RU2321631C2 - Non-infectious for human adenovirus as vector for substitution genetic therapy of angiogenesis disorder providing effective synthesis of human angiogenin in mammalian transfected cells, method for angiogenesis induction, method for treatment of ischemic disease, composition for induction of angiogenesis and treatment of ischemic disease - Google Patents
Non-infectious for human adenovirus as vector for substitution genetic therapy of angiogenesis disorder providing effective synthesis of human angiogenin in mammalian transfected cells, method for angiogenesis induction, method for treatment of ischemic disease, composition for induction of angiogenesis and treatment of ischemic disease Download PDFInfo
- Publication number
- RU2321631C2 RU2321631C2 RU2005119667/13A RU2005119667A RU2321631C2 RU 2321631 C2 RU2321631 C2 RU 2321631C2 RU 2005119667/13 A RU2005119667/13 A RU 2005119667/13A RU 2005119667 A RU2005119667 A RU 2005119667A RU 2321631 C2 RU2321631 C2 RU 2321631C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- angiogenesis
- induction
- ischemic disease
- adenovirus
- treatment
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и может быть использовано в медицине для лечения кардиоваскулярных заболеваний.The invention relates to biotechnology, genetic engineering and can be used in medicine for the treatment of cardiovascular diseases.
Хронические облитерирующие заболевания сосудов являются одними из самых угрожающих здоровью людей в мире. Ишемические заболевания миокарда и нижних конечностей представляют, таким образом, серьезную медицинскую проблему, решение которой в настоящее время видят в улучшении кровоснабжения путем терапевтического ангиогенеза, т.е. в индукции развития дополнительной сети сосудов.Chronic obliterating vascular disease is one of the most threatening human health in the world. Coronary diseases of the myocardium and lower extremities are thus a serious medical problem, the solution of which is currently seen as improving blood supply through therapeutic angiogenesis, i.e. in the induction of the development of an additional network of vessels.
Ангиогенез - неоваскуляризация, развитие сети новых сосудов, процесс образования новых кровеносных сосудов - может быть индуцирован воздействием большого количества факторов прямого и непрямого действия.Angiogenesis - neovascularization, the development of a network of new vessels, the process of formation of new blood vessels - can be induced by the action of a large number of factors of direct and indirect action.
К факторам прямого действия относится ряд белков, среди них фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), плацентарный фактор роста (PlGF), фактор роста гепатоцитов (HGF), щелочной и кислый факторы роста фибробластов (FGF), ангиогенин и др. К непрямым индукторам относятся трансформирующий фактор роста (TGF), фактор некроза опухолей (TNF) и др. [Strydom D.J. The angiogenins. Cell.Mol.Life Sci., 1998, v.54, pp.811-824].Factors of direct action include a number of proteins, including vascular endothelial growth factor (VEGF), placental growth factor (PlGF), hepatocyte growth factor (HGF), alkaline and acidic fibroblast growth factors (FGF), angiogenin, etc. Indirect inducers include transforming growth factor (TGF), tumor necrosis factor (TNF), etc. [Strydom DJ The angiogenins. Cell. Mol. Life Sci., 1998, v. 54, pp. 811-824].
Одним из самых сильных ангиогенных факторов прямого действия является ангиогенин. Ангиогенин был обнаружен и очищен исключительно по его способности индуцировать неоваскуляризацию. При этом ангиогенин, по-видимому, оказывает свое действие на многих этапах сложного процесса ангиогенеза: он вызывает пролиферацию эндотелиальных клеток, инвазию эндотелиальных клеток в матрикс, стимулирует протеолитическую активность этих клеток и клеточную адгезию [Badet J. Angiogenin, a potent mediator of angiogenesis. Biological, biochemical and structural properties. Path.Biol, 1999, v.47, pp.345-351].One of the strongest angiogenic factors of direct action is angiogenin. Angiogenin was discovered and purified solely by its ability to induce neovascularization. Moreover, angiogenin, apparently, exerts its effect at many stages of the complex process of angiogenesis: it causes proliferation of endothelial cells, invasion of endothelial cells into the matrix, stimulates the proteolytic activity of these cells and cell adhesion [Badet J. Angiogenin, a potent mediator of angiogenesis. Biological, biochemical and structural properties. Path. Biol, 1999, v. 47, pp. 345-351].
