RU2210594C2

RU2210594C2 - Mutant luciferase (variants), dna encoding indicated luciferase and vector for expression of indicated protein

Info

Publication number: RU2210594C2
Application number: RU97113723A
Authority: RU
Inventors: Дэвид Джеймс СКУИРРЕЛЛ; Кристофер Робин ЛОУЭ; Питер Джон УАЙТ; Джеймс Огастус Генри МЮРРЕЙ
Original assignee: Дзе Секретэри Оф Стейт Фор Дефенс
Priority date: 1995-01-20
Filing date: 1996-01-19
Publication date: 2003-08-20
Also published as: GB9501172D0; ZA96453B

Abstract

FIELD: molecular biology, genetic engineering, biochemistry, enzymes. SUBSTANCE: invention relates to preparing novel proteins and can be used in any analysis based on determination of adenosine triphosphate (ATP). Invention proposes mutant forms of enzyme luciferase with enhanced affinity to ATP preparing by replacing amino acid glutamate relating to conservative region sequence of enzyme of wild type and corresponding to residue in position 270 of luciferase from Photinus pyralis for other amino acid residues, in part, lysine, arginine, glutamine or alanine and addition of amino acid residue provides reduction of K_M value. As result of addition of additional mutations involving the replace of glutamate residue at position corresponding to residue 354 in luciferase structure from Photinus pyralis for lysine residue and/or the replace of residue at position corresponding to residue 215 in structure of luciferase from Photinus pyralis for residue of hydrophobic amino acid the proposed mutant forms of enzyme confer the enhanced thermal stability additionally. Invention relates also to preparing DNA sequences encoding indicated mutant forms of luciferase and plasmid vector structures providing expression of corresponding recombinant proteins in transformed cells of E. coli. EFFECT: improved preparing method, valuable properties of luciferase and DNA. 14 cl, 6 dwg, 2 tbl, 2 ex

Description

Настоящее изобретение относится к новый белкам, обладающим люциферазной активностью, а также к ДНК и векторам, кодирующим их экспрессию. Главным образом настоящее изобретение предусматривает люциферазы с более низким значением К_М в отношении субстратного АТФ, чем существующие нативные и рекомбинантные люциферазы дикого и измененного дикого типов.The present invention relates to new proteins having luciferase activity, as well as to DNA and vectors encoding their expression. Mostly, the present invention provides luciferase with a lower K _M value in relation to substrate ATP than the existing native and recombinant wild-type and modified wild-type luciferase.

Люциферазы светляков катализируют окисление люциферина в присутствии АТР, Мg²⁺ и молекулярного кислорода, в результате чего возникает свечение. Такая реакция имеет квантовый выход около 0.88 (см. Deluca и McElroy (1978), а также Seliger и McElroy (1960), и такое светоиспускательное свойство обеспечивает их применение в люминометрических анализах, в которых измеряют уровни содержания АТФ.Firefly luciferase catalyzes the oxidation of luciferin in the presence of ATP, Mg ²⁺ and molecular oxygen, resulting in a glow. Such a reaction has a quantum yield of about 0.88 (see Deluca and McElroy (1978), as well as Seliger and McElroy (1960), and such a light-emitting property ensures their use in luminometric analyzes in which ATP levels are measured.

Люциферазу получают непосредственно из тела светляков или путем экспрессии из микроорганизмов, включающих конструкции рекомбинантной ДНК, кодирующие энзим. Важными разновидностями, из которых может быть получен энзим или кодирующая его ДНК, являются Японские GENJI и HEIKE светляки Luciola cruciata и Luciola lateralis, Восточно-Европейский светляк Luciola mingrelica, Северно-Американский светляк (Photinus pyralis), а также личинка светляка обыкновенного и личинка Европейского светляка Lampyris noctiluca. Luciferase is obtained directly from the body of fireflies or by expression from microorganisms, including recombinant DNA constructs encoding an enzyme. Important species from which the enzyme or its encoding DNA can be obtained are the Japanese GENJI and HEIKE fireflies Luciola cruciata and Luciola lateralis, the East European firefly Luciola mingrelica, the North American firefly Photinus pyralis, and the European firefly larva and European larva Firefly Lampyris noctiluca.

Термостойкость люцифераз дикого и рекомбинантного типов такова, что они теряют активность очень быстро при воздействии температур выше примерно 30^oС, особенно около 35^oС, и это приводит к дефициту энзима при использовании при высоких температурах окружающего воздуха. Известно, что люцифераза Японского светляка может быть термостабилизирована путем мутации в положении 217 для замены треонинового остатка на изолейциновый остаток (Kajiyama и Nakano (1993) Biochemistry 32, стр. 13795-13799); при этом также повышаются рН стабильность и удельная активность.The heat resistance of wild and recombinant types of luciferase is such that they lose activity very quickly when exposed to temperatures above about 30 ^o C, especially about 35 ^o C, and this leads to a deficiency of the enzyme when used at high ambient temperatures. It is known that Japanese firefly luciferase can be thermally stabilized by mutation at position 217 to replace the threonine residue with an isoleucine residue (Kajiyama and Nakano (1993) Biochemistry 32, pp. 13795-13799); this also increases the pH stability and specific activity.

В совместно поданной заявке на патент GB 9405750.2 описывается аминокислотная замена, способствующая повышению термостойкости, inter alia, Photinus pyralis, которая может использоваться для изменения в положении 217 с получением люциферазы, которая относительно термостабильна при 50^oС или выше.The co-filed patent application GB 9405750.2 describes an amino acid substitution contributing to an increase in heat resistance, inter alia, Photinus pyralis, which can be used to change at position 217 to produce luciferase, which is relatively thermostable at 50 ^{° C.} or higher.

Настоящее изобретение относится к дальнейшему улучшению свойств люциферазных энзимов, обеспечивающему их пригодность для использования в анализах, основанных на детекции аденозин трифосфата при относительно низких уровнях его содержания. Такое усиление свойств обеспечивается заменой аминокислоты в положении, соответствующем позиции 270 в аминокислотной последовательности люциферазы Photinus pyralis, в результате чего константа Микаэлиса-Ментена (Michaelis-Menten) (К_М) энзима понижается по сравнению с соответствующей люциферазой, имеющей последовательность дикого типа. Это соответствует аминокислоте 272 в Luciola mingrelica, Luciola cruciata и Luciola lateralis. Это также соответствует аминокислоте 270 в Lampris Noctiluca.The present invention relates to further improving the properties of luciferase enzymes, ensuring their suitability for use in assays based on the detection of adenosine triphosphate at relatively low levels. This enhancement of properties is achieved by replacing the amino acid at a position corresponding to position 270 in the amino acid sequence of Photinus pyralis luciferase, as a result of which the Michaelis-Menten constant (K _M ) of the enzyme decreases compared to the corresponding luciferase having a wild-type sequence. This corresponds to amino acid 272 in Luciola mingrelica, Luciola cruciata and Luciola lateralis. This also corresponds to amino acid 270 in Lampris Noctiluca.

