RU2306147C2 - Anticancer agent containing lk8 protein as active ingredient - Google Patents
Anticancer agent containing lk8 protein as active ingredient Download PDFInfo
- Publication number
- RU2306147C2 RU2306147C2 RU2005129273/15A RU2005129273A RU2306147C2 RU 2306147 C2 RU2306147 C2 RU 2306147C2 RU 2005129273/15 A RU2005129273/15 A RU 2005129273/15A RU 2005129273 A RU2005129273 A RU 2005129273A RU 2306147 C2 RU2306147 C2 RU 2306147C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- cancer
- metastasis
- cells
- agent
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 89
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 82
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 title abstract description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 34
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims abstract description 26
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 claims abstract description 25
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 8
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 16
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 14
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 6
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 6
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 15
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 abstract 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 75
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 34
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 17
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 12
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 10
- 102100040214 Apolipoprotein(a) Human genes 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 7
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 7
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 6
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 6
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 6
- 101710115418 Apolipoprotein(a) Proteins 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 3
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 3
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 3
- 231100000371 dose-limiting toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108010012927 Apoprotein(a) Proteins 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000889990 Homo sapiens Apolipoprotein(a) Proteins 0.000 description 2
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 2
- 231100000215 acute (single dose) toxicity testing Toxicity 0.000 description 2
- 238000011047 acute toxicity test Methods 0.000 description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 102000006991 Apolipoprotein B-100 Human genes 0.000 description 1
- 108010008150 Apolipoprotein B-100 Proteins 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100021866 Hepatocyte growth factor Human genes 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108010033266 Lipoprotein(a) Proteins 0.000 description 1
- 206010028116 Mucosal inflammation Diseases 0.000 description 1
- 201000010927 Mucositis Diseases 0.000 description 1
- 238000011794 NU/NU nude mouse Methods 0.000 description 1
- 208000003788 Neoplasm Micrometastasis Diseases 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003527 anti-angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001399 anti-metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002257 antimetastatic agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000010410 dusting Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 1
- 229960003511 macrogol Drugs 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- -1 olive oil Chemical class 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 108010085336 phosphoribosyl-AMP cyclohydrolase Proteins 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 208000037959 spinal tumor Diseases 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 238000011521 systemic chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Область изобретенияField of Invention
Настоящее изобретение относится к противораковому агенту, содержащему определенный белок в качестве активного ингредиента, более точно, к противораковому агенту, содержащему белок, соответствующий kringle KV38 аполипопротеина (а) в качестве активного ингредиента.The present invention relates to an anticancer agent containing a specific protein as an active ingredient, more specifically, to an anticancer agent containing a protein corresponding to kringle KV38 of apolipoprotein (a) as an active ingredient.
Уровень техникиState of the art
Опухоль развивается посредством неконтролируемой беспорядочной патологической пролиферации клеток. Если указанная опухоль демонстрирует деструктивный рост, инвазивность и метастазирование, она считается злокачественной опухолью. Инвазивность представляет собой свойство инфильтрировать и разрушать окружающие ткани, и, в частности, базальный слой, формирующий границу тканей, разрушается в результате указанного свойства, что приводит к локальному распространению и, иногда, поступлению опухоли в систему кровообращения. Метастазирование означает распространение опухолевых клеток из первичного очага в другие области через лимфатические или кровеносные сосуды. В широком смысле метастазирование означает также прямое распространение опухолевых клеток через перитонеальную полость или другие пространства.A tumor develops through uncontrolled, random, abnormal cell proliferation. If the specified tumor shows destructive growth, invasiveness and metastasis, it is considered a malignant tumor. Invasiveness is the property of infiltrating and destroying surrounding tissues, and, in particular, the basal layer that forms the tissue border is destroyed as a result of this property, which leads to local spread and, sometimes, the tumor enters the circulatory system. Metastasis means the spread of tumor cells from the primary focus to other areas through the lymphatic or blood vessels. In a broad sense, metastasis also means the direct spread of tumor cells through the peritoneal cavity or other spaces.
В настоящее время для лечения злокачественных опухолей используют хирургическое вмешательство, лучевую терапию и химиотерапию, по отдельности или совместно. Хирургическое вмешательство представляет собой путь удаления патологических тканей. Так опухоли в конкретных областях, таких как молочная железа, толстая кишка и кожа, можно эффективно удалить с помощью хирургической операции. Однако опухоли позвоночника или рассеянные опухоли, такие как лейкоз, невозможно адекватно лечить хирургическим вмешательством.Currently, for the treatment of malignant tumors using surgery, radiation therapy and chemotherapy, individually or together. Surgery is a way to remove pathological tissues. So tumors in specific areas, such as the mammary gland, colon and skin, can be effectively removed with surgery. However, spinal tumors or scattered tumors, such as leukemia, cannot be adequately treated with surgery.
Химиотерапия блокирует репликацию или метаболизм клеток, и ее применяют для лечения рака молочной железы, рака легких и рака семенников. Однако пациенты со злокачественными опухолями, которых лечат химиотерапией, серьезно страдают от побочных эффектов системной химиотерапии. Тошнота и рвота являются среди прочих наиболее распространенными, но тяжелыми эффектами. Побочные эффекты химиотерапии могут влиять на жизнь пациента, поскольку они могут быстро снижать его адаптивность. Кроме того, токсичность, ограничивающая дозу (DLT), также является одним из основных побочных эффектов химиотерапии, который требует тщательного внимания при введении лекарственного средства. Мукозит представляет собой пример DLT против противораковых агентов, таких как 5-фторурацил, который представляет собой антиметаболический цитотоксический агент, и метотрексат, а также противораковые антибиотики, такие как доксорубицин. Если пациент серьезно страдает от указанных побочных эффектов химиотерапии, его или ее следует госпитализировать и вводить анодин для уменьшения боли. Таким образом, побочные эффекты химиотерапии и лучевой терапии являются самой большой проблемой при лечении пациентов со злокачественными опухолями.Chemotherapy blocks the replication or metabolism of cells, and it is used to treat breast cancer, lung cancer, and testicular cancer. However, patients with malignant tumors treated with chemotherapy suffer severely from the side effects of systemic chemotherapy. Nausea and vomiting are among the most common but severe effects. Side effects of chemotherapy can affect the patient's life, as they can quickly reduce his adaptability. In addition, dose limiting toxicity (DLT) is also one of the main side effects of chemotherapy, which requires careful attention when administering the drug. Mucositis is an example of DLT against anti-cancer agents such as 5-fluorouracil, which is an antimetabolic cytotoxic agent, and methotrexate, as well as anti-cancer antibiotics such as doxorubicin. If the patient is seriously suffering from these side effects of chemotherapy, he or she should be hospitalized and anodine administered to reduce pain. Thus, the side effects of chemotherapy and radiation therapy are the biggest problem in the treatment of patients with malignant tumors.
Таким образом, существует настоятельная необходимость в разработке противоракового агента, происходящего от живого существа, с целью уменьшения побочных эффектов химиотерапии. В частности, среди веществ, вырабатываемых в живом существе, был найден многообещающий субъект, который не атакует раковые клетки непосредственным образом, а предотвращает рост раковых клеток, действуя против различных эндотелиальных клеток, способствующих росту раковых клеток. Таким образом, противораковый агент, содержащий указанный субъект, может не только лечить злокачественные опухоли, но и предотвращать метастазирование.Thus, there is an urgent need to develop an anticancer agent derived from a living creature in order to reduce the side effects of chemotherapy. In particular, among the substances produced in a living creature, a promising subject was found that does not attack cancer cells directly, but prevents the growth of cancer cells, acting against various endothelial cells that contribute to the growth of cancer cells. Thus, an anticancer agent containing the specified subject can not only treat malignant tumors, but also prevent metastasis.
