RU2330885C2 - Method of production of live culture influenza virus vaccines - Google Patents
Method of production of live culture influenza virus vaccines Download PDFInfo
- Publication number
- RU2330885C2 RU2330885C2 RU2006110264/13A RU2006110264A RU2330885C2 RU 2330885 C2 RU2330885 C2 RU 2330885C2 RU 2006110264/13 A RU2006110264/13 A RU 2006110264/13A RU 2006110264 A RU2006110264 A RU 2006110264A RU 2330885 C2 RU2330885 C2 RU 2330885C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- influenza virus
- cells
- vaccine
- mdck
- virus
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 52
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 title claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 22
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 51
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 28
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 14
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 9
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 6
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims abstract description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims abstract description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 19
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 claims description 11
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 8
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 7
- 229940055729 papain Drugs 0.000 claims description 7
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 claims description 7
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims description 4
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 claims description 4
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims description 4
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 claims description 4
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 claims description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 3
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 abstract description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 3
- 230000003019 stabilising effect Effects 0.000 abstract 2
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 abstract 1
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 abstract 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 68
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 29
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 28
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 20
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 17
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 9
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 7
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 7
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 7
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 7
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 6
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 5
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 4
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 4
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000011265 semifinished product Substances 0.000 description 4
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 4
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 3
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 3
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 3
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000371980 Influenza B virus (B/Shanghai/361/2002) Species 0.000 description 2
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 2
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 2
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 229940031418 trivalent vaccine Drugs 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 208000031504 Asymptomatic Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- 241001500351 Influenzavirus A Species 0.000 description 1
- 241001500350 Influenzavirus B Species 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 208000020584 Polyploidy Diseases 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 208000037280 Trisomy Diseases 0.000 description 1
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 1
- 230000001894 hemadsorption Effects 0.000 description 1
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005088 multinucleated cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 230000036515 potency Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 229960000172 trivalent influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 210000001325 yolk sac Anatomy 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Изобретение относится к технологии получения живой гриппозной вакцины и может быть использовано в фармацевтической промышленности для производства вакцин и лечебно-профилактических препаратов.The invention relates to a technology for producing live influenza vaccine and can be used in the pharmaceutical industry for the production of vaccines and therapeutic drugs.
Во всем мире для защиты населения от гриппа производятся и применяются инактивированные, субъединичные формы гриппозных вакцин, приготовленные на куриных эмбрионах, которые при правильном применении могут защитить от гриппа 80% вакцинированных. Однако высокая стоимость таких препаратов, а также сложность производства и применения инактивированных вакцин затрудняют их использование для массовой профилактики гриппа. Несмотря на то что инактивированные вакцины формируют более высокий уровень общего гуморального иммунитета, эти препараты практически не способны индуцировать местный секреторный иммунитет. Эффективность инактивированной гриппозной вакцины резко снижается даже при небольших изменениях антигенной структуры эпидемического штамма по сравнению с вакцинным.All over the world, inactivated, subunit forms of influenza vaccines prepared on chicken embryos are produced and used to protect the population against influenza, which, when used correctly, can protect 80% of those vaccinated against influenza. However, the high cost of such drugs, as well as the complexity of the production and use of inactivated vaccines make it difficult to use them for mass prevention of influenza. Despite the fact that inactivated vaccines form a higher level of general humoral immunity, these drugs are practically not able to induce local secretory immunity. The effectiveness of an inactivated influenza vaccine decreases dramatically even with small changes in the antigenic structure of the epidemic strain compared with the vaccine.
В России широко применяется живая вакцина, стимулирующая при интраназальном применении развитие бессимптомной инфекции с формированием гуморального, секреторного и клеточного иммунитета и иммунологической памяти. Достаточно эффективные живые вакцины имеют определенные преимущества перед убитыми вакцинами по экономичности, простоте производства и применения, а также по большей широте иммунологического действия. С этими преимуществами связано усиление внимания в последнее время к разработке живой гриппозной вакцины и в США. Применяемые в настоящее время гриппозные вакцины нуждаются в ежегодной корректировке с учетом постоянно происходящих изменений в антигенном составе поверхностных гликопротеинов вируса. Каждый год возникает непрогнозируемая ситуация, когда за очень короткий отрезок времени необходимо произвести достаточное количество вакцины, обладающей адекватной эффективностью в отношении штаммов, которые вероятнее всего вызовут эпидемию гриппа.In Russia, a live vaccine is widely used that stimulates the development of asymptomatic infection with the formation of humoral, secretory and cellular immunity and immunological memory with intranasal administration. Sufficiently effective live vaccines have certain advantages over killed vaccines in terms of cost-effectiveness, ease of production and use, as well as a greater breadth of immunological effect. These benefits are associated with increased attention recently to the development of live influenza vaccine in the United States. Currently used influenza vaccines need to be adjusted annually, taking into account the constantly occurring changes in the antigenic composition of the surface glycoproteins of the virus. Every year, an unpredictable situation arises when in a very short period of time it is necessary to produce a sufficient amount of vaccine that is adequately effective against strains that are most likely to cause an influenza epidemic.
Живая гриппозная вакцина индуцирует широкий спектр антител, способных нейтрализовать варианты с изменившейся антигенной специфичностью гемагглютинина. Кроме того, живая вакцина является более экономичной, т.к. требует примерно в 10 раз меньше куриных эмбрионов для производства. Применение в производстве вакцины культуры клеток позволяет сделать вакцину еще более экономичной, а использование бессывороточной питательной среды полностью исключит аллергические реакции вакцинированных на белки куриных яиц.Live influenza vaccine induces a wide range of antibodies that can neutralize variants with altered antigenic specificity of hemagglutinin. In addition, a live vaccine is more economical because requires about 10 times less chicken embryos for production. The use of cell culture in the production of vaccines makes the vaccine even more economical, and the use of a serum-free culture medium completely eliminates the allergic reactions of eggs vaccinated on chicken proteins.
Предшествующий уровень техникиState of the art
Известен способ получения инактивированной вирусной вакцины, включающий культивирование штаммов вируса гриппа в куриных эмбрионах в течение 72-96 часов, инкубацию эмбрионов в течение ночи в холодильнике, последующий сбор аллантоисной жидкости, инактивацию вируса, очистку с помощью фильтрации и/или центрифугирования (Requirements For Inactivated Influenza Vaccine, World Health Organization Technical Report Series, 384 (1966).A known method of producing an inactivated viral vaccine, including culturing influenza virus strains in chicken embryos for 72-96 hours, incubating the embryos overnight in a refrigerator, collecting allantoic fluid, inactivating the virus, purifying by filtration and / or centrifugation (Requirements For Inactivated Influenza Vaccine, World Health Organization Technical Report Series, 384 (1966).