Усиление согласно настоящему изобретению, кроме этого, обеспечивает люциферазы, характеризующиеся способностью окислять Д-люциферин с испусканием света с длинами волн, которые отличаются от длин волн для люциферазы дикого типа, что позволяет использовать их в качестве специфических меток в анализах связывания, в которых длина волны испускаемого света является характеристикой присутствия конкретного меченого материала, или позволяет использовать ДНК кодирующие люциферазы в качестве ДНК-репортера для клеток, полученных методами генной инженерии, или клеток, являющихся их производными. The amplification according to the present invention, in addition, provides luciferase characterized by the ability to oxidize D-luciferin with the emission of light with wavelengths that differ from wavelengths for wild-type luciferase, which allows them to be used as specific labels in binding assays in which the wavelength of the emitted light is a characteristic of the presence of a specific labeled material, or allows the use of DNA encoding luciferase as a DNA reporter for cells obtained by gene rd engineering, or cells, which are derived from them.

Таким образом, в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения обеспечивается белок, обладающий люциферазной активностью и примерно 60% гомологией аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata или Luciola lateralis, характеризующийся тем, что аминокислотный остаток, соответствующий остатку 270 в люциферазе Photinus pyralis и остатку 272 в люциферазах Luciola mingrelica, Luciola cruciata и Luciola lateralis, представляет собой аминокислоту, отличную от глютамата. Предпочтительно, такой белок характеризуется тем, что он содержит консервированную аминокислотную последовательность F (1) ХЕ (2) FL, в которой (1) представляет собой D или Е, (2) представляет собой Т или L, а Х представляет собой аминокислоту, отличную от глютамата, причем символы F, E, L, D и Т относятся к соответствующей аминокислоте согласно однобуквенному аминокислотному коду. Thus, in accordance with a first aspect of the present invention, there is provided a protein having luciferase activity and approximately 60% amino acid sequence homology with the amino acid sequence Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata or Luciola lateralis, characterized in that the amino acid residue corresponding to residue 270 in luciferase Photinus pyralis and residue 272 in the luciferase Luciola mingrelica, Luciola cruciata and Luciola lateralis, is an amino acid other than glutamate. Preferably, such a protein is characterized in that it contains a canned amino acid sequence F (1) XE (2) FL, in which (1) is D or E, (2) is T or L, and X is an amino acid that is excellent from glutamate, the symbols F, E, L, D and T refer to the corresponding amino acid according to a one-letter amino acid code.

Предпочтительной аминокислотой Х, как установлено к настоящему времени, является лизин или его аналог, либо модификации. Другие предпочтительные аминокислоты включают аргинин, глютамин и аланин. The preferred amino acid X, as established to date, is lysine or its analogue, or modifications. Other preferred amino acids include arginine, glutamine and alanine.

В соответствии с еще более предпочтительными формами настоящего изобретения белок изобретения также содержит аминокислоту в положении, соответствующем аминокислоте 217 люцифераз светляков Luciola или 215 разновидности Photinus pyralis, которая заменена на гидрофобную аминокислоту, предпочтительно, изолейцин, лейцин или валин или их аналоги, и/или содержит аминокислоту в положении, соответствующем аминокислоте 356 люциферазы светляка Luciola или 354 Photinus pyralis, которая заменена на аминокислоту, отличную от глютамата, особенно, на лизин, аргинин, лейцин, изолейцин или гистидин, или на их аналоги или модификации. In accordance with even more preferred forms of the present invention, the protein of the invention also contains an amino acid at a position corresponding to amino acid 217 of Luciola firefly luciferase or 215 of Photinus pyralis species, which is replaced by a hydrophobic amino acid, preferably isoleucine, leucine or valine or their analogs, and / or contains an amino acid at a position corresponding to amino acid 356 of firefly Luciola luciferase or 354 Photinus pyralis, which is replaced by an amino acid other than glutamate, especially lysine, arginine, leucine, isol eucin or histidine, or their analogues or modifications.

В соответствии со вторым аспектом изобретения обеспечивается ДНК, кодирующая белок изобретения, а в соответствии с третьим аспектом предусматривается вектор, особенно плазмида, содержащий luc ген (ген, кодирующий люциферазу) в такой форме, которая способна экспрессировать белок изобретения. Такие формы характеризуются наличием вектора, содержащего последовательности ДНК, способные контролировать экспрессию белка изобретения таким образом, что при введении в клетку-хозяина микроорганизма белок способен легко экспрессироваться требуемым образом, если это необходимо, путем присоединения подходящих индукторов. In accordance with a second aspect of the invention, DNA encoding a protein of the invention is provided, and in accordance with a third aspect, a vector is provided, especially a plasmid containing the luc gene (luciferase encoding gene) in a form that is capable of expressing the protein of the invention. Such forms are characterized by the presence of a vector containing DNA sequences capable of controlling the expression of the protein of the invention in such a way that when introduced into the host cell of the microorganism, the protein can easily be expressed in the desired manner, if necessary, by attaching suitable inducers.

Все luc гены для Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata и Luciola lateralis известны и могут быть выделены стандартными методами молекулярной биологии. То же относится к Lampris noctiluca. luc ген Photinus pyralis коммерчески доступен от Promega в виде плазмиды pGEM-luc. Таким образом, удобные методы и источники получения исходного материала для продуцирования ДНК изобретения представляют собой (1) использование геномной ДНК встречающегося в природе светляка и амплификацию ее luc гена с использованием, например, РСК, (II) pGEM и (III) pGLf 37 плазмиды Kajiyama и Nakano. Другие гены, кодирующие белки, обладающие люциферазной активностью, т.е. активностью в окислении люциферина с испусканием света, также являются подходящими источниками исходного материала для получения ДНК и, в конечном счете, через экспрессию гена, белка изобретения. All luc genes for Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata and Luciola lateralis are known and can be isolated using standard molecular biology methods. The same applies to Lampris noctiluca. luc Photinus pyralis gene is commercially available from Promega as the plasmid pGEM-luc. Thus, convenient methods and sources of obtaining the starting material for DNA production of the invention are (1) the use of genomic DNA of a naturally occurring firefly and the amplification of its luc gene using, for example, CSCs, (II) pGEM and (III) pGLf 37 plasmids Kajiyama and Nakano. Other genes encoding proteins having luciferase activity, i.e. activity in the oxidation of luciferin with the emission of light, are also suitable sources of starting material for obtaining DNA and, ultimately, through the expression of a gene, a protein of the invention.

Подходящие векторы для использования в манипуляциях с ДНК гена дикого типа или другого luc гена, направленных на получение ДНК изобретения, представляют собой любой вектор, в котором может содержаться такая ДНК при осуществлении замены глютамата природного происхождения на другую аминокислоту. В случае химически индуцированного мутагенеза, например, с использованием такого агента, как гидроксиламин, указанная операция не имеет решающего значения и существует большое число подходящих векторов, известных специалисту в данной области, обеспечивающих легкую манипуляцию с геном до и после процесса мутагенеза. Может оказаться предпочтительным специально мутировать luc ген по глютаматной позиции и в таком случае требуется проведение операции сайтнаправленного мутагенеза. Такие операции легче всего осуществлять в векторах, и они хорошо известны специалистам в данной области. Suitable vectors for use in manipulating the DNA of a wild-type gene or other luc gene aimed at obtaining the DNA of the invention are any vector that may contain such DNA when replacing naturally occurring glutamate with another amino acid. In the case of chemically induced mutagenesis, for example, using an agent such as hydroxylamine, this operation is not critical and there are a large number of suitable vectors known to the person skilled in the art, providing easy manipulation of the gene before and after the mutagenesis process. It may be preferable to specifically mutate the luc gene at the glutamate position, and in this case, site-directed mutagenesis surgery is required. Such operations are easiest to carry out in vectors, and they are well known to specialists in this field.

