RU2266330C2 - BIOLOGICALLY ACTIVE ANIMAL FATTY ACID Δ5-DESATURASE, DNA SEQUENCE ENCODING THE SAME, CLONING END EXPRESSING VECTORS CONTAINING SAID SEQUENCE, METHOD FOR PRODUCTION OF POLYUNSATURATED FATTY ACIDS, METHOD FOR CONVERTING OF DIHOMO-γ-LINOLENIC ACID TO ARACHIDONIC ACID, PROBE (VARIANTS), AND METHOD FOR DETECTION OF Δ5-DESATURASE USING THE SAME - Google Patents
BIOLOGICALLY ACTIVE ANIMAL FATTY ACID Δ5-DESATURASE, DNA SEQUENCE ENCODING THE SAME, CLONING END EXPRESSING VECTORS CONTAINING SAID SEQUENCE, METHOD FOR PRODUCTION OF POLYUNSATURATED FATTY ACIDS, METHOD FOR CONVERTING OF DIHOMO-γ-LINOLENIC ACID TO ARACHIDONIC ACID, PROBE (VARIANTS), AND METHOD FOR DETECTION OF Δ5-DESATURASE USING THE SAME Download PDFInfo
- Publication number
- RU2266330C2 RU2266330C2 RU2000116010/13A RU2000116010A RU2266330C2 RU 2266330 C2 RU2266330 C2 RU 2266330C2 RU 2000116010/13 A RU2000116010/13 A RU 2000116010/13A RU 2000116010 A RU2000116010 A RU 2000116010A RU 2266330 C2 RU2266330 C2 RU 2266330C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- desaturase
- dna sequence
- sequence
- fatty acids
- acid
- Prior art date
Links
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims abstract description 45
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 title claims abstract description 37
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 title claims abstract description 24
- HOBAELRKJCKHQD-QNEBEIHSSA-N dihomo-γ-linolenic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCC(O)=O HOBAELRKJCKHQD-QNEBEIHSSA-N 0.000 title claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 title claims abstract description 18
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 18
- HOBAELRKJCKHQD-UHFFFAOYSA-N (8Z,11Z,14Z)-8,11,14-eicosatrienoic acid Natural products CCCCCC=CCC=CCC=CCCCCCCC(O)=O HOBAELRKJCKHQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 17
- 235000021298 Dihomo-γ-linolenic acid Nutrition 0.000 title claims abstract description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 title description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 title description 4
- 108010073542 Delta-5 Fatty Acid Desaturase Proteins 0.000 title 2
- 102100034542 Acyl-CoA (8-3)-desaturase Human genes 0.000 title 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title 1
- 108010087894 Fatty acid desaturases Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 102000009114 Fatty acid desaturases Human genes 0.000 claims abstract description 36
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 26
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 26
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 26
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 claims description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 claims 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 26
- JAZBEHYOTPTENJ-JLNKQSITSA-N all-cis-5,8,11,14,17-icosapentaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O JAZBEHYOTPTENJ-JLNKQSITSA-N 0.000 abstract description 8
- 229940066279 eicosapentaenoate Drugs 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 241000244202 Caenorhabditis Species 0.000 abstract 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 abstract 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 19
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 17
- 241000907999 Mortierella alpina Species 0.000 description 16
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 16
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 10
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 6
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 5
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 208000016444 Benign adult familial myoclonic epilepsy Diseases 0.000 description 3
- 102100025287 Cytochrome b Human genes 0.000 description 3
- 108010075028 Cytochromes b Proteins 0.000 description 3
- 239000004165 Methyl ester of fatty acids Substances 0.000 description 3
- 241000306281 Mucor ambiguus Species 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 208000016427 familial adult myoclonic epilepsy Diseases 0.000 description 3
- ZGNITFSDLCMLGI-UHFFFAOYSA-N flubendiamide Chemical compound CC1=CC(C(F)(C(F)(F)F)C(F)(F)F)=CC=C1NC(=O)C1=CC=CC(I)=C1C(=O)NC(C)(C)CS(C)(=O)=O ZGNITFSDLCMLGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 240000002900 Arthrospira platensis Species 0.000 description 2
- 235000016425 Arthrospira platensis Nutrition 0.000 description 2
- 241001072256 Boraginaceae Species 0.000 description 2
- 235000007689 Borago officinalis Nutrition 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 2
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 2
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 2
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 2
- 229940082787 spirulina Drugs 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- LGHXTTIAZFVCCU-SSVNFBSYSA-N (2E,4E,6E,8E)-octadeca-2,4,6,8-tetraenoic acid Chemical compound CCCCCCCCC\C=C\C=C\C=C\C=C\C(O)=O LGHXTTIAZFVCCU-SSVNFBSYSA-N 0.000 description 1
- ZEBIJPXNSBSHGD-ZKWNWVNESA-N (5z,8z,11z,14z)-2-methylicosa-5,8,11,14-tetraenoic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCC(C)C(O)=O ZEBIJPXNSBSHGD-ZKWNWVNESA-N 0.000 description 1
- JXYWFNAQESKDNC-BTJKTKAUSA-N (z)-4-hydroxy-4-oxobut-2-enoate;2-[(4-methoxyphenyl)methyl-pyridin-2-ylamino]ethyl-dimethylazanium Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O.C1=CC(OC)=CC=C1CN(CCN(C)C)C1=CC=CC=N1 JXYWFNAQESKDNC-BTJKTKAUSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 241000233788 Arecaceae Species 0.000 description 1
- 235000021537 Beetroot Nutrition 0.000 description 1
- 244000056139 Brassica cretica Species 0.000 description 1
- 235000003351 Brassica cretica Nutrition 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 235000003343 Brassica rupestris Nutrition 0.000 description 1
- 244000020518 Carthamus tinctorius Species 0.000 description 1
- 235000003255 Carthamus tinctorius Nutrition 0.000 description 1
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 1
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 235000001950 Elaeis guineensis Nutrition 0.000 description 1
- 244000127993 Elaeis melanococca Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 1
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 241000219925 Oenothera Species 0.000 description 1
- 235000004496 Oenothera biennis Nutrition 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 244000000231 Sesamum indicum Species 0.000 description 1
- 235000003434 Sesamum indicum Nutrition 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000592344 Spermatophyta Species 0.000 description 1
- 241000192584 Synechocystis Species 0.000 description 1
- 241000192593 Synechocystis sp. PCC 6803 Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N all-cis-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCC(O)=O MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical compound ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 229940124558 contraceptive agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003433 contraceptive agent Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N dCTP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 229940000640 docosahexaenoate Drugs 0.000 description 1
- 150000002066 eicosanoids Chemical class 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 229940066963 gamma-linolenate Drugs 0.000 description 1
- VZCCETWTMQHEPK-QNEBEIHSSA-N gamma-linolenic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC(O)=O VZCCETWTMQHEPK-QNEBEIHSSA-N 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000037427 ion transport Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000008161 low-grade oil Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 235000010460 mustard Nutrition 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000006180 nutrition needs Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 230000006259 progesterone secretion Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 229940127293 prostanoid Drugs 0.000 description 1
- 150000003814 prostanoids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 108010009106 sphingolipid desaturase Proteins 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000005062 synaptic transmission Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 150000003595 thromboxanes Chemical class 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 150000003672 ureas Chemical class 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
Это изобретение относится к последовательностям ДНК, кодирующим Δ5-десатуразы жирных кислот, кодируемым Δ5-десатуразам жирных кислот и применению Δ5-десатураз жирных кислот.This invention relates to DNA sequences encoding Δ 5 fatty acid desaturase encoded by Δ 5 fatty acid desaturase and the use of Δ 5 fatty acid desaturase.
Полиненасыщенные жирные кислоты важны физиологически благодаря их специфическим укрепляющим здоровье активностям и биомедицински в отношении их потенциального фармацевтического применения при лечении определенных болезненных состояний.Polyunsaturated fatty acids are physiologically important due to their specific health-enhancing activities and biomedical in relation to their potential pharmaceutical use in the treatment of certain disease states.
Полиненасыщенные жирные кислоты являются предшественниками двух больших классов метаболитов: простаноидов (которые включают в себя простаглаидины и тромбоксаны) и лейкотриенов. Δ5-Десатураза жирных кислот катализирует превращение дигомо-γ-линоленовой кислоты (ДГЛК) в арахидоновую кислоту (АК) и эйкозатетраеноата (ЭТЕ) в эйкозапентаеноат (ЭПЕ), путем введения двойных связей в положение Δ5-углерода соответствующих субстратов, и существует в форме связанного с мембраной эндоплазматического ретикулума белка в его нативном состоянии.Polyunsaturated fatty acids are the precursors of two large classes of metabolites: prostanoids (which include prostaglaidins and thromboxanes) and leukotrienes. Δ 5 fatty acid desaturase catalyzes the conversion of dihomo-γ-linolenic acid (DGLA) to arachidonic acid (AA) and eicosatetraenoate (ETE) into eicosapentaenoate (EPE), by introducing double bonds to the Δ 5 carbon position of the corresponding substrates, and exists in the form of a membrane-bound endoplasmic reticulum protein in its native state.