Недостатками данного способа являются содержание в вакцине определенных количеств белков куриных эмбрионов, которые вызывают неблагоприятные реакции у лиц с аллергией к этим белкам; изменение антигенной структуры вируса при культивировании в куриных эмбрионах за счет утраты определенных антигенных доменов; возможность контаминации посторонними вирусами; потребность (одномоментная) в большом количестве куриных эмбрионов при наработке вакцины. Для получения одной дозы вакцины требуется 1-2 куриных эмбриона, т.е. для наработки 1 млн доз гриппозной вакцины необходимо более 1 млн куриных эмбрионов. Кроме того, каждый куриный эмбрион представляет собой уникальную биологическую систему и тем самым предполагает наличие определенной нестабильности получаемого вакцинного препарата.The disadvantages of this method are the content in the vaccine of certain amounts of proteins of chicken embryos, which cause adverse reactions in individuals allergic to these proteins; a change in the antigenic structure of the virus during cultivation in chicken embryos due to the loss of certain antigenic domains; the possibility of contamination with extraneous viruses; the need (one-time) for a large number of chicken embryos during vaccine production. To receive a single dose of the vaccine, 1-2 chicken embryos are required, i.e. more than 1 million chicken embryos are needed to produce 1 million doses of influenza vaccine. In addition, each chicken embryo is a unique biological system and thus suggests a certain instability of the resulting vaccine preparation.
Известен другой способ получения живой вирусной вакцины (Фармакопейная статья Министерства здравоохранения России №42-3569-98 «Вакцина гриппозная аллантоисная живая интраназальная сухая для взрослых»), включающий заражение куриных эмбрионов вакцинными штаммами вируса гриппа, сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости, введение мясного пептона, розлив в ампулы, лиофилизацию и запайку. Готовый продукт представляет собой сухую пористую массу, обладающую запахом пептона.There is another way to obtain a live viral vaccine (Pharmacopoeia article of the Ministry of Health of Russia No. 42-3569-98 "Flu vaccine allantoic live intranasal dry for adults"), including infection of chicken embryos with vaccine strains of the influenza virus, collection of virus-containing allantoic fluid, introduction of meat peptone, bottling into ampoules, lyophilization and sealing. The finished product is a dry porous mass with the smell of peptone.
Однако очистка от балластных примесей в технологии не предусмотрена, что отрицательно сказывается на аллергологической безопасности вакцины. Кроме того, наблюдается изменение антигенной структуры вируса гриппа при культивировании в куриных эмбрионах, и не исключена контаминация вакцины ретровирусами и др. вирусами птиц, присутствующими в эмбрионах.However, purification from ballast impurities is not provided for in the technology, which adversely affects the allergological safety of the vaccine. In addition, there is a change in the antigenic structure of the influenza virus during cultivation in chicken embryos, and vaccine contamination with retroviruses and other avian viruses present in the embryos is not ruled out.
Известен другой способ (US 5698433, B1, 16.12.1997) получения инактивированной вакцины против гриппа, включающий культивирование штаммов вируса гриппа на агрегатах первичных клеток куриных эмбрионов в присутствии трипсина в лабораторном спиннере или двухлитровом ферментере, сбор вируссодержащей жидкости, ультрафильтрацию, цетрифугирование, инактивацию вируса и введение гидроокиси алюминия в качестве адъюванта. Технология проста в исполнении, позволяет получать большие объемы вируссодержащей жидкости с высоким титром активности вируса (выход с клеток, полученных из 4 куриных эмбрионов, составляет 400-500 мл вируссодержащей жидкости в течение 96 ч или 100 мл антигена, что в 14 раз выше, чем на куриных эмбрионах). Получаемая вакцина не содержит примеси белков куриных яиц.Another method is known (US 5698433, B1, 16.16.1997) for producing an inactivated influenza vaccine, including culturing influenza virus strains on primary cells of chicken embryos in the presence of trypsin in a laboratory spinner or two-liter fermenter, collecting virus-containing liquid, ultrafiltration, centrifugation, virus inactivation and the introduction of aluminum hydroxide as an adjuvant. The technology is simple to implement, it allows to obtain large volumes of virus-containing liquid with a high titer of virus activity (the output from cells obtained from 4 chicken embryos is 400-500 ml of virus-containing liquid for 96 hours or 100 ml of antigen, which is 14 times higher than on chicken embryos). The resulting vaccine does not contain chicken protein impurities.
Однако указанный способ обладает рядом недостатков: используется первичная культура клеток, не обладающая стандартными свойствами и недостаточно охарактеризованная; возможна контаминация культуры клеток и вакцины посторонними вирусами, микоплазмами, прионами; используется культура клеток куриных эмбрионов, следовательно, возможно изменение антигенной структуры штаммов вируса гриппа, что имеет место при культивировании на куриных эмбрионах.However, this method has several disadvantages: a primary cell culture is used that does not have standard properties and is not sufficiently characterized; contamination of cell culture and vaccine with extraneous viruses, mycoplasmas, prions is possible; cell culture of chicken embryos is used, therefore, it is possible to change the antigenic structure of strains of the influenza virus, which occurs during cultivation on chicken embryos.
Помимо указанных недостатков во всех известных технологиях производства гриппозных вакцин, в том числе в описанных выше аналогах, используют продукты животного происхождения (сыворотка крови крупного рогатого скота, трипсин, желатоза или человеческий сывороточный альбумин в качестве стабилизатора), что может привести как к аллергизации иммунизируемых, так и возможному заражению посторонними вирусами, микоплазмами, прионами, содержащимися в продуктах животных.In addition to these shortcomings, all known technologies for the production of influenza vaccines, including the analogues described above, use animal products (bovine serum, trypsin, gelatose or human serum albumin as a stabilizer), which can lead to allergenization of immunized, and possible infection with extraneous viruses, mycoplasmas, prions contained in animal products.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ получения инактивированных и живых гриппозных вакцин (US 6344354, B1, 05.02.2002), включающий культивирование высокопродуктивных штаммов вируса гриппа на аттестованных перевиваемых линиях клеток (Vero, MDCK) в питательной среде Игла MEM с добавлением 5-10% фетальной сыворотки и трипсина в количестве (0,05-1,0 мкг/мл), отмывку клеток после образования монослоя, введение бычьего сывороточного альбумина, сбор вируссодержащей жидкости, очистку с помощью центрифугирования или хроматографии и последующее введение хемотерапевтических компонентов, адъювантов или полимеров (полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль).The closest analogue (prototype) is a method for producing inactivated and live influenza vaccines (US 6344354, B1, 02/05/2002), including culturing highly productive strains of the influenza virus on certified transplantable cell lines (Vero, MDCK) in nutrient medium MEM Needle with the addition of 5- 10% fetal serum and trypsin in an amount (0.05-1.0 μg / ml), washing the cells after the formation of a monolayer, introducing bovine serum albumin, collecting virus-containing liquid, purification by centrifugation or chromatography and subsequent administration of chemotherapeutic components, adjuvants or polymers (polyethylene, polypropylene).