Подходящие векторы для экспрессии luc генов дикого и известного типа и генов настоящего изобретения включают рКК223-3, pDR 540, имеющийся в распоряжении Boehringer Mannheim и рТ7-7, причем два первых вектора содержат tac промотор, находящийся под контролем лактозного репрессора, что позволяет индуцировать экспрессию в присутствии изопропил-тиогалактозида (IPTG). рТ7-7 может контролироваться Т7-РНК полимеразным промотором и таким образом обеспечивает основу для очень высокого уровня генной экспрессии в E.coli клетках, содержащих Т7 РНК полимеразу. Было установлено, что наивысшая экспрессия в присутствии таких векторов имеет место тогда, когда luc гены вводятся в рТ7-7 вектор. Suitable vectors for the expression of wild and known type luc genes and the genes of the present invention include pKK223-3, pDR 540 available to Boehringer Mannheim and pT7-7, the first two vectors containing a tac promoter controlled by a lactose repressor, which allows expression to be induced in the presence of isopropyl-thiogalactoside (IPTG). pT7-7 can be controlled by the T7 RNA polymerase promoter and thus provides the basis for a very high level of gene expression in E. coli cells containing T7 RNA polymerase. It was found that the highest expression in the presence of such vectors occurs when luc genes are introduced into the pT7-7 vector.

Экспрессия люциферазы из luc гена, вставленного в рКК223-3 и рDR 540, приводит в результате к экспрессии люциферазы с N-терминальной последовательностью дикого типа, тогда как экспрессия из luc гена, вставленного в рТ7-7, приводит в результате к синтезу слитого белка с экстра N-терминальными аминокислотами A-R-I-Q. Сайт связывания рибосомы и старт-кодон luc гена каждого из соответствующих векторов с присутствующим в них luc геном (названных конструкциями pPW 204, pPW 116 и pPW 304) показаны в табл. 1, приведенной в Примерах. pPW 601, на которую ссылаются ниже, получают удалением уникального Xh о I сайта pPW 116. Expression of luciferase from the luc gene inserted in pKK223-3 and pDR 540 results in the expression of luciferase with the wild-type N-terminal sequence, while expression from the luc gene inserted in pT7-7 results in the synthesis of a fusion protein c extra N-terminal amino acids ARIQ. The binding site of the ribosome and the start codon of the luc gene of each of the corresponding vectors with the luc gene present in them (called the constructs pPW 204, pPW 116 and pPW 304) are shown in Table. 1 given in the Examples. pPW 601, which is referred to below, is obtained by deleting the unique Xh about I site pPW 116.

Третий аспект настоящего изобретения предусматривает клетки, способные экспрессировать белки изобретения; способы получения таких белков с использованием таких клеток и диагностические наборы и реагенты, содержащие белки изобретения. Также предусматриваются способы анализа, в которых содержание АТР измеряют с использованием реагентов люциферин/люцифераза, как хорошо известно в данной области, причем такие методы характеризуются тем, что люцифераза представляет собой белок изобретения. Люциферазные препараты изобретения характеризуются относительно низким значением К_М в сравнении с соответствующими люциферазами дикого типа и рекомбинантными люциферазами и предпочтительные люциферазы с двойной и тройной заменами (т.е. 215, 270, 354 замененная Photinus или 217, 272, 356 замененная Luciola или 215, 270, 354 замененная L. noctiluca) также характеризуются относительной термостабильностью при 30-70^oС, особенно при 37-60^oС и особенно при 40-50^oС. Таким образом, настоящее изобретение не должно рассматриваться как препятствие к использованию авторами изобретения и другими исследователями результатов по улучшению термостабильности, полученных в других современных и предыдущих работах.A third aspect of the present invention provides cells capable of expressing the proteins of the invention; methods for producing such proteins using such cells; and diagnostic kits and reagents containing the proteins of the invention. Analysis methods are also provided in which the ATP content is measured using luciferin / luciferase reagents, as is well known in the art, and such methods are characterized in that luciferase is a protein of the invention. The luciferase preparations of the invention are characterized by a relatively low K _M value compared to the corresponding wild-type luciferase and recombinant luciferase and preferred double and triple luciferase (i.e., 215, 270, 354 replaced by Photinus or 217, 272, 356 replaced by Luciola or 215, 270, 354 replaced L. noctiluca) are also characterized by thermostability relative at 30-70 ^o C, particularly at 37-60 ^o C and especially at 40-50 ^o C. Thus, the present invention should not be considered as an obstacle to the use of IMAGE authors eniya and other researchers of the results to improve thermal stability, obtained in other current and previous work.

Любая клетка, способная к экспрессии гетерологического белка с использованием ДНК последовательностей в его ДНК или в таких векторах, как плазмиды, содержащиеся в клетке, могут использоваться для экспрессии белков изобретения. Типичными представителями таких клеток являются такие дрожжевые и бактериальные клетки, как Saccharomyces cerevisiae и Escherichia coli, однако специалисты в данной области должны иметь в виду, что большое число организмов-хозяев может оказаться пригодным для целей, касающихся экспрессии белка. Any cell capable of expressing a heterologous protein using DNA sequences in its DNA or in vectors such as plasmids contained in a cell can be used to express the proteins of the invention. Typical representatives of such cells are yeast and bacterial cells such as Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli, however, those skilled in the art should bear in mind that a large number of host organisms may be suitable for purposes related to protein expression.

Белок может экспрессироваться, как белок со структурой, аналогичной нативной и известной рекомбинантной люциферазам, или может экспрессироваться в виде слияния или конъюгата таких белков с другими аминокислотами, пептидами, белками или другими химическими субстанциями, например, с указанной выше последовательностью A-R-I-Q. A protein can be expressed as a protein with a structure similar to native and known recombinant luciferase, or can be expressed as a fusion or conjugate of such proteins with other amino acids, peptides, proteins or other chemical substances, for example, with the above sequence A-R-I-Q.

Специалист в данной области должен иметь в виду, что некоторые хозяева могут отдавать предпочтение конкретному кодону, например, бактерии в некоторых случаях используют другие кодоны, чем дрожжи, и таким образом, ДНК, введенная в организм такого хозяина, может с успехом подвергаться изменению с получением перерожденного кодона для данной аминокислоты, что обеспечивает более благоприятную экспрессию в таком хозяине. Разумеется, что такие перерожденные ДНК охватываются сферой ДНК изобретения. The person skilled in the art should bear in mind that some hosts may prefer a particular codon, for example, bacteria in some cases use codons other than yeast, and thus, DNA introduced into the body of such a host can be successfully modified to obtain a degenerate codon for a given amino acid, which provides more favorable expression in such a host. Of course, such degenerated DNA is encompassed by the DNA domain of the invention.

