осторожным помешиванием при 4°С, мембраны промывали 4 раза раствором T-TBS, после чего инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре с раствором конъюгированного вторичного антитела, разбавленного в блокирующем буферном растворе. Мембрану затем промывали четыре раза раствором T-TBS до проявления и визуализации, используя рентгеновскую пленку и ECL SUPERSIGNAL WEST FEMTO или PICO хемилюминесцентный субстрат (Pierce Chemical Co., Rockford IL) согласно предписаниям производителя.In another analysis of the effect of the methods and compounds of the present invention on glucose control, human 293A cells were placed as a continuous mass on 35 mm culture plates and cultured for 1 day at 37 ° C. in a medium containing 10% CO ₂ in a DMEM containing 5% FBS and 1% penicillin-streptomycin. The indicated medium was changed to Opti-Mem medium and incubation was continued for an additional 18-24 hours. Then either vehicle as a control or Compound B was added to the medium, and the cells were incubated for an additional 24, 48 or 72 hours. The plates were placed on ice, the supernatant culture liquid was removed and lysis buffer solution-1 (LB-1: 10 mM Tris pH 7.4, 1 mM EDTA, 150 mM sodium chloride, 0.5% IGEPAL) was added. Cell lysates were collected, cytosolic fractions were also collected, and cytosolic proteins were isolated using SDS-PAGE as described above. After isolation, proteins were transferred to a PVDF membrane, where they were exposed to a current of 400 mA for 1.5 hours at 4 ° C. The membrane was incubated in a blocking buffer solution for 2 hours or overnight and washed once with a T-TBS solution before adding an anti-aldolase antibody solution diluted to a working concentration in a blocking buffer solution. After overnight incubation with gentle stirring at 4 ° C, the membranes were washed 4 times with a T-TBS solution, after which they were incubated for one hour at room temperature with a conjugated secondary antibody solution diluted in blocking buffer solution. The membrane was then washed four times with T-TBS until development and visualization using an X-ray film and ECL SUPERSIGNAL WEST FEMTO or PICO chemiluminescent substrate (Pierce Chemical Co., Rockford IL) according to the manufacturer's instructions.

Как видно на Фиг.9В, экспрессия альдолазы увеличивалась со временем в клетках, обработанных соединением В в течение 24, 48 и 72 часов, в то время, как культуры, обработанные контрольным наполнителем, не показали увеличения экспрессии альдолазы. Культуры, обработанные соединением В, не показали какого-либо увеличения β-тубулин экспрессии, указывая на то, что увеличение экспрессии у альдолазы было специфическим и не связано с общим увеличением экспрессии белков.As seen in FIG. 9B, aldolase expression increased over time in cells treated with Compound B for 24, 48 and 72 hours, while cultures treated with control vehicle did not show an increase in aldolase expression. The cultures treated with compound B did not show any increase in β-tubulin expression, indicating that the increase in expression at the aldolase was specific and not associated with a general increase in protein expression.

Эти результаты также показали, что соединения и способы изобретения изменяют регулирование глюкозы, и это говорит о том, что обработка соединением настоящего изобретения потенциально создает метаболический сдвиг в продуцировании энергии за счет модулирования гомеостаза жира и глюкозы.These results also showed that the compounds and methods of the invention alter glucose regulation, and this suggests that treatment with a compound of the present invention potentially creates a metabolic shift in energy production by modulating fat and glucose homeostasis.

Пример 11: Увеличенная экспрессия регуляторных факторов, принимающих участие в регулировании содержания глюкозыExample 11: Increased expression of regulatory factors involved in the regulation of glucose