Недостатками данного способа-прототипа являются монослойное культивирование клеток в культуральных флаконах, что не может обеспечить наработку больших объемов вируссодержащей жидкости; использование для культивирования клеток питательной среды Игла MEM с добавлением 5-10% фетальной сыворотки, а также введение на стадии наработки вируса бычьего сывороточного альбумина, что приводит к внесению в вакцину компонентов сырья животного происхождения, которые могут являться источником посторонних вирусов, микоплазм, прионов, а также вызывать дополнительную аллергизацию иммунизируемого организма.The disadvantages of this prototype method are monolayer cell cultivation in culture bottles, which cannot ensure the production of large volumes of virus-containing fluid; the use of MEM Needle for the cultivation of cells of the nutrient medium with the addition of 5-10% fetal serum, as well as the introduction of bovine serum albumin virus at the stage of production, which leads to the introduction of components of animal feed that can be a source of extraneous viruses, mycoplasmas, prions, and also cause additional allergization of the immunized organism.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Техническим результатом предлагаемого способа является получение в промышленных масштабах живой культуральной трехвалентной гриппозной вакцины на основе вакцинных холодоадаптированных штаммов вируса гриппа А и В для интраназального и парентерального применения с более низким содержанием посторонних белковых компонентов животного происхождения, что снижает возможность аллергических реакций.The technical result of the proposed method is the production on an industrial scale of a live cultural trivalent influenza vaccine based on cold-adapted vaccine strains of influenza A and B virus for intranasal and parenteral administration with a lower content of extraneous protein components of animal origin, which reduces the possibility of allergic reactions.
Указанный результат достигается тем, что в способе получения живой гриппозной вакцины, включающем культивирование перевиваемых клеток MDCK в питательной среде, получение вируссодержащей субстанции путем культивирования вакцинных штаммов вируса гриппа в культуре клеток MDCK на этой же питательной среде, очистку вирусной субстанции от балластных примесей, введение в очищенную субстанцию стабилизирующих добавок и сушку готовой формы вакцины, согласно изобретению в качестве вирусных штаммов используют вакцинные холодоадаптированные реассортанты штаммов вирусов гриппа, в качестве питательной среды при культивировании клеток MDCK и штаммов вирусов гриппа на указанных клетках используют бессывороточную питательную среду с добавлением гидролизата сои в концентрации 0,01-10% и протеолитического фермента в количестве 0,25-50,0 мкг/мл до введения посевной дозы штаммов вирусов гриппа, а культивирование культур клеток MDCK и холодоадаптированных штаммов вируса гриппа в указанной культуре клеток осуществляют в суспензии на микроносителях, вносимых в бессывороточную питательную среду в концентрации 1-6 г/л.This result is achieved by the fact that in a method for producing a live influenza vaccine, comprising cultivating transplantable MDCK cells in a nutrient medium, obtaining a virus-containing substance by cultivating vaccine strains of the influenza virus in an MDCK cell culture on the same nutrient medium, purifying the viral substance from ballast impurities, introducing the purified substance of stabilizing additives and the drying of the finished vaccine form, according to the invention, cold-adapted vaccines reas are used as viral strains Orthants of influenza virus strains, as a nutrient medium in the cultivation of MDCK cells and influenza virus strains on these cells, use a serum-free culture medium with the addition of soy hydrolyzate in a concentration of 0.01-10% and a proteolytic enzyme in an amount of 0.25-50.0 μg / ml prior to the administration of a seed dose of influenza virus strains, and the cultivation of MDCK cell cultures and cold-adapted influenza virus strains in the indicated cell culture is carried out in suspension on microcarriers introduced into serum-free culture medium in concentration of 1-6 g / l.
В качестве культуры клеток MDCK используют культуру, заложенную на хранение при температуре жидкого азота в виде посевного и рабочего банков и аттестованную на отсутствие посторонних вирусов, отсутствие онкогенных потенций и видовую идентичность.As a culture of MDCK cells, a culture stored at liquid nitrogen temperature in the form of seed and working banks and certified for the absence of extraneous viruses, the absence of oncogenic potentials and species identity is used.
В качестве вакцинных холодоадаптированных реассортантов вируса гриппа используют вакцинные штаммы типа A/H3N2; A/H1N1 и типа В этого вируса.As vaccine cold-adapted reassortants of influenza virus, vaccine strains of type A / H3N2 are used; A / H1N1 and type B of this virus.
Посевная доза перевиваемых клеток MDCK составляет 100-600 тыс. клеток на 1 мл среды, а посевная доза вакцинных штаммов вируса гриппа имеет множественность заражения 0,01-0,0001 ЭИД50/кл.The seeding dose of transplanted MDCK cells is 100-600 thousand cells per 1 ml of medium, and the seeding dose of vaccine strains of influenza virus has a multiplicity of infection of 0.01-0.0001 EID 50 / CL.
В качестве протеолитического фермента используют протеолитический фермент растительного происхождения папаин, а в качестве микроносителя - Цитодекс 1.Papain is a proteolytic enzyme of plant origin as a proteolytic enzyme, and Cytodex 1 is used as a microcarrier.
Сбор вируссодержащей жидкости осуществляют после достижения специфической активности вируса гриппа не менее 8,0 lg ЭИД50/мл, а удаление балластных примесей из вирусной субстанции осуществляют фильтрованием.The collection of virus-containing fluid is carried out after the specific activity of the influenza virus is not less than 8.0 lg EID 50 / ml, and the removal of ballast impurities from the viral substance is carried out by filtration.
В качестве стабилизирующих добавок используют сахарозу и пептон из сои в конечной концентрации (5-10) и (3-8) мас.% соответственно.As stabilizing additives, sucrose and peptone from soybeans are used in a final concentration of (5-10) and (3-8) wt.%, Respectively.
Сушку вакцины осуществляют путем ее замораживания в течение 18 ч при температуре не выше минус 40°С с последующей лиофилизацией в течение 48 ч, причем перед запайкой ампулы с вирусной вакциной заполняют инертным газом, в частности аргоном.The vaccine is dried by freezing it for 18 hours at a temperature not exceeding minus 40 ° С followed by lyophilization for 48 hours, and before sealing, the ampoules with the viral vaccine are filled with an inert gas, in particular argon.
Вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины представляют собой реассортанты, получаемые в России на основе холодоадаптированных мутантов - доноров аттенуации А/Ленинград/134/47/57 (H2N2) и В/СССР/60/69. Эти доноры характеризуются холодоадаптированностью, т.е. способностью размножаться при пониженной температуре, температурочувствительностью и безвредностью для лабораторных животных и человека. Необходимым условием безвредности и генетической стабильности вакцинных штаммов считается наличие в составе их генома 5-6 мутантных генов, кодирующих внутренние белки донора аттенуации, при этом гены гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) всегда происходят от актуального эпидемического вируса.Vaccine strains of a live influenza vaccine are reassortants obtained in Russia on the basis of cold-adapted mutants - attenuation donors A / Leningrad / 134/47/57 (H2N2) and B / USSR / 60/69. These donors are characterized by cold adaptation, i.e. the ability to reproduce at low temperatures, temperature sensitivity and harmlessness for laboratory animals and humans. A necessary condition for the safety and genetic stability of vaccine strains is considered to be the presence of 5-6 mutant genes encoding the internal proteins of the attenuation donor in their genome, while the hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) genes always come from the current epidemic virus.