Арахидоновая кислота имеет 20-членную углеродную цепь с 4 двойными связями и играет большое значение в метаболизме человека, так как она является предшественником для синтеза простагландинов - жирных кислот с 20-членной углеродной цепью, которые содержат 5-членное углеродное кольцо. Простагландины являются модуляторами действия гормонов, а потенциальные эффекты простагландинов включают в себя стимуляцию воспаления, регуляцию кровотока к отдельным органам, контроль ионного транспорта через некоторые мембраны и модуляцию синаптической передачи. Простагландины также потенциально применимы в качестве контрацептивов, благодаря их способности подавлять секрецию прогестерона. Поэтому умение модулировать синтез простагландинов путем контролируемых уровней экспрессии синтеза предшественников полиненасыщенных жирных кислот является очень важным как медицински, так и промышленно.Arachidonic acid has a 20-membered carbon chain with 4 double bonds and plays an important role in human metabolism, as it is a precursor for the synthesis of prostaglandins - fatty acids with a 20-membered carbon chain that contain a 5-membered carbon ring. Prostaglandins are modulators of the action of hormones, and the potential effects of prostaglandins include stimulation of inflammation, regulation of blood flow to individual organs, control of ion transport through certain membranes, and modulation of synaptic transmission. Prostaglandins are also potentially useful as contraceptives, due to their ability to suppress progesterone secretion. Therefore, the ability to modulate the synthesis of prostaglandins by controlled expression levels of the synthesis of polyunsaturated fatty acid precursors is very important both medically and industrially.
Возрастающее значение полиненасыщенных жирных кислот в пищевой и фармацевтической промышленностях привело к повышенному спросу, который превысил уровни современного производства и дополнительных источников высокого качества, необходимы дешевые полиненасыщенные жирные кислоты.The increasing importance of polyunsaturated fatty acids in the food and pharmaceutical industries has led to increased demand, which has exceeded the levels of modern production and additional sources of high quality, cheap polyunsaturated fatty acids are needed.
Современные промышленные источники полиненасыщенных жирных кислот включают в себя выбранные семенные растения, морскую рыбу и выбранных млекопитающих, а традиционные методы переработки для экстрагирования полиненасыщенных жирных кислот из этих источников включают в себя экстракцию растворителем, демаргаринизацию, образование аддуктов мочевины и дистилляцию. Однако представленные источники имеют недостатки, касающиеся сезонных и климатических различий как в уровнях производства, так и в качестве нехватки растительных и рыбных источников и высоких цен рафинирования низкосортных масел. Высокие цены, связанные с недостаточными уровнями производства, замедлили развитие промышленно пригодного применения полиненасыщенных жирных кислот.Current industrial sources of polyunsaturated fatty acids include selected seed plants, marine fish and selected mammals, and traditional processing methods for extracting polyunsaturated fatty acids from these sources include solvent extraction, demargarization, formation of urea adducts and distillation. However, the sources presented have drawbacks regarding seasonal and climatic differences both in production levels and in the lack of vegetable and fish sources and the high refining prices of low-grade oils. High prices associated with insufficient production levels have slowed the development of the industrially suitable use of polyunsaturated fatty acids.
Большие усилия были затрачены на разработку альтернативных источников полиненасыщенных жирных кислот, и были проведены исследования для характеристики составных генов и кодируемых белков их биосинтеза. Инженерия биосинтеза полиненасыщенных жирных кислот, например в масличных культурах, имеет много достоинств для производства крупномасштабных количеств, например, γ-линолената (ГЛ), дигомо-γ-линолената (ДГГЛ), арахидоновой кислоты (АК), эйкозапентаеноата (ЭПЕ) и докозагексаеноата (ДГЕ). Практическая реализация этого была проиллюстрирована экспрессией гена Δ6-десатуразы бурачника в табаке, имевшей результатом продукцию ГЛ и октадекатетраеновой кислоты, 18:4 (Soyanova et.al. (1997), PNAS 94, 9411-9414), Поскольку большинство биосинтетических генов для синтеза полиненасыщенных жирных кислот становятся доступными, это предоставляет возможность для продуцирования по меньшей мере ГЛ, АК, ЭПЕ и ДГЕ в масличных культурах, а также контролирования типа собранного липида. Преимущества, которые были бы получены от таких культур включают в себя дешевый и поддерживаемый запас требуемых в крупном масштабе полиненасыщенных жирных кислот, заданный профиль полиненасыщенных жирных кислот для удовлетворения конкретных пищевых потребностей, а в тонкой химической промышленности получение необычных жирных кислот с заданными степенями и положениями ненасыщенности.Great efforts have been devoted to the development of alternative sources of polyunsaturated fatty acids, and studies have been carried out to characterize the composite genes and encoded proteins of their biosynthesis. The biosynthesis engineering of polyunsaturated fatty acids, for example in oilseeds, has many advantages for the production of large-scale quantities, for example, γ-linolenate (GL), dihomo-γ-linolenate (DHGL), arachidonic acid (AA), eicosapentaenoate (EPE) and docosahexaenoate DHE). The practical implementation of this has been illustrated by the expression of the Δ 6 gene for borage in tobacco, resulting in the production of GL and octadecatetraenoic acid, 18: 4 (Soyanova et.al. (1997), PNAS 94, 9411-9414), since most biosynthetic genes for synthesis polyunsaturated fatty acids are becoming available, this provides the opportunity for the production of at least GL, AK, EPE and DHE in oilseeds, as well as controlling the type of lipid collected. The benefits that would be gained from such crops include a cheap and maintained supply of large-scale polyunsaturated fatty acids, a predetermined profile of polyunsaturated fatty acids to meet specific nutritional needs, and in the fine chemical industry, the production of unusual fatty acids with predetermined degrees and positions of unsaturation .
Дополнительным подходом к получению полиненасыщенных жирных кислот является утилизация биосинтетической способности низших организмов, например, водорослей, бактерий, грибов (включая фикомицетов), которые могут синтезировать весь ряд полиненасыщенных жирных кислот и могут выращиваться в промышленных масштабах. Генетическая трансформация этих организмов будет облегчать выведение сверхпродуцирующих штаммов и манипулирование полиненасыщенным профилем путем инженерии.An additional approach to the production of polyunsaturated fatty acids is the utilization of the biosynthetic ability of lower organisms, for example, algae, bacteria, fungi (including phycomycetes), which can synthesize the whole range of polyunsaturated fatty acids and can be grown on an industrial scale. The genetic transformation of these organisms will facilitate the removal of super-producing strains and the manipulation of the polyunsaturated profile by engineering.
Были клонированы грибные Δ5- и Δ6-десатуразы жирных кислот, а их последовательности рассмотрены в WO 98/46763, WO 98/46764, WO 9846765.Fungal Δ 5 and Δ 6 fatty acid desaturases were cloned, and their sequences are discussed in WO 98/46763, WO 98/46764, WO 9846765.
Метаболизм полиненасыщенных жирных кислот имеет наибольшее значение в метаболизме человека. Эти кислоты, через эйкозаноиды, являются фундаментальными для правильного поддержания гомеостаза и сцеплены с серьезными физиологическими и патофизиологическими синдромами.The metabolism of polyunsaturated fatty acids is of greatest importance in human metabolism. These acids, through eicosanoids, are fundamental to the proper maintenance of homeostasis and are linked to serious physiological and pathophysiological syndromes.
Неожиданно авторы изобретения выделили из обитающего в почве мицелиального гриба класса зигомицетов, Mortierella alpina, и охарактеризовали последовательность ДНК, кодирующую функционально активную Δ5-десатуразу жирных кислот.Surprisingly, the inventors isolated a class of zygomycetes, Mortierella alpina, from a mycelial fungus living in the soil, and characterized a DNA sequence encoding a functionally active Δ 5 fatty acid desaturase.
Вместе с тем, авторы изобретения неожиданно выделили из нематоды, Caenorhabditis elegans, и охарактеризовали последовательность ДНК, кодирующую функционально активную Δ5-десатуразу жирных кислот. Эта последовательность ДНК, кодирующая функционально активную Δ5-десатуразу жирных кислот, как полагают, вероятно, более тесно связана с Δ5-десатуразой жирных кислот человека, чем какие-либо из до сих пор выделенных последовательностей гена Δ5-десатуразы жирных кислот.However, the inventors unexpectedly isolated Caenorhabditis elegans from a nematode and characterized a DNA sequence encoding a functionally active Δ 5 fatty acid desaturase. This DNA sequence encoding a functionally active Δ 5 fatty acid desaturase is believed to be more closely related to human Δ 5 fatty acid desaturase than any of the hitherto isolated Δ 5 fatty acid desaturase gene sequences.
Также как и потенциальные благоприятные эффекты для человека от полипептида, кодируемого последовательностями ДНК по изобретению, последовательности ДНК по изобретению могут облегчить клонирование эквивалентного гена человека и, таким образом, способствовать сверхпродуцированию последовательности ДНК человека и сделать возможным ее биомедицинское использование при лечении некоторых болезней человека.As well as potential beneficial effects for humans from the polypeptide encoded by the DNA sequences of the invention, the DNA sequences of the invention can facilitate the cloning of an equivalent human gene and, thus, contribute to the overproduction of the human DNA sequence and enable its biomedical use in the treatment of certain human diseases.