Для демонстрации того, что соединения и способы изобретения изменяют поглощение и утилизацию глюкозы in vivo, образцы, полученные как в Примере 3, описанном выше, дополнительно анализировали для идентификации изменений в характере индукции гликолитических генов с течением времени. Как показано на Фигурах 10А, 10В и 10С, экспрессия генов, кодирующих ферменты, принимающие участие в регулировании содержания глюкозы, увеличивается координированным образом после обработки соединением В. Характеристики транскрипта, представленные на Фигурах 10А, 10В и 10С, включают фосфофруктокиназу (PFK)-P тромбоцитного типа (1), PFK-L печеночного типа (2), енолазу-1 (3), транспортеров глюкозы (GluT)-1 (4), лактатдегидрогеназу-1 (5), альдолазу-1 (6) и гексокиназу-1 (7). В ходе проведения испытания, большинство уровней содержания мРНК возрастали после введения соединения, затем возвращались до контролируемых уровней после 24-48 часов. Кроме того, хотя экспрессия генов, кодирующих гликолитические ферменты, была аналогичной среди различных органов, почка (Фиг.10А), печень (Фиг.10В) и легкое (Фиг.10С), обнаружили различия как в повышении относительных уровней экспрессии, так и в продолжительности повышения в конкретных молекулах мРНК. Эти различия относятся, в частности, к различной степени, до которой гликолитическая активность обеспечивает основной источник энергии для соответствующей ткани, особенно во время стресса. Эти результаты показывают, что соединения изобретения специфически индуцируют гликолитические эффекты и что эти эффекты могут отличаться в зависимости от ткани.To demonstrate that the compounds and methods of the invention alter the absorption and utilization of glucose in vivo, the samples obtained as in Example 3 described above were further analyzed to identify changes in the pattern of induction of glycolytic genes over time. As shown in Figures 10A, 10B and 10C, the expression of genes encoding the enzymes involved in the regulation of glucose increases in a coordinated manner after treatment with compound B. The transcript characteristics shown in Figures 10A, 10B and 10C include phosphofructokinase (PFK) -P platelet type (1), liver-type PFK-L (2), enolase-1 (3), glucose transporters (GluT) -1 (4), lactate dehydrogenase-1 (5), aldolase-1 (6) and hexokinase-1 (7). During the test, most mRNA levels increased after compound administration, then returned to controlled levels after 24-48 hours. In addition, although the expression of genes encoding glycolytic enzymes was similar among various organs, the kidney (Fig. 10A), the liver (Fig. 10B) and the lung (Fig. 10C), found differences both in increasing relative expression levels and in duration of increase in specific mRNA molecules. These differences relate in particular to the varying degrees to which glycolytic activity provides the main source of energy for the corresponding tissue, especially during stress. These results show that the compounds of the invention specifically induce glycolytic effects and that these effects may vary depending on the tissue.

Пример 12: Влияние соединений на потребление кислородаExample 12: Effect of Compounds on Oxygen Consumption

Продуцирование энергии из жира и глюкозы происходит обычно при окислительной респирации. Однако, при гипоксических условиях, в утилизации энергии наблюдается сдвиг на компенсацию пониженных уровней содержания кислорода. Обычно, анаэробный гликолиз увеличивается, и окисление жирных кислот используется до того предела, который возможен на основе доступности кислорода. В основном, потребность в кислороде, которая соответствует суммарным энергетическим потребностям, должна уменьшаться. Следующий эксперимент проводили для установления, снижают ли способы изобретения, при изменении утилизации энергии, потребность клеток в кислороде. Клетки 293А и HeLa человека (American Type Culture Collection) выращивали раздельно до слияния в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (Mediatech, Inc., Herndon VA) и 1% фетальной бычьей сыворотки при температуре 37°С, в среде, содержащей 10% СО₂. Клетки собирали и повторно суспендировали в среде с плотностью 500000 клеток/мл, и 0,2 мл клеточной суспензии добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета Oxygen Biosensor (BD Biosciences, Bedford MA). Планшеты Oxygen Sensor (BD Bioscience) содержат комплекс рутения, который является более флуоресцентным в отсутствие кислорода. Следовательно, флуоресцентная индикация увеличивается за счет присутствия на планшете кислород-потребляющих клеток, которые изменяют состояние равновесия в сторону более низкой кислородной насыщенности и более высокой флуоресценции.Energy production from fat and glucose usually occurs during oxidative respiration. However, under hypoxic conditions, there is a shift in energy utilization to compensate for lower levels of oxygen. Typically, anaerobic glycolysis is increased, and fatty acid oxidation is used to the extent possible based on the availability of oxygen. Basically, the need for oxygen, which corresponds to the total energy needs, should be reduced. The following experiment was carried out to establish whether the methods of the invention reduce, with a change in energy utilization, the oxygen demand of cells. Human Type 293A and HeLa cells (American Type Culture Collection) were grown separately before fusion in high glucose DMEM (Mediatech, Inc., Herndon VA) and 1% fetal bovine serum at 37 ° C in 10% CO ₂ . Cells were harvested and resuspended in a medium with a density of 500,000 cells / ml, and 0.2 ml of cell suspension was added to each well of an Oxygen Biosensor 96-well plate (BD Biosciences, Bedford MA). Oxygen Sensor (BD Bioscience) tablets contain a ruthenium complex that is more fluorescent in the absence of oxygen. Therefore, the fluorescence indication increases due to the presence of oxygen-consuming cells on the plate, which change the equilibrium state towards lower oxygen saturation and higher fluorescence.