Kringle представляет собой разновидность белковой структуры, которая состоит из 80 аминокислот и трех внутримолекулярных дисульфидных связей. Структуру kringle находят во многих белках, таких как тротромбин (Walz, D.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74:1069-1073, 1977), урокиназа (Pennica, D. et al., Nature, 301:579-582, 1983), фактор роста гепатоцитов (Lukker, N.A. et al., Protein Eng., 7:895-903, 1994) и аполипопротеин(а) (далее в настоящем документе упоминается как "аро(а)") (McLean, J.W. et al., Nature, 330:132-137, 1987). Kringle состоит из отдельной свернутой единицы. Функции kringle до сих пор не имеют ясного объяснения.Kringle is a type of protein structure that consists of 80 amino acids and three intramolecular disulfide bonds. The kringle structure is found in many proteins, such as throthrombin (Walz, DA et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74: 1069-1073, 1977), urokinase (Pennica, D. et al., Nature, 301: 579-582, 1983), hepatocyte growth factor (Lukker, NA et al., Protein Eng., 7: 895-903, 1994) and apolipoprotein (a) (hereinafter referred to as "apo (a)") ( McLean, JW et al., Nature, 330: 132-137, 1987). Kringle consists of a single collapsed unit. The kringle functions still do not have a clear explanation.
Аро(а) включает два типа доменов kringle, KIV и KV, и неактивный протеиназо-подобный участок. Домен kringle KIV разделяется на 10 подтипов (KIV-1 ~ KIV-10), согласно гомологии аминокислот, и 15 ~ 40 число копий указанного домена обнаруживают в различных аллелях человеческого гена аро(а). Аро(а) формирует липопротеин(а) (далее в настоящем документе упоминается как "Lp(а)") посредством ковалентной связи с аро В-100, главным белковым компонентом липопротеина низкой плотности (LDL) (Fless, G.M., J. Biol. Chem., 261:8712-8717, 1986). Повышение содержания Lp(a) в самой цитоплазме представляет собой главный фактор риска атеросклероза (Armstrong, V.W. et al., Artherosclerosis, 62:249-257, 1986; Assmann, G., Am. J. Cardiol., 77:1179-1184, 1996).Apo (a) includes two types of kringle domains, KIV and KV, and an inactive proteinase-like site. The kringle KIV domain is divided into 10 subtypes (KIV-1 ~ KIV-10), according to amino acid homology, and 15 ~ 40 copies of this domain are found in different alleles of the human apo (a) gene. Apo (a) forms lipoprotein (a) (hereinafter referred to as “Lp (a)”) by covalent bonding with apo B-100, the main protein component of low density lipoprotein (LDL) (Fless, GM, J. Biol. Chem., 261: 8712-8717, 1986). An increase in Lp (a) in the cytoplasm itself is a major risk factor for atherosclerosis (Armstrong, VW et al., Artherosclerosis, 62: 249-257, 1986; Assmann, G., Am. J. Cardiol., 77: 1179-1184 , 1996).
На основе того факта, что артеросклероз и рост раковых клеток зависят от ангиогенеза, заявители изучили противораковую активность KV38, одного из человеческих аро(а) kringle. В результате заявители завершили настоящее изобретение, подтвердив, что указанный белок можно эффективно использовать в качестве противоракового агента, поскольку он ингибирует ангиогенез эндогенным фактором роста, подобным bFGF, который необходим для роста раковых клеток.Based on the fact that arteriosclerosis and cancer cell growth are dependent on angiogenesis, the applicants studied the anticancer activity of KV38, one of the human aro (a) kringle. As a result, the applicants completed the present invention, confirming that the protein can be effectively used as an anticancer agent, since it inhibits angiogenesis by an endogenous growth factor, such as bFGF, which is necessary for the growth of cancer cells.
Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
Целью настоящего изобретения является разработка противоракового агента, включающего человеческий аро(а) kringle KV38 (далее в настоящем документе упоминается как "белок LK8") в качестве активного ингредиента.An object of the present invention is to provide an anti-cancer agent comprising human apo (a) kringle KV38 (hereinafter referred to as “LK8 protein”) as an active ingredient.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретенияDetailed Description of Preferred Embodiments of the Present Invention
Для того чтобы добиться указанной выше цели настоящего изобретения, настоящее изобретение обеспечивает противораковый агент, содержащий белок LK8 в качестве активного ингредиента.In order to achieve the above objectives of the present invention, the present invention provides an anticancer agent containing LK8 protein as an active ingredient.
Далее настоящее изобретение описывается подробно.Further, the present invention is described in detail.
Противораковый агент по настоящему изобретению характеризуется содержанием белка LK8, имеющего аминокислотную последовательность, представленную SEQ. ID. № 1, в качестве активного ингредиента. Предпочтительно использовать агент в качестве ингибитора метастазирования, более предпочтительно его используют для подавления метастазирования рака толстой кишки или рака прямой кишки в печень.The anticancer agent of the present invention is characterized by an LK8 protein having the amino acid sequence represented by SEQ. ID No. 1, as an active ingredient. It is preferable to use the agent as an inhibitor of metastasis, more preferably it is used to inhibit metastasis of colon cancer or colon cancer in the liver.
Помимо этого противораковый агент используют для лечения первичных опухолей. Более предпочтительно агент используют для лечения рака, выбранного из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака легкого, рака толстой кишки и рака прямой кишки.In addition, an anticancer agent is used to treat primary tumors. More preferably, the agent is used to treat cancer selected from the group consisting of prostate cancer, lung cancer, colon cancer, and colon cancer.
Противораковый агент по настоящему изобретению предпочтительно содержит белок LK8 в количестве 0,1 ~ 100 мг/кг, более предпочтительно, содержит белок LK8 в количестве 1 ~ 50 мг/кг, а частота введения составляет 1 ~ 4 раза в день. Однако композиция не ограничивается указанными параметрами, и возможны изменения в соответствии с состоянием пациента и типом и скоростью прогрессирования заболевания.The anticancer agent of the present invention preferably contains LK8 protein in an amount of 0.1 ~ 100 mg / kg, more preferably contains LK8 protein in an amount of 1 ~ 50 mg / kg, and the frequency of administration is 1 ~ 4 times per day. However, the composition is not limited to these parameters, and changes are possible in accordance with the condition of the patient and the type and rate of disease progression.
В настоящем изобретении «KV38» означает аро(а) kringle, а LK8 означает рекомбинантный белок KV38. Однако и белок KV38, и белок LK8, обычно называется белком LK8, если особо не указывается иное.In the present invention, “KV38” means apo (a) kringle, and LK8 means a recombinant KV38 protein. However, both the KV38 protein and the LK8 protein are commonly referred to as the LK8 protein, unless specifically indicated otherwise.
Белок LK8 по настоящему изобретению представляет собой домен, соответствующий KV38 kringle многих доменов аро(а) kringle, и обладает ингибирующим действием на пролиферацию и дифференцировку раковых клеток и метастазирование посредством подавления активности эндотелиальных клеток in vitro, а также in vivo. Как объясняется в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, системное введение белка LK8 приводит к ингибированию первичной опухоли и ее метастазирования (см. ФИГ.2 ~ ФИГ.6). Таким образом, белок LK8 по настоящему изобретению можно эффективно использовать в качестве противоракового агента, особенно для первичных опухолей, а также в качестве ингибитора метастазирования, благодаря его свойствам подавления опухолевого роста и метастазирования.The LK8 protein of the present invention is a domain corresponding to the KV38 kringle of many apo (a) kringle domains and has an inhibitory effect on the proliferation and differentiation of cancer cells and metastasis by suppressing endothelial cell activity in vitro as well as in vivo. As explained in a preferred embodiment of the present invention, systemic administration of the LK8 protein leads to inhibition of the primary tumor and its metastasis (see FIG. 2 ~ FIG. 6). Thus, the LK8 protein of the present invention can be effectively used as an anticancer agent, especially for primary tumors, as well as an inhibitor of metastasis, due to its properties of suppressing tumor growth and metastasis.
