RU2315998C2 - Способ определения влияния соединений на процесс скачка митохондриальной проницаемости и мембранный потенциал митохондрий - Google Patents
Способ определения влияния соединений на процесс скачка митохондриальной проницаемости и мембранный потенциал митохондрий Download PDFInfo
- Publication number
- RU2315998C2 RU2315998C2 RU2005138847/15A RU2005138847A RU2315998C2 RU 2315998 C2 RU2315998 C2 RU 2315998C2 RU 2005138847/15 A RU2005138847/15 A RU 2005138847/15A RU 2005138847 A RU2005138847 A RU 2005138847A RU 2315998 C2 RU2315998 C2 RU 2315998C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mitochondria
- mitochondrial
- jump
- light absorption
- membrane potential
- Prior art date
Links
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 title claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 230000035699 permeability Effects 0.000 title claims abstract description 20
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 17
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 title claims abstract description 8
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 claims abstract description 59
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 27
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 claims abstract description 26
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 16
- OARRHUQTFTUEOS-UHFFFAOYSA-N safranin Chemical compound [Cl-].C=12C=C(N)C(C)=CC2=NC2=CC(C)=C(N)C=C2[N+]=1C1=CC=CC=C1 OARRHUQTFTUEOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 10
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 238000007728 cost analysis Methods 0.000 abstract 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 5
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- JNODQFNWMXFMEV-UHFFFAOYSA-N latrepirdine Chemical class C1N(C)CCC2=C1C1=CC(C)=CC=C1N2CCC1=CC=C(C)N=C1 JNODQFNWMXFMEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000037050 permeability transition Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- BMZRVOVNUMQTIN-UHFFFAOYSA-N Carbonyl Cyanide para-Trifluoromethoxyphenylhydrazone Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(NN=C(C#N)C#N)C=C1 BMZRVOVNUMQTIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000001120 cytoprotective effect Effects 0.000 description 2
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 2
- 230000010627 oxidative phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000035806 respiratory chain Effects 0.000 description 2
- 108010030583 (melle-4)cyclosporin Proteins 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- PFYWPQMAWCYNGW-UHFFFAOYSA-M [6-(dimethylamino)-9-(2-methoxycarbonylphenyl)xanthen-3-ylidene]-dimethylazanium;perchlorate Chemical compound [O-]Cl(=O)(=O)=O.COC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C21 PFYWPQMAWCYNGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N biuret Chemical compound NC(=O)NC(N)=O OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 1
- WDRWZVWLVBXVOI-QTNFYWBSSA-L dipotassium;(2s)-2-aminopentanedioate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O WDRWZVWLVBXVOI-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000028161 membrane depolarization Effects 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000027829 mitochondrial depolarization Effects 0.000 description 1
- 230000008965 mitochondrial swelling Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 235000013919 monopotassium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- RPJPZDVUUKWPGT-FOIHOXPVSA-N nim811 Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H]1N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@H](CC)NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC1=O RPJPZDVUUKWPGT-FOIHOXPVSA-N 0.000 description 1
- SVICABYXKQIXBM-UHFFFAOYSA-L potassium malate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C(=O)C(O)CC([O-])=O SVICABYXKQIXBM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000011033 potassium malate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001415 potassium malate Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для определения соединений, обладающих как цитопротекторным, так и цитостатическим эффектом, что необходимо при поиске лекарственных средств. Способ заключается в том, что измерение этих параметров проводят в одной пробе, путем выделения митохондрий из различных органов, приготовления суспензии митохондрий в буфере, последующего добавления в нее потенциал-зависимого красителя Сафранин А в концентрации 4,5-5,5 мкМ, приготовления плашек с исследуемыми веществами, добавления в них суспензии митохондрий с последующим измерением изменения светопоглощения во времени при длинах волн 554 нм и 524 нм при энергизации митохондрий и после индукции скачка митохондриальной проницаемости, после чего о наличии скачка митохондриальной проницаемости судят по наличию скачкообразного снижения светопоглощения при 554 нм после проведения индукции скачка митохондриальной проницаемости, а о влиянии соединений на мембранный потенциал митохондрий - по изменению величины разности светопоглощений при длинах волн 554 нм и 524 нм потенциал-зависимого красителя сафранина А в суспензии митохондрий под влиянием исследуемых веществ при энергизации митохондрий. Изобретение обеспечивает повышение производительности с одновременным удешевлением способа за счет одновременного определения влияния исследуемого вещества на оба параметра. 2 ил.