Для утроения содержимого наборов лунок, в 10 мкл объемы добавляли следующие агенты обработки: 1) 0,5% DMSO (наполнитель в качестве контрольного соединения); 2) 200 мкМ додецила сульфата натрия (SDS; в качестве положительного контрольного соединения при отсутствии потребления кислорода); 3) 5, 25 или 50 мкМ соединения В; 4) 10, 100 или 1000 мкМ десферриоксамин мезилата (DFO) и 5) только среду. Кроме того, 0,2 мл только среды или среды со 100 мМ SDS также инкубировали в лунках без клеток с целью обеспечения соответствующего контроля для фоновой флуоресценции планшета.To triple the contents of the well sets, the following processing agents were added in 10 μl volumes: 1) 0.5% DMSO (vehicle as a control compound); 2) 200 μM sodium dodecyl sulfate (SDS; as a positive control compound in the absence of oxygen consumption); 3) 5, 25 or 50 μM of compound B; 4) 10, 100 or 1000 μM desferrioxamine mesylate (DFO) and 5) medium only. In addition, 0.2 ml of medium alone or medium with 100 mM SDS was also incubated in cell free wells to provide appropriate control for background fluorescence of the plate.

Культуры инкубировали в течение дополнительных 72 часов и затем измеряли флуоресценцию в флуориметре FL600 (Biotek Instruments, Inc., Winooski VT) при длине волны возбуждения, равной 485 нм, и при длине волны излучения, равной 590 нм. Данные были нанесены на график в виде функции флуоресценции, и был проведен описательный статистический анализ с использованием компьютерной программы EXCEL (Microsoft Corp., Bellevue WA).The cultures were incubated for an additional 72 hours and then fluorescence was measured in a FL600 fluorimeter (Biotek Instruments, Inc., Winooski VT) at an excitation wavelength of 485 nm and an emission wavelength of 590 nm. Data were plotted as a fluorescence function, and a descriptive statistical analysis was performed using the EXCEL computer program (Microsoft Corp., Bellevue WA).

Как клетки HeLa, так и клетки 293А, обработанные соединением изобретения, демонстрировали зависимое от дозы снижение флуоресценции, указывая на уменьшение потребления кислорода по сравнению с клетками, обработанными наполнителем в качестве контрольного соединения (смотри Фиг.11). Как было установлено с использованием колориметрического анализа WST-1 (Roche), уменьшенное потребление кислорода произошло не по причине потери активности или жизнеспособности у клеток, наводящей на мысль о возможной цитотоксичности. Дополнительные эксперименты с использованием других типов клеток и конечных точек подтвердили, что уменьшение потребления кислорода не связано с цитотоксичностью соединения.Both HeLa cells and 293A cells treated with the compound of the invention showed a dose-dependent decrease in fluorescence, indicating a decrease in oxygen consumption compared to cells treated with vehicle as a control compound (see FIG. 11). As was established using the colorimetric analysis of WST-1 (Roche), the reduced oxygen consumption was not due to a loss of activity or viability in cells, suggesting possible cytotoxicity. Additional experiments using other types of cells and endpoints confirmed that the decrease in oxygen consumption is not associated with the cytotoxicity of the compound.

Данные показывают, что обработка клеток из тканей различного происхождения соединениями изобретения приводит к сдвигу в метаболизме клеток, который уменьшает общее потребление кислорода.The data show that treatment of cells from tissues of various origins with the compounds of the invention leads to a shift in cell metabolism, which reduces the overall oxygen consumption.