Эффект от лечения будет усилен, если белок LK8 по настоящему изобретению использовать совместно с обычно химиотерапией или лучевой терапией. Лучевую терапию осуществляют для того, чтобы разрушить первичную опухоль, и если белок LK8 вводят во время лучевой терапии, можно более эффективно предотвратить метастазирование. Что касается химиотерапии, цитотоксичность, вызываемая огромной дозой химических противораковых агентов, представляет собой самую большую проблему. Если белок LK8 по настоящему изобретению вводить во время химиотерапии, уменьшенное количество химических противораковых агентов будет оказывать эквивалентное или даже улучшенное противораковое действие, а также уменьшать цитотоксичность.The effect of the treatment will be enhanced if the LK8 protein of the present invention is used in conjunction with usually chemotherapy or radiation therapy. Radiation therapy is carried out in order to destroy the primary tumor, and if the LK8 protein is administered during radiation therapy, metastasis can be more effectively prevented. As for chemotherapy, cytotoxicity caused by a huge dose of chemical anticancer agents is the biggest problem. If the LK8 protein of the present invention is administered during chemotherapy, a reduced amount of chemical anticancer agents will have an equivalent or even improved anticancer effect and also reduce cytotoxicity.
В заключение можно сказать, что если введение белка LK8 осуществляют совместно с хирургическим вмешательством, лучевой терапией, химиотерапией или иммунотерапией, эффект от лечения будет максимальным. И кроме того, непрерывное введение белка LK8 удлиняет состояние покоя микрометастазов, подавляет рост первичной опухоли и стабилизирует состояние. Многие обычные противораковые агенты предназначены для длительного введения, вызывая такие проблемы как длительное производство белка и высокая цена продукта. Альтернативой для них является генная терапия. Также ожидается, что белок LK8 максимизирует эффект противоракового агента или ингибитора метастазирования, если его будут использовать для генной терапии.In conclusion, we can say that if the introduction of LK8 protein is carried out in conjunction with surgery, radiation therapy, chemotherapy or immunotherapy, the effect of treatment will be maximum. And in addition, continuous administration of LK8 protein lengthens the resting state of micrometastases, inhibits the growth of the primary tumor and stabilizes the condition. Many common anticancer agents are designed for long-term administration, causing problems such as long-term protein production and the high cost of the product. An alternative for them is gene therapy. It is also expected that the LK8 protein maximizes the effect of an anticancer agent or metastasis inhibitor if it is used for gene therapy.
Противораковый агент, содержащий белок LK8, по настоящему изобретению можно вводить перорально или парентерально и использовать в обычных формах фармацевтических композиций.The anti-cancer agent containing the LK8 protein of the present invention can be administered orally or parenterally and used in conventional forms of pharmaceutical compositions.
Противораковый агент можно изготавливать для перорального или парентерального введения смешиванием с обычными наполнителями, связующими агентами, увлажняющими агентами, разрыхлителями, разбавителями, такими как поверхностно-активные агенты или наполнители. Твердые композиции для перорального введения представляют собой таблетки, пилюли, опудривающие порошки, гранулы и капсулы. Указанные твердые композиции изготавливают смешиванием с одним или более подходящих наполнителей, таких как крахмал, карбонат кальция, сахароза или лактоза, желатин и т.п. Помимо простых наполнителей можно использовать смазывающие агенты, например стеарат магния, тальк и т.п. Жидкие композиции для перорального введения представляют собой суспензии, растворы, эмульсии и сиропы, и указанные выше композиции могут содержать различные наполнители, такие как увлажняющие агенты, подсластители, ароматизаторы и консерванты, помимо обычно используемых простых разбавителей, таких как вода или жидкий парафин. Композиции для парентерального введения представляют собой стерилизованные водные растворы, не растворимые в воде наполнители, суспензии, эмульсии и суппозитории. Не растворимые в воде наполнители и суспензии могут содержать, помимо активного соединения или соединений, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, такое как оливковое масло, сложный эфир для инъекций, такой как этилолеат и т.п. Суппозитории могут содержать, помимо активного соединения или соединений, витепсол, макрогол, твин 61, масло какао, лауриновое масло, глицеринизированный желатин и т.п.An anticancer agent can be formulated for oral or parenteral administration by mixing with conventional excipients, binders, wetting agents, disintegrants, diluents such as surfactants or excipients. Solid compositions for oral administration are tablets, pills, dusting powders, granules and capsules. These solid compositions are prepared by mixing with one or more suitable excipients, such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, and the like. In addition to simple fillers, lubricants such as magnesium stearate, talc, etc. can be used. Liquid compositions for oral administration are suspensions, solutions, emulsions and syrups, and the above compositions may contain various excipients, such as moisturizing agents, sweeteners, flavorings and preservatives, in addition to commonly used simple diluents, such as water or liquid paraffin. Compositions for parenteral administration are sterilized aqueous solutions, water-insoluble excipients, suspensions, emulsions and suppositories. Water-insoluble excipients and suspensions may contain, in addition to the active compound or compounds, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil, such as olive oil, an ester for injection, such as ethyl oleate and the like. Suppositories may contain, in addition to the active compound or compounds, vitepsol, macrogol, tween 61, cocoa butter, lauric oil, glycerin gelatin, and the like.
LD50 белка LK8 составляет приблизительно 1000 мг/кг, что свидетельствует о весьма высокой безопасности противоракового агента по настоящему изобретению (см. таблицу 2).The LD 50 of LK8 protein is approximately 1000 mg / kg, which indicates the very high safety of the anti-cancer agent of the present invention (see table 2).
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
Осуществление предпочтительных вариантов настоящего изобретения можно лучше понять с помощью прилагаемых чертежей.The implementation of the preferred variants of the present invention can be better understood using the accompanying drawings.
ФИГ.1 представляет собой схематическое изображение экспрессирующего вектора "pMBRI-LK8 (8,25 т.п.н.)" гена LK8, в котором кДНК LK8 (261 п.н.) встроена между промотором АОХ1 и терминатором АОХ1.FIG. 1 is a schematic representation of the pKBRI-LK8 (8.25 kb) expression vector of the LK8 gene, in which the LK8 cDNA (261 bp) is inserted between the AOX1 promoter and the AOX1 terminator.
ФИГ.2 представляет собой серию фотографий и график, показывающие, что метастазирование в легкие клеточной линии меланомы мышей, B16F10, которую инъецировали в хвостовую вену мышей (C57BL/6), ингибируются лечением белком LK8,FIG. 2 is a series of photographs and a graph showing that lung metastasis of the mouse melanoma cell line, B16F10, which was injected into the tail vein of mice (C57BL / 6), is inhibited by treatment with LK8 protein,
(а) легкое мыши, леченной только PBS,(a) the lung of a mouse treated only with PBS,
(b) легкое мыши, леченной белком LK8 1 мг/кг,(b) lung of a mouse treated with 1 mg / kg LK8 protein,
(с) график, показывающий, что метастазирование клеток B16F10 в легкое мыши ингибируется лечением белком LK8.(c) a graph showing that metastasis of B16F10 cells to mouse lung is inhibited by treatment with LK8 protein.