Description
Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для определения соединений, обладающих как цитопротекторным, так и цитостатическим эффектом, что необходимо при поиске лекарственных средств, применяемых, в частности, для лечения нейродегенеративных, кардио- и онкозаболеваний.
В настоящем описании изобретения под термином скачок митохондриальной проницаемости (МРТ - mitochondrial permeability transition) подразумевается такое состояние митохондриальной мембраны, при котором мембрана митохондрий становится проницаемой для веществ с молекулярным весом менее 1500 дальтон и наблюдается изменение формы митохондрий - "набухание" митохондрий.
Мембранный потенциал митохондрий характеризует функциональную активность митохондрий, в основном функционирование их дыхательной цепи, и может определяться различными методами - спектрофотометрическими, флуорометрическими, с помощью электродов.
Под термином "энергизация митохондрий" подразумевается процесс запуска работы дыхательной цепи митохондрий путем добавления субстратов окислительного фосфорилирования, результатом которого является увеличение мембранного потенциала митохондрий.
Под термином " индукция МРТ" подразумевается процесс запуска скачка митохондриальной проницаемости путем добавления известных (или новых) веществ, которые вызывают появление проницаемости внутренней мембраны митохондрий и ее деполяризацию, что может быть предотвращено предварительным добавлением специфического ингибитора МРТ циклоспорина А. Известен способ определения влияния соединений на процесс скачка митохондриальной проницаемости и мембранный потенциал митохондрий, который включает получение суспензии митохондрий из различных органов, приготовление плашек с исследуемыми веществами, добавление в них суспензии митохондрий в среде с потенциал-зависимым красителем, в качестве которого используют метиловый эфир тетраметилродамина (ТМРМ). После чего измеряют кинетику изменения флуоресценции и светопоглощения проб, при этом индукцию МРТ проводят последовательным добавлением CaCl2 и (NH4)2HPO4. Затем строят графики зависимости светопоглощения от времени и зависимости флуоресценции от времени. После чего, по наличию изменения величины (скачкообразного снижения) светопоглощения под влиянием исследуемых веществ судят об изменении формы ("набухании") митохондрий, в том числе после добавления индукторов это изменение характеризует МРТ, а по изменению флюоресценции, определяемой в той же пробе, судят об изменении мембранного потенциала (Blattner J.R., Lihua He, Lemasters J.J. Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader. Analytical Biochemistry, 295, 220-226, 2001).
Однако для осуществления этого способа требуется использование не только дорогого реактива ТМРМ, а также достаточно дорогого и сложного оборудования, в том числе, флюоресцентного плашечного ридера, дающего возможность одновременной регистрации светопоглощения и флуоресценции.
Известен принятый за прототип способ определения влияния соединений на процесс скачка митохондриальной проницаемости и мембранный потенциал митохондрий, который включает выделение митохондрий из различных органов, приготовление суспенции митохондрий в буфере, в который для энергизации митохондрий дополнительно добавляют субстраты дыхания (5 мМ глутамат натрия +5 мМ малат натрия), приготовление плашек с исследуемыми веществами, добавление в них суспензии митохондрий с последующим измерением кинетики изменения светопоглощения при 535 нм в течение 28 мин во время которого индукцию МРТ проводят добавленим CaCl2 и (NH4)2HPO4. После чего строят график зависимости светопоглощения суспензии митохондрий с исследуемым веществом при 535 нм от времени и по наличию скачкообразного снижения светопоглощения под влиянием исследуемых веществ судят об изменении формы ("набухании") митохондрий, т.е. определяют МРТ. Затем в плашки, приготовленные аналогично описанному выше, дополнительно добавляют потенциал-зависимый краситель Сафранин А в концентрации - 15 мкМ и регистрируют начальное значение флуоресценции (потенциал покоя) как в контрольных пробах, так и в присутствии производных исследуемых веществ. Одинаковые значения флуоресценции в контрольных и опытных пробах свидетельствует об отсутствии влияния исследуемых соединений на мембранный потенциал митохондрий. Снижение флуоресценции сафранина А отображает снижение мембранного потенциала в опытных пробах по сравнению с контрольными и свидетельствует о наличии влияния исследуемых соединений на мембранный потенциал митохондрий. Затем добавляют в качестве индукторов МРТ CaCl2 и (NH4)2HPO4 (как и при измерении "набухания" митохондрий). В конце эксперимента добавляют для контроля полной деполяризации митохондрий (нулевая величина потенциала) известный разобщитель окислительного фосфорилирования - FCCP [carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone] - в концентрации, вызывающей полное изчезновение мембранного потенциала митохондрий. (Waldmeier P.C., Feldtrauer J.J., Ting Qian, Lemasters J.J. Inhibition of the mitochondrial permeability transition by the nonimmunosuppressive Cyclosporin derivative NIM811. Molecular Pharmacology, 62, 22-29, 2002).