Е. coli BL 21 (ДЕЗ) представляет собой один из примеров подходящего хозяина и содержит Т7 РНК полимеразу, устойчиво интегрированную в ее хромосому под контролем индуцируемого lac UV5 промотора, и, таким образом, является совместимой с рТ7-7 производными конструкциями. В-штаммы Е. coli, подобные BL 21, характеризуются отсутствием Ion протеазы и ompT внешне-мембранной протеазы. Такие дефекты способствуют стабилизации экспрессии и аккумуляции посторонних белков в E.coli. Анализы сырых экстрактов E.coli BL 21 (ДЕЗ), содержащих каждую из описанных выше трех экспрессионных конструкций, показали, что наивысшие уровни экспрессии люциферазы достигаются из клеток, содержащих конструкцию рР W304 (см. табл. 2). Специалист в данной области может обнаружить и другие подходящие линии клеток, например, клетки E.coli JM109, используемые в приведенных ниже примерах. E. coli BL 21 (DEZ) is one example of a suitable host and contains T7 RNA polymerase stably integrated into its chromosome under the control of the lac-induced UV5 promoter, and is thus compatible with pT7-7 derivative constructs. E. coli B strains like BL 21 are characterized by the absence of an Ion protease and ompT external membrane protease. Such defects contribute to the stabilization of the expression and accumulation of foreign proteins in E. coli. Assays of crude extracts of E. coli BL 21 (DEZ) containing each of the three expression constructs described above showed that the highest levels of luciferase expression are achieved from cells containing the pP W304 construct (see Table 2). One of skill in the art can detect other suitable cell lines, for example, E. coli JM109 cells used in the examples below.

Далее, исключительно в целях иллюстрации, будут описаны белки, ДНК, векторы и клетки изобретения со ссылкой на следующие, не ограничивающие сферу изобретения. Примеры, чертежи, таблицы и перечень последовательностей. Специалисту в данной области должно быть ясно, что могут использоваться и другие белки, конъюгаты белков, ДНК, векторы и клетки, а также методы анализа и диагностические наборы, включающие любые из упомянутых выше. Further, solely for purposes of illustration, the proteins, DNA, vectors and cells of the invention will be described with reference to the following, not limiting the scope of the invention. Examples, drawings, tables and sequence listing. One skilled in the art will appreciate that other proteins, protein conjugates, DNA, vectors and cells, as well as assay methods and diagnostic kits, including any of the above, can be used.

Фиг. 1 изображает рестрикционную карту плазмиды pPW 204, полученной из рКК223-3 путем инсерции luc гена, как описано в приведенных ниже Примерах. FIG. 1 depicts a restriction map of the plasmid pPW 204 obtained from pKK223-3 by insertion of the luc gene, as described in the Examples below.

Фиг. 2 изображает рестрикционную карту плазмиды pPW 116, полученной из рDR 540 путем инсерции luc гена, как описано в следующих ниже Примерах. FIG. 2 depicts a restriction map of the plasmid pPW 116 obtained from pDR 540 by insertion of the luc gene, as described in the following Examples.

Фиг. 3 изображает рестрикционную карту плазмиды pPW 304, полученной из рТ7-7 путем инсерции luc гена, как описано в приведенных ниже Примерах. FIG. 3 depicts a restriction map of the plasmid pPW 304 obtained from pT7-7 by insertion of the luc gene, as described in the Examples below.

Фиг. 4 изображает рестрикционную карту плазмиды pPW 601a, полученную из рDR 540, и фрагмент Bam H1/Sst 1 из pGEM-luc с удаленным сайтом Xho. FIG. 4 depicts a restriction map of plasmid pPW 601a derived from pDR 540 and a Bam H1 / Sst 1 fragment from pGEM-luc with the Xho site deleted.

Фиг.5 изображает график термической инактивации рекомбинантных люцифераз дикого типа Photinus /Sigma/, люциферазы изобретения с измененным значением К_М, термостабильного 354 лизинового мутанта, описанного в совместно поданной GB 9405750.2 и К_М/354 лизинового двойного мутанта настоящего изобретения, подвергнутого инкубации при заданной температуре в течение 16 минут в соответствии с описанным в приведенных ниже Примерах.5 shows a graph of heat inactivation of recombinant wild-type luciferases Photinus / Sigma /, luciferase invention with a modified value of K _M, 354 lysine mutant thermostable as described in copending GB 9405750.2 and K _M / 354 lysine double mutant of the present invention, subjected to incubation for a given temperature for 16 minutes as described in the Examples below.

Фиг.6 изображает рестрикционную карту рТ7-7 после Tabor. 6 depicts a restriction map of pT7-7 after Tabor.

Перечень последовательностей
Перечень последовательностей, приведенный в конце описания, содержит следующие ДНК и аминокислотные последовательности:
SEQ 1Д 1: изображает последовательность ДНК для ДНК, кодирующей люциферазу изобретения, в которой Photinus pyralis кодон дикого типа мутирован в положениях 811-813, в случае лизина только основание в позиции 811 мутировано на А. Изображена также позиция введения термостабильности в положениях 1063-65.Sequence listing
The sequence listing at the end of the description contains the following DNA and amino acid sequences:
SEQ 1D 1: depicts the DNA sequence for DNA encoding the luciferase of the invention in which the Photinus pyralis wild-type codon is mutated at positions 811-813, in the case of lysine, only the base at position 811 is mutated at A. The position of introducing thermal stability at positions 1063-65 is also shown .

SEQ 1Д 2: изображает аминокислотную последовательность белка изобретения, в которой аминокислотный 270 глютамат дикого типа Photinus pyralis заменен на остаток Хаа, отличный от глютамата. SEQ 1D 2: depicts the amino acid sequence of a protein of the invention in which the amino acid 270 glutamate of wild-type Photinus pyralis is replaced with a Xaa residue other than glutamate.

SEQ 1Д 3: изображает последовательность олигонуклеотида, используемого для SDM мутации pPW 601a с заменой глютамата в положении 270 на лизин. SEQ 1D 3: depicts the sequence of the oligonucleotide used for SDM mutation pPW 601a with the replacement of glutamate at position 270 with lysine.

SEQ 1Д 4: изображает аминокислотную последовательность белка изобретения, в которой глютамат 270 аминокислоты дикого типа Photinus pyralis заменен на лизин и аминокислота в положении 354 заменена на лизин. SEQ 1D 4: depicts the amino acid sequence of a protein of the invention in which the glutamate 270 of the wild-type amino acid Photinus pyralis is replaced by lysine and the amino acid at position 354 is replaced by lysine.

SEQ 1Д 5: изображает последовательность олигонуклеотида, используемого для SDM мутации pPW 601a с заменой глютамата в положении 354 на лизин. SEQ 1D 5: depicts the sequence of the oligonucleotide used for SDM mutation pPW 601a with the replacement of glutamate at position 354 with lysine.