ФИГ.3 представляет собой серию фотографий и график, показывающие, что метастазирование в печень клеточной линии колоректального рака мышей СТ-26, трансплантированной в селезенку мыши, ингибируются лечением белком LK8,FIG. 3 is a series of photographs and a graph showing that liver metastasis of the CT-26 mouse colorectal cancer cell line transplanted into mouse spleen is inhibited by treatment with LK8 protein,
(а) печень мыши, леченной PBS (контроль) и белком LK8 (10 мг/кг в день),(a) the liver of a mouse treated with PBS (control) and LK8 protein (10 mg / kg per day),
(b) график, показывающий количество колоний клеток СТ-26, метастазировавших в печень мыши, леченной PBS (контроль) и белком LK8 (10 мг/кг в день),(b) a graph showing the number of colonies of CT-26 cells metastasized to the liver of a mouse treated with PBS (control) and LK8 protein (10 mg / kg per day),
(с) фотографии, показывающие распределение раковых клеток СТ-26, метастазировавших в печень мыши, леченной PBS (контроль) и белком LK8 (10 мг/кг в день), которое наблюдалось при окрашивании гематоксилин-эозином.(c) photographs showing the distribution of CT-26 cancer cells metastasized to the liver of a mouse treated with PBS (control) and LK8 protein (10 mg / kg per day), which was observed with hematoxylin-eosin staining.
ФИГ.4 представляет собой серию графиков, показывающих изменения размеров опухоли у мыши, которой трансплантировали клетки рака предстательной железы человека РС-3, в соответствии с введением белка LK8,FIG. 4 is a series of graphs showing changes in tumor size in a mouse transplanted with PC-3 human prostate cancer cells in accordance with the administration of the LK8 protein,
(а) график, показывающий изменения размеров опухоли после лечения белком LK8 100 мг/кг в день.(a) a graph showing changes in tumor size after treatment with LK8 protein of 100 mg / kg per day.
(b) график, показывающий изменения размеров опухоли после лечения белком LK8 50 мг/кг в день.(b) a graph showing changes in tumor size after treatment with LK8 protein of 50 mg / kg per day.
ФИГ.5 представляет собой график, показывающий изменения размеров опухоли у мыши, которой трансплантировали клетки рака легкого человека А549, в соответствии с введением белка LK8.FIG. 5 is a graph showing changes in tumor size in a mouse transplanted with A549 human lung cancer cells in accordance with the administration of the LK8 protein.
ФИГ.6 представляет собой серию графиков, показывающих изменения размеров опухоли (а) и массы опухоли (b) у мышей, которым трансплантировали клетки рака прямой кишки и рака толстой кишки человека LS 174Т, в соответствии с введением белка LK8.FIG.6 is a series of graphs showing changes in tumor size (a) and tumor mass (b) in mice transplanted with colon cancer cells and human colon cancer LS 174T, in accordance with the introduction of protein LK8.
ПримерыExamples
Практические и в настоящее время предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения являются иллюстративными, как показано в следующих примерах.Practical and currently preferred embodiments of the present invention are illustrative, as shown in the following examples.
Однако следует оценить тот факт, что специалисты, принимая во внимание настоящее описание, могут производить модификации и улучшения в пределах идеи и объема настоящего изобретения.However, one should appreciate the fact that specialists, taking into account the present description, can make modifications and improvements within the scope of the idea and scope of the present invention.
Пример 1: Изготовление белка LK8Example 1: Production of LK8 Protein
<1-1> Построение экспрессирующего вектора LK8 pMBRI-LK8<1-1> Construction of the expressing vector LK8 pMBRI-LK8
Для того чтобы эффективно изготовить белок LK8, заявители сначала сконструировали экспрессирующий вектор LK8.In order to efficiently produce the LK8 protein, applicants first constructed the LK8 expression vector.
Для экспрессии гена LK8 использовали вектор pPIC9 (8,0 т.п.н., Invitrogen, Нидерланды) в качестве базового вектора. Как можно видеть на репрезентативной карте, экспрессирующий вектор pPIC9 включает, по порядку, промотор АОХ1, который обеспечивает высокую экспрессию метанолом, сигнал секреции α-фактора, который включает секрецию экспрессируемого белка, 3'AOX1 (TT), сигнал полиаденилирования АОХ1, который обеспечивает эффективную терминацию транскрипции и полиаденилирования, и фрагмент ДНК, кодирующий гистидинол-дегидрогеназу дикого типа Pichia pastoris, которую используют в качестве селектируемого маркера для трансформанта указанного выше штамма.For expression of the LK8 gene, the pPIC9 vector (8.0 kb, Invitrogen, Netherlands) was used as the base vector. As can be seen on the representative map, the pPIC9 expression vector includes, in order, the AOX1 promoter, which provides high methanol expression, the α-factor secretion signal, which includes the secretion of the expressed protein, 3'AOX1 (TT), the AOX1 polyadenylation signal, which provides an effective termination of transcription and polyadenylation, and a DNA fragment encoding the wild-type histidinol dehydrogenase Pichia pastoris, which is used as a selectable marker for transforming the above strain.
Сначала ген LK8 амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров "LK8N-Xhol", представленного SEQ. ID. № 2 и "LK8C-EcoRI", представленного SEQ. ID. № 3, с использованием pET15b/LK8 (см. PCT/KR99/00554) в качестве матрицы. Продукт ПЦР подвергали ферментативному расщеплению с использованием рестрикционных ферментов XhoI и EcoRI, с последующим субклонированием путем инсерции продукта в вектор pPIC9, который подвергали ферментативному расщеплению с использованием тех же рестрикционных ферментов. В конечном итоге был сконструирован экспрессирующий вектор гена LK8 - "pMBRI-LK8" (8,25 т.п.н.).First, the LK8 gene was amplified by PCR using the primers "LK8N-Xhol" represented by SEQ. ID No. 2 and "LK8C-EcoRI" represented by SEQ. ID No. 3, using pET15b / LK8 (see PCT / KR99 / 00554) as a matrix. The PCR product was enzymatically digested using restriction enzymes XhoI and EcoRI, followed by subcloning by insertion of the product into the pPIC9 vector, which was enzymatically digested using the same restriction enzymes. Ultimately, an expression vector of the LK8 gene, “pMBRI-LK8” (8.25 kb), was constructed.
<1-2> Получение трансформанта, включающего pMBRI-LK8<1-2> Obtaining a transformant comprising pMBRI-LK8
Pichia pastoris, метилотропный дрожжевой гриб, использовали в качестве хозяина для получения рекомбинантного трансформанта.Pichia pastoris, a methylotropic yeast fungus, was used as a host to produce a recombinant transformant.
В частности, экспрессирующий вектор гена LK8, "pMBRI-LK8", обрабатывали рестрикционным ферментом SacI, обеспечивающим линеаризацию. Вектор встроили в ген AOXI хромосомы указанного выше штамма-хозяина с использованием гомологичной рекомбинации. В то же время для трансформации осуществляли электропорацию. Рекомбинантный дрожжевой трансформант выбирали со среды с дефицитом гистидина путем изучения колониеобразования. Осуществляли ПЦР для подтверждения инсерции кДНК LK8 в область АОХ1 хромосомы выбранного рекомбинантного трансформанта. Затем рекомбинантный трансформант культивировали, и индуцировали метанолом экспрессию гена LK8. В результате экспрессия гена LK8 была подтверждена, что свидетельствует о массовой секреции белка в культуральной среде.In particular, the LK8 gene expression vector, "pMBRI-LK8", was treated with the SacI restriction enzyme, which provided linearization. The vector was inserted into the AOXI gene of the chromosome of the above host strain using homologous recombination. At the same time, electroporation was performed for transformation. Recombinant yeast transformant was selected from histidine-deficient media by studying colony formation. PCR was performed to confirm the insertion of LK8 cDNA into the AOX1 region of the chromosome of the selected recombinant transformant. Then, the recombinant transformant was cultured, and LK8 gene expression was induced by methanol. As a result, the expression of the LK8 gene was confirmed, indicating mass secretion of the protein in the culture medium.