Растительные и грибные десатуразы являются, главным образом, интегральными мембранными полипептидами, что затрудняет их очистку и впоследствии характеристику традиционными методами. Поэтому для лучшего изучения липидного обмена выбраны молекулярные методы, включающие в себя использование мутантов и трансгенных растений.Plant and fungal desaturases are mainly integral membrane polypeptides, which complicates their purification and subsequently characterization by traditional methods. Therefore, for a better study of lipid metabolism, molecular methods were chosen, including the use of mutants and transgenic plants.
Согласно первому аспекту изобретения предложена выделенная животная Δ5-десатураза жирных кислот и ее функционально активные части.According to a first aspect of the invention, there is provided an isolated animal Δ 5 fatty acid desaturase and its functionally active parts.
Согласно второму аспекту изобретения предложена выделенная Δ5-десатураза жирных кислот С.elegans.According to a second aspect of the invention, an isolated Δ 5 -desaturase of C. elegans fatty acids is provided.
Согласно третьему аспекту изобретения предложена последовательность ДНК по первому или второму аспекту изобретения, включающая в себя по меньшей мере часть последовательности, представленной в SEQ.2, и эквиваленты этой последовательности или частей этой последовательности, которые кодируют функционально активную Δ5-десатуразу жирных кислот в силу вырожденности генетического кода. Предпочтительно, последовательность ДНК имеет происхождение от последовательности ДНК Caenorhabditis elegans.According to a third aspect of the invention, there is provided a DNA sequence according to the first or second aspect of the invention, comprising at least a portion of the sequence shown in SEQ.2 and equivalents of this sequence or parts of this sequence that encode a functionally active Δ 5 fatty acid desaturase by virtue of degeneracy of the genetic code. Preferably, the DNA sequence is derived from Caenorhabditis elegans DNA sequence.
Предпочтительно, ген, кодирующий Δ5-десатуразу жирных кислот, кодируемую клонированным геном, имеет длину 1341 п.н. (пар нуклеотидов). Белок с подсчитанной молекулярной массой 57 кДа имеет длину 447 аминокислот.Preferably, the gene encoding the Δ 5 fatty acid desaturase encoded by the cloned gene is 1341 bp in length. (nucleotide pairs). A protein with a calculated molecular weight of 57 kDa has a length of 447 amino acids.
В качестве альтернативы, последовательность ДНК кодирует функционально активную Δ5-десатуразу жирных кислот и включает в себя по меньшей мере часть последовательности, представленной в SEQ.1, и эквиваленты этой последовательности или частей, этой последовательности, которые кодируют функционально активную Δ5-десатуразу жирных кислот в силу вырожденности генетического кода. Предпочтительно, последовательность ДНК имеет происхождение от последовательности ДНК Mortierelfa alpina.Alternatively, the DNA sequence encodes a functionally active Δ 5 fatty acid desaturase and includes at least a portion of the sequence shown in SEQ.1 and equivalents to this sequence or parts of this sequence that encode a functionally active Δ 5 fatty acid desaturase acids due to the degeneracy of the genetic code. Preferably, the DNA sequence is derived from the DNA sequence of Mortierelfa alpina.
Предпочтительно, ген, кодирующий Δ5-десатуразу жирных кислот, кодируемую клонированным геном, имеет длину 1338 п.н. Белок с подсчитанной молекулярной массой 57 кДа имеет длину 447 аминокислот.Preferably, the gene encoding the Δ 5 fatty acid desaturase encoded by the cloned gene is 1338 bp in length. A protein with a calculated molecular weight of 57 kDa has a length of 447 amino acids.
Предпочтительно, последовательность ДНК по третьему аспекту изобретения функционально активна у млекопитающего.Preferably, the DNA sequence of the third aspect of the invention is functionally active in a mammal.
Предпочтительно, последовательность ДНК экспрессируется у млекопитающего.Preferably, the DNA sequence is expressed in a mammal.
Предпочтительно, последовательность ДНК экспрессируется у человека.Preferably, the DNA sequence is expressed in humans.
Предпочтительно, последовательность ДНК получена путем модификации функционально активного природного гена, кодирующая Δ5-десатуразу жирных кислот.Preferably, the DNA sequence is obtained by modifying a functionally active natural gene encoding Δ 5 fatty acid desaturase.
Предпочтительно, модификация включает в себя модификацию химическими, физическими или биологическими способами без утраты каталитической активности фермента, который она кодирует.Preferably, the modification includes modification by chemical, physical or biological methods without losing the catalytic activity of the enzyme that it encodes.
Предпочтительно, модификация улучшает каталитическую активность фермента, который она кодирует.Preferably, the modification improves the catalytic activity of the enzyme that it encodes.
Предпочтительно, биологическая модификация включает в себя методы рекомбинантных ДНК и методы принудительной эволюции.Preferably, the biological modification includes recombinant DNA methods and forced evolution methods.
Предпочтительно, метод принудительной эволюции представляет собой перетасовку ДНК.Preferably, the forced evolution method is DNA shuffling.
Согласно четвертому аспекту изобретения предложен полипептид, кодируемый последовательностью ДНК по третьему аспекту изобретения.According to a fourth aspect of the invention, there is provided a polypeptide encoded by the DNA sequence of the third aspect of the invention.
Предпочтительно, по меньшей мере часть полипептида имеет последовательность, представленную в SEQ.3, или функционально активные эквиваленты этой последовательности или частей этой последовательности. В качестве альтернативы, по меньшей мере часть полипептида имеет последовательность, представленную в SEQ.4, или функционально активные эквиваленты этой последовательности или частей этой последовательности.Preferably, at least a portion of the polypeptide has the sequence shown in SEQ.3, or functionally active equivalents of this sequence or parts of this sequence. Alternatively, at least part of the polypeptide has the sequence shown in SEQ.4, or functionally active equivalents of this sequence or parts of this sequence.
Предпочтительно, полипептид катализирует превращение дигомо-γ-линоленовой кислоты в арахидоновую кислоту.Preferably, the polypeptide catalyzes the conversion of dihomo-γ-linolenic acid to arachidonic acid.
Предпочтительно, полипептид модифицирован без утраты каталитической активности кодируемого полипептида.Preferably, the polypeptide is modified without losing the catalytic activity of the encoded polypeptide.
Предпочтительно, полипептид модифицирован таким образом, чтобы вводить конкретную степень насыщенности субстрата в конкретное положение в молекулярной структуре субстрата.Preferably, the polypeptide is modified so as to introduce a specific degree of saturation of the substrate at a specific position in the molecular structure of the substrate.
Согласно пятому аспекту изобретения предложен вектор, содержащий последовательность ДНК любой части последовательности ДНК по третьему аспекту изобретения.According to a fifth aspect of the invention, there is provided a vector comprising a DNA sequence of any part of the DNA sequence of the third aspect of the invention.
Согласно шестому аспекту изобретения предложен способ получения полиненасыщенных жирных кислот, при котором субстрат приводят в контакт с Δ5-десатуразой жирных кислот по первому или второму аспекту изобретения или с полипептидом по четвертому аспекту изобретения.According to a sixth aspect of the invention, there is provided a method for producing polyunsaturated fatty acids, wherein the substrate is contacted with the Δ 5 desaturase of fatty acids according to the first or second aspect of the invention or with the polypeptide of the fourth aspect of the invention.
Согласно седьмому аспекту изобретения предложен способ превращения дигомо-γ-линоленовой кислоты в арахидоновую кислоту, при котором превращение катализируют Δ5-десатуразой жирных кислот по первому или второму аспекту изобретения или полипептидом по четвертому аспекту изобретения.According to a seventh aspect of the invention, there is provided a method for converting dihomo-γ-linolenic acid to arachidonic acid, wherein the conversion is catalyzed by a Δ 5 -desaturase of fatty acids according to the first or second aspect of the invention or a polypeptide according to the fourth aspect of the invention.
Согласно восьмому аспекту изобретения предложен организм, сконструированный для продуцирования высоких уровней полипептида по четвертому аспекту изобретения.According to an eighth aspect of the invention, there is provided an organism designed to produce high levels of the polypeptide of the fourth aspect of the invention.
Согласно девятому аспекту изобретения предложен организм, сконструированный для продуцирования высоких уровней продукта реакции, катализируемой Δ5-десатуразой жирных кислот по первому или второму аспекту изобретения или полипептидом по четвертому аспекту изобретения.According to a ninth aspect of the invention, there is provided an organism designed to produce high levels of a reaction product catalyzed by a Δ 5 desaturase of fatty acids according to the first or second aspect of the invention or a polypeptide according to the fourth aspect of the invention.
Предпочтительно, организм сконструирован для осуществления способа по шестому или седьмому аспекту изобретения.Preferably, the body is designed to implement the method according to the sixth or seventh aspect of the invention.
Предпочтительно, организм представляет собой микроорганизм.Preferably, the organism is a microorganism.
Предпочтительно, микроорганизм выбран из водорослей, бактерий и грибов.Preferably, the microorganism is selected from algae, bacteria and fungi.
Предпочтительно, грибы включают в себя фикомицеты. В качестве альтернативы, микроорганизм представляет собой дрожжи.Preferably, the fungi include ficomycetes. Alternatively, the microorganism is a yeast.