Штамм А/47/Шандон/93/1(H1N1) получен при скрещивании холодоадаптированного мастер-штамма А/Ленинград/134/47/57(H2N2) с эпидемическим штаммом А/Шандон/93/1(Н1N1).Strain A / 47 / Chandon / 93/1 (H1N1) was obtained by crossing the cold-adapted master strain A / Leningrad / 134/47/57 (H2N2) with the epidemic strain A / Chandon / 93/1 (H1N1).
Штамм вируса гриппа А/47/Иоганнесбург/94/2(Н3N2) получен при скрещивании холодоадаптированного мастер-штамма А/Ленинград/134/47/57(H2N2) с эпидемическим штаммом A/Иоганнесбург/94/2(H3N2).The influenza virus strain A / 47 / Johannesburg / 94/2 (H3N2) was obtained by crossing the cold-adapted master strain A / Leningrad / 134/47/57 (H2N2) with the epidemic strain A / Johannesburg / 94/2 (H3N2).
Штамм В/60/Петербург/95/20 получен при скрещивании холодоадаптированного мастер-штамма В/СССР/60/69 с эпидемическим штаммом В/Петербург/95/20.Strain B / 60 / Petersburg / 95/20 was obtained by crossing a cold-adapted master strain B / USSR / 60/69 with the epidemic strain B / Petersburg / 95/20.
Вакцинные штаммы вируса гриппа хранятся в Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биопрепаратов (ГИСК) им. Л.А.Тарасевича, г.Москва.Vaccine strains of the influenza virus are stored at the State Research Institute for Standardization and Control of Medical Biological Products (GISK) named after L.A. Tarasevich, Moscow.
Существенным преимуществом перевиваемых клеток является их стабильность, стандартность, возможность получения большого количества клеток-продуцентов в достаточно короткие сроки, долговременное использование клеток, относительно низкая стоимость вакцинных препаратов. Клеточные линии, аттестованные в соответствии с требованиями ВОЗ, свободны от контаминирующих агентов, в то время как куриные эмбрионы нередко содержат ретровирусы и некоторые другие агенты. При выращивании вирусов гриппа на перевиваемых линиях клеток, которые можно культивировать при использовании бессывороточных сред, исключается возможность аллергических реакций на вакцину у лиц с аллергией к компонентам клеток куриных эмбрионов и компонентам сыворотки, что также особенно важно при изготовлении живых гриппозных вакцин, которые не проходят такой тщательной очистки, как инактивированные гриппозные вакцины. Кроме того, гемагглютинин штаммов вируса гриппа человека, выделенных и культивируемых в куриных эмбрионах, может терять один из антигенных доменов, в то время как при выделении и культивировании вируса гриппа на линии клеток MDCK все антигенные домены сохраняются, и гемагглютинин таких изолятов антигенно полностью идентичен гемагглютинину вируса гриппа, размножающемуся в организме человека. Имеются также данные о том, что вакцины, приготовленные на клетках MDCK или Vero, лучше защищают вакцинированных животных от заражения вирулентными штаммами вируса гриппа, а также индуцируют более кросс-реактивные антитела, чем вакцины, полученные на куриных эмбрионах, которые больше стимулируют антитела, специфические к гомологичному антигену (Alymova I., Kodihalli S., Govorkova E. et al. Immunogenicity and protective efficacy in mice of influenza virus В vaccines grown in mammalian).A significant advantage of transplanted cells is their stability, standardization, the possibility of obtaining a large number of producer cells in a fairly short time, long-term use of cells, and the relatively low cost of vaccine preparations. WHO-certified cell lines are free of contaminating agents, while chicken embryos often contain retroviruses and some other agents. When growing influenza viruses on transplantable cell lines that can be cultured using serum-free media, the possibility of allergic reactions to the vaccine in people with allergies to the components of chicken embryo cells and components of the serum is excluded, which is also especially important in the manufacture of live influenza vaccines that do not pass such thorough cleaning like inactivated flu vaccines. In addition, the hemagglutinin of human influenza virus strains isolated and cultured in chicken embryos may lose one of the antigenic domains, while the isolation and cultivation of the influenza virus on the MDCK cell line preserves all antigenic domains, and the hemagglutinin of such isolates is antigenically completely identical to hemagglutinin influenza virus that multiplies in the human body. There is also evidence that vaccines prepared on MDCK or Vero cells better protect vaccinated animals from infection with virulent strains of the influenza virus, and also induce more cross-reactive antibodies than vaccines obtained on chicken embryos, which stimulate antibodies specific for to the homologous antigen (Alymova I., Kodihalli S., Govorkova E. et al. Immunogenicity and protective efficacy in mice of influenza virus B vaccines grown in mammalian).
Среди клеточных линий, потенциально пригодных для производства гриппозных вакцин, исследовались, главным образом, линия клеток MDCK, происходящая из клеток почек собаки, и линия клеток Vero, полученная из клеток почки африканской зеленой мартышки. В сравнительных опытах (Merten О., Managuerra J., Hannoun С. et al. Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation. In: Novel Strategies in Design and Production of Vaccines. Eds. Cohen S., Shafferman A., Plenum Press, N.-Y., 1996, pp. 141-150) было показано, что клетки MDCK продуцируют одинаковое количество клеток в 2 раза быстрее, чем клетки Vero, и в 7 раз быстрее, чем клетки ВНК. Что касается продукции гемагглютинина, то общее количество оказалось примерно одинаковым в клетках MDCK и Vero, однако в клетках MDCK это количество образуется на 6-й день после заражения, а в клетках Vero - на 14-й.Among cell lines potentially suitable for the production of influenza vaccines, mainly the MDCK cell line derived from dog kidney cells and the Vero cell line derived from African green monkey kidney cells were examined. In comparative experiments (Merten O., Managuerra J., Hannoun C. et al. Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation. In: Novel Strategies in Design and Production of Vaccines. Eds. Cohen S., Shafferman A., Plenum Press, N.-Y., 1996, pp. 141-150), it was shown that MDCK cells produce the same number of cells 2 times faster than Vero cells and 7 times faster than BHK cells. As for the production of hemagglutinin, the total amount was approximately the same in MDCK and Vero cells, however, in MDCK cells this amount was formed on the 6th day after infection, and in Vero cells on the 14th.
Гидролизат сои получают путем частичного гидролиза соевого изолята Maisol (Германия) в 0,1 нормальном растворе соляной кислоты при двух избыточных атмосферах в автоклаве. Гидролизат из сои в указанных концентрациях является дополнительным питательным компонентом для культур клеток MDCK.Soy hydrolyzate is obtained by partial hydrolysis of Maisol soy isolate (Germany) in a 0.1 normal solution of hydrochloric acid under two excess atmospheres in an autoclave. The soy hydrolyzate at the indicated concentrations is an additional nutritional component for MDCK cell cultures.