Однако этот способ трудоемок и требует значительного времени проведения испытаний.
Задачей предлагаемого изобретения является повышение производительности с одновременным удешевлением способа определения влияния соединений на процесс МРТ и мембранный потенциал митохондрий, за счет одновременного определения влияния исследуемого вещества на оба этих параметра.
Поставленная задача достигается способом определения влияния соединений на процесс скачка митохондриальной проницаемости и мембранный потенциал митохондрий, путем выделения митохондрий из различных органов, приготовления суспензии митохондрий в буфере, приготовления плашек с исследуемыми веществами, добавления в них суспензии митохондрий с последующим измерением изменения светопоглощения во времени при энергизации митохондрий и после индукции скачка митохондриальной проницаемости, при этом о наличии скачка митохондриальной проницаемости судят по наличию скачкообразного снижения светопоглощения под влиянием исследуемых веществ после проведения индукции скачка митохондриальной проницаемости, а влияние соединений на мембранный потенциал митохондрий определяют в присутствии потенциал-зависимого красителя Сафранин А при энергизации митохондрий. Новизна предлагаемого способа заключается в том, что измерение скачка митохондриальной проницаемости и мембранного потенциала проводят в одной пробе, при этом Сафранин А добавляют непосредственно при приготовлении суспензии митохондрий, причем концентрация его составляет 4,5-5,5 мкМ, а измерение изменения светопоглощения во времени проводят при длинах волн 554 нм и 524 нм, после чего о наличии скачка митохондриальной проницаемости судят по наличию скачкообразного снижения светопоглощения при 554 нм, а о влиянии соединений на мембранный потенциал митохондрий по изменению величины разности светопоглощений при длинах волн 554 нм и 524 нм потенциал-зависимого красителя сафранина А в суспензии митохондрий под влиянием исследуемых веществ.
Экспериментально было установлено, что концентрациия Сафранина А, равная 4,5-5,5 мкМ, является достаточной для измерений изменений мембранного потенциала, но не влияет на характеристики митохондрий, а величина разности его светопоглощения при длинах волн 554 нм и 524 нм (А554-А524) в суспензии митохондрий характеризует мембранный потенциал митохондрий. Первоначальное увеличение абсолютной величины разницы А554-А524 при энергизации митохондрий после добавления субстратов дыхания отражает появление мембранного потенциала митохондрий, а уменьшение этой разности после добавления исследуемых веществ свидетельствует о влиянии на него этих веществ.
Техническим результатом, который может быть получен при осуществлении изобретения, является возможность одновременно в условиях высокопроизводительного скрининга (в 24-, 48-, 96- и т.д. - ячеечных планшетах) охарактеризовать влияние вещества и на МРТ, и на изменение мембранного потенциала митохондрий.
Возможность осуществления изобретения с реализацией заявляемого назначения и получением технического результата подтверждается, но не исчерпывается следующим примером.
Пример. Скрининг аналогов димебона с целью выяснения вероятности наличия у них влияния на процесс скачка митохондриальной проницаемости и мембранный потенциал митохондрий.