В качестве альтернативы, организм представляет собой растение. Предпочтительно, растение выбрано из масличных растений.Alternatively, the body is a plant. Preferably, the plant is selected from oil plants.
Предпочтительно, масличные растения выбраны из масличного рапса, подсолнечника, злаков, включая кукурузу, табака, бобовых, включая арахис и сою, сафлора, масличной пальмы, кокосовой и других пальм, хлопчатника, кунжута, горчицы, льна, клещевины, бурачника и энотеры.Preferably, the oil plants are selected from oilseed rape, sunflower, cereals, including corn, tobacco, legumes, including peanuts and soybeans, safflower, oil palm, coconut and other palms, cotton, sesame, mustard, flax, castor oil, beetroot and evening primrose.
Согласно десятому аспекту изобретения предложен семенной или другой репродуктивный материал, имеющий происхождение от организма по девятому аспекту изобретения.According to a tenth aspect of the invention, there is provided seed or other reproductive material derived from an organism according to the ninth aspect of the invention.
Предпочтительно, организм представляет собой млекопитающее.Preferably, the body is a mammal.
Согласно одиннадцатому аспекту изобретения предложен мультиферментный путь, где путь включает в себя Δ5-десатуразу жирных кислот по первому или второму аспекту изобретения.According to an eleventh aspect of the invention, a multi-enzyme pathway is provided, wherein the pathway includes Δ 5 fatty acid desaturase according to the first or second aspect of the invention.
Согласно двенадцатому аспекту изобретения предложено соединение, полученное путем превращения субстрата, где указанное превращение катализируют Δ5-десатуразой жирных кислот по первому или второму аспекту изобретения.According to a twelfth aspect of the invention, there is provided a compound obtained by converting a substrate, wherein said conversion is catalyzed by a Δ 5 -desaturase of fatty acids according to the first or second aspect of the invention.
Согласно тринадцатому аспекту изобретения предложено промежуточное соединение, полученное путем реакции, катализируемой Δ5-десатуразой жирных кислот по первому или второму аспекту изобретения.According to a thirteenth aspect of the invention, there is provided an intermediate compound obtained by a reaction catalyzed by a Δ 5 fatty acid desaturase according to the first or second aspect of the invention.
Согласно четырнадцатому аспекту изобретения предложен продукт питания или диетическая добавка, содержащие полиненасыщенную жирную кислоту, полученную способом по шестому аспекту изобретения.According to a fourteenth aspect of the invention, there is provided a food product or dietary supplement containing a polyunsaturated fatty acid obtained by the method of the sixth aspect of the invention.
Согласно пятнадцатому аспекту изобретения предложен фармацевтический препарат, содержащий полиненасыщенную жирную кислоту, полученную способом по шестому аспекту изобретения.According to a fifteenth aspect of the invention, there is provided a pharmaceutical preparation comprising a polyunsaturated fatty acid obtained by the method of the sixth aspect of the invention.
Согласно шестнадцатому аспекту изобретения предложены простагландины, синтезируемые биосинтетическим путем, включающим в себя каталитическую активность Δ5-десатуразы жирных кислот по первому или второму аспекту изобретения.According to a sixteenth aspect of the invention, prostaglandins are synthesized biosynthetically, including the catalytic activity of Δ 5 fatty acid desaturase according to the first or second aspect of the invention.
Согласно семнадцатому аспекту изобретения предложен способ модуляции синтеза простагландинов путем контроля уровней экспрессии последовательности ДНК по третьему аспекту изобретения.According to a seventeenth aspect of the invention, there is provided a method for modulating prostaglandin synthesis by controlling expression levels of a DNA sequence in a third aspect of the invention.
Согласно восемнадцатому аспекту изобретения предложен зонд, включающий в себя всю последовательность ДНК по третьему аспекту изобретения или ее часть либо эквивалентную последовательность РНК.According to an eighteenth aspect of the invention, there is provided a probe comprising the entire DNA sequence of the third aspect of the invention or a portion thereof or an equivalent RNA sequence.
Согласно девятнадцатому аспекту изобретения предложен зонд, включающий в себя весь полипептид-Δ5-десатуразу жирных кислот по четвертому аспекту изобретения или его часть.According to a nineteenth aspect of the invention, there is provided a probe comprising the entire Δ 5 fatty acid polypeptide-Δ 5 desaturase of the fourth aspect of the invention or a portion thereof.
Согласно двадцатому аспекту изобретения предложен способ выделения Δ5-десатураз с использованием зонда по девятнадцатому аспекту изобретения.According to a twentieth aspect of the invention, there is provided a method for isolating Δ 5 desaturases using the probe of the nineteenth aspect of the invention.
Возможно, что ген по изобретению может быть трансформирован в клетки человека и использован в методах генотерапии на подходящем уровне in vivo для обеспечения в организме пациента постоянного запаса жирных кислот, превращаемых ферментами в полиненасыщенные жирные кислоты. Это могло бы быть эффективным профилактическим лечением, например, для пациентов страдающих высокими уровнями холестерина или другими медицинскими состояниями, где введение полиненасыщенных жирных кислот может иметь благоприятные эффекты, предупреждающие заболевание.It is possible that the gene of the invention can be transformed into human cells and used in gene therapy methods at an appropriate in vivo level to provide the patient with a constant supply of fatty acids converted by polyunsaturated fatty acids by enzymes. This could be an effective prophylactic treatment, for example, for patients suffering from high cholesterol levels or other medical conditions where the administration of polyunsaturated fatty acids can have beneficial effects that prevent the disease.
Вместе с тем, либо целые последовательности ДНК по изобретению или их части, либо целые полипептидные последовательности по изобретению или их части могли бы быть использованы в качестве зондов для поиска в исследовательских или диагностических целях.However, either whole DNA sequences of the invention or parts thereof, or entire polypeptide sequences of the invention or parts thereof could be used as probes for research or diagnostic purposes.
Далее изобретение будет описано посредством единственного примера со ссылкой на сопровождающие графические материалы, SEQ.1-4 и Фиг.1-4, в которых:The invention will now be described by way of a single example with reference to the accompanying drawings, SEQ.1-4 and FIGS. 1-4, in which:
SEQ.1 представляет собой последовательность кДНК, кодирующую Δ5-десатуразу жирных кислот из Mortierella alpina;SEQ.1 is a cDNA sequence encoding Δ 5 fatty acid desaturase from Mortierella alpina;
SEQ.2 представляет собой последовательность кДНК, кодирующую Δ5-десатуразу жирных кислот из С.elegans;SEQ.2 is a cDNA sequence encoding Δ 5 fatty acid desaturase from C. elegans;
SEQ.3 представляет собой пептидную последовательность, полученную трансляцией генной последовательности SEQ.1;SEQ.3 is a peptide sequence obtained by translation of the gene sequence of SEQ.1;
SEQ.4 представляет собой пептидную последовательность, полученную трансляцией генной последовательности SEQ.2;SEQ.4 is a peptide sequence obtained by translation of the gene sequence of SEQ.2;
Фиг.1 представляет собой выравнивание гена, кодирующего Δ5-десатуразу жирных кислот Mortierella alpina с разными *6-десатуразами и Δ5-десатуразой;Figure 1 is the alignment of the gene encoding the Δ 5 desaturase of fatty acids Mortierella alpina with different * 6 desaturases and Δ 5 desaturase;
Фиг.2 представляет собой выравнивание гена, кодирующего Δ5-десатуразу жирных кислот с Δ6-десатуразой С.elegans и грибной Δ5-десатуразой из М.alpina;Figure 2 is the alignment of the gene encoding Δ 5 -desaturase of fatty acids with Δ 6 -desaturase of C. elegans and fungal Δ 5 -desaturase of M. alpina;
Фиг.3 представляет собой полученную с помощью газовой хроматографии хроматограмму метиловых эфиров жирных кислот из индуцированных дрожжевых клеток-трансформантов, трансформированных геном Δ5-десатуразы жирных кислот Mortierella alpina, и неиндуцированных дрожжевых клеток-трансформантов;Figure 3 is a gas chromatography chromatogram of methyl esters of fatty acids from induced yeast transformant cells transformed with the Δ 5 gene of the Mortierella alpina fatty acid desaturase and non-induced yeast transformant cells;
Фиг.4 представляет собой полученную с помощью газовой хроматографии хроматограмму метиловых эфиров жирных кислот из индуцированных дрожжевых клеток-трансформантов, трансформированных геном Δ5-десатуразы жирных кислот C.elegans, и неиндуцированных дрожжевых клеток-трансформантов.Figure 4 is a gas chromatography chromatogram of methyl esters of fatty acids from induced yeast transformant cells transformed with the C. elegans Δ 5 fatty acid desaturase gene and uninduced transformant yeast cells.