Папаин - растительный протеолитический фермент класса гидролаз - проявляет широкую субстратную специфичность и производится фирмой ICN, США. Папаин обеспечивает в питательной среде в указанных концентрациях гарантированное проникновение вируса гриппа в клетки MDCK в процессе их инфицирования указанным вирусом.Papain, a plant proteolytic enzyme of the hydrolase class, exhibits broad substrate specificity and is manufactured by ICN, USA. Papain provides in a nutrient medium at the indicated concentrations the guaranteed penetration of the influenza virus into MDCK cells during their infection with the indicated virus.
Микроносители обеспечивают в указанных концентрациях более высокую наработку клеток и вируса и больший выход вируссодержащего материала. В процессе экспериментальных исследований подобраны именно микроносители Цитодекс 1 фирмы Sigma размером 1 мм, на поверхности которых формируются устойчивые монослои клеток MDCK, которые способны продуцировать вирус гриппа, не теряя своих физиологических функций.Microcarriers provide at the indicated concentrations higher production of cells and virus and a higher yield of virus-containing material. In the course of experimental studies, it was precisely Sigma Cytodex 1 microcarriers that were selected that were 1 mm in size, on the surface of which stable monolayers of MDCK cells are formed, which are capable of producing the influenza virus without losing their physiological functions.
Бессывороточная питательная среда MDSS2 производится фирмой Axcevir, Франция.The serum-free nutrient medium MDSS2 is manufactured by Axcevir, France.
Варианты осуществления изобретенияEmbodiments of the invention
Ниже приведены примеры конкретного выполнения способа получения живой культуральной гриппозной вакцины.The following are examples of a specific implementation of the method for producing a live culture influenza vaccine.
Пример №1. Аттестация культуры клеток MDCKExample No. 1. Certification of cell culture MDCK
Для работы используют культуру клеток MDCK из посевного и рабочего банков. Аттестацию культуры клеток MDCK проводят в соответствии с требованиями ВОЗ к перевиваемым линиям клеток.For work using a culture of MDCK cells from the seed and working banks. Certification of cell culture MDCK carried out in accordance with the requirements of the WHO for transplantable cell lines.
Исследована цитоморфология культуры в нативных и фиксированных препаратах в световом микроскопе. Показано, что культура клеток MDCK состоит из эпителиоподобных клеток. Ядра округлые с хроматиновой зернистостью. Ядрышки округлые, от одного до нескольких в ядре. Цитоплазма зернистая. Имеются гигантские и многоядерные клетки, количество которых увеличивается в процессе культивирования. Клетки образуют монослой на 2 сутки культивирования, в то же время отмечается пик митотической активности, патологические митозы не наблюдаются.The cytomorphology of culture in native and fixed preparations in a light microscope was studied. It was shown that the MDCK cell culture consists of epithelial-like cells. The nuclei are rounded with chromatin grit. Nuclei rounded, from one to several in the nucleus. The cytoplasm is granular. There are giant and multinucleated cells, the number of which increases during cultivation. Cells form a monolayer on the 2nd day of cultivation, at the same time, a peak in mitotic activity is noted, pathological mitoses are not observed.
При проведении контроля культуральной жидкости методом посева на тиогликолевую среду установлено, что посевной и рабочий банки клеток MDCK обладают стерильностью.During the control of the culture fluid by the method of seeding on a thioglycol medium, it was found that the seed and working banks of MDCK cells are sterile.
Методом прямого посева культуральной жидкости посевного и рабочего банков клеток MDCK на селективные питательные среды и методом окраски ДНК интеркалирующими флюорохромами микоплазма не обнаружена. Для системы ПЦР-анализа использовали две пары праймеров (GPO-1 и MGSO- для первого цикла; GPO-2 и MGSO- для второго цикла), которые позволяют выявить все известные виды микоплазм. Методом ПЦР-анализа микоплазма не обнаружена.Mycoplasma was not detected by direct inoculation of the culture fluid of the inoculum and working banks of MDCK cells on selective nutrient media and by DNA staining with intercalating fluorochromes. For the PCR analysis system, two pairs of primers were used (GPO-1 and MGSO-for the first cycle; GPO-2 and MGSO-for the second cycle), which make it possible to identify all known types of mycoplasmas. Mycoplasma was not detected by PCR analysis.
Проведен контроль на выявление посторонних вирусов в культуре клеток, на куриных эмбрионах и на животных. При контроле посевного и рабочего банков на культуре клеток исследовали состояние монослоя интактных клеток посевного и рабочего банка в течение 14 суток. Цитопатического действия (ЦПД) не обнаружено. По истечении этого срока пробы культуральной жидкости исследовали в реакции гемагглютинации, а монослой в реакции гемадсорбции с эритроцитами морских свинок. Реакции отрицательные. Пробы культуральной жидкости исследовали в трех видах клеточных культур: MDCK (гомологичной), Л-68 (диплоидная культура), Vero, в течение 14 суток. ЦПД не обнаружено. По истечении этого срока пробы культуральной жидкости исследовали в реакции гемагглютинации, а монослой - в реакции гемадсорбции с эритроцитами морской свинки. Реакции отрицательные. В посевном и рабочем банках линии MDCK цитопатогенных, гемадсорбирующих и гемагглютинирующих вирусов не обнаружено.A control was conducted to detect foreign viruses in cell culture, chicken embryos and animals. During the control of the inoculum and working banks on the cell culture, the state of the monolayer of intact cells of the inoculating and working banks was studied for 14 days. No cytopathic effect (CPP) was found. After this period, samples of the culture fluid were examined in a hemagglutination reaction, and the monolayer in the hemadsor sion reaction with guinea pig erythrocytes. The reactions are negative. Culture fluid samples were examined in three types of cell cultures: MDCK (homologous), L-68 (diploid culture), Vero, for 14 days. No CPC detected. After this period, samples of the culture fluid were examined in a hemagglutination reaction, and the monolayer was studied in a hemadsorption reaction with guinea pig erythrocytes. The reactions are negative. In the seed and working banks of the MDCK line, no cytopathogenic, hemadsorbing and hemagglutinating viruses were detected.
При контроле посевного и рабочего банков на куриных эмбрионах исследуемый материал в количестве 106 клеток вводили в желточный мешок, аллантоисную полость и на хорионаллантоисную оболочку куриных эмбрионов (по 10 эмбрионов на точку), эмбрионы инкубировали в течение 7-10 сут, после чего определяли жизнеспособность эмбрионов и ставили реакцию гемагглютинации с аллантоисной жидкостью. В посевном и рабочем банках линии MDCK посторонних вирусов не обнаружено.To control the seed and working banks on chicken embryos, the studied material in the amount of 10 6 cells was introduced into the yolk sac, allantoic cavity and the chorionallantoic membrane of chicken embryos (10 embryos per point), the embryos were incubated for 7-10 days, after which the viability was determined embryos and put a hemagglutination reaction with allantoic fluid. No foreign viruses were detected in the seed and working banks of the MDCK line.