ПРИМЕРЫ
Пример 1: Получение плазмид, содержащих ДНК изобретения
Плазмиды рКК223-3 и рDR 540 получали от Боэрингер Маннхейм, pDR 540 также выпускается фирмой Фармациа Биотех Ст. Албанс, Великобритания. Фагмидную pBluescript IISK/+/ получали от Стратаген Ла Йолла, США. E.coli штамм BL 21 /ДЕЗ/ использовали для экспрессии люциферазы из рТ7-7 производных плазмид, а E.coli штамм JM109/4/ использовали в экспериментах по клонированию и для экспрессии люциферазы из pDR 540 производных плазмид.EXAMPLES
Example 1: Obtaining plasmids containing the DNA of the invention
Plasmids pKK223-3 and pDR 540 were obtained from Boehringer Mannheim, pDR 540 is also produced by Pharmacia Biotech St. Albans, UK. The phagemid pBluescript IISK / + / was obtained from Stratagen La Yolla, USA. E. coli strain BL 21 (DEZ) was used to express luciferase from pT7-7 derived plasmids, and E. coli strain JM109 / 4 / was used in cloning experiments and to express luciferase from pDR 540 derived plasmids.

Плазмиду рТ7-7 (см. Текущие протоколы в сборнике "Молекулярная биология", т. 11, раздел 16.2.1) получали от Стан Табор, Отделение биологической химии. Гарвардская медицинская школа, Бостон, Масс. 02115, и (как показано на фиг.6) она содержит Т7 РНК полимеразный промотор ⌀ 10 и сайт начала трансляции для 10 белка Т7 гена (Т7 bp 22857-22972), вставленный между Pyull и ClaI сайтами рТ7-5. Уникальные рестрикционные сайты для создания слитых белков (после заполнения на 5' окончаниях) представляли собой Рамку 0: EcoR1, Рамку 1: NdcI, SmaI, ClaI, Рамку 2: Bam HI, Sa1I, Hind 111. SacI сайт исходного полилинкера удаляли делецией и дополнительный Xbal сайт создавали в обратном направлении от инициирующего кодона. Plasmid pT7-7 (see Current Protocols in the Molecular Biology collection, Vol. 11, Section 16.2.1) was obtained from Stan Tabor, Department of Biological Chemistry. Harvard Medical School, Boston, Mass. 02115, and (as shown in FIG. 6) it contains the T7 RNA polymerase promoter ⌀ 10 and the translation start site for 10 T7 gene proteins (T7 bp 22857-22972) inserted between the Pyull and ClaI sites of pT7-5. The unique restriction sites for creating fusion proteins (after filling at 5 'ends) were Box 0: EcoR1, Box 1: NdcI, SmaI, ClaI, Box 2: Bam HI, Sa1I, Hind 111. The SacI site of the original polylinker was deleted by deletion and Xbal site created in the opposite direction from the initiating codon.

Как отмечалось в преамбуле к чертежам, рР W204 получали из рКК223-3, pPW 116 получали из pDR 540, pPW 304 - из рТ7-7; причем каждую из них получали инсерцией luc гена производного из Промега pGEM-luc с использованием стандартных рестрикционно-эндонуклеазных методов и методов лигирования, тогда как pPW 601 создавали клонированием luc гена и Bam HI/Sst 1 фрагмента из рGЕМ-luc в рDR 540 и pPW 601а при удалении уникального XhoI сайта в полилинкере плазмиды. pPW 601а содержит уникальный сайт распознования для Аyа 1, который упрощает SДM методику для замен люциферазной аминокислоты 354. As noted in the preamble to the drawings, pP W204 was obtained from pKK223-3, pPW 116 was obtained from pDR 540, pPW 304 from pT7-7; moreover, each of them was obtained by insertion of the luc gene of the Promeg derivative pGEM-luc using standard restriction endonuclease and ligation methods, while pPW 601 was created by cloning the luc gene and the Bam HI / Sst 1 fragment from pGEM-luc into pDR 540 and pPW 601a when removing a unique XhoI site in the polylinker of the plasmid. pPW 601a contains a unique recognition site for Aya 1, which simplifies the SDM technique for replacing the luciferase amino acid 354.

Для получения pPW 304, рТ7-7 переваривали с EcoR1, концы заполняли с использованием фрагмента Кленова, продукт переваривали с Sa1I и ДНК очищали на геле; pGEM-luc переваривали с Bam H1, образовавшиеся выступы переваривали с МВ11, продукт переваривали с Sa1I и полученный 1.Kb фрагмент очищали и лигировали в очищенную рТ7-7 ДНК. To obtain pPW 304, pT7-7 was digested with EcoR1, the ends were filled using a Klenov fragment, the product was digested with Sa1I, and the DNA was gel purified; pGEM-luc was digested with Bam H1, the resulting protrusions were digested with MB11, the product was digested with Sa1I and the obtained 1.Kb fragment was purified and ligated into purified pT7-7 DNA.

Трансформацию плазмид в ВМН 71-18 mut S клетки осуществляли с использованием Bio-Rad Gene Pulser версии 2-89. Для получения pPW 601 клонов производили сбор клеток и создавали очищенный смешанный плазмидный пул, содержащий мутированные и родительские плазмиды, и вторичный рестрикционный перевар с Av аl осуществляли до трансформации в E.coli JM109 клетки. Такие клетки высеевали на селективную среду (L В агар + 50 мкг/мл ампициллина), и клоны подвергали скринингу путем очистки их плазмидной ДНК и анализа на желаемое изменение. Плазмидную ДНК очищали с использованием щелочного лизиса (Birnboim и До1у /1979/ Nucleic Acids Res. 7, стр. 1513). The transformation of plasmids in BMN 71-18 mut S cells was carried out using Bio-Rad Gene Pulser version 2-89. To obtain pPW 601 clones, cells were harvested and a purified mixed plasmid pool containing mutated and parental plasmids was created, and a secondary restriction digest with Av Al was performed before transformation into E. coli JM109 cells. Such cells were plated on selective medium (L B agar + 50 μg / ml ampicillin), and the clones were screened by purification of their plasmid DNA and analysis for the desired change. Plasmid DNA was purified using alkaline lysis (Birnboim and Do1u / 1979 / Nucleic Acids Res. 7, p. 1513).

Относительные уровни экспрессии люциферазы из каждой из конструкций pPW 204, pPW 116 и pPW 304 составляли 0.1:0.5:1.0 из E.coli BL 21 /ДЕЗ/. Клетки выращивали в L В при 37^oС до значения ОД 600 порядка 0.3, затем индуцировали с помощью IРТG и выращивание продолжали в течение 4 часов, после чего получали сырой экстракт и измеряли люциферазную активность.The relative levels of luciferase expression from each of the constructs pPW 204, pPW 116, and pPW 304 were 0.1: 0.5: 1.0 from E. coli BL 21 / DEZ /. Cells were grown in L B at 37 ^° C to an OD 600 of the order of 0.3, then induced with IPTG and cultivation was continued for 4 hours, after which a crude extract was obtained and luciferase activity was measured.

Таблица 1: Сайты связывания рибосомы (подчеркнуты) и инициирующие кодоны в экспрессионных конструкциях, используемых в Примере 1. Table 1: Ribosome binding sites (underlined) and initiation codons in the expression constructs used in Example 1.