Секретированный белок LK8 по настоящему изобретению был составлен из аминокислотной последовательности, представленной SEQ. ID. № 1.The secreted LK8 protein of the present invention was composed of the amino acid sequence represented by SEQ. ID Number 1.
<1-3> Культивирование рекомбинантного штамма<1-3> Cultivation of the recombinant strain
<1-3-1> Посевочная культура<1-3-1> Sowing culture
В настоящем изобретении рекомбинантный штамм получали инсерцией гена LK8 в Pichia pastoris. Установленный штамм культивировали после посева в течение 24 часов с получением подходящей биомассы и активности (при разведении в 20 раз ОП600 составляла 0,8-1,2).In the present invention, a recombinant strain was obtained by insertion of the LK8 gene in Pichia pastoris. The established strain was cultured after seeding for 24 hours to obtain the appropriate biomass and activity (when diluted 20 times, the OD 600 was 0.8-1.2).
Посевочную культуру получали в среде YDP (1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 2% декстроза) в течение 24 часов при встряхивании культуры. Использовали ферментер объемом 75 л. Объем первоначальной среды составлял 20 л, а конечный объем культурального раствора доводили до 40 л способом подпитываемой культуры.A seed culture was obtained in YDP medium (1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose) for 24 hours with shaking of the culture. A 75 liter fermenter was used. The volume of the initial medium was 20 L, and the final volume of the culture solution was adjusted to 40 L by the fed culture method.
<1-3-2> Основная культура<1-3-2> Main culture
По окончании культивирования посевочной культуры в среде YPD получали основную культуру с использованием раствора посевочной культуры в количестве 30% от первичной среды. Основную культуру получали в ферментере, содержавшем ингредиенты, перечисленные ниже в таблице 1. Когда фермент насыщался подачей метанола, фермент восстанавливали более чем 10% для продукции белка LK8. Тем временем непрерывно подавали метанол для индуцирования непрерывной экспрессии белка. Процедуру повторяли для получения белка LK8. Скорость потребления источника углерода была пропорциональна количеству клеток. Таким образом, когда некоторое количество фермента восстанавливалось, скорость подачи метанола автоматически регулировалась, таким образом, чтобы она не выходила за пределы ±20%. В результате повторения указанного выше процесса культивирования, во время которого ферментация продолжалась более 200 часов, получали секретированный белок LK8 в количестве 250 мг на 1 л культурального раствора.After cultivation of the seed culture in YPD medium, the main culture was obtained using a seed culture solution in an amount of 30% of the primary medium. The main culture was obtained in a fermenter containing the ingredients listed in table 1 below. When the enzyme was saturated with methanol, the enzyme was reduced to more than 10% to produce LK8 protein. Meanwhile, methanol was continuously fed to induce continuous expression of the protein. The procedure was repeated to obtain LK8 protein. The rate of consumption of the carbon source was proportional to the number of cells. Thus, when a certain amount of the enzyme was restored, the feed rate of methanol was automatically adjusted so that it did not go beyond ± 20%. As a result of the repetition of the above cultivation process, during which fermentation lasted more than 200 hours, secreted LK8 protein was obtained in an amount of 250 mg per 1 liter of culture solution.
Состав среды для основной культурыThe composition of the medium for the main culture
Раствор металлических
микроэлементовMethanol
Metal solution
trace elements
8 мл/л500 g / l
8 ml / l
металлических
микроэлементовSolution composition
metal
trace elements
KI
MnSO4·H2O
NaMo·H2O
H3BO4
CoCl2
ZnCl2
FeSO4·H2O
Биотин
H2SO4 CuSO 4 · 5H 2 O
Ki
MnSO 4 H 2 O
NaMo · H 2 O
H 3 BO 4
CoCl 2
ZnCl 2
FeSO 4 · H 2 O
Biotin
H 2 SO 4
0,3 г/л
4 г/л
0,1 г/л
0,01 г/л
0,1 г/л
3 г/л
10 г/л
0,1 г/л
5 мл/л4 g / l
0.3 g / l
4 g / l
0.1 g / l
0.01 g / l
0.1 g / l
3 g / l
10 g / l
0.1 g / l
5 ml / l
Пример 2: Экспериментальное метастазирование в легкие с использованием внутривенного введения клеток мышиной меланомы B16F10Example 2: Experimental lung metastasis using intravenous administration of murine melanoma B16F10 cells
Клетки B16F10 (1,8Ч105) мышиной меланомы (далее в настоящем документе упоминаются как «клетки меланомы») (Американская коллекция типовых культур) вводили в хвостовую вену мыши C57BL/6 (Charles River Japan, Inc.). Начиная со следующего дня, белок LK8, полученный в описанном выше <примере 1>, инъецировали подкожно дважды (1 мг/кг в день, 0,2 мг/кг в день) в день в течение 14 дней. Контрольной группе инъецировали PBS вместо белка LK8. На 13-й день после трансплантации клеток мышь вскрывали и извлекали легкое для подсчета количества колоний метастазировавших злокачественных клеток (клеток меланомы).Murine melanoma B16F10 (1.8 × 10 5 ) cells (hereinafter referred to as “melanoma cells”) (American Type Culture Collection) were introduced into the tail vein of a C57BL / 6 mouse (Charles River Japan, Inc.). Starting from the next day, the LK8 protein obtained in the above <Example 1> was injected subcutaneously twice (1 mg / kg per day, 0.2 mg / kg per day) per day for 14 days. The control group was injected with PBS instead of LK8 protein. On the 13th day after cell transplantation, the mouse was opened and the lung was removed to count the number of colonies of metastatic malignant cells (melanoma cells).
В результате, огромные колонии сформировались в легких у мышей контрольной группы, которым инъецировали PBS, что свидетельствует о переносе клеток меланомы (ФИГ.2а). Напротив, количество и размеры колоний, образовавшихся переносом клеток меланомы, были значительно меньше в экспериментальной группе мышей, которым инъецировали белок LK8 (ФИГ.2b). В заключение можно сказать, что в группе, леченной белком LK8 1 мг/кг, наблюдалось 53% ингибирование метастазирования по сравнению с контрольной группой (ФИГ.2с).As a result, huge colonies formed in the lungs of the mice of the control group, which were injected with PBS, which indicates the transfer of melanoma cells (FIG. 2A). In contrast, the number and size of the colonies formed by the transfer of melanoma cells were significantly smaller in the experimental group of mice injected with LK8 protein (FIG. 2b). In conclusion, we can say that in the group treated with LK8 protein 1 mg / kg, there was a 53% inhibition of metastasis compared with the control group (FIG. 2c).