При контроле посевного и рабочего банков на лабораторных животных исследуемый материал внутримышечно вводили мышам-сосункам в возрасте 24 ч (28 голов мышей-сосунков, 107 клеток на группу), взрослым мышам (10 голов, 107 клеток на группу мышей), морским свинкам (5 голов, 107 клеток на группу), кроликам (5 голов, 107 клеток на группу животных), за животными проводили наблюдение в течение 28 дней, после чего проводили автоназию и осмотр внутренних органов. Все животные в эксперименте были живы, изменений внутренних органов не отмечено. Посторонних вирусов в посевном и рабочем банках клеток MDCK не обнаружено.To control the seed and working banks in laboratory animals, the studied material was intramuscularly administered to sucker mice at the age of 24 hours (28 heads of sucker mice, 10 7 cells per group), adult mice (10 goals, 10 7 cells per group of mice), and guinea pigs (5 animals, 10 7 cells per group), rabbits (5 animals, 10 7 cells per animal group), the animals were monitored for 28 days, after which autonasia and internal organs were examined. All animals in the experiment were alive, no changes in internal organs were noted. No extraneous viruses were found in the seed and working banks of MDCK cells.
Онкогенные потенции клеток посевного и рабочего банков определяли в системе in vivo. При контроле использовали метод гетеротрансплантации клеток иммуносупрессивным животным в сравнительных опытах с эталонной клеточной линией Hela, вызывающей прогрессирующий рост опухолей. За животными наблюдали в течение 21 суток. При этом все животные были живы, при макроскопическом исследовании на наличие опухоли в лимфатических узлах, печени, почках, легких и в месте введения клеток патологические изменения не выявлены. При контроле в системе in vivo установлено, что клетки MDCK посевного и рабочего банков онкогенными потенциями не обладают.The oncogenic potencies of the cells of the seed and working banks were determined in vivo. In the control, the method of heterotransplantation of cells to immunosuppressive animals was used in comparative experiments with the Hela reference cell line, which causes progressive tumor growth. The animals were observed for 21 days. In this case, all animals were alive, with a macroscopic examination for the presence of a tumor in the lymph nodes, liver, kidneys, lungs and at the injection site, pathological changes were not detected. When monitoring in vivo, it was found that the MDCK cells of the seed and working banks do not possess oncogenic potentials.
Проведен контроль видовой идентичности клеток линии MDCK методом кариологического анализа и методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле для определения изоферментов. При кариологическом анализе клеток линии MDCK установлено, что кариотип представляет собой производную от нормального кариотипа собаки, Canis familiaris, 2n=78. Клетки MDCK характеризуются присутствием нормальных (не перестроенных) аутосом, по некоторым аутосомам отмечена трисомия (пары 29, 30, 38). Одна из Х хромосом также не перестроена. Кроме того, клетки MDCK характеризуются присутствием маркерных хромосом, образованных в результате разнообразных транслокаций участков хромосом (предположительно X, 3, 4, 21, 23, 24, 28). Очевидных полиплоидов не отмечено. Клетки посевного и рабочего банков MDCK имеют достаточно стабильный кариотип, характеризующийся четкими морфологическими признаками. Проведен анализ электрофоретической подвижности изофермента Г-6-ФДГ. Клетки MDCK посевного и рабочего банков имеют Г-6-ФДГ, характерные для клеток собаки.The species identity of MDCK line cells was verified by karyological analysis and polyacrylamide gel electrophoresis to determine isoenzymes. A karyological analysis of MDCK cells revealed that the karyotype is a derivative of the normal dog karyotype, Canis familiaris, 2n = 78. MDCK cells are characterized by the presence of normal (not rearranged) autosomes; trisomy is noted for some autosomes (pairs 29, 30, 38). One of the X chromosomes is also not rearranged. In addition, MDCK cells are characterized by the presence of marker chromosomes resulting from a variety of translocations of chromosome regions (presumably X, 3, 4, 21, 23, 24, 28). No obvious polyploids were noted. The cells of the seed and working banks of MDCK have a fairly stable karyotype, characterized by clear morphological characteristics. An analysis of the electrophoretic mobility of the G-6-FDG isoenzyme was carried out. The MDCK cells of the seed and worker banks have G-6-FDG characteristic of dog cells.
Пример №2. Приготовление субстанции живой культуральной гриппозной вакцины (ЖГВ)Example No. 2. Preparation of the Substance of Live Culture Influenza Vaccine (VHF)
Культуральный сосуд 1- или 10-литрового ферментера заполняют бессывороточной питательной средой. Аттестованную культуру клеток MDCK (в соответствии с примером 1) берут из банка коллекции культур клеток ГНЦ ВБ «Вектор» и вносят ее в указанный культуральный сосуд из расчета 100-600 тыс. клеток на мл питательной среды. Дополнительно в культуральный сосуд вносят микроноситель Цитодекс I в концентрации 1-6 г/л. Осаждение клеток на микроносителе проводят 12 часов при температуре 35-37°С (объем заполнения культурального сосуда - 25-30%). Режим посадки клеток: 5 мин перемешивание, 10 мин перерыв. Заданные параметры культивирования: частота вращения перемешивающего устройства 50-80 об/мин, аэрация поверхностная со скоростью продува от 0 до 10 л/ч. Водородный показатель рН поддерживают в пределах от 6,9 до 7,2 с помощью дозированной подачи 7,5%-ного раствора углекислого натрия. Температура культивирования 35-37°С. Перфузию питательной среды начинают при концентрации клеток 600-900 тыс./мл. Скорость перфузии зависит от концентрации клеток. Время культивирования клеток - 96-144 часов. После наработки клеток удаляют 50% среды, в суспензию вносят один из вакцинных холодоадаптированных реассортантов вируса гриппа, например А/47/Иоганнесбург/94/2 (H3N2), с множественностью заражения 0,01-0,0001 ЭИД50/кл, и поддерживающую бессывороточную питательную среду, содержащую протеолитический фермент папаин в количестве 0,25-50,0 мкг/мл или трипсин в количестве 2,0-20,0 мкг/мл и гидролизат сои в концентрации 0,01-10%. Далее культивируют вирус при температуре (34±1)°С. При появлении цитопатического действия вируса на клетки (2-5 суток) осуществляют сбор вируссодержащей жидкости со специфической активностью не менее 8,0 lg ЭИД50/мл, которую освобождают фильтрованием от клеточного детрита. В вируссодержащую суспензию добавляют стерильный раствор стабилизатора (сахароза и пептон из сои в конечной концентрации 10% и 5% соответственно) для получения жидкого полуфабриката штамма А/47/Иоганнесбург/94/2 (H3N2) живой гриппозной вакцины (ЖГВ).A culture vessel of a 1- or 10-liter fermenter is filled with serum-free culture medium. A certified MDCK cell culture (in accordance with Example 1) is taken from the collection cell bank of the State Scientific Center of the WB “Vector” and introduced into the indicated culture vessel at the rate of 100-600 thousand cells per ml of culture medium. Additionally, the microcarrier Cytodex I is introduced into the culture vessel at a concentration of 1-6 g / l. Cell deposition on a microcarrier is carried out for 12 hours at a temperature of 35-37 ° C (the filling volume of the culture vessel is 25-30%). Cell planting mode: 5 min stirring, 10 min break. The specified cultivation parameters: the stirring device rotational speed of 50-80 rpm, surface aeration with a blowing rate from 0 to 10 l / h. The pH is maintained between 6.9 and 7.2 with a dosed supply of a 7.5% sodium carbonate solution. The cultivation temperature is 35-37 ° C. Culture medium perfusion is started at a cell concentration of 600-900 thousand / ml. The perfusion rate depends on the concentration of cells. The cell cultivation time is 96-144 hours. After the accumulation of the cells, 50% of the medium is removed, one of the vaccine cold-adapted reassortants of the influenza virus, for example A / 47 / Johannesburg / 94/2 (H3N2), with a multiplicity of infection of 0.01-0.0001 EID 50 / cell, and supporting serum-free culture medium containing the proteolytic enzyme papain in an amount of 0.25-50.0 μg / ml or trypsin in an amount of 2.0-20.0 μg / ml and a soy hydrolyzate in a concentration of 0.01-10%. Then the virus is cultured at a temperature of (34 ± 1) ° C. When the cytopathic effect of the virus on the cells appears (2-5 days), a virus-containing liquid is collected with a specific activity of at least 8.0 lg EID 50 / ml, which is released by filtration from cellular detritus. A sterile stabilizer solution (sucrose and peptone from soybeans at a final concentration of 10% and 5%, respectively) is added to the virus-containing suspension to obtain a liquid semi-finished product of strain A / 47 / Johannesburg / 94/2 (H3N2) of live influenza vaccine (GHF).