Неполную очистку люцифераз осуществляли на E.coli JM 109 клетках, собранных в ранней стационарной фазе и затем ресуспендированных в 50 мМ Трис НС1 рН 8.0, содержащей 50 мМ КСl, 0.5 мМ дитиотреитола и 1 мМ ЕДТА (Буффер А). Клетки разрушали дезинтеграцией на ультразвуковом дезинтеграторе М SE Soniprep (амплитуда 14 мкм) и лизат центрифугировали с 30000 х г в течение 1 часа. Затем супернатант сырого экстракта подвергали фракционированию в присутствии сульфата аммония и фракции, осажденные в области насыщения 35-55%, содержали люциферазную активность и их растворяли в Буффере А и подвергали диализу в течение ночи противотоком к 500 мл 50 мМ Трис-НСl буффера рН 8.0, содержащего 0.4 мМ ДТТ (Буффер В).

Incomplete purification of luciferases was carried out on E. coli JM 109 cells collected in the early stationary phase and then resuspended in 50 mM Tris HCl pH 8.0 containing 50 mM KCl, 0.5 mM dithiothreitol and 1 mM EDTA (Buffer A). Cells were disrupted by disintegration on an M SE Soniprep ultrasonic disintegrator (amplitude 14 μm) and the lysate was centrifuged from 30,000 xg for 1 hour. Then, the supernatant of the crude extract was fractionated in the presence of ammonium sulfate and the fractions precipitated in the saturation region of 35-55% contained luciferase activity and were dissolved in Buffer A and dialyzed overnight against 500 ml of 50 mM Tris-Hcl buffer pH 8.0, containing 0.4 mm DTT (Buffer B).

Полную очистку люцифераз проводили путем загрузки осажденного и диализированного энзима в Моно Q (HR 10/10) анионообменную колонку, проводя элюирование линейным градиентом 0-200 мМ NaC1 в Буффере В (объемная скорость 4 мл/мин; фракции объемом 2 мл). Целевые фракции, содержащие люциферазную активность, дополняли 50% глицерина (об./об.) и хранили при -20^oС.The luciferase was completely purified by loading the precipitated and dialyzed enzyme into a Mono Q (HR 10/10) anion exchange column, eluting with a linear gradient of 0-200 mM NaC1 in Buffer B (bulk velocity 4 ml / min; fractions with a volume of 2 ml). Target fractions containing luciferase activity were supplemented with 50% glycerol (v / v) and stored at -20 ^o C.

Люциферазу светляков (полученную из кристаллической суспензии, каталожный L 9009), а также соэнзим А и АТР получали от Сигма Кэмикал Ко. Калиевую соль люциферина жуков получали от Промега Корпорэйшн, Мэдисон Висконсин, США. Клеточные экстракты готовили в соответствии с описанием в техническом бюллетене Промега 101. Аликвоты E.coli культур подвергали лизису в реагенте для лизиса клеточных культур (25 мМ Трис-фосфат, рН 7.8, 2 мМ ДТТ, 2 мМ ЕДТА, 10% глицерина, 1% Тритона Х-100, 2.5 мг/мл BSA, 1.25 мг/мл лизозима) в течение 10 минут при комнатной температуре, центрифугировали при силе в 16000 г в течение 2 минут и затем хранили до проведения анализа на льду. Firefly luciferase (obtained from a crystalline suspension, catalog L 9009), as well as coenzyme A and ATP, were obtained from Sigma Chemical Co. Beetle luciferin potassium salt was obtained from Promega Corporation, Madison Wisconsin, USA. Cell extracts were prepared as described in the Promega 101 technical bulletin. Aliquots of E. coli cultures were lysed in a cell culture lysis reagent (25 mM Tris-phosphate, pH 7.8, 2 mM DTT, 2 mM EDTA, 10% glycerol, 1% Triton X-100, 2.5 mg / ml BSA, 1.25 mg / ml lysozyme) for 10 minutes at room temperature, centrifuged at 16,000 g for 2 minutes and then stored until analysis on ice.

Люциферазную активность клеточных линий оценивали мониторингом биолюминесценции, испускаемой колониями, путем их переноса на найлоновые фильтры (Хибонд N, Амершам) и последующего смачивания фильтров 0.5 мМ люциферина в 100 мМ натрий цитратного буффера рН 5.0 (Wood и De Luca, /1987/ Anal Biochem 161, стр. 501-507) при комнатной температуре. Анализы люциферазы in vitro проводили при 21^oС с использованием 100 мкл аналитического буффера (20 мМ Трицина рН 7.8, содержащего 1 мМ MgSO₄, 0.1 мМ ЕДТА, 33.3 мМ ДТТ, 0.27 мМ соэнзима А, 0.47 мМ Д-люциферина, 0.53 мМ АТР и 1-5 мкл образца). Конечное значение рН аналитической смеси составляло 7.8 и световые измерения проводили на люминометре БиоОрбит 1250 или в титрационных микропланшетах с использованием лабораторной системы Люминоскан RS планшетный люминометр.The luciferase activity of cell lines was assessed by monitoring the bioluminescence emitted by the colonies by transferring them to nylon filters (Khibond N, Amersham) and then wetting the filters with 0.5 mM luciferin in 100 mM sodium citrate buffer pH 5.0 (Wood and De Luca, / 1987 / Anal Biochem 161 , p. 501-507) at room temperature. In vitro luciferase assays were performed at 21 ^{° C.} using 100 μl assay buffer (20 mM Tricin pH 7.8 containing 1 mM MgSO ₄ , 0.1 mM EDTA, 33.3 mM DTT, 0.27 mM coenzyme A, 0.47 mM D-luciferin, 0.53 mM ATP and 1-5 μl of sample). The final pH of the analytical mixture was 7.8 and light measurements were carried out on a BioOrbit 1250 luminometer or in microtiter plates using the Luminoscan laboratory laboratory system RS flat luminometer.

Белок определяли по методу Bradford (1976) Anal.Biochem, 72, стр. 248-254, используя в качестве стандарта BSA. Для осуществления не-специфических химических мутаций ДНК, плазмиды, содержащие luc гены, обрабатывали в соответствии с методом Kironde с сотр. (1989) Biochem. J. 259, стр. 421-426 с использованием 0.8 М гидроксиламина, 1 мМ ЕДТА в 0.1 мМ фосфата натрия, рН 6.0, в течение 2 часов при 65^oС.Protein was determined according to the method of Bradford (1976) Anal. Biochem, 72, pp. 248-254, using BSA as the standard. To perform non-specific chemical DNA mutations, plasmids containing luc genes were processed according to the Kironde method with al. (1989) Biochem. J. 259, p. 421-426 using 0.8 M hydroxylamine, 1 mM EDTA in 0.1 mM sodium phosphate, pH 6.0, for 2 hours at 65 ^° C.