Клонирование и секвенирование гена Δ5-десатуразы жирных кислот из Mortierella alpinaCloning and sequencing of the Δ 5 fatty acid desaturase gene from Mortierella alpina
Последовательности ДНК по изобретению, кодирующие Δ5-десатуразы жирных кислот, клонировали, используя метод ПЦР в сочетании с матрицами из библиотеки кДНК и праймерами, сконструированными конкретным образом. Функцию последовательностей ДНК, а именно превращение дигомо-γ-линоленовой кислоты (ДГГЛК) в арахидоновую кислоту (АК) и эйкозатетраеноата (ЭТЕ) в эйкозапентаеноат (ЭПЕ), проверяли путем экспрессии соответствующих кДНК в дрожжах.The DNA sequences of the invention encoding Δ 5 fatty acid desaturases were cloned using PCR in combination with cDNA library templates and primers specifically designed. The function of the DNA sequences, namely the conversion of dihomo-γ-linolenic acid (DHGLA) to arachidonic acid (AK) and eicosatetraenoate (ETE) to eicosapentaenoate (EPE), was verified by expression of the corresponding cDNA in yeast.
Ген Δ5-десатуразы жирных кислот из Mortierella alpina клонировали методами полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя кДНК из Mortierella alpina в качестве матрицы и вырожденные олигонуклеотидные праймеры (ВП), сконструированные конкретным образом, как показано ниже, основанные на первом и третьем гистидиновых боксах растительных Δ12- и Δ15-десатураз, предварительно идентифицированных Шенклином (Shanklin, J, Whittle E J & Fox, BG Biochemistry. 33, 12787-12794 (1994)).The Δ 5 gene of fatty acid desaturase from Mortierella alpina was cloned by polymerase chain reaction (PCR) using cDNA from Mortierella alpina as a template and degenerate oligonucleotide primers (VP), designed in a specific way, as shown below, based on the first and third histine boxes plant Δ 12 and Δ 15 desaturas previously identified by Shanklin (Shanklin, J, Whittle EJ & Fox, BG Biochemistry. 33, 12787-12794 (1994)).
Вырожденные олигонуклеотидные праймеры (ВП),Degenerate oligonucleotide primers (VP),
5'-GCGAATTA(A/T)TIGGICA(T/C)GA(T/C)TG(T/C)GICA-3'5'-GC GAATTA (A / T) TIGGICA (T / C) GA (T / C) TG (T / C) GICA-3 '
5'-GCGAATTCATIT(G/T)IGG(A/G)AAIA(G/A)(A/G)TG(A/G)TG-3'5'-GC GAATTC ATIT (G / T) IGG (A / G) AAIA (G / A) (A / G) TG (A / G) TG-3 '
где I представляет собой инозин, а Есо RI-сайты подчеркнуты.where I is inosine and Eco RI sites are underlined.
ПЦР-амплификации проводили полностью традиционно в термоблоке для реакций, программированном на выполнение программы: 2 минуты при 94°С, затем 45 секунд при 94°С, 1 минута при 55°С и 1 минута при 72°С в течении 32 циклов, с последующей элонгацией при 72°С в течение дополнительных 10 минут. Продукты ПЦР-амплификации разделяли в 1%-ных агарозных гелях.PCR amplification was carried out completely traditionally in the reaction thermoblock programmed for the program: 2 minutes at 94 ° C, then 45 seconds at 94 ° C, 1 minute at 55 ° C and 1 minute at 72 ° C for 32 cycles, s subsequent elongation at 72 ° C for an additional 10 minutes. PCR amplification products were separated on 1% agarose gels.
Ряд продуктов ПЦР, амплифицированных на кДНК-матрице из Mortierella alpina, включал продукт длиной 660 п.н., который очищали от геля, клонировали в векторе pGEM-T (PromegaRTM) и трансформировали в экспрессионного хозяина Escherichia coli, DH 5α.A number of PCR products amplified on a cDNA template from Mortierella alpina included a 660 bp product that was gel purified, cloned in the pGEM-T vector (Promega RTM ) and transformed into the expression host Escherichia coli, DH 5α.
К последовательности продукта длиной 660 п.н. сконструировали праймеры (П) и выполняли амплификацию фрагментов путем ПЦР, используя клонированный фрагмент длиной 660 п.н. в качестве матрицы и последовательность-специфичные праймеры (П), основанные на последовательности продукта длиной 660 п.н.The product sequence length of 660 bp primers (P) were constructed and fragments were amplified by PCR using a 660 bp cloned fragment. as a matrix and sequence-specific primers (P) based on the sequence of the product with a length of 660 bp
Delta В прямойDelta In Straight
5'-GATGCGTCTCACTTTTCA-3'5'-GATGCGTCTCACTTTTCA-3 '
Delta В обратныйDelta Inverse
5'-GTGGTGCACAGCCTGGTAGTT-3'5'-GTGGTGCACAGCCTGGTAGTT-3 '
Продукты этой ПЦР-амплификации очищали от геля и использовали в качестве зондов для скрининга библиотеки кДНК Mortierella alpina. Зонд для поиска фрагмента гибридизовался с 25 из 3,5×105 проверенных фаговых клонов и один клон, как было показано путем рестрикционного анализа, имел ожидаемый размер - 1,5 т. п.н. (тысяч пар нуклеотидов). Этот клон, обозначенный L11, отобрали для дальнейшего анализа. Анализ последовательности L11 выявил открытую рамку считывания длиной 1338 п.н., кодирующую полипептид из 446 аминокислот. Когда продолжили анализировать белок и геномные базы данных, используя программу GCG8 (Devereux J. et al. Nucleic Acids. Res. 12, 387-395 (1984)), L11 показала низкую степень идентичности (20%) гену Δ6-десатуразы из вида Synechocystis PCC6803 (Фиг.1).The products of this PCR amplification were gel purified and used as probes for screening the Mortierella alpina cDNA library. The probe for searching for a fragment hybridized with 25 of the 3.5 × 10 5 checked phage clones and one clone, as shown by restriction analysis, had the expected size of 1.5 bp (thousand pairs of nucleotides). This clone, designated L11, was selected for further analysis. Sequence analysis of L11 revealed an 1338 bp open reading frame encoding a 446 amino acid polypeptide. When they continued to analyze the protein and genomic databases using the GCG8 program (Devereux J. et al. Nucleic Acids. Res. 12, 387-395 (1984)), L11 showed a low degree of identity (20%) to the Δ 6 -desaturase gene from the species Synechocystis PCC6803 (Figure 1).
На Фиг.1 выравненные последовательности имеют следующие регистрационные номера:1, aligned sequences have the following registration numbers:
S54259 Δ12-десатураза Spirulina регистрационный номер Х86736S54259 Δ 12 Desaturase Spirulina registration number X86736
S54809 Δ6-десатураза Spirulina регистрационный номер Х87094S54809 Δ 6 -desaturase Spirulina registration number X87094
S68358 предполагаемая десатураза сфинголипидов регистрационный номер Х87143S68358 putative sphingolipid desaturase registration number X87143
S35157 Δ6-десатураза Synechocystis регистрационный номер L 11421S35157 Δ 6 Desaturase Synechocystis registration number L 11421
PBOR6 Δ6-десатураза бурачника регистрационный номер U79010PBOR6 Δ 6 - borage desaturase registration number U79010
FU2 Δ5-десатураза регистрационный номер AF054824FU2 Δ 5 Desaturase Registration Number AF054824
К тому же, хотя все три гистидиновых бокса, характерная черта десатуразных ферментов, присутствуют в транслируемой последовательности, третий гистидиновый бокс, локализованный в последовательности в положении 1159 п.н., содержит вариант QXXHH. Транслируемая последовательность также содержит на N-конце цитохром b5-подобный гем-связывающий домен, который включает в себя EHHPGG-фрагмент, несмотря на то, что эта особенность предварительно была обнаружена только на С-конце других грибных десатураз.In addition, although all three histidine boxes, a characteristic feature of desaturase enzymes, are present in the translated sequence, the third histidine box, localized in the sequence at 1159 bp, contains the QXXHH variant. The translated sequence also contains at the N-terminus a cytochrome b 5 -like heme-binding domain, which includes an EHHPGG fragment, although this feature was previously detected only at the C-terminus of other fungal desaturases.