Таким же образом, параллельно или последовательно, нарабатывают жидкий полуфабрикат вакцинных штаммов холодоадаптированных реассортантов вируса гриппа А/47/Шандон/93/1 (H1N1) и В/60/Петербург/95/20.In the same way, in parallel or sequentially, a liquid semi-finished product of vaccine strains of cold-adapted reassortants of the influenza virus A / 47 / Chandon / 93/1 (H1N1) and B / 60 / Petersburg / 95/20 is produced.
Примечание: ЭИД - эмбриональная инфекционная доза.Note: EID is an embryonic infectious dose.
Пример №3. Получение готовой формы ЖГВExample No. 3. Obtaining the finished form of ZhGV
Для получения трехвалентной вакцины перед розливом жидкие полуфабрикаты, полученные из вируссодержащей жидкости вакцинных штаммов А/47/Иоганнесбург/94/2 (H3N2), А/47/Шандон/93/1 (H1N1) и В/60/Петербург/95/20 вируса гриппа, объединяют в равных пропорциях. Для получения моновакцины используют жидкий полуфабрикат одного из выше приведенных штаммов вируса гриппа. Полученную жидкую форму вакцины разливают в ампулы по 0,6 мл в каждую и замораживают при температуре не выше минус 40°С в течение 18 ч. Продукт лиофильно высушивают в течение 48 ч в стерильных условиях. После окончания сушки ампулы заполняют инертным газом (аргоном) и запаивают.To obtain a trivalent vaccine before bottling, liquid semi-finished products obtained from the virus-containing liquid of vaccine strains A / 47 / Johannesburg / 94/2 (H3N2), A / 47 / Chandon / 93/1 (H1N1) and B / 60 / Petersburg / 95/20 influenza virus, are combined in equal proportions. To obtain a single vaccine, a liquid semi-finished product of one of the above strains of the influenza virus is used. The resulting liquid form of the vaccine is poured into ampoules of 0.6 ml each and frozen at a temperature not exceeding minus 40 ° C for 18 hours. The product is freeze-dried for 48 hours under sterile conditions. After drying, the ampoules are filled with an inert gas (argon) and sealed.
Пример №4. Определение специфической активности препаратов живой гриппозной вакциныExample No. 4. Determination of the specific activity of live influenza vaccine preparations
Специфическую активность вируссодержащего материала определяют в моновакцинах до сведения в трехвалентную вакцину, полученных одновременно с тривакциной, путем титрования на куриных эмбрионах по методике, изложенной в Методических указаниях «Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям». МУК 4.1/4.2.588-96. Специфическая активность вакцины после лиофилизации составляет не менее 6,0-6,5 lg ЭИД50/0,2мл.The specific activity of the virus-containing material is determined in monovaccines to the information in the trivalent vaccine obtained simultaneously with the trivaccine, by titration on chicken embryos according to the method described in the Methodological guidelines “Methods of control of medical immunobiological drugs administered to people”. MUK 4.1 / 4.2.588-96. The specific activity of the vaccine after lyophilization is not less than 6.0-6.5 lg EID 50 / 0.2 ml.
Пример №5. Изучение динамики размножения вируса гриппа при разной множественности заражения на примере штамма А/47/Шандон/93/1 (H1N1) вируса гриппаExample No. 5. The study of the dynamics of the multiplication of influenza virus with different multiplicity of infection on the example of strain A / 47 / Chandon / 93/1 (H1N1) of the influenza virus
Культуру клеток MDCK заражают штаммом А/47/Шандон/93/1 (H1N1) вируса гриппа при разной множественности заражения (0,001; 0,005, 0,0005 и 0,0001 ЭИД50/кл) и культивируют в среде Игла MEM или в бессывороточной среде в присутствии 1-6 мкг/мл трипсина. При множественности заражения 0,005 и 0,001 ЭИД50/кл максимальный титр вируса при использовании среды Игла MEM (при использовании в составе ростовой среды для посадки клеток 5% фетальной сыворотки) достигается уже на 2-3 сутки, а в случае бессывороточной среды - только на 3-4 сутки, но титры были выше на 1-1,5 lg (Таблица 1). Уменьшение множественности до 0,0005 ЭИД50/кл приводит к сдвигу максимальных титров еще на 1 сутки (для штамма А/47/Шандон/93/1 (H1N1) при использовании сыворотки для посадки клеток максимальный титр был на 4-е сутки и составлял 1010,5 ЭИД50/мл, при использовании бессывороточной среды - на 5-е сутки, титр равен 109,5 ЭИД50/мл). Дальнейшее уменьшение множественности инфекции не способствует увеличению инфекционных титров в течение 5 суток эксперимента.An MDCK cell culture is infected with influenza strain A / 47 / Chandon / 93/1 (H1N1) at different infection rates (0.001; 0.005, 0.0005 and 0.0001 EID 50 / cell) and cultured in MEM needle or serum-free medium in the presence of 1-6 μg / ml trypsin. With a multiplicity of infection of 0.005 and 0.001 EID 50 / cell, the maximum titer of the virus when using the Needle MEM medium (when using 5% fetal serum as a part of the growth medium for planting cells) is reached already for 2-3 days, and in the case of serum-free medium - only by 3 -4 days, but the titers were higher by 1-1.5 lg (table 1). A decrease in the multiplicity to 0.0005 EID 50 / cell leads to a shift in the maximum titers by 1 day (for strain A / 47 / Chandon / 93/1 (H1N1) when using serum for planting cells, the maximum titer was on the 4th day and amounted to 10 10.5 EID 50 / ml, when using serum-free medium on the 5th day, the titer is 10 9.5 EID 50 / ml). A further decrease in the multiplicity of infection does not contribute to an increase in infectious titers within 5 days of the experiment.