К_М мутант вначале создавали путем гидроксиламин-индуцированного мутагенеза luc гена в pPW 304 с получением плазмиды 304 G1, несущей единственную замену основания в последовательности ДНК в положении 811 SEQ IД 1, в результате чего происходила замена аминокислотного глютамата на лизин в положении 270. Фрагмент ДНК размером 1.1 кь (BstE II/Stu I) клонировали из pPW 304 и использовали для замены соответствующего фрагмента в рР601а с образованием pPW 601G1, обеспечивая таким образом luc ген, кодирующий люциферазу, без четырех дополнительных аминокислот, кодируемых pPW 304 (без включения М из M-A-R-1-Q).The K _M mutant was first created by hydroxylamine-induced mutagenesis of the luc gene in pPW 304 to obtain plasmid 304 G1 carrying the only base substitution in the DNA sequence at position 811 of SEQ ID 1, resulting in the replacement of amino acid glutamate with lysine at position 270. DNA fragment 1.1 kb (BstE II / Stu I) was cloned from pPW 304 and used to replace the corresponding fragment in pP601a to form pPW 601G1, thus providing the luc gene encoding luciferase without four additional amino acids encoded by pPW 304 (b inclusion of MAR-M of 1-Q).

Мутагенезированную плазмиду обессоливали в колонке Nick сорта G60 ДНК (Фармация) с последующим трансформированием в E.coli BL 21 (ДЕЗ). Люцифераза, экспрессированная из такой системы, демонстрировала фенотип с низким значением К_М, идентичный фенотипу исходного мутанта.The mutagenized plasmid was desalted in a Nick column of the G60 DNA grade (Pharmacy), followed by transformation into E. coli BL 21 (DEZ). Luciferase expressed from such a system showed a phenotype with a low K _M value identical to the phenotype of the original mutant.

Секвенирование двунитевой ДНК осуществляли путем дидеоксицепной терминации по методу Sanger с сотр. (1977) Prac. Nat. Acad. Sci (США) 74, 5463-5467 с использованием (альфа^-32 Р) dATP и электрофорезом в полиакриламидных гелях в присутствии 8М мочевины (6% вес./об.). Применяли также автоматическое секвенирование с использованием автоматического секвенсора ДНК модели 373 А (Эпплайд Биосистемс).Double-stranded DNA sequencing was carried out by dideoxy chain termination according to the method of Sanger et al. (1977) Prac. Nat. Acad Sci (USA) 74, 5463-5467 using (alpha ^-32 P) dATP and polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of 8M urea (6% w / v). Also used automatic sequencing using an automatic DNA sequencer model 373 A (Apple Biosystems).

Анализ на определение значения К_М такой люциферазы по отношению к АТР осуществляли при 21^oС с использованием 100 мкл аналитического буффера (20 мМ трицина рН 7.8, содержащего 1.0 мМ MgSO₄, 0.1 мМ ЕДТА, 33 мМ дитиотриэтола, 270 мкМ соэнзима А, 470 мкМ Д-люциферина и 6.25-400 мкМ АТР), применяя люминометр для измерения срm.Analysis to determine the K _M value of such luciferase with respect to ATP was carried out at 21 ^° C using 100 μl of analytical buffer (20 mM tricin pH 7.8, containing 1.0 mM MgSO ₄ , 0.1 mM EDTA, 33 mM dithiotriethol, 270 μM coenzyme A, 470 μM D-luciferin and 6.25-400 μM ATP), using a luminometer to measure cpm.

Установленное значение К_М для 601а-рекомбинантного дикого типа составило 66,1 мкМ (s.e.4.1); для 601 аК (термостабильный мутант с лизином в положении 354) - 61.3 (s.e. 4.7) и для 601aG1 (изменение К_М, вызванное 270 лизином) - 28.7 (s. e. 0.9), что иллюстрирует тот факт, что замена в положении 270 изменяет концентрацию АТР, более чем на половину делая ее оптимальной для энзима.The determined K _M value for the 601a-recombinant wild type was 66.1 μM (se4.1); for 601 aK (thermostable mutant with lysine at position 354) - 61.3 (se 4.7) and for 601aG1 (change in K _M caused by 270 lysine) - 28.7 (se 0.9), which illustrates the fact that the substitution at position 270 changes the concentration of ATP , more than half making it optimal for the enzyme.

Эффект 270 замены на термостабильность люциферазы является отрицательным, причем, при 37^oС t_1/2, активность достигается только через 2 минуты по сравнению с значением активности дикого типа на 7 минуте, однако при 30^oС удельная активность 270 выше, чем у дикого типа.The effect of 270 substitutions on the thermal stability of luciferase is negative, moreover, at 37 ^° C t _1/2 , activity is achieved only after 2 minutes compared to the value of wild-type activity at 7 minutes, however, at 30 ^° C the specific activity of 270 is higher than that of wild type.

Пример 2: Получение "двух-мутантной" 270К:354К Photinus pyralis люциферазы
С целью компенсации пониженной термостабильности люциферазы с заменой в положении 270, получали двух-замененную люциферазу с использованием сайт-направленного мутагенеза для внесения методами генной инженерии лизиновой замены в положении 354 в 270-лизиновые люциферазы, кодирующие ДНК и плазмиду, описанные в Примере 1. Такая операция включает мутацию с использованием специально обозначенных олигонуклеотидов для превращения рPW601аG1 в pPW601a в G1K.Example 2: Obtaining a "two-mutant" 270K: 354K Photinus pyralis luciferase
In order to compensate for the reduced thermal stability of luciferase with a substitution at position 270, a two-substituted luciferase was obtained using site-directed mutagenesis to make genetic engineering a lysine substitution at position 354 in 270-lysine luciferase encoding DNA and plasmid described in Example 1. Such the operation involves a mutation using specially designated oligonucleotides to convert pPW601-G1 to pPW601a to G1K.

Олигонуклеотид, используемый для осуществления 354 лизиновой замены с помощью SДМ, представлял собой

/SEQ IД 5/, причем подчеркнутый Т является ошибочно спаренным.The oligonucleotide used to make 354 lysine substitution using SDM was

/ SEQ ID 5 /, and the underlined T is mistakenly paired.

Сайт-направленный мутагенез, требуемый для превращения глютамата 354 из рР W601аЕ270К, и в случае необходимости для прямого синтеза 270 мутанта из pPW601a, в желаемые аминокислоты осуществляли с использованием следующего протокола с обозначением нуклеотидов, когда это требуется. The site-directed mutagenesis required to convert glutamate 354 from pP W601aE270K and, if necessary, to directly synthesize the 270 mutant from pPW601a, into the desired amino acids was carried out using the following protocol with the nucleotide designation, when required.

Протокол сайт-направленного мутагенеза: Отобранную плазмиду денатурировали и отжигали с селекционными и мутагенными олигонуклеотидами для желаемой замены. Синтезировали и лигировали цепь мутантной ДНК и всю первичную рестрикцию переваривали с рестрикционной эндонуклеазой. Олигонуклеотидные праймеры для секвенирования и SДМ синтезировали с использованием синтезатора ДНК модели 380А фирмы Эпплайд Биосистемс. ДНК олигонуклеотидные праймеры предназначены для разрушения либо уникального Аyа 1 сайта внутри luc гена, или уникального Scal сайта внутри гена для β-лактамазы; присутствие таких сайтов используется для селекции от плазмид, не подвергнутых мутагенезу. Точные протоколы соответствовали описанным для Набора сайт - направленного мутагенеза Transformer^RTM (Версия 2.0), продаваемого Клонтех Лабораториз Инк. (США) под каталожным номером К1600-1.Site-directed mutagenesis protocol: The selected plasmid was denatured and annealed with selection and mutagenic oligonucleotides for the desired replacement. A mutant DNA strand was synthesized and ligated, and all primary restriction was digested with restriction endonuclease. Sequencing oligonucleotide primers and SDMs were synthesized using an Apple Biosystems model 380A DNA synthesizer. DNA oligonucleotide primers are designed to destroy either the unique Aya 1 site inside the luc gene, or the unique Scal site inside the gene for β-lactamase; the presence of such sites is used for selection from plasmids not subjected to mutagenesis. The exact protocols were as described for the Transformer ^RTM Site-directed Mutagenesis ^Kit (Version 2.0) sold by Clontech Laboratories Inc. (USA) under catalog number K1600-1.