Пример 3: Экспериментальное метастазирование в печень с использованием внутривенного введения клеток мышиного колоректального рака СТ-26Example 3: Experimental liver metastasis using intravenous administration of CT-26 mouse colorectal cancer cells
Клетки СТ-26 (Американская коллекция типовых культур), клетки мышиного колоректального рака, инъецировали в селезенку для индуцирования метастазирования в печень. Затем изучали эффект ингибирования образования метастазов белка LK8. В частности, клетки СТ-26, которые были на 80% выращены на планшете, промывали PBS с последующей сингуляризацией 0,02% EDTA. Одиночные клетки снова промывали PBS, затем тщательно ресуспендировали в PBS. Суспензию окрашивали трипановым синим для подсчета количества клеток. Плотность клеток доводили до 5·105/мл, которые затем инъецировали каждой мыши в 100 мкл. Использовали 6 ~ 8-недельных мышей Balb/c (Charles River Japan, Inc.). После хирургического разреза правой части живота суспензию раковых клеток осторожно инъецировали в селезенку иглой калибра 30. Белок LK8 подкожно инъецировали экспериментальной группе два раза в день в количестве 10 мг/кг, и подобным же образом инъецировали физиологический раствор контрольной группе. Спустя 14 дней мышей умерщвляли для исследования печени (ФИГ.3а) и подсчитывали количество колоний, видимых на поверхности печени, которая была фиксирована в 10% растворе формалина. Не наблюдалось большой разницы в весе между группами. Однако количество колоний, которые были перенесены в печень, было значительно меньше в экспериментальной группе, которой вводили белок LK8 в количестве 10 мг/кг в день, чем в контрольной группе. Уменьшение количества колоний в экспериментальной группе, которой инъецировали белок LK8 в количестве 10 мг/кг в день, составляло приблизительно 60%, по сравнению с контрольной группой (ФИГ.3b). Кроме того, срезу печеночной ткани, которая была фиксирована в растворе формалина, окрашивали гематоксилин-эозином и изучали. В результате область опухоли была значительно ограничена в экспериментальной группе, леченной белком LK8, по сравнению с контрольной группой (ФИГ.3с).CT-26 cells (American Type Culture Collection), mouse colorectal cancer cells, were injected into the spleen to induce liver metastasis. Then studied the effect of inhibiting the formation of metastases of the protein LK8. In particular, CT-26 cells, which were 80% grown on a plate, were washed with PBS, followed by singularization of 0.02% EDTA. Single cells were washed again with PBS, then carefully resuspended in PBS. The suspension was stained with trypan blue to count the number of cells. The cell density was adjusted to 5 · 10 5 / ml, which were then injected into each mouse in 100 μl. Used 6 ~ 8-week-old Balb / c mice (Charles River Japan, Inc.). After a surgical incision in the right abdomen, a suspension of cancer cells was carefully injected into the spleen with a 30 gauge needle. LK8 protein was subcutaneously injected to the experimental group twice a day at 10 mg / kg, and physiological saline was injected in the same way to the control group. After 14 days, the mice were sacrificed for liver examination (FIG. 3a) and the number of colonies visible on the surface of the liver, which was fixed in a 10% formalin solution, was counted. There was not much difference in weight between the groups. However, the number of colonies that were transferred to the liver was significantly less in the experimental group, which was injected with LK8 protein in the amount of 10 mg / kg per day than in the control group. The decrease in the number of colonies in the experimental group, which was injected with LK8 protein in the amount of 10 mg / kg per day, was approximately 60%, compared with the control group (FIG. 3b). In addition, a section of liver tissue that was fixed in a formalin solution was stained with hematoxylin-eosin and studied. As a result, the tumor region was significantly limited in the experimental group treated with LK8 protein, compared with the control group (FIG. 3c).
Пример 4: Ингибирование роста первичной опухолиExample 4: Inhibition of Primary Tumor Growth
Для того чтобы изучить влияние белка LK8 на антиангиогенез in vivo, использовали модель ксенотрансплантированной опухоли. Каждый релевантный эксперимент выполняли с использованием 4-недельных, отобранных слепым способом самок бестимусных мышей Balb/c nu/nu (Charles River Japan, Inc.), которые были выращены в стерильных условиях.In order to study the effect of LK8 protein on in vivo antiangiogenesis, a xenograft tumor model was used. Each relevant experiment was performed using 4-week-old, blindly selected female Balb / c nu / nu nude mice (Charles River Japan, Inc.) that were grown under sterile conditions.
<Рак предстательной железы человека (РС-3)><Human Prostate Cancer (RS-3)>
Клетки рака предстательной железы человека РС-3 (Американская коллекция типовых культур) культивировали в среде RPMI 1640 (GIBCO™, Invitrogen Corporation) с добавлением 10% FBS и приблизительно 5·106 клеток РС-3 подкожно инъецировали в центральную мышечную область спины бестимусной мыши. Ровно через 10 дней после трансплантации белок LK8 инъецировали в количестве 100 мг/кг в день. В то же время контрольной группе инъецировали только PBS вместо белка LK8. Лечение продолжали в течение 30 дней, затем размер опухоли измеряли каждые 3-4 дня. В результате рост опухоли был подавлен лечением белком LK8, что составляло приблизительно 60% ингибирование по сравнению с контрольной группой (ФИГ.4а). В случае, когда белок LK8 инъецировали в количестве 50 мг/кг в день, рост опухоли был подавлен сходным образом свыше 60% по сравнению с контрольной группой (ФИГ.4b).Human prostate cancer cells PC-3 (American Type Culture Collection) were cultured in RPMI 1640 medium (GIBCO ™, Invitrogen Corporation) supplemented with 10% FBS and approximately 5 · 10 6 PC-3 cells were injected subcutaneously into the central muscle region of the athymic mouse . Exactly 10 days after transplantation, LK8 protein was injected in an amount of 100 mg / kg per day. At the same time, only PBS was injected into the control group instead of LK8 protein. The treatment was continued for 30 days, then the tumor size was measured every 3-4 days. As a result, tumor growth was suppressed by treatment with LK8 protein, which was approximately 60% inhibition compared to the control group (FIG. 4a). In the case when the LK8 protein was injected in an amount of 50 mg / kg per day, tumor growth was similarly suppressed by more than 60% compared with the control group (FIG. 4b).
<4-2> Рак легкого человека (А549)<4-2> Cancer of the lung of a person (A549)
Клетки рака легкого человека А549 (Американская коллекция типовых культур) культивировали в среде DMEM (GIBCO™, Invitrogen Corporation) с добавлением 10% FBS. Затем приблизительно 1·107 опухолевых клеток подкожно инъецировали в центральную мышечную область спины бестимусной мыши. Ровно через 5 дней после трансплантации белок LK8 инъецировали в количестве 50 мг/кг в день. Контрольной группе инъецировали только PBS вместо белка LK8. Лечение продолжали в течение 46 дней, затем размер опухоли измеряли каждые 3-4 дня. В результате рост опухоли был подавлен лечением белком LK8, что составляло 61% ингибирование по сравнению с контролем (ФИГ.5).A549 human lung cancer cells (American Type Culture Collection) were cultured in DMEM (GIBCO ™, Invitrogen Corporation) supplemented with 10% FBS. Then, approximately 1 · 10 7 tumor cells were subcutaneously injected into the central muscle region of the back of the athymic mouse. Exactly 5 days after transplantation, LK8 protein was injected in an amount of 50 mg / kg per day. The control group was only injected with PBS instead of LK8 protein. Treatment was continued for 46 days, then the tumor size was measured every 3-4 days. As a result, tumor growth was suppressed by treatment with LK8 protein, which was 61% inhibition compared to control (FIG. 5).
<4-3> Рак толстой и прямой кишки человека (LS 174T)<4-3> Cancer of the colon and rectum of a person (LS 174T)
Клетки рака толстой и прямой кишки человека LS 174T (Американская коллекция типовых культур) культивировали в среде RPMI (GIBCO™, Invitrogen Corporation) с добавлением 10% FBS. Затем 5·106 опухолевых клеток подкожно инъецировали в центральную мышечную область спины бестимусной мыши. Ровно через 5 дней после трансплантации белок LK8 инъецировали в количестве 50 мг/кг в день. Контрольной группе вводили только PBS вместо белка LK8. Лечение продолжали в течение 34 дней, затем размер опухоли измеряли каждые 3-4 дня. В результате рост опухоли был подавлен лечением белком LK8, что составляло 64% ингибирование по сравнению с контролем (ФИГ.6а). Также вес опухоли уменьшался при лечении белком LK8 приблизительно на 68,7%, по измерению в последний день эксперимента (ФИГ.6b).Human colon and rectal cancer cells LS 174T (American Type Culture Collection) were cultured in RPMI medium (GIBCO ™, Invitrogen Corporation) supplemented with 10% FBS. Then 5 · 10 6 tumor cells were subcutaneously injected into the central muscle region of the back of a nude mouse. Exactly 5 days after transplantation, LK8 protein was injected in an amount of 50 mg / kg per day. Only PBS was administered to the control group instead of LK8 protein. Treatment was continued for 34 days, then tumor size was measured every 3-4 days. As a result, tumor growth was suppressed by treatment with LK8 protein, which was 64% inhibition compared to the control (FIG. 6a). Also, the tumor weight decreased during treatment with LK8 protein by approximately 68.7%, as measured on the last day of the experiment (FIG.6b).