Пример №6. Изучение стабильности ts- 40 и са+ 25 генетических признаковExample No. 6. The study of the stability of ts - 40 and ca + 25 genetic traits
У всех трех холодоадаптированных штаммов вируса гриппа изучали стабильность ts- 40 (неспособность размножаться при 40°С) и са+ 25 (способность к размножению при 25°С) генетических признаков в течение 5 пассажей в монослойных культурах клеток MDCK при 34°С в присутствии 1-6 мкг/мл трипсина. Проверку этих признаков осуществляли путем параллельного титрования на куриных эмбрионах штаммов вируса гриппа после каждого из пяти пассажей на культуре клеток MDCK. Варианты, полученные после 5 пассажей в клетках MDCK, сохраняли высокую репродуктивность в куриных эмбрионах при оптимальной температуре (34°С), а также бляшкообразующую способность в системе клеток MDCK, свойственную исходным штаммам. Все три штамма на всех пассажах, включая пятый, сохранили способность размножаться при 25°С, т.е. са+ 25 признак, и не размножались при 40°С, т.е. сохранили ts- 40 признак (Таблица 2).The stability of ts - 40 (inability to reproduce at 40 ° C) and ca + 25 (ability to reproduce at 25 ° C) genetic traits for 5 passages in monolayer MDCK cell cultures at 34 ° C in the presence of all three cold-adapted strains of the influenza virus were studied 1-6 μg / ml trypsin. Verification of these signs was carried out by parallel titration on chicken embryos of influenza virus strains after each of the five passages on an MDCK cell culture. The variants obtained after 5 passages in MDCK cells retained high reproductive performance in chicken embryos at the optimum temperature (34 ° C), as well as plaque-forming ability in the MDCK cell system, which is characteristic of the initial strains. All three strains in all passages, including the fifth, retained the ability to reproduce at 25 ° C, i.e. CA + 25 sign, and did not breed at 40 ° C, i.e. saved ts - 40 sign (Table 2).
Пример №7. Изучение влияния фермента папаина на культивирование холодоадаптированных вакцинных штаммов вируса гриппаExample No. 7. Study of the influence of the papain enzyme on the cultivation of cold-adapted vaccine strains of influenza virus
С целью замены компонентов животного происхождения в технологии получения живой гриппозной вакцины на препараты растительного происхождения проведены исследования по использованию фермента папаин растительного происхождения при наработке штаммов вируса гриппа. Для этого в поддерживающую среду, используемую при культивировании штаммов вируса гриппа, добавляют папаин. Данные приведены в таблице 3.In order to replace the components of animal origin in the technology for producing live influenza vaccine with herbal preparations, studies have been carried out on the use of the enzyme papain of plant origin in the production of influenza virus strains. To do this, papain is added to the support medium used in the cultivation of influenza virus strains. The data are shown in table 3.
Анализ таблицы 3 показывает, что при концентрации папаина в поддерживающей среде, равной 0,25-20,0 мкг/мл, титр вируса гриппа на 3-4 сутки культивирования составлял 7,3- 8,5 lg ЭИД50/мл, в то время как в контрольном эксперименте (без введения фермента в поддерживающую среду) титр вируса гриппа был равен 6,5-6,7 lg ЭИД50/мл, что подтверждает эффективность действия указанного фермента.The analysis of table 3 shows that at a concentration of papain in a support medium of 0.25-20.0 μg / ml, the titer of the influenza virus for 3-4 days of cultivation was 7.3-8.5 lg EID 50 / ml, while while in the control experiment (without introducing the enzyme into the supporting medium) the titer of the influenza virus was 6.5-6.7 lg EID 50 / ml, which confirms the effectiveness of this enzyme.
Claims (7)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006110264/13A RU2330885C2 (en) | 2003-06-18 | 2003-06-18 | Method of production of live culture influenza virus vaccines |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006110264/13A RU2330885C2 (en) | 2003-06-18 | 2003-06-18 | Method of production of live culture influenza virus vaccines |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2006110264A RU2006110264A (en) | 2007-10-10 |
| RU2330885C2 true RU2330885C2 (en) | 2008-08-10 |
Family
ID=38952536
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006110264/13A RU2330885C2 (en) | 2003-06-18 | 2003-06-18 | Method of production of live culture influenza virus vaccines |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2330885C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2617051C1 (en) * | 2016-05-04 | 2017-04-19 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | Method of obtaining microencapsulated forms of live culture vaccine against seasonal and pandemic influenza for intranasal use |
-
2003
- 2003-06-18 RU RU2006110264/13A patent/RU2330885C2/en not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2617051C1 (en) * | 2016-05-04 | 2017-04-19 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | Method of obtaining microencapsulated forms of live culture vaccine against seasonal and pandemic influenza for intranasal use |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2006110264A (en) | 2007-10-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2352638T3 (en) | ANIMAL CELLS AND REPLICATION PROCEDURES OF THE VIRUS OF THE FLU. | |
| ES2367081T3 (en) | PROCEDURE FOR THE REPLICATION OF VIRUSES OF THE FLU IN CELL CULTURE AND THE VIRUSES OF THE FLU THAT CAN BE OBTAINED BY THE PROCEDURE. | |
| KR100968141B1 (en) | Methods of Proliferation of Viruses in Cell Cultures | |
| ES2367833T3 (en) | PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF AN ACTIVE COMPONENT OF A DRUG OR AGENT OF DIAGNOSIS IN CULTURE IN SUSPENSION OF MDCK CELLS. | |
| WO2004110484A1 (en) | Method for producing a live tissue-cultural vaccine against influenza virus | |
| RU2420314C1 (en) | Method of obtaining life culture vaccine against influenza virus | |
| BRPI0914805B1 (en) | method for replicating viruses in a scldk cell culture, process for adapting substrate-dependent cldk cells for suspension development, method for continuously propagating suspended scldk cells, and, composition | |
| RU2330885C2 (en) | Method of production of live culture influenza virus vaccines | |
| CN1617882B (en) | Method of isolation and purification of trypsin from pronase protease and use thereof | |
| SU1317021A1 (en) | Manъs embryo skin and muscle diploid cells strain used for cultivating viruses | |
| Yokoo et al. | Effect of cytolytic infection on maintenance of resistance to HVJ (Sendai virus) in an altered BHK cell culture | |
| Nechaeva et al. | Development of Pilot Technology for Cell-Based Anti-Influenza Live Attenuated Pandemic Vaccine Manufacturing | |
| Nechaeva et al. | Development and Production of New Live Measles Vaccine Based on Human Embryo Lung Diploid Cell Culture L-68 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180619 |