Пример 13: Кратковременное уменьшение содержания триглицеридов в плазмеExample 13: Short-term reduction in plasma triglycerides

Крыс Sprague Dawley подвергали обработке и образцы собирали, как описано в Примере 5. Анализ образцов крови показал, что способы изобретения приводят к значительному увеличению содержания в плазме триглицеридов при дозах соединения В, равных 60, 100 и 200 мг/кг. Однако, никакого соответствующего увеличения содержания в плазме холестерина не наблюдалось. Таким образом, похоже, что увеличение содержания триглицеридов обязано метаболическому сдвигу в направлении утилизации жировых накоплений для удовлетворения энергетических потребностей. Кроме того, любое увеличение гликолиза при отсутствии кислород-требующего цикла потенциально генерирует триглицерид в качестве побочного продукта.Sprague Dawley rats were processed and samples were collected as described in Example 5. Analysis of blood samples showed that the methods of the invention resulted in a significant increase in plasma triglycerides at doses of compound B of 60, 100 and 200 mg / kg. However, no corresponding increase in plasma cholesterol was observed. Thus, it seems that the increase in triglycerides is due to a metabolic shift towards the utilization of fat accumulations to meet energy needs. In addition, any increase in glycolysis in the absence of an oxygen-demanding cycle potentially generates triglyceride as a by-product.

Различные модификации изобретения, в дополнение к тем, которые здесь показаны и описаны, будут очевидны специалистам в данной области. Имеется в виду, что такие модификации находятся в пределах объема Формулы изобретения.Various modifications of the invention, in addition to those shown and described herein, will be apparent to those skilled in the art. It is understood that such modifications are within the scope of the claims.

Все ссылки, приведенные здесь, вводятся во всей их полноте.All references cited herein are entered in their entirety.

Claims

1. A method of regulating fat metabolism or the process of fat metabolism in a subject by stabilizing the alpha subunit of a hypoxia-induced factor protein (HIFα), comprising administering to the subject an effective amount of a compound that inhibits HIF hydroxylase activity.

2. The method according to claim 1, characterized in that the HIF hydroxylase activity is a HIF prolyl hydroxylase activity.

3. The method according to claim 1, characterized in that the stabilizing effect is carried out in vitro.

4. The method according to claim 1, characterized in that the stabilizing effect is carried out in vivo.

5. The method according to claim 1, characterized in that the subject is selected from the group consisting of cells, tissue and organ.

6. The method according to claim 1, characterized in that the subject is an animal.

7. The method according to claim 1, characterized in that the subject is a mammal.

8. The method according to claim 1, characterized in that the subject is a person.

9. The method according to claim 1, characterized in that the fat metabolism process is selected from the group consisting of fat absorption, fat transport, fat accumulation, fat processing, fat synthesis and fat utilization.

10. The method according to claim 1, characterized in that HIFα is selected from the group consisting of HIF1α, HIF2α and HIF3α.

11. The method according to claim 2, characterized in that the prolyl hydroxylase is selected from the group consisting of EGLN1, EGLN2 and EGLN3.

12. A method of achieving fat homeostasis in a subject by stabilizing HIFα, comprising administering to the subject an effective amount of a compound that inhibits HIF hydroxylase activity.

13. A method of treating or preventing obesity in a subject by stabilizing HIFα, comprising administering to the subject an effective amount of a compound that inhibits HIF hydroxylase activity.

14. A method of controlling body weight in a subject by stabilizing HIFα, comprising administering to the subject an effective amount of a compound that inhibits HIF hydroxylase activity.

15. A method of reducing body fat in a subject by stabilizing HIFα, comprising administering to the subject an effective amount of a compound that inhibits HIF hydroxylase activity.

16. The method according to clause 15, wherein the body fat in the subject is visceral fat.

17. The method according to clause 15, wherein the body fat in the subject is abdominal fat.

18. A method of inducing weight loss in a subject by stabilizing HIFα, comprising administering to the subject an effective amount of a compound that inhibits HIF hydroxylase activity.

19. A method of increasing expression of a regulatory factor of fat in a subject by stabilizing HIFα, comprising administering to the subject an effective amount of a compound that inhibits HIF hydroxylase activity.

20. The method according to item 21, wherein the regulatory fat factor is selected from the group consisting of leptin, apolipoprotein A-IV, cytosolic acyl-CoA-thioesterase-1, binding protein of insulin-like growth factor (IGFBP-1), carnitine- acetyltransferase, PAI-1, DEC1 / Stra13 and PPAR-γ.

21. A method of reducing oxygen consumption in a subject by stabilizing HIFα, comprising administering to the subject an effective amount of a compound that inhibits HIF hydroxylase activity.

22. A method of inducing a metabolic shift in fat utilization in a subject by stabilizing HIFα, comprising administering to the subject an effective amount of a compound that inhibits HIF hydroxylase activity.

23. The method according to p. 22, characterized in that the induction of metabolic shift towards anaerobic metabolism by stabilizing HIFα in the subject.