Митохондрий из печени крыс выделяют стандартным методом дифференциального центрифугирования. Концентрацию белка в полученном препарате митохондрий определяют стандартным биуретовым методом. Препарат митохондрий разводят в среде А (состав: маннитол - 225 мМ, сахароза - 75 мМ, HEPES - 10 мМ, ЭГТА - 20 мкМ) из расчета 0,9 мг белка в 1 мл среды А и непосредственно перед началом измерения в суспензию добавляют сафранин А в конечной концентрации 5 мкМ. Для 24-ячеечного планшета одновременно готовят 4 разведения 2 исследуемых веществ (100 мкМ - 10 мМ) и 10 мкл каждого разведения веществ вносят в опытные ячейки планшета (колонки 2-5 планшета). Ряды А и В одинаковы и содержат вещество 1, ряды С и D одинаковы и содержат вещество 2. В шестую колонку добавляют по 10 мкл максимальной концентрации вещества данного ряда. Затем в каждую ячейку 1-5 колонки планшета вносят по 0,98 мл суспензии митохондрий с сафранином. В ячейки шестого ряда планшета добавлют по 0,98 мл среды А с сафранином, не содержащей митохондрий. После этого планшет помещают в плашечный ридер и записывают светопоглощение при 524 и 554 нм. Через 2,5 мин от начала записи проводят энергизацию митохондрий, добавляя во все пробы по 10 мкл субстратов дыхания (0,5 М раствор глутамата калия и 0,5 М раствор малата калия). Через 5 мин от начала записи проводят индукцию МРТ, добавляя во все пробы планшета по 10 мкл 0,5 М раствора хлористого кальция. Запись светопоглощения продолжают в течение 30 минут. Анализ полученных данных проводят с помощью графика зависимости разности изменения светопоглощения при 524 и 554 нМ от времени. Скачкообразное снижение величины светопоглощения суспензии митохондрий при 554 нм отражает наличие МРТ, т.е. изменение формы митохондрий - "набухание" (см. фиг.1а и 2а).
Уменьшение абсолютного значения величины разности светопоглощения Сафранина А при длинах волн 554 нм и 524 нм (А554-А524) в суспензии митохондрий после добавления субстратов дыхания характеризует увеличение мембранного потенциала митохондрий, а отсутствие различий между контрольными пробами и опытными до добавления индукторов МРТ свидетельствует об отсутствии влияния димебона на мембранный потенциал митохондрий (см. фиг.1б). Большее по сравнению с контролем абсолютное значение величины разности светопоглощения Сафранина А при длинах волн 554 нм и 524 нм (А554-А524) в суспензии митохондрий после добавления субстратов дыхания свидетельствует о влиянии, в данном случае, снижении мембранного потенциала митохондрий аналогом димебона - веществом IP9205 (фиг.2б).
Проведение исследований по способу-прототипу показало наличие тех же характеристик для исследуемых веществ, что и предлагаемый нами способ, в то же время проведения анализа снизилось примерно в 2 раза, кроме того аналогичное число анализов требует вдвое меньшего расхода животных и реактивов.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет оценить действие различных соединений на процесс "набухания" митохондрий, характеризующий связанный с индукцией клеточной гибели процесс МРТ с одновременной оценкой влияния веществ на мембранный потенциал митохондрий. Это дает возможность проводить определение соединений, обладающих как цитопротекторным, так и цитостатическим эффектом, что необходимо при поиске лекарственных средств, применяемых, в частности, для лечения нейродегенеративных, кардио- и онкозаболеваний.
Claims (1)
- Способ определения влияния соединений на процесс скачка митохондриальной проницаемости и мембранный потенциал митохондрий путем выделения митохондрий из различных органов, приготовления суспензии митохондрий в буфере, приготовления плашек с исследуемыми веществами, добавление в них суспензии митохондрий с последующим измерением изменения светопоглощения во времени при энергизации митохондрий и после индукции скачка митохондриальной проницаемости, при этом о наличии скачка митохондриальной проницаемости судят по наличию скачкообразного снижения светопоглощения под влиянием исследуемых веществ во время проведения индукции скачка митохондриальной проницаемости, а влияние соединений на мембранный потенциал митохондрий определяют в присутствии потенциалзависимого красителя Сафранин А, отличающийся тем, что измерение скачка митохондриальной проницаемости и мембранного потенциала проводят в одной пробе, при этом Сафранин А добавляют непосредственно при приготовлении суспензии митохондрий, причем концентрация его составляет 4,5-5,5 мкМ, а измерение изменения светопоглощения во времени проводят при длинах волн 554 нм и 524 нм, после чего о наличии скачка митохондриальной проницаемости судят по наличию скачкообразного снижения светопоглощения при 554 нм, а о влиянии соединений на мембранный потенциал митохондрий по изменению величины разности светопоглощений при длинах волн 554 нм и 524 нм потенциалзависимого красителя сафранина А в суспензии митохондрий под влиянием исследуемых веществ.