Пример 5: Тест на острую токсичность белка LK8Example 5: LK8 Protein Acute Toxicity Test
В тесте на острую токсичность использовали 5-недельных крыс линии SPF SD (Sprague Dawley). Крыс разделяли на 5 групп и 5 крысам каждой группы вводили однократно белок LK8 в дозах 260 мкг, 364 мг/кг, 510 мг/кг, 714 мг/кг и 1000 мг/кг соответственно, путем внутривенной инъекции (таблица 2). В течение 14 дней после введения испытуемого материала, белка LK8, наблюдали смерть, клинические симптомы и изменения массы тела. Были проведены гематологические анализы и биохимические анализы крови, и любые патологические признаки в желудочно-кишечном тракте, органах грудной клетки и живота изучали визуально во время вскрытия. В результате выявили слабую токсичность в группе, которой вводили 1000 мг/кг белка LK8, но ни случаев токсичности, ни случаев смерти не было выявлено в других группах в большинстве тестов, включая изменения массы тела, анализ крови, гематологические анализы и биохимические анализы крови, вскрытие и т.п. Таким образом, белок LK8, использовавшийся в указанном эксперименте, был оценен как безопасное вещество, поскольку он не вызывал никаких токсических изменений у крыс вплоть до уровня 1000 мг/кг, а его установленные величины LD50 были значительно больше, чем 1000 мг/кг для крыс (таблица 2).In the acute toxicity test, 5-week-old SPF SD rats (Sprague Dawley) were used. Rats were divided into 5 groups and 5 rats of each group were injected once with LK8 protein at doses of 260 μg, 364 mg / kg, 510 mg / kg, 714 mg / kg and 1000 mg / kg, respectively, by intravenous injection (table 2). Within 14 days after administration of the test material, LK8 protein, death, clinical symptoms, and changes in body weight were observed. Hematological tests and biochemical blood tests were performed, and any pathological signs in the gastrointestinal tract, organs of the chest and abdomen were examined visually during the autopsy. As a result, mild toxicity was detected in the group that was injected with 1000 mg / kg of LK8 protein, but neither toxicity nor death was detected in other groups in most tests, including changes in body weight, blood tests, hematological tests and biochemical blood tests, autopsy, etc. Thus, the LK8 protein used in this experiment was evaluated as a safe substance because it did not cause any toxic changes in rats up to the level of 1000 mg / kg, and its established LD50 values were significantly greater than 1000 mg / kg for rats (table 2).
Количество случаев смерти по дням после введения белка LK8The number of deaths by days after administration of LK8 protein
общее количество крыс в испытанииtotal number of rats in the test
ПРИМЕНИМОСТЬ В ПРОМЫШЛЕННОСТИINDUSTRIAL APPLICABILITY
Как было объяснено ранее в настоящем документе, белок LK8 обладает ингибирующим действием на метастазирование, в частности на рост рака предстательной железы человека, рак легкого, рак толстой кишки и рак прямой кишки, при системном введении. Таким образом, противораковый агент, содержащий белок LK8, по настоящему изобретению можно эффективно использовать в качестве агента для лечения первичной опухоли или ингибитора метастазирования.As explained earlier in this document, the LK8 protein has an inhibitory effect on metastasis, in particular on the growth of human prostate cancer, lung cancer, colon cancer and colon cancer, when administered systemically. Thus, the anticancer agent containing the LK8 protein of the present invention can be effectively used as an agent for treating a primary tumor or an inhibitor of metastasis.
Специалисты оценят тот факт, что концепции и конкретные варианты осуществления настоящего изобретения, раскрытые в описании, можно легко использовать в качестве основы для модификации или разработки других вариантов осуществления таких же целей настоящего изобретения. Специалисты оценят также тот факт, что указанные эквивалентные варианты осуществления настоящего изобретения не отступают от идеи и объема настоящего изобретения, которые изложены в прилагаемой формуле изобретения.Those skilled in the art will appreciate the fact that the concepts and specific embodiments of the present invention disclosed herein can easily be used as a basis for modifying or developing other embodiments of the same objectives of the present invention. Those skilled in the art will also appreciate the fact that these equivalent embodiments of the present invention do not depart from the idea and scope of the present invention as set forth in the appended claims.
Claims (7)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020030010797A KR100595364B1 (en) | 2003-02-20 | 2003-02-20 | Anticancer agent containing L8 protein as an active ingredient |
| KR10-2003-0010797 | 2003-02-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2005129273A RU2005129273A (en) | 2006-03-10 |
| RU2306147C2 true RU2306147C2 (en) | 2007-09-20 |
Family
ID=36116045
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005129273/15A RU2306147C2 (en) | 2003-02-20 | 2004-02-20 | Anticancer agent containing lk8 protein as active ingredient |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1608395A4 (en) |
| JP (1) | JP2006518342A (en) |
| KR (1) | KR100595364B1 (en) |
| CN (1) | CN100546646C (en) |
| AU (1) | AU2004212856B2 (en) |
| BR (1) | BRPI0407611A (en) |
| CA (1) | CA2516172A1 (en) |
| RU (1) | RU2306147C2 (en) |
| WO (1) | WO2004073730A1 (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7960348B2 (en) | 2005-12-22 | 2011-06-14 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Metastin derivatives and use thereof |
| US8361968B2 (en) | 2002-12-26 | 2013-01-29 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Metastin derivatives and use thereof |
| US8404643B2 (en) | 2005-12-22 | 2013-03-26 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Metastin derivatives and use thereof |
| US8765909B2 (en) | 2006-10-25 | 2014-07-01 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Metastin derivatives and use thereof |
| US8778871B2 (en) | 2004-06-25 | 2014-07-15 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Metastin derivatives and use thereof |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7285277B2 (en) | 2002-03-15 | 2007-10-23 | Mogam Biotechnology Research Institute | Anticancer agent |
| KR100681762B1 (en) * | 2004-01-09 | 2007-02-15 | 재단법인 목암생명공학연구소 | Anti-cancer agent containing human apolipoprotein (a) Kringle Lv68 or Lv8 gene as an active ingredient and a method for treating cancer using the same |
| KR100888022B1 (en) | 2006-12-21 | 2009-03-09 | 재단법인 목암생명공학연구소 | Fusion protein between immunoglobulin Fc and human apolipoprotein (a) kringle fragment L8 8Fc |
| FR2919062B1 (en) | 2007-07-19 | 2009-10-02 | Biomerieux Sa | METHOD OF DETERMINING AMINOACYLASE 1 FOR IN VITRO DIAGNOSIS OF COLORECTAL CANCER. |
| FR2919061B1 (en) | 2007-07-19 | 2009-10-02 | Biomerieux Sa | METHOD OF DOSING PLASTINE-I FOR IN VITRO DIAGNOSIS OF COLORECTAL CANCER. |
| FR2919064B1 (en) | 2007-07-19 | 2009-10-02 | Biomerieux Sa | METHOD OF ASSAYING APOLIPOPROTEIN ALL FOR IN VITRO DIAGNOSIS OF COLORECTAL CANCER |
| FR2919060B1 (en) | 2007-07-19 | 2012-11-30 | Biomerieux Sa | METHOD OF DETERMINING EZRINE FOR IN VITRO DIAGNOSIS OF COLORECTAL CANCER |
| FR2919063B1 (en) | 2007-07-19 | 2009-10-02 | Biomerieux Sa | METHOD OF DETERMINING LEUCOCYTE ELASTASE INHIBITOR FOR IN VITRO DIAGNOSIS OF COLORECTAL CANCER. |
| JP5715817B2 (en) | 2007-07-19 | 2015-05-13 | ビオメリューＢｉｏｍｅｒｉｅｕｘ | Method for assay of liver fatty acid binding protein, CEA and CA19-9 for in vitro diagnosis of colorectal cancer |
| FR2919065B1 (en) | 2007-07-19 | 2009-10-02 | Biomerieux Sa | METHOD FOR DETERMINING APOLIPOPROTEIN AI FOR IN VITRO DIAGNOSIS OF COLORECTAL CANCER |
| FR2933773B1 (en) | 2008-07-10 | 2013-02-15 | Biomerieux Sa | METHOD FOR DETERMINING THE ISOMERASE DISULFIDE PROTEIN FOR IN VITRO DIAGNOSIS OF COLORECTAL CANCER |
| WO2012067427A2 (en) * | 2010-11-16 | 2012-05-24 | 재단법인 목암생명공학연구소 | Pharmaceutical composition containing lk8 protein as an active ingredient for preventing or treating diabetic retinopathy or age-related macular degeneration |
| WO2024229406A1 (en) | 2023-05-04 | 2024-11-07 | Revolution Medicines, Inc. | Combination therapy for a ras related disease or disorder |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001019868A1 (en) * | 1999-09-15 | 2001-03-22 | Mogam Biotechnology Research Institute | A novel angiogenesis inhibitor |
-
2003
- 2003-02-20 KR KR1020030010797A patent/KR100595364B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-02-20 CA CA002516172A patent/CA2516172A1/en not_active Abandoned
- 2004-02-20 BR BRPI0407611-7A patent/BRPI0407611A/en not_active IP Right Cessation
- 2004-02-20 EP EP04713257A patent/EP1608395A4/en not_active Withdrawn
- 2004-02-20 AU AU2004212856A patent/AU2004212856B2/en not_active Ceased
- 2004-02-20 RU RU2005129273/15A patent/RU2306147C2/en not_active IP Right Cessation
- 2004-02-20 WO PCT/KR2004/000357 patent/WO2004073730A1/en active IP Right Grant
- 2004-02-20 JP JP2006500650A patent/JP2006518342A/en not_active Withdrawn
- 2004-02-20 CN CNB2004800048895A patent/CN100546646C/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001019868A1 (en) * | 1999-09-15 | 2001-03-22 | Mogam Biotechnology Research Institute | A novel angiogenesis inhibitor |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SCANU et al. Apolipoprotein (a: structyral and functional consequenses of mutations in kringle type 10 (or kringle 4-37), Clinical Genenics, July 1994, vol.46, pp.42-45. GABEL et al. Sequences within apolipoprotein(a) kringle IV types 6-8 bind directly to low-density lipoprotein and mediate noncovalent association of apolipoprotein(a) with apoliporotein B-100, Biochemistry, May 1998, vol.37, pp.7892-7898. * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8361968B2 (en) | 2002-12-26 | 2013-01-29 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Metastin derivatives and use thereof |
| US8778871B2 (en) | 2004-06-25 | 2014-07-15 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Metastin derivatives and use thereof |
| US7960348B2 (en) | 2005-12-22 | 2011-06-14 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Metastin derivatives and use thereof |
| US8404643B2 (en) | 2005-12-22 | 2013-03-26 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Metastin derivatives and use thereof |
| US8765909B2 (en) | 2006-10-25 | 2014-07-01 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Metastin derivatives and use thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2004212856B2 (en) | 2007-07-19 |
| BRPI0407611A (en) | 2006-02-14 |
| EP1608395A4 (en) | 2007-10-31 |
| AU2004212856A1 (en) | 2004-09-02 |
| KR20040075270A (en) | 2004-08-27 |
| EP1608395A1 (en) | 2005-12-28 |
| RU2005129273A (en) | 2006-03-10 |
| CN100546646C (en) | 2009-10-07 |
| CN1753685A (en) | 2006-03-29 |
| CA2516172A1 (en) | 2004-09-02 |
| WO2004073730A1 (en) | 2004-09-02 |
| KR100595364B1 (en) | 2006-07-03 |
| JP2006518342A (en) | 2006-08-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2306147C2 (en) | Anticancer agent containing lk8 protein as active ingredient | |
| KR100861428B1 (en) | Fatty acid analogs for cancer treatment | |
| CN109692326A (en) | A kind of application of bee venom lipidic nanoparticles | |
| CN109528654A (en) | A kind of irinotecan hydrochloride and doxorubicin hydrochloride carry liposome and preparation method thereof altogether | |
| Velázquez et al. | Butyrate inhibits seeding and growth of colorectal metastases to the liver in mice | |
| EP0774255A1 (en) | Use of ursolic acid for the manufacture of a medicament for suppressing metastasis | |
| EP4378453A1 (en) | Dual-targeting biomimetic liposome containing elemene and cabazitaxel, and preparation method therefor and use thereof | |
| Lee et al. | Effect of onconase±tamoxifen on AsPC-1 human pancreatic tumors in nude mice | |
| CN114948959B (en) | A kind of nanomedicine that regulates tumor lactate metabolism and its preparation method and application | |
| CN116726021A (en) | A combination drug of DRP1 inhibitor and ferroptosis inducer and its anti-tumor use | |
| TW201406371A (en) | Magnolol for new treatment of bladder cancer and/or inhibition of cancer metastasis and/or improvement of cachexia | |
| EP0768084A1 (en) | Cancerous metastasis inhibitor | |
| US7150870B2 (en) | Anti-tumor agent | |
| Li et al. | The enhanced treatment efficacy of invasive brain glioma by dual-targeted artemether plus paclitaxel micelles | |
| CN110575450B (en) | Application of 2, 5-furandimethanol in preparation of antitumor drugs | |
| US20180133192A1 (en) | Fructose analogs and their combinations as anti-cancer agents | |
| CN116036289A (en) | Nanometer preparation for enhancing iron death treatment effect, and preparation method and application thereof | |
| Ohkoshi et al. | Clinical experience with a protease inhibitor [N, N-dimethylcarbamoylmethyl 4-(4-guanidinobenzoyloxy)-phenylacetate] methanesulfate for prevention of recurrence of carcinoma of the mouth and in treatment of terminal carcinoma | |
| CN112618569A (en) | Medicine for treating urothelial cancer | |
| KR101002672B1 (en) | Chromoline-containing PEGylated liposomes and methods for preparing the same | |
| Oikawa et al. | A potential use of a synthetic retinoid TAC‐101 as an orally active agent that blocks angiogenesis in liver metastases of human stomach cancer cells | |
| CN111265555A (en) | Application of ganoderma lucidum spore extract in relieving gastrointestinal side effects caused by chemotherapeutic drugs | |
| JPWO2006035515A1 (en) | Pharmaceutical composition for treating or preventing superficial bladder cancer, and use thereof | |
| CN111467367B (en) | Plant monomer composition for inhibiting tumor cell growth and preparation method and application thereof | |
| CN107412736A (en) | A kind of antineoplastic combination medicine and its purposes in cancer therapy drug is prepared |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140221 |