RU2276157C2 - Polysaccharide eliciting immunostimulating activity, method for its preparing and using - Google Patents
Polysaccharide eliciting immunostimulating activity, method for its preparing and using Download PDFInfo
- Publication number
- RU2276157C2 RU2276157C2 RU2003119072/04A RU2003119072A RU2276157C2 RU 2276157 C2 RU2276157 C2 RU 2276157C2 RU 2003119072/04 A RU2003119072/04 A RU 2003119072/04A RU 2003119072 A RU2003119072 A RU 2003119072A RU 2276157 C2 RU2276157 C2 RU 2276157C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cancer
- treatment
- polysaccharide
- flowers
- stage
- Prior art date
Links
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title claims abstract description 48
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 48
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title claims abstract description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 title description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 39
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 18
- FJEKYHHLGZLYAT-FKUIBCNASA-N galp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)N)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CNC=N1 FJEKYHHLGZLYAT-FKUIBCNASA-N 0.000 claims abstract description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 101150019464 ARAF gene Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 240000001432 Calendula officinalis Species 0.000 claims abstract description 8
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000002803 maceration Methods 0.000 claims abstract description 5
- HMFHBZSHGGEWLO-HWQSCIPKSA-N L-arabinofuranose Chemical compound OC[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-HWQSCIPKSA-N 0.000 claims abstract 2
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 claims abstract 2
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims abstract 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract 2
- 229960003082 galactose Drugs 0.000 claims abstract 2
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 16
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 claims description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 5
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 claims description 4
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims description 4
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 4
- 208000036071 Rhinorrhea Diseases 0.000 claims description 4
- 206010039101 Rhinorrhoea Diseases 0.000 claims description 4
- 230000007815 allergy Effects 0.000 claims description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 4
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 4
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 claims description 4
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 3
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 3
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 201000005825 prostate adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 3
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 3
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 claims description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 2
- 238000013532 laser treatment Methods 0.000 claims description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 15
- 235000005881 Calendula officinalis Nutrition 0.000 abstract description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 238000003801 milling Methods 0.000 abstract 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 26
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 15
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 8
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 231100000111 LD50 Toxicity 0.000 description 6
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 5
- HMFHBZSHGGEWLO-QMKXCQHVSA-N alpha-L-arabinofuranose Chemical compound OC[C@@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-QMKXCQHVSA-N 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 5
- 238000003929 heteronuclear multiple quantum coherence Methods 0.000 description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 5
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 5
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 5
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 5
- 238000011076 safety test Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 238000001460 carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000005100 correlation spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 3
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 3
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- AJBZENLMTKDAEK-UHFFFAOYSA-N 3a,5a,5b,8,8,11a-hexamethyl-1-prop-1-en-2-yl-1,2,3,4,5,6,7,7a,9,10,11,11b,12,13,13a,13b-hexadecahydrocyclopenta[a]chrysene-4,9-diol Chemical compound CC12CCC(O)C(C)(C)C1CCC(C1(C)CC3O)(C)C2CCC1C1C3(C)CCC1C(=C)C AJBZENLMTKDAEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000132025 Calendula Species 0.000 description 2
- 235000003880 Calendula Nutrition 0.000 description 2
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000981253 Mus musculus GPI-linked NAD(P)(+)-arginine ADP-ribosyltransferase 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 235000014134 echinacea Nutrition 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000000105 evaporative light scattering detection Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- XILIYVSXLSWUAI-UHFFFAOYSA-N 2-(diethylamino)ethyl n'-phenylcarbamimidothioate;dihydrobromide Chemical compound Br.Br.CCN(CC)CCSC(N)=NC1=CC=CC=C1 XILIYVSXLSWUAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 3-(trimethylsilyl)propane-1-sulfonic acid Chemical compound C[Si](C)(C)CCCS(O)(=O)=O TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011749 CBA mouse Methods 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-OUBTZVSYSA-N Carbon-13 Chemical group [13C] OKTJSMMVPCPJKN-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 244000133098 Echinacea angustifolia Species 0.000 description 1
- 240000004530 Echinacea purpurea Species 0.000 description 1
- UKIYDXCFKFLIMU-UHFFFAOYSA-M Isopaque Chemical compound [Na+].CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I UKIYDXCFKFLIMU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 231100000215 acute (single dose) toxicity testing Toxicity 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000002518 distortionless enhancement with polarization transfer Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000007233 immunological mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940047091 other immunostimulants in atc Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Настоящее изобретение относится к полисахариду формулы I, обнаруживающему иммуностимулирующую активность, к способу его получения, к его применению при лечении иммуносупрессорных заболеваний и к содержащим его фармацевтическим композициям.The present invention relates to a polysaccharide of formula I, which detects immunostimulatory activity, to a method for its preparation, to its use in the treatment of immunosuppressive diseases, and to pharmaceutical compositions containing it.
Уровень техникиState of the art
Иммунную систему можно определить как собрание молекул, клеток и органов, чьи сложные взаимодействия образуют эмерджентную систему, как правило, способную защитить индивидуум как от внешних посягательств, так и от собственных измененных клеток.The immune system can be defined as a collection of molecules, cells and organs, whose complex interactions form an emergent system, as a rule, capable of protecting an individual both from external attacks and from his own altered cells.
Иммунную систему можно разделить на две функционально различные части: часть, элементы которой являются врожденными, и часть, элементы которой являются приобретенными. Врожденный иммунитет относят на счет иммунных элементов, которые неспецифические и неадаптивные. Они способны различать инородные ткани/организмы, но не способны распознавать определенного посягателя. Приобретенный иммунитет относят на счет элементов, которые специфичны и адаптивны. Они способны отличать инородные клетки от собственных и могут отличать один инородный антиген от другого. Приобретенный иммунитет обладает памятью. Это делает возможными иммунизацию и сопротивление повторному заражению тем же микроорганизмом. Клетками, ответственными за иммунитет, являются лимфоциты, у которых существует два подкласса - В- и Т-клетки.The immune system can be divided into two functionally different parts: the part, the elements of which are innate, and the part, the elements of which are acquired. Congenital immunity is attributed to immune elements that are non-specific and non-adaptive. They are able to distinguish between foreign tissues / organisms, but they are not able to recognize a specific attacker. Acquired immunity is attributed to elements that are specific and adaptive. They are able to distinguish foreign cells from their own and can distinguish one foreign antigen from another. Acquired immunity has memory. This makes immunization and resistance to reinfection with the same microorganism possible. The cells responsible for the immune system are lymphocytes, in which there are two subclasses - B and T cells.
Приобретенного иммунитета можно добиться или путем естественного заражения или вакцинации (активным путем), или путем введения иммуноцитов (пассивным путем). В то время как на первом пути обнаруживается длительное действие, которое даже может стать постоянным, на последнем действие не является длительным.Acquired immunity can be achieved either by natural infection or vaccination (active way), or by introducing immunocytes (passive way). While the first path reveals a long-lasting action that can even become permanent, the last path does not last long.
Пациентов с иммуносупрессорными заболеваниями лечат иммуностимуляторами для того, чтобы активировать их иммунную систему. Различные иммуностимуляторы известны из US 4801578, US 5417979, WO 9851319. Иммуностимуляторы на основе полисахаридов известны из DE 18917177 и ЕР 0225496. В указанных патентах описываются полисахариды с иммуностимулирующей активностью и их получение из культур растительных клеток. В качестве растений используют Echinacea purpurea, Echinacea angustifolia и Calendula officinalis.Patients with immunosuppressive diseases are treated with immunostimulants in order to activate their immune system. Various immunostimulants are known from US 4801578, US 5417979, WO 9851319. Polysaccharide-based immunostimulants are known from DE 18917177 and EP 0225496. These patents describe polysaccharides with immunostimulating activity and their preparation from plant cell cultures. As plants, Echinacea purpurea, Echinacea angustifolia and Calendula officinalis are used.
Однако ни один из указанных стимуляторов не обнаруживает удовлетворительной активности в случае иммуносупрессорных заболеваний. Таким образом сохраняется потребность в других иммуностимуляторах, обнаруживающих улучшенную активность в широком спектре.However, none of these stimulants shows satisfactory activity in the case of immunosuppressive diseases. Thus, there remains a need for other immunostimulants that exhibit improved activity in a wide range.
Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
Настоящее изобретение относится к полисахариду формулы I, обнаруживающему иммуностимулирующую активность, способу его получения, его применению при лечении иммуносупрессорных заболеваний и к содержащим его фармацевтическим композициям.The present invention relates to a polysaccharide of formula I, which detects immunostimulatory activity, a method for its preparation, its use in the treatment of immunosuppressive diseases, and pharmaceutical compositions containing it.
В одном аспекте изобретение относится к полисахаридам формулы I:In one aspect, the invention relates to polysaccharides of the formula I:
Схема IScheme I
где n=7-8.where n = 7-8.
Во втором аспекте изобретение относится к способу получения полисахарида формулы I. Указанный способ включает, во-первых, получение водного экстракта из растения Calendula officinalis согласно способу, описанному в находящейся в процессе одновременного рассмотрения заявке авторов данного изобретения, и, во-вторых, выделение полисахарида с использованием сочетания методов разделения, направляемых биоанализом.In a second aspect, the invention relates to a method for producing a polysaccharide of formula I. This method includes, firstly, obtaining an aqueous extract from a Calendula officinalis plant according to the method described in the pending application of the authors of this invention, and secondly, isolating the polysaccharide using a combination of separation methods guided by bioanalysis.
В другом аспекте изобретение относится к применению полисахарида формулы I настоящего изобретения в качестве лечебного средства при лечении иммуносупрессорных заболеваний, таких как рак, туберкулез, грипп, насморк, аллергии, красная волчанка, псориаз и СПИД.In another aspect, the invention relates to the use of a polysaccharide of formula I of the present invention as a therapeutic agent in the treatment of immunosuppressive diseases such as cancer, tuberculosis, influenza, runny nose, allergies, lupus erythematosus, psoriasis and AIDS.
В другом аспекте изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим полисахарид формулы I.In another aspect, the invention relates to pharmaceutical compositions comprising a polysaccharide of formula I.
Настоящая заявка включает представленные фигуры и таблицы.This application includes figures and tables.
Фигура 1 представляет собой схему выделения PF2.Figure 1 is a diagram of the allocation of PF2.
Фигура 2 представляет собой схему выделения PF2R.Figure 2 is a diagram of the allocation of PF2R.
Фигура 3 представляет собой спектр 1Н-ЯМР PF2RS8A.Figure 3 is a 1 H-NMR spectrum of PF2RS8A.
Фигура 4 представляет собой спектр 13С-ЯМР PF2RS8A.Figure 4 is a 13 C-NMR spectrum of PF2RS8A.
Фигура 5 представляет собой ТСХ продуктов гидролиза PF2RS8A ТФК и других моносахаридов.Figure 5 is a TLC of the hydrolysis products of PF2RS8A TFA and other monosaccharides.
Фигура 6 представляет собой схему выделения PF2RS8B2, т.е. полисахарида формулы I.Figure 6 is a selection scheme for PF2RS8B2, i.e. polysaccharide of formula I.
Фигура 7 представляет собой профиль ВЭЖХ PF2RS8B2 с испарительным детектором светорассеяния.Figure 7 is an HPLC profile of PF2RS8B2 with an evaporative light scattering detector.
Фигура 8 представляет собой профиль ВЭЖХ PF2RS8B2 с фотодиодным УФ-детектором.Figure 8 is an HPLC profile of PF2RS8B2 with a UV photodiode detector.
Фигура 9 представляет собой спектр 1Н-ЯМР PF2RS8B2.Figure 9 is a 1 H-NMR spectrum of PF2RS8B2.
Таблица 1 отражает действие образцов PF2RS8A и PF2RS8B2 на трансформацию лимфоцитов.Table 1 reflects the effect of samples PF2RS8A and PF2RS8B2 on the transformation of lymphocytes.
Фигура 10 представляет собой спектр 13С-ЯМР PF2RS8B2, т.е. полисахарида формулы I.Figure 10 is a 13 C-NMR spectrum of PF2RS8B2, i.e. polysaccharide of formula I.
Фигура 11 представляет собой спектр DEPT-135 PF2RS8B2.Figure 11 is a spectrum of DEPT-135 PF2RS8B2.
Фигура 12 представляет собой спектр DEPT-90 PF2RS8B2.Figure 12 is a spectrum of DEPT-90 PF2RS8B2.
Фигура 13 представляет собой спектр HMQC PF2RS8B2.Figure 13 is a spectrum of HMQC PF2RS8B2.
Фигура 14 представляет собой спектр 1H-1H-COSY PF2RS8B2.Figure 14 is a spectrum of 1 H- 1 H-COZY PF2RS8B2.
Фигура 15 представляет собой спектр 1H-1H-COSY PF2RS8B2.Figure 15 is a spectrum of 1 H- 1 H-COZY PF2RS8B2.
Фигура 16 представляет собой спектр HMQC PF2RS8B2.Figure 16 is a spectrum of HMQC PF2RS8B2.
Таблица 2 отражает спектр 13С-ЯМР PF2RS8B2.Table 2 reflects the 13 C-NMR spectrum of PF2RS8B2.
Фигура 17 представляет собой спектр НМВС PF2RS8B2.Figure 17 is a spectrum of NMVS PF2RS8B2.
Фигура 18 представляет собой спектр НМВС PF2RS8B2.Figure 18 is a spectrum of NMVS PF2RS8B2.
Фигура 19 представляет собой ТСХ продуктов гидролиза PF2RS8B2 ТФК и других моносахаридов.Figure 19 is a TLC of the hydrolysis products of PF2RS8B2 TFA and other monosaccharides.
Фигура 20 представляет собой диаграмму измерения молекулярной массы.Figure 20 is a molecular weight measurement chart.
Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Как указывалось выше, в первом аспекте изобретение относится к полисахариду формулы I:As indicated above, in a first aspect, the invention relates to a polysaccharide of formula I:
Схема IScheme I
где n=7-8.where n = 7-8.
Конфигурационная структура соединения формулы I отражается схемой II:The configuration structure of the compounds of formula I is reflected in scheme II:
Схема IIScheme II
где n=7-8.where n = 7-8.
Полисахарид имеет молекулярную массу примерно 10000.The polysaccharide has a molecular weight of approximately 10,000.
Во втором аспекте изобретение относится к способу получения полисахарида формулы I. Данный способ включает, во-первых, получение водного экстракта из растения Calendula officinalis согласно способу, описанному в находящейся в процессе одновременного рассмотрения заявке авторов данного изобретения "Способ получения водных экстрактов растений и экстракты, полученные таким способом", и зарегистрированной одновременно с настоящей заявкой, и, во-вторых, выделение полисахарида с использованием сочетания методов разделения, направляемых биоанализом.In a second aspect, the invention relates to a method for producing a polysaccharide of formula I. This method includes, firstly, obtaining an aqueous extract from a Calendula officinalis plant according to the method described in the pending application of the inventors of the present invention, "Method for producing aqueous plant extracts and extracts, obtained in this way, "and registered simultaneously with this application, and, secondly, the isolation of the polysaccharide using a combination of separation methods, guided by bioanalysis.
Водный экстракт Calendula officinalis получают, подвергая цветки указанного растения описанному далее процессу.An aqueous extract of Calendula officinalis is obtained by exposing the flowers of said plant to the process described below.
a) Очистка цветков.a) Cleaning the flowers.
b) Измельчение цветков.b) Shredding of flowers.
c) Обработка измельченных цветков лазерным излучением.c) Laser treatment of shredded flowers.
d) Суспендирование в воде смеси, полученной на стадии c).d) Suspension in water of the mixture obtained in step c).
e) Мацерация суспензии, полученной на стадии d).e) Maceration of the suspension obtained in stage d).
f) Отделение полученной жидкости.f) Separation of the resulting liquid.
Очистку (стадия а) осуществляют, промывая цветки Calendula officinalis водой. Количество воды, используемой на данной стадии, не определяется и может изменяться в зависимости от степени загрязнения растений. Хотя более высокие и более низкие температуры не исключаются, температура воды должна быть между 10 и 40°С, предпочтительно - между 20 и 35°С, и наиболее предпочтительно -28°С. Можно использовать моечную камеру для облегчения данной стадии. Как количество воды, так и время пребывания растительного сырья в моечной камере не определяется и может, следовательно, изменяться в зависимости от степени загрязнения растений. Стадию промывки можно осуществлять несколько раз со стадией сушки в промежутках. Такую стадию сушки предпочтительно осуществлять, размещая растительное сырье на солнце.The purification (step a) is carried out by washing the flowers of Calendula officinalis with water. The amount of water used at this stage is not determined and may vary depending on the degree of pollution of the plants. Although higher and lower temperatures are not excluded, the water temperature should be between 10 and 40 ° C, preferably between 20 and 35 ° C, and most preferably -28 ° C. A washing chamber can be used to facilitate this step. Both the amount of water and the residence time of the plant material in the washing chamber are not determined and may therefore vary depending on the degree of contamination of the plants. The washing step can be carried out several times with the drying step in between. Such a drying step is preferably carried out by placing the plant material in the sun.
Как только цветки тщательно очищены, их измельчают (стадия b) обычными способами, такими как с применением машины для измельчения или даже вручную. Хотя более высокие и более низкие температуры не исключаются, температура, при которой цветки измельчают, должна составлять от 10 до 40°С.Once the flowers are thoroughly cleaned, they are ground (stage b) by conventional methods, such as using a chopping machine or even manually. Although higher and lower temperatures are not excluded, the temperature at which the flowers are chopped should be between 10 and 40 ° C.
Затем измельченные цветки подвергают обработке лазерным излучением (стадия c). В качестве источника лазерного излучения используют предпочтительно красный линейный лазерный диод, способный генерировать излучение при длине волны в интервале 150-810 нм. Предпочтительно длина волны лазерного излучения составляет 200-400 нм и наиболее предпочтительно - 250 нм. Мощность лазерного излучения составляет предпочтительно 1-60 Вт, предпочтительнее - 10-30 Вт и наиболее предпочтительно - 20 Вт. Пятно имеет диаметр предпочтительно 1-6 мм, предпочтительнее - 2-5 нм и наиболее предпочтительно - 4 мм. На измельченное растительное сырье воздействуют лазерным излучением таким образом, чтобы облучалась вся смесь или ее большая часть. Этого достигают или перемещая вручную лазерный генератор в растительном сырье или пропуская измельченный материал на ленточном конвейере через набор из нескольких лазерных генераторов. Предпочтительно каждый килограмм измельченного материала обрабатывают лазерным излучением в течение 3-10 мин, предпочтительнее - в течение 5 мин. Хотя более высокие и более низкие температуры не исключаются, температура, при которой измельченное растительное сырье обрабатывают лазерным излучением, должна составлять от 10 до 40°С.The crushed flowers are then treated with laser radiation (step c). The laser source used is preferably a red linear laser diode capable of generating radiation at a wavelength in the range of 150-810 nm. Preferably, the laser wavelength is 200-400 nm, and most preferably 250 nm. The laser radiation power is preferably 1-60 watts, more preferably 10-30 watts and most preferably 20 watts. The spot has a diameter of preferably 1-6 mm, more preferably 2-5 nm, and most preferably 4 mm. The chopped plant material is exposed to laser radiation in such a way that the entire mixture or its majority is irradiated. This is achieved either by manually moving the laser generator in plant materials or by passing the crushed material on a conveyor belt through a set of several laser generators. Preferably, each kilogram of ground material is treated with laser radiation for 3-10 minutes, more preferably 5 minutes. Although higher and lower temperatures are not excluded, the temperature at which the chopped plant material is treated with laser radiation should be between 10 and 40 ° C.
Затем обработанный лазерным излучением материал суспендируют в воде (стадия d). На данной стадии можно использовать любую коммерческую минеральную воду. Суспендирование осуществляют таким образом, чтобы присутствовало 50-300, предпочтительно - 100-250 г обработанного лазером материала на 1 л воды. Хотя более высокие и более низкие температуры не исключаются, температура, при которой суспендируют измельченное растительное сырье, должна составлять от 10 до 40°С.Then, the laser-treated material is suspended in water (step d). At this stage, any commercial mineral water may be used. The suspension is carried out so that 50-300, preferably 100-250 g, of the laser-treated material per 1 liter of water are present. Although higher and lower temperatures are not excluded, the temperature at which the chopped plant material is suspended should be between 10 and 40 ° C.
Затем суспензию выдерживают в течение 5-25 сут, предпочтительно - 7-15 сут, при температуре от 2 до 10°С, предпочтительно - от 4 до 8°С, с тем, чтобы произошла мацерация (стадия е).Then the suspension is incubated for 5-25 days, preferably 7-15 days, at a temperature of 2 to 10 ° C, preferably 4 to 8 ° C, so that maceration occurs (step e).
Наконец, после стадии мацерации осуществляют отделение жидкой фазы от твердой фазы (стадия f). Отделения можно достичь одной декантацией или предпочтительно декантацией с последующей фильтрацией. Фильтрацию осуществляют предпочтительно под давлением. Наиболее предпочтительно осуществлять последовательно три фильтрации под давлением через фильтры 5 мкм, 1 мкм и 0,22 мкм. Хотя более высокие и более низкие температуры не исключаются, температура, при которой осуществляют отделение, должна составлять от 10 до 40°С.Finally, after the maceration step, the liquid phase is separated from the solid phase (step f). Separation can be achieved by one decantation, or preferably by decantation, followed by filtration. The filtration is preferably carried out under pressure. It is most preferable to carry out successively three filtrations under pressure through filters of 5 μm, 1 μm and 0.22 μm. Although higher and lower temperatures are not excluded, the temperature at which the separation is carried out should be from 10 to 40 ° C.
Наконец, получают водный экстракт коричневато-желтого цвета.Finally, a brownish yellow aqueous extract is obtained.
Затем полученный экстракт подвергают процессу выделения, который включает осаждение метанолом, центрифугирование и хроматографическое разделение, направлямое биоанализом. Применяемый бионанализ осуществляют in vitro, добавляя образцы лимфоцитов, выделенных из крови мыши, согласно способу, описанному в литературе: Мах W. et al., Journal of Natural Products, vol.54, no.6, pp.1531-1542 (1991). Контролируют включение тимидина, что означает репликацию ДНК. Такое включение свидетельствует как о повышении числа лимфоцитов, так и о повышении активности лимфоцитов. Указанные используемые способы выделения включают повторное осаждение этанолом, центрифугирование, диализ и/или колоночную хроматографию.Then, the extract obtained is subjected to a separation process, which includes precipitation with methanol, centrifugation and chromatographic separation, guided by bioanalysis. The bionanalysis used is carried out in vitro by adding samples of lymphocytes isolated from mouse blood according to the method described in the literature: Max W. et al., Journal of Natural Products, vol. 54, no.6, pp. 1531-1542 (1991) . Thymidine incorporation is controlled, which means DNA replication. This inclusion indicates both an increase in the number of lymphocytes and an increase in the activity of lymphocytes. Said isolation methods used include ethanol re-precipitation, centrifugation, dialysis and / or column chromatography.
Таким образом, лиофилизуют 112 л полученного предварительно водного экстракта и получают 800 г желтовато-коричневого порошка ("PF2"). Полученный порошок фракционируют на фракцию, растворимую в МеОН, и остаток, нерастворимый в MeOH (PF2R, 350 г), который обнаруживает активность трансформации лейкоцитов. Часть (80 г) такого материала подвергают осаждению MeOH, центрифугированию, диализу и/или колоночной хроматографии на сефадексе DEAE, что ведет к выделению нескольких кристаллических веществ, которые определяют как неактивные неорганические соли (фигура 1).Thus, 112 L of the previously obtained aqueous extract was lyophilized to obtain 800 g of a tan powder (“PF2”). The resulting powder was fractionated into a fraction soluble in MeOH and a residue insoluble in MeOH (PF2R, 350 g), which detected leukocyte transformation activity. A portion (80 g) of such material is subjected to MeOH precipitation, centrifugation, dialysis and / or column chromatography on a DEAE Sephadex, which leads to the isolation of several crystalline substances, which are defined as inactive inorganic salts (Figure 1).
Часть (270 г) PF2R, которую подвергают осаждению MeOH до конечных концентраций 25, 50 и 67%, приводит к активным преципитатам. Наиболее активным материалом является преципитат, полученный из 50% раствора MeOH (PF2RS8, 51,2 г, LT=+1059%). Обработка части в 5 г PF2RS8 путем растворения в воде с последующим центрифугированием и хроматографическое разделение супернатанта на сефадексе G-25 приводит к активному полисахариду, обогащенному фракцией, названной PF2RS8A (0,13 г, LT=+1074%). Затем из второй части (6 г) преципитата 50% MeOH получают PF2RS8A' (0,3 г). Как показано на фигуре 2, выделяют ряд других фракций и кристаллических веществ, однако все они не показывают уровень активности PF2RS8A.Part (270 g) of PF2R, which is subjected to precipitation of MeOH to final concentrations of 25, 50 and 67%, leads to active precipitates. The most active material is a precipitate obtained from a 50% MeOH solution (PF2RS8, 51.2 g, LT = + 1059%). Processing a 5 g portion of PF2RS8 by dissolving in water followed by centrifugation and chromatographic separation of the supernatant on Sephadex G-25 leads to an active polysaccharide enriched in a fraction called PF2RS8A (0.13 g, LT = + 1074%). Then, from the second part (6 g) of a 50% MeOH precipitate, PF2RS8A '(0.3 g) is obtained. As shown in figure 2, a number of other fractions and crystalline substances are isolated, however, they all do not show the level of activity of PF2RS8A.
PF2RS8A характеризуют методами спектроскопии (спектры 1Н-, 13С-ЯМР и DEPT (неискаженное усиление переносом поляризации (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer)) и химического анализа (гидролиз с ТФК и анализ методом ТСХ на силикагеле). См. фигуры 3, 4 и 5.PF2RS8A is characterized by spectroscopic methods ( 1 H-, 13 C-NMR and DEPT spectra (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) and chemical analysis (hydrolysis with TFA and TLC analysis on silica gel). See figures 3, 4 and 5.
Более активную смесь полисахаридов PF2RS8A (1,4 г) выделяют из остального преципитата 50% MeOH (PF2RS8). В то же время обработка части (2,0 г) нерастворимой фракции 67% раствора MeOH (PF2RS9A; LT=+735%) приводит к выделению смеси полисахаридов (PF2RS9A, 0,3 г), которую анализом методом 1Н-ЯМР идентифицируют как PF2RS8A. Поэтому PF2RS9A (0,2 г) объединяют с PF2RS8A (1,4 г), и смесь, названную "PF2RS8B", подвергают дальнейшему разделению на сефадексе G-50 (20-80 мм), как показано на фигуре 6. Элюирование водой дает шесть фракций (PF2RS8B 1, 2, 3, 4, 5 и 6), анализ методом ВЭЖХ которых показывает, что только основной изолят PF2RS8B2 является гомогенным при детекции как с испарительным детектором светорассеяния, так и с УФ-детектором (фигуры 7 и 8). Спектральный анализ методами 1Н- и 13С-ЯМР (фигуры 9 и 10) дает спектры указанного изолята, которые весьма схожи со спектрами, полученными для PF2RS8A (фигуры 2 и 4), что предполагает, что он является основным полисахаридом в смеси. Следовательно, фракция PF2RS8B2 состоит из полисахарида формулы I и воды. Последнюю можно удалить способами, известными в технике.A more active mixture of polysaccharides PF2RS8A (1.4 g) was isolated from the rest of the precipitate with 50% MeOH (PF2RS8). At the same time, treatment of a part (2.0 g) of an insoluble fraction of a 67% MeOH solution (PF2RS9A; LT = + 735%) leads to the isolation of a mixture of polysaccharides (PF2RS9A, 0.3 g), which is identified by 1 H-NMR analysis as PF2RS8A. Therefore, PF2RS9A (0.2 g) was combined with PF2RS8A (1.4 g), and the mixture called "PF2RS8B" was further separated in Sephadex G-50 (20-80 mm), as shown in Figure 6. Elution with water gives six fractions (
Биоанализ гомогенного изолята PF2RS8B2 и исходной для него смеси PF2RS8A при таком же анализе показывает активность трансформации лейкоцитов (LT) 6203% и 3532% соответственно (табл.1). Более высокий уровень активности, показанный изолятом, предполагает, что данный полисахарид является основной активной составляющей для биологического действия экстракта настоящего изобретения.The bioanalysis of the homogeneous isolate PF2RS8B2 and its initial mixture PF2RS8A with the same analysis shows the activity of transformation of leukocytes (LT) 6203% and 3532%, respectively (Table 1). The higher level of activity shown by the isolate suggests that this polysaccharide is the main active ingredient for the biological action of the extract of the present invention.
Активный полисахарид PF2RS8B2 (полисахарид формулы I) характеризуют методами спектроскопии (спектры 1Н-, 13С-ЯМР, HMQC (гетероядерная множественная квантовая когерентность (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence)) и 2D 1Н-1Н COSY (двумерная протон-протонная корреляционная спектроскопия ядерного магнитного резонанса (2-Dimensional proton-proton NMR correlation spectroscopy)) и химического анализа (гидролиз с ТФК и анализ методом ТСХ на силикагеле). Так, сигналы 1Н-ЯМР (фигура 9) при δ 5,3 и 3,2 м.д. указывают на полисахарид. Сигналы 13С-ЯМР (фигуры 10-12) при δ 111,9 (д), 110,1 (д) м.д. приписываются аномерным углеродам 1→3, связанным с α-L-арабинофуранозой и концевой α-L-арабинофуранозой (обозначенными Araf и Araf', соответственно). Сигналы при δ 106,1 (д) и 105,9 (д) приписываются аномерным углеродам 1→6, связанным с β-D-галактопиранозой, и 1→3, 1→6, связанным с β-D-галактопиранозой (обозначенными Galp' и Galp соответственно), в то время как сигнал при δ 100,2 (д) м.д. приписывается аномерным углеродам α-L-рамнопиранозы (обозначенной Rhap). Сигналы аномерных протонов (Н-1) также легко распознаются из-за их относительного слабопольного сдвига в спектрах 1Н-ЯМР. Прямая корреляция между сигналами протона и углерода-13, наблюдаемая в спектре HMQC (фигура 13), определяет сигналы 1Н-ЯМР δ 5,08 (ушс), 5,23 (ушс), 4,47 (д, J=7,9 Гц), 4,53 (д, J=7,3 Гц) и 5,1 (ушс) м.д., соответствующие аномерным протонам α-L-арабинофуранозы (Araf'), α-L-арабинофуранозы (Araf), β-D-галактопиранозы (Galp') и α-L-рамнопиранозы (Rhap). Используя указанные сигналы в качестве стандарта, можно обнаружить другие сигналы протонов, анализируя спектры 2D 1Н-1Н COSY (фигуры 14, 15). Подобным образом по спектрам HMQC определяют соответствующие сигналы углеродов (фигуры 13, 16 и табл.2). Последовательность звеньев сахаров определяют следующим образом. Слабопольный сдвиг сигнала при С-3 Araf (δ 79,4) и Galp (δ 82,8) и сигналы С-6 Galp и Galp' (δ 69,2) предполагают, что указанные углероды связаны с другими углеводными звеньями. Наблюдение широкой корреляции между С-1 Araf и С-6 Galp и Galp' в спектре НМВС (гетероядерная множественная корреляция связей (Heteronuclear Multiple Bond Correlation)) (фигура 17) предполагает 1→6, связанный с главной цепью β-D-галактопиранозы. Из наблюдений широкой корреляции между С-1 Araf и С-3 Galp (фигура 18) Araf является 1→3, связанным с Galp. Из спектра 1Н-ЯМР (фигура 9) вычисляют соотношение сахаров согласно интеграционным величинам пиков аномерных протонов, соответствующее Araf:Araf':Galp:Galp':Rhap / 3:1:2:2:1.Поэтому PF2RS8B2 рассматривают как полисахарид с крупными боковыми цепями с первичной структурой, показанной формулой I (схема I). Схема II представляет ту же структуру, показывающую стереохимическую конфигурацию отдельных сахаров.The active polysaccharide PF2RS8B2 (polysaccharide of formula I) is characterized by spectroscopy ( 1 H-, 13 C-NMR spectra, HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence) and 2D 1 H- 1 H COSY (two-dimensional proton-proton spectroscopy nuclear magnetic resonance (2-Dimensional proton-proton NMR correlation spectroscopy) and chemical analysis (hydrolysis with TFA and TLC analysis on silica gel). Thus, 1 H-NMR signals (figure 9) at δ 5.3 and 3.2 ppm indicate a polysaccharide Signals 13 C-NMR (figures 10-12) at δ 111.9 (d), 110.1 (d) ppm are attributed to anomeric angles to ferodes 1 → 3 associated with α-L-arabinofuranose and terminal α-L-arabinofuranose (designated Araf and Araf ' , respectively). Signals at δ 106.1 (d) and 105.9 (d) are attributed to
Для того чтобы подтвердить идентичность составляющих его сахаров, PF2RS8B2 гидролизуют с ТФК (0,5 М, 100-120°С), осуществляя затем анализ методом ТСХ (фигура 19). Наличие основных сахаров α-L-арабинофуранозы и β-D-галактопиранозы легко устанавливается, в то время как наличие дополнительного сахара α-L-рамнопиранозы определяется труднее, вероятно, из-за количества гидролизата, наносимого на пластину для ТСХ.In order to confirm the identity of its constituent sugars, PF2RS8B2 is hydrolyzed with TFA (0.5 M, 100-120 ° C), then carried out by TLC analysis (Figure 19). The presence of the main sugars of α-L-arabinofuranose and β-D-galactopyranose is easily determined, while the presence of additional sugar of α-L-ramnopyranose is more difficult to determine, probably due to the amount of hydrolyzate applied to the TLC plate.
Молекулярную массу PF2RS8B2 оценивают методом гельпроникающей (по размеру) хроматографии. Средняя молекулярная масса PF2RS8B2, оцененная таким образом, составляет 10000 (см. фигуру 20).The molecular weight of PF2RS8B2 is evaluated by gel permeation (size) chromatography. The average molecular weight of PF2RS8B2 so estimated is 10,000 (see FIG. 20).
Полисахарид формулы I неожиданно обнаруживает очень высокую активность как иммуностимулятор, что отражается в примерах, приведенных ниже. Третий аспект изобретения таким образом относится к применению полисахарида формулы I при лечении иммуносупрессорных заболеваний, таких как рак, туберкулез, грипп, насморк, аллергии, красная волчанка, псориаз и СПИД. Не являющимися ограничительными примерами раковых заболеваний являются рак печени, рак легких, рак почек, рак толстой кишки, рак молочной железы, рак предстательной железы или аденокарцинома предстательной железы; раковые заболевания головного мозга, такие как астроцитома и глиобластома; рак шейки матки и рак мочевого пузыря.A polysaccharide of formula I unexpectedly exhibits a very high activity as an immunostimulant, as reflected in the examples below. A third aspect of the invention thus relates to the use of a polysaccharide of formula I in the treatment of immunosuppressive diseases such as cancer, tuberculosis, flu, runny nose, allergies, lupus erythematosus, psoriasis and AIDS. Non-limiting examples of cancers are liver cancer, lung cancer, kidney cancer, colon cancer, breast cancer, prostate cancer, or prostate adenocarcinoma; brain cancers such as astrocytoma and glioblastoma; cervical cancer and bladder cancer.
Четвертый аспект изобретения относится к фармацевтическим композициям, содержащим полисахарид формулы I.A fourth aspect of the invention relates to pharmaceutical compositions comprising a polysaccharide of formula I.
Полисахарид по настоящему изобретению можно вводить или отдельно в виде чистого вещества или в форме фармацевтических препаратов, хотя предпочтительно соединение изобретения вводят в комбинированной форме. Комбинация лекарственного средства предпочтительно имеет форму композиции, которая (1) содержит один полисахарид по изобретению; (2) содержит одно или несколько соответствующих связующих, носителей и/или вспомогательных веществ и (3) может также содержать дополнительные терапевтически активные вещества.The polysaccharide of the present invention can be administered either separately as a pure substance or in the form of pharmaceutical preparations, although preferably the compound of the invention is administered in combination form. The combination of drugs preferably takes the form of a composition that (1) contains one polysaccharide according to the invention; (2) contains one or more appropriate binders, carriers and / or excipients; and (3) may also contain additional therapeutically active substances.
Носители, связующие вещества и/или вспомогательные вещества должны быть фармакологически переносимыми с тем, чтобы их можно было комбинировать с другими компонентами композиции или препарата и не оказывать вредного действия на организм, который лечат.Carriers, binders and / or excipients must be pharmacologically tolerable so that they can be combined with other components of the composition or preparation and not have a harmful effect on the organism being treated.
К таким композициям относятся композиции, подходящие для перорального и парентерального (в том числе подкожного, интрадермального, внутримышечного и внутривенного) введения, хотя наилучший способ введения зависит от состояния пациента.Such compositions include compositions suitable for oral and parenteral (including subcutaneous, intradermal, intramuscular and intravenous) administration, although the best route of administration depends on the condition of the patient.
Композиции могут находиться в форме однократных доз. Композиции получают согласно способам, известным в области фармакологии. Соответствующие количества активных веществ, подходящие для введения, могут изменяться как функция конкретной области терапии. Вообще концентрация активного вещества в композиции в форме однократной дозы составляет от 5% до 95% всей композиции.The compositions may be in single dose form. The compositions are prepared according to methods known in the field of pharmacology. Appropriate amounts of active substances suitable for administration may vary as a function of a particular area of therapy. In general, the concentration of the active substance in the composition in a single dose form is from 5% to 95% of the total composition.
Применение изобретения иллюстрируется приведенными ниже примерами.The application of the invention is illustrated by the following examples.
Пример 1. Получение водного экстракта цветков Calendula oficinalis согласно способу изобретения.Example 1. Obtaining an aqueous extract of Calendula oficinalis flowers according to the method of the invention.
Цветки Calendula oficinalis (500 г) помещают в моечную камеру и подвергают промывке водой при примерно 28°С. Затем цветки измельчают с помощью машины для измельчения. Полученные 500 г измельченного материала подвергают обработке излучением красного линейного лазерного диода, способного генерировать излучение с длиной волны 250 нм, мощностью 20 Вт и диаметром пятна 4 мм. Обработку осуществляют вручную, перемещая лазерный генератор по измельченному материалу в течение 2,5 мин, так что облучается вся смесь или ее большая часть. Затем материал, обработанный лазером, суспендируют в 2 л воды при температуре примерно 20°С. Затем суспензию выдерживают в течение 12 сут при температуре 4°С. Наконец, осуществляют разделение жидкой и твердой фазы сначала декантацией жидкости (твердое вещество прессуют для облегчения отделения) и затем последовательными тремя фильтрациями под давлением через фильтры 5, 1 и 0,22 мкм при температуре примерно 20°С. Способ дает приблизительно 1,7 л раствора (водный экстракт) коричневато-желтого цвета.The flowers of Calendula oficinalis (500 g) are placed in a washing chamber and rinsed with water at about 28 ° C. Then the flowers are crushed using a chopping machine. The resulting 500 g of crushed material is subjected to radiation treatment of a red linear laser diode capable of generating radiation with a wavelength of 250 nm, a power of 20 W and a spot diameter of 4 mm. The treatment is carried out manually by moving the laser generator over the crushed material for 2.5 minutes, so that the whole mixture or most of it is irradiated. The laser-treated material is then suspended in 2 L of water at a temperature of about 20 ° C. Then the suspension is incubated for 12 days at a temperature of 4 ° C. Finally, liquid and solid phases are separated first by decantation of the liquid (solid is pressed to facilitate separation) and then by successive three filtrations under pressure through
Пример 2. Выделение полисахарида формулы I осуществляют так, как описывается ранее в описании.Example 2. The selection of a polysaccharide of formula I is carried out as described previously in the description.
Пример 3. Полисахарид формулы I испытывают с целью определения его активности как иммуностимулятора путем количественной оценки активности трансформации лейкоцитов (LTA). Под активностью трансформации лейкоцитов подразумевается тот факт, что лимфоциты переходят из пассивного состояния в активное, что необходимо для борьбы с болезнями через иммунологический механизм, или для восстановления иммунной системы, которую могли ослабить различные факторы. Испытания осуществляют согласно описанному в литературе способу (Max W. et al., Journal of Natural Products, vol.54, no.6, pp.1531-1542 (1991)), добавляя in vitro раствор полисахарида изобретения к лимфоцитам, выделенным из организма мыши. Контролируют включение тимидина, что означает репликацию ДНК. Такое включение свидетельствует как о повышении числа лимфоцитов, так и о повышении активности лимфоцитов.Example 3. A polysaccharide of formula I is tested to determine its activity as an immunostimulant by quantifying the activity of leukocyte transformation (LTA). Under the activity of the transformation of leukocytes, it is meant the fact that the lymphocytes pass from a passive state to an active one, which is necessary to fight diseases through the immunological mechanism, or to restore the immune system, which various factors could weaken. The tests are carried out according to the method described in the literature (Max W. et al., Journal of Natural Products, vol. 54, no.6, pp.1531-1542 (1991)), adding in vitro a solution of the polysaccharide of the invention to lymphocytes isolated from the body the mouse. Thymidine incorporation is controlled, which means DNA replication. This inclusion indicates both an increase in the number of lymphocytes and an increase in the activity of lymphocytes.
Полисахарид формулы I дает LTA +6203% относительно нестимулированных лимфоцитов.A polysaccharide of formula I gives LTA + 6203% relative to unstimulated lymphocytes.
Пример 4. Испытание полисахарида по изобретению на токсичностьExample 4. Toxicity test of the polysaccharide of the invention
Материалы и методыMaterials and methods
Протокол испытаний на безопасность in vivoIn vivo safety test report
Для испытаний на биологическую безопасность животных разделяли на три группы по 10 животных в каждой. Животным вводили перорально при помощи назогастрального зонда различные дозы полисахарида настоящего изобретения (ЕС) каждые 48 ч в течение 30 дней. По истечении этого периода оставшихся животных содержали еще в течение 1 месяца для оценки отдаленных токсических эффектов после введения испытываемого соединения.For biological safety tests, animals were divided into three groups of 10 animals each. Animals were orally administered with a nasogastric tube various doses of the polysaccharide of the present invention (EC) every 48 hours for 30 days. After this period, the remaining animals were kept for another 1 month to assess the long-term toxic effects after administration of the test compound.
Лабораторные животныеLaboratory animals
МышиMice
Эксперименты проводили на трех линиях мышей BALB/c, CBA и C57/BL6. Животных каждой линии распределяли на 5 групп по 10 мышей в каждой и после введения каждую из групп обозначали следующим образом:The experiments were performed on three lines of BALB / c, CBA and C57 / BL6 mice. Animals of each line were divided into 5 groups of 10 mice in each and after administration, each of the groups was designated as follows:
Контроль: вводили 200 мкл водыControl: 200 μl of water was injected
ЕС-А: вводили дозу ЕС 2750 мг/кг веса в объеме 200 мкл (5х раствор)EC-A: an EU dose of 2750 mg / kg of body weight was administered in a volume of 200 μl (5x solution)
ЕС-В: каждому животному вводили дозу ЕС 550 мг/кг веса в объеме 200 мкл (1х раствор)EC-B: each animal was injected with an EU dose of 550 mg / kg body weight in a volume of 200 μl (1x solution)
ЕС-С: каждому животному вводили дозу ЕС 55 мг/кг веса в объеме 200 мкл (0,1х раствор)EC-C: each animal was injected with an EU dose of 55 mg / kg of body weight in a volume of 200 μl (0.1x solution)
EC-D: каждому животному вводили дозу ЕС 11 мг/кг веса в объеме 200 мкл (0,02х раствор).EC-D: Each animal was injected with an EU dose of 11 mg / kg body weight in a volume of 200 μl (0.02 × solution).
КрысыRats
Животных разделяли на 4 группы:Animals were divided into 4 groups:
Контроль: вводили 1 мл водыControl: 1 ml of water was injected
ЕС-А: вводили дозу ЕС 2750 мг/кг веса в объеме 1 мл (5х раствор)EC-A: a dose of EC 2750 mg / kg of body weight was introduced in a volume of 1 ml (5x solution)
ЕС-В: каждому животному вводили дозу ЕС 550 мг/кг веса в объеме 1 мл (1х раствор)EC-B: each animal was given a dose of EC 550 mg / kg of body weight in a volume of 1 ml (1x solution)
ЕС-С: каждому животному вводили дозу ЕС 55 мг/кг веса в объеме 1 мл (0,1х раствор).EC-C: each animal was given a dose of EC 55 mg / kg body weight in a volume of 1 ml (0.1x solution).
Протокол испытаний на модели пролиферации лимфоцитов периферической крови человека in vitro.Test report on an in vitro model of human peripheral blood lymphocyte proliferation.
Для установления эффекта на лимфоциты периферической крови (ЛПК) человека строили зависимость типа «доза-ответ».To establish the effect on the peripheral blood lymphocytes (LPC) of a person, a dose-response relationship was built.
Лимфоциты выделяли из цельной периферической крови с использованием градиента плотности Ficoll Isopaque (Histopaque 1077, Sigma Diagnostics). Кровь разводили PBS (забуференный фосфатом физиологический солевой раствор) и добавляли в пробирку с 3 мл Ficoll. Пробирку центрифугировали в течение 30 мин при 400 g при комнатной температуре. После центрифугирования непрозрачную интерфазу между Ficoll и плазмой, содержащей мононуклеарные клетки, отсасывали при помощи пастеровской пипетки (фиг. 21).Lymphocytes were isolated from whole peripheral blood using a Ficoll Isopaque density gradient (Histopaque 1077, Sigma Diagnostics). Blood was diluted with PBS (phosphate buffered saline) and added to a 3 ml Ficoll tube. The tube was centrifuged for 30 min at 400 g at room temperature. After centrifugation, the opaque interphase between Ficoll and plasma containing mononuclear cells was aspirated using a Pasteur pipette (Fig. 21).
ЛПК обрабатывали в течение 72 ч различными концентрациями ЕС (от 2 мг до 15 мкг на мл) или иными доступными в настоящее время веществами, обладающими мощным иммуномодуляторным эффектом in vitro, но проявляющими сильную токсичность in vivo такими как конканавалин А и фитогемагглютинин (ФГА) в концентрациях в диапазоне от 10 мкг до 1,25 мкг на 1 мл.LPCs were treated for 72 h with various concentrations of EC (from 2 mg to 15 μg per ml) or other currently available substances that have a potent immunomodulatory effect in vitro but exhibit strong in vivo toxicity such as concanavalin A and phytohemagglutinin (PHA) in concentrations ranging from 10 μg to 1.25 μg per 1 ml.
Для проведения этого анализа использовали набор для колориметрического измерения пролиферации клеток (Anti-Brdu colorimetric kit. Cell Proliferation ELISA (Roche Diagnostics)), который является альтернативой анализу включения радиоактивного [3Н]-тимидина в синтезируемую ДНК.To carry out this analysis, we used a kit for colorimetric measurement of cell proliferation (Anti-Brdu colorimetric kit. Cell Proliferation ELISA (Roche Diagnostics)), which is an alternative to the analysis of the incorporation of radioactive [ 3 H] -thymidine into the synthesized DNA.
- Клетки культивировали в 96-луночном планшете при 37°С в течение 48 ч при плотности 5×104 клеток на лунку. Эксперимент проводили в, по меньшей мере, трехкратной повторности для каждой лунки. В качестве культуральной среды использовали RPMI 1640 (Sigma).- Cells were cultured in a 96-well plate at 37 ° C for 48 hours at a density of 5 × 10 4 cells per well. The experiment was carried out in at least triplicate for each well. As the culture medium used RPMI 1640 (Sigma).
- Затем в каждую лунку вносили по 15 мкл раствора 5-бром-2-дезоксиуридина (BrdU) и оставляли в инкубаторе дополнительно на 24 ч.- Then, 15 μl of a solution of 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) was added to each well and left in the incubator for an additional 24 hours.
- Спустя 72 ч с начала инкубации клетки центрифугировали при 300 g в течение 10 мин, фиксировали нагреванием (60°С в течение 1 ч), и ДНК денатурировали добавлением Fix Denat (200 мкл на лунку). Денатурация ДНК необходима для улучшения связывания антитела против BrdU.- After 72 hours from the start of incubation, the cells were centrifuged at 300 g for 10 minutes, fixed by heating (60 ° C for 1 hour), and the DNA was denatured by the addition of Fix Denat (200 μl per well). DNA denaturation is necessary to improve anti-BrdU antibody binding.
- В каждую лунку добавляли по 100 мкл раствора антител AntiBrdU и оставляли инкубироваться на 90 мин при 15-25°С. При этом происходит связывание антител antiBrdU с BrdU, включившимся в состав ДНК.- 100 μl of AntiBrdU antibody solution was added to each well and allowed to incubate for 90 min at 15-25 ° C. In this case, the binding of antiBrdU antibodies to BrdU, which is included in the DNA, occurs.
- Образовавшиеся иммунные комплексы детектируют после добавления 100 мкл раствора субстрата в каждую лунку. В качестве останавливающего раствора используют 1 М серную кислоту в количестве 25 мкл на лунку.- The resulting immune complexes are detected after adding 100 μl of substrate solution to each well. As a stopping solution, 1 M sulfuric acid is used in an amount of 25 μl per well.
- Количественную оценку реакции проводят с использованием многолуночного спектрофотометра (планшет-ридер для ELISA, установленный на длину волны 450 нм). Интенсивность окрашивания (т.е. оптическая плотность) коррелирует с количеством синтезированной ДНК, т.е. с пролиферацией клеток в микрокультурах.- A quantitative assessment of the reaction is carried out using a multi-well spectrophotometer (tablet reader for ELISA installed at a wavelength of 450 nm). Staining intensity (i.e. optical density) correlates with the amount of synthesized DNA, i.e. with cell proliferation in microcultures.
Протокол испытаний на модели цитотоксичности естественных киллеров (NK)Test report on natural killer (NK) cytotoxicity model
Для оценки индукции цитотоксической активности клеток NK мышам линии BALB/C ежедневно в течение 7 дней вводили перорально суточную дозу ЕС в диапазоне 1,1-0,22 мг на животное.To evaluate the induction of the cytotoxic activity of NK cells, BALB / C mice were dosed daily for 7 days with an oral dose of EC in the range of 1.1-0.22 mg per animal.
Клетки селезенки этих животных использовали в качестве эффекторных клеток, а клетки линии лимфомы YAC-1 использовали в качестве клеток-мишеней. Количественную оценку проводили с помощью стандартного способа анализа цитотоксичности NK с использованием 51Cr. В качестве положительного контроля использовали соединение тилорон, который известен как индуктор цитотоксической активности клеток NK. Его вводили так же, как и ЕС.The spleen cells of these animals were used as effector cells, and the lymphoma cell line YAC-1 was used as target cells. Quantification was performed using a standard NK cytotoxicity assay using 51 Cr. As a positive control, the tiloron compound, which is known as an inducer of the cytotoxic activity of NK cells, was used. It was introduced in the same way as the EU.
Результаты испытанийTest results
Испытания безопасности in vivo на мышахIn vivo safety tests in mice
В испытаниях на биологическую безопасность на мышах BALB/C (фиг.22) ни в контрольной группе, ни в группах, получавших ЕС в дозах 55 мг/кг веса (0,1х концентрация) и 11 мг/кг веса (0,02х концентрация), в течение 30 дней исследования и в течение последующих 30 дней наблюдения после окончания исследования среди животных гибели отмечено не было. При дозе 550 мг/кг веса (1х концентрация) спустя 15 дней после начала исследования 50% животных погибло (ЛД50), тогда как остальные 50% остались живыми. При дозе 2750 мг/кг веса (5х концентрация) спустя 20 дней после начала исследования 80% животных погибло, тогда как остальные 20% оставались живыми до конца исследования. Данный эксперимент был повторен трижды, и полученные результаты были во всех случаях сходными, что свидетельствует о репрезентативности проведенного анализа.In biological safety tests in BALB / C mice (FIG. 22), neither in the control group nor in the groups receiving the EU at doses of 55 mg / kg body weight (0.1x concentration) and 11 mg / kg body weight (0.02x concentration ), during the 30 days of the study and during the next 30 days of observation after the end of the study, no deaths were observed among animals. At a dose of 550 mg / kg body weight (1x concentration) 15 days after the start of the study, 50% of the animals died (LD 50 ), while the remaining 50% remained alive. At a dose of 2750 mg / kg body weight (5x concentration), 20 days after the start of the study, 80% of the animals died, while the remaining 20% remained alive until the end of the study. This experiment was repeated three times, and the results were similar in all cases, which indicates the representativeness of the analysis.
В анализе на токсичность на мышах СВА (фиг.23) в контрольной группе и в группах, получавших ЕС в дозе 55 мг/кг веса (0,1х концентрация) и в дозе 11 мг/кг веса (0,02х концентрация), смертности не наблюдалось после 30 дней исследования. Напротив, в группе, получавшей 550 мг/кг веса, на 20 день наблюдалась 50% смертность, тогда как оставшиеся 50% мышей оставались живыми до конца исследования.In the toxicity analysis in CBA mice (Fig. 23) in the control group and in the groups receiving the EU at a dose of 55 mg / kg weight (0.1x concentration) and at a dose of 11 mg / kg weight (0.02x concentration), mortality not observed after 30 days of the study. In contrast, in the 550 mg / kg weight group, 50% mortality was observed on
Наивысшая смертность наблюдалась в группе, получавшей ЕС в дозе 2750 мг/кг веса (5х концентрация), в которой 7 мышей погибли к 20 дню, а остальные 3 оставались живыми до конца исследования.The highest mortality was observed in the group receiving the EU at a dose of 2750 mg / kg body weight (5x concentration), in which 7 mice died by
В группах мышей линии С57/В16, которым перорально давали воду (контроль), а также ЕС в дозе 55 мг/кг веса (0,1х концентрация) или 11 мг/кг веса (0,02х концентрация), смертности не наблюдалось.In groups of C57 / B16 mice that were given water orally (control), as well as EC at a dose of 55 mg / kg body weight (0.1x concentration) or 11 mg / kg body weight (0.02 concentration), no mortality was observed.
Напротив, в группе мышей С57/В16, которым вводили количество ЕС, эквивалентное 550 мг/кг веса (1х концентрация), наблюдалась гибель 60% животных к 20 дню, тогда как остальные животные оставались живыми до конца исследования.In contrast, in the group of C57 / B16 mice that were injected with an amount of EC equivalent to 550 mg / kg body weight (1x concentration), 60% of the animals died by
Наивысшая смертность наблюдалась в группе, получавшей ЕС в дозе 2750 мг/кг веса (5х концентрация). Как видно из фиг.24, смертность в этой группе составляла 80% к 20 дню, тогда как остальные 20% животных оставались живыми до конца исследования.The highest mortality was observed in the group receiving the EU at a dose of 2750 mg / kg body weight (5x concentration). As can be seen from Fig.24, the mortality in this group was 80% by
Испытания безопасности in vivo на крысахIn vivo safety tests in rats
В испытаниях безопасности на крысах линии Wistar смертности не наблюдалось в контрольной группе и в группах, получавших ЕС в дозе 55 мг/кг веса (0,1х концентрация) и 550 мг/кг веса (1х концентрация). Однако в группе крыс, получавших ЕС в дозе 2750 мг/кг веса (5х концентрация), была отмечена гибель 6 животных (60% от всей группы) к 15 дню (ЛД50), тогда как остальные 4 животных оставались живыми до конца исследования (фиг.25). Данный эксперимент был повторен трижды, и полученные результаты были во всех случаях сходными, что свидетельствует о репрезентативности проведенного анализа.In Wistar rat safety trials, mortality was not observed in the control group and in the groups receiving the EU at a dose of 55 mg / kg body weight (0.1x concentration) and 550 mg / kg body weight (1x concentration). However, in the group of rats treated with the EU at a dose of 2750 mg / kg body weight (5x concentration), the death of 6 animals (60% of the whole group) by the 15th day (LD 50 ) was noted, while the remaining 4 animals remained alive until the end of the study ( Fig.25). This experiment was repeated three times, and the results were similar in all cases, which indicates the representativeness of the analysis.
Как можно видеть, результаты исследований биологической безопасности были весьма сходными в случае трех различных линий мышей (BALB/C, СВА, C57/BL6), не отмечалось каких-либо достоверных различий, и для всех трех линий 50% летальная доза (ЛД50) была одинаковой и составляла 55 мг/кг веса (1х концентрация). Следовательно, дозы, соответствующие 0,1х и 0,02х концентрации, могут быть безопасно использованы в последующих экспериментах, поскольку они являются нетоксичными.As you can see, the results of biosafety studies were very similar in the case of three different mouse lines (BALB / C, CBA, C57 / BL6), there were no significant differences, and for all three
Напротив, в опытах по острой токсичности на крысах 50% летальная доза (ЛД50) была 2750 мг/кг веса (5х концентрация), а не 550 мг/кг (1х концентрация), при которой смертности вообще не отмечалось.In contrast, in experiments on acute toxicity in rats, the 50% lethal dose (LD 50 ) was 2750 mg / kg body weight (5x concentration), and not 550 mg / kg (1x concentration), at which there was no mortality at all.
Таким образом, можно сделать вывод о том, что сколь либо достоверных различий в летальной дозе между линями одного вида лабораторных животных (мышь) не наблюдалось, тогда как между различными видами животных наблюдались достоверные различия в 50% летальных дозах, причем более высокие летальные дозы наблюдались на крысах.Thus, we can conclude that there were no significant differences in the lethal dose between the lines of one type of laboratory animal (mouse), while significant differences in 50% of the lethal doses were observed between different animal species, with higher lethal doses on rats.
Следует отметить, что всех мышей и крыс, которые выжили в ходе исследований острой токсичности в течение 30 дней (введение ЕС через день), наблюдали дополнительно еще в течение 30 дней для оценки отдаленных эффектов после введения исследуемого соединения. Гибели животных или каких-либо физических изменений в этот период времени отмечено не было.It should be noted that all mice and rats that survived acute toxicity studies for 30 days (EC administration every other day) were observed for an additional 30 days to evaluate the long-term effects after administration of the test compound. No death of animals or any physical changes during this period of time was noted.
На погибших животных проводили аутопсию, и как показало предварительное заключение, наиболее пораженным органом оказалась печень (некроз).An autopsy was performed on the dead animals, and as the preliminary conclusion showed, the liver (necrosis) was the most affected organ.
Эти эксперименты по острой токсичности полисахарида изобретения проводились как на мышах, так и на крысах в, по меньшей мере, трехкратной повторности с получением очень близких результатов. Представлены данные, полученные в одном из экспериментов.These experiments on the acute toxicity of the polysaccharide of the invention were carried out both in mice and in rats in at least triplicate with very similar results. The data obtained in one of the experiments are presented.
Исследование цитотоксичности естественных киллеровThe study of cytotoxicity of natural killer cells
На фиг. 26 показан лизис клеток YAC-1 (в процентном выражении), измеряемый по высвобождению 51Cr, при использовании в качестве эффекторных клеток селезенки мышей линии BALB/c, которым вводили перорально в течение 7 дней ЕС в дозе 55 мг/кг веса тела или 11 мг/кг веса.In FIG. Figure 26 shows the lysis of YAC-1 cells (in percentage terms), measured by 51 Cr release, using BALB / c mice that were orally administered for 55 days with EC at a dose of 55 mg / kg body weight or 11 as effector cells mg / kg of weight.
Как можно видеть, лизис клеток (в процентах) не превышает 10%, что позволяет сделать вывод о том, что исследуемое соединение не индуцирует цитотоксичности естественных киллеров.As you can see, cell lysis (in percent) does not exceed 10%, which allows us to conclude that the test compound does not induce cytotoxicity of natural killers.
Эти эксперименты проводились в трехкратной повторности с получением очень близких результатов. Представлены данные, полученные в одном из экспериментов (см. табл.1, 2).These experiments were carried out in triplicate with very similar results. The data obtained in one of the experiments are presented (see Tables 1, 2).
Claims (16)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003119072/04A RU2276157C2 (en) | 2000-11-27 | 2000-11-27 | Polysaccharide eliciting immunostimulating activity, method for its preparing and using |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003119072/04A RU2276157C2 (en) | 2000-11-27 | 2000-11-27 | Polysaccharide eliciting immunostimulating activity, method for its preparing and using |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2003119072A RU2003119072A (en) | 2004-12-27 |
| RU2276157C2 true RU2276157C2 (en) | 2006-05-10 |
Family
ID=36657289
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003119072/04A RU2276157C2 (en) | 2000-11-27 | 2000-11-27 | Polysaccharide eliciting immunostimulating activity, method for its preparing and using |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2276157C2 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2553354C2 (en) * | 2010-03-24 | 2015-06-10 | Морисита Дзинтан Ко., Лтд. | Antiallergic agent |
| RU2727667C1 (en) * | 2016-08-09 | 2020-07-22 | Имэджин Глоубал Кэар Корпорейшн | Polysaccharide exhibiting immunostimulating activity with respect to innate immunity, and agent which stimulates innate immunity, or a food product and beverage containing thereof |
| RU2795463C2 (en) * | 2016-08-09 | 2023-05-03 | Имэджин Глоубал Кэар Корпорейшн | Polysaccharide with immunostimulatory activity in respect of immunity and immunity stimulating agent or a food product and a drink containing it |
-
2000
- 2000-11-27 RU RU2003119072/04A patent/RU2276157C2/en not_active IP Right Cessation
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2553354C2 (en) * | 2010-03-24 | 2015-06-10 | Морисита Дзинтан Ко., Лтд. | Antiallergic agent |
| RU2727667C1 (en) * | 2016-08-09 | 2020-07-22 | Имэджин Глоубал Кэар Корпорейшн | Polysaccharide exhibiting immunostimulating activity with respect to innate immunity, and agent which stimulates innate immunity, or a food product and beverage containing thereof |
| US11213058B2 (en) | 2016-08-09 | 2022-01-04 | Imagine Global Care Corporation | Polysaccharide having innate immunity stimulating activity |
| RU2795463C2 (en) * | 2016-08-09 | 2023-05-03 | Имэджин Глоубал Кэар Корпорейшн | Polysaccharide with immunostimulatory activity in respect of immunity and immunity stimulating agent or a food product and a drink containing it |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2124361C1 (en) | Method of isolation of resin tragacanth polysaccharide fraction from plant of genus astragal, composition based on polysaccharide fraction, method of inhibition of cancer tumor growth, method of inhibition of viral infections | |
| JP2888249B2 (en) | Aloe composition and use thereof | |
| JP2004505925A (en) | Chlorella preparations exhibiting immunomodulatory properties | |
| KR100506384B1 (en) | The pharmaceutical composition and its preparation method of herb mixture for cancer inhibition, recovery of immune system and protection of body from oxidative damage | |
| Osadebe et al. | Comparative acute toxicities and immunomodulatory potentials of five Eastern Nigeria mistletoes | |
| RU2276157C2 (en) | Polysaccharide eliciting immunostimulating activity, method for its preparing and using | |
| NO173655B (en) | PROCEDURE FOR EXTRACING A TETRAPEPTIME FROM BIOLOGICAL MATERIAL | |
| EP1343826B1 (en) | Polysaccharide compound having immune stimulating activity | |
| JP2005515266A (en) | Plant extracts that are active as immunostimulants | |
| RU2560845C1 (en) | Method for producing low-molecular activated embryonic complex (nika-em) | |
| KR100506396B1 (en) | The pharmaceutical composition and its preparation method of herb mixture for cancer inhibition, recovery of immune system and protection of body from oxidative damage | |
| WO2016086842A1 (en) | Dihydro-β-agarofuran sesquiterpenoid, preparation method and use thereof | |
| EA010735B1 (en) | Medicament normalising reproductive male function and method for preparing thereof | |
| KR100204365B1 (en) | Extraction Method of Immunity-Enhancing Composition from Korean Mistletoe and Its Extract | |
| RU2240810C2 (en) | Method for producing and applying embryonic antitumor modulator agent | |
| AU2001218789A1 (en) | Polysaccharide compound having immune stimulating activity | |
| RU2033796C1 (en) | Peptide-containing fraction from mammalian spleen showing immunostimulating activity, and a method of its preparing | |
| RU2341272C1 (en) | Nonspecific immunotherapy agent | |
| RU2121844C1 (en) | Method of preparing a carbohydrate-protein complex from japanese scallop | |
| RU2341271C1 (en) | Agent of antimetastatic action | |
| MXPA97002174A (en) | Celu growth regulator | |
| CN118530383A (en) | Preparation method, identification method and application of roxburghii polysaccharide | |
| ZA200304444B (en) | Polysaccharide compound having immune stimulating activity. | |
| TWI296526B (en) | Polysaccharide compound having immune stimulating activity | |
| KR20000047082A (en) | Cancer cell apoptosis-inducing composition containing extract of casesalpinia sappan |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20081128 |