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005138847/15A RU2315998C2 (ru) | 2005-12-14 | 2005-12-14 | Способ определения влияния соединений на процесс скачка митохондриальной проницаемости и мембранный потенциал митохондрий |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005138847/15A RU2315998C2 (ru) | 2005-12-14 | 2005-12-14 | Способ определения влияния соединений на процесс скачка митохондриальной проницаемости и мембранный потенциал митохондрий |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2005138847A RU2005138847A (ru) | 2007-06-20 |
| RU2315998C2 true RU2315998C2 (ru) | 2008-01-27 |
Family
ID=38314057
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005138847/15A RU2315998C2 (ru) | 2005-12-14 | 2005-12-14 | Способ определения влияния соединений на процесс скачка митохондриальной проницаемости и мембранный потенциал митохондрий |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2315998C2 (ru) |
-
2005
- 2005-12-14 RU RU2005138847/15A patent/RU2315998C2/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| VERCESI A.E. et al. J. Biol. Chem. 1991, Aug. 5, 266(22):14431-4. * |
| WALDMEIER P.C. et al. Molecular Pharmacology. 62, 22-29, 1002. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2005138847A (ru) | 2007-06-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Buhner et al. | Activation of human enteric neurons by supernatants of colonic biopsy specimens from patients with irritable bowel syndrome | |
| Ke et al. | A near-infrared naphthalimide fluorescent probe for targeting the lysosomes of liver cancer cells and specifically selecting HSA | |
| Skoumalova et al. | The role of free radicals in canine counterpart of senile dementia of the Alzheimer type | |
| Lee et al. | Diversity-oriented fluorescence library approach for the discovery of sensors and probes | |
| WO2001050134A3 (en) | Methods of detection of amyloidogenic proteins | |
| JPH03172196A (ja) | 蛍光発生基質およびそれを用いたタンパク質分解酵素の検出方法 | |
| JP2000502443A (ja) | 毛管電気泳動を使用して新規の治療コンパウンド類のための天然物サンプルのスクリーニング | |
| Giles et al. | A complex containing the O-GlcNAc transferase OGT-1 and the ubiquitin ligase EEL-1 regulates GABA neuron function | |
| US20090227043A1 (en) | Fluorescence Resonance Energy Transfer Assay Based on Modified Solid Surface | |
| US20060263841A1 (en) | Fluorescent probes for use in protein kinase inhibitor binding assay | |
| JP6106264B2 (ja) | 乳酸塩の定量のための遺伝学的にコードされたプローブならびに代謝速度および乳酸塩輸送の定量方法 | |
| JP2009544954A (ja) | 体液中のアミロイド−βオリゴマーの検出方法 | |
| Bagert et al. | Time-resolved proteomic analysis of quorum sensing in Vibrio harveyi | |
| Yang et al. | Fluorescent probe for Cu 2+ and the secondary application of the resultant complex to detect cysteine | |
| MXPA96004183A (en) | Method of examination to identify paraprotein ligands objet | |
| Marti | Metal complexes and time-resolved photoluminescence spectroscopy for sensing applications | |
| Senisterra et al. | Application of high-throughput isothermal denaturation to assess protein stability and screen for ligands | |
| JP2024096748A (ja) | アルファ－シヌクレイン病のアッセイ、方法、及び治療 | |
| Koltun et al. | Measuring mRNA translation in neuronal processes and somata by tRNA-FRET | |
| JP7054690B2 (ja) | 細胞内のイオンチャネル活性を測定するための組成物および方法 | |
| DE102011055265A1 (de) | Automatenfähiger Immunoassay für biogene Amine | |
| Benbow et al. | Predicting safety toleration of pharmaceutical chemical leads: cytotoxicity correlations to exploratory toxicity studies | |
| Kislyuk et al. | Development of a sensitive and quantitative UHPLC-MS/MS method to study the whole-body uptake of pharmaceuticals in zebrafish | |
| CN106544007A (zh) | 一种检测生物体系内次氯酸的荧光探针及其应用 | |
| RU2315998C2 (ru) | Способ определения влияния соединений на процесс скачка митохондриальной проницаемости и мембранный потенциал митохондрий |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| QA4A | Patent open for licensing |
Effective date: 20160405 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20181215 |