Рестрикционная карта для pPW 601, полученной из рДR540 и клонированного luc гена, показана на фиг.4. Сайт-направленный мутагенез проводили в соответствии с описанным выше и в инструкциях Клонтех с целью превращения вставленного luc гена дикого типа Photinus в последовательность, представленную в SEQ 1Д 1 с экспрессированным белком с аминокислотной последовательностью, модифицированной в положении 270, обозначенном как Хаа в SEQ 1Д 2 с заменой на лизин. A restriction map for pPW 601 obtained from pDR540 and the cloned luc gene is shown in FIG. 4. Site-directed mutagenesis was performed as described above and in the Clontech instructions to convert the inserted wild-type Photinus luc gene into the sequence shown in SEQ 1D 1 with the expressed protein with the amino acid sequence modified at position 270, designated Xaa in SEQ 1D 2 with replacement for lysine.

Исследования по определению К_М проводили, как описано в Примере 1, тогда как исследования по термической инактивации проводили с использованием сырых экстрактов при 37^oС в лизисном буффере (25 мМ Трис фосфата рН 7.8, 2 мМ ДТТ, 2 мМ ЕДТА, 10% глицерина и 1% Тритона-Х-100), отбирая через различные промежутки времени аликвоты энзима и анализируя их, как описано выше (в присутствии 530 мкМ АТР). Строили график зависимости остаточной активности от времени.Studies to determine K _M were carried out as described in Example 1, while studies on thermal inactivation were carried out using crude extracts at 37 ^° C in a lysis buffer (25 mM Tris phosphate pH 7.8, 2 mM DTT, 2 mM EDTA, 10% glycerol and 1% Triton-X-100), taking aliquots of the enzyme at various time intervals and analyzing them as described above (in the presence of 530 μM ATP). We plotted the dependence of residual activity on time.

Значение К_М для 601аG1К, объекта двойной замены настоящего примера, было определено, как равное 25.2 мкМ (s.e. 1.5), что опять составляет менее половины соответствующих значений для 354 лизинового мутанта и люциферазы дикого типа.The K _M value for 601-G1K, the double replacement object of the present example, was determined to be 25.2 μM (se 1.5), which again is less than half the corresponding values for 354 wild-type lysine mutant and luciferase.

Величины t_1/2, т. е. время, после которого активность люциферазы понижается при непрерывном нагревании на 50% от исходного значения, имели следующие значения:
601а (рекомбинантный дикий тип) - t_1/2 достигается через 7,0 мин.The values of t _1/2 , i.e., the time after which the luciferase activity decreases with continuous heating by 50% of the initial value, had the following values:
601a (recombinant wild type) - t _{1/2 is} reached after 7.0 minutes.

601aG1 (270 К_М замена) - t_1/2 достигается через 1,75 мин.601aG1 (270 K _M replacement) - t _1/2 reached after 1.75 min.

601аК (354 термостабильная замена) - t_1/2 достигается через 35 мин.601aK (354 thermostable replacement) - t _{1/2 is} reached after 35 minutes.

601аGIК (270 + 354 замены) - t_1/2 достигается через 10,5 мин.601aGIK (270 + 354 replacements) - t _{1/2 is} reached after 10.5 minutes.

Приведенные выше данные включены в следующую ниже таблицу (плюс другие данные) совместно со значениями К_М.The above data are included in the following table (plus other data) together with K _M values.

Claims

1. A protein having luciferase activity and characterized by the wild-type luciferase amino acid sequence in which at least a natural glutamate residue belonging to a conserved region of the sequence and corresponding to Photinus pyralis luciferase residue 270 (or luciferase residue 272 of Luciola mingrelica, Luciola cruciata or Luciola lateralis) is replaced by another amino acid residue other than glutamate, so that the Michaelis-Menten constant (K _M ) of the enzyme decreases compared to the corresponding luciferase wildly th type.

2. The protein according to claim 1, characterized in that in the region of substitution it contains the amino acid sequence F (1) XE (2) FL, where (1) represents D or E, (2) represents T or L, and X represents an altered amino acid residue.

3. The protein of claim 2, wherein the amino acid residue X is lysine.

4. The protein according to any one of the preceding paragraphs, characterized in that it is further mutated so that the amino acid residue corresponding to residue 215 of the luciferase Photinus pyralis or residue 217 of the luciferase Luciola mingrelica, Luciola cruciata and Luciola lateralis is replaced by a hydrophobic amino acid.

5. The protein of claim 4, wherein the hydrophobic amino acid is isoleucine, leucine, or valine, or an analog of any of them.

6. The protein according to any one of paragraphs. 1-3, characterized in that it is further mutated in such a way that the amino acid residue corresponding to residue 354 of Photinus pyralis luciferase or residue 356 of Luciola mingrelica, Luciola cruciata or Luciola lateralis luciferase is replaced by an amino acid other than glutamate and providing increased thermal stability of the protein.

7. The protein of claim 6, wherein the amino acid other than glutamate and providing an increase in protein thermal stability is lysine.

8. A protein having luciferase activity and characterized by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, where Xaa is lysine.

9. The DNA encoding the protein according to claim 1, characterized in that its polynucleotide sequence is a wild-type luciferase sequence obtained from organisms producing an enzyme with a glutamate residue belonging to the conserved region of the sequence corresponding to the residue at position 270 of Photinus pyralis luciferase (or residue 272 of luciferase Luciola mingrelica, Luciola cruciata or Luciola lateralis), in which the codon corresponding to the named amino acid residue is replaced by a codon defining an amino acid other than glut ata, such that the K _m of the enzyme is reduced compared with the corresponding wild-type luciferase, or genetically degenerate forms.

10. The DNA according to claim 9, characterized in that it has the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1, where the N nucleotides at positions 811-813 form a codon encoding an amino acid other than glutamate, while providing a decrease in the value of K _M compared with the corresponding wild-type luciferase, or its genetically degenerate form.

11. The DNA of claim 10, wherein the N nucleotides at positions 811-813 encode lysine.

12. A vector for the expression of a protein characterized in any one of paragraphs. 1-8, in E. coli cell, which is a plasmid selected from the group consisting of pKK223-3, pDR540 and pT7-7, into which the DNA characterized in any of claims is ligated. 9-11.

13. The expression vector according to claim 12, characterized in that it is pPW204, pPW116, pPW304 and pPW601a.

14. A protein having luciferase activity and characterized by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, where Xaa is arginine, glutamine or alanine.

Priority on points:
GB 9501172.2, 01.20.1995 for PP. 1-13;
PCT / GB 96/00099, 01/19/1996 according to claim 14.