Известны способы индукции ангиогенеза в тканях взрослых организмов путем введения генетических конструкций на основе аденовирусов человека, несущих ген фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) [Rajagopalan S., Shah M., Luciano A., Crystal R., Nabel E.G. Adenovirus-mediated gene transfer of VEGF(121) improves lower-extremity endothelial function and flow reserve. Circulation, 2001, v.107, pp.753-755], факторов роста фибробластов (FGF) [Shigematsu H. Adenovirus-mediated ex vivo gene transfer of basic fibroblast growth factor promotes collateral development in rabbit model of hind limb ischemia. Gene Ther., 2001, v.8, pp.837-845]. Они были испытаны на многих моделях, некоторые из них и на человеке [Zhang D., Gai L., Fan R., Dong W., Wen Y. Efficacy and safety of therapeutic angiogenesis from direct myocardial administration of an adenoviral vector expressing vascular endothelial growth factor 165. Clin. Med.J., 2002, v.115, pp.643-648]. При этом эффективность терапевтического эффекта во многих случаях остается незначительной. В первую очередь это связано с наличием у всех людей предсуществующего иммунитета к аденовирусам человека, которые использовались как векторы. Мощный иммунный ответ быстро нейтрализует вводимые конструкции [Harvey B.-G., Hackett N.R., El-Sawy T. et al. Variability of human systemic humoral responses to adenovirus gene transfer vectors administrated to different organs. J.Virol, 1999, v.73, pp.6729-6742], что снижает терапевтический эффект.Known methods for the induction of angiogenesis in the tissues of adult organisms by introducing genetic constructs based on human adenoviruses carrying the gene for vascular endothelial growth factor (VEGF) [Rajagopalan S., Shah M., Luciano A., Crystal R., Nabel E.G. Adenovirus-mediated gene transfer of VEGF (121) improves lower-extremity endothelial function and flow reserve. Circulation, 2001, v. 107, pp. 753-755], fibroblast growth factors (FGF) [Shigematsu H. Adenovirus-mediated ex vivo gene transfer of basic fibroblast growth factor promotes collateral development in rabbit model of hind limb ischemia. Gene Ther., 2001, v. 8, pp. 837-845]. They have been tested on many models, some of them on humans [Zhang D., Gai L., Fan R., Dong W., Wen Y. Efficacy and safety of therapeutic angiogenesis from direct myocardial administration of an adenoviral vector expressing vascular endothelial growth factor 165. Clin. Med. J., 2002, v. 115, pp.643-648]. Moreover, the effectiveness of the therapeutic effect in many cases remains negligible. This is primarily due to the presence in all people of preexisting immunity to human adenoviruses, which were used as vectors. A powerful immune response quickly neutralizes the administered constructs [Harvey B.-G., Hackett N.R., El-Sawy T. et al. Variability of human systemic humoral responses to adenovirus gene transfer vectors administrated to different organs. J. Virol, 1999, v.73, pp.6729-6742], which reduces the therapeutic effect.
Таким образом, важным является создание новых векторов, для которых бы этот фактор отсутствовал. Для этого возможно использование в качестве векторов вирусов, которые присущи организмам, не относящимся к приматам. Таким вектором могли бы служить аденовирусы птиц, к которым у людей нет предсуществующего иммунного ответа и получение которых в препаративных количествах экономически существенно выгоднее. Последнее обстоятельство связано с тем, что аденовирусы птиц возможно размножать на дешевых куриных эмбрионах, а не в культивируемых клетках человека, как это осуществляется в случае аденовирусов человека.Thus, it is important to create new vectors for which this factor would be absent. To do this, you can use as vectors viruses that are inherent in organisms that are not related to primates. Bird adenoviruses, to which humans do not have a preexisting immune response, and the preparation of which in preparative amounts is economically much more profitable, could serve as such a vector. The latter circumstance is related to the fact that bird adenoviruses can be propagated on cheap chicken embryos, and not in cultured human cells, as is the case with human adenoviruses.
Таким образом, создание новых эффективных и стабильных генетических конструкций, кодирующих различные ангиогенные факторы, способных к экспрессии при введении их человеку, является важной задачей.Thus, the creation of new effective and stable genetic constructs encoding various angiogenic factors capable of expression when introduced into humans is an important task.