Саузерн-блоттинг геномной ДНКSouthern Genomic DNA Blotting
Последовательность-специфичные праймеры, сконструированные к последовательности L11 между гистидиновыми боксами 1 и 3 последовательности L11, использовали в ПЦР-реакции для амплификации участка длиной 660 п.н. последовательности L11. Продукт ПЦР длиной 660 п.н. очищали от геля и выполняли блот-гибридизацию по Саузерну рестрицированных геномных ДНК из Mortierella alpina и Mucor circinelloides, используя в качестве зонда фрагмент длиной 660 п.н. Результаты означают, что ген, кодирующий Δ5-десатуразу жирных кислот по изобретению, представлен у Mortierella alpina уникальной копией и, по-видимому, отсутствует у Mucor circinelloides. К тому же, у Mucor circinelloides не обнаруживается Δ5-десатуразная активность.Sequence-specific primers designed for the L11 sequence between
Экспрессия клонированного гена Mortierella alpina, кодирующего Δ5-десатуразу жирных кислотExpression of the cloned Mortierella alpina gene encoding Δ 5 fatty acid desaturase
Для того, чтобы подтвердить, что последовательность L11 кодировала фермент - Δ5-десатуразу жирных кислот, кДНК субклонировали в дрожжевом экспрессирующем векторе pYES2, предоставленном Invitrogen™, под контролем промотора GAL4-полимеразы для выхода плазмиды pYES2/L11. Экспрессию L11 проверяли путем транскрипции-трансляции pYES2/L11 in vitro, используя сопряженную систему транскрипции и трансляции Promega™. Получали продукты трансляции, меченные 35S-метионином, которые разделяли электрофорезом в ПААГ (полиакриламидном геле) в присутствии SDS (додецилсульфата натрия) и визуализировали путем экспонирования с авторадиографической пленкой. Подсчитанная молекулярная масса продукта составила 55-60 кДа, а контрольная плазмида без вставки, pYES2, не способна давать какого-либо меченного продукта трансляции.In order to confirm that the L11 sequence encoded the Δ 5 fatty acid desaturase enzyme, cDNA was subcloned into the yeast expression vector pYES2 provided by Invitrogen ™ under the control of the GAL4 polymerase promoter to yield plasmid pYES2 / L11. L11 expression was tested by in vitro pYES2 / L11 transcription-translation using a Promega ™ conjugated transcription and translation system. Received translation products labeled with 35 S-methionine, which were separated by electrophoresis in SDS page (polyacrylamide gel) in the presence of SDS (sodium dodecyl sulfate) and visualized by exposure with an autoradiographic film. The calculated molecular weight of the product was 55-60 kDa, and the control plasmid without insert, pYES2, was not able to produce any labeled translation product.
Конструкцию pYES2/L11 трансформировали в дрожжи, Saccharomyces cerevisiae, и выращивали на среде YCA, обедненной урацилом. Трансформантов отбирали благодаря присутствию селектируемого маркера URA3, который несет pYES2/L11, а экспрессию L11 индуцировали добавлением галактозы до конечной концентрации 1% мМ. Культуры выращивали в течение ночи в присутствии 0,5 мМ дигомо-γ-линолената, детергента (1%-ного тергитола, NP-40) и 2%-ной рафинозы. Аликвотные пробы отбирали в моменты времени t=0, t=4 часа и t=16 часов. Все жирные кислоты дрожжей анализировали посредством ГХ (газовой хроматографии) метиловых эфиров. Липиды из индуцированных и неиндуцированных контрольных проб трансметилировали 1М HCl в метаноле при 80°С в течение 1 часа. Метиловые эфиры жирных кислот (МЭЖК) экстрагировали в гексане. Анализ с помощью ГХ МЭЖК проводили, используя газовый хроматограф Hewlett Packard серии 58804, оснащенный присоединенной капиллярной колонкой 25 М × 0,32 мм RSL-500ВР и пламенно-ионизационным детектором.The pYES2 / L11 construct was transformed into yeast, Saccharomyces cerevisiae, and grown on UCA depleted in UCA. Transformants were selected due to the presence of a selectable URA3 marker that carries pYES2 / L11, and L11 expression was induced by the addition of galactose to a final concentration of 1% mM. Cultures were grown overnight in the presence of 0.5 mM dihomo-γ-linolenate, detergent (1% tergitol, NP-40) and 2% raffinose. Aliquots were taken at time points t = 0, t = 4 hours and t = 16 hours. All yeast fatty acids were analyzed by GC (gas chromatography) methyl esters. Lipids from induced and non-induced control samples were transmethylated with 1M HCl in methanol at 80 ° C for 1 hour. Fatty acid methyl esters (FAMEs) were extracted in hexane. GC analysis of FAME was performed using a Hewlett Packard 58804 gas chromatograph equipped with an attached 25 M × 0.32 mm RSL-500BP capillary column and a flame ionization detector.
Когда метиловые эфиры всех жирных кислот, выделенных из дрожжей, несущих плазмиду pYes2/L11 и выращенных в присутствии галактозы и дигомо-γ-линоленовой кислоты, проанализировали посредством ГХ, обнаружили дополнительный пик (см. Фиг.3). Этот дополнительный пик имел такое же время удерживания, как стандарт аутентичной арахидоновой кислоты (Sigma), показывая, что трансгенные дрожжи способны к десатурированию дигомо-γ-линоленовой кислоты в Δ5-положении. Таких пиков не было обнаружено в контрольных пробах (трансформация pYes2), Фиг.3. Идентичность дополнительного пика подтвердили посредством ГХ-МС (газовая хроматография-масс-спектрометрия) (Kratos MC80RFA, работающий при напряжении ионизации 70 эВ с диапазоном сканирования 500-40 дальтон), которая точно идентифицировала это соединение, как арахидоновую кислоту.When methyl esters of all fatty acids isolated from yeast carrying the plasmid pYes2 / L11 and grown in the presence of galactose and dihomo-γ-linolenic acid were analyzed by GC, an additional peak was detected (see FIG. 3). This additional peak had the same retention time as the standard of authentic arachidonic acid (Sigma), showing that transgenic yeast is capable of desaturation of dihomo-γ-linolenic acid in the Δ 5 position. No such peaks were found in the control samples (pYes2 transformation), FIG. 3. The identity of the additional peak was confirmed by GC-MS (gas chromatography-mass spectrometry) (Kratos MC80RFA, operating at an ionization voltage of 70 eV with a scanning range of 500-40 daltons), which accurately identified this compound as arachidonic acid.
Это демонстрирует, что последовательность ДНК из Mortierella alpina кодирует функционально активный полипептид, вовлеченный в синтез арахидоновой кислоты в присутствии галактозы и дигомо-γ-линоленовой кислоты.This demonstrates that the DNA sequence from Mortierella alpina encodes a functionally active polypeptide involved in the synthesis of arachidonic acid in the presence of galactose and dihomo-γ-linolenic acid.
Клонирование и секвенирование гена Δ5-десатуразы жирных кислот C.elegansCloning and sequencing of the gene -desaturazy C.elegans Δ 5 fatty acids
Предварительно авторы изобретения идентифицировали грибные Δ5- и Δ6-десатуразы жирных кислот, которые отличались от предварительно идентифицированных микросомальных десатураз как из растительных, так и из животных видов. Это отличие было вызвано присутствием N-концевого удлиняющего сегмента, который демонстрировал гомологию с электронодонорным белком-цитохромом b5.Previously, the inventors identified fungal Δ 5 and Δ 6 fatty acid desaturases, which differed from previously identified microsomal desaturases from both plant and animal species. This difference was caused by the presence of an N-terminal extension segment, which showed homology with electron-donating protein cytochrome b 5 .
Во время характеристики грибной Δ5-десатуразы жирных кислот Mortierella alpina и Δ6-десатуразы жирных кислот С. afegans (находится в космиде W08D2 (регистрационный номер Z70271)), авторы изобретения идентифицировали родственную последовательность в космиде T13F2.1 (регистрационный номер Z81122), также содержащей ДНК С.elegans, которая, вероятно, кодирует десатуразу жирных кислот.During the characterization of the fungal Δ 5 fatty acid desaturase of Mortierella alpina and the Δ 6 fatty acid desaturase of C. afegans (located in cosmid W08D2 (registration number Z70271)), the inventors identified a related sequence in cosmid T13F2.1 (registration number Z81122), also containing C. elegans DNA, which probably encodes a fatty acid desaturase.
Анализ последовательностей с использованием программы Genefinder (Wilson, R. et al (1994) Nature, 368, 32-38)) показал, что космиды W08D2 и T13F2 содержат перекрывающиеся участки. Вместе с тем, было установлено, что космида T13F2, содержит открытую рамку считывания (ОРС), обозначенную T13F2.1, которая содержит N-концевой домен цитохрома b5 (определенный диагностическим фрагментом His-Pro-Gly-Gly), а также три гистидиновых бокса - характерную черту всех микросомальных десатураз. Кроме того, эта предполагаемая десатураза содержала вариантный третий гистидиновый бокс с Н→Q заменой вместо первого гистидина в фрагменте His-X-X-His-His. Эта глутаматная замена присутствует как в растительных, так и в животных Δ6-десатуразах жирных кислот, и в грибной Δ5-десатуразе жирных кислот из М.alpina.Sequence analysis using the Genefinder program (Wilson, R. et al (1994) Nature, 368, 32-38)) showed that the cosmids W08D2 and T13F2 contain overlapping regions. At the same time, it was found that the cosmid T13F2 contains an open reading frame (OPC), designated T13F2.1, which contains the N-terminal domain of cytochrome b 5 (determined by the His-Pro-Gly-Gly diagnostic fragment), as well as three histidine Boxing is a characteristic feature of all microsomal desaturases. In addition, this putative desaturase contained a variant third histidine box with an H → Q substitution instead of the first histidine in the His-XX-His-His fragment. This glutamate substitution is present in both plant and animal Δ 6 fatty acid desaturases, and in mushroom Δ 5 fatty acid desaturase from M. alpina.
Перекрывание между космидами T13F2 и W08D2 сделало возможным установление пространственной близости ОРС предполагаемой десатуразы T13F2.1 с Δ6-десатуразой жирных кислот, показывая, что две последовательности расположены тандемно на IV хромосоме, отделены 990 основаниями от предсказанного стоп-кодона T13F2.1 до инициирующего метионинового триплета Δ6-десатуразы жирных кислот.The overlap between the cosmids T13F2 and W08D2 made it possible to establish the spatial proximity of the OPC of the putative T13F2.1 desaturase with the Δ 6 -desaturase of fatty acids, showing that the two sequences are located in tandem on the IV chromosome, separated by 990 bases from the predicted stop codon T13F2.1 to the initiating methionine methionine Δ 6 triplet of fatty acid desaturase.
Поскольку анализ последовательности предсказал, что ОРС T13F2.1 разделена рядом интронов, гетерологичная функциональная экспрессия геномной ДНК невозможна. Поэтому полимеразную цепную реакцию использовали для амплификации клона, содержащего неполную кДНК, соответствующую большому предсказанному экзону на 5'-конце ОРС T13F2.1 с применением следующих праймеров: СЕ прямого и СЕ обратногоSince sequence analysis predicted that OPC T13F2.1 is separated by a number of introns, heterologous functional expression of genomic DNA is not possible. Therefore, the polymerase chain reaction was used to amplify a clone containing incomplete cDNA corresponding to the large predicted exon at the 5'-end of the T13F2.1 OPC using the following primers: direct and reverse CE
СЕ прямойCE direct
5' - ATGGTATTACGAGAGCAAGA-3'5 '- ATGGTATTACGAGAGCAAGA-3'
СЕ обратныйCE reverse
5' -TCTGGGATCTCTGGTTCTTG-3'5 '-TCTGGGATCTCTGGTTCTTG-3'
После начальной денатурации при 94°С в течение 2 минут проводили амплификацию в 32 цикла: 45 секунд при 94°С, 1 минута при 55°С и 1 минута при 72°С, с последующей заключительной элонгацией при 72°С в течение дополнительных 10 минут.After initial denaturation at 94 ° C for 2 minutes, amplification was performed in 32 cycles: 45 seconds at 94 ° C, 1 minute at 55 ° C and 1 minute at 72 ° C, followed by final elongation at 72 ° C for an additional 10 minutes.
Фрагмент ДНК правильно предсказанного размера (который визуализировали в 1%-ном агарозном геле) амплифицировали, бэнд на геле вырезали, ДНК очищали и лигировали непосредственно с pGEM-T (Promega), и полученную в результате плазмиду трансформировали в клетки E.coli DH 5α. Плазмидную ДНК очищали для секвенирования, используя набор Qiagen QIAprep miniprep, а нуклеотидную последовательность вставки определяли путем автоматизированного секвенирования, используя ДНК-секвенатор ABI-377.A correctly predicted DNA fragment (which was visualized on a 1% agarose gel) was amplified, the band on the gel was excised, the DNA was purified and ligated directly with pGEM-T (Promega), and the resulting plasmid was transformed into E. coli DH 5α cells. Plasmid DNA was purified for sequencing using the Qiagen QIAprep miniprep kit, and the nucleotide sequence of the insert was determined by automated sequencing using an ABI-377 DNA sequencer.
Для того, чтобы выделить полный кодирующий участок, соответствующий OPC T13F2.1, этот выделенный ПЦР-амплифицированный фрагмент длиной 233 п.н. использовали для скрининга библиотеки кДНК смешанной стадии С.elegans, которую сконструировали в λiZapll Prof. Yuji Kohara-Mishima, Япония. Скрининг проводили, используя стандартные методы (Sambrook et al (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual), с применением в качестве зонда клонированный продукт ПЦР. Фрагменты ДНК метили радиоактивным изотопом α[32Р] дЦТФ (дезоксицитидинтрифосфат), используя готовую реакционную смесь для мечения ДНК (Pharmacia). Из 1,4×105 бляшкообразующих единиц, проверенных на гибридизацию с фрагментом длиной 233 п.н. 5 бляшек дали положительные ответы и были вырезаны из чашек с агаром и элюированы в SM-буфер. Полученные в результате фаговые суспензии проверяли на присутствие T13F2.1 путем ПЦР-амплификации, используя СЕ прямой и СЕ обратный. Один клон, обозначенный L4, очищали 2 дополнительными циклами культивирования и скрининга путем гибридизации при 65°С, используя фрагмент длиной 233 п.н., выделенный посредством ПЦР. Плазмиду L4 выделяли из λ-клона L4 путем эксцизии и секвенировали обе цепи кДНК-вставки, используя ДНК-секвенатор ABI-377 Perkin-Elmer.In order to isolate the complete coding region corresponding to OPC T13F2.1, this isolated PCR amplified fragment of 233 bp in length used to screen a mixed stage cDNA library of C. elegans, which was constructed in λiZapll Prof. Yuji Kohara-Mishima, Japan. Screening was performed using standard methods (Sambrook et al (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual) using a cloned PCR product as a probe. DNA fragments were labeled with the radioactive isotope α [ 32 P] dTCP (deoxycytidine triphosphate) using the prepared reaction mixture for DNA labeling (Pharmacia). Of the 1.4 × 10 5 plaque-forming units tested for hybridization with a 233
Полученная в результате последовательность ДНК представлена в SEQ.2, и предсказанная аминокислотная последовательность представлена в SEQ.4.The resulting DNA sequence is presented in SEQ.2, and the predicted amino acid sequence is presented in SEQ.4.
Функциональный анализ L4 в дрожжахFunctional analysis of L4 in yeast
Полный кодирующий участок L4 (кодирующий 447 аминокислот) амплифицировали путем ПЦР, используя показанные ниже праймеры YCED прямой и YCED обратный, которые также включали фланкирующие HindIII- и BamHI-сайты рестрикции:The entire L4 coding region (encoding 447 amino acids) was amplified by PCR using the YCED direct and YCED reverse primers shown below, which also included flanking HindIII and BamHI restriction sites:
YCED прямойYCED direct
5'-GCGAAGCTTAAAATGGTATTACGAGAGCAAGAGC-3'5'-GCG AAGCTT AAAATGGTATTACGAGAGCAAGAGC-3 '
(отжиг с инициирующим метионином показан жирным шрифтом, сайт рестрикции HindIII подчеркнут)(annealing with initiating methionine is shown in bold, the HindIII restriction site is underlined)
YCED обратныйYCED reverse
5'-GCGGGATCCAATCTAGGCAATCTTTTTAGTCAA-3'5'-GCG GGATCC AATCTAGGCAATCTTTTTAGTCAA-3 '
(отжиг с комплементом стоп-кодона показан жирным шрифтом, сайт рестрикции BamHI подчеркнут).(annealing with the complement of the stop codon is shown in bold, the BamHI restriction site is underlined).
Амплифицированный продукт ПЦР, содержащий полный кодирующий участок L4, лигировали с дрожжевым экспрессирующим вектором pYES2 (Invitrogen), вниз от промотора GAL1, используя сайты рестрикции HindIII и BamHI (ферменты предоставлены Boehringer Mannheim). Полученную в результате конструкцию, обозначенную pYES2/L4, трансформировали в клетки E.coli и правильность полученной с помощью ПЦР вставки в плазмиду pYES2/L4 подтвердили in vitro посредством сопряженной транскрипции-трансляции, используя TNT-систему (Promega). Полученные в результате продукты трансляции метили 35S-метионином, разделяли электрофорезом в ПААГ в присутствии SDS и визуализировали посредством авторадиографии.The amplified PCR product containing the complete L4 coding region was ligated with the yeast expression vector pYES2 (Invitrogen) downstream of the GAL1 promoter using the HindIII and BamHI restriction sites (enzymes provided by Boehringer Mannheim). The resulting construct, designated pYES2 / L4, was transformed into E. coli cells and the validity of the PCR insert insert into plasmid pYES2 / L4 was confirmed in vitro by conjugated transcription-translation using the TNT system (Promega). The resulting translation products were labeled with 35 S-methionine, separated by SDSP electrophoresis in the presence of SDS, and visualized by autoradiography.
Продукт трансляции, полученный с pYES2/L4, имел молекулярную массу приблизительно Мr=57 000, тогда как контрольный вектор, pYES2 без вставки, не давал продукта трансляции.The translation product obtained with pYES2 / L4 had a molecular weight of approximately M r = 57,000, while the control vector, pYES2 without insertion, did not produce the translation product.
Для функционального анализа кодирующего участка L4 рекомбинантную плазмиду трансформировали в клетки S.cerevisiae DBY746 методом обработки ацетатом лития (Elble R. (1992) Bio Techniques 13 18-20). Клетки культивировали в течение ночи в среде, содержащей рафинозу в качестве источника углерода, обогащенную добавлением либо линолевой кислоты (18:2Δ9, 12), либо дигомо-γ-линоленовой кислоты (С20:33Δ8, 11, 14) в присутствии 1%-ного тергитола (как описано Napier et al (1998) Biochem. J. 330 611-614). Эти жирные кислоты отсутствуют у S.cerewsiae, но служат в качестве специфических субстратов либо для Δ6-, либо для Δ5-десатуразы, соответственно. Экспрессию кодирующего участка L4 с промотора GAL1 вектора индуцировали добавлением галактозы до 1%. Выращивание культур продолжалось в течение 16 часов до отбора аликвотных проб для анализа жирных кислот посредством ГХ. Все жирные кислоты, экстрагированные из дрожжевых культур, анализировали посредством газовой хроматографии (ГХ) метиловых эфиров. Липиды трансметилировали 1М HCl в метаноле при 80°С в течение 1 часа, затем метиловые эфиры жирных кислот (МЭЖК) экстрагировали в гексане. Анализ с помощью ГХ МЭЖК проводили, используя газовый хроматограф Hewlett Packard серии 5880А, оснащенный присоединенной капиллярной колонкой 25 М × 0,32 мм RSL-500 ВР и пламенно-ионизационным детектором. Жирные кислоты идентифицировали путем сравнения с временем удерживания стандартов МЭЖК (Sigma). Относительное процентное содержание жирных кислот подсчитывали исходя из площадей под пиками. Арахидоновую кислоту идентифицировали посредством ГХ-МС, используя Krats MC80RFA, работающий при напряжении ионизации 70 эВ с диапазоном сканирования 500-40 дальтон. Фиг.4 показывает результат анализа с помощью ГХ метиловых эфиров жирных кислот трансформированных штаммов дрожжей. Дополнительный пик выявляется на развертке, полученной с индуцированной pYES2/L4, выращенной в присутствии дигомо-γ-линоленовой кислоты, по сравнению с контролем, содержащим пустой вектор. Этот пик также отсутствовал у неиндуцированных культур, выращенных на среде с дигомо-γ-линоленовой кислотой и, к тому же, важно отметить, что pYES2/L4, выращенная в присутствии линолевой кислоты, не способна накапливать какие-либо новые пики, показывая что эта жирная кислота не является субстратом для фермента, кодируемого кДНК С.elegans. Время удерживания дополнительного пика идентично времени удерживания аутентичного стандарта метил-арахидоновой кислоты. Жирную кислоту, полученную из дигомо-γ-линоленовой кислоты, дополнительно характеризовали посредством ГХ-МС (газовой хроматографии-масс-спектрометрии) и идентифицировали, как арахидоновую кислоту. Следовательно, результаты показывают, что трансформированные плазмидой pYES2/L4 дрожжевые клетки приобрели функциональную Δ5-десатуразную активность и были способны к синтезу арахидоновой кислоты из дигомо-γ-линоленовой кислоты, выступающей в качестве субстрата. Δ5-Десатураза в трансформированных дрожжах, по-видимому, являлась эффективным катализатором.For functional analysis of the L4 coding region, the recombinant plasmid was transformed into S. cerevisiae DBY746 cells by lithium acetate treatment (Elble R. (1992) Bio Techniques 13 18-20). Cells were cultured overnight in a medium containing raffinose as a carbon source, enriched with the addition of either linoleic acid (18: 2Δ 9, 12 ) or dihomo-γ-linolenic acid (C20: 33Δ 8, 11, 14 ) in the presence of 1% tergitol (as described by Napier et al (1998) Biochem. J. 330 611-614). These fatty acids are absent in S.cerewsiae, but serve as specific substrates for either Δ 6 - or Δ 5 desaturase, respectively. The expression of the L4 coding region from the GAL1 promoter of the vector was induced by the addition of galactose to 1%. Cultivation continued for 16 hours until aliquots were taken for GC analysis of fatty acids. All fatty acids extracted from yeast cultures were analyzed by gas chromatography (GC) of methyl esters. Lipids were transmethylated with 1M HCl in methanol at 80 ° C for 1 hour, then fatty acid methyl esters (FAMEs) were extracted in hexane. GC analysis of FAME was performed using a Hewlett Packard 5880A gas chromatograph equipped with an attached 25 M × 0.32 mm RSL-500 BP capillary column and flame ionization detector. Fatty acids were identified by comparison with the retention time of FAME standards (Sigma). The relative percentage of fatty acids was calculated based on the areas under the peaks. Arachidonic acid was identified by GC-MS using a Krats MC80RFA operating at an ionization voltage of 70 eV with a scanning range of 500-40 daltons. Figure 4 shows the result of analysis by GC methyl esters of fatty acids of transformed yeast strains. An additional peak is detected on a scan obtained with pYES2 / L4 induced, grown in the presence of dihomo-γ-linolenic acid, compared with a control containing an empty vector. This peak was also absent in non-induced cultures grown on a medium with dihomo-γ-linolenic acid and, moreover, it is important to note that pYES2 / L4 grown in the presence of linoleic acid is not able to accumulate any new peaks, showing that this fatty acid is not a substrate for the enzyme encoded by C. elegans cDNA. The retention time of the additional peak is identical to the retention time of the authentic methyl arachidonic acid standard. The fatty acid obtained from dihomo-γ-linolenic acid was further characterized by GC-MS (gas chromatography-mass spectrometry) and identified as arachidonic acid. Therefore, the results show that the yeast cells transformed with plasmid pYES2 / L4 acquired functional Δ 5 desaturase activity and were capable of synthesizing arachidonic acid from dihomo-γ-linolenic acid acting as a substrate. Δ 5 -Desaturase in transformed yeast, apparently, was an effective catalyst.
Это демонстрирует, что последовательность ДНК из С.elegans кодирует функционально активный полипептид, вовлеченный в синтез арахидоновой кислоты в присутствии галактозы и дигомо-γ-линолената.This demonstrates that the DNA sequence from C. elegans encodes a functionally active polypeptide involved in the synthesis of arachidonic acid in the presence of galactose and dihomo-γ-linolenate.
Claims (15)
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9727256.1 | 1997-12-23 | ||
| GB9814034.6 | 1998-06-29 | ||
| GBGB9814034.6A GB9814034D0 (en) | 1998-06-29 | 1998-06-29 | Desaturase gene |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2000116010A RU2000116010A (en) | 2003-01-27 |
| RU2266330C2 true RU2266330C2 (en) | 2005-12-20 |
Family
ID=10834596
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2000116010/13A RU2266330C2 (en) | 1998-06-29 | 1998-12-23 | BIOLOGICALLY ACTIVE ANIMAL FATTY ACID Δ5-DESATURASE, DNA SEQUENCE ENCODING THE SAME, CLONING END EXPRESSING VECTORS CONTAINING SAID SEQUENCE, METHOD FOR PRODUCTION OF POLYUNSATURATED FATTY ACIDS, METHOD FOR CONVERTING OF DIHOMO-γ-LINOLENIC ACID TO ARACHIDONIC ACID, PROBE (VARIANTS), AND METHOD FOR DETECTION OF Δ5-DESATURASE USING THE SAME |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| GB (1) | GB9814034D0 (en) |
| RU (1) | RU2266330C2 (en) |
-
1998
- 1998-06-29 GB GBGB9814034.6A patent/GB9814034D0/en not_active Ceased
- 1998-12-23 RU RU2000116010/13A patent/RU2266330C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| DEBORAH L. et al. Biochemistry. 36, № 23, 6960-6967, 1997. * |
| R.WILSONRET A.L. Nature. 368, № 6466, 1994. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB9814034D0 (en) | 1998-08-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20200002712A1 (en) | Fad4, fad5, fad5-2, and fad6, novel fatty acid desaturase family members and uses thereof | |
| Michaelson et al. | Functional identification of a fatty acid Δ5 desaturase gene from Caenorhabditis elegans | |
| RU2152996C2 (en) | Dna fragment (variants), method of plant preparing, method of induction of gamma-linolenic acid producing (variants), method of induction of octadecatetraenoic acid and delta-6-desaturase producing in cyanobacterium | |
| RU2248397C2 (en) | Genes encoding desaturases and their applying | |
| AU1774899A (en) | Desaturase | |
| US20030152983A1 (en) | Desaturase | |
| EP1790720B1 (en) | Polypeptide having activity of unsaturating omega3-fatty acid, polynucleotide coding for the polypeptide and use thereof | |
| CA2132556A1 (en) | Recombinant ¨9 desaturase and a gene encoding the same | |
| US7135623B1 (en) | Nucleic acid which is obtained from Tetrahymena and which codes for a delta-6-desaturase, the production thereof and use | |
| KR102086235B1 (en) | Method for producing resolvin D2 analogues by combination reaction using recombinant lipoxigenases and resolvin D2 analogues therefrom | |
| RU2266330C2 (en) | BIOLOGICALLY ACTIVE ANIMAL FATTY ACID Δ5-DESATURASE, DNA SEQUENCE ENCODING THE SAME, CLONING END EXPRESSING VECTORS CONTAINING SAID SEQUENCE, METHOD FOR PRODUCTION OF POLYUNSATURATED FATTY ACIDS, METHOD FOR CONVERTING OF DIHOMO-γ-LINOLENIC ACID TO ARACHIDONIC ACID, PROBE (VARIANTS), AND METHOD FOR DETECTION OF Δ5-DESATURASE USING THE SAME | |
| CN100487121C (en) | Nucleotide sequence of Pichia pastoris omega3-fatty acid dehydrogenase and application thereof | |
| CN101724637B (en) | Nucleotide Sequence of Isochrysis globosa Δ9 Elongase and Its Application | |
| MXPA00006158A (en) | Desaturase | |
| CA2608848C (en) | Fad4, fad5, fad5-2, and fad6, novel fatty acid desaturase family members and uses thereof | |
| Napier et al. | Desaturase (Patent US 2003/0152983 A1) | |
| RU2000116010A (en) | DESATURASIS |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20051224 |