Техническим результатом, достигнутым при реализации настоящего изобретения, является получение на основе неинфекционного для человека аденовируса птиц CELO рекомбинантного аденовируса CELOAng, кодирующего ангиогенин человека и обеспечивающего длительную индукцию ангиогенеза в организме животных и человека, а также возможность лечения ишемической болезни с использованием полученного рекомбинантного вируса. Важным преимуществом этой векторной системы является отсутствие предсуществующего иммунного ответа в организме человека и неспособность к репликации в клетках млекопитающих (включая человека). Преимущество рекомбинантного вируса, сконструированного на основе аденовируса птиц, перед рекомбинантами, создаваемыми на основе аденовирусов человека, заключается также в том, что аденовирус птиц CELO способен расти в куриных эмбрионах. При заражении в дозе 107 БОЕ/эмбрион урожай вируса составляет 109-1010 БОЕ из одного эмбриона.The technical result achieved by the implementation of the present invention is the production of recombinant CELOAng recombinant adenovirus CELO based on non-infectious human adenovirus CELO encoding human angiogenin and providing long-term induction of angiogenesis in animals and humans, as well as the possibility of treating ischemic disease using the obtained recombinant virus. An important advantage of this vector system is the lack of a preexisting immune response in humans and the inability to replicate in mammalian cells (including humans). The advantage of recombinant virus constructed on the basis of avian adenovirus over recombinants created on the basis of human adenoviruses also lies in the fact that CELO bird adenovirus can grow in chicken embryos. When infected at a dose of 10 7 PFU / embryo, the virus yield is 10 9 -10 10 PFU from one embryo.
Указанный технический результат достигается тем, что полученный рекомбинантный аденовирус CELOAng в сайте делеции, несущественной для репликации вируса области (от 95,3 до 99,7 ед. карты), содержит экспрессирующую кассету, состоящую из промотора ранней области цитомегаловируса, кДНК гена ангиогенина и сигнала полиаденилирования гормона роста быка.The specified technical result is achieved by the fact that the obtained recombinant adenovirus CELOAng at the deletion site, which is not essential for the replication of the region virus (from 95.3 to 99.7 map units), contains an expression cassette consisting of a promoter of the early region of cytomegalovirus, cDNA of the angiogenin gene and signal polyadenylation of bovine growth hormone.
Для получения рекомбинантного аденовируса использовали метод гомологичной рекомбинации в культуре клеток. Предварительно кДНК гена ангиогенина была вырезана из плазмиды pAng3 с помощью рестриктаз Nhe I и Sma I и клонирована в плазмиде pCBEdlRV по сайтам Nhel и EcoRV. Плазмида pCBEdlRV несет фрагмент генома аденовируса CELO от 88,8 до 100 ед. карты, и в сайте делеции, несущественной для репликации вируса области (от 95,3 до 99,7 ед. карты) находится экспрессирующая кассета (промотор ранней области цитомегаловируса, полилинкер и сигнал полиаденилирования гена гормона роста быка). Сконструированную плазмиду pS415Ang использовали для получения рекомбинантного аденовируса в результате котрансфекции методом кальциево-фосфатной преципитации клеток линии LHM (гепатома кур) с фрагментом генома вируса CELO от 0 до 99,7 ед. карты (данный фрагмент образуется после рестрикции ДНК аденовируса CELO рестриктазой Swal). Процесс рекомбинации гомологичных участков геномной и плазмидной ДНК в клетках приводил к генерации рекомбинантного вируса CELOAng, содержащего ген ангиогенина под контролем промотора цитомегаловируса (CMV) в области делеции "несущественного" участка генома аденовируса. Во избежание возможной контаминации рекомбинантного аденовируса вирусом CELO дикого типа проводили очистку методом повторного получения индивидуальных аденовирусных бляшек на культуре клеток LHM.To obtain recombinant adenovirus, the method of homologous recombination in cell culture was used. Previously, the angiogenin gene cDNA was excised from the pAng3 plasmid using restriction enzymes Nhe I and Sma I and cloned into the pCBEdlRV plasmid at the Nhel and EcoRV sites. Plasmid pCBEdlRV carries a fragment of the CELO adenovirus genome from 88.8 to 100 units. of the card, and in the deletion site, which is not essential for virus region replication (from 95.3 to 99.7 card units), there is an expression cassette (promoter of the early cytomegalovirus region, polylinker and signal of polyadenylation of the gene for growth hormone bull). The constructed plasmid pS415Ang was used to obtain recombinant adenovirus as a result of cotransfection by calcium phosphate precipitation of LHM cells (chicken hepatoma) with a CELO virus genome fragment from 0 to 99.7 units. maps (this fragment is formed after restriction of the DNA of the adenovirus CELO with the restriction enzyme Swal). The process of recombination of homologous regions of genomic and plasmid DNA in cells led to the generation of a recombinant virus CELOAng containing the angiogenin gene under the control of the cytomegalovirus (CMV) promoter in the region of deletion of the "non-essential" section of the adenovirus genome. In order to avoid possible contamination of the recombinant adenovirus with wild-type CELO virus, purification was performed by re-obtaining individual adenovirus plaques in LHM cell culture.
Накопление рекомбинантного аденовируса CELOAng осуществляли в куриных эмбрионах, очистку и концентрирование аденовируса проводили по модифицированному методу Green.The accumulation of recombinant adenovirus CELOAng was carried out in chicken embryos, purification and concentration of adenovirus was carried out according to the modified Green method.
Указанный технический результат достигается также тем, что в способе индукции ангиогенеза, включающем введение в живой организм млекопитающего фактора индукции ангиогенеза, отличительной особенностью является то, что для введения используют рекомбинантный аденовирус CELOAng.The specified technical result is also achieved by the fact that in the method of inducing angiogenesis, which includes introducing the angiogenesis induction factor into a living organism of a mammal, a distinctive feature is that the recombinant CELOAng adenovirus is used for administration.
Достигается указанный технический результат также тем, что в способе лечения ишемической болезни, включающем введение в организм фактора индукции ангиогенеза, отличительной особенностью является то, что в качестве такового используют рекомбинантный аденовирус CELOAng.This technical result is also achieved by the fact that in the method of treating ischemic disease, including the introduction of an angiogenesis induction factor into the body, a distinctive feature is that recombinant CELOAng adenovirus is used as such.
Целесообразно вводить 3×109-3×1010 БОЕ рекомбинантного аденовируса CELOAng в виде раствора в физиологически приемлемом растворителе трехкратно с интервалом 3 дня.It is advisable to enter 3 × 10 9 -3 × 10 10 PFU of recombinant CELOAng adenovirus in the form of a solution in a physiologically acceptable solvent three times with an interval of 3 days.
Указанный технический результат достигается также тем, что в композиции для индукции ангиогенеза и лечения ишемической болезни, содержащей фактор индукции ангиогенеза и растворитель, в качестве фактора индукции ангиогенеза она содержит рекомбинантный аденовирус CELOAng, а в качестве растворителя - физиологически приемлемый растворитель.The specified technical result is also achieved by the fact that in the composition for the induction of angiogenesis and treatment of ischemic disease containing the angiogenesis induction factor and the solvent, it contains the recombinant adenovirus CELOAng as the angiogenesis induction factor, and a physiologically acceptable solvent as the solvent.
На чертеже приведен геном рекомбинантного аденовируса птиц CELOAng.The drawing shows the genome of the recombinant avian adenovirus CELOAng.
Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.The following are examples illustrating the invention.
Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pS415Ang.Example 1. Construction of recombinant plasmid DNA pS415Ang.
2 мкг плазмидной ДНК pAng3 обрабатывают рестриктазами (по 10 ед) Nhe I и Sma I в буфере Y+/Tango (Fermentas), содержащем 10 мМ Tris-HCl (pH 7.4), 100 мМ KCl, 1 мМ MDTT, 1 мМ EDTA, 0,2 мг BSA, 50% glycerol, и из полученного гидролизата выделяют с помощью электрофореза в 1% агарозном геле фрагмент для вставки, содержащий ген ангиогенина (около 0,8 т.п.о.).2 μg of pAng3 plasmid DNA is treated with restriction enzymes (10 units each) of Nhe I and Sma I in Y + / Tango buffer (Fermentas) containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM KCl, 1 mM MDTT, 1 mM EDTA, 0.2 mg BSA, 50% glycerol, and an insert fragment containing an angiogenin gene (about 0.8 kb) was isolated from the resulting hydrolyzate by electrophoresis on a 1% agarose gel.
5 мкг плазмидной ДНК pCBEdlRV обрабатывают рестриктазами (по 10 ед) Nhe I и EcoRV в буфере Multicor (Promega), содержащем 10 мМ Tris-HCl (pH 7.5), 100 мМ KCl, 1 мМ MDTT, 1 мМ EDTA, 0,2 мг BSA, 50% glycerol, и из полученного гидролизата выделяют с помощью электрофореза в 1% агарозном геле векторную часть плазмиды (около 7 т.п.о.).5 μg of plasmid DNA pCBEdlRV is treated with restriction enzymes (10 units each) of Nhe I and EcoRV in Multicor buffer (Promega) containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM KCl, 1 mM MDTT, 1 mM EDTA, 0.2 mg BSA, 50% glycerol, and the vector portion of the plasmid (about 7 kb) is isolated from the resulting hydrolyzate by electrophoresis on a 1% agarose gel.
0,5 мкг полученного вектора лигируют с 0,1 мкг фрагмента для вставки, содержащего ген ангиогенина в 20 мкл лигазного буфера, содержащего 50 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 10 мМ MgCl2, 1 мМ MDTT, 5 мМ дитиотриена, 0,1 мг АТР в присутствии 10 ед. ДНК-лигазы фага Т4.0.5 μg of the resulting vector is ligated with 0.1 μg of the insert fragment containing the angiogenin gene in 20 μl of ligase buffer containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , 1 mM MDTT, 5 mM dithiotriene , 0.1 mg of ATP in the presence of 10 units. Phage T4 DNA ligases.
2 мкл лигазной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е.coli штамм DH5α. Трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Из выросших клонов выделяют плазмидную ДНК pS415Ang и анализируют рестрикционным анализом при помощи эндонуклеаз BamHI и BstEII, а также при помощи эндонуклеазы EcoRI.2 μl of the ligase mixture is used to transform competent E. coli cells strain DH5α. Transformants are plated on LB agar containing 100 μg / ml ampicillin. PS415Ang plasmid DNA was isolated from grown clones and analyzed by restriction analysis using BamHI and BstEII endonucleases, as well as with EcoRI endonuclease.
Пример 2. Конструирование рекомбинантного аденовируса CELOAng.Example 2. Construction of recombinant adenovirus CELOAng.
10 мкг плазмидной конструкции pS415Ang используют для котрансфекции клеток линии LMH совместно с 10 мкг фрагмента генома вируса CELO от 0 до 99.7 ед. карты. Этот фрагмент получают из ДНК вируса CELO после ее гидролиза рестриктазой Swa I.10 μg of the plasmid construct pS415Ang is used for cotransfection of LMH cell lines together with 10 μg of a fragment of the CELO virus genome from 0 to 99.7 units. cards. This fragment is obtained from the DNA of the CELO virus after its hydrolysis with restriction enzyme Swa I.
Трансфекцию проводили методом кальциево-фосфатной преципитации по Graham. Клетки линии LMH рассеивали за 24 часа до трансфекции. Кальциево-фосфатный преципитат получали, смешивая 1 × HEBS буфер (5 г/л HEPES, 8 г/л NaCl, 0,37 г/л KCl, 0,125 г/л Na2HPO4 × 2H2О, 1 г/л глюкозы рН 7,1) с 20 мкг/мл препаратов ДНК. К полученной смеси по каплям добавляли 2,5 М CaCl2 (50 мкл/мл), перемешивали, инкубировали смесь при комнатной температуре 30 мин и полученный преципитат вносили в культуральную среду из расчета 1 мл преципитата на 10 мл среды. После инкубации в СО2-инкубаторе в течение 4,5 часов среду заменяли на покрытие с 0,5%-ной агарозой.Transfection was carried out by the method of calcium phosphate precipitation according to Graham. LMH cell lines were scattered 24 hours before transfection. Calcium phosphate precipitate was prepared by mixing 1 × HEBS buffer (5 g / L HEPES, 8 g / L NaCl, 0.37 g / L KCl, 0.125 g / L Na 2 HPO 4 × 2H 2 O, 1 g / L glucose pH 7.1) with 20 μg / ml DNA preparations. 2.5 M CaCl 2 (50 μl / ml) was added dropwise to the resulting mixture, stirred, the mixture was incubated at room temperature for 30 minutes, and the resulting precipitate was added to the culture medium at the rate of 1 ml of precipitate per 10 ml of medium. After incubation in a CO 2 incubator for 4.5 hours, the medium was replaced with a coating with 0.5% agarose.
Процесс рекомбинации гомологичных участков геномной и плазмидной ДНК в клетках приводит к генерации рекомбинантного вируса CELOAng, содержащего ген Ang под контролем промотора цитомегаловируса (ЦМВ) в области делеции "несущественного" участка генома. Бляшки рекомбинантного аденовируса CELOAng, которые появлялись на 13 день после трансфекции, отбирали пастеровской пипеткой и полученный вирусный материал размножали на клетках линии LMH.The process of recombination of homologous regions of genomic and plasmid DNA in cells leads to the generation of a recombinant CELOAng virus containing the Ang gene under the control of the cytomegalovirus (CMV) promoter in the region of deletion of the "non-essential" part of the genome. Plaques of the recombinant CELOAng adenovirus that appeared 13 days after transfection were selected with a Pasteur pipette and the resulting viral material was propagated on LMH cells.
Возможную контаминацию препаратов CELOAng вирусом CELO дикого типа устраняют проведением очистки методом повторного получения индивидуальных вирусных бляшек на культуре клеток LMH. Отсутствие контаминации очищенных препаратов CELOAng доказывают проведением анализа при помощи ПЦР с использованием двух пар праймеров: первая пара комплиментарна участку гена Ang, вторая пара - участку делетированного (по EcoRV) фрагмента генома CELO.The possible contamination of CELOAng preparations with the wild-type CELO virus is eliminated by purification by re-obtaining individual viral plaques on an LMH cell culture. The absence of contamination of purified CELOAng preparations is proved by PCR analysis using two pairs of primers: the first pair is complementary to the Ang gene region, the second pair to the deleted region (according to EcoRV) of the CELO genome fragment.
Пример 3. Тестирование ангиогенной активности рекомбинантного аденовируса. CELOAng на экспериментальной модели.Example 3. Testing of the angiogenic activity of recombinant adenovirus. CELOAng on an experimental model.
Использованы крысы-самцы линии Вистар весом 200-250 г.Male Wistar rats weighing 200-250 g were used.
Животным давали эфирный наркоз, после чего на задней конечности в области передней большеберцовой мышци делали разрез кожи 4-5 мм длиной и под визуальным контролем в 3-4 инъекции вводили в М. tibialis anterior 3×109 БОЕ аденовируса CELOAng (опытная группа) или CELO/SEAP (контрольная группа). Инъекции повторяли дважды с интервалом 3 дня, через 7 дней после последней инъекции животных выводили из эксперимента. Затем осуществляли забор передней тибиальной мышцы исследуемой конечности крысы. Для контроля возможного системного действия плазмид осуществляли забор тканей печени, почек и селезенки. Для гистологического исследования материал фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине и заключали в парафин.The animals were given ether anesthesia, after which a 4–5 mm long skin incision was made in the hind limb in the anterior tibial muscle and, under visual control, 3-4 injections were injected into M. tibialis anterior 3 × 10 9 PFU of CELOAng adenovirus (experimental group) or CELO / SEAP (control group). Injections were repeated twice with an interval of 3 days, 7 days after the last injection, the animals were withdrawn from the experiment. Then, the front tibial muscle of the studied limb of the rat was taken. To control the possible systemic action of plasmids, liver, kidney, and spleen tissues were taken. For histological examination, the material was fixed in 10% neutral formalin and embedded in paraffin.
Из исследуемой мышцы от каждой крысы получали 3 блока. Парафиновые срезы мышц окрашивали азокармином по Гейденгайну. В каждой из образцов при увеличении в 280 раз производили подсчет капилляров в 30-ти полях зрения. Полученные данные обрабатывали методом вариационной статистики с использованием критерия Фишера-Стьюдента.From the studied muscle, 3 blocks were obtained from each rat. Paraffin sections of the muscles were stained with Heidengain azocarmine. In each of the samples, with an increase of 280 times, capillaries were counted in 30 fields of view. The data obtained were processed by the method of variation statistics using the Fisher-Student test.
Результат представлен в табл. 1.The result is presented in table. one.
Таким образом, при трехкратном с интервалом 3 дня введении в переднюю большеберцовую мышцу (М. tibialis anterior) крыс по 3×109 бляшкообразующих единиц аденовируса CELOAng наблюдается статистически достоверное повышение числа капилляров в одном поле зрения мышечной ткани.Thus, with 3 × 10 9 rats plaque-forming units of CELOAng adenovirus rats injected three times at 3 days each into the anterior tibial muscle (M. tibialis anterior) muscle, a statistically significant increase in the number of capillaries in one field of view of muscle tissue is observed.
Пример 4. Клиническая апробация метода в отделении хирургии сосудов Российского научного центра хирургии РАМН.Example 4. Clinical testing of the method in the Department of Vascular Surgery of the Russian Scientific Center for Surgery RAMS.
В исследование включено 9 пациентов (8 мужчин, 1 женщина) в возрасте от 42 до 70 лет. Этиологией заболевания в 8 случаях был атеросклероз (в т.ч. в 1 случае в сочетании с сахарным диабетом) и в 1 случае - артериит. Патология артериального сосудистого русла у данных пациентов характеризовалась преимущественно дистальными формами поражения, т.е. выраженными окклюзионно-стенотическими поражениями подколенно-тибиального сегмента в сочетании с отсутствием гемодинамически значимых поражений сосудов аорто-подвздошно-бедренного сегмента. Данные варианты поражения были неблагоприятны для выполнения прямых реконструктивных сосудистых операций. На момент поступления в клинику дистанция безболевой ходьбы пациентов составляла от 40 до 100 метров, у пациентов имелись минимальные трофические изменения. Пациентам вводился рекомбинантный вирус CELOAng путем прямых внутримышечных инъекций в тибиальную группу мышц пораженной конечности трехкратно в равных дозах (3×1010 БОЕ аденовируса) с интервалом 3 дня.The study included 9 patients (8 men, 1 woman) aged 42 to 70 years. The etiology of the disease in 8 cases was atherosclerosis (including in 1 case in combination with diabetes mellitus) and in 1 case - arteritis. The pathology of the arterial vascular bed in these patients was characterized mainly by distal forms of damage, i.e. pronounced occlusal-stenotic lesions of the popliteal-tibial segment in combination with the absence of hemodynamically significant lesions of the vessels of the aorto-iliac-femoral segment. These lesions were unfavorable for direct reconstructive vascular surgery. At the time of admission to the clinic, the distance of painless walking of patients ranged from 40 to 100 meters, patients had minimal trophic changes. Recombinant CELOAng virus was injected into patients by direct intramuscular injection into the tibial muscle group of the affected limb three times in equal doses (3 × 10 10 PFU of adenovirus) with an interval of 3 days.
Отдаленные результаты применения метода в клинике изучены у 7 больных в сроки от 6 до 22 месяцев. Эффективность лечения оценивалась по клиническим критериям (жалобы, дистанция безболевой ходьбы, наличие трофических расстройств), а также с использованием ультразвуковых и радиоизотопных методов. У всех пациентов с явлениями хронической ишемии после введения генно-инженерных конструкций наблюдался положительный эффект, выражающийся в увеличении дистанции безболевой ходьбы до 200-1000 м, заживлении имеющихся трофических дефектов. По данным ультразвукового исследования отмечалось увеличение лодыжечно-плечевого индекса давления, а также увеличение перфузии мышц нижних конечностей по данным радиоизотопных методов исследования. Сохранность конечностей в указанные сроки составила 100%. Каких-либо побочных эффектов (за исключением субфебрильной температуры в первые 2 дня после введения препарата) не наблюдалось.The long-term results of applying the method in the clinic were studied in 7 patients in the period from 6 to 22 months. The effectiveness of treatment was evaluated according to clinical criteria (complaints, distance of painless walking, the presence of trophic disorders), as well as using ultrasound and radioisotope methods. In all patients with chronic ischemia, after the introduction of genetic engineering structures, a positive effect was observed, expressed in an increase in the distance of painless walking to 200-1000 m, healing of existing trophic defects. According to ultrasound data, an increase in the ankle-brachial pressure index was noted, as well as an increase in perfusion of the muscles of the lower extremities according to radioisotope research methods. The safety of the limbs in the specified time amounted to 100%. There were no side effects (with the exception of subfebrile temperature in the first 2 days after administration of the drug).
Таким образом, на основе неифекционного для человека аденовируса птиц CELO получен рекомбинантный аденовирус CELOAng, кодирующий ангиогенин человека и обеспечивающий эффективную индукцию ангиогенеза. Новый рекомбинантный аденовирус CELOAng позволяет эффективно лечить ишемическую болезнь.Thus, on the basis of non-infectious CELO bird adenovirus for humans, a recombinant CELOAng adenovirus was obtained that encodes human angiogenin and provides effective induction of angiogenesis. The new recombinant adenovirus CELOAng allows you to effectively treat ischemic disease.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005119667/13A RU2321631C2 (en) | 2005-06-24 | 2005-06-24 | Non-infectious for human adenovirus as vector for substitution genetic therapy of angiogenesis disorder providing effective synthesis of human angiogenin in mammalian transfected cells, method for angiogenesis induction, method for treatment of ischemic disease, composition for induction of angiogenesis and treatment of ischemic disease |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005119667/13A RU2321631C2 (en) | 2005-06-24 | 2005-06-24 | Non-infectious for human adenovirus as vector for substitution genetic therapy of angiogenesis disorder providing effective synthesis of human angiogenin in mammalian transfected cells, method for angiogenesis induction, method for treatment of ischemic disease, composition for induction of angiogenesis and treatment of ischemic disease |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2005119667A RU2005119667A (en) | 2006-12-27 |
| RU2321631C2 true RU2321631C2 (en) | 2008-04-10 |
Family
ID=37759514
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005119667/13A RU2321631C2 (en) | 2005-06-24 | 2005-06-24 | Non-infectious for human adenovirus as vector for substitution genetic therapy of angiogenesis disorder providing effective synthesis of human angiogenin in mammalian transfected cells, method for angiogenesis induction, method for treatment of ischemic disease, composition for induction of angiogenesis and treatment of ischemic disease |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2321631C2 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| MXPA99006993A (en) * | 1997-01-29 | 2005-06-01 | Cornell Res Foundation Inc | Multiple site delivery of adenoviral vector for the induction of angiogenesis. |
-
2005
- 2005-06-24 RU RU2005119667/13A patent/RU2321631C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| MXPA99006993A (en) * | 1997-01-29 | 2005-06-01 | Cornell Res Foundation Inc | Multiple site delivery of adenoviral vector for the induction of angiogenesis. |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BENEST A.V., SALMON A.H., WANG W., GLOVER C.P., UNEY J., HARPER S.J., BATES D.O. VEGF and angiopoietin-1 stimulate different angiogenic phenotypes that combine to enhance functional neovascularization in adult tissue. Microcirculation. 2006 Sep;13(6):423-37. * |
| CHEN S.L., ZHANG B.R., MEI J., XU Z.Y., ZHU J.L., CAI K.H., HUANG S.D., LIU Y.L. Induction of angiogenesis in ischemic myocardium by adenovirus mediated angiopoietin-1 gene transfer, an experimental study. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2003 Apr 25; 83(8):637-40. Chinese. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2005119667A (en) | 2006-12-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2147553T5 (en) | RECOMBINANT VIRAL VECTORS FOR EXPRESSION IN MUSCLE CELLS. | |
| CN100569297C (en) | Gene transfer-mediated angiogenesis therapy | |
| KR100403707B1 (en) | Recombinant Adenovirus Encoding Gliacell-Induced Neuronal Factors (GDNF) | |
| US6685934B1 (en) | Recombinant adenoviruses coding for basic fibroblast growth factors (BFGF) | |
| JP2004313198A (en) | Adenovirus-mediated gene transfer into myocardial and vascular smooth muscle | |
| JP2007527395A (en) | Bone marrow-derived cells and medium injection method for angiogenesis | |
| Tirney et al. | Nitric oxide synthase gene therapy for erectile dysfunction: comparison of plasmid, adenovirus, and adenovirus-transduced myoblast vectors | |
| DE60035035T2 (en) | INJECTION OF AUTOLOGOUS BONE MARROW IN THE HEART MUSCLES | |
| US20040224409A1 (en) | Recombinant adenoviruses coding for brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | |
| EA005157B1 (en) | Techniques and compositions for treating heart failure and ventricular remodeling by in vivo delivery of angiogenic transgenes | |
| US20090305977A1 (en) | Method for treating peripheral arterial disease with zinc finger proteins | |
| Vasquez et al. | Replication-Deficient Adenovirus Vector Transfer ofgfpReporter Gene into Supraoptic Nucleus and Subfornical Organ Neurons | |
| RU2321631C2 (en) | Non-infectious for human adenovirus as vector for substitution genetic therapy of angiogenesis disorder providing effective synthesis of human angiogenin in mammalian transfected cells, method for angiogenesis induction, method for treatment of ischemic disease, composition for induction of angiogenesis and treatment of ischemic disease | |
| KR20190015153A (en) | Pharmaceutical composition for preventing or treating vascular diseases comprising mesenchymal stem cell expressing hepatocyte growth factor | |
| CN110769861A (en) | Methods of treating ischemic tissue | |
| US6743623B2 (en) | Viral recombinant vectors for expression in muscle cells | |
| JP4554940B2 (en) | Medicament containing mesenchymal cells derived from human placenta and method for producing VEGF using the cells | |
| AU2001280060A1 (en) | Nucleic acid constructs, vascular cells transformed therewith, pharmaceutical compositions and methods utilizing same for inducing angiogenesis | |
| IL112993A (en) | Recombinant viruses, their preparation and their use in gene therapy | |
| KR20190050277A (en) | Pharmaceutical composition for treating or preventing ischemic cardiovascular disease | |
| KR100765496B1 (en) | Recombinant adenovirus comprising DNA sequence encoding EGF-like domain peptide of hiregulin beta 1 and pharmaceutical composition for neuronal differentiation and regeneration comprising the same | |
| AU703793B2 (en) | Recombinant adenoviruses coding for brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | |
| JP2001504088A (en) | Methods for treating amyotrophic lateral sclerosis | |
| RU2719013C1 (en) | Genetic engineering structure for stimulating post-traumatic regeneration of peripheral nerves | |
| US6099831A (en) | Viral recombinant vectors for expression